VBNC - Université de Poitiers

THÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École Doctorale : Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique
Secteur de recherche : MICROBIOLOGIE DE L’EAU
Présentée par
Laëtitia ALLERON
ETUDE DE L’ETAT VIABLE NON CULTIVABLE
(VBNC) CHEZ LEGIONELLA PNEUMOPHILA LENS
APRES TRAITEMENTS MONOCHLORAMINE ET
THERMIQUE
Directeur de Thèse : Professeur Jacques FRERE
Soutenue de 08 Février 2008
Devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs :
Mme Sophie JARRAUD, MCU PH, HDR, Université de Lyon Nord
M. Sam DUKAN, Chargé de Recherche CNRS, HDR, Université de Marseille
Examinateurs : Mme Marie-Hélène RODIER, PU-PH, Université de Poitiers
M. Thierry JOUENNE, Directeur de Recherche CNRS, Université de Rouen
M. Jacques FRERE, Professeur, Université de Poitiers
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE .................................................................................... 8
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE................................................... 10
1. LEGIONELLA .................................................................................................................. 10
1.1. Historique .................................................................................................................. 10
1.2. La légionellose .......................................................................................................... 10
1.3. Présentation de la bactérie......................................................................................... 12
1.3.1. Classification...................................................................................................... 12
1.3.2. Description / Morphologie ................................................................................. 13
1.3.3. Caractères microbiologiques et biochimiques.................................................... 14
1.3.4. Caractères culturaux........................................................................................... 14
1.3.5. Facteurs de virulence.......................................................................................... 14
1.4. Ecologie des légionelles ............................................................................................ 16
1.4.1. Interaction avec les amibes ................................................................................ 20
1.4.2. Colonisation des biofilms................................................................................... 21
1.5. Cycle de vie de L. pneumophila ................................................................................ 21
1.5.1. La phase de réplication....................................................................................... 23
1.5.2. La phase de transmission.................................................................................... 23
1.5.3. La forme MIF (Mature Intracellular Form)........................................................ 24
2. L’ETAT VIABLE NON CULTIVABLE (VBNC).......................................................... 25
2.1. Définition .................................................................................................................. 25
2.2 L’état VBNC chez L. pneumophila............................................................................ 28
2.2.1. Carence en nutriments........................................................................................ 29
2.2.2. Influence de la température ................................................................................ 29
2.2.3. Influence de la teneur en oxygène dissous ......................................................... 30
2.2.4. Influence du pH.................................................................................................. 30
2.2.5. Influence de la salinité........................................................................................ 30
2.2.6. Traitements oxydants ......................................................................................... 31
2.3 Analyse de l’état VBNC............................................................................................. 31
3. UN NOUVEAU FACTEUR DE RESSUCITATION : LA PROTEINE Rpf
(Resuscitation-promoting-factor) ......................................................................................... 36
3.1. Rpf chez les bactéries Gram positives : .................................................................... 36
3.2. Rpf chez les bactéries Gram négatif.......................................................................... 38
3.3. Structure et mode d’action ........................................................................................ 40
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES.......................................................... 42
1. Souches microbiennes, conditions de culture et de conservation .................................... 42
1.1. Legionella pneumophila............................................................................................ 42
1.2. Acanthamoeba castellanii ......................................................................................... 42
1.3. Escherichia coli......................................................................................................... 43
2. Traitement des bactéries en suspension par la monochloramine ..................................... 43
3. Traitement thermique ....................................................................................................... 44
4. Etude de la viabilité des cellules ...................................................................................... 44
1
4.1. Dénombrement des bactéries cultivables sur gélose ................................................. 44
4.2. Etude de l’intégrité membranaire : LIVE/DEAD® BacLight™................................ 44
4.3. Etude de l’activité estérase : CHEMCHROME V6 .................................................. 46
4.4. Infection de l’amibe Acanthamoeba castellanii........................................................ 46
5. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des bactéries à l’état VBNC ............... 47
6. Analyse protéomique........................................................................................................ 48
6.1. Préparation des échantillons : EXTRACTION DES PROTÉINES............................. 49
6.2. Electrophorèse bidimensionnelle : 2D-PAGE........................................................... 49
6.2.1. Principe............................................................................................................... 49
6.2.2. 1ère dimension : IEF............................................................................................ 50
6.2.3. 2NDE DIMENSION : SDS-PAGE....................................................................... 51
6.2.4. Coloration au nitrate d’argent ............................................................................ 52
6.2.5. Analyse d’image................................................................................................. 52
6.2.6. Spectrométrie de masse MALDI-TOF............................................................... 53
7. Méthodes de biologie moléculaire ................................................................................... 53
7.1. Plasmides................................................................................................................... 53
7.2. Clonage moléculaire et PCR ..................................................................................... 54
7.2.1. Réactions de PCR et amorces............................................................................. 54
7.2.2. Ligature du produit PCR dans pCR-Blunt ......................................................... 55
7.2.3. Clonage après digestion par les enzymes de restriction..................................... 55
7.3. Transformation d’Escherichia coli............................................................................ 55
7.4. Expression des protéines recombinantes................................................................... 55
7.5. Extraction et purification des protéines recombinantes ............................................ 56
7.5.1. Extraction ........................................................................................................... 56
7.5.2. Purification ......................................................................................................... 56
7.5.3. Vérification des protéines induites par SDS-PAGE........................................... 57
7.5.4. Test de réveil de L. pneumophila par les protéines recombinantes.................... 57
CHAPITRE 3 : RESULTATS ...................................................................................... 58
1. Impact du traitement par la monochloramine .................................................................. 58
1.1. Cultivabilité et viabilité............................................................................................. 59
1.2. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des bactéries non cultivables ....... 60
1.3. Traitements des bactéries pour l’électrophorèse 2D ................................................. 62
1.4. Analyse protéomique................................................................................................. 64
1.4.1. Analyse par SDS-PAGE..................................................................................... 64
1.4.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle.................................................... 65
2. Impact du traitement thermique ....................................................................................... 76
2.1. Cultivabilité et viabilité............................................................................................. 76
2.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle........................................................... 80
3. Identification du gène Rpf chez L. pneumophila ............................................................. 82
3.1. Amplification du gène rpf chez L. pneumophila....................................................... 82
3.2. Expression des protéines recombinantes................................................................... 84
3.2.1. Protéines recombinantes marquée en N-terminal............................................... 84
3.2.2. Protéines recombinantes marquée en C-terminal............................................... 86
3.2.3. Test de réveil de L. pneumophila non cultivables.............................................. 86
CONCLUSIONS / PERSPECTIVES ........................................................................... 88
2
ANNEXE 1 : Préparation des milieux de culture pour L. pneumophila et E. coli....... 92
ANNEXE 2 : Préparation des milieux de culture pour Acanthamoeba castellanii ...... 94
ANNEXE 3 : Préparation des solutions nécessaires au traitement NH2Cl .................. 95
ANNEXE 4 : Préparation des gels d’électrophorèse 2D .............................................. 97
ANNEXE 5 : Préparation des gels d’électrophorèse pour la SDS-PAGE.................... 98
ANNEXE 6 : Fixation et coloration des protéines ....................................................... 99
ANNEXE 7 : Liste des protéines dont la quantité augmente à l’état VBNC ............. 100
ANNEXE 8 : Liste des protéines dont la quantité varie après le stress
monochloramine ......................................................................................................... 101
ANNEXE 9 : Liste des protéines dont la quantité varie dans le milieu pauvre en
nutriments (carence nutritionnelle) ............................................................................. 102
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................... 103
ARTICLE 1
ARTICLE 2
3
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cycle de vie de Legionella pneumophila………………………...……………….17
Figure 2 : schéma d’infection d’une amibe par Legionella..................................................... 19
Figure 3 : Cycle de vie de L. pneumophila (Molofsky & Swanson, 2004)............................. 21
Figure 4 : Expression des phénotypes pendant les phases de réplication et de transmission.. 22
Figure 5 : Alignement partiel de séquences en AA de Rpfs chez les mycobactéries.............. 35
Figure 6 : comparaison de RpfBc avec d'
autres glycosides hydrolases..…………………….39
Figure 7 : Cultivabilité de L. pneumophila en suspension après traitement à la
monochloramine (moyenne de 3 expériences)......................................................................... 59
Figure 8 : Autoradiographie de profils protéiques de L. pneumophila obtenus après marquage
à différents temps, par un mélange cystéine /méthionine S35 .................................................. 60
Figure 9 : Comparaison de profils protéiques par SDS-PAGE de L. pneumophila cultivables
ou non cultivables restées 0 jours (J0) ou 15 jours (J15) dans le milieu de repos ................... 64
Figure 10 : Exemple de gel obtenu en déposant 350 µg de protéines de L. pneumophila traitée
par 20 mg/L de monochloramine resté 15 jours dans le milieu de repos................................. 66
Figure 11 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la monochloramine
après incubation dans le milieu de repos (150 µg de protéines déposées)............................... 67
Figure 12 : Exemple de gel obtenu en déposant 150µg de protéines d’un échantillon traité par
20mg/L NH2Cl et prélevé juste après traitement. .................................................................... 68
Figure 13 : Localisation des protéines dont la quantité est augmentée d’un facteur supérieur
ou égal à 2 à l’état VBNC ........................................................................................................ 71
Figure 14 : Dénombrement des L. pneumophila cultivables après traitement thermique ....... 77
Figure 15 : Observation en microscopie à épifluorescence de l’activité estérase de L.
pneumophila, 169 j après traitement à 57,5°C (Chemchrome V6) .......................................... 79
Figure 16 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la chaleur après
incubation plusieurs jours dans le milieu de repos................................................................... 80
Figure 17 : Comparaison de séquences en AA de Rpf entre L. pneumophila et Salmonella...81
Figure 18 : Résultat de l’amplication du gène rpf chez L. pneumophila................................. 83
Figure 19 : Expression de la protéine Rpf marquée en N-terminal par une queue polyhistidine .................................................................................................................................... 84
Figure 20 : Purification de la protéine Rpf marquée en N-terminal........................................ 85
Figure 21 : Comparaison de séquence en AA de Rpf entre L. pneumophila, Salmonella et
Micrococcus luteus...................................................................................................................87
4
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Conditions de formation et réveil de VBNC chez différentes bactéries .............. 26
Tableau 2 : Différentes conditions induisant l’état VBNC chez L. pneumophila................... 28
Tableau 3 : Séquence en acides aminés de différentes Rpfs ................................................... 35
Tableau 4 : Organismes possédant des gènes rpf-like ............................................................ 37
Tableau 5 : Amorces utilisées pour réaliser la PCR................................................................ 54
Tableau 6 : Cultivabilité et viabilité de L. pneumophila après traitement par 20 mg/L de
monochloramine et incubation dans le milieu de repos ........................................................... 62
Tableau 7 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 15 jours
apès l’entrée dans l’état VBNC ................................................................................................ 70
Tableau 8 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 après
traitements par la monochloramine .......................................................................................... 70
Tableau 9 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 après 15
jours dans un milieu pauvre ..................................................................................................... 70
Tableau 10 : Viabilité de Legionella pneumophila HL 0350 5056 non cultivable après
traitement à 57,5 C pendant une heure ..................................................................................... 78
5
LISTE DES ABREVIATIONS
ACES : N-(2-acétoamido)-2-aminoethanesulfonic acid
ACP : Acyl Carrier Protein
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ARN : Acide Ribonucléique
APS : Ammonium PerSulfate
BCYE : Buffered Charcoal Yeast Extract
BET : Bromure d’Ethidium
BYE : Buffered Yeast Extract
CHAPS : 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate
(C32H58N2O7S)
CNRL : Centre National de Référence des Légionelles
COT : Carbone Organique Total
CSHPF : Conseil Supérieur d’Hygiène Publique de France
DDASS : Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales
DFA : Direct Fluorescent Antibody
DMI : Dose Minimale Inhibitrice
DO600nm : Densité Optique à 600 nm
DPD : N,N-diéthylphénylène-1,4-diamine
DTT : Dithiothreitol
DVC : Direct Viable Count
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid (acide éthylène-diamine-tétraacétique)
EUP : Eau Ultra Pure
FISH : Fluorescent In Situ Hybridization
Hsp : Heat shock proteins
IEF : Focalisation IsoElectrique
LB: Luria-Bertani
LLAP : Legionella-like amoebal pathogens
MALDI-TOF-MS : Matrix-Associated Laser Desorption Ionisation/Time Of Flight-Mass
Spectrometer
MIF : Mature Intracellular Form
MIP : Macrophage Infectivity Potentiator
6
MOMP : Major Outer Membrane Protein
OMP : Outer Membrane Protein
pb : paire de bases
PCR : Polymerase Chain Reaction
PVC : Polychlorure de vinyle
PYG : Peptone Yeast extract Glucose
Rpf : Resuscitation-promoting-factor
RT-PCR : Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
TEMED : N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine
UFC : Unité Formant Colonie
UV : Ultra Violet
VBNC : Viable But NonCulturable
2D : Bidimensionnelle
7
INTRODUCTION GENERALE
Les légionelles sont des bactéries hydrotelluriques responsables d’infections pulmonaires chez
l’Homme appelées légionelloses (Gaillot, 2004b). Ces bactéries sont présentes dans les
réservoirs naturels ou artificiels d’eau douce tels que les réseaux de distribution d’eau chaude
sanitaire (ballons de réserve d’eau, douches, robinets), les systèmes de climatisation les tours
aéroréfrigérantes, les eaux thermales ou encore les fontaines décoratives où elles prolifèrent
dans l’eau stagnante et lorsque la température de l'
eau est comprise entre 25 et 43°C (Doleans
et al., 2004; Leoni et al., 2005; Tison & Seidler, 1983).
De nombreux travaux ont été effectués afin d’optimiser les méthodes de décontamination des
réseaux de distribution et d’autres installations en vue d’éradiquer ces bactéries.
Par exemple, dans le cas des réseaux d’eau chaude sanitaires et plus particulièrement ceux des
établissements de soin (hôpitaux, cliniques, …), lorsqu’une analyse d’eau révèle un taux
supérieur à 1 000 UFC/L, une désinfection doit être réalisée. Les deux méthodes reconnues
par la Direction Générale de la Santé pour la désinfection des réseaux sont le choc chloré et le
choc thermique ((CSHPF), 2001).
D’autres désinfectants ou biocides sont également employés pour la désinfection, tels que
d’autres agents oxydants (chloramines, composés bromés, iodés), l’ozone, les ultraviolets ou
les ions métalliques (cuivre, argent), ... (Blanc et al., 2005; Cheng et al., 2007; Kim et al.,
2002; Landeen et al., 1989; Mietzner et al., 1997).
Cependant, malgré la mise en place de traitements, on observe fréquemment une
recolonisation des réseaux par ces légionelles peu de temps après désinfection.
Cette recontamination peut avoir plusieurs causes :
- la première est la présence de biofilms qui constituent des réservoirs pour plusieurs
espèces de microrganismes dont les légionelles, et leur fournissent une protection vis-à-vis
des agressions extérieures via la matrice extracellulaire. Les bactéries ainsi protégées peuvent
survivre à l’action du désinfectant puis reformer un biofilm ou être décrochées de celui-ci et
se retrouver dans l’eau circulante.
- la présence de protozoaires dont les amibes peuvent constituer une deuxième cause.
En effet, les légionelles sont capables d’infecter des amibes, d’y survivre et de s’y multiplier
8
(Borella et al., 2005; Bozue & Johnson, 1996). Ces amibes sont capables de résister aux
désinfectants, protégeant ainsi les bactéries. Ces dernières peuvent être par la suite libérées
dans l’environnement, coloniser des biofilms ou infecter l’Homme.
- cette reprise d'
activité peut également s’expliquer par la formation de bactéries
viables mais non cultivables (VBNC) suite au traitement. Ces bactéries sont incapables de se
développer sur les milieux de culture utilisés en routine dans les laboratoires (A.F.N.O.R.,
2003) mais possèdent encore une activité métabolique (Oliver, 1993; Oliver, 2005). Dans
certains cas, lorsque les conditions sont favorables, par exemple en présence d’amibes, les
légionelles à l’état VBNC sont capables de retrouver leur capacité à se développer et à se
multiplier sur milieu gélosé : cette étape est appelée « ressuscitation », « revivification » ou
« réveil » (Garcia et al., 2007; Steinert et al., 1997). Les bactéries que l’on pensait mortes,
puisque non détectables sur les milieux utilisés, sont de nouveaux détectables dans les
réseaux.
L’objectif principal de nos travaux a été d’étudier l’état viable non cultivable chez L.
pneumophila. Pour cela, nous avons produit des VBNC en utilisant la monochloramine et le
traitement thermique. Ensuite, nous avons entrepris une analyse protéomique de façon à
rechercher l’existence potentielle de protéines spécifiques de l’état VBNC et d’identifier
éventuellement les voies métaboliques utilisées dans cet état.
La dernière partie de notre travail a porté sur une étude préliminaire d’une protéine que nous
avons détectée chez L. pneumophila et qui est homologue aux protéines Rpf (Resuscitation
promoting factor) décrites chez d’autres bactéries.
9
CHAPITRE 1 :
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. LEGIONELLA
1.1. Historique
En 1976, 182 vétérans de la légion américaine, logeant dans un hôtel de Philadelphie
et participant à la 56ème convention de l'
American Legion, ont contracté une pneumonie
sévère provoquant 34 décès (Fraser et al., 1977).
La bactérie à l’origine de cette épidémie a été isolée en 1977. Compte tenu des
circonstances, la maladie causée par ce microorganisme a été appelée la « maladie des
légionnaires » (ou légionellose) et la bactérie, Legionella pneumophila.
En 1979, le genre Legionella a été établi. Il s’agit du seul genre composant la famille
des Legionellaceae.
Par la suite, des isolats, qui jusque là n’avaient pas été identifiés, ont été caractérisées
rétrospectivement. En réalité, les premières souches de Legionella ont été isolées à partir de
cobaye en utilisant des procédés destinés à l’isolement de Rickettsia mais ces bactéries n'
ont
fait l'
objet d'
aucune étude approfondie jusqu’en 1976 (Fields et al., 2002; Fraser, 2005).
1.2. La légionellose
Les légionelloses se présentent essentiellement comme des infections pulmonaires aigües.
Les légionelles sont pathogènes ou potentiellement pathogènes pour l'
homme et elles
peuvent être isolées de crachats, de liquides de lavage broncho-alvéolaire, du parenchyme
pulmonaire, du liquide pleural, du liquide péricardique, du sang, des valves cardiaques,
d'
abcès et de matériel médical (cathéters, sondes...).
La transmission de cette bactérie s'
effectue par voie aérienne (inhalation d'
eau
contaminée, diffusée en aérosol).
10
Cliniquement, les infections de l’homme évoluent sous trois formes :
La fièvre de Pontiac : qui est une forme bénigne, analogue à un syndrome grippal,
guérissant de façon spontanée en 2 à 5 jours. Elle représenterait 95% des cas (c'
est-à-dire que
sur 100 personnes contaminées, 95 développent la maladie).
La maladie des légionnaires : qui est une forme grave survenant chez les personnes
fragilisées (personnes âgées, immunodéprimés, fumeurs, …) se caractérisant par une infection
pulmonaire aiguë. Elle débute, après une incubation de 2 à 10 jours, par un syndrome pseudogrippal. Ultérieurement, on observe une fièvre élevée, une dyspnée, une toux importante, une
pleurésie, la formation d'
abcès pulmonaires, des désordres rénaux (protéinurie, hématurie,
insuffisance rénale), des troubles gastro-intestinaux (douleurs abdominales, vomissements,
diarrhée) et, parfois, des troubles neurologiques (somnolence, délire, confusion). En l'
absence
de traitement antibiotique adapté, le taux de mortalité est important et peut atteindre 15 à
20%.
Les légionelloses extra-pulmonaires : elles sont rares mais très graves. Elles
concernent principalement le cœur (myocardite, péricardite, endocardite), l'
appareil digestif
(péritonite, colite nécrosante, pancréatite), l'
appareil musculaire, le système nerveux ou l'
œil
(rétinite).
Cette maladie n’est pas contagieuse (transmissible d’un sujet malade à un sujet sain)
mais elle fait l'
objet, en France, d'
une surveillance qui repose sur la déclaration obligatoire
instaurée depuis 1987. Le Centre National de Référence des Légionelles (CNRL) assure une
activité d'
expertise auprès des laboratoires.
En France, depuis le renforcement de la surveillance de la légionellose en 1997 et la
sensibilisation des professionnels de santé, le nombre de cas de légionellose déclarés auprès
des autorités sanitaires a augmenté. Il s'
élève à 1443 cas pour l'
année 2006 avec une incidence
de 3,3 pour 100 000 habitants. Depuis 1998, plus de 10 épisodes de cas groupés de
légionellose (ayant concerné chacun de 8 à 86 personnes) ont donné lieu à des investigations
épidémiologiques et environnementales afin d'
identifier la ou les source(s) de contamination.
Dans de nombreux cas, la contamination de tours aéroréfrigérantes par les légionelles a été
mise en cause (Paris 1998, Lens 2003-2004…). Les autres sources de contaminations
incriminées dans les épidémies sont les circuits de distribution d'
eau chaude sanitaire
(douches), les systèmes de climatisation, les eaux thermales chaudes où les Legionella se
multiplient à des températures comprises entre 20 et 45°C.
11
Le risque de contracter la légionellose pour une personne après avoir été exposée à de
l'
eau contaminée dépend de certains facteurs : les caractéristiques de l'
exposition ainsi que
l'
état de santé de la personne exposée.
Le conseil Supérieur d’Hygiène Public de France a défini en 2005 ((CSHPF), 2005) deux
catégories de population à risque :
-
Les « personnes à haut risque » : les immunodéprimés sévères ou non suite à une
transplantation ou greffe d’organe, ou suite à une corticothérapie prolongée (0,5 mg/kg de
prednisone pendant 30 jours ou plus, ou équivalent) ou récente et à haute dose (c’est à dire
supérieure à 5 mg/kg de prednisone pendant plus de 5 jours).
-
Les « personnes à risque » : les personnes ayant un système immunitaire fortement
diminué du fait d’une pathologie (hémopathie maligne, leucémie, cancers surtout
bronchopulmonaires) ou d’un traitement immunodépresseur.
D’autres facteurs associés à la maladie ont été incriminés :
• l’âge supérieur à 50 ans, l’incidence augmentant avec l’âge : la maladie du
légionnaire est rare chez les personnes de moins de 20 ans. De très rares cas de légionellose
ont été rapportés en pédiatrie chez les enfants immunodéprimés.
• le sexe masculin (3 malades sur 4 sont des hommes),
• les fumeurs (entre 1997 et 1999, 32 à 41 % des malades sont des fumeurs),
• certaines maladies comme le sida, le cancer, le diabète …),
• les antécédents d’une intervention chirurgicale récente,
• les pathologies chroniques cardiaques, pulmonaires ou l’insuffisance rénale,
• l'
alcoolisme n’est pas toujours retrouvé dans la littérature.
Un certain nombre de cas s’observe néanmoins chez des sujets n’ayant pas de facteur de
risque rapporté.
1.3. Présentation de la bactérie
1.3.1. Classification
La famille des Legionellaceae ne renferme que le genre Legionella et sa définition est
identique à celle de son propre genre.
Les légionelles sont des bactéries de l'
environnement, aptes à infecter des protozoaires et
susceptibles de provoquer des infections chez l'
Homme.
12
Le genre Legionella a suscité de nombreux travaux et, dès 1980, quatre nouvelles espèces ont
été décrites. Actuellement, ce genre rassemble une cinquantaine d’espèces différentes et plus
de 70 sérogroupes.
Il existe trois espèces pathogènes principales :
- L. pneumophila est la bactérie la plus importante en pathologie humaine. On connaît
à l’heure actuelle 15 sérogroupes pour cette bactérie. Elle est l’agent responsable d’environ
90% des cas de légionelloses diagnostiqués en France. Le sérogroupe 1 est le plus fréquent
(70 à 90% des cas) puis le sérogroupe 6 (les autres espèces sont généralement isolées chez les
personnes immunodéprimées) (Jarraud et al., 2000).
- L. jordanis et L. bozemani
sont à l’origine de moins de 10% et 3% des cas
respectivement.
Plusieurs souches de légionelles, qualifiées de LLAP (Legionella-like amoebal pathogens) car
elles induisent la lyse amibienne, n'
ont pu être cultivées qu’en présence d’amibes et pourraient
représenter plusieurs espèces différentes. En mai 2001, Adeleke et al. ont validé les
nomenclatures de Legionella drozanskii, de Legionella fallonii et de Legionella rowbothamii
pour sept souches de LLAP. Leur pouvoir pathogène, à l’exception de L. lytica, est
actuellement inconnu (Adeleke et al., 2001; Hookey et al., 1996).
Le genre Legionella et la famille des Legionellaceae forment un groupe cohérent placé dans
l'
ordre
des
Legionellales
(classe
des
Gammaproteobacteria,
embranchement
des
"Proteobacteria"). Phylogénétiquement, les espèces les plus proches des Legionellaceae sont
Coxiella burnetii et Rickettsiella grylli, espèces actuellement exclues de l'
ordre des
Rickettsiales.
1.3.2. Description / Morphologie
Les légionelles se présentent sous forme de bacilles à Gram négatif (faiblement colorés) de
forme coccobacillaire de 0,3 à 0,9 µm de large sur 2 à 20 µm (ou plus) de longueur, devenant
filamenteux en culture, aérobies stricts, non sporulés, non acido-résistants, non capsulés. Ces
bactéries sont d'
origine hydrique et sont généralement mobiles (sauf L. oakridgensis) au
moyen d'
un ou plusieurs flagelles polaires ou subpolaires.
En culture, les colonies sont grisâtres, polymorphes avec un aspect en verre "brisé" à la loupe
binoculaire.
13
1.3.3. Caractères microbiologiques et biochimiques
Ces bactéries possèdent deux catalases (KatA et KatB), hydrolysent l'
hippurate et la gélatine.
Ces deux derniers caractères sont variables selon les espèces et les souches d’une même
espèce. Elles n'
hydrolysent pas les sucres (ni fermentation ni oxydation), ne réduisent pas les
nitrates et ne synthétisent pas d’uréase. La plupart des espèces produisent une β-lactamase et
les réactions d’oxydase sont variables selon les espèces.
