Deuxième partie
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Agence Universitaire de la Francophonie COOPERATION SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE AVEC LE VIET NAM Paris, Octobre 2008 Partie II: La dengue Biologie Moléculaire & Pathogénie Philippe Desprès Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-01 particules virales intracellulaires particule virale extracellulaire Le virus de la dengue Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-02 Les constituants du virion de la dengue M E Lipides issus issus de de l’hô l’hôttee Lipides Capside ARN génomique Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-03 Topologie des protéines M et E à la surface du virion E M Bicouche lipidique Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-04 Homodimère de la protéine E Structure 3D de la Protéine E du virus DEN-1 N-oligosaccharide en E-67 N-oligosaccharide en E-153 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-05 Organisation du génome du virus de la dengue C M E ARNss L’ARN génomique ouvre un seul long cadre de lecture de 10,300 nucléotides coiffe 5 ’ R.N.C ~ 100 nt Protéines structurales C prM E R.N.C. Protéines non-structurales NS1 2a 2b NS3 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. 4a 4b 650 nt 3 ’ NS5 II-06 Cycle réplicatif viral Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-07 Virus de la dengue Modèle de réplication de l’ARN viral Membrane plasmique H+ endocytose H+ H+ + H H+ H+ H+ H+ H+ NC libre décapsidation F.R. + I.R. Cytosol 5 ’ ARN génomique 5 ’ 3 ’ C.R. ARNdb RNA (-) 3 ’ 5 ’ 3 ’ (+) (+) (+) RNA (-) 1 2 3 0-3 3-6 6-9,>9 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. hrs p.i. II-08 Biogenèse des protéines virales E NS1 prM Signalases Lumière du réticulum endoplasmique NS2b M NS4a NS4b Membranes du RE C COO- NS2a NS2B NS3 Domaine protéase NH+3 NS 5 Capside NS 3 Cytosol Domaine hélicase Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. Polymérase à ARN dépendant de l’ARN II-09 Sensibilité de la cellule hôte à l’infection par le virus de la dengue Cellules de de moustiques moustiques Cellules Cellules de de mammifère mammifère Cellules Pas de cytolyse Syncitia (pH acides) Persistance virale Infection abortive Effets cytopathiques Mort apoptotique Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-10 Pathogénie de la dengue hémorragique Pic de virémie Fièvre Sévérité de la maladie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 jour 6 log Titre viral au pic de virémie Titre viral Forme sévère de la maladie 4 log 2 log 40°C Temp. 39°C 38°C Syndrome de choc Halstead, 1980 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. FD FHD Gr.I-II FHD Gr.III II-11 Diagnostic de laboratoire d’une infection par le virus de la dengue Sécurité biologique: niveau P3 en Europe Echantillons biologiques: sérum en général Détection de l’ARN du virus de la dengue: RT-PCR en temps réel et amplification génique de l’ARN viral Isolement du virus de la dengue: Isolement sur des lignées stables de cellules de moustiques Aedes (cellules C6/36 and AP61). L’isolement peut être aussi réalisé sur des femelles de moustiques Aedes par la voie intrathoracique Confirmation de l’isolement par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps spécifiques. Analyse moléculaire par séquençage des séquences virales amplifiées. Analyse sérologique ELISA de capture des IgM et des IgG spécifiques du virus de la dengue Tests de neutralisation in vitro sur cultures cellulaires IgM onset P oSudden u s s ée soudaine Inoculation Arbovirus du of fièv fever de re virus inoculation de la dengue ANR viral incubation Jour -5/-2 Jour 0 IgG + Jour +4/+7 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. Jour +15 II-12 Pathogénie de la dengue hémorragique % d’infection virale Le niveau de risques de FHD/SCD est 15 à 80 plus élevé lors des infections secondaires par rapport aux infections primaires Fièvre indifférenciée Fièvre dengue L’infection secondaire par un sérotype hétérologue