Bactéries

I. BACTERIOLOGIE GENERALE
II. RELATIONS BACTERIE-HOTE
III. APPLICATIONS
« Unité d’Enseignement 2.10.S1 »
« Infectiologie-Hygiène »
(année 2011-12)
---Professeur Gérard CHABANON
Laboratoire de Bactériologie-Hygiène
Faculté de Médecine Toulouse-Rangueil
IFSI, UE 2.10.S1, G. Chabanon
I . BACTERIOLOGIE GENERALE
INTRODUCTION AU MONDE MICROBIEN
GENERALITES
1. Microscope :
- apparaît au début du XVII è siècle ; postérieur à la
lunette astronomique, postérieure aux lunettes à lire (300 ans),
- Anthony Van Leuwenhoeck (Delf) : le plus grand et
plus infatigable des observateurs au microscope ;
découverte d’un monde vivant, «animacules
microscopiques » ; base de la microbiologie mais pas
seulement,
- constat de l’étendue du monde microbien : air, eau,
sol (environnement) et animaux.
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2. Terminologie : un repère, le Dictionnaire de la Langue
Française par E. Littré, Paris, 1875 ; mots non encore
répertoriés :
. microbe , mais sont cités « les microscopiques »
cad les êtres vivants qui ne peuvent être vus qu’au
microscope et, bien entendu les « animacules »,
. bactérie : terme non encore retenu ;
ceux largement décrits : infection, contagion,
épidémie
et
mesures
préventives
(lazaret,
quarantaine) ; exemple : grande peste (XIV è siècle)
mais connue et parfaitement décrite bien avant (V-VI av
J.C.) ; plus près de nous : choléra (XIXè siècle);
progrès des connaissances issus des épidémies…
. « virus », terme utilisé mais pour décrire à la fois
toutes les substances capables de produire la maladie
infectieuse mais également le principe de transmission
des maladies contagieuses ; la définition du virus, telle
que nous la connaissons aujourd’hui, est plus
tardive.
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3.Structure fonctionnelle des bactéries
Généralités
1/ Bactéries : plus petits microorganismes vivants
connus ; unicellulaires ; font partie des procaryotes.
2/ Nous appartenons aux eucaryotes ; nous sommes des
êtres vivants pluricellulaires, nos cellules sont
organisées en tissus.
Attention ! il existe d’autres organismes vivants,
unicellulaires qui sont classés parmi les eucaryotes
(champignons, algues, protozoaires…).
3/ Comparaison cellule eucaryote/cellule procaryote :
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cellule eucaryote
cellule procaryote
Noyau
oui
non ; appareil nucléaire
membrane nucléaire
oui
non
chromosome
oui
oui
multiple de 2N « diploïde »
unique N = 1 « haploïde »
multiplication
mitose
Pluricellulaire
bi-partition (scissiparité)
1 cellule mère 2 cellules
filles identiques
mitochondries
(« centrale d’énergie »)
oui
lieu : intracytoplasmique
non
lieu de production d’énergie :
membrane cytoplasmique
paroi
absente
présente
(sauf cellule végétale)
(sauf mycoplasmes)
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4. Taille(s) et forme(s) :
. généralement : taille de 1 à 10 µm ; les morphologies
et les types de groupement, reflet du mode de division,
sont des critères très utilisés pour identifier les bactéries,
. visibles au microscope optique : sphère (cocci),
bâtonnets (bacilles), incurvées (vibrions), spirochètes
(dispositif optique spécial) ; microscopie optique
courant : grossissements de 100 à 1000 fois,
. intérêt de certaines colorations : GRAM (positif ou
négatif), ZIEHL (mycobactéries)…
. microscopie électronique (ultra-structure) : apport
considérable par coloration négative ou coupes
sagittales; balayage.