Elles sont chimio-organotrophes et utilisent les acides aminés comme source d'
énergie et de
carbone (Benson & Fields, 1998). Ces bactéries synthétisent plus d'
acides gras ramifiés que
d'
acides gras non ramifiés. Elles présentent jusqu’à 90% d’acides gras insaturés dans la paroi
(caractère inhabituel pour une bactérie Gram négatif).
Le G + C % des diverses espèces varie de 38 à 52.
1.3.4. Caractères culturaux
Des légionelles ont été isolées dans des eaux de 6 à 66°C mais elles sont plutôt thermophiles
avec un optimum compris entre 20 et 45°C.
Leur culture est favorisée en présence de 2,5 % de CO2 et nécessite de la L-cystéine et du fer.
La croissance est optimale pour un pH légèrement acide (de l’ordre de 6,8-6,9) et, pour la
majorité des espèces, pour une température de 36°C +/- 1°C pendant 3 à 10 jours.
Les cultures sont généralement réalisées sur gélose BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract)
supplémenté en L-cytéine, en tampon ACES et en fer (Feeley et al., 1979). La source de fer
peut être constituée par du nitrate de fer, du sulfate de fer, du chlorure de fer, de l’hématine ou
de l’hémine mais, les meilleurs résultats sont obtenus avec du pyrophosphate de fer.
Les colonies sont grisâtres, de consistance muqueuse, de taille hétérogène et, observée à la
loupe binoculaire, elles présentent généralement un aspect en « verre brisé ».
Les légionelles ne cultivent pas sur gélose au sang.
1.3.5. Facteurs de virulence
La virulence s’exprime au travers de facteurs phénotypiques ou génomiques qui peuvent aussi
être influencés par l’environnement : ce sont des facteurs de surface, de sécrétion et
déterminants périplasmiques et cytosoliques.
14
Une variété de structures de surface est impliquée dans la pathogénicité de Legionella.
Le Lipopolysaccharide (LPS) est situé à la surface de la bactérie. C’est un
déterminant immunogène majeur de la surface des cellules qui intervient dans l’adhésion de
Legionella à la muqueuse respiratoire (Steinert et al., 2002).
La protéine MOMP (Major Outer Membran Protein) est une porine associée au
peptidoglycanne, codée par ompS, capable de s’insérer dans les membranes, incluant celles
des cellules hôtes, et d’ouvrir des canaux qui vont permettre le passage d’ions (Dowling et al.,
1992; Gabay et al., 1985). Cette protéine se lie également aux récepteurs du complément CR1
et CR3 qui se trouvent à la surface des monocytes humains, favorisant l’attachement de la
bactérie à la cellule hôte (Steinert et al., 2002).
Le pili de type IV est également produit par L. pneumophila. Il intervient dans le
mécanisme d’attachement à la cellule hôte (Rossier & Cianciotto, 2001; Soderberg et al.,
2004).
En ce qui concerne les flagelles, le gène de la flagelline est régulé par la température,
la phase de croissance, les acides aminés, la viscosité ou la pression osmotique. Bien que les
flagelles de Legionella ne soient pas nécessaires à la réplication intracellulaire, ils permettent
d’augmenter la probabilité de rencontre avec une cellule hôte et la capacité d’invasion d’une
façon indépendante de l’adhérence (Vogel & Isberg, 1999). Les flagelles ne constituent pas
des adhésines.
La Protéine Mip (Macrophage infectivity potentiator) codée par le gène mip est
une protéine de 24 kDa exprimée à la surface des L. pneumophila, qui est nécessaire pour les
premières étapes d’infection intracellulaire des cellules hôtes (Cianciotto, 2001). Cette
protéine possède une activité peptidyl-prolyl cis/ trans isomérase (PPIase) (Steinert et al.,
2002).
La protéine de choc thermique de 60kDa (Hsp60) serait aussi impliquée dans
l’attachement et l’entrée de Legionella dans les cellules épithéliales HeLa (Garduno et al.,
1998). La synthèse de cette protéine est induite pendant la croissance dans les macrophages et
in vitro en réponse au peroxyde d’hydrogène, à la chaleur et au choc osmotique.
15
Des facteurs de sécrétion sont également impliqués dans la virulence et notamment le
système dot/icm (defective for organelle trafficking/intracellular multiplication). C’est le
système de sécrétion le plus important, dédié à faciliter l’infection intracellulaire. Il s’agit
d’un système de sécrétion de type IV. Il est impliqué dans le mécanisme d’inhibition de la
fusion phagosome-lysosome et semble essentiel pour la virulence chez l’animal (Cianciotto,
2001; Zink et al., 2002). Ce système est impliqué dans la virulence et la multiplication
intracellulaire.
1.4. Ecologie des légionelles
Les légionelles sont présentes dans tous les environnements humides. Elles ont été
isolées dans les écosystèmes naturels (eaux de surface, eaux douces (mares, étangs), rivières,
sédiments humides : sol, boues ou les réseaux de distribution d’eaux (chaudes en particulier
où elles sont présentes en grand nombre : eaux thermales,…) (Fliermans et al., 1981; Stout et
al., 1985). Elles sont également retrouvées dans des installations générant des aérosols telles
que les tours aéroréfrigérantes, jaccuzzis, installations de production et de distribution d'
eau
chaude sanitaire (ballons de stockage, réseaux d'
eau, pommeaux de douche, robinets, etc)
dans les établissements recevant du public, les établissements de santé, les établissements
thermaux, les logements collectifs et les maisons individuelles de conditionnement d'
air. Les
sols non humides et les animaux ne sont pas des réservoirs de germes.
Des études environnementales réalisées essentiellement dans des lieux collectifs ont montré
que 37 à 70% des équipements collectifs de distribution d’eau chaude étudiés contenaient des
Legionella, à une concentration variant de 50 à 106 UFC/L ((CSHPF), 2005).
Une autre étude, réalisée en mai 2000 par la DRASS d’Aquitaine et la DDASS de Gironde,
sur la prévalence des Legionella dans les réseaux d’eau des établissements recevant du public
et des établissements de santé a montré que :
- sur l’ensemble des analyses effectuées (930 au total), environ 32% sont positives ;
- 16% des résultats d’analyses sont supérieurs à 1000 UFC/L ;
- 41,8 % des établissements ont au moins une analyse positive ;
- pour les établissements de santé, 34,3% des analyses sont positives et 21,8% des
analyses sont supérieures à 103 UFC/L ;
- pour les établissements recevant du public, 26,8 % des analyses sont positives et 12,5
% des analyses ont des résultats supérieurs à 1000 UFC/L.
16
17
Figure 1 : Cycle de vie de L. pneumophila (d’après (Bitar et al., 2004))
Ces éléments sont représentatifs d’une situation globale alors que certains établissements
n’ont pas mis en œuvre de plan rigoureux d’entretien des installations. Ces chiffres semblent
montrer que la présence des légionelles dans les réseaux est une situation relativement
courante. Il s’agit donc d’être vigilant dans la gestion des réseaux pour maîtriser le risque de
prolifération des légionelles.
Ces différentes installations ont pour point commun de réunir les conditions favorisant le
développement des Legionella et de leur multiplication :
-
Caractéristiques propres aux réseaux : présence de bras morts (eau stagnante),
nature des matériaux (fer, zinc, aluminium, chlorure de polyvinyle (PVC), …), pH
de l’eau compris entre 6,8 et 7,0 (Levi, 2001; Ohno et al., 2003; Stout et al., 1985).
La présence de dépôts de tartre ou de corrosion est un facteur favorisant le
développement des légionelles.
-
Caractéristiques de l’eau : présence de la bactérie plus marquée dans les eaux
minéralisées, avec des hydrogénocarbonates, calcium, magnésium, fer, … Le
carbone organique total tendrait à promouvoir le développement de L.
pneumophila alors que la présence de cuivre aurait une action inhibitrice (Leoni et
al., 2005; States et al., 1985)
-
Température de l’eau inférieure à 50°C : Les sources de contamination par les
bactéries pathogènes les plus souvent incriminées sont les installations dont la
température de l’eau est comprise entre 25 et 42°C (Ohno et al., 2003).
-
La présence de biofilms : des prélèvements effectués sur les biofilms des
installations ont montré leur colonisation par Legionella jusqu’à des concentrations
de 105 UFC/cm2. Ces études montrent que les biofilms représentent un réservoir
important de cette bactérie qui peuvent ensuite être détachés et entraînés avec le
flux.
-
La présence d’autres microorganismes : les légionelles peuvent en outre
coloniser des amibes ou autres protozoaires ciliés dans lesquels elles survivent, se
développent et contaminent le milieu après lyse de leur hôte (Figure 1) (AlbertWeissenberger et al., 2007; Fields et al., 2002).
18
Figure 2 : schéma d’infection d’une amibe par Legionella
(http://www.mgc.ac.cn/VFs/Figures/Legionella/Legionella.png)
19
1.4.1. Interaction avec les amibes
Les légionelles sont les parasites d’au moins 2 espèces de protozoaires ciliés, dont
Tetrahymena, et 13 espèces d’amibes dont Acanthamoeba sp., Didasculus sp., Echinamoeba
sp., Hartmanella sp., Mayorella sp., Naegleria sp., Schizopyrenus sp., Vahlampfia sp. ... qui
ont été isolées de systèmes contaminés par Legionella (Abu Kwaik et al., 1998; Bozue &
Johnson, 1996; Steinert et al., 2002).
Les légionelles, pour survivre, pénètrent dans ces micro-organismes eucaryotes, en
particulier les amibes libres, sont ensuite capables de détourner les systèmes de destruction
habituellement mis en place par ces hôtes pour digérer les bactéries, puis se multiplient dans
des vacuoles (Bozue & Johnson, 1996) (Figure 2). Après 36 à 48 heures d’infection, la
vacuole de phagocytose emplie la quasi-totalité de la cellule hôte et contient un nombre
important de bactéries qui vont être libérées dans l’environnement sous forme d’une vésicule
remplie de légionelles, ou sous forme libre par lyse de l’amibe (Figure 1) (Abu Kwaik et al.,
1998). Les légionelles vont ainsi pouvoir de nouveau coloniser des biofilms, infecter d’autres
amibes ou contaminer l’Homme. Le parasitisme des protozoaires par les légionelles permet
une pollution importante du milieu extérieur.
Dans les vacuoles, les légionelles sont mobiles, elles ont une taille inférieure à la taille
des bactéries cultivées sur les milieux gélosés et elles acquièrent des propriétés particulières
car, après avoir été libérées, elles sont plus résistantes aux conditions environnementales
défavorables (températures élevées, acidité, pression osmotique, biocides, …) et leur pouvoir
infectieux vis à vis des cellules de mammifères est plus important (Abu Kwaik et al., 1998;
Philippe et al., 2006; Thomas et al., 2004).
En plus d’augmenter la virulence des légionelles, les amibes constituent une protection
et leur permettent de survivre pendant de longues périodes lorsque les conditions sont
défavorables comme, par exemple, dans des milieux pauvres en nutriments, des traitements
visant à les éradiquer, etc (Bouyer et al., 2007; Neumeister et al., 2000; Thomas et al., 2004).
Les amibes sont capables d’expulser des vésicules remplies de légionelles dans
l’environnement ; vésicules à l’intérieur desquelles ces bactéries peuvent survivre pendant de
longue périodes (Bouyer et al., 2007).
Il convient de remarquer que L. pneumophila est apte à infecter de nombreux microorganismes eucaryotes ce qui pourrait expliquer que cette espèce soit largement répandue.
L’adaptation vis-à-vis des eucaryotes, quant à elle, pourrait expliquer le fait que L.
pneumophila soit l'
espèce la plus fréquemment impliquée dans les infections de légionelles
chez l'
Homme.
20
1.4.2. Colonisation des biofilms
Les biofilms sont des communautés de microorganismes enchassées dans une matrice
d’exopolymères (Costerton et al., 1994; Donlan, 2002).
Cette communauté peut être constituée de bactéries, de champignons, de protozoaires
tels que les amibes, d’algues et d’autres organismes procaryotes ou eucaryotes.
Certaines souches du genre Legionella, dont L. bozemanii et L. pneumophila, sont
capables de former des biofilms mono-espèces ou de coloniser des biofilms multi-espèces
(Declerck et al., 2007; Fields et al., 2002; Murga et al., 2001; Rogers et al., 1994; Steinert et
al., 2002). Ces biofilms peuvent fournir aux légionelles une protection vis-à-vis des
agressions extérieures, notamment au cours de la désinfection (Green, 1993; Green & Pirrie,
1993; Murga et al., 2001; Rogers et al., 1994).
Ils peuvent également être le siège de la multiplication de ces bactéries, mais il
semblerait que les légionelles nécessitent la présence d’amibes telles que Hartmanella
vermiformis ou Acanthamoeba castellanii pour pouvoir s’y multiplier (Declerck et al., 2007;
Kuiper et al., 2004; Murga et al., 2001). Récemment, il a été montré que Legionella était
capable d’utiliser les cellules bactériennes mortes des biofilms comme source de nutriments
pour se multiplier (Temmerman et al., 2006).
1.5. Cycle de vie de L. pneumophila
Dans l’environnement, le cycle de vie de L. pneumophila consiste en au moins deux
phases (Molofsky & Swanson, 2004) (Figure 3).
Figure 3 : Cycle de vie de L. pneumophila (Molofsky & Swanson, 2004)
21
Figure 4 : Expression des phénotypes pendant les phases de réplication (A) et de
transmission (B) (Molofsky & Swanson, 2004)
22
1.5.1. La phase de réplication
Associée à la phase exponentielle de croissance, elle est rencontrée quand les
conditions du milieu sont favorables à la croissance (Figure 3). Pendant cette phase, les gènes
de virulence sont peu exprimés, la bactérie se multiplie mais est plus sensible aux stress
environnementaux (Figure 4A).
Pendant cette phase, au cours de laquelle les nutriments sont abondants, le régulateur
post-transcriptionnel CsrA (Carbon Storage Regulator A) est exprimé et joue un rôle
important dans l’activation de la réplication et la répression de la phase de transmission
(Molofsky & Swanson, 2003). En effet, ce régulateur, en réprimant le facteur sigma
flagellaire FliA de façon directe ou indirecte via le facteur sigma RpoN (sigma 54) et/ou
FleQ, va aussi réprimer les caractéristiques et les traits de virulence qui sont associées à la
phase de transmission, c'
est-à-dire : la production de flagelles, l’évasion de la fusion
phagosome-lysosome et la cytotoxicité. Il va également réprimer la résistance aux stress
environnementaux et l’évasion de l’endosome (Molofsky & Swanson, 2003).
1.5.2. La phase de transmission
Associée à la phase stationnaire, elle est exprimée lorsque le milieu devient
défavorable à la croissance (peu de nutriments). Pendant cette phase, L. pneumophila ne se
réplique pas mais certains caractères, dont les gènes de virulence, sont exprimés de façon à
augmenter la résistance aux stress environnementaux.
Le passage de L. pneumophila de la forme réplicative à la forme transmissive fait
intervenir des réactions en cascade impliquant différents médiateurs : ppGpp, LetA/LetS,
RpoS, FliA et LetE (Figure 4B).
Lorsque le milieu devient pauvre en nutriments, la diminution de la quantité d’acides
aminés stimule la production de l’« alarmone » ppGpp (guanosine 3’, 5’-bipyrophosphate), un
second messager (synthétisé par l’enzyme RelA et l’hydrolase/synthase SpoT) qui coordonne
l’entrée dans la phase de transmission avec induction des caractères qui y sont associés
(Hammer & Swanson, 1999).
L’augmentation de ppGpp induit, entre autres, l’activation du facteur sigma RpoS
( S/
38
) qui, à son tour, active d’autres gènes. L’ensemble de ces phénomènes conduit à une
augmentation de la sensibilité de la bactérie vis-à-vis du sodium, la mobilité et la capacité
d’évasion de la fusion phagosome-lysosome (Bachman & Swanson, 2001).
23
En parallèle, une autre voie RpoS-indépendante est activée par le ppGpp : elle fait
intervenir le système à deux composantes LetA/LetS et le regulon LetE, qui répriment le
régulateur post-transcriptionnel CsrA via CsrB. Ainsi CsrA ne peut plus réprimer le facteur
sigma flagellaire FliA, RpoN (sigma 54) et/ou FleQ. Ceci entraîne l’activation des caractères
de résistance aux stress environnementaux, la mobilité, la cytotoxicité et l’évasion de
l’endosome et du lysosome (Bachman & Swanson, 2004; Molofsky & Swanson, 2004).
La bactérie en phase de transmission, pourra infecter un macrophage et y persister
plusieurs jours sans se répliquer (Molofsky & Swanson, 2003). Par contre, si les bactéries
ingérées sont en phase réplicative, elles seront plus sensibles aux systèmes de destruction de
cet hôte et seront plus facilement détruites.
1.5.3. La forme MIF (Mature Intracellular Form)
Lorsque L. pneumophila est cultivée dans des cellules HeLa, les amibes ou les
macrophages, elle peut être présente sous deux formes : la forme réplicative (décrite dans le
paragraphe 1.5.1) et, après des cultures prolongées, une forme morphologiquement distincte
ressemblant à un kyste : la forme MIF (Mature Intracellular Form) (Garduno et al., 2002).
Sous cette forme, la bactérie se présente sous la forme d’un bâtonnet court avec une paroi très
épaisse lui donnant un aspect de kyste, possède un métabolisme réduit et plusieurs traits
communs avec les cellules en phase stationnaire de croissance en milieu liquide comme la
composition de la membrane externe.
Cependant, les légionelles sous la forme MIF possèdent plus de protéines, dont Hsp60 (qui
sert d’invasine dans les cellules HeLa), dans leur membrane externe que les cellules en phase
stationnaire et expriment un marqueur de transition entre la forme réplicative et la forme
MIF appelé protéine MagA (MIF-associated gene), de fonction inconnue mais ressemblant
aux alkylhydroperoxide reductases (AhpC), suggérant un rôle possible dans la protection visà-vis des stress oxydants (Hiltz et al., 2004).
Ces légionelles sont également 10 fois plus infectieuses que les cellules en phase stationnaire,
plus résistantes à certains antibiotiques et détergents et tolèrent des gammes de pH élevés.
Cette forme ne semble être rencontrée que lors d’infection de cellules eucaryotes et est
supposée être une forme transmissive de L. pneumophila dans l’environnement.
24
2. L’ETAT VIABLE NON CULTIVABLE (VBNC)
2.1. Définition
Le cycle de vie bactérien comprend deux parties : l’étape de croissance et l’étape de survie.
La capacité des bactéries à survivre dans les environnements hostiles est essentielle pour leur
persistance.
Lorsque les conditions de l’environnement sont défavorables, les bactéries sporulantes
(telles que Bacillus, Clostridium, Sporosarcina) produisent des structures particulières : les
endospores. Ces cellules dites « dormantes », particulièrement résistantes à la chaleur, aux
UV, aux agents chimiques ou encore la dessiccation, peuvent maintenir leur viabilité pendant
de longues périodes, attendant des conditions favorables pour germer.
Certaines bactéries non-sporulantes, quant à elles, utilisent d’autres voies lorsqu’elles
sont exposées à des conditions hostiles. Elles sont capables d’entrer dans un état « végétatif »
en modifiant leur métabolisme. Cet état est souvent référencé comme un état « viable non
cultivable » (VBNC) (Yamamoto, 2000). Il a été décrit pour la première fois chez Vibrio
cholerae (Xu & al., 1982).
Les bactéries à l’état VBNC sont incapables de cultiver sur les milieux de culture
conventionnels mais possèdent néanmoins une activité métabolique (Yamamoto, 2000).
Cet état est complexe et sa définition très controversée. En effet, cette définition
s’applique à deux états physiologiques différents et peut correspondre à des bactéries :
-
potentiellement réplicatives c'
est-à-dire pouvant retrouver leur capacité à cultiver si
des conditions spécifiques sont rencontrées ; ce qui conduit à la « ressuscitation »
ou « réveil » des cellules (McDougald et al., 1998). Ce réveil est la démonstration
de l’existence d’un l’état VBNC chez l’espèce bactérienne considérée. Dans ce
cas, l’état VBNC constituerait donc une stratégie de survie vis-à-vis des conditions
défavorables de l’environnement (Colwell, 2000).
-
en phase de transition, de la vie vers la mort cellulaire, dans laquelle ces bactéries
possèdent encore des signes d’activité métabolique et de respiration mais se
dégradent progressivement (Yamamoto, 2000).
25
Des transformations cellulaires telles que la réduction de la taille des cellules, la
diminution de la quantité d’ARN, la condensation du cytoplasme, l’incapacité à se multiplier
ou encore la réduction de l’activité métabolique caractériseraient cet état VBNC (Byrd, 2000;
McDougald et al., 1998; Tangwatcharin et al., 2006).
Cet état survient majoritairement dans la phase de survie, après la phase stationnaire.
Plus de 60 espèces bactériennes sont décrites comme étant capables d’entrer à l’état VBNC,
incluant de nombreux pathogènes humain, Gram positifs (Listeria monocytogenes,
Enterococcus, Micrococcus luteus, …) et Gram négatifs (E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio
vulnificus,
Legionella
pneumophila,
Campylobacter
jejuni,
Salmonella
enterica,
Pseudomonas, Helicobacter pylori, …) (Tableau 1) (Oliver, 2005). Cet état intervient lorsque
ces microorganismes sont exposés à différents stress comme la diminution de la quantité de
nutriments disponibles, la température, la salinité, la teneur en oxygène, etc (Gauthier, 2000).
Tableau 1 : Conditions de formation et réveil de VBNC chez différentes bactéries
(Kell et al., 1998)
26
Suite du tableau 1 (Kell et al., 1998)
27
2.2 L’état VBNC chez L. pneumophila
Différentes études ont pu montrer que L. pneumophila était capable de former des
VBNC dans diverses conditions et d’être revivifiées (c'
est-à-dire retrouver leur caractère
cultivable) par différents procédés dont la co-culture avec des protozoaires (Tetrahymena
pyriformis GL, A. castellanii, A. polyphaga).
Les températures élevées, les pH extrêmes (Ohno et al., 2003), la faible quantité de
nutriments (Paszko-Kolva et al., 1992; Yamamoto et al., 1996) ou encore les traitements
oxydants (Bej et al., 1991; Garcia et al., 2007; Huq et al., 2003) ont été rapportés comme
pouvant induire la formation de VBNC chez cette bactérie (Tableau 2).
Tableau 2 : Différentes conditions induisant l’état VBNC chez L. pneumophila
L. pneumophila Strain
Stress condition
Serogroup 1
(Philadelphia, Stafford
62210)
Bloomington
(serogroup 3)
- Environnmental strain
(GIFU 11041)
- Clinical (GIFU 9888)
- Avirulent mutant
(GIFU 11940)
Starvation in tap water,
4°C and 37°C
Chlorine treatment
(100 ppm, 1h)
Methods used to prove
the VBC state
Yolk sac chick embryo
Respiratory activity
Authors
(Hussong et al., 1987)
(Bej et al., 1991)
Ultra pure water
(37°C, 35d)
- Esterase activity
- protozoa ciliated
(Tetrahymena pyriformis
GL)
(Yamamoto et al., 1996)
Philadelphia JR 32
Sterilized tap water
(20°C, 125d)
(Steinert et al., 1997)
Suzuki (sérogroupe 1)
Hot water with high
mineral content
(pH 5, 15d)
- Acridine Orange Direct
Count (AODC)
- Amoeba
(Acanthamoeba
castellanii)
Suzuki (sérogroupe 1)
Tap water
(42°C, 65d)
Various serogroup 1
NaOCl treatment
28
- Membrane integrity
(BacLight)
- Membrane integrity
(BacLight)
- Amoeba
- Acanthamoeba
polyphaga
(Ohno et al., 2003)
(Ohno et al., 2003)
(Garcia et al., 2007)
2.2.1. Carence en nutriments
Cette condition d’induction de l’état VBNC a fait l’objet d’un grand nombre d’études
(Tableau 2).
L’état VBNC a été décrit pour la première fois chez différentes souches de Legionella
pneumophila serogroupe 1 en 1987, suite à la découverte, dans des échantillons provenant du
Stafford District General Hospital très peu de temps après une épidémie de légionellose, de
légionelles non détectées sur milieu gélosé mais détectées grâce à une méthode de comptage
direct utilisant des anticorps fluorescents (DFA) (Hussong et al., 1987). Cette équipe a
supposé que ces bactéries, à l’image de ce qui avait été découvert chez Vibrio cholerae en
1985, devaient être à l’état viable non cultivable (Colwell et al., 1985). Par conséquent, ils ont
étudié la croissance et la survie de deux souches de L. pneumophila (Philadelphia et Stafford
62210) dans de l’eau du robinet à 4°C et/ou 37°C. Il s’est avéré que ces bactéries devenaient
non cultivables après 74 et 40 jours à 4°C et 37°C respectivement mais étaient toujours
fortement détectées par les anticorps fluorescents et semblaient toujours viables. Des tests
d’infection d’œufs embryonnaires de poulet ont montré que ces bactéries étaient capables de
retrouver leur capacité à cultiver sur milieu gélosé mais que la virulence de ces bactéries à
l’état VBNC était, cependant, réduite envers ces œufs embryonnaires par rapport aux cellules
cultivables.
Dix ans plus tard, Steinert et al. (1997), en réalisant une expérience similaire à celle de
Hussong et al, ont montré que des légionelles incubées dans de l’eau du robinet stérile à 25°C
pendant 125 jours perdaient la capacité à former des colonies sur milieu gélosé (<1 UFC/mL);
mais possédaient encore une activité métabolique (acridine orange). Ces mêmes cellules cocultivées à 37°C avec Acanthamoeba castellanii, protozoaire largement répandu dans
l’environnement, ont retrouvé leur capacité à cultiver sur milieu gélosé après 24 H
d’incubation.
2.2.2. Influence de la température
La température de l’eau est sans doute un des paramètres les plus importants gouvernant la
présence de Legionella puisqu’elle influence à la fois sa multiplication et sa survie. En effet, il
est admis que cette bactérie se multiplie dans le milieu hydrique à des températures comprises
entre 25°C et 42°C et qu’elle a la capacité d’y survivre entre 6 et 66°C (Fliermans et al.,
1981; Wadowsky et al., 1985). Lorsque la température atteint des valeurs supérieures à 40°C,
la quantité de bactéries cultivables diminue de façon importante en fonction du temps
29
d’incubation bien qu’une activité métabolique soit maintenue (Ohno et al., 2003; Wadowsky
et al., 1985).