provoque une réponse anamestique et massive en FHD Grades I & II Infection primaire Antibody-Dependent Enhancement (A.D.E.) Infection secondaire anticorps de faible avidité vis à vis du virus infectant Grades III & IV SCD (S. Halstead) Original Antigenic Sin L’infection secondaire par un sérotype hétérologue stimule la population T mémoire pré-existante Faible Elevée de faible spécificité vis à vis du virus infectant Sévérité de l’infection virale Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. (K. Screaton et al.) II-13 Anticorps Compléments Plaquettes Ag classe I CPA Mo s Ly DEN e Original antigenic sin DEN In DEN fe DEN CPA Mo ct DEN io Cellules endothéliales n Activation Activation des plaquettes du complément CPA Mo Lyse DEN Mo Cellules endothéliales T CD4 Ag classe II -γ N F I DEN DEN Lymphocytes T FcγR I-II A.D.E DEN Monocytes Macrophages T CD8 DEN DEN Platelet-activating factor (PAF) C3a C5a TNF-α, IL-1, PAF IL-6, histamine IL-2, IL-10 TNF-α, IL-6, IFN-γ cellules endothéliales vasculaires II-14 Fuite plasmatique TNF-α, IL-1, PAF IL-6, IL-8 (from Kurane & Ennis, 1994) Fièvre hémorragique de dengue Les facteurs viraux impliqués dans la FHD Les épidémies de FHD par les sérotypes 2 et 3 en Amérique Latine ont été associées aux génotypes viraux en provenance d’Asie du Sud. Le études phylogénétiques mettent en évidence une diversité génétiques accrue entre les virus de la dengue au sein d’un même sérotype. Cette diversité génétique pourrait être la conséquence de la recombinaison homologue entre les virus de la dengue d’un même sérotype chez le vecteur moustique. "Risk to be exp osed to dengue viruses wit h expanded range of pathogenic properties in the future." ( M a ck e n zie et a l . ) Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-15 Les principales stratégies vaccinales contre la dengue Un vaccin contre la dengue doit protéger efficacement contre les quatre sérotypes du virus. 1 - Souches v irales v i vantes atténu ées: Mahidol University & Aventis-Pasteur US Army & GlaxoSmithKline US National Institutes of Health 2 - Virus chimériques: A c ambis: gènes prM et E des virus DEN dans le génome du vaccin 17D de la fièvre jaune C . D.C: gènes prM et E des virus DEN dans le génome de la souche atténuée DEN-2 Mahidol 3 - Virus de la rougeole recombinant (IP Paris): Domaine III antigénique de la protéine E des virus de la dengue exprimés par le vecteur dérivé de la souche atténuée vaccinale Schwarz du virus de la rougeole Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-16 Recherches: identité des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle De l’infection par le virus de la dengue au site d’inoculation par le moustique. Epidermis Epiderme Derme Dermis Epiderme Keratinocytes Melanocytes Derme Langerhans cells Cellules de Langerhans Virus de la dengue Cellules dendritiques Lymphocytes II-17 Monocytes/ Monocytes/macrophages Macrophages Virus de la dengue inoculé par le moustique N Cellules de Langerhans immatures Épithélium stratifié N Cellules dendritiques dermales immatures (CD209/DC-SIGN +) Sous épithélium Antigène viral Les cellules dendritiques dermales sont permissives au virus de la dengue (IF) lymphe 105 Macrophages du derme < 103 104 103 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. DEN-1 DEN-2 DEN-3 < 103 (PFU/FFU mL-1) cibles Target cells Production virale Nodules lymphatiques Lymph node Rate Spleen Liver Foie Cellules 106 < 103 capillaires II-18 Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes Groupe de recherche Centre National de Référence des Arbovirus Base moléculaire de la pathogénicité virale Surveillance arbovirologique PARDIGON Nathalie COFFEY Lark BLANCHET Matthieu MERTENS Eva BRAULT Jean-Baptiste PAULOUS Sylvie Développement d’outils diagnostiques Dr. RENAUDAT Charlotte (dir.adj.) GRANDADAM Marc (dir.adj.) FRENKIEL Marie-Pascale MOLTINI Isabelle MILLIOT Brigitte Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes & CNR des Arbovirus Institut Pasteur, Paris. France. II-19