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Morphologie des bactéries
D. Clavé - M. Archambaud
2010
Structure bactérienne
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Eléments constitutifs de la structure bactérienne (1)
1/ cytoplasme, apparaît optiquement « vide » ; contient :
- chromosome ou génome de la bactérie (« appareil nucléaire »):
. composé d’ADN, double brin, généralement unique, circulaire,
. sa réplication (multiplication à l’identique) est la cible d’action de
certains antibiotiques (quinolones; rifamycines ; nitro-imidazolés …)
. siège de mutations (modification de composition de la chaîne
polydésoxyribonucléotidique (ADN) dont certaines peuvent être à
l’origine de la résistance de la bactérie aux antibiotiques (résistance
aux antibiotiques; mutation de la cible)
. le séquençage partiel et mieux encore le séquençage de l’entier
chromosome permettent une identification parfaite de la bactérie
(méthode d’identification peu utilisée en routine),
- plasmides, ADN, support gènes résistance antibiotiques (résistance
plasmidique; R enzymatique) / gènes de virulence (facteurs
pathogénicité).
- ribosomes, regroupés sous forme de polyribosomes, lieu de la
synthèse des protéines : polyribosomes + ARNm + ARNt peptides ;
cibles d’action de certains antibiotiques (aminoglycosides,
tétracyclines, chloramphénicol, Macrolides,Lincosamines,Synegistine…)
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Eléments constitutifs de la structure bactérienne (2)
2/ membrane cytoplasmique, bi-couche phospholipidique :
- participe aux échanges nutritionnels entre la cellule bactérienne et son
environnement ;
- « centrale » de production d’énergie ;
- cible d’action de certains antiseptiques et antibiotiques (polymyxines,
nitrofuranes).
3/ paroi
- présente chez toutes les cellules procaryotes et chez certaines
cellules eucaryotes (végétales), ORIGINALITE
- constituée d’une macromolécule très originale :
le peptidoglycane, macromolécule rigide (confère à la bactérie sa forme),
agencée en maille de filet, rôle protecteur (résistante aux chocs
osmotiques),
- support du caractère gram positif ou gram négatif (coloration de
GRAM), lié à sa composition chimique et à son organisation physique
(épaisseur GRAM + > GRAM-) ; très important en pratique : diagnostic
bactériologique, action antibiotiques, physiopathologie…
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Gram positif
Sreptococcus
Staphylococcus
Listeria
Clostridium
Nocardia
Gram négatif
entérobactérie
Pseudomonas
Helicobacter pylori
Acinetobacter
Eléments inconstants de la structure bactérienne (4)
1. capsule : double extérieurement la bactérie ; plus souvent de
nature polysaccharidique (pneumocoque ; méningocoque) mais non
exclusivement ; facteur inhibiteur de la phagocytose.
Remarque : il peut exister chez certaines bactéries d’autres composés
présents à la surface de la bactérie et désignés sous le terme
d’exopolysaccharides ou « slime » (chez Pseudomonas aeruginosa
ou bacille pyocyanique).
2. fimbriae ou pili ; structures filamenteuses plus ou moins organisées,
de nature protéique ; certaines d’entre elles constituent un facteur de
pathogéncité (par ex : sont le support de molécules dites
« adhésines » car permettent la fixation des bactéries à la surface des
cellules des muqueuses).
3. spore ++: lorsque la bactérie se trouve dans des conditions de
vie défavorables, elle se transforme en spore (sporulation) :
. il s’agit pour la bactérie d’une forme de survie mais aussi de
résistance à la dessiccation et à la chaleur ; ce qui explique les
températures qu’il faut atteindre au cours des procédures de
stérilisation (120°en chaleur humide) pour les tuer ; cette modifi cation
de forme est rencontrée chez les bactéries habituellement présentes
dans l’environnement : bacillus, clostridium (Clostridium tetani,
responsable du tétanos)…
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« forme végétative »
conditions défavorables
« germination »
« sporulation »
conditions favorables
« spores »
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Mode d ’action
Les cibles bactériennes des
antibiotiques
L ’ADN
Le ribosome
Quinolones
Rifamycines
Nitroimidazolés
Sulfamides
Aminosides
Macrolides, kétolides
Lincosamides
Synergistines
Tétracyclines
Acide fusidique
Phénicolés
Linezolide
La paroi
β-lactamines
Glycopeptides
Fosfomycine
La membrane externe
Polymyxines
Daptomycine
II. RELATIONS BACTERIE – HOTE
FACTEURS DE PATHOGENICITE DES BACTERIES,
leur rôle dans la genèse du processus infectieux
Généralités (1)
1. Bactérie « pathogène » : capable de provoquer une maladie
infectieuse chez un individu (animaux… plantes) dont les
mécanismes de défense sont normaux.