2.2.3. Influence de la teneur en oxygène dissous
Les légionelles sont des bactéries aérobies ; elles exigent pour leur croissance la présence
d’oxygène à une teneur supérieure à 2,2 mg/l.
Legionella pneumophila ne se multiplie que dans des conditions aérobies (6,0 à 6,7 mg/l
d’oxygène dissous) (Wadowsky et al., 1985). Dans ces conditions, la population bactérienne
augmente de 1 log après 7 jours d’incubation à 35°C. Par contre, pour des teneurs moins
élevées en oxygène (1,7 à 2,2 mg/l d’oxygène dissous), aucune multiplication n’a pu être
observée ; au contraire, à partir de 7 jours d’incubation à 35°C à ces teneurs, la population
bactérienne diminue de 0,5 log, puis de 1,7 log au bout de 28 jours.
2.2.4. Influence du pH
La croissance de Legionella, dans l’eau potable, a été observée à des pH compris entre 5,5 et
9,2 avec un optimal à pH 6,9 (Wadowsky et al., 1985).
Les travaux menés par Ohno et al. en 2003, ont montré qu’il existait une relation entre la
température et le pH pour la survie de cette bactérie : plus le pH s’éloigne de la neutralité et
moins la survie est importante, et pour un pH donné, la survie baisse quand la température
s’élève. Par exemple, à pH 10,0 à 42°C, les légionelles perdent rapidement à la fois leur
cultivabilité et leur activité métabolique (les bactéries sont tuées) alors qu’à pH 5,0 à la même
température, la cultivabilité est perdue mais l’activité métabolique est maintenue pendant au
moins 61 jours (les bactéries sont dans un état VBNC). A pH 6,0 et 8,0, à la même
température, la cultivabilité est lentement perdue.
2.2.5. Influence de la salinité
Des travaux portant sur l’effet conjugué de la salinité et de la température sur la croissance de
L. pneumophila ont montré que pour des températures comprises entre 4 et 20°C, les
variations de concentration de sels ont peu d’influence sur Legionella (Heller et al., 1998). En
réalité, sur cette gamme de température, Legionella peut survivre dans des solutions allant
jusqu’à 3% de salinité.
Par contre, pour des températures plus élevées, une corrélation a été observée entre
l’augmentation de la concentration en NaCl et la réduction du nombre de cellules. Par
30
exemple, pour des températures de 30°C et 37°C, les fortes concentrations en sels
(supérieures à 1,5%) provoquent une forte diminution du nombre de cellules.
Cependant, dans cette étude, aucun marqueur de viabilité n’a été utilisé. Par conséquent, il est
difficile de savoir si les bactéries non cultivables étaient des VBNC.
2.2.6. Traitements oxydants
De nombreuses études ont été menées sur l’impact des traitements (chlore, chaleur, ozone,
UV, monochloramine) sur L. pneumophila (Chang et al., 2007; Cunliffe, 1990; Green &
Pirrie, 1993; Kool et al., 1999; Muraca et al., 1987). La plupart d’entre elles, basées
simplement sur des analyses de cultivabilité, montre une action efficace des traitements sur la
réduction et l’inactivation des légionelles (Cunliffe, 1990; Flannery et al., 2006; Green &
Pirrie, 1993; Kool et al., 1999; Kuchta et al., 1983; Muraca et al., 1987).
Cependant, Bej et al. (1991), en utilisant un marqueur de viabilité en complément des
méthodes de culture sur milieu gélosé, ont montré que des traitements au chlore utilisés pour
désinfecter des tours aéroréfrigérantes étaient capables d’induire la production de bactéries
viables non cultivables.
Récemment, Garc a et al. en 2007, ont mené une étude sur sept souches de L. pneumophila
cliniques et environnementales traitées par 256 mg/L d’hypochlorite de sodium (NaOCl) dans
du milieu BYE. Cette étude a montré que des souches qui n’étaient plus cultivables 22 à 46
heures après le traitement par le NaOCl étaient capables de retrouver leur capacité à se
multiplier après avoir été mis en présence d’Acanthamoeba polyphaga. Ce qui confirme la
présence de VBNC après traitement NaOCl.
2.3 Analyse de l’état VBNC
A notre connaissance, aucun travaux portant sur une analyse moléculaire approfondie de l’état
VBNC chez Legionella n’est à l’heure actuelle disponible dans la littérature.
Cependant, ce type d’analyse a été entrepris pour l’étude de l’état VBNC chez d’autres
bactéries, telles que Enterococcus feacalis, Vibrio cholerae, Escherichia coli O157 :H7,
Lactobacillus, en utilisant une approche protéomique ou transcriptomique (Asakura et al.,
2007a; Asakura et al., 2007b; De Angelis & Gobbetti, 2004; Heim et al., 2002).
31
Heim et al. (2002) ont étudié les variations du protéome chez E. faecalis à l’état
VBNC après une incubation de 20 jours dans de l’eau de lac à 4°C. Ils ont montré que les
bactéries en carence nutritionnelle mais cultivables et à l’état VBNC présentaient des profils
différents. Ces profils différaient également de celui des bactéries en phase exponentielle de
croissance.
Dans cette étude, une analyse protéomique partielle a montré une diminution de la quantité
de certaines protéines importantes durant l’état VBNC :
- deux protéines de stress, GroEL et DnaK ;
- la fructose biphosphate aldolase, protéine clé dans la voie de la glycolyse,
l’enolase (glycolyse), l’ATP synthase (phosphorylation oxydative) et l’enoyl-ACP
reductase (biosynthèse des phospholipides), une protéine homologue au système
mannose-specific phosphotransferase (PTS) de Clostridium acetobutylicum, le
facteur d’élongation EF-Tu, impliqué dans la synthèse protéique, la régulation de la
croissance et la réponse au stress ce qui semble être en accord avec la diminution de
l’activité métabolique observée durant l’état VBNC ;
En revanche, l’accumulation de la quantité de trois protéines est observée dans les cellules à
l’état VBNC :
- une protéine homologue du facteur d’élongation factor Ts (EF-Ts) de Listeria
innocua,
- une protéine homologue de la fructose-bisphosphate aldolase de Streptococcus
pneumoniae,
- une protéine régulatrice de catabolites (putative catabolite regulator protein CRP,
CAA09491).
L’analyse de l’expression de ces trois protéines par RT-PCR (Reverse-Transcriptase
Polymerase Chain Reaction) a montré qu’elles étaient exprimées dans cet état pendant au
moins 14 jours.
Une autre protéine (30 kDa, pI = 6) est observée seulement chez les cellules à l’état VBNC.
Cette protéine n’a pas pu être identifiée mais il est possible qu’elle corresponde à une forme
modifiée de l’enoyl-ACP reductase, cette hypothèse provenant de la comparaison des gels 2D
obtenus à partir de différents états cellulaires.
La comparaison des profils 2D obtenus à partir des différents états cellulaires (carence
nutritionnelle, VBNC et phase exponentielle) montre une certaine spécificité pour l’état
VBNC. L’enoyl-ACP reductase est réprimée dans l’état VBNC mais aussi en carence
32
nutritionnelle, ce qui n’est pas le cas du facteur d’élongation EF-Ts, de la fructose
biphosphate aldolase et de la mannose-specific PTS dont la variation de synthèse
(amplification ou réduction) semble spécifique de l’état VBNC.
Pour Escherichia coli O157 :H7, une perte totale de cultivabilité est observée après 48
heures d’incubation dans du tampon phosphate (PBS) contenant 0,05 % de peroxyde
d’hydrogène (H2O2), alors que 11 % de la population possèdent encore une intégrité
membranaire. Une incubation de 72 heure conduit à une réduction importante du nombre de
cellules à membrane intègre (0,4 %) (Asakura et al., 2007b). Le facteur d’élongation EF-Tu,
qui était sous-exprimé chez E. faecalis (Heim et al., 2002), voit son expression maintenue
chez E. coli. Ceci laisse supposer un maintien de la synthèse protéique chez cette bactérie
(Asakura et al., 2007b). Une accumulation importante de la quantité d’une protéine de la
membrane externe, OmpW, a été observée dans l’état VBNC. Cette protéine, bien que
possédant une fonction inconnue, pourrait être une protéine de réponse à l’oxydation par le
H2O2.
Une accumulation de la quantité d’homosérine kinase (ThrB), impliquée dans la biosynthèse
de la thréonine, est également observée à l’état VBNC.
Parmi les protéines dont la synthèse est diminuée après 48 heures d’incubation dans l’H2O2,
on retrouve des facteurs de réponse au stress oxydatif : l’Alkyl hydroperoxide reductase
(AhpCF) et la Dihydrolipoyllysine-residue Acetyltransferase (AceF).
L’analyse transcriptomique de Vibrio vulnificus à l’état VBNC suite à un stress à 4°C
dans une eau de mer artificielle pendant 70 jours, a permis de mettre en évidence l’induction
et la répression de centaines de gènes par rapport aux cellules en phase stationnaire (Asakura
et al., 2007a). Ces gènes ont été classés suivant leur fonction : Synthèse protéique,
métabolisme énergétique, enveloppe cellulaire, processus cellulaires, fonction régulatrice,
synthèse d’acides aminés, protéines de transport,…
Parmi les gènes sur exprimés à l’état VBNC, on retrouve des gènes codants pour :
-
des protéines de transport de métaux : fer, magnésium, potassium et cobalamine
(vitamine B12)
-
des protéines impliquées dans la chimiotaxie (qui est le mouvement des cellules
vers ou loin d'
une substance en réponse à son gradient de concentration : ceci est
important pour la recherche de la nourriture, fuir les toxiques, …)
33
-
des protéines associées au flagelle (flaC : qui code pour un composant intervenant
dans l’assemblage du filament, fliG codant pour une protéine moteur) alors que le
gène fliN codant pour une protéine impliquée dans la rotation du flagelle et
nécessaire pour la formation du crochet est sous exprimé dans cet état
-
protéines associées à l’enveloppe : PilQ impliquée dans l’assemblage du pili de
type IV, la lipoprotéine NlpL, une « outer membran protein »de transport de
nitrate/sulfonate/bicarbonate de type-ABC et une UDP-glucose-6-dehydrogénase
-
une chitinase jouant un rôle majeur dans l’utilisation de la chitine par la bactérie
Nous pouvons constater, au regard des résultats obtenus, que les protéines dont la synthèse est
augmentée à l’état VBNC chez ces différentes bactéries semblent différentes. L’état VBNC
étant obtenu dans des conditions différentes, il est possible que l’expression du protéome ou
du transcriptome des bactéries soit fonction des conditions conduisant à l’état VBNC, du
temps passé dans cet état ou encore de l’espèce bactérienne.
34
Figure 5 : Alignement partiel de séquences en acides aminés de Rpfs chez les
mycobactéries. (Zhu et al., 2003) (MluZ96935 est la Rpf de M. luteus ; Rv0867c, Rv1009,
Rv1884c, Rv2450c sont des protéines de M. tuberculosis ; ML0240 and ML2030, de M. leprae ; Av27
de M. avium contig27 ; Mptb de M. avium subsp. paratuberculosis contig1289 ; MS3310 et MS3312
de M. smegmatis. Les cadres en grisé indiquent des résidus identiques et les lettres encadrées des
résidus similaires).
Tableau 3 : Séquence en acides aminés de différentes Rpfs (Schroeckh & Martin, 2006)
35
3. UN NOUVEAU FACTEUR DE RESSUCITATION :
LA PROTEINE Rpf (Resuscitation-promoting-factor)
3.1. Rpf chez les bactéries Gram positives :
En 1994, Votyakova et al., ont observé que des cultures de Micrococcus luteus,
devenues non cultivables après être restées en phase stationnaire prolongée (3 à 6 mois),
étaient capables de retrouver leur capacité à cultiver sur milieu gélosé après avoir été mises en
présence d’un surnageant de M. luteus prélevé en fin de phase exponentielle (Votyakova et
al., 1994).
Les premiers travaux réalisés à partir d’un surnageant de M. luteus ont permis d’isoler
et caractériser une protéine de 17 kDa. Cette protéine, nommée Rpf (Resuscitation-promoting
factor), est capable de réveiller des cultures de M. luteus non cultivables à très basses
concentrations (de l’ordre du picomolaire) et est nécessaire pour la croissance du
microorganisme en milieu minimum (Mukamolova et al., 1998a; Mukamolova et al., 1998b).
Le gène rpf semble nécessaire au microorganime, car un mutant rpf ne peut pas être obtenu, à
moins qu’une seconde copie fonctionnelle du gène rpf soit présente sur un plasmide
(Mukamolova et al., 1998a).
Ce facteur, bien que produit chez M. luteus, a aussi la capacité de stimuler la
croissance de mycobactéries (Mukamolova et al., 1998a). Rpf est le premier facteur de
croissance bactérienne qui ait été identifié.
La comparaison de la séquence primaire de Rpf avec les bases de données accessibles
en ligne a permis de mettre en évidence l’existence de gènes rpf chez d’autres actinomycètes
tels que Mycobacterium tuberculosis (5 rpf) et M. leprae (2 rpf), Corynebacterium
glutamicum, plusieurs espèces de Streptomyces (Mukamolova et al., 1998a; Zhu et al., 2003),
Brevibacterium ou encore Rhodococcus (Schroeckh & Martin, 2006) (Figure 5 et Tableau 3).
Contrairement à M. luteus, qui ne possède qu’un gène rpf, la plupart de ces
microorganismes en possèdent plusieurs (Ravagnani et al., 2005) (Tableau 4).
36
Tableau 4 : Organismes possédant des gènes rpf-like (Ravagnani et al., 2005).
Chez M. tuberculosis par exemple, les cinq gènes (rpf A, B, C, D et E) sont exprimés
lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance. Les cinq protéines Rpfs
stimulent la croissance de M. luteus, Mycobacterium smegmatis et M. bovis à des
concentrations de l’ordre du picomolaire.
L’inactivation d’un seul de ces cinq gènes, quelqu’il soit ( rpf A, B, C, D ou E), ne conduit à
aucune différence de croissance in vitro et in vivo de survie à long terme ou de capacité à
réveiller les VBNC par rapport à la souche sauvage (Downing et al., 2004; Downing et al.,
2005). La perte d’un de ces gènes affecte néanmoins l’expression d’un grand nombre de gènes
(groEL 1 et 2, groES, cspA, etc…) chez la bactérie. L’inactivation de trois gènes sur cinq
( rpfA rpfC rpfB ou rpfA rpfC rpfD), quant à elle, conduit à une réduction important
de la virulence in vivo, empêche le réveil des VBNC et altère la croissance à long terme du
microorganisme (Downing et al., 2005).
Ces cinq gènes sont individuellement dispensables pour la croissance, la survie du
microorganisme et le réveil des VBNC mais ils sembleraient tout de même jouer un rôle
collectif pour permettre le réveil des VBNC.
Toutes les protéines testées jusqu’à présent montrent, à basses concentrations (de
l’ordre du picomolaire), une activité croisée entre les espèces produisant des Rpfs. Par
exemple, des essais réalisés avec des protéines produites par R. fascians, A. globiformis et M.
luteus ont montré qu’elles étaient capables de réveiller M. luteus à l’état de dormance. Par
contre, des tests effectués avec R. rhodochrous, R. fascians et M. luteus ont montré un effet
stimulant des Rpf produites par les 3 espèces sur les deux Rhodococcus, alors que M. luteus
ne peut être ressuscité que par son propre surnageant.
37
3.2. Rpf chez les bactéries Gram négatif
Asakura et al. (2002) ont montré que Salmonella enterica serovar Oranienburg
Sa99004 entre dans un état VBNC après 24 heures, à 4°C, dans une solution de NaCl à 7%.
L’addition de surnageant de S. Oranienburg en phase exponentielle de croissance permet de
revivifier ces cellules dormantes. Il a été suggéré que les bactéries en phase exponentielle
sécrétaient une molécule permettant la ressuscitation sous forme soluble (Asakura et al.,
2002).
La disponibilité de la séquence du génome de Salmonella a permis la recherche d’un
gène rpf au sein de ce genre. Un tel gène rpf, possèdant une homologie en nucléotides et en
acides aminés de 44,8 % et 24,2 % respectivement avec le gène rpf de M. luteus, a été
identifié chez Salmonella Typhimurium LT2 (Panutdaporn et al., 2006). Ce gène possède 99,4
% d’identité en nucléotides et une similarité de 99,6 % en acides aminés avec le gène
homologue de S. Oranienburg.
Le gène rpf a été cloné et la protéine produite et purifiée. La capacité de « réveil » de
la protéine recombinante rRpf (25 kDa) a été étudiée sur une population non cultivable de S.
Oranienburg, mais possédant 76% de cellules viables (déterminé par BacLight), obtenue après
incubation pendant 3 jours, à 37°C, dans une solution de NaCl à 7%.
Après 7 jours à 30°C, un retour à la cultivabilité a été observé pour les cellules
exposées à des doses supérieures ou égales à 0,01 µg/mL de rRpf alors que les cellules qui
n’ont pas été mises en contact avec cette protéine recombinante restent non cultivables. Cette
réponse semble dose dépendante, puisque plus la quantité de protéines rRpf ajoutée est
importante, plus le nombre de cellules cultivables observé est élevé. De plus, cette activité est
inhibée en présence d’anticorps anti-rRpf.
38
39
Figure 6 : Comparaison de RpfBc avec d’autres glycosides hydrolases (Cohen-Gonsaud et al., 2005)
(a) superposition de la structure de RpfBc (rouge) et du lysozyme de type c (bleu)
(b) superposition de la structure de RpfBc (rouge), de Slt 35 (gris) et Slt 70 (vert)
3.3. Structure et mode d’action
Le mécanisme d’action de cette protéine est encore mal connu mais différentes hypothèses ont
été émises.
Il a tout d’abord été supposé que les protéines Rpfs se comportaient comme des
cytokines en se liant à des récepteurs entraînant la croissance (Mukamolova et al., 1998a).
Mais jusqu’à présent aucun récepteur n’a pu être identifié.
L’observation de la séquence et de la structure de ce facteur de croissance a permis de
mettre en évidence l’existence d’un domaine conservé de 70 résidus commun à toutes les
protéines Rpf-like : le domaine Rpf (Cohen-Gonsaud et al., 2004; Mukamolova et al., 2002).
Ce dernier est à la fois nécessaire et suffisant pour l’activité biologique.
La figure 7 montre que la structure adoptée par ce domaine fonctionnel (en rouge sur les
Figure 6 a et b) présente des homologies avec la structure repliée de glycoside hydrolases
clivant le peptidoglycane : le lysozyme de type c (en bleu sur Figure 6. a) et deux
transglycosidases lytiques solubles (SLT) : Slt35 (en gris sur Figure 6. b) et Slt 70 (en vert sur
Figure 6 b) (Cohen-Gonsaud et al., 2005).
Cette protéine Rpf possède un site glutamate catalytique (Glu292), se trouvant à la
même position que celui du lysozyme (Glu35) et de Slt35 (Glu162) et Slt 70 (Glu478), qui
joue un rôle critique dans le phénomène de réveil des VBNC puisque l’absence de ce site
entraîne une suppression de l’activité de réveil de Rpf.
Telkov et al. en 2006 ont montré que la protéine Rpf était capable d’hydrolyser les liaisons
1-4 du peptidoglycane et que le résidu glutamate Glu54 (conservé chez toutes les Rpf) et
deux résidus cystéine Cys53 et Cys114, qui forment un pont dissulfure chez Rpf, sont
impliqués dans cette catalyse. Cette activité enzymatique fait des Rpfs des peptidoglycane
hydrolases et probablement des transglycosidases lytiques.
La réaction d’hydrolyse du substrat semble optimale à pH 6 et est activée par l’ajout
de sels de magnésium et de calcium. Par contre, elle est fortement inhibée en présence de sels
de zinc (Telkov et al., 2006).
Remarque : Chez les microcoques, il existe un autre domaine lysozyme-like : le domaine
LysM de 40 résidus impliqué dans la liaison au peptidoglycane mais ce domaine LysM ne
semble pas nécessaire l’activité biologique.
40
Le mécanisme de réveil reste néanmoins inconnu mais il est supposé que le réveil des VBNC
nécessite une modification de l’enveloppe bactérienne.
Un grand nombre de questions reste encore sans réponse :
-
Quelle est la nature du signal généré par Rpf ?
-
Comment le signal est-il transmis ou détecté par les cellules ?
-
Existe-t-il un récepteur de surface pour tous les produits générés par Rpf ou
entrent-ils de façon passive dans les cellules ?
-
Comment se passe l’arrêt de la croissance chez les bactéries à l’état VBNC ?
S’agit-il d’un blocage de la division cellulaire ou de la réplication de l’ADN ?
-
Quelles sont les signaux conduisant à l’action de Rpf ?
Ce dont on est sûr, c’est que la fonction de ces protéines Rpf montre que l’état VBNC pour les
bactéries Gram positif et négatif testées est bien une stratégie de survie.
En ce qui concerne L. pneumophila et les autres bactéries Gram négatif, aucun facteur
rRpf n’a encore été découvert. Les seuls outils actuellement connus et utilisés pour le réveil
de L. pneumophila à l’état sont deux amibes du genre Acanthamoeba : A. castellanii et A.
polyphaga, un protozoaire cilié : Tetrahymena pyriformis GL et l’embryon d’oeuf de poule
(Hussong et al., 1987; Steinert et al., 1997; Yamamoto et al., 1996).
41
CHAPITRE 2 :
MATERIELS ET METHODES
1. Souches microbiennes, conditions de culture et de
conservation
1.1. Legionella pneumophila
Nous avons utilisé la souche L. pneumophila sérogroupe 1 Lens HL 0350 5056 fournie
par le Centre National de Référence des Légionelles (CNRL) de Lyon.
Cette bactérie a été à l’origine de l’épidémie survenue dans le courant de l'
hiver 2003 dans le
Pas-de-Calais, à Lens, avec près de 90 cas constatés et 17 morts.
Les cultures sont isolées et numérées sur gélose Buffered Charcoal Yeast Extract
(BCYE : Annexe 1) et incubées à 37°C, pendant 4 à 5 jours.
Les cultures en milieu liquide sont réalisées en Buffered Yeast Extract (BYE : Annexe 1) à
37°C, 5 % CO2 pendant 5 jours
Pour les numérations, les colonies sont dénombrées sur milieu gélosé BCYE après 5 à 7 jours
à 37°C, 5 % CO2.
Les souches sont conservées dans du bouillon BYE en présence de 30 % de glycérol à -80°C.
1.2. Acanthamoeba castellanii
La souche d’amibe utilisée est Acanthamoeba castellanii ATCC 50739 fournie par M.
Steinert (Wursburg, Allemagne).
Les cultures sont réalisées en bouillon PYG (Peptone Yeast extract Glucose) à 25°C. Pour sa
conservation, la souche est repiquée tous les 7 jours.
42
1.3. Escherichia coli
Les souches utilisées sont E. coli Top 10 et E. coli M15 pREP4.
Les cultures sont réalisées en milieu LB (Luria-Bertani) (Annexe 1), solide ou liquide, à 37°C
sous agitation (250 rpm) sans antibiotiques pour la souche Top 10 et en présence de 25 µg/mL
de kanamycine pour la souche M15 pREP4.
Les souches sont conservées dans leur bouillon en présence de 30 % de glycérol à -80°C.
2. Traitement des bactéries en suspension par la
monochloramine
Les bactéries en phase stationnaire (5 jours, bouillon BYE) sont collectées par centrifugation,
lavées deux fois avec de l’eau ultra pure (EUP) stérile à température ambiante. Les cellules
sont ensuite remises en suspension dans de l’EUP stérile de façon à avoir une suspension
ayant une DO600nm de 1. Cette suspension est traitée par une solution de monochloramine à
des concentrations comprises entre 0 et 20 mg/L pendant 1 heure. Du sulfite de sodium
(Na2SO3) est ensuite ajouté pour arrêter le traitement.
La quantité de sulfite de sodium à ajouter est calculée de la manière suivante :
n moles de Na2SO3 = 1,5 x n moles de NH2Cl de façon à être en excès de sulfite.
Les cellules sont ensuite centrifugées (5000 g, 10 min, 4°C), le culot est remis en suspension
dans du BYE dilué au 1000ème (qui constitue le « milieu de repos ») puis les suspensions
bactériennes ainsi obtenues sont incubées à 25°C pendant plusieurs jours. A cette dilution,
nous obtenons une quantité de carbone organique total (COT) proche de celle présente dans
l’eau du robinet (environ 2 mg/L). Le BYE dilué au millième ne permet pas la croissance de
L. pneumophila (résultats non montrés) ni la formation de biofilms (Hachicha S., 2001).
L’impact du traitement et la survie des légionelles sont estimés par dénombrement des
bactéries cultivables, étude de l’intégrité membranaire (LIVE/DEAD BacLight, Molecular
Probes) et de l’activité enzymatique (Chemchrome V6, Chemunex) et des tests d’infectiosité
vis-à-vis des amibes.
43
3. Traitement thermique
Les bactéries en phase stationnaire (5 jours, bouillon BYE) sont collectées par centrifugation,
lavées deux fois avec de l’EUP stérile puis remises en suspension dans de l’EUP stérile de
façon à obtenir une suspension ayant une DO600nm de 1.
40 mL de ces suspensions sont ensuite incubées pendant 1 heure, sous agitation, dans des
bain-marie à des températures comprises entre 50 et 60°C. Après traitement, les cellules sont
centrifugées (5000 g, 10 min, 4°C), remises en suspension dans du BYE dilué au 1000ème puis
incubées à 25°C pendant plusieurs jours.
L’impact du traitement thermique et la survie des légionelles sont estimés en utilisant les
mêmes méthodes que pour le traitement par la monochloramine (cultivabilité, intégrité
membranaire, activité estérase).
4. Etude de la viabilité des cellules
4.1. Dénombrement des bactéries cultivables sur gélose
100 µL de suspension bactérienne diluée ou non sont étalées sur gélose BCYE- en duplicat
(différentes dilutions sont réalisées pour chaque type d’échantillon). Les géloses sont ensuite
incubées à 37°C dans l’étuve à 5 % de CO2 et les colonies formées sont comptées après 3 à 10
jours.
4.2. Etude de l’intégrité membranaire : LIVE/DEAD® BacLight™
Nous avons utilisé le kit Molecular probes’ LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability
Kits L-7012. Ce kit contient 2 réactifs (A et B) et de l’huile pour le montage entre lame et
lamelle.
