isolement des Legionella pneumophila

Nouvelles méthodes de détec/on/dénombrement/enrichissement/
isolement des Legionella pneumophila vivantes Dr. Sam Dukan Laboratoire de Chimie Bactérienne UMR7283 – 31 Chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille – [email protected] La Viabilité chez les Bactéries : Un concept dépendant de la méthode utilisée
Vivant STRESS Mort Vivant Capacité à former une colonie Colonie 3 →  NoLons Fondamentales associées à la Cul/vabilité : Métaboliser Grandir Se diviser Dans un temps donné Jusqu’à aQeindre une colonie La Viabilité chez les Bactéries : Un concept dépendant de la méthode utilisée
Viabilité Capacité à former une colonie Se diviser + G + M Capacité à s’allonger Grandir (G) + M AcLvité Métabolique RespiraLon Cellulaire Métaboliser (M) Intégrité membranaire Intégrité Physique UFC DVC CV6® BacLight® Total La Viabilité chez les Bactéries : Un concept dépendant de la méthode utilisée
Single-cell analysis of cell viability after a biocide
treatment unveils an absence of positive correlation
between two commonly used viability markers
Adrien Ducret & Sam Dukan
Laboratoire de Chimie Bact!
erienne, Institut de Microbiologie de la M!
editerran!
ee – Universit!
e Aix-Marseille, CNRS UMR7283, 31 Chemin Joseph
Aiguier, Marseille, 13009, France
Microbiologyopen. 2013 Feb;2(1):123-­‐9. doi: 10.1002/mbo3.62. Epub 2012 Dec 26 Keywords
CV6, DVC, E. coli, hypochlorous acid, ibidi
chamber
Correspondence
Sam Dukan, Aix Marseille Universit!
e,
Laboratoire de Chimie Bact!
erienne (UMR
7283), Institut de Microbiologie de la
M!
editerran!
ee (IMM), CNRS, 31 Chemin
Joseph Aiguier, 13402 Marseille, France.
Tel: +33 4 91 16 46 01; Fax: +33 4 91 71 89 14;
E-mail: [email protected]
Funding Information
This work was supported by the CNRS.
Received: 17 August 2012; Revised: 13
Abstract
Discrimination among viable/active or dead/inactive cells in a microbial community is a vital question to address issues on ecological microbiology or
microbiological quality control. It is commonly assumed that metabolically
active cells (ChemchromeV6 [CV6] procedure) correspond to viable cells
(direct viable count procedure [DVC]), although this assumption has never
been demonstrated and is therefore a matter of debate. Indeed, simultaneous
determination of cell viability and metabolic activity has never been performed
on the same cells. Here, we developed a microfluidic device to investigate the
viability and the metabolic activity of Escherichia coli cells at single-cell level.
Cells were immobilized in a flow chamber in which different solutions were
sequentially injected according to different scenarios. By using time-lapse
microscopy combined with automated tracking procedures, we first successfully
assessed the ability of cells to divide and their metabolic activity at single-cell
L’état Viable Mais Non Cultivable (VBNC) : résurrection ??
Pathogène? culLvable STRESS Perte de la capacité à former une colonie RésurrecLon RestauraLon de la capacité à former une colonie Problème de Santé Publique culLvable L’étalement sur gélose provoque un stress : Notion de létalité conditionnée
Cellules IniLalement Vivantes Etat généLquement contrôlé Ou non Létalité condiLonnée Etalement Colonie Colonie Colonie Viable mais Colonie Colonie Non Cul/vable Stress oxydant lors de l’étalement sur gélose AgrégaLon des protéines AugmentaLon de la concentraLon en protéines oxydées AltéraLon des défenses contre les FRO Mise au point d’un nouveau milieu de culture pour L. pneumophila
S = Pyruvate + Glutamate + …. BCYES BCYE Le milieu BCYES est breveté CNRS/BASF Conséquence : Absence de la « résurrection » de L. pneumophila
A. castelellanii 106/ml L. pneumophila 108/ml IncubaLon 3 jours à 37°C puis dénombrement Suivie de la viabilité de L. pneumophila par la méthode des micro-colonies
Suivie de la viabilité de L. pneumophila par la méthode des micro-colonies
ObservaLon of cell division and micro-­‐colony formaLon within 20h for L. pneumophila Growth
parameters
25
y = 0.1019e0.2704x
R! = 0.96899
20
Phase contrast
microscopic
video imaging"
15
Detection
algorithm
coded as an
ImageJ plugin"
10
Lag phase
5
0
0
5
10
15
20
Suivie de la viabilité de L. pneumophila par la méthode des micro-colonies
Chlorine
% of living cells (standard method)
% of cells forming a micro-colony
0.2 mM
20%
80%
0.6 mM
1%
17%
5 mM
0%
0%
DBNPA
% of living cells (standard method)
% of cells forming a micro-colony
0.01 mM 0.05 mM 0.5 mM
70%
46%
0.01%
100%
92%
5%
1 mM
0%
0%
0.5 mM
1.5%
21%
Magne/c Par/cle Concentrator 4 Magne/c Par/cle Concentrator 2 17
18
13
14
19
15
Vista 9 superior 10 11
5
1
6
2
7
3
20
16
12
8
4
Sampling
Analysis
Collecting samples from
different sources, generally
1 liter
Capturing Legionella cells by
magnetic beads & marking cells with
conjugated antibodies
Concentrating original water
sample, generally in a final
volume of 10 mL
Action
Taking steps on the
risk facilities
>104
104
103
102
RISK Filtering
Semi-quantitative
Concentration
≥103
≥104
102
Color
0.35
0.14
0.06
Absorbance
Quantitative
Binding force
MAGNETIC BEAD
LEGIONELLA CELL
Signal reduc/on was shown by Legipid test when biocides were added. This decrease depends on the biocide Structure des membranes bactériennes
Principe du marquage du LPS
Metabolic Glycan Labeling Nouveau procédé de détection/dénombrement/enrichissement des bactéries vivantes
UNIQUEMENT LES BACTERIES VIVANTES 1
N3
N N
N
"click"
R
Isolement Enrichissement Dénombrement des bactéries vivantes Espèce bactérienne suivant la molécule uLlisée Dumont et al., 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 3143-­‐3146 Mas et al., Angew. Chem. Int. Ed. (in press) 2 Brevets R
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L. pneumophila - spécificité de détection
et de dénombrement
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L. pneumophila - spécificité de détection et de dénombrement
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Figure S2: Compound 2 is not incorporated by Legionella that not belong to the L. pneumophila species. Detection
I
of metabolically incorporated 2 by various Legionella strains shown by Cu -catalyzed click reaction with 5, and
further visualized using an Alexa Fluor 488-IgG anti-biotin antibody. Phase contrast and fluorescence images in the
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L. pneumophila - spécificité de détection et de dénombrement
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S1: Compound 2 is not incorporated by E. coli and P. aeruginosa. Detection of metabolically incorpo
I
oli and P. aeruginosa shown by Cu -catalyzed click reaction with 5, and further visualized using an
88-IgG anti-biotin antibody. Phase contrast and fluorescence images in the presence (right pa
e of 2 (left panel). Scale bar = 1 µm.
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Objectif final : Le LEGIALERT
CréaLon de la Start-­‐up DECLICK et développement du premier kit LEGIALERT permeQant le dénombrement de L. pneumophila en moins de 24 heures via une approche équivalente au « nombre le plus probable » LEGIALER
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LEGIALER
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Maïalène Chabalier Adrien Ducret Audrey Dumont Emilie Fugier Marina Péramé DECLICK
Aurélie Baron Jordi Mas Pons Grégory Sautejeau