2. Maladie infectieuse : conséquence d’un conflit entre :
. capacité d’agression de la bactérie (ou du pathogène : virus,
parasites, champignons…) vis-à-vis de l’hôte
. mécanismes de défense de l’hôte : « défenses non
spécifiques », dites naturelles et « défenses spécifiques », la
réponse immunitaire: humorale, cellulaire ; DUALITE.
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Généralités (2)
3. Maladie infectieuse : description très ancienne dans l’histoire de
l’humanité: écrits, momies, représentations peintures/sculptures…) ;
particularité, contagiosité, épidémie, mesures préventives
(isolement) mais existence de maladies infectieuses non
contagieuses (ex: infection urinaire).
4. Lien de causalité maladie/agent pathogène ++ :
. historique , compréhension expérimentale de la
maladie naturelle
- par inoculation de « produits » issus d’un individu malade à un
animal sain ou de la bactérie isolée en culture pure ; fin du XIXè
siècle, travaux de Pasteur, Koch, … :
ex Mycobacterium tuberculosis et le cobaye (tuberculose),
- par injection de l’un des « produits » bactériens : toxine tétanique et
cobaye (tétanos) ; premier quart du XXè siècle ; « théorie toxinique
de la maladie infectieuse »,
- par vaccination, contre preuve.
. aujourd’hui : nous savons que, bien souvent, la genèse de la
maladie infectieuse est le résultat de l’action de plusieurs facteurs
de pathogénicité que la bactérie en cause peut exprimer.
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GENERALITES (3)
5. Territorialité : monde septique/monde stérile ++
- nous vivons dans un environnement septique ; microorganismes
dans sol, air et eau.
- surface de notre corps, revêtement peau et muqueuses ; limite
physique, naturelle entre territoires septiques et stériles :
-> extérieur, flores microbiennes présentes : muqueuses (oropharynx, digestif, vaginale, surtout) >> peau
.
.
-- -> intérieur, stérile : viscères (cœur, foie, cerveau, muscles, os,..)
et liquides organiques (sang, lymphe, LCR, urines…).
- composition flores bactériennes humaines:
. bactéries « endogènes », « flore commensale » résidente,
présente chez tous les individus ; majoritaire
(ex : tube digestif : anaérobies ; Escherichia coli et entérocoques…)
. bactéries en « transit », issues de l’environnement, quantité
variable selon périodes et individus.
Association peau/muqueuse + flores microbiennes résidentes:
barrière naturelle très efficace contre l’infection.
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Les flores bactériennes
Quantités
Flore cutanée
Flore oro-pharyngée
Flore digestive
Flore vaginale
=Flores commensales
D. Clavé - M. Archambaud
2010
GENERALITES (4)
6. BACTERIES « PATHOGENES »
Deux situations à considérer :
- - Bactéries pathogènes opportunistes (BPO) :
. nombreuses espèces concernées; origine soit bactérie des
« flores commensales » soit de « flore de transit , saprophyte»
. conditions normales : BPO ne créent pas de maladie
infectieuse mais, si conditions « favorables » (occasion fait le
larron) – rupture spontanée /provoquée revêtement cutanéomuqueux - -> infection.
Remarque : « portage sain ». L’organisme héberge, en l’absence
de signe(s) d’infection, une bactérie bien connue pour son pouvoir
pathogène; ex : streptocoque A (Streptococcus pyogenes)
(angine,…) ou méningocoque (Neisseria meningitidis) (méningite
cérébrospinale); le mécanisme du passage d’un simple portage ->
maladie déclarée, demeure mal expliqué,
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GENERALITES (5)
-
- Bactéries pathogènes spécifiques (BPS) :
. nombre limité d’espèces concernées - essai de définition :
. dès leur pénétration dans l’organisme (voies naturelles),
expression de leur pouvoir pathogène et apparition de l’infection,
. leur isolement en culture, à partir d’un prélèvement, est synonyme
d’infection ++.
ex : Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Neisseria gonorrhoeae…
Remarque : PATHOVARS ++ :
certaines souches, appartenant à une espèce bactérienne donnée,
considérée habituellement telle que BPO, peuvent posséder des gènes de
virulence -> comportement de BPS ; ex actualité très récente:
- souches d’ Escherichia coli, hyper virulentes (graines germées);
situation déjà décrite, E.coli -> « maladie des hamburgers » ou Syndrome
Hémolytique et Urémique…;
- souche de Klebsiella pneumoniae, hyper virulente et multi résistante
aux antibiotiques (Inde, Asie -> importation récente en EU).