Réactif A : Syto 9 dye : 3,34 mM
Réactif B : Iodure de propidium : 20 mM
Le mélange A-B utilisé est constitué des réactifs A et B mélangés à part égale.
Principe
Cette méthode de marquage des bactéries mortes et vivantes est basée sur l’intégrité
membranaire des cellules.
44
Ce kit utilise deux fluorochromes, de masses moléculaires différentes, qui se fixent sur l’ADN
double brin:
-
le Syto9, de faible masse moléculaire, pénètre dans toutes les cellules et émet une
fluorescence verte sous lumière bleue.
-
l’iodure de propidium (IP) ne pénètre que dans les cellules dont la membrane est
suffisamment endommagée. Il émet une fluorescence rouge et masque la
fluorescence du Syto9.
Ainsi, en microscopie à épifluorescence, les cellules viables apparaîtront vertes, et les cellules
mortes, rouges.
Marquage
1 mL de suspension bactérienne est mis en présence de 3 µL de mélange A-B et placé pendant
15 min dans le noir. Cette suspension est ensuite filtrée sur une membrane noire en
polycarbonate de porosité 0,22 µm (Millipore) puis la membrane est rincée deux fois avec 10
mL d’EUP stérile.
La membrane est ensuite placée sur une lame de verre, une goutte d’huile fournie dans le kit
est déposée et le tout est recouvert d’une lamelle. Les lames peuvent ainsi être conservées à 410°C à l’abri de la lumière pendant une semaine avant observation.
Pour l’observation, nous avons utilisé un microscope à épifluorescence Olympus Bx 41(avec
contraste de phase et fluorescence) équipé de filtres d’excitation de longueurs d’onde
comprises entre 430 nm et 490 nm. 20 champs ont été photographiés pour chaque échantillon.
Les bactéries fluorescentes (vertes et rouges) présentes sur chaque photo ont ensuite été
comptées sur le logiciel Photoshop.
Le nombre de cellules est déterminé en utilisant la formule suivante :
N=
Y×A×d
a×v
N : nombre de cellules/mL
Y : nombre moyen de cellules par champs observés
A : surface de filtration utile (surface de la membrane = 3,8 cm2)
d : facteur de dilution
a : surface du champ microscopique observé (soit 0,00038 cm2)
v : volume de suspension filtré (en mL)
45
4.3. Etude de l’activité estérase : CHEMCHROME V6
Nous avons utilisé le kit Chemchrome V6 vendu par Chemunex.
Le ChemChrome V6 est un marqueur de viabilité qui repose sur un brevet Chemunex dont le
principe est de cibler l’activité enzymatique intracellulaire des micro-organismes vivants
(activité cible : estérase). Le critère de viabilité repose sur l’activité enzymatique
intracellulaire et l’intégrité membranaire du micro-organisme.
Principe
Dans le cytoplasme des cellules métaboliquement actives, le substrat initialement non
fluorescent est clivé par une enzyme libérant ainsi un fluorochrome. Seules les cellules
viables avec une membrane intègre ont la capacité de réaliser le clivage et de retenir le
marqueur fluorescent. Ainsi, les cellules vivantes, apparaissant vertes en microscopie à épifluorescence, peuvent être facilement discriminées des cellules mortes, qui ne fluorescent pas.
Marquage
1 mL de suspension bactérienne traitée ou non par la monochloramine sont traités comme
indiqué sur le protocole fourni avec le kit Chemchrome V6 puis observé avec le microscope à
épifluoresence Olympus Bx 41.
4.4. Infection de l’amibe Acanthamoeba castellanii
Afin de déterminer si les bactéries non cultivables sont capables de retrouver leur
cultivabilité, nous avons décidé d’infecter Acanthamoeba castellanii, suite aux travaux de
Steinert et al. (1997) montrant que des VBNC pouvaient être revivifiées.
Préparation des amibes
Les amibes A.castellanii sont mises en culture dans du milieu PYG pendant 3 jours à 25°C
dans des flasques de 70mL (25 cm2) en polystyrène. Après ces 3 jours, le milieu PYG des
flasques est enlevé sans décrocher les amibes qui sont fixées sur le fond. Les cellules adhérées
sont lavées une fois avec du tampon amibes (Annexe 2). Les amibes adhérées sont décrochées
et remises en suspension dans le tampon amibes. Les amibes sont numérées sur une cellule de
Malassez. Ensuite, cette suspension d’amibes est diluée de façon à avoir une concentration de
5.105 amibes/mL.
46
Infection des amibes
0,5 mL de suspensions de légionelles à DO600nm égale à 1 traitées par la monochloramine ou
la chaleur et non cultivables, sont mises en présence de 5 mL de suspension d’Acanthamoeba
castellanii à 5.105 amibes/mL dans des flasques de culture cellulaire de 25 cm2 (BD Falcon,
Réf. 353082, VWR).
Les co-cultures sont ensuite incubées à 37°C pendant 3 jours.
Un contrôle positif a été réalisé incubant 50 µL d’une suspension de légionelles cultivables à
105 UFC/mL avec 5 mL de suspension d’amibes à 5.105 amibes/mL. Cette culture est incubée
de la même façon que les tests précédents.
Après incubation, 500 µL de co-cultures sont centrifugées pendant 5 min à 12000g puis
vortexées pendant 1 min pour favoriser la lyse des amibes. 100 µL de cette suspension sont
étalés sur gélose BCYE en duplicat, puis incubés à 37°C dans l’étuve à CO2 (5%) pendant 4 à
5 jours. L’observation de la présence ou non de colonies sur gélose est ensuite réalisée.
5. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des
bactéries à l’état VBNC
Afin de vérifier que les légionelles à l’état VBNC sont capables de synthétiser des protéines
de novo, nous avons utilisé un mélange de cystéine et de méthionine marquées au S35 (NEG072 Expres35S Protein labelling mix, Perkin-Elmer).
Pour cela, nous avons utilisé des suspensions à 108 L. pneumophila/mL cultivables ou
devenues non cultivables suite à un traitement par 1 mg/L de monochloramine.
40 mL de chacune des suspensions ont été centrifugés (7000 g, 10 min) et le culot a été repris
dans 4 mL de BYE.
1 mL des 2 suspensions ainsi obtenues a été mis en présence de 45 µL de mélange
cystéine/méthionine marqué au S35 pendant 4, 8 et 23 H à 37°C.
Les protéines ont été extraites de la manière suivante :
Les bactéries sont collectées par centrifugation (7000 g, 10 min) et le culot repris dans 100 µl
de Tris-HCl 50 mM-EDTA 20 mM pH 8 auxquels sont ajoutés 12 µl de SDS 20 %. Le
mélange est incubé 10 min à 37 °C, puis centrifugé (7000 g, 10 min). Le surnageant est
collecté. 5,5 µl de ß mercaptoéthanol et 11,5 µl de bleu de bromophénol à 0,1% sont ajouté.
Le mélange est placé 5 min à 100°C, puis centrifugé 5 min à 7000 g.
47
Les protéines extraites sont déposées sur gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate –
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) (Annexe 5) et soumises à une électrophorèse 10 min à
65 mA puis à 45 mA jusqu’à la sortie du bleu du gel.
Le gel a ensuite été séché puis placé dans une cassette pour Phosphorimager Storm
(Amersham Pharmacia Biotech) une semaine à 20°C.
Le support de la cassette a ensuite été analysé à l’aide d’un Phosphorimager Storm 820.
Pour évaluer l’incorporation de la radioactivité dans les échantillons, 6 µL de chaque extrait
protéique ont été ajoutés à 1 mL de solution de scintillation (Packard Instrument) puis
comptés à l’aide d’un compteur Bêta (Packard Instruments).
6. Analyse protéomique
Le terme protéome désigne l’ensemble des protéines exprimées par un génome à un
moment précis et dans un environnement donné. L’analyse protéomique permet de
caractériser et de quantifier les protéines présentes dans des conditions déterminées. Ainsi, le
protéome représente une véritable carte d’identité de l’état phénotypique de l’organisme
étudié. Cette analyse permet de refléter les modifications traductionnelles et posttraductionnelles.
Actuellement, la technique de séparation des protéines par électrophorèse
bidimensionnelle (2D-PAGE) correspond à l’approche protéomique la plus répandue et la
plus accessible. Cette technique commence par une préparation de l’échantillon protéique,
suivie d’une séparation des protéines par 2D-PAGE, protéines qui seront ensuite identifiées
par spectrométrie de masse du type MALDI-TOF.
L’électrophorèse bidimensionnelle (combinaison de deux électrophorèses) est une technique
permettant la séparation de l’ensemble des protéines d’un organisme selon leur point
isoélectrique et leur masse moléculaire.
Dans le cadre de notre travail, nous avons utilisé cette méthode de façon à étudier
l’impact de la monochloramine sur L. pneumophila et observer une éventuelle variation de la
quantité de certaines protéines en fonction du temps après traitement par rapport aux bactéries
non traitées. Nous espérons, par cette technique, pouvoir identifier des protéines spécifiques
de l’état VBNC chez L. pneumophila.
48
6.1. Préparation des échantillons : EXTRACTION DES
PROTÉINES
L’extraction des protéines totales est réalisée à partir de 10 mL de culture de L.
pneumophila Lens (à DO600nm = 1). Les cellules sont centrifugées (10 min, 5000 g, 4°C) et le
culot est lavé deux fois dans 1 mL de tampon de lavage (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 10
mM). Le deuxième lavage est suivi d’une centrifugation de 2 min à 10000 g à 4°C puis les
culots sont remis en suspension 450 µL de tampon de réhydratation (Urée 7,5 M, Thiourée
2 M, DTT 100 mM, CHAPS 4 %, Ampholytes 3-10 0,2 %), mélangés vigoureusement en
utilisant un vortex pendant 2 min et incubés à 30°C pendant 2 heures en vortexant toutes les
15 min.
Les tubes sont ensuite centrifugés à 13000 g, 15°C pendant 30 min, les surnageants sont
ensuite récupérés et stockés à -80°C jusqu’à utilisation.
La concentration protéique des surnageants est déterminée par une méthode basée sur celle de
Lowry (RC DC Protein Assay, Biorad), la BSA étant utilisée comme standard pour réaliser la
droite d’étalonnage.
6.2. Electrophorèse bidimensionnelle : 2D-PAGE
6.2.1. Principe
Cette technique consiste, dans un premier temps, à soumettre les protéines à un champ
électrique dans un gradient de pH. Les protéines vont migrer en fonction de leur charge et
s’immobiliser dans la zone de pH pour laquelle leur charge globale est nulle. Cette étape, ou
première dimension, est appelée focalisation isoélectrique (IEF).
Dans un second temps, ces protéines vont subir une seconde migration en SDS-PAGE. Ce
type d’électrophorèse permet une séparation des protéines essentiellement en fonction de leur
masse moléculaire : cette étape constitue la deuxième dimension.
Le SDS est un détergent anionique qui dénature les protéines en coupant les liaisons
hydrogènes et entourant les protéines d’une charge négative. La séparation est réalisée grâce
au tamisage moléculaire opéré par le gel.
49
Les applications sont multiples, depuis la vérification de la pureté d'
un échantillon jusqu'
à des
études de variabilité génétique, en passant par le suivi des variations d'
expression en fonction
de différents facteurs : développement, différenciation, traitements (drogues, stress,
hormones, etc).
6.2.2. 1ère dimension : IEF
Pour réaliser cette étape, nous avons utilisé des bandelettes de gels au sein duquel un
gradient de pH a déjà été établi (ImmobilineTM DryStrip pH 3-10 à gradient non linéaire, 18
cm GE, Healthcare).
L’étape précédant l’IEF consiste à réhydrater les bandelettes de gels (ou ImmobilineTM
DryStrip) déshydratées avec l’échantillon protéique. Lors de la préparation de ces échantillons
pour la réhydratation, 3 µL d'
Orange G à 0,4 % sont ajoutés à 350 µL d’échantillon contenant
150 µg de protéines de L. pneumophila. Ce mélange est mis sous agitation pendant 30 min à
température ambiante puis centrifugé 5 min à 8000 g et déposé dans une plaque de
réhydratation. Les bandelettes de gels, débarrassées du plastique protégeant le gel déshydraté,
sont placées dans la plaque de réhydratation sur l’échantillon protéique, gel vers le bas. Après
s’être assuré que l’échantillon était réparti uniformément, sans bulles d’air, sous les
bandelettes, celles sont chacunes recouvertes par 2,5 mL d'
huile minérale.
La réhydratation est réalisée de façon passive à 20°C pendant 16 h avec le "Bio-Rad Protean
IEF Cell".
Lorsque la réhydratation est terminée, deux pièces de papier filtre (hydratées avec 7
µL d'
EUP) sont placées entre les bandelettes de gels et les électrodes (1 papier/électrode).
L'
IEF (ou première dimension) est ensuite réalisée avec le "Bio-Rad Protean IEF Cell" à 20°C
et 50 µA/bandelette avec les "settings" suivants:
0 à 250 V avec "rapid ramp" (15 min)
250 V à 4000 V avec "linear ramp" (2 h)
le voltage est ensuite conservé constant (4000 V) jusqu'
à ce qu'
un total de
20000 V/h soit atteint.
Lorsque l'
IEF est terminée, il est possible de congeler indéfiniment les bandelettes à -80°C,
sans équilibration dans les tampons avec SDS. Au moment de réaliser la SDS-PAGE, les
bandelettes seront alors décongelées et l’équilibration se fera juste avant l’électrophorèse en
SDS-PAGE.
50
6.2.3. 2NDE DIMENSION : SDS-PAGE
Avant de déposer la bandelette sur le gel de seconde dimension, il est nécessaire, pour
réaliser la seconde dimension, de saturer le gel en SDS et en agent réducteur (DTT) afin
d’ioniser les protéines et de réduire les ponts dissulfures : cette étape est l’équilibration.
Lorsque l’agent réducteur est le DTT, il est nécessaire de procéder à une seconde incubation
avec de l’iodoacétamide. Ceci prévient la ré-oxydation des protéines au cours de
l’électrophorèse et alkyle le DTT résiduel, minimisant les traînées verticales.
Equilibration des bandelettes de gels
Chaque bandelette ayant subi l’IEF est équilibrée par incubation dans deux bains
successifs de tampons d’équilibration. Le premier bain est réalisé, sous agitation lente pendant
10 min, dans 6 mL de tampon d’équilibration I avec DTT (Urée 6 M, SDS 2 %, Tris-HCl
0,375 M pH 8,8, glycérol 20 %, DTT 130 mM) auquel a été rajouté du Bleu de Bromophénol.
Ensuite, les strips sont placés dans un deuxième bain, sous agitation douce pendant 10
minutes, dans 6 mL de tampon d'
équilibration II (Urée 6 M, SDS 2 %, Tris-HCl 0,375 M pH
8,8, glycérol 20 %, iodoacétamide 135 mM).
Seconde dimension (SDS-PAGE)
Les bandelettes équilibrées sont placés sur les gels de concentration (Annexe 4)
perpendiculairement à ceux-ci sans former de bulles. Les DryStrips sont ensuite immobilisés à
la surface des gels de concentration en ajoutant de l'
agarose à bas point de fusion à 2 %
préparé dans du tampon de migration 1 X (25 mM Tris; 0,192 M Glycine, pH 8,3, 0,1 %
SDS).
La migration électrophorétique est réalisée dans le système PROTEAN II xi and XL Cells
(Biorad), dans du tampon de migration 1 X, à 10 mA/gel pendant 1 heure puis 24 mA/gel
pendant 6 heures, à 10°C, jusqu'
à ce que le bleu de bromophénol soit à environ 1 cm du bas
du gel. Une fois l'
électrophorèse terminée, les gels sont placés dans un bain de fixation
(mélange Méthanol/Acide Acétique/EUP (40/10/50)) pendant une nuit afin de fixer les
protéines dans les gels.
51
6.2.4. Coloration au nitrate d’argent
Après l’étape de fixation, les gels sont lavés tout d’abord dans 2 bains de 10 min chacun
d’éthanol 10 % puis dans 3 bains de 10 min chacun d’EUP. Ils sont ensuite placés pendant
une minute dans un bain de thiosulfate de sodium 0,02 % (w/v) : cette étape correspond à la
sensibilisation. Après un lavage à l’eau ultra pure de quelques secondes (pour éviter les bruits
de fond), les gels sont immergés pendant 30 min dans un bain d’argent à 0,1 % (w/v) à
l’obscurité. Vient ensuite l’étape de développement, au cours de laquelle les gels sont placés
successivement dans trois bains de solution de développement (Formaldéhyde 37 % : 200 µL,
Carbonate de sodium : 24 g, Thiosulfate de sodium 2 % : 80 µL, EUP : qsp 2 L) dont la durée
varie de quelques secondes à 20 min (1er : 200 mL/gel quelques sec, 2ème : 400 mL/gel 10 min,
3ème : 400 mL/gel 5 min). Cette étape est ensuite arrêtée par un bain de 10 min (ou 2 bains de
5 min) dans une solution d’arrêt du développement (solution d’acide acétique 1 %). La
dernière étape consiste à rincer les gels dans 3 bains d’eau ultra pure pendant 10 minutes.
Les gels sont ensuite scannés à l’aide du système GS-710 Calibrated Imaging Densitometer
(Biorad) et peuvent être conservés dans du glycérol 3 % à 4°C.
6.2.5. Analyse d’image
L’analyse comparative des gels est réalisée à l’aide d’un logiciel d’analyse PDQuest (version
7, Biorad) au sein du plateau protéomique de l’IFRMP 23 (UMR 6522 CNRS, Rouen).
Les variations d’intensité de spots protéiques sont détectées via ce logiciel d’analyse. Afin
d’éliminer les variations individuelles entre les gels, 3 gels par conditions (provenant de
cultures différentes) sont alignés et comparés.
Au cours de l’analyse, seules les différences d’intensité de spots retrouvées sur au moins 2
gels par conditions ont été retenues et considérées comme reflétant une expression
différentielle des protéines.
Les spots d’intérêts ont été extraits et identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF
et/ou LC-MS/MS (Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse en tandem)
à la plate forme protéomique de Rouen (UMR 6522 CNRS, Laurent COQUET, Arbia
KHEMIRI, Thierry JOUENNE).
52
6.2.6. Spectrométrie de masse MALDI-TOF
L’identification des protéines a été réalisée au sein du plateau protéomique de l’IFRMP 23
(UMR 6522 CNRS, Rouen). La méthode MALDI-TOF-MS (Matrix-Associated Laser
Desorption Ionisation/Time Of Flight-Mass Spectrometer) est basée sur une technique
d’ionisation des molécules qui utilise la désorption laser à partir d’une matrice ionisante dans
laquelle est inclus l’échantillon. Cette technique génère des spectres permettant de déterminer
la masse des peptides résultant de la digestion des échantillons.
Les spots d’intérêt extraits des gels sont soumis à une digestion trypsique à l’aide d’un
digesteur automatique (MultiPROBE II, Perkin Elmer). Les peptides qui en résultent sont
ensuite analysés par la technique MALDI-TOF-MS à l’aide d’un spectromètre de masse
MALDI-TOF (prOTOF 2000TM, Perkin Elmer).
À partir de la masse des peptides obtenue, les prédictions en acides aminés permettent
d’identifier les protéines correspondantes, en utilisant l’outil bioinformatique MASCOT
(Mascot Daemon) (http///www.matrixscience.com) en interrogeant la base de données
NCBInr. Les modifications induites par la 2D (ajout d’iodoacétamide sur les cystéines,
oxydation des méthionines…) doivent être prises en compte pour l’identification.
Ces analyses ont été réalisées à la plate forme protéomique de Rouen (UMR 6522 CNRS) par
Laurent COQUET.
7. Méthodes de biologie moléculaire
7.1. Plasmides
Le vecteur pCR-Blunt (Invitrogen) a été utilisé pour cloner le fragment d’ADN à extrémités
franches obtenu après PCR. Ce plasmide possède un gène de résistance à la kanamycine, qui
permet de sélectionner en présence de kanamycine (50µg/mL) les E. coli Top10 possédant le
plasmide après transformation.
pQE30 et pQE70 (Quiagen) permettent de produire une protéine recombinante avec une
queue polyhistidine en N-terminal et C-terminal respectivement. Ils possèdent tout deux un
gène de résistance à l’Ampicilline.
53
Les plasmides sont extraits à l’aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel) selon les
instructions du fournisseur.
Ensuite, les plasmides sont contrôlés par électrophorèse en gel d’agarose 0,7% dans du
tampon de migration Tris-Borate-EDTA 0,5 X (TBE : Tris-HCl 25 mM, pH 8, Acide Borique
25 mM, EDTA 0,5 mM) en présence de 0,1 µg/mL de bromure d’éthidium (BET).
7.2. Clonage moléculaire et PCR
Les protocoles classiques de biologie moléculaire utilisés dans cette partie sont décrits dans
Molecular Cloning, Sambrook et Russell (2001).
7.2.1. Réactions de PCR et amorces
Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 50 µL, en présence de
1,75 unités de Pfx (Invitrogen), de tampon Amplification Pfx 1X commercialisé avec
l’enzyme, 1 mM de MgSO4, 80 µM de chacun des 4 dNTP, 0,3 µM de chacune des amorces
(Tableau 5) et l’ADN de L. pneumophila.
Les amorces possèdent des sites de restriction introduits pour faciliter les clonages ultérieurs.
Tableau 5 : Amorces utilisées pour réaliser la PCR
Construction
His-tag en
N-Term
His-tag en
C-Term
Nom
Rpf Lens
Direct
Rpf Lens
Inverse
Rpf his
dir2
Rpf his
Reverse
Nombre
de bases
Tm
(°C)
Site de
restriction
34
96
BamHI
34
100
HindIII
26
78
SphI
26
80
BglII
Séquence
CTGGATCCATGATGAAACTGT
TAGCGATTGATAC
CGAAAGCTTATCCACGCGAAT
CTCCTTGAGTAAC
GGGCATGCTGAAACTGTTAGC
GATTG
GGAGATCTTCCACGCGAATCT
CCTTG
La réaction de PCR est initiée par une étape de dénaturation de 2 min à 94°C. Ensuite, le
cycle PCR commence par une dénaturation à 94°C pendant 15 secondes. L’hybridation des
amorces est réalisée à 55°C pendant 30 secondes et l’élongation à 68°C pendant 30 secondes.
Ce cycle est répété 30 fois puis la terminaison de l’élongation est effectuée à 68°C pendant 5
min.
Les produits PCR sont purifiés à l’aide du kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) selon
les instructions du fournisseur et repris dans un volume final de 10 µL.
54
7.2.2. Ligature du produit PCR dans pCR-Blunt
La ligature est réalisée dans un volume final de 10 µL, en présence de 25 ng de pCR-Blunt, de
tampon de ligature 2,5 X fourni avec le kit, de 5 µL de produit PCR purifié et de 4 unités de
T4 DNA ligase. La réaction est réalisée 1 heure à 16°C comme indiqué dans le Zero Blunt
PCR Cloning kit (Invitrogen). Le produit de ligature est purifié par précipitation, en présence
d’acétate de sodium et d’éthanol, puis repris dans 10 µL d’EUP.
7.2.3. Clonage après digestion par les enzymes de restriction
Les vecteurs pQE30 et pQE70 (50 ng) et l’ADN exogène à cloner (500ng) sont digérés
par les enzymes appropriées (BamHI/HindIII pour pQE30 ou BglII/SphI pour pQE70) 2
heures à 37°C. Les enzymes sont inactivées par chauffage à 75°C pendant 10 minutes.
Les fragments à cloner sont purifiés après migration électrophorétique sur gel d’agarose 0,7%
en tampon de migration TBE 0,5 X en présence de 0,1 µg/mL de BET, à l’aide du kit
NucleoSpin ExtractII (Macherey-Nagel) selon les instructions du fournisseur.
La ligature dans les vecteurs est réalisée 1 heure à 16°C à l’aide d’une T4 DNA ligase.
7.3. Transformation d’Escherichia coli
Des cellules compétentes ont été préparées par la méthode au CaCl2 (Mandel et Higa,
1970). Après transformation thermique (3 minutes à 42°C), puis un repos d’une heure en
présence de LB à 37°C, les bactéries sont étalées sur gélose LB contenant 25 µg/mL de
kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline. Les boîtes sont incubées la nuit à 37°C.
7.4. Expression des protéines recombinantes
Les colonies qui se sont développées sur le milieu LB contenant les antibiotiques sont
repiquées dans des tubes de 5 mL de LB avec antibiotiques et incubées à 37°C sous agitation
pendant une nuit.
2,5 mL de cette préculture d’une nuit sont ensemencés sur 50 mL de LB contenant 100 µg/mL
d’ampicilline et 25 µg/mL de kanamycine dans un erlenmeyer de 250 mL. La culture est
incubée à 37°C, sous agitation (environ 300 rpm), jusqu’à ce que la DO600nm soit comprise
entre 0,5 et 0,7.
55
1 mL de culture est prélevé juste avant induction (contrôle non induit) et centrifugé à 4000 g
pendant 20 min. Le surnageant est éliminé et le culot lavé avec 1 mL d’eau ultra pure stérile
puis conservé à -80° C jusqu’à l’analyse.
L’expression de la protéine est induite en ajoutant de l’IPTG de façon à obtenir une
concentration finale de 1mM. Les cultures sont incubées à 37°C sous agitation (environ 300
rpm) pendant 4 heures.
Après 4 heures d’incubation, différents volumes de culture sont prélevés, centrifugés et lavés
avec de l’eau ultra pure stérile puis les culots sont conservés à -80°C.
7.5. Extraction et purification des protéines recombinantes
7.5.1. Extraction
Les protéines recombinantes sont extraites, à l’aide de microbilles de verre stériles (0,10,25mm, Fisher Scientific) par vortexage de 2 min en présence de tampon BB-Urée (0,5 M
NaCl, 20 mM Tris-HCl, 8 M Urée, pH 8,0), en 3 étapes de 500 µL, 500 µL et enfin 200 µL.
Après chaque vortexage, les cellules sont centrifugées 2 minutes à 10000 g. Le surnageant
récupéré à chaque étape est collecté dans un même tube (environ 1,2 mL) puis ce mélange est
centrifugé 15 min. à 10000g à 4°C. Le surnageant est récupéré et constitue l’Extrait Brut
(EB).
Afin d’optimiser l’extraction, le même protocole a été appliqué sur d’autres échantillons en
présence de 1 % ou 2 % de Tween 20 dans le tampon BB-Urée.
7.5.2. Purification
La protéine marquée par le His-tag est purifiée sur résine de Nickel.
600 µL de résine greffée par du Nickel sont mis en présence de 1 mL d’extrait brut. Ce
mélange est agité par retournement 8 à 10 fois pour optimiser le contact protéine-résine puis
laissé au repos 5 minutes à température ambiante avant d’être centrifugé 1 min. à 10000g. La
fraction non retenue, notée E0, est conservée pour contrôle.
Lavages : 600 µL de tampon BB (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) sont ajoutés sur la
résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à 10000 g. La
fraction non retenue, notée EBB, est conservée. Cette étape est répétée deux fois (soit 1,2 mL
de EBB récupéré).
56
600 µL de tampon WB (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 60 mM imidazole, pH 8,0) sont
ajoutés sur la résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à
10000 g. La fraction non retenue, notée EWB, est conservée. Cette étape est répétée deux fois
(soit 1,2 mL de EWB récupéré).
Elution : 600 µL de tampon EL (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 500 mM imidazole, pH 8,0)
sont ajoutés sur la résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à
10000 g. Cette étape est répétée trois fois et les fractions non retenues, notées EP, (soit 1800
µL) sont collectées dans un même tube.
7.5.3. Vérification des protéines induites par SDS-PAGE
Chaque fraction récupérée lors de la purification est déposée sur gels SDS-PAGE (Annexe 5)
et l’électrophorèse est réalisée à l’aide du Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System
(Biorad) à 65mA pendant 10min suivi de à 48mA jusqu'
à ce que le bleu de bromophénol sorte
du gel.
Après migration, les gels SDS-PAGE sont placés dans un bain de fixation (mélange
Méthanol/Acide Acétique/EUP : 40/10/50) pendant 1 heure afin de fixer les protéines dans les
gels. Les gels sont ensuite placés dans un bain de solution de coloration au bleu de Coomassie
colloïdal (Annexe 6) pendant une nuit, rincés avec de l’eau ultra pure puis scannés à l’aide du
système GS-710 Calibrated Imaging densitometre (Biorad).
7.5.4. Test de réveil de L. pneumophila par les protéines
recombinantes
En nous basant sur les travaux de Pantdapom et al., 2006 réalisés sur Salmonella, nous avons
testé les protéines recombinantes Rpf que nous avons obtenues sur des suspensions de L.
pneumophila à 109 bactéries/mL devenues non cultivables suite à un traitement à 57,5°C ou à
une incubation prolongées (3 mois) dans un milieu pauvre (BYE dilué au millième) à 25°C
mais possédant une membrane intègre (BacLight).
Nous avons réalisé les tests dans du BYE 5%. Pour cela, nous avons mis en présence 50 µL
de BYE 10%, 50 µL de suspension bactérienne à 109 cellules/mL et 10 µL de protéine
purifiée.
Des tests ont également été réalisés en ajoutant 10 µL d’extrait brut induit et non induit.
Les tubes ont ensuite été placés à 37°C, 5% CO2 pendant 3 jours.
57
CHAPITRE 3 :
RESULTATS
1. Impact du traitement par la monochloramine
Les chocs chlorés restent les traitements les plus employés dans les circuits et les
réseaux d’eau. Cependant, l’utilisation du chlore présente certains inconvénients tels que la
production de sous-produits cancérigènes et une augmentation de la corrosion des
canalisations. La monochloramine est l’un des biocides pouvant représenter une alternative à
la désinfection au chlore en raison de sa faible capacité à produire des composés
organochlorés et sa stabilité en réseau de distribution.
Au cours de mes travaux de DEA (2003-2004) portant sur la survie de Legionella
pneumophila dans les biofilms, nous avons utilisé la monochloramine en raison de sa capacité
à inactiver les bactéries présentes dans les biofilms et sa faible réactivité avec les
polysaccharides extracellulaires présents dans le biofilm, contrairement au chlore qui possède
une réactivité élevée avec les différents constituants du milieu aquatique (Kim et al., 2002;
LeChevallier et al., 1988).
Nos travaux ont montré que suite à un traitement des biofilms de légionelles avec des
doses supérieures ou égales à 1 mg/L de monochloramine, L. pneumophila devenait non
cultivables (voir article 1 (Alleron et al., 2006) après les annexes). Ces cellules ont pu être
réveillées après passage dans Acanthamoeba castellanii 30 jours après traitement et
possédaient encore une activité estérase 145 jours après l’entrée dans l’état VBNC.
Suite à ces résultats, nous avons souhaité étudier, par une approche protéomique, l’état
VBNC chez L. pneumophila. Pour cette étude, nous avons utilisé des suspensions de
légionelles (pour des raisons de contrôle de quantité de cellules) et nous avons utilisé la
monochloramine pour les traitements.
58
1.1. Cultivabilité et viabilité
Des tests préliminaires ont été réalisés sur des suspensions de L. pneumophila Lens à 107
cellules/mL afin de déterminer l’abattement des populations planctoniques. Ces cellules ont
été traitées, dans de l’eau, pendant 1 heure, par des concentrations de monochloramine
comprises entre 0 et 5 mg équivalent Cl2/L.
Au cours de nos travaux, nous avons cherché dans nos échantillons une « CMI »
(Concentration Minimale Inhibitrice) c'
est-à-dire la concentration en monochloramine
minimale pour laquelle nous observons une perte totale de cultivabilité ; le but étant de
rechercher la présence de bactéries à l’état VBNC dans ces échantillons.
Nous avons observé moins de une Unité Formant Colonie (UFC) dans 300 µL d’échantillons
traités avec des doses supérieures ou égales à 1 mg/L (Figure 7) ; ce qui correspond à moins
de 3 UFC/mL environ.
1,E+08
UFC/mL
1,E+06
1,E+04
1,E+02
1,E+00
0
1
2
3
4
5
[NH2Cl] mg/L
Figure 7 : Cultivabilité de L. pneumophila en suspension après traitement à la
monochloramine (moyenne de 3 expériences)
L’étude de l’intégrité membranaire (BacLight) a été entreprise afin de déterminer si les
bactéries non cultivables étaient potentiellement viables. Nous avons observés le jour du
traitement, que dans l’échantillon cultivable (non traité), 73,7 % (± 6,2 %) des cellules
possédaient une membrane intègre alors que dans les échantillons non cultivables, obtenus
après traitement par 1 et 5 mg/L de monochloramine, cette proportion était respectivement de
52, 2 % (± 6,6 %) et 27,5 % (± 7,0 %). Ces résultats suggèrent qu’une quantité non
négligeable est potentiellement viable après traitement.
Afin de vérifier que tous ces échantillons étaient capables de retrouver leur culivabilité, nous
les avons incubés en présence de l’amibe Acanthamoeba castellanii pendant 3 jours à 37°C.
59
Aucune bactérie cultivable n’a été observée après co-incubation avec ce protozoaire. Ces
résultats peuvent avoir plusieurs causes : les conditions de cultures ne sont peut être pas
adaptées, l’amibe utilisée n’est peut être pas adéquate (Garcia et al., 2007) ou encore les
légionelles ne sont peut être pas viables.
Pour écarter cette hypothèse, nous avons réalisé des marquages au S35 pour évaluer le
maintien de la synthèse protéiques des bactéries non cultivables.
1.2. Evaluation du maintien de la synthèse protéique des
bactéries non cultivables
Pour vérifier que ces bactéries étaient capables de synthétiser, de novo, des protéines
dans cet état, nous avons placé à 37°C, pendant plusieurs heures, des L. pneumophila
cultivables (non traitées) et non cultivables (obtenues après traitement par 1 mg/L de
monochloramine), dans du milieu BYE liquide, supplémenté en cystéine/méthionine marquée
au S 35.
Deux marquages ont été réalisés, chaque marquage étant constitué par un lot de
bactéries cultivables et un lot de bactéries non-cultivables traitées par la monochloramine
(1mg/L). Les résultats obtenus pour un marquage sont représentés sur la Figure 8.
Echantillon cultivable
4H
8H
Echantillon non cultivable
4H
8H
23H
Figure 8 : Autoradiographie de profils protéiques de L. pneumophila obtenus après
marquage à différents temps, par un mélange cystéine /méthionine S35
60
La Figure 8 ne représente aucun marqueur de taille car nous n’avons pas réalisé de coloration
au bleu de Coomassie. De plus nous souhaitions seulement voir s’il existait un signal après
ajout de S35, l’intérêt n’étant pas de déterminer la taille des protéines éventuellement
produites.
Nous observons que les échantillons cultivables (non traités) sont capables d’incorporer la
cystéine et la méthionine marquées pour produire de nouvelles protéines en 4 heures. Cette
production s’accroît en fonction du temps puisque au bout de 8 heures, une quantité
importante de protéines marquées est observée.
Par contre, en ce qui concerne les bactéries non cultivables (traitées par 1 mg/L de
monochloramine), le temps nécessaire pour observer la production de nouvelles protéines est
beaucoup plus long (23 heures) et le marquage obtenu est très faible par rapport à
l’échantillon cultivable. Il semble également que les protéines nouvellement synthétisées par
les bactéries non cultivables soient différentes de celles produites par les cultivables.
Les résultats obtenus montrent une synthèse protéique de novo chez les bactéries à l’état
VBNC, même si cette activité métabolique est réduite par rapport aux échantillons
cultivables. Ceci confirme que les bactéries non cultivables après traitement par 1 mg/L de
monochloramine sont à l’état VBNC et donc l’hypothèse selon laquelle les conditions de
réveil par les amibes ne sont pas optimales semble plus probable.
Ces résultats nous ont permis d’envisager une analyse bidimensionnelle des échantillons
marqués afin de pouvoir déterminer si des protéines spécifiques sont produites à l’état VBNC.
Afin d’évaluer la quantité de S35 incorporé, nous avons réalisé un comptage de la radioactivité
par scintillation liquide dans les échantillons.
Le nombre de coups par minutes obtenu pour les échantillons non cultivables 23 H après
addition de S35 est en moyenne d’environ 13586 CPM (13974 pour le premier marquage et
13198 pour le second marquage), ce qui est faible par rapport à ce qui a été obtenu pour les
échantillons non traités après 4 et 8 H en présence de S35 (81088 et 128070 CPM
respectivement). Ce faible marquage nous a conduit à abandonner l’analyse après marquage
au S35.
Afin d’étudier la différence de profils protéiques des bactéries à l’état VBNC par rapport aux
bactéries cultivables, nous avons décidé d’utiliser l’électrophorèse bidimensionnelle (2D) sans
incorporer de radioactivité.
61
1.3. Traitements des bactéries pour l’électrophorèse 2D
Des premiers tests d’électrophorèse 2D réalisés nous ont conduit à utiliser des concentrations
bactériennes importantes pour pouvoir obtenir le signal optimal lors de l’analyse 2D.
Par conséquent, nous avons dû réaliser des traitements de suspensions de L. pneumophila à
DO600nm égale à 1.
Nous avons cherché dans nos échantillons une « CMI » (Concentration Minimale Inhibitrice)
c'
est-à-dire la concentration en monochloramine minimale pour laquelle nous observons une
perte totale de cultivabilité ; le but étant de rechercher la présence de bactéries à l’état VBNC
dans ces échantillons.
Pour cela, les échantillons ont été traités avec des doses de monochloramine comprises entre 0
et 50 mg/L et ont ensuite été placés dans un milieu pauvre en nutriment (appelé milieu de
repos) pendant plusieurs jours afin d’étudier leur comportement. Des dénombrements de
bactéries cultivables et des analyses d’intégrité membranaire ont été réalisés sur les différents
échantillons (Tableau 6).
Nous n’avons pas observé de colonies sur les boîtes (moins de une UFC dans 300 µL
d’échantillons traités avec des doses d’oxydant supérieures ou égales à 20 mg/L ; ce qui
correspond à moins de 3 UFC/mL environ).
Nous avons donc retenu cette dose pour réaliser les analyses de viabilité.
Le Tableau 6 représente les résultats de cultivabilité et de viabilité obtenus pour les
échantillons cultivables (non traité) et non cultivables (Traités par 20 mg/L de
monochloramine) après incubation de plusieurs jours dans le milieu de repos.
Tableau 6 : Cultivabilité et viabilité de L. pneumophila après traitement par 20 mg/L de
monochloramine et incubation dans le milieu de repos (moyenne de 9 expériences)
UFC/mL
% de cellules viables b
a
Repos
Non traité1
Traité2
Non traité1
Traité2
0
1,99 ± 0,54.108
0
7
63,3 ± 6,7
25,2 ± 8,3
15
5,7 ± 1,4.10
0
36,7 ± 6,4
25,4 ± 7,6
7
21
3,7 ± 1,4.10
0
17,2 ± 5,1
17 ± 4,8
a
Nombre de jours passés dans le milieu de repos après le traitement à 57,5°C
b
comptage réalisé après marquage avec le kit BacLight
1
cellules non traitées par la monochloramine
2
cellules non cultivables obtenues après traitement par 20 mg/L de monochloramine
62
En ce qui concerne les échantillons non traités, nous pouvons observer que la quantité
de bactéries cultivables diminue en fonction du temps de séjour dans le milieu pauvre en
nutriments. Cette diminution s’accompagne d’une baisse du pourcentage de cellules à
membrane intègre qui semble plus importante que celle observée chez les bactéries à l’état
VBNC. En effet, le pourcentage de bactéries à membrane intègre diminue de 44 % en 21 jours
pour les échantillons non traités (63,3 % à 17,2 %) alors que pour les échantillons traités par
20 mg/L de monochloramine ce pourcentage chute seulement de 8 % (25,2 % à 17 %) sur
cette même période. Ceci pourrait suggérer que les bactéries à l’état VBNC sont plus
résistantes à la carence en nutriments ; ce qui a déjà été suggéré par Chang et al., 2007 (Chang
et al., 2007).
Les échantillons traités non cultivables présentent une proportion comprise entre 25 %
et 17 % jusqu’à 21 jours d’incubation dans le milieu de repos. L’intégrité membranaire est
relativement stable au cours de cette période puisque cette proportion de cellules viables varie
peu au cours du temps.
Afin de vérifier que tous ces échantillons étaient capables de retrouver leur
culivabilité, nous les avons incubés en présence de l’amibe Acanthamoeba castellanii pendant
3 jours à 37°C.
Aucune bactérie cultivable n’a été observée après co-incubation avec ce protozoaire. Ces
résultats peuvent avoir plusieurs causes : les conditions de cultures ne sont peut être pas
adaptées, l’amibe utilisée n’est peut être pas adéquate (Garcia et al., 2007) ou encore les
légionelles ne sont peut être pas viables.
En ce qui concerne la viabilité, nous avons utilisé le kit Chemchrome V6 afin de
déterminer, de façon qualitative, si les cellules non cultivables présentaient une activité
estérase. Ces échantillons présentaient une activité estérase (cette activité n’a pas été
quantifiée).
Ces résultats montrent que le traitement par 20 mg/L de monochloramine peut
conduire à l’état VBNC chez L. pneumophila.
63
1.4. Analyse protéomique
1.4.1. Analyse par SDS-PAGE
Nous avons réalisé une analyse en SDS-PAGE afin de comparer les profils protéiques des
échantillons cultivables (non traités) et non cultivables (traités par 20 mg/L de
monochloramine). Pour cela, nous avons extrait les protéines issues de 10 mL de suspensions
bactériennes à DO600nm égale à 1, cultivables et non cultivables restés 0 ou 15 jours dans le
milieu de repos (notés respectivement J0 et J15). Les protéines ainsi obtenues ont été
déposées sur gel SDS-PAGE.
Remarque : En ce qui concerne l’échantillon traité, nous avons sélectionné la dose minimale à
partir de laquelle nous n’observions pas de bactéries cultivables (c'
est-à-dire moins de une
UFC dans 300 µL d’échantillon traité) mais possédant encore une activité métabolique : c'
està-dire 20 mg/L.
Cette expérience a été réalisée 6 fois. La Figure 9 montre les résultats obtenus pour une
expérience. Les résultats obtenus pour les 5 autres expériences sont les mêmes que ceux
présentés sur la figure 9.
Cultivable
KDa
M
J0
J15
Non cultivable
J0
J15
205,0
97,4
66,0
55,0
45,0
36,0
29,0
24,0
20,1
14,2
Figure 9 : Comparaison de profils protéiques par SDS-PAGE de L. pneumophila
cultivables ou non cultivables restées 0 jours (J0) ou 15 jours (J15) dans le milieu de
repos
64
En premier lieu, nous pouvons constater que le profil des bactéries traitées (non
cultivables) est différent de celui des bactéries non traitées (cultivables).
Dans un second temps, avec ce type d’analyse, nous n’observons pas de différence
d’expression au cours du temps au sein d’une même population : c'
est-à-dire entre J0 et J15
pour les échantillons cultivables et non cultivables.
L’analyse monodimensionnelle n’est pas assez fine pour donner des informations de
modification de profil dans nos conditions expérimentales. Par conséquent, pour étudier la
différence d’expression de l’ensemble des protéines, nous avons choisi d’utiliser
l’électrophorèse bidimensionnelle qui permet la séparation des protéines en fonction de leur
point isoélectrique et de leur masse moléculaire. Ainsi, sur les gels d’électrophorèse, nous
obtenons des spots au lieu de bandes protéiques ; chaque spot représentant une protéine ou un
groupe de protéines possédant le même PI et la même masse.
1.4.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle
Afin de déterminer la quantité de protéines nécessaire pour l’analyse bidimensionnelle, nous
avons déposé 350, 150 et 75 µg de protéines sur les gels.
Les gels avec 350 µg de protéines colorés au nitrate d’argent présentaient des traînées
importantes et des spots saturés (Figure 10). Nous avons par la suite utilisé 150 µg de
protéines, de façon à faciliter l’analyse des variations d’intensité des spots par densitométrie.
65
pHi
3
4,9
5,4
5,9
6,9
8
9,2
10
PM
(Da)
43,000
28,500
22,000
10,500
7,000
Figure 10 : Exemple de gel obtenu en déposant 350 µg de protéines de L. pneumophila
traitée par 20 mg/L de monochloramine resté 15 jours dans le milieu de repos.
Les échantillons que nous avons analysés par électrophorèse 2D sont :
-
cultivables (non traités), prélevés le jour J0 (Figure 11A)
-
cultivables (non traités), restés 15 jours dans le milieu de repos (J15) (Figure 11B)
-
non cultivables (traités par 20 mg/L de monochloramine), prélevés juste après
traitement (J0) (Figure 11C)
-
non cultivables (traités par 20 mg/L de monochloramine), restés 15 jours dans le
milieu de repos après traitement (J15) (Figure 11D)
Les différents gels obtenus sont représentés dans la Figure 11.
66
Figure 11 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la
monochloramine après incubation dans le milieu de repos (150 µg de protéines déposées).
(A : échantillon non traité prélevé à J0, B : échantillon non traité et prélevé 15 jours après incubation dans le
milieu de repos, C : échantillon traité par 20 mg/L de monochloramine et prélevé le jour du traitement, D :
échantillon traité par 20 mg/L de monochloramine et prélevé 15 jours après incubation dans le milieu de repos )
(expériences réalisées 3 fois).
Les gels traités montrent dans la partie haute du gel, pour des points isoélectriques compris
entre 4,9 et 6,9, des zones mal résolues avec des spots saturés et/ou dupliqués (4,9 <pHi< 5,4)
ainsi que des traînées verticales notamment autour de 5,5 ne montrant pas ou peu de protéines
(Figure 5). Ces différentes observations rendant l’analyse d’intensité de spots difficile, nous
avons sélectionné une partie du gel (4,5 < pH < 10 et 7,000 < PM < 30,000 Da) relativement
bien résolue présentant des spots protéiques non saturés pour réaliser la comparaison des gels
67
(encadré rouge Figure 12). Les spots situés en dehors de cette zone ont tout de même été
prélevés et envoyé à la plate forme protéomique de Rouen pour identification.
D’après l’analyse de son génome, la souche Lens code potentiellement pour 2580 protéines
(Cazalet et al., 2004). Sur le gel présenté en figure 12, on dénombre environ 800 spots
protéiques soit environ 30% des protéines potentiellement exprimées chez L. pneumophila
Lens. La portion de gel que nous avons retenue doit représenter environ 10% seulement des
protéines potentielles de cette souche.
Figure 12 : Exemple de gel obtenu en déposant 150µg de protéines d’un échantillon
traité par 20mg/L NH2Cl et prélevé juste après traitement.
(L’encadré rouge représente la zone retenue pour l’analyse d’intensité des spots par PDQUEST).
Les gels obtenus dans chacune des 4 conditions ont été comparés grâce au logiciel
PDQUEST. Ceci a permis de distinguer et d’étudier différents états :
-
la carence nutritionnelle : par comparaison des échantillons non traités restés ou
non 15 jours dans le milieu de repos (J0 et J15)
-
le stress monochloramine : par comparaison des échantillons traités et non traités
prélevés le jour du traitement (J0)
-
l’état VBNC : par comparaison des échantillons traités restés ou non 15 jours dans
le milieu de repos (J0 et J15)
68
Analyse statistique des données
Pour chaque condition, 3 gels ont été réalisés à partir de 3 échantillons différents (issus de
cultures différentes et traités ou non) et comparés à l’aide d’un densitomètre GS-710 (Biorad).
Les résultats obtenus ont été analysés grâce à un outil d’analyse de variance développé par
Christian Lacombe (UMR CNRS 6008, Poitiers).
Le principe consiste en un calcul de variance au sein d’un même set de référence (3 gels
D20J0 par exemple) et entre les sets de référence et expérimentaux (D20J0 et D20J15 par
exemple).
Un spot est considéré comme étant présent s’il existe dans au moins n-1 gels c'
est-à-dire 2
dans notre cas.
Si le coefficient de variance (CV) entre le set de référence et le set expérimental est
supérieur au CV calculé au sein de chaque set, alors le spot sera retenu pour les analyses.
Les spots n’étant pas présent dans les deux sets (référence et expérimental) sont considérés
comme de nouveaux spots.
Les spots montrant une différence d’intensité significative dans au moins deux gels sur trois
ont été retenus pour une identification par spectrométrie de masse. Les résultats ont été
exprimés en pourcentage d’intensité (% OD) pour chaque spot par rapport au total des spots
présents sur le gel. Ceci nous a permis de nous affranchir des variations d’intensité pouvant
être dues à une variation de quantité de protéines déposées sur les gels.
Nous avons fixé comme seuil significatif 2 ; ainsi tout spot ayant une différence d’intensité
supérieure ou égale à 2 sera considéré comme significativement augmenté.
Les protéines ont ensuite été identifiées en utilisant l’outil informatique MASCOT (Mascot
Daemon) en interrogeant la base de données NCBInr.
Résultats discussion
Le Tableau 7 représente les protéines dont l’intensité augmente d’un facteur supérieur
ou égal à 2, 15 jours après l’entrée des cellules dans l’état VBNC.
Le but de nos travaux n’était pas d’analyser les variations d’expression de protéines
suite au stress monochloramine et en condition de carence nutritionnelle dans ces deux
conditions mais d’étudier l’état VBNC. Par conséquent, les Tableau 8 Tableau 9, représentant
les protéines dont l’intensité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 dans ces deux
conditions, ont été présentés dans le seul but de confirmer que les protéines surexprimées à
l’état VBNC étaient bien spécifiques de cet état.
La discussion s’articulera donc seulement autour des protéines retenues à l’état VBNC.
69
Tableau 7 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 15 jours apès
l’entrée dans l’état VBNC
N°
identification
YP 094956
YP 095880
YP 094363
YP 094957
YP 095885
YP 094520
YP 126188
YP 095867
YP 096657
YP 127582
Masse (kDa)
PI
27,317
28,448
24,497
33,404
23,76
11,402
24,788
28,476
23,972
33,385
6,35
5,62
9,61
5,19
5,56
6,05
9,19
6,91
6,06
5,44
Ratio D20J15/D20J0
VBNC
21,8
9,63
5,47
4,82
4,06
2,34
2,26
2,17
2
2
Identification
Electron transfer flavoprotein, beta subunit
Enoyl reductase
50S ribosomal protein L1
Electron transfer flavoprotein, alpha subunit
ATP-dependent Clp protease, proteolytic subunit ClpP
Sigma 54 modulation protein
Macrophage infectivity potentiator (Mip)
27kDa outer membrane protein
50S ribosomal protein L25, ribosomal 5S rRNA E-loop binding protein
Hypothetical protein lpl2247
Tableau 8 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 après
traitements par la monochloramine
N°
identification
YP 094723
YP 094585
YP 094363
YP 125941
YP 125969
YP 127582
YP 126782
YP 095467
YP 125639
YP 094372
YP 095880
YP 094723
YP 094969
YP 096958
5504
YP 094956
YP 128222
YP 096820
YP 126188
YP 096707
Masse (kDa)
PI
10,469
10,584
24,497
27,329
11,279
33,385
16,561
25,444
17,53
11,931
28,448
10,469
5,85
5,78
5,47
6,18
7,89
5,44
6,1
5,45
6,28
9,62
5,62
5,85
15,771
22,151
Not identified
27,317
21,626
7,39
24,788
23,64
5,79
5,89
Ratio
D20J0/D0J0
708,74
54,35
43,78
43,67
33,85
26,61
21,9
13,6
13,29
12,66
8,74
8,34
6,35
5,95
6,55
9,19
5,07
7,43
6,19
3,02
2,9
2,34
2,16
2,04
1,97
Identification
Hsp10, GroES
DNA binding protein Fis
50S ribosomal protein L1
Succinate dehydrogenase catalytic subunit
Hypothetical protein lpl0606
Hypothetical protein lpl2247
50S ribosomal protein L9
Transcriptional regulatory protein CpxR
Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
30S ribosomal protein S10
Enoyl reductase
10kDa chaperonin (Protein Cpn10) (groES protein)
(Heat shock protein A)
Universal stress protein A (UspA)
Peroxynitrite reductase AhpC/Tsa family
Not identified
Electron tranfer flavoprotein, beta subunit
Superoxide dismutase, iron
Cold shock protein CspE
Macrophage infectivity potentiator (Mip)
SpA stringent starvation protein A
Tableau 9 : Protéines dont la quantité augmente d’un facteur supérieur ou égal à 2 après 15
jours dans un milieu pauvre
N°
identification
YP 095880
YP 095741
6802
3602
YP 094363
YP 125847
YP 094956
YP 096667
YP 127022
Masse (kDa)
PI
28,448
5,62
30,739
6,35
Not identified
Not identified
24,497
5,47
35,436
6,22
27,317
6,35
28,794
6,14
28,128
6,33
Ratio D0J15/D0J0
starvation
33,47
15,97
6,47
6,19
2,99
2,34
2,07
1,91
1,88
Identification
Enoyl reductase
30S ribosomal protein S2
Not identified
Not identified
50S ribosomal protein L1
Hypothetical protein lpl0481
Electron transfert flavoprotein, beta subunit
Pantoate-beta-alanine ligase
Hypothetical protein lpl1683
Remarque : A titre d’information, tous les résultats de variations d’expression des
protéines, dans chacune des trois conditions, sont présentés en annexes 7, 8 et 9.