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Modélisation du processus infectieux :
de la porte d’entrée -> l’infection (1)
1) Colonisation, pénétration/invasion :
- peau plus résistante que muqueuses ; certaines bactéries capables pénétrer
spontanément peau saine (Leptospires) ; rôle favorisants traumatismes (micro
traumatismes, plaies, …),
- surface muqueuses, point de départ majorité infections spontanées ++,
(spontanées ; provoquées chirurgie, endoscopie) ;
. adhésines chez certaines bactéries (fimbriae, cf partie I du cours) facilitent
fixation surface muqueuses ;
. exopolysaccharides ou « slime » protection bactéries/défenses non spécifiques
.
Remarques +++:
- notre organisme est, en permanence le siège de tentatives de
colonisation/invasion par les bactéries et assure leur élimination : arbre
respiratoire : escalator mucociliaire ; voies urinaires : jet des urines ; tube digestif :
acidité, effet de barrière flore « endogène » ….
- dans des conditions normales, les défenses « naturelles » assurent le maintien
de la stérilité des tissus s/cut. et s/muqueux ,des viscères et des liquides
organiques…
- infections dites « épicellulaires » ++ : bactérie infectante n’atteint pas espaces
s/cutanés/muqueux. (Bordetella pertussis/coqueluche, Neisseria gonorrhoeae
/blénorragie (MST)…
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Modélisation du processus infectieux : de la porte
d’entrée -> l’infection(2)
2) Multiplication/diffusion (tissus, septicémies) ; facteurs bactériens
facilitant cette étape :
- résistance phagocytose ; capsule (cf partie I du cours) ; survie…
- captation du Fe : sidérophores.
- résistance pouvoir bactéricide sang (sérum)…
- échappement au système immunitaire…
3) Destruction tissus (nécrose…) : action toxines et enzymes
bactériens ++
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Toxines bactériennes (1)
1) Toxines protéiques :
- nombreuses bactéries assurent la synthèse de telles toxines
- >300 décrites
- par définition, effet biologique constaté à très faibles doses ; armes NBC
- conséquences cliniques variées :
. soit la toxine est responsable à elle seule de maladie clinique (tox
tétanique/tétanos ; tox botulinique/botulisme ; entérotoxine : intoxication alimentaire,
choléra…
. soit, maladie clinique résultat actions conjuguées toxine(s) + enzymes (s)
- classification :
. AB toxines, composées de 2 polypeptides :
B fixation à la membrane cellulaire (cellule cible) ; A partie active fixation sur la cible, dans
la cellule (Tox tétanique, botulinique, entérotoxines….)
. toxines cytolytiques, cible = membrane cellulaire ex phospholipase/globules
rouges/hémolysine redoutable (Clostridium perfringens)
. toxines agissant tels des « super antigènes » c.a.d. -> réponse inflammatoire
massive -> « syndrome de choc toxique », pronostic redoutable (staphylococcique,
streptococcique)
- antigéniques et immunogènes : induisent la synthèse d’anticorps, capables de
« neutraliser » le pouvoir tox de la toxine
toxine -> anatoxine c.a.d. sous action conjuguée de la chaleur et du formol la protéine
perd sa toxicité (détoxification) mais reste antigénique et immunogène
-> vaccins anti tétaniques et anti diphtériques.
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2) Endotoxines :
- nature chimique : Lipide A, en fait un complexe
lipopolysaccharidique, désigné par le terme de LPS
- enchassé dans la membrane externe de la paroi des
bactéries à Gram négatif ; de composition identique pour
toutes les BG- antigénique et immunogène (pas intérêt en pratique…)
- nombreux effets biologiques (cascade…), quelle que soit
l’espèce bactérienne BG- : hyperthermie, leucopénie, libération
de médiateurs pro-inflammatoires -> choc hémodynamique
endotoxinique ou dit encore « choc septique à Gram
négatif » ; redoutable (réanimation).