70
Nous pouvons observer que, parmi les différentes protéines dont la quantité augmente, les
protéines qui semblent plus spécifiques à l’état VBNC, par rapport aux stress
monochloramine et carence nutritionnelle, peuvent être classées en quatre catégories : facteur
de virulence, synthèse protéique, production d’énergie et enveloppe cellulaire. Les différentes
protéines sont représentées sur le gel en Figure 13.
"
#
'
$
%&
& *+
,(
()
!
-
%
Figure 13 : Localisation des protéines dont la quantité est augmentée d’un facteur
supérieur ou égal à 2 à l’état VBNC (gel réalisé en déposant 150 µg de protéines extraites de
populations de L. pneumophila Lens traitées par 20 mg/L de monochloramine puis restées 15 jours dans
le milieu pauvre)
Facteur de virulence
Parmi ces protéines, la protéine Mip a retenu notre intérêt car c’est un facteur de
virulence nécessaire pour les premières étapes d’infection intracellulaire des cellules hôtes
(Cianciotto, 2001). L’expression de ce facteur est augmentée d’un facteur 2 suite au
traitement monochloramine puis d’un facteur 2,26 15 jours après ce traitement. Il ne semble
pas varier de façon significative dans la condition de carence en nutriments. Ce qui signifie
que la protéine Mip est exprimée environ 4 fois plus dans l’état VBNC qu’à l’état cultivable
71
le jour du traitement (J0). Une analyse électrophorétique 2D réalisée 64 jours après l’entrée à
l’état VBNC a montré que cette protéine était toujours détectable (résultats non montrés).
Cela pourrait indiquer le maintien d’un état de virulence à l’état VBNC. Ce qui pourrait être
rapproché de leur capacité à être réveillées par les amibes (Steinert et al.,1997 ; Garc a et al.,
2007).
Synthèse protéique
La sous-unité ribosomale 50S contient 34 protéines différentes (L1 à L34) et deux
molécules d’ARN (23S et 5S) et est responsable de la formation de la liaison peptidique via la
peptidyl-tranférase qui la compose.
La protéine L1 se lie directement à l’ARNr 23S et est localisée près du site où le facteur
d’élongation Tu est lié au ribosome.
Dans l’état VBNC, les protéines ribosomales L1 et L25 de la sous unité 50S voient leur
expression augmentée d’un facteur 5,47 et 2 respectivement. La production de la protéine
ribosomales L25 ne semble pas varier dans les autres conditions (Tableaux 1 et 2) alors que
celle de L1 est aussi augmentée dans les deux autres conditions. Cette augmentation est plus
spectaculaire suite au traitement monochloramine (x 43,78) que dans les conditions de
carence nutritionnelle (x 2,99). La comparaison de ces différents résultats montre que la
protéine ribosomale L1 est beaucoup plus exprimée à l’état VBNC que dans les conditions de
carence en nutriments.
Si tous les éléments de la sous-unité étaient augmentés, cela suggérerait que la synthèse
ribosomique serait augmentée. Or dans notre étude, seulement 2 protéines ribosomales ont été
détectées comme ayant une accumulation significative de leur quantité dans l’état VBNC. Les
autres protéines ne peuvent peut être pas être visualisées par l’approche protéomique. Une
analyse transcriptomique pourrait être utilisée pour étudier la variation d’expression des gènes
codant pour les autres protéines ribosomales. Pour déterminer si la synthèse ribosomique est
maintenue ou augmentée, il faudrait utiliser par exemple une approche d’hybridation in situ
(FISH) sur l’ARN 16S. Les résultats pourraient être confirmés grâce à des techniques telles
que l’utilisation d’anticorps.
Le facteur de transcription sigma 54 (
54
), codé par le gène rpoN, a d’abord été décrit,
chez des bactéries Gram-négatives telles que Salmonella Typhimurium ou Escherichia coli,
comme étant impliqué dans le métabolisme de l’azote en contrôlant, notamment chez
Salmonella Typhimurium l’expression de la glutamine synthétase, enzyme jouant un rôle
72
essentiel dans le métabolisme de l’azote en catalysant la condensation du glutamate et de
l’ammoniaque pour former la glutamine. Cet acide aminé est un élément crucial de la
métabolisation de l'
azote : l’ammoniac formé par la fixation de l’azote est assimilée en
composé organique par la conversion de l'
acide glutamique en glutamine. De plus, la
glutamine peut être utilisée comme donneur d'
azote dans les biosynthèses de nombreux
composés, y compris d'
autres acides aminés, les purines et les pyrimidines.
Le facteur
54
joue également un rôle dans le métabolisme du carbone ainsi que dans
l’initiation de la transcription en formant un complexe enzymatique appelé holoenzyme
spécifique de l’initiation de la transcription. Il est capable de reconnaître spécifiquement la
séquence promotrice -24/-12 (séquence consensus relativement bien conservée) et se lie à
l’ARN polymérase ADN-dépendante, assurant une association forte et spécifique de cette
enzyme sur l’ADN (Buck et al., 2000).
Chez L. pneumophila, ce facteur sigma ainsi que le régulateur transcriptionnel FleQ semblent
être nécessaire pour la formation de flagelles. En effet, la mutation des gène rpoN et fleQ
conduit à des mutants non flagellés (Jacobi et al., 2004).
Le facteur
54
voit son expression augmentée de façon significative (2,34) à l’état
VBNC alors que dans les deux autres conditions il ne semble pas y avoir d’augmentation.
Une augmentation de ce facteur
54
pourrait ainsi avoir plusieurs significations : métabolisme
de l’azote et du carbone augmenté ou du moins actif, une transcription active ou encore un
maintien de la production de flagelles, qui est un des facteurs de virulence chez Legionella.
Ce dernier aspect pourrait indiquer, comme pour la protéine Mip, le maintien d’un état de
virulence à l’état VBNC.
Afin de vérifier le maintien de la formation de flagelles, il serait utile d’étudier les variations
d’expression du gène FleQ en utilisant l’analyse transcriptomique.
Production d’énergie
Les protéines montrant les expressions les plus importantes (entre 4 et 21,8) sont des protéines
impliquées dans les voies de production d’énergie : ATP-dépendant Clp protease, enoyl
reductase et electron transfer flavoprotein.
L’Electron transfer flavoprotein sert d’accepteur spécifique d’électrons pour d’autres
désydrogénases. Elle permet le transfert des électrons vers la chaîne respiratoire principale via
l’ETF-ubiquinone oxydoréductase. La production de la sous-unité beta de cette protéine dans
les cellules à l’état VBNC est de 10 fois supérieure à celle des cellules cultivables restées 15
73
jours dans le milieu de repos (21,8/2,07). Cette augmentation peut être le reflet d’un échange
important d’électrons et donc de l’activité respiratoire des cellules.
La protéolyse est un élément essentiel du métabolisme cellulaire et de la réponse aux
stimuli environnementaux. Elle module l’activité de nombreux peptides régulateurs et assure
l‘élimination des protéines anormales ou endommagées. Chez les bactéries, il existe différents
systèmes d’adressage des substrats et plusieurs protéases ATP-dépendantes. Chacune associe
une activité ATPase « chaperonne » et une activité peptidase distinctes. Les principales
protéases ATP-dépendante bactériennes sont FtsH, Lon, HslUV et les Clp-protéases. Ces
dernières sont des complexes multimériques assemblés autour de la protéase ClpP et sont
essentielles à l’adaptation rapide aux conditions de stress, en assurant le fonctionnement
d‘importantes voies métaboliques. Pour plusieurs espèces pathogènes, la protéolyse ClpPdépendante est indispensable au déroulement de l’infection, en favorisant la survie chez l’hôte
ou en modulant directement l’activité de facteurs de virulence (Gaillot, 2004a).
Dans notre cas, l’ATP-dependant Clp protease voit son expression augmentée seulement dans
l’état VBNC et d’un facteur 4,06. En vue de ce qui est connu des Clp-protéases bactériennes,
le maintien d’un état de la virulence à l’état VBNC n’est pas à écarter.
L’enoyl reductase, impliquée dans la biosynthèse des acides gras, voit son expression
augmenter dans les trois conditions (Tableaux 7, 8 et 9). Suite au stress monochloramine cette
expression est augmentée d’un facteur 9,63, dans l’état VBNC, elle est de nouveau augmentée
d’un facteur 8,74. Cependant, dans les conditions de carence en nutriments, elle augmente
d’un facteur 33,47. Cette protéine est exprimée de façon importante dans les différentes
conditions de stress. Cette protéine ne semble pas spécifique de l’état VBNC. Il a été observé
dans nos différentes conditions, diverses formes modifiées de cette protéine ; il nous est
difficile de statuer sur cette protéine.
Enveloppe cellulaire
A l’image de ce qui a été décrit chez E. coli O157 :H7 (Asakura et al., 2007), une protéine de
la membrane externe Omp voit sa production augmenter 15 jours après l’entrée à l’état VBNC
(x 2,17), mais de façon moins spectaculaire que chez E. coli (x 2100). Cette protéine est
toujours détectée sur gel 2D 64 jours après l’entrée à l’état VBNC.
74
L’accumulation de la quantité de ces différentes protéines à l’état VBNC semble indiquer que
les VBNC peuvent utiliser potentiellement différentes voies métaboliques pour obtenir de
l’énergie et pouvoir survivre dans les conditions défavorables.
Cependant, pour chaque protéine, nous n’avons pas observé, dans la zone étudiée,
d’augmentation de quantité de toutes les protéines impliquées dans une voie métabolique. Il
serait nécessaire de compléter les résultats obtenus par une analyse globale de l’expression
des gènes comme la transcriptomique.
Les différents résultats obtenus pourraient également être confirmés grâce à des techniques
telles que l’utilisation d’anticorps, la mesure d’activité métabolique ou l’utilisation de RTPCR (cible : ARNm).
75
2. Impact du traitement thermique
2.1. Cultivabilité et viabilité
La température optimale de croissance des légionelles est comprise entre 25 et 43°C.
Ces bactéries se retrouvent dans les réseaux d’eaux où elles prolifèrent dans l’eau stagnante et
lorsque la température de l'
eau est comprise entre 25° et 43°C, en présence des différentes
composantes minérales et biologiques (Abu-Kwaik et al. 1998).
Afin d’éviter la prolifération des légionelles dans les réseaux d’eaux chaudes, la Direction
Générale de la Santé conseille de maintenir en tout point du réseau, des températures
comprises entre 50 et 60°C. À ces températures, les durées moyennes nécessaires pour abattre
1 logarithme de légionelles sont courtes (de l’ordre de la minute). En effet, à 55°C, 57,5°C et
60°C ces durées sont respectivement de 20, 6 et 2 minutes.
Au cours de nos travaux, nous avons cherché dans nos échantillons une variante de la
CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) que nous pouvons appeler la TMI (Température
Minimale Inhibitrice) c'
est-à-dire la température minimale pour laquelle nous n’observons pas
de bactéries cultivables dans les échantillons prélevés (c'
est-à-dire moins de une UFC dans
300 µL d’échantillon traité) ; le but étant de rechercher la présence de bactéries à l’état VBNC
dans ces échantillons.
Nous avons choisi des traitements de 1 heure et la gamme de températures testée correspond à
celle conseillée par la Direction Générale de la Santé pour éviter la prolifération des
légionelles dans les réseaux d’eaux chaudes : c'
est-à-dire entre 50 et 60°C.
La Figure 14Figure 14 présente l’évolution du nombre de bactéries cultivables/mL en
fonction de la température appliquée.
76
1,E+06
UFC/mL
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
50
52
54
56
58
60
Température (°C)
Figure 14 : Dénombrement des L. pneumophila cultivables après traitement thermique
(Les expériences ont été réalisées au moins 3 fois.)
Avant traitement, la concentration de la suspension bactérienne était de 1,86 ± 0,7.108
cellules cultivables par mL. Nous pouvons observer, sur la figure 1, que le nombre de
bactéries cultivables diminue de façon importante (4 log environ) suite à un traitement de 1 h
à 51°C et que plus la température augmente, plus le nombre de cellules cultivables diminue.
Nous avons observé moins de une UFC dans 300 µL d’échantillons traités avec des doses
d’oxydant supérieures ou égales à 20 mg/L ; ce qui correspond à moins de 3 UFC/mL environ
à 57,5°C.
Ces résultats sont en accord avec ce qui est rapporté dans la littérature à savoir qu’à 57,5°C le
temps moyen nécessaire pour abattre 1 logarithme de légionelles est de 6 minutes (CSHPF,
2001). Dans notre étude, le temps moyen d’inactivation d’une suspension à 108 cellules/mL
est d’environ 1 heure.
Cette température a été choisie pour rechercher la présence éventuelle de bactéries à l’état
VBNC.
Pour cela, après traitement, les cellules ont été placées plusieurs jours à 25°C dans un milieu
pauvre en nutriments constitué de BYE dilué au millième : ce milieu est appelé milieu de
repos.
Nous avons étudiés la viabilité des échantillons traités à cette température ainsi que des
échantillons non traités, au cours du temps. Pour cela, nous avons analysé l’intégrité
membranaire (BacLight) et l’activité estérase (Chemchrome V6), en utilisant un microscope à
épifluorescence. Les résultats obtenus sont représentés dans le Tableau 10.
77
Tableau 10 : Viabilité de Legionella pneumophila HL 0350 5056 non cultivable après
traitement à 57,5 C pendant une heure (moyenne de 3 expériences).
Non traité1
Traité2
Non traité1
Traité2
9
1 ± 0,52.108
0
74,3 ± 5,3
49,2 ± 6,6
% de Cellules
estérase
positives c
Traité2
41,8 ± 1,8
38
6 ± 1,3.105
0
61,1 ± 4,2
38,4 ± 0,9
36,0 ± 5,5
% de cellules à membrane
intègre b
UFC/mL
Repos a
0
38,7 ± 2,4
169
0
57,2 ± 5,8
a
Nombre de jours passés dans le milieu de repos après le traitement à 57,5°C
b
comptage réalisé après marquage avec le kit BacLight
c
comptage réalisé après marquage par le Chemchrome V6
1
cellules non traitées thermiquement
2
cellules non cultivables obtenues après traitement à 57,5°C pendant 1 H
40,0 ± 9,4
En ce qui concerne les échantillons non traités, nous pouvons observer que la quantité
de bactéries cultivables diminue en fonction du temps de séjour dans le milieu pauvre en
nutriments. Cette diminution s’accompagne d’une baisse du pourcentage de cellules à
membrane intègre qui semble plus importante (baisse de 14 % entre 9 et 169 jours) que celle
observée chez les bactéries à l’état VBNC (baisse de 10 % sur cette même période). Ceci
pourrait laisser supposer que les bactéries à l’état VBNC sont plus résistantes aux stress
environnementaux, ce qui a déjà été suggéré par Chang et al., 2007.
Les échantillons traités non cultivables présentent une proportion importante (environ
40 %) de cellules à membrane intègre quelque soit le temps d’incubation dans le milieu de
repos. Cette proportion de cellules viables varie peu au cours du temps.
En ce qui concerne l’activité estérase, nous avons réalisé l’analyse seulement sur les lots de
cellules non cultivables de façon à confirmer que les cellules sont à l’état VBNC. Le tableau
10 montre que, au sein de ces populations, le nombre de cellules possédant une activité
estérase est important et que cette quantité varie peu sur la période étudiée c'
est-à-dire 169
jours (Figure 15)
78
.
'
10 µm
Figure 15 : Observation en microscopie à épifluorescence de l’activité estérase de L.
pneumophila, 169 j après traitement à 57,5°C (Chemchrome V6)
Il est à noter que lors de notre étude de l’activité métabolique, nous avons observé trois types
d’intensité : des cellules avec une fluorescence verte prononcée (flèche 1 Figure 15), d’autres
cellules d’intensité moyenne (flèche 2) et des groupe de bactéries très faiblement
fluorescentes (groupe 3). Pour le calcul du nombre de bactéries présentant une activité
estérase, nous avons pris en compte les cellules de type 1 et 2. Nous avons considéré les
cellules de type 3 comme des « fantômes » ou « cadavres bactériens » puisque leur intensité
de fluorescenece est équivalente à des cellules restées 21 jours dans l’eau après un traitement
de une heure dans de l’isopropanol 100 % (résultats non montrés).
Le traitement à 57,5°C réalisé au cours de notre expérience conduit bien à la formation de
VBNC qui restent métaboliquement actives pendant au moins 169 jours. Ces résultats ont été
soumis à publication (voir article 2 après les annexes)
79
2.2. Analyse par électrophorèse bidimensionnelle.
A l’image de ce qui a été réalisé après traitement par la monochloramine, nous avons utilisé
l’électrophorèse 2D pour étudier le profil protéique des bactéries à l’état VBNC suite à un
traitement thermique et voir si les protéines exprimées dans cet état son différentes de celles
obtenues après traitement par la monochloramine. Ainsi on pourrait déterminer si l’expression
protéique à l’état VBNC est fonction des conditions conduisant à cet état.
Les différents gels obtenus sont représentés dans la Figure 16. L’analyse de ces gels est
actuellement en cours.
Figure 16 : Analyse protéomique de L. pneumophila traitées ou non par la chaleur après
incubation plusieurs jours dans le milieu de repos (A : échantillon non traité prélevé à J0, B :
échantillon non traité et prélevé 30 jours après incubation dans le milieu de repos, C : échantillon traité à 57,5°C
et prélevé à le jour du traitement, D : échantillon traité à 57,5°C et prélevé 30 jours après incubation dans le
milieu de repos (150 µg de protéines déposées). (Expériences réalisées 3 fois)
80
81
Figure 17 : Comparaison de séquences en acides aminés de Rpf entre L. pneumophila et Salmonella (! : I V, $ : L M, % : F Y, # : B D E N Q Z)
3. Identification du gène Rpf chez L. pneumophila
La description récente d’une protéine Rpf chez une bactérie Gram-négative, Salmonella
(Panutdapom et al., 2006) nous a conduit à chercher la présence d’une protéine similaire chez
Legionella pneumophila. L’interrogation de banques de données de L. pneumophila Lens,
Paris et Philadelphia disponibles sur expasy (http://www.expasy.org/tools/blast/) a montré
qu’il existait chez ces bactéries une séquence Rpf-like.
Les séquences de ces 3 souches de légionelles ont été comparées entre elles et avec la
séquence
de
Salmonella
grâce
à
un
outil
d’alignement
en
ligne
(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). Les résultats obtenus sont représentés
sur la Figure 17.
La comparaison de séquences montre que le gène rpf-like des trois souches de légionelles
étudiées possède 33 % d’identité (nucléotides) et 51 % de similarité (acides aminés) avec la
séquence Rpf de Salmonella en terme d’acides aminés.
La séquence de ce gène de la souche Lens possède 96 % d’identité (nucléotides) et 97 % de
similarité (acides aminés) avec celui de la souche Paris et 97 % d’identité (nucléotides) et 98
% de similarité (acides aminés) avec la souche Philadelphia.
Nous avons choisi de cloner le gène de la souche Lens.
Pour cela, nous avons dessiné des amorces pour pouvoir amplifier le gène correspondant chez
L. pneumophila. Afin de pouvoir cloner le fragment amplifié par la suite, nous avons introduit
aux extrémités des amorces des séquences correspondant aux sites de restriction des enzymes
de restriction : BamHI, HindIII, SphI et BglII.
3.1. Amplification du gène rpf chez L. pneumophila
La technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) permet d’amplifier rapidement un
fragment d’ADN. Pour cela, elle utilise d’une part des amorces oligonucléotidiques
complémentaires d’une séquence de l’ADN et d’autre part une ADN polymérase.
Dans notre étude, la PCR est utilisée afin d’amplifier le gène rpf codant pour ce qu’on
appellera par la suite la protéine recombinante rRpf. Après hybridation des amorces sur
l’ADN et élongation par l’ADN polymérase, les fragments d’ADN sont dénaturés afin de
82
permettre de nouveau l’hybridation des amorces. Ce cycle est ainsi répété plusieurs fois,
entraînant une amplification exponentielle du fragment d’ADN délimité par les deux amorces.
La taille des fragments d’ADN amplifiés par PCR a été réalisée par électrophorèse en
gel d’agarose 0,7 %.
La Figure 18 représente les résultats d’amplication PCR.
A
Lens Philadelphia
B
M 1Kb
1Kb
bp
Lens
bp
4072
3054
2036
1636
4072
3054
2036
1636
1018
1018
506,5
506
Figure 18 : Résultat de l’amplication du gène rpf chez L. pneumophila
A : ADN amplifié avec les amorces Rpf Lens Direct, Rpf Lens Inverse (pour le clônage His-tag en NTerminal)
B : ADN amplifié avec les amorces Rpf his dir2, Rpf his Reverse (pour le clonage His-tag en CTerminal)
Les fragments obtenus pour Lens et Philadelphia sont de tailles similaires qui correspondent à
la taille de l’amplicon attendue (686 pb). Par contre, pour la souche Paris, aucune bande n’est
visible.
Nous avons choisi de produire la protéine Rpf de la souche Lens après clonage chez E. coli en
la marquant en N ou C-terminal avec une queue polyhistidine, chez E. coli.
83
3.2. Expression des protéines recombinantes
3.2.1. Protéines recombinantes marquée en N-terminal
L’amplicon de la souche Lens a été cloné dans pCR-Blunt puis dans pQE30 et nous avons
obtenus des clones possédant la construction plasmidique permettant la production de Rpf
marquée en N-terminal par la queue poly-histidine.
Le séquençage des plasmides de quelques clones a montré qu’ils contenaient bien le gène rpf.
Nous avons donc réalisés des essais d’induction pendant 30 minutes à 4 heures la production
de cette protéine chez E. coli en utilisant de IPTG, dans du milieu LB contenant de
l’Ampicilline à 25 µg/mL et de la Kanamycine à 100 µg/mL, à 37°C sous agitation.
En parallèle, les même clones ont été cultivés en l’absence d’IPTG et ont servis de témoin
d’induction.
Les protéines ont ensuite été extraites et les extraits bruts déposés sur gel SDS-PAGE.
Les résultats obtenus sont représentés dans la Figure 19.
Figure 19 : Expression de la protéine Rpf marquée en N-terminal par une queue polyhistidine
Une bande correspondant à une masse d’environ 24 kDa et n’existant pas dans l’extrait
protéique non induit, est visible 30 minutes après induction par l’IPTG (flèche Figure 19).
L’intensité de cette bande s’intensifie lorsque le temps d’induction augmente. La protéine
clonée semble avoir été produite (masse attendue : 24,43 kDa).
La protéine Rpf a été purifiée sur résine de Nickel en présence ou non de Tween 20. L’éluat
obtenu a été déposé sur gel SDS-PAGE. Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure
20.
84
Figure 20 : Purification de la protéine Rpf marquée en N-terminal.
La bande à 24 kDa correspondant à la protéine attendue est présente dans les trois extrait bruts
(EB) avec ou sans Tween 20.
Les puits E0 représente la fraction non retenue lors le la première étape de purification et les
puits EP l’éluat obtenu en fin de purification lors du décrochage des protéines fixées sur la
résine.
Les puits EBB et EWB correspondent à des étapes de lavages.
On constate tout d’abord que, dans la fraction (E0) une quantité non négligeable de protéine
d’intérêt n’a pas été retenue par la résine. Cependant, lors des étapes de lavage, cette protéine
n’a pas été retrouvée. Lors de l’élution (puits EP), la protéine est bien récupérée mais d’autres
bandes protéiques sont également présentes alors que nous aurions du obtenir seulement la
bande correspondant à la protéine.
L’ajout de Tween 20 pendant la purification permet d’obtenir des quantités de Rpf plus
importante qu’en absence de Tween 20.
La présence en quantité importante de Rpf comparée aux autres protéines nous a conduit à
conserver cette fraction pour réaliser des tests de réveil sur des légionelles à l’état VBNC.
85
3.2.2. Protéines recombinantes marquée en C-terminal
Le clonage en C-terminal a été réalisé plusieurs fois en utilisant les plasmides pCR-Blunt et
pQE70. Nous avons obtenu peu de colonies pour chaque essai.
L’analyse de ces clones a montré que nous n’avons pas réussi le clonage attendu.
La poursuite de ce travail est actuellement en cours.
3.2.3. Test de réveil de L. pneumophila non cultivables
Les différents tests de réveil réalisés sur L. pneumophila à l’état VBNC n’ont pas conduit à un
retour à la cultivabilité. Ceci est peut être dû à de nombreuses raisons. Il peut s’agir de
conditions opératoires défavorables, du fait d’une concentration trop faible de protéine Rpf,
d’une durée de contact inadaptée, d’un mauvais choix de milieu, ou encore d’un mauvais
choix dans la procédure de production de VBNC. La protéine Rpf obtenue après purification
n’était peut-être pas suffisamment pure. Enfin, la protéine marquée en N-terminal n’est peutêtre pas active.
Suite à ces résultats, nous avons comparé la séquence des Rpf de Legionella, Salmonella et
Micrococcus luteus (Figure 21) pour rechercher le résidu glutamate Glu54 et les deux résidus
cystéine Cys53 et Cys114, qui ont été décrits comme étant impliqués dans la réaction de
catalyse du peptidoglycanne (Telkov et al., 2006). Ces trois résidus ne sont pas situés à la
même position que chez M. luteus. Ceci pourrait expliquer pourquoi la Rpf ne réveille pas les
VBNC. Cependant, chez Salmonella, ces trois résidus ne sont pas non plus situés à la même
position que chez M. luteus, cependant cette molécule est active pour le réveil des VBNC
chez Salmonella (Panutdaporn et al., 2006). Par conséquent, ces acides aminés ne semblent
pas être impliqués dans le mécanisme de réveil chez Salmonella.
Il faudrait étudier la configuration de la Rpf de Legionella et la comparer avec celle des Rpf
connues afin de voir si la structure adoptée par la protéine présente des homologies avec la
structure repliée de glycoside hydrolases.
Il serait peut être nécessaire de tester d’autres protéines Rpf, notamment celle de M. luteus et
de Salmonella, sur les échantillons non cultivables de L.pneumophila.
A l’inverse, la protéine Rpf de L.pneumophila que nous avons produite pourrait être testée sur
ces microorganismes afin de tester sa capacité de réveil ou son influence sur la croissance.
86
87
Figure 21 : Comparaison de séquences en acides aminés de Rpf entre L. pneumophila, Salmonella et Micrococcus luteus
(! : I V, $ : L M, % : F Y, # : B D E N Q Z)
CONCLUSIONS / PERSPECTIVES
Trois décennies après sa découverte, Legionella constitue toujours un problème de santé
publique et suscite encore un grand intérêt au sein de la communauté microbiologique.
Cette bactérie est présente dans de nombreux milieux aquatiques, naturels ou artificiels, où
elle est capable d’adopter de multiples stratégies de survie afin d’échapper à son éradication.
Dans les installations artificielles telles que les tours aéroréfrigérantes par exemple,
Legionella trouve une protection à l’intérieur des biofilms ainsi que dans les protozoaires
(souvent les amibes) au sein desquelles elle est capable de se multiplier. Ces deux
composantes posent problème puisque elles rendent difficile l’éradication de cette bactérie.
Il a également été montré que cette bactérie pouvait exister dans l’environnement sous une
forme viable mais non cultivable sur milieu gélosé : l’état VBNC. Cet état pose problème
d’un point de vue détection et dénombrement par les méthodes utilisées en routine dans les
laboratoires d’analyses. Des travaux ont montré que dans cet état, la bactérie est capable
d’infecter les amibes généralement retrouvées dans les installations à risque (Acanthamoeba
castellanii par exemple), de s’y multiplier et de retrouver leur caractère cultivable. De plus, ce
passage dans les amibes augmenterait également la virulence de cette bactérie. Ceci peut
suggérer que, sous la forme viable non cultivable, Legionella est potentiellement infectieuse
pour l’Homme puisque cette bactérie est capable d’infecter des macrophages et de s’y
multiplier.
Dans ce contexte, les objectifs des travaux présentés dans ce mémoire étaient :
-
d’étudier la survie de L. pneumophila après traitements thermique et oxydant
(monochloramine)
-
d’étudier l’état VBNC chez cette bactérie en utilisant une approche protéomique
-
de rechercher l’existence d’un facteur de ressuscitation Rpf chez L. pneumophila et
d’étudier sa capacité à réveiller les VBNC
88
La première partie de notre travail a porté sur l’impact des traitements par la monochloramine
et la chaleur sur des populations planctoniques de légionelles. Nous avons montré que ces
traitements étaient capables de conduire à la formation de VBNC chez cette bactérie.
En effet, suite à des traitements de une heure par 20 mg/L de monochloramine et à 57,5°C,
des populations, qui présentaient initialement une concentration de légionelles de 108
UFC/mL, sont devenues non détectables sur milieu gélosé. Cependant, l’utilisation de divers
outils analytiques a pu montrer que 20 à 40 % des cellules étaient encore viables après
traitement et que cette viabilité pouvait être maintenue pendant au moins 169 jours.
Bien que nos études aient portées sur des suspensions constituées uniquement de légionelles
et à des concentrations qu’on rencontre rarement dans l’environnement, il est possible
d’envisager que les traitements appliqués dans des réseaux d’eaux puissent conduire
également à la formation de bactéries à l’état VBNC. Ceci pourrait expliquer pourquoi on
observe une recolonisation rapide des réseaux d’eaux.
Il serait nécessaire de développer un outil analytique de routine permettant de prendre en
compte cette population non cultivable.
Dans une deuxième partie, notre travail a consisté à étudier les variations d’expression
protéique au sein des populations que nous avons considérées comme VBNC.
Par comparaison avec des cellules ayant subit un stress monochloramine ou une carence
nutritionnelle, nous avons pu mettre en évidence la surexpression de 10 protéines semblant
spécifiques de l’état VBNC.
Parmi ces protéines, on retrouve un facteur de virulence nécessaire pour les premières étapes
d’infection intracellulaire de cellules hôte : la protéine Mip.
On retrouve également des protéines impliquées dans :
-
la synthèse protéique : 2 sous-unités ribosomales 50S (L1 et L25) et le facteur de
transcription sigma 54
-
la production d’énergie : l’electron transfer flavoprotein, l’ATP-dependant Clp
protease, l’enoyl reductase
-
l’enveloppe cellulaire : une protéine Omp de 27 kDa.
Ces résultats ont montré, dans un premier temps, que les Legionella non cultivables obtenues
dans nos conditions étaient douées d’une activité métabolique de part leur capacité à
synthétiser des protéines.
89
Dans un second temps, la surexpression de protéines impliquées dans diverses voies
métaboliques semble indiquer que les VBNC peuvent utiliser potentiellement ces voies pour
obtenir l’énergie nécessaire à leur survie.
Outre la protéine Mip, plusieurs des protéines induites dans l’état VBNC semblent avoir un
lien, direct ou indirect, avec la virulence de la bactérie : c’est le cas du facteur sigma 54 qui
est impliqué dans la formation de flagelles, impliquées dans l’invasion des cellules hôtes et
l’ATP-dependant Clp protease, dont l’activité est indispensable au déroulement de l’infection
chez certains pathogènes. Ces résultats corroborent l’hypothèse selon laquelle les bactéries à
l’état VBNC sont potentiellement infectieuses et virulentes pour les cellules hôtes. Ainsi, si
ces bactéries à l’état VBNC se retrouve inhalées par l’Homme, on peut envisager qu’elles
puissent être responsables du développement de la maladie chez celui-ci.
Ceci confirme la nécessité d’outils permettant de détecter les Legionella, ou d’autres bactéries
pathogènes, à l’état VBNC.
De nombreuses études ont montré que chez plusieurs bactéries Gram-positives et chez
Salmonella, il existe un facteur capable de réveiller ces bactéries à l’état VBNC, c'
est-à-dire
de leur rendre leur capacité à se multiplier sur milieu gélosé : ce facteur est le Resuscitationpromoting factor Rpf.
Cette protéine pourrait être l’outil permettant de détecter les bactéries à l’état VBNC dans
l’environnement.
La dernière partie de nos travaux a consistée à rechercher la présence d’un gène rpf-like chez
L. pneumophila.
L’interrogation de banques de données nous a permis de mettre en évidence chez cette
bactérie d’un gène rpf-like possédant 33 % d’identité (nucléotides) et 51 % de similarité
(acides aminés) avec celui de Salmonella. Nous avons donc cloné ce gène, produit et purifié la
protéine recombinante. Les essais de réveil de Legionella à l’état VBNC n’ont pas conduit à
un retour à la cultivabilité. La poursuite de ce travail est actuellement en cours.
Au terme de ce travail, il est important d’en examiner les perspectives.
En ce qui concerne la viabilité des cellules non cultivables, il serait nécessaire de développer
une technique rapide et efficace permettant de déterminer leur viabilité et de les détecter dans
les laboratoires d’analyses. Pour cela, on pourrait utiliser l’hybridation in situ (FISH) pour
détecter une cible moléculaire spécifique des cellules viables cultivables ou non.
90
L’analyse des protéines exprimées à l’état VBNC suite à un traitement thermique doit être
poursuivie afin de déterminer si les protéines qui sont surexprimées correspondent à celles qui
le sont suite à des traitements oxydants. Si oui, il serait peut être possible d’identifier une
protéine commune à ces différentes VBNC et l’utiliser comme cible pour des méthodes de
détection.
Il faudrait aussi envisager une étude transcriptomique afin de compléter des résultats obtenus
par protéomique et pour établir un profil global plus précis des VBNC.
La mutation de gènes surexprimés à l’état VBNC pourrait indiquer s’ils sont nécessaires à la
formation et au maintien de l’état VBNC : ce qui permettrait d’orienter les traitements.
Les travaux sur la protéine Rpf doivent être poursuivis. Si cette protéine s’avère capable de
réveiller les Legionella, alors on pourrait envisager de l’utiliser, en analyse de routine, pour la
recherche de cette bactérie dans l’environnement.
91
ANNEXE 1 :
Préparation des milieux de culture pour L. pneumophila et E. coli
Milieu gélosé BCYEComposition pour 1 litre :
-
Extrait de levure (Difco, 212750)
12 g
-
Tampon ACES (Sigma, A-9758)
10 g
-
Charbon actif (Sigma, C-5510)
2g
-
Alpha-cétoglutarate (Sigma, K-2000)
1g
-
Hydroxyde de potassium
2,8 g
-
Agar (Difco, 214530)
15 g
-
L-cystéine hydrochloride (Sigma, C-7880)
0.5 g
-
Pyrophosphate de fer (Sigma, P-6526)
0.3 g
Tous les composants, sauf la L-cystéine et le pyrophosphate de fer, sont dissous dans environ
800 mL d’eau distillée et le pH est ajusté à 6.9 ± 0,05 à l'
aide de solution de HCl 1 M ou de
solution de KOH 1 M si nécessaire. Ensuite, compléter le volume à 1 litre avec de l’eau
distillée. Stériliser à l'
autoclave à 121°C pendant 15 min.
La L-cystéine est préparée à une concentration de 80 g/L et le pyrophosphate de fer à 50 g/L à
l'
aide d’eau distillée puis filtrés sur filtre seringue 0,2 µm et conservés à 4°C jusqu'
à
utilisation. Ces solution 200 fois concentrées seront ajoutées au milieu en surfusion à 50°C
lors de l'
utilisation à raison de 2,5 mL/500 mL de milieu.
Milieu liquide BYELa composition pour 1 litre est la même que celle du milieu gélosé sans charbon actif ni agar.
Le milieu n’est pas autoclavé mais stérilisé par filtration sur 0,22µm.
La L-cystéine à 80 g/L et le pyrophosphate de fer à 50 g/L sont préparés comme pour le
milieu gélosé et sont ajoutées au milieu liquide au moment de l'
utilisation à raison de 25 µL/5
mL de milieu.
92
Milieu gélosé LB
Composition pour 1 litre :
-
Bactotryptone
10 g
-
Extrait de levure
-
Chlorure de sodium
10 g
-
Agar
15 g
-
Eau distillée q.s.p
5g
1L
Le milieu est ensuite stérilisé 15 min à 121°C
Milieu liquide LB
La composition pour 1 litre est la même que celle du milieu gélosé sans agar.
Le milieu est ensuite stérilisé 15 min à 121°C
93
ANNEXE 2 :
Préparation des milieux de culture pour Acanthamoeba castellanii
Milieu PYG liquide :
Composition pour 1 litre:
Dissoudre dans 900 mL d’EUP:
-
Protéose peptone
20 g
-
Extrait de levure
1g
Ensuite, ajouter :
-
MgSO4 : 7H2O 0,4M
10 mL
-
CaCl2 : 2H2O 0,05M
8 mL
-
Citrate de sodium
1g
-
Na2HPO4 : 2H2O 0,25M
10 mL
-
KH2PO4 0,25M
10 mL
Le pH est ajusté à 6,5 avec une solution de HCl 1N ou de NaOH 1N puis le milieu est
autoclavé à 120°C pendant 20 min. Lorsque le milieu est refroidi, il est ajouté stérilement :
-
(NH4)2FeII(SO4)2 : 6H2O 5mM stérile (filtré sur 0,22µm)
10 mL
-
Glucose 2M stérile
50 mL
Préparation du tampon amibes (Acanthamoeba Buffer) pour 1 L :
La préparation est la même que pour le milieu PYG mais sans peptone, extrait de levure ni
glucose.
94
ANNEXE 3 :
Préparation des solutions nécessaires au traitement NH2Cl
Tampon pH=6
60,6 mL d’acide phosphorique (H3PO4) à 85% (d = 1,7) sont introduits dans 800 mL d’EUP.
Le pH est alors neutralisé jusqu’à un pH voisin de 5 par une solution de NaOH 20N.
0,8 g de sel disodique dihydraté d’EDTA sont ensuite ajoutés ainsi que 0,02 g de chlorure
mercurique. Le volume est ensuite complété à 990 mL environ, le pH ajusté à 6 par une
solution de NaOH 20N puis la solution est complétée à 1 litre avec de l’EUP.
Solution de DPD
Dans 250 mL d’EUP, sont ajoutés, sous agitation :
-
0,2 g du sel disodique dihydraté d’EDTA
-
2 mL d’acide sulfurique concentré
Puis, 1,1 g de sulfate anhydre de N,N-diéthylphénylène-1,4-diamine (ou 1,5 g de la forme
pentahydratée) sont dissout dans ce mélange dont le volume est ensuite ajusté à 1 litre.
Cette solution est conservée dans un flacon en verre brin à l’abri de la chaleur pendant un
mois. Lorsque cette solution devient rose, elle doit être refaite.
Solution de monochloramine (NH2Cl)
La monochloramine est préparée par action du chlore (hypochlorite de sodium) sur l’azote
ammoniacal (solution de chlorure d’ammonium).
Cl2 + NH3
NH2Cl + HCl
Dans 800 mL d’EUP, ajouter:
4 mL de solution de NaHCO3 à 1M (qui sert de tampon)
56 mL de solution de NH4Cl à 100 mM
Le pH est ajusté à 9,1 avec une solution de soude à 0.5M puis la solution est agitée pendant 3
min. 2mL de solution commerciale de NaOCl à 150g Cl2/L sont ensuite ajoutés lentement et
le pH est de nouveau ajusté à 9,1 avec de l'
acide sulfurique 1M. le volume est ajusté à 1 L
avec de l’EUP et la solution conservée au frais, à l'
abri de la lumière pendant maximum 4
jours.
Cette solution est dosée grâce à la méthode DPD (N, N-Diéthyl-P-Phénylènediamine).
95
Dosage de la solution de monochloramine
Principe :
La solution de monochloramine est dosée par la méthode colorimétrique à la N, N-Diéthyl-PPhénylènediamine (DPD). Cette technique de dosage est décrite dans la norme AFNOR NF
T90-038 (1994). En milieu neutre, les halogènes oxydent la DPD en radical semiquinone,
suivant la réaction suivante :
Le radical ainsi obtenu est de couleur rouge et présente un spectre à 2 maximums d’absorption
(510nm et 550nm).
Dans un mélange chlore-chloramines, la DPD est seulement oxydée par le chlore libre. Les
chloramines ne réagissant pas avec la DPD, il est généralement ajouté au mélange réactionnel
de dosage de l’iodure de potassium (KI) qui est oxydé par la monochloramine et qui oxyde
par la suite le réactif DPD (A.F.N.O.R., 1987; Soulard et al., 1981).
Afin de doser la monochloramine, 250 µL de tampon pH=6 et 250 µL de solution de DPD
sont mélangés sous agitation à 5ml d’échantillon. L’ajout de 10 µL d’iodure de potassium à
(KI) à 5 g/L libère de l’iode qui réagit sur la DPD et permet d’obtenir une coloration rose dont
l’intensité est mesurée à une longueur d’onde de 510nm, dans une cuve de 1 cm sur un
spectrophotomètre Thermo Spectronic, Biomate 3 (Bioblock). La courbe d’étalonnage est
obtenue par dilution d’une solution mère d’hypochlorite de sodium dans de l’eau ultra pure
tamponnée à pH 7,8. Elle permet de doser des solutions de chlore et de monochloramine dont
la concentration varie entre 0 et 5 mg Cl2/L. Lorsque la concentration est supérieure à 5 mg
Cl2/L, une dilution est réalisée avant le dosage. La limite de détection de cette méthode est
estimée à 0,03 mg CL2/L.
La concentration de la solution mère est déterminée grâce à l'
équation :
[NH2Cl] en mg/L = (DO * 200) / 0,2335
Le résultat est exprimé en mg d’équivalent chlore (Cl2)/L.
96
ANNEXE 4 :
Préparation des gels d’électrophorèse 2D
Gels de séparation (pour 2 grands gels)
Acrylamide 40%
23,55 mL
Bis 2%
12,57 mL
Tris pH 8,9 1 M
29,02 mL
Eau milliQ
11,56 mL
SDS 20%
387 µL
TEMED (6,6 M) 76,7%
60,75 µL
Ammonium PerSulfate (APS) 10% (w/v)
232,2 µL
L’Ammonium PerSulfate (APS) et le TEMED sont ajoutés juste avant de couler les gels. Les
2 gels sont ensuite coulés en laissant 1,5cm en haut pour le gel de concentration et le strip puis
5mL de 1-butanol sont ajoutés au-dessus des gels de façon à régulariser la surface du gel et
éviter l'
évaporation. Après polymérisation, le butanol est enlevé, la surface des gels est rincée
abondamment plusieurs fois avec de l'
EUP puis de l’EUP est ajoutée à la surface des gels. Les
gels sont ensuite placés à 4°C pendant la nuit. Ensuite, l’eau à la surface des gels de résolution
est enlevée et le restant d’eau est ôté en utilisant du papier absorbant. Les gels de
concentration sont ensuite coulés à la surface des gels de résolution.
Gels de concentration (pour 2 gels)
Acrylamide 40%
1,384 mL
Bis 2%
0,736 mL
Tris pH 6,8 1M
1,522 mL
Eau milliQ
8,37 mL
SDS 20%
60,9 µL
TEMED (6,6 M) 76,7%
39,75 µL
APS 10% (w/v)
60,9 µL
L’APS et le TEMED sont ajoutés juste avant de couler les gels. Les 2 gels sont ensuite coulés
au-dessus des gels de résolution en laissant 0,5cm au-dessus du gel de concentration pour
pouvoir déposer la bandelette de gel par la suite. Ils sont ensuite recouverts par du 1-butanol
afin de régulariser leur surface. Après polymérisation, le 1-butanol est enlevé, la surface des
gels rincée abondamment à l’EUP et du tampon de migration 1 X (25 mM Tris; 0,192 M
Glycine, pH 8,3, 0,1% SDS) est ajouté à la surface des gels afin de faciliter le dépôt des
bandelettes de gels à la surface des gels de concentration.
97
ANNEXE 5 :
Préparation des gels d’électrophorèse pour la SDS-PAGE
Préparation du gel de concentration (2,5mL):
Acrylamide 40%
0,2265 mL
Bis 2%
0,1545 mL
Tampon de concentration 4X
0,625 mL
EUP
1,494 mL
APS 25%
25 µL
TEMED
2,5 µL
Préparation du gel de résolution (5mL):
Acrylamide 40%
1,45 mL
Bis 2%
0,99 mL
Tampon de résolution 4X
1,25 mL
EUP
1,31 mL
APS 25%
12,5 µL
TEMED
1,25 µL
Le gel de concentration est coulé au-dessus du gel de résolution.
Remarque : Avant dépôt, 50µL de chaque échantillon protéique sont ajoutés à 50µL de
« tampon de charge DTT » (0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, 25 % glycérol, 2 % SDS, 0,01 %
Bleu de Bromphénol, 0,2 M DTT). Chauffer à 100°C pendant 5min.
98
ANNEXE 6 :
Fixation et coloration des protéines
(Protocole de coloration au Bleu de Coomassie colloïdal)
Solution A:
100g (NH4)2SO4 est dissous dans environ 800mL H2O ultra pure et 20g de H3PO4 85%
(11,76mL) sont ensuite ajoutés. Ajuster le volume à 980mL.
Solution B:
Du Bleu de Coomassie-G250 à 5% (w/v) est préparé dans H2O ultra pure.
Mélanger les solutions A et B dans des proportions de 98% de solution A et 2% de solution
B.
Ce qui correspond à : 31,36 mL de solution A + 0,64 mL de solution B.
Agiter le mélange à grande vitesse pendant la journée. La solution en résultant est appelée
solution C.
Solution de coloration (40 mL par gel):
Mélanger 80% de solution C avec 20% de méthanol.
Ce qui correspond à : 32 mL de solution C + 8 mL de méthanol.
N. B.: La solution de coloration peut être utilisée le même jour que celui de la préparation.
Procédure de coloration:
-
Fixer le gel pendant une heure dans 40 mL de solution de fixation (40% méthanol
et 10% acide acétique. 40 mL par gel. Ce qui correspond à : 16 mL de méthanol +
4 mL d’acide acétique + 20 mL d’eau ultra pure).
-
Enlever la solution de fixation et la remplacer par 40 mL de solution de
coloration. Mettre sous agitation lente pendant une nuit.
-
La coloration peut être réalisée toute la nuit, mais aussi pendant un minimum de 3
heures.
-
Le gel est ensuite décoloré dans H2O ultra pure.
99
PI
Ratio D20J15/D20J0
VBNC
Identification
YP 094956
YP 095880
YP 094363
YP 094957
YP 095885
YP 094520
YP 126188
YP 095867
YP 096657
YP 127582
YP 094723
YP 125941
YP 128222
YP 094585
27,317
28,448
24,497
33,404
23,76
11,402
24,788
28,476
23,972
33,385
10,469
27,329
21,626
10,584
6,35
5,62
9,61
5,19
5,56
6,05
9,19
6,91
6,06
5,44
5,85
6,18
5,95
5,78
21,8
9,63
5,47
4,82
4,06
2,34
2,26
2,17
2
2
1,48
1,46
1,31
1,3
Electron transfer flavoprotein, beta subunit
Enoyl reductase
50S ribosomal protein L1
Electron transfer flavoprotein, alpha subunit
ATP-dependent Clp protease, proteolytic subunit ClpP
Sigma 54 modulation protein
Macrophage infectivity potentiator (Mip)
27kDa outer membrane protein
50S ribosomal protein L25, ribosomal 5S rRNA E-loop binding protein
Hypothetical protein lpl2247
Hsp10, 10kDa chaperonin GroES
Succinate dehydrogenase catalytic subunit
Superoxide dismutase, iron
DNA binding protein Fis
ANNEXE 7 :
Masse (kDa)
Liste des protéines dont la quantité augmente à l’état VBNC
100
N°
identification
ANNEXE 8 :
Liste des protéines dont la quantité varie après le stress
monochloramine
N°
identification
Masse (kDa)
PI
Ratio
D20J0/D0J0
stress NH2Cl
YP 094723
YP 094585
YP 094363
YP 125941
YP 125969
YP 127582
YP 126782
YP 095467
YP 125639
YP 094372
YP 095880
YP 094723
10,469
10,584
24,497
27,329
11,279
33,385
16,561
25,444
17,53
11,931
28,448
10,469
5,85
5,78
5,47
6,18
7,89
5,44
6,1
5,45
6,28
9,62
5,62
5,85
708,74
54,35
43,78
43,67
34,29
26,61
21,90
13,60
13,29
12,66
8,74
8,34
YP 094969
YP 096958
5504
YP 094956
YP 128222
YP 096820
YP 126188
YP 096707
YP 095769
YP 127155
YP 125847
YP 094363
YP 096667
YP 095774
YP 127545
YP 096764
YP 127022
YP 095741
15,771
22,151
Not identified
27,317
21,626
7,39
24,788
23,64
10,681
25,302
35,436
24,497
28,794
28,82
25,159
21,063
28,128
30,739
5,79
5,89
7,43
6,19
3,02
2,90
2,34
2,16
2,04
1,97
1,46
1,15
0,76
0,50
0,40
0,20
0,19
0,13
0,12
0,04
6,35
5,95
6,55
9,19
5,07
9,1
7,83
6,22
9,61
6,14
6,66
7,84
6,52
6,33
6,35
101
Identification
Hsp10, GroES
DNA binding protein Fis
50S ribosomal protein L1
Succinate dehydrogenase catalytic subunit
Hypothetical protein lpl0606
Hypothetical protein lpl2247
50S ribosomal protein L9
Transcriptional regulatory protein CpxR
Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
30S ribosomal protein S10
Enoyl reductase
10kDa chaperonin (Protein Cpn10) (groES protein)
(Heat shock protein A)
Universal stress protein A (UspA)
Peroxynitrite reductase AhpC/Tsa family
Not identified
Electron tranfer flavoprotein, beta subunit
Superoxide dismutase, iron
Cold shock protein CspE
Macrophage infectivity potentiator (Mip)
SpA stringent starvation protein A
Fis transcriptional activator
hypothetical protein lpl1817
Hypothetical protein lpl0481
protéine ribosomale L1
Pantoate-beta-alanine ligase
Inositol-1-monophosphatase
Hypothetical protein lpl2210
GTP cyclohydrolase I
Hypothetical protein lpl1683
30S ribosomal protein S2
PI
5,62
28,448
6,35
30,739
Not identified
Not identified
24,497
5,47
35,436
6,22
27,317
6,35
28,794
6,14
28,128
6,33
28,82
6,66
7,84
25,159
6,52
21,063
7,83
25,302
23,643
5,07
11,402
2,34
21,626
5,95
16,596
6,07
Ratio D0J15/D0J0
carence
nutritionnelle
33,47
15,97
6,47
6,19
2,99
2,34
2,07
1,91
1,88
1,57
1,55
1,49
0,76
0,72
0,64
0,56
0,52
Identification
Enoyl reductase
30S ribosomal protein S2
Not identified
Not identified
50S ribosomal protein L1
Hypothetical protein lpl0481
Electron transfert flavoprotein, beta subunit
Pantoate-beta-alanine ligase
Hypothetical protein lpl1683
Inositol-1-monophosphatase
Hypothetical protein lpl2210
GTP cyclohydrolase I
Hypothetical protein lpl1817
SpA stringent starvation protein A
Sigma 54 modulaion protein
Superoxide dismutase, iron
DNA binding stress protein
ANNEXE 9 :
102
YP 095880
YP 095741
6802
3602
YP 094363
YP 125847
YP 094956
YP 096667
YP 127022
YP 095774
YP 127545
YP 096764
YP 127155
YP 096707
YP 094520
YP 128222
YP 094725
Masse (kDa)
Liste des protéines dont la quantité varie dans le milieu pauvre en
nutriments (carence nutritionnelle)
N°
identification
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
(CSHPF), Conseil. Supérieur d'Hygiène Publique de France. (2001). Gestion du risque lié
aux légionelles, Paris.
(CSHPF), Conseil. Supérieur d'Hygiène Publique de France. (2005). Le risque lié aux
légionelles - Guide d’investigation et d’aide à la gestion, Paris.