Remarque : une toxine bactérienne (toxine protéique), : ex
toxine tétanique (Clostridium tetani/tétanos) ; toxine botulinique
(Clostridium
botulinum/botulisme)
;
entérotoxines
(Staphylococcus aureus/intoxication alimentaire ; Vibrion
cholerae/choléra
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En conclusion,
Modèle animal : historiquement -> étude du processus
infectieux/protection expérimentale : démarche
globale dans la connaissance des relations agent
pathogène/hôte ; demeure encore aujourd’hui mais,
surtout, études de protection (vaccins…) ; autre animal
« zebra fish »++
« Théorie toxinique » de la maladie infectieuse : étape
historique fondamentale d’investigation (vaccins très
efficaces) mais nombre très limité de bactéries
concernées ;
Concepts actuels : origine du pouvoir pathogène d’une
bactérie est « pluri factorielle » « boîte à outils » y
compris les facteurs d’échappement aux systèmes de
défense de l’hôte (mosaïque antigénique) ; approche
génétique « gènes de pathogénicité » -> vaccins du
futur ... ; tout individu n’a certainement pas le même
statut devant le risque infectieux…
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Zebrafish
III. APPLICATIONS : DIAGNOSTIC
BACTERIOLOGIQUE D’UNE INFECTION
AU LABORATOIRE
Généralités (1)
Le diagnostic au laboratoire d’une infection
bactérienne repose sur les étapes suivantes :
1. Mise en évidence de la bactérie infectante dans les
prélèvements du patient ; diagnostic direct :
- réaliser un examen direct, microscopique, des
prélèvements ; approche cyto-bactériologique
- isoler la bactérie après mise en culture des
prélèvements et l’identifier ; tester sa sensibilité aux
antibiotiques (antibiogramme)
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- détection rapide d’Ag bactériens ++ dans les
prélèvements : S.pneumoniae (Ag capsulaire,
urines,LCR) ; S.pyogenes (gorge) ; Legionella
(urines) ; C.difficile (toxine,selles)
- détection rapide de gènes (ADN) bactériens
d’« intérêt » ; identification bactérie: ex
Mycoplasma pneumoniae; gènes de
virulence : ex E.coli; gènes résistance aux
antibiotiques : ex Staphylococcus aureus…
2. Recherche de la réponse immunitaire du
patient à l’infection : diagnostic indirect :
- humorale -> AC dans le sérum
- cellulaire -> Intra Dermo Réaction ;
ex test tuberculinique
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Généralités (2)
Le diagnostic au laboratoire d’une infection
bactérienne demande une parfaite concertation entre le
médecin, le personnel soignant qui, bien souvent, réalise
les prélèvements et le laboratoire d’analyses.
Il est essentiel de fournir des renseignements cliniques
précis et de les joindre aux prélèvements lors de la
demande d’analyse.
Il est impératif de respecter les protocoles pour le
recueil des prélèvement (asepsie par ex…) ainsi que les
conditions
optimales
d’acheminement
des
prélèvements au laboratoire (délai, température…)
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Généralités (3)
Les prélèvements doivent être réalisés avant l’administration
d’antibiotiques ou au décours d’un arrêt volontaire de
l’antibiothérapie (« fenêtre »).
La nature du prélèvement est fonction du siège (type) de
l’infection (suspicion) : oropharynx / angine ; urine / IU ; sang /
septicémie ; expectoration / infection respiratoire ; LCR / méningite…
La performance de l’analyse bactériologique dépend en grande
partie de la qualité du prélèvement ; la pertinence de
l’interprétation du résultat est augmentée par la qualité des
renseignements cliniques et thérapeutiques fournis au biologiste.
Enfin, au niveau du laboratoire, il y a lieu de distinguer les
prélèvements issus selon leurs sites anatomiques : stériles ou
septiques (flores commensales : selles (intestin), cavité vaginale,
oropharynx et peau -> considérations techniques et interprétation
des résultats.
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EXAMEN DIRECT DU PRELEVEMENT
Certains prélèvements sont examinés,
d’emblée, directement au microscope après
coloration pour examens cytologique (bleu de
méthylène, MGG,) et bactériologique (Gram) :
ex urines/infection urinaire ; liquide céphalorachidien/méningite purulente ; sécrétions
trachéo-bronchiques/infection respiratoire ;
ponction abcès…
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LCR de méningite
Coloration de Gram
* Polynucléaires
* Coques à Gram +
(diplocoques) capsulés
Pour les liquides biologiques : LCR, L. articulaire …
numération et formule des éléments nucléés
après cytocentrifugation et coloration
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2010
MISE EN CULTURE DU PRELEVEMENT
Objectif : assurer l’isolement sur milieu
solide de colonies bactériennes, point
de départ de :
- identification -> nom de Genre et
d’espèce : ex Staphylococcus aureus,
- détermination de sa sensibilité aux
antibiotiques ; antibiogramme
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Milieux de culture : solides ou liquides
Isolement sur géloses
Conditions de culture
Identification des bactéries
(besoin de culture pure =
isolement de chaque type de
colonies)
Dénomination
Ex:Staphylococcus aureus
Staphylococcus
epidermidis
Escherichia coli
D. Clavé - M. Archambaud
2010
Conduite de l’examen bactériologique
Jour 1 et jours suivants
Bien observer les différentes colonies
-> Taille
-> Couleur
-> Hémolytique ou non…
-> Coloration de GRAM sur les différentes colonies
D. Clavé - M. Archambaud
2010
Identification des bactéries
Nom espèce exemple : Staphylococcus aureus
Protéines
ADN
PCR
Amorces spécifiques espèce
Amorces spécifiques toxine
Identification moléculaire
Métabolisme bactérien
Enzymes
Identification biochimique
membrane externe, capsule…
Identification antigénique
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Antibiogramme standard par diffusion en milieu
solide
D. Clavé - M. Archambaud
2010
Antibiogramme en milieu liquide / automate
D. Clavé - M. Archambaud
2010
Temps de réponse des cultures
• Au moins 48 heures
– Dans la journée pour l’examen direct
– 24 h au minimum pour isolement des colonies
– 24 h de plus pour l’identification et
l’antibiogramme. Temps légèrement
raccourcis avec les automates (exemple
VitekR, PhoenixR)
• Parfois beaucoup plus long
• Réponse définitive entre 2 et 15 jours…….
D. Clavé - M. Archambaud
2010
COMMENTAIRES (1)
Bactérie sensible, de sensibilité intermédiaire ou
résistante à un antibiotique : sur quelles bases ?
-> détermination de la concentration minimale
inhibitrice (CMI)
-> comparaison, pour une souche bactérienne donnée
et un antibiotique donné, entre la valeur de la CMI et la
concentration moyenne obtenue dans le sérum d’un
individu lors de l’administration de cet antibiotique à
posologie habituelle.
La surveillance efficacité/toxicité d’un antibiotique
peut imposer, dans certaines situations cliniques, son
dosage (aminoglycosides, vancomycine).
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Antibiogramme en milieu liquide / automate
D. Clavé - M. Archambaud
2010
COMMENTAIRES (2)
Biologie moléculaire et analyse de l’ADN bactérien :
une introduction récente et en plein développement
apportant une expertise irremplaçable pour :
- détection rapide des bactéries « d’intérêt » dans les
prélèvements
- identification de certaines espèces bactériennes ++:
ex : bactéries de l’environnement/infections humaines
- caractérisation d’une souche au sein d’une
espèce donnée ++ :
. gène(s) de toxine(s)
. « marqueur » épidémiologique, par exemple, de « tracer » sa
diffusion ; empreintes génétiques : ex Legionella
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Document CNR des légionelloses
Démarche qualité prise en charge
des prélèvements
est sous la responsabilité du laboratoire qui doit s’assurer que
l’ensemble des actes réalisés lors des phases :
pré-analytiques (prescription, prélèvement, collecte
des renseignements, transport)
analytiques (analyse proprement dite)postanalytiques (expression, interprétation et transmission
des résultats)
a fait l’objet de procédures écrites et de contrôles de qualité.
A chaque étape des mesures de sécurité doivent être prises et
respectées.
D. Clavé - M. Archambaud
2010