A.F.N.O.R. (1987). Dosage du chlore libre et du chlore total. receuil des normes françaises;
Eaux méthoses d'essai, 1990, 4ème Ed, AFNOR Ed - Norme NF T 90-038 (Octobre 1987),
403-414.
A.F.N.O.R. (2003). Recherche et dénombrement des Legionella et Legionella pneumophila.
Norme AFNOR T90-431, Septembre 2003.
Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C. & Harb, O. S. (1998).
Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and
pathogenesis. Applied and environmental microbiology 64, 3127-3133.
Adeleke, A. A., Fields, B. S., Benson, R. F. & other authors (2001). Legionella drozanskii
sp. nov., Legionella rowbothamii sp. nov. and Legionella fallonii sp. nov.: three unusual new
Legionella species. International journal of systematic and evolutionary microbiology 51,
1151-1160.
Albert-Weissenberger, C., Cazalet, C. & Buchrieser, C. (2007). Legionella pneumophila a human pathogen that co-evolved with fresh water protozoa. Cell Mol Life Sci 64, 432-448.
Alleron, L., Frère, J., Merlet, N. & Legube, B. (2006). Monochloramine treatment induces
a viable but non culturable state into biofilm and planktonic Legionella pneumophila
populations. Legionella : state of the Art 30 years after its recognition, Edited by Nicholas P
Cianciotto et al 2006 ASM Press , Washington, DC, 533-537.
Asakura, H., Watarai, M., Shirahata, T. & Makino, S. (2002). Viable but nonculturable
Salmonella species recovery and systemic infection in morphine-treated mice. The Journal of
infectious diseases 186, 1526-1529.
Asakura, H., Ishiwa, A., Arakawa, E., Makino, S., Okada, Y., Yamamoto, S. & Igimi, S.
(2007a). Gene expression profile of Vibrio cholerae in the cold stress-induced viable but nonculturable state. Environmental microbiology 9, 869-879.
Asakura, H., Panutdaporn, N., Kawamoto, K., Igimi, S., Yamamoto, S. & Makino, S.
(2007b). Proteomic characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the
oxidation-induced viable but non-culturable state. Microbiology and immunology 51, 875881.
103
Bachman, M. A. & Swanson, M. S. (2001). RpoS co-operates with other factors to induce
Legionella pneumophila virulence in the stationary phase. Molecular microbiology 40, 12011214.
Bachman, M. A. & Swanson, M. S. (2004). The LetE protein enhances expression of
multiple LetA/LetS-dependent transmission traits by Legionella pneumophila. Infection and
immunity 72, 3284-3293.
Bej, A. K., Mahbubani, M. H. & Atlas, R. M. (1991). Detection of viable Legionella
pneumophila in water by polymerase chain reaction and gene probe methods. Applied and
environmental microbiology 57, 597-600.
Benson, R. F. & Fields, B. S. (1998). Classification of the genus Legionella. Seminars in
respiratory infections 13, 90-99.
Bitar, D. M., Molmeret, M. & Abu Kwaik, Y. (2004). Molecular and cell biology of
Legionella pneumophila. Int J Med Microbiol 293, 519-527.
Blanc, D. S., Carrara, P., Zanetti, G. & Francioli, P. (2005). Water disinfection with
ozone, copper and silver ions, and temperature increase to control Legionella: seven years of
experience in a university teaching hospital. J Hosp Infect 60, 69-72.
Borella, P., Guerrieri, E., Marchesi, I., Bondi, M. & Messi, P. (2005). Water ecology of
Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives. Biotechnol Annu Rev
11, 355-380.
Bouyer, S., Imbert, C., Rodier, M. H. & Hechard, Y. (2007). Long-term survival of
Legionella pneumophila associated with Acanthamoeba castellanii vesicles. Environmental
microbiology 9, 1341-1344.
Bozue, J. A. & Johnson, W. (1996). Interaction of Legionella pneumophila with
Acanthamoeba castellanii: uptake by coiling phagocytosis and inhibition of phagosomelysosome fusion. Infection and immunity 64, 668-673.
Buck, M., Gallegos, M. T., Studholme, D. J., Guo, Y. & Gralla, J. D. (2000). The bacterial
enhancer-dependent sigma(54) (sigma(N)) transcription factor. Journal of bacteriology 182,
4129-4136.
Byrd, J. J. (2000). Morphological changes leading to the nonculturable state. In
Nonculturable microorganisms in the environment (Colwell RR, Grimes DJ, Editeurs), ASM
Press; Washington, DC, 7-18.
Cazalet, C., Rusniok, C., Bruggemann, H. & other authors (2004). Evidence in the
Legionella pneumophila genome for exploitation of host cell functions and high genome
plasticity. Nature genetics 36, 1165-1173.
Chang, C. W., Hwang, Y. H., Cheng, W. Y. & Chang, C. P. (2007). Effects of chlorination
and heat disinfection on long-term starved Legionella pneumophila in warm water. Journal of
applied microbiology 102, 1636-1644.
104
Cheng, Y. W., Chan, R. C. & Wong, P. K. (2007). Disinfection of Legionella pneumophila
by photocatalytic oxidation. Water Res 41, 842-852.
Cianciotto, N. P. (2001). Pathogenicity of Legionella pneumophila. Int J Med Microbiol 291,
331-343.
Cohen-Gonsaud, M., Keep, N. H., Davies, A. P., Ward, J., Henderson, B. & Labesse, G.
(2004). Resuscitation-promoting factors possess a lysozyme-like domain. Trends in
biochemical sciences 29, 7-10.
Cohen-Gonsaud, M., Barthe, P., Bagneris, C., Henderson, B., Ward, J., Roumestand, C.
& Keep, N. H. (2005). The structure of a resuscitation-promoting factor domain from
Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes. Nat Struct Mol Biol 12, 270-273.
Colwell, R. R., Brayton, P. R., Grimes, D. J., Roszak, D. B., Huq, S. A. & Palmer, L. M.
(1985). Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment:
Implications for the release of genetically engineered microorganisms. Bio/Technology 3,
817-820.
Colwell, R. R. (2000). Viable but nonculturable bacteria: a survival strategy. J Infect
Chemother 6, 121-125.
Costerton, J. W., Lewandowski, Z., DeBeer, D., Caldwell, D., Korber, D. & James, G.
(1994). Biofilms, the customized microniche. Journal of bacteriology 176, 2137-2142.
Cunliffe, D. A. (1990). Inactivation of Legionella pneumophila by monochloramine. J Appl
Bacteriol 68, 453-459.
De Angelis, M. & Gobbetti, M. (2004). Environmental stress responses in Lactobacillus: a
review. Proteomics 4, 106-122.
Declerck, P., Behets, J., van Hoef, V. & Ollevier, F. (2007). Detection of Legionella spp.
and some of their amoeba hosts in floating biofilms from anthropogenic and natural aquatic
environments. Water Res 41, 3159-3167.
Doleans, A., Aurell, H., Reyrolle, M., Lina, G., Freney, J., Vandenesch, F., Etienne, J. &
Jarraud, S. (2004). Clinical and environmental distributions of Legionella strains in France
are different. J Clin Microbiol 42, 458-460.
Donlan, R. M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging infectious diseases 8,
881-890.
Dowling, J. N., Saha, A. K. & Glew, R. H. (1992). Virulence factors of the family
Legionellaceae. Microbiological reviews 56, 32-60.
Downing, K. J., Betts, J. C., Young, D. I., McAdam, R. A., Kelly, F., Young, M. &
Mizrahi, V. (2004). Global expression profiling of strains harbouring null mutations reveals
that the five rpf-like genes of Mycobacterium tuberculosis show functional redundancy.
Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 84, 167-179.
105
Downing, K. J., Mischenko, V. V., Shleeva, M. O., Young, D. I., Young, M., Kaprelyants,
A. S., Apt, A. S. & Mizrahi, V. (2005). Mutants of Mycobacterium tuberculosis lacking three
of the five rpf-like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro.
Infection and immunity 73, 3038-3043.
Feeley, J. C., Gibson, R. J., Gorman, G. W., Langford, N. C., Rasheed, J. K., Mackel, D.
C. & Baine, W. B. (1979). Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for
Legionella pneumophila. J Clin Microbiol 10, 437-441.
Fields, B. S., Benson, R. F. & Besser, R. E. (2002). Legionella and Legionnaires'disease: 25
years of investigation. Clin Microbiol Rev 15, 506-526.
Flannery, B., Gelling, L. B., Vugia, D. J. & other authors (2006). Reducing Legionella
colonization in water systems with monochloramine. Emerging infectious diseases 12, 588596.
Fliermans, C. B., Cherry, W. B., Orrison, L. H., Smith, S. J., Tison, D. L. & Pope, D. H.
(1981). Ecological distribution of Legionella pneumophila. Applied and environmental
microbiology 41, 9-16.
Fraser, D. W., Tsai, T. R., Orenstein, W. & other authors (1977). Legionnaires'disease:
description of an epidemic of pneumonia. The New England journal of medicine 297, 11891197.
Fraser, D. W. (2005). The challenges were legion. The Lancet infectious diseases 5, 237-241.
Gabay, J. E., Blake, M., Niles, W. D. & Horwitz, M. A. (1985). Purification of Legionella
pneumophila major outer membrane protein and demonstration that it is a porin. Journal of
bacteriology 162, 85-91.
Gaillot, O. (2004a). [ATP-dependant proteolysis and bacterial pathogenesis]. Annales de
biologie clinique 62, 7-14.
Gaillot, O. (2004b). [Legionella and legionellosis: of water, bacteria and men]. Annales
pharmaceutiques francaises 62, 244-246.
Garcia, M. T., Jones, S., Pelaz, C., Millar, R. D. & Abu Kwaik, Y. (2007). Acanthamoeba
polyphaga resuscitates viable non-culturable Legionella pneumophila after disinfection.
Environmental microbiology 9, 1267-1277.
Garduno, R. A., Garduno, E. & Hoffman, P. S. (1998). Surface-associated hsp60
chaperonin of Legionella pneumophila mediates invasion in a HeLa cell model. Infection and
immunity 66, 4602-4610.
Garduno, R. A., Garduno, E., Hiltz, M. & Hoffman, P. S. (2002). Intracellular growth of
Legionella pneumophila gives rise to a differentiated form dissimilar to stationary-phase
forms. Infection and immunity 70, 6273-6283.
106
Gauthier, M. J. (2000). Environmental parameters associated with the viable but non
culturable state. In Nonculturable microorganisms in the environment (Colwell RR, Grimes
DJ, Editeurs), ASM Press; Washington, DC, 87-112.
Green, P. N. (1993). Efficacy of biocides on laboratory-generated Legionella biofilms. Lett
Appl Microbiol 17, 158-161.
Green, P. N. & Pirrie, R. S. (1993). A laboratory apparatus for the generation and biocide
efficacy testing of Legionella biofilms. J Appl Bacteriol 74, 388-393.
Hammer, B. K. & Swanson, M. S. (1999). Co-ordination of Legionella pneumophila
virulence with entry into stationary phase by ppGpp. Molecular microbiology 33, 721-731.
Heim, S., Lleo, M. M., Bonato, B., Guzman, C. A. & Canepari, P. (2002). The viable but
nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as
determined by proteome analysis. Journal of bacteriology 184, 6739-6745.
Heller, R., Holler, C., Sussmuth, R. & Gundermann, K. O. (1998). Effect of salt
concentration and temperature on survival of Legionella pneumophila. Lett Appl Microbiol
26, 64-68.
Hiltz, M. F., Sisson, G. R., Brassinga, A. K., Garduno, E., Garduno, R. A. & Hoffman, P.
S. (2004). Expression of magA in Legionella pneumophila Philadelphia-1 is developmentally
regulated and a marker of formation of mature intracellular forms. Journal of bacteriology
186, 3038-3045.
Hookey, J. V., Saunders, N. A., Fry, N. K., Birtles, R. J. & Harrison, T. G. (1996).
Phylogeny of Legionellaceae based on small-subunit ribosomal DNA sequences and proposal
of Legionella lytica comb. nov. for Legionella-like amoebal pathogens. IntJSystBact 46, 526531.
Huq, A., Rivera, I. N. G. & Colwell, R. R. (2003). Epidemiological significance of viable
but non culturable microorganisms. In Nonculturable microorganisms in the environment
(Colwell RR, Grimes DJ, Editeurs), ASM Press; Washington, DC, 301-323.
Hussong, D., Colwell, R. R., O'Brien, M., Weiss, E., Pearson, A. D., Weiner, R. M. &
Burge, W. D. (1987). Viable Legionella pneumophila not detected by culture on agar media.
Bio/Technology 5, 947-950.
Jacobi, S., Schade, R. & Heuner, K. (2004). Characterization of the alternative sigma factor
sigma54 and the transcriptional regulator FleQ of Legionella pneumophila, which are both
involved in the regulation cascade of flagellar gene expression. Journal of bacteriology 186,
2540-2547.
Jarraud, S., Reyrolle, M. & Etienne, J. (2000). Legionella et Légionellose. In Précis de
microbiologie clinique, ESKA Editor, 1389-1405.
Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R. & Barer, M. R. (1998).
Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical
issues. Antonie van Leeuwenhoek 73, 169-187.
107
Kim, B. R., Anderson, J. E., Mueller, S. A., Gaines, W. A. & Kendall, A. M. (2002).
Literature review--efficacy of various disinfectants against Legionella in water systems.
Water Res 36, 4433-4444.
Kool, J. L., Carpenter, J. C. & Fields, B. S. (1999). Effect of monochloramine disinfection
of municipal drinking water on risk of nosocomial Legionnaires'disease. Lancet 353, 272277.
Kuchta, J. M., States, S. J., McNamara, A. M., Wadowsky, R. M. & Yee, R. B. (1983).
Susceptibility of Legionella pneumophila to chlorine in tap water. Applied and environmental
microbiology 46, 1134-1139.
Kuiper, M. W., Wullings, B. A., Akkermans, A. D., Beumer, R. R. & van der Kooij, D.
(2004). Intracellular proliferation of Legionella pneumophila in Hartmannella vermiformis in
aquatic biofilms grown on plasticized polyvinyl chloride. Applied and environmental
microbiology 70, 6826-6833.
Landeen, L. K., Yahya, M. T. & Gerba, C. P. (1989). Efficacy of copper and silver ions
and reduced levels of free chlorine in inactivation of Legionella pneumophila. Applied and
environmental microbiology 55, 3045-3050.
LeChevallier, M. W., Cawthon, C. D. & Lee, R. G. (1988). Inactivation of biofilm bacteria.
Applied and environmental microbiology 54, 2492-2499.
Leoni, E., De Luca, G., Legnani, P. P., Sacchetti, R., Stampi, S. & Zanetti, F. (2005).
Legionella waterline colonization: detection of Legionella species in domestic, hotel and
hospital hot water systems. Journal of applied microbiology 98, 373-379.
Levi, Y. (2001). Ecologie microbienne des réseaux d'
eau potable et risque microbiologique :
l'
exemple de Legionella pneumophila. Revue Française des Laboratoires 336.
McDougald, D., Rice, S. A., Weichart, D. & Kjelleberg, S. (1998). Nonculturability:
adaptation or debilitation? FEMS microbiology ecology 25, 1-9.
Mietzner, S., Schwille, R. C., Farley, A., Wald, E. R., Ge, J. H., States, S. J., Libert, T. &
Wadowsky, R. M. (1997). Efficacy of thermal treatment and copper-silver ionization for
controlling Legionella pneumophila in high-volume hot water plumbing systems in hospitals.
American journal of infection control 25, 452-457.
Molofsky, A. B. & Swanson, M. S. (2003). Legionella pneumophila CsrA is a pivotal
repressor of transmission traits and activator of replication. Molecular microbiology 50, 445461.
Molofsky, A. B. & Swanson, M. S. (2004). Differentiate to thrive: lessons from the
Legionella pneumophila life cycle. Molecular microbiology 53, 29-40.
Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S., Young, D. I., Young, M. & Kell, D. B. (1998a).
A bacterial cytokine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 95, 8916-8921.
108
Mukamolova, G. V., Yanopolskaya, N. D., Kell, D. B. & Kaprelyants, A. S. (1998b). On
resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek 73,
237-243.
Mukamolova, G. V., Turapov, O. A., Young, D. I., Kaprelyants, A. S., Kell, D. B. &
Young, M. (2002). A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis.
Molecular microbiology 46, 623-635.
Muraca, P., Stout, J. E. & Yu, V. L. (1987). Comparative assessment of chlorine, heat,
ozone, and UV light for killing Legionella pneumophila within a model plumbing system.
Applied and environmental microbiology 53, 447-453.
Murga, R., Forster, T. S., Brown, E., Pruckler, J. M., Fields, B. S. & Donlan, R. M.
(2001). Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water
system. Microbiology (Reading, England) 147, 3121-3126.
Neumeister, B., Reiff, G., Faigle, M., Dietz, K., Northoff, H. & Lang, F. (2000). Influence
of Acanthamoeba castellanii on intracellular growth of different Legionella species in human
monocytes. Applied and environmental microbiology 66, 914-919.
Ohno, A., Kato, N., Yamada, K. & Yamaguchi, K. (2003). Factors influencing survival of
Legionella pneumophila serotype 1 in hot spring water and tap water. Applied and
environmental microbiology 69, 2540-2547.
Oliver, J. D. (1993). Formation of viable but non culturable cells. Starvation in Bacteria,
edited by Staffan Kjelleberg Plenum Press, New York, 239-273.
Oliver, J. D. (2005). The viable but nonculturable state in bacteria. J Microbiol 43 Spec No,
93-100.
Panutdaporn, N., Kawamoto, K., Asakura, H. & Makino, S. I. (2006). Resuscitation of the
viable but non-culturable state of Salmonella enterica serovar Oranienburg by recombinant
resuscitation-promoting factor derived from Salmonella Typhimurium strain LT2.
International journal of food microbiology 106, 241-247.
Paszko-Kolva, C. M., Shahamat, M. & Colwell, R. R. (1992). Long-term survival of
Legionella pneumophila serogroup 1 under low-nutrient conditions and associated
morphological changes. FEMS microbiology ecology 102, 45-55.
Philippe, C., Blech, M. F. & Hartemann, P. (2006). [Intra-amoebal development of
Legionella pneumophila and the potential role of amoebae in the transmission of
Legionnaires'disease]. Medecine et maladies infectieuses 36, 196-200.
Ravagnani, A., Finan, C. L. & Young, M. (2005). A novel firmicute protein family related
to the actinobacterial resuscitation-promoting factors by non-orthologous domain
displacement. BMC Genomics 6, 39.
109
Rogers, J., Dowsett, A. B., Dennis, P. J., Lee, J. V. & Keevil, C. W. (1994). Influence of
temperature and plumbing material selection on biofilm formation and growth of Legionella
pneumophila in a model potable water system containing complex microbial flora. Applied
and environmental microbiology 60, 1585-1592.
Rossier, O. & Cianciotto, N. P. (2001). Type II protein secretion is a subset of the PilDdependent processes that facilitate intracellular infection by Legionella pneumophila.
Infection and immunity 69, 2092-2098.
Schroeckh, V. & Martin, K. (2006). Resuscitation-promoting factors: distribution among
actinobacteria, synthesis during life-cycle and biological activity. Antonie van Leeuwenhoek
89, 359-365.
Soderberg, M. A., Rossier, O. & Cianciotto, N. P. (2004). The type II protein secretion
system of Legionella pneumophila promotes growth at low temperatures. Journal of
bacteriology 186, 3712-3720.
Soulard, M., Bloc, F. & Hatterer, A. (1981). Etude expérimentale critique de trois méthodes
absorptiométriques pour le dosage des halogènes et des halogénamines en solution aqueuse.
Analusis 9, 35-46.
States, S. J., Conley, L. F., Ceraso, M., Stephenson, T. E., Wolford, R. S., Wadowsky, R.
M., McNamara, A. M. & Yee, R. B. (1985). Effects of metals on Legionella pneumophila
growth in drinking water plumbing systems. Applied and environmental microbiology 50,
1149-1154.
Steinert, M., Emody, L., Amann, R. & Hacker, J. (1997). Resuscitation of viable but
nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii.
Applied and environmental microbiology 63, 2047-2053.
Steinert, M., Hentschel, U. & Hacker, J. (2002). Legionella pneumophila: an aquatic
microbe goes astray. FEMS Microbiol Rev 26, 149-162.
Stout, J. E., Yu, V. L. & Best, M. G. (1985). Ecology of Legionella pneumophila within
water distribution systems. Applied and environmental microbiology 49, 221-228.
Tangwatcharin, P., Chanthachum, S., Khopaibool, P. & Griffiths, M. W. (2006).
Morphological and physiological responses of Campylobacter jejuni to stress. Journal of food
protection 69, 2747-2753.
Telkov, M. V., Demina, G. R., Voloshin, S. A. & other authors (2006). Proteins of the Rpf
(resuscitation promoting factor) family are peptidoglycan hydrolases. Biochemistry 71, 414422.
Temmerman, R., Vervaeren, H., Noseda, B., Boon, N. & Verstraete, W. (2006).
Necrotrophic growth of Legionella pneumophila. Applied and environmental microbiology
72, 4323-4328.
110
Thomas, V., Bouchez, T., Nicolas, V., Robert, S., Loret, J. F. & Levi, Y. (2004). Amoebae
in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella
persistence. Journal of applied microbiology 97, 950-963.
Tison, D. L. & Seidler, R. J. (1983). Legionella incidence and density in potable drinking
water supplies. Applied and environmental microbiology 45, 337-339.
Vogel, J. P. & Isberg, R. R. (1999). Cell biology of Legionella pneumophila. Current
opinion in microbiology 2, 30-34.
Votyakova, T. V., Kaprelyants, A. S. & Kell, D. B. (1994). Influence of Viable Cells on the
Resuscitation of Dormant Cells in Micrococcus luteus Cultures Held in an Extended
Stationary Phase: the Population Effect. Applied and environmental microbiology 60, 32843291.
Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M. & Yee, R. B. (1985). Effect of
temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella
pneumophila in potable water. Applied and environmental microbiology 49, 1197-1205.
Xu, H. S. & al., e. (1982). Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio
cholerae in the estuarine and marine environment. Microb Ecol 8, 313-323.
Yamamoto, H., Hashimoto, Y. & Ezaki, T. (1996). Study of nonculturable Legionella
pneumophila cells during multiple-nutrient starvation. FEMS microbiology ecology 20, 149154.
Yamamoto, H. (2000). Viable but nonculturable state as a general phenomenon of non-sporeforming bacteria, and its modeling. J Infect Chemother 6, 112-114.
Zhu, W., Plikaytis, B. B. & Shinnick, T. M. (2003). Resuscitation factors from
mycobacteria: homologs of Micrococcus luteus proteins. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland)
83, 261-269.
Zink, S. D., Pedersen, L., Cianciotto, N. P. & Abu-Kwaik, Y. (2002). The Dot/Icm type IV
secretion system of Legionella pneumophila is essential for the induction of apoptosis in
human macrophages. Infection and immunity 70, 1657-1663.
111
RESUME : Survie de Legionella pneumophila après traitement
Legionella pneumophila, l’agent responsable d’une pneumonie sévère atypique chez
l’Homme appelée maladie du légionnaire, est ubiquitaire dans les environnements
aquatiques. Les traitements généralement appliqués dans les réseaux d’eau afin d’éradiquer
cette bactérie sont souvent suivis d’une recolonisation rapide de cette bactérie. Un des
facteurs pouvant expliquer cette recolonisation peut être l’état Viable Non Cultivable
(VBNC).
L’objectif de nos travaux a été d’étudier la survie de L. pneumophila après des traitements
oxydant et thermique et notamment d’étudier l’état VBNC.
Dans un premier temps nous avons réalisé un traitement monochloramine et un traitement
thermique sur une suspension de légionelles. Nous avons observé que le traitement par 20
mg/L de monochloramine ainsi que celui à 57,5°C, conduisaient à la formation de VBNC
chez L. pneumophila. De plus, ces bactéries peuvent persister dans cet état pendant au moins
169 jours après traitement.
Dans un second temps, une étude partielle des protéines exprimées à l’état VBNC a été
menée. Nous avons montré que l’expression de plusieurs protéines, impliquées dans les voies
de production d’énergie, de synthèse protéique et dans la virulence, était augmentée d’un
facteur supérieur ou égale à deux par comparaison avec des bactéries ayant subit un stress
monochloramine ou une carence en nutriments.
Dans un troisième temps, la recherche d’un facteur de ressuscitation Rpf a été entreprise chez
L. pneumophila. Un gène rpf-like, possédant 33% d’identité et 51% de similarité avec celui
de Salmonella, a été découvert. Ce gène a été cloné mais la protéine recombinante obtenue
n’a pas conduit à un retour à la cultivabilité des cellules.
ABSTRACT: Survival of L. pneumophila after treatments
Legionella pneumophila, the causative agent of an atypical severe pneumonia in humans
called Legionnaires’ disease, is ubiquitous in aquatic environments. The treatments usually
applied to eradicate this bacterium are often followed by a quick new contamination. One of
the causes that could explain this colonisation could be the Viable But NonCulturable state
(VBNC).
The aim of this work was to study the survival of L. pneumophila after oxidative and heat
treatments and then to study the VBNC.
First, we have treated Legionella suspension with monochloramine and heat. We have
observed that a 20 mg/L monochloramine treatment and a 57.5°C treatment lead to the
VBNC state. Moreover, these bacteria could persist in this state during at least 169 days.
Secondly, we have realised a partial study of Legionella proteins expressed in the VBNC
state. Several proteins expressions, implicated in energy production, protein synthesis and
virulence, were induced more than 2-fold in comparison with bacteria stressed by
monochloramine or in starvation.
Finally, we have search for a Resuscitation-promoting-factor Rpf in L. pneumophila genome.
An rpf-like gene, showing 33% of identity and 51% similarity with Salmonella rpf was
found. This gene has been cloned but the recombinant protein obtained didn’t lead to a
recovery of legionella culturability.
DISCIPLINE : Microbiologie de l’eau
MOTS CLES : VBNC - Legionella pneumophila - Acanthamoeba - Monochloramine Intégrité membranaire - Activité estérase
INTITULE ET ADRESSE DE L’U.F.R. OU DU LABORATOIRE :
UMR-CNRS 6008 - équipe Microbiologie De l’Eau, IBMIG – PBS, 40 avenue du recteur
Pineau, 86022 POITIERS Cedex
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