Réponse immunitaire de l`hôte dans la symbiose bactérienne
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N° d’ordre 2006-ISAL-00107 Année 2006 Thèse Réponse immunitaire de l'hôte dans la symbiose bactérienne intracellulaire du charançon Sitophilus zeamais présentée devant L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon pour obtenir le grade de docteur Ecole doctorale : Evolution, Ecosystèmes, Microbiologie et Modélisation Spécialité : Analyse et Modélisation des Systèmes biologiques Par Caroline ANSELME Soutenue le 6 Décembre 2006 devant la Commission d’examen Jury LEMAITRE Bruno BOUCHON Didier FLEURY Frédéric MOYA Andrés VOLKOFF Anne-Nathalie HEDDI Abdelaziz Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Directeur 2005 SIGLE ECOLE DOCTORALE CHIMIE DE LYON E2MC E.E.A. E2M2 EDIIS EDISS Math IF MEGA NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 Responsable : M. Denis SINOU 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 Fax : 04 78 89 89 14 [email protected] ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION M. Alain BONNAFOUS Université Lyon 2 DES COMPORTEMENTS 14 avenue Berthelot MRASH M. Alain BONNAFOUS Responsable : M. Alain BONNAFOUS Laboratoire d’Economie des Transports 69363 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 Alain.bonnafous∂ish-lyon.cnrs.fr ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, M. Daniel BARBIER INSA DE LYON AUTOMATIQUE Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex M. Daniel BARBIER Tél : 04.72.43.64.43 Fax 04 72 43 60 82 [email protected] EVOLUTION, ECOSYSTEME, M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive MICROBIOLOGIE, MODELISATION Equipe Dynamique des Populations Bactériennes http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2 Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS M. Jean-Pierre FLANDROIS Tél : 04.78.86.31.50 Fax 04 72 43 13 88 E2m2∂biomserv.univ-lyon1.fr M. Lionel BRUNIE INFORMATIQUE ET INFORMATION INSA DE LYON POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis EDIIS Bâtiment Blaise Pascal M. Lionel BRUNIE 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 Fax 04 72 43 60 71 [email protected] INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE M. Alain Jean COZZONE http://www.ibcp.fr/ediss IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 M. Alain Jean COZZONE Tél : 04.72.72.26.75 Fax : 04 72 72 26 01 [email protected] M. Jacques JOSEPH MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml Ecole Centrale de Lyon Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des M. Jacques JOSEPH Surfaces 36 Avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél : 04.72.18.62.51 Fax 04 72 18 60 90 [email protected] M. Franck WAGNER MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE Université Claude Bernard Lyon1 http://www.ens-lyon.fr/MathIS Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES M. Franck WAGNER Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 Fax : 04 72 43 16 87 [email protected] MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE M. François SIDOROFF CIVIL, ACOUSTIQUE Ecole Centrale de Lyon http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue M. François SIDOROFF BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 Fax : 04 72 18 65 37 [email protected] À ma famille, mes parents et ma sœur qui m’ont soutenue toutes ces années et qui m’ont permis d’en arriver là… Merci... Remerciements Mes remerciements vont aux rapporteurs : Didier Bouchon et Bruno Lemaitre ainsi qu’aux membres du jury : Frédéric Fleury, Andrés Moya et Anne-Nathalie Volkoff pour avoir accepté de juger ce travail. Merci également à Pierre Couble, Bernard Duvic, Gérard Febvay et Phillipe Normand pour les discussions constructives menées lors des réunions du comité de pilotage. Je tiens à remercier tout particulièrement Aziz Heddi, mon directeur de thèse, pour ces quatre années de recherche passionnantes, pour son optimisme et surtout pour tout ce que j’ai appris… Un grand merci à Agnès Vallier, sans qui ce travail ne serait pas ce qu’il est. Merci pour son encadrement technique, son aide, son soutien et toutes les heures qu’elle a passées sous la loupe… Merci aussi à Carole Vincent-Monégat pour son aide, ses précieux conseils -surtout sa technique de “digestion micro-onde”- et pour toutes nos discussions enrichissantes... Merci également à Séverine Balmand pour son aide en histologie et Marjolaine Rey pour son aide lors de l’identification des peptides antibactériens du charançon... en espérant qu’elles ne m’en voudront pas trop de les avoir embarquées avec moi dans cette galère… Mes remerciements vont aussi à Gabrielle Duport pour les pucerons aposymbiotiques, Yvan Rahbé pour son aide et ses conseils à de nombreuses reprises, Paul Nardon pour ses conseils en histologie et pour avoir partagé avec moi ses connaissances sur le modèle charançon, Anne-Marie Grenier pour la correction de ce manuscrit et Hubert Charles pour son aide précieuse en statistiques, la lecture critique de cette thèse et son soutien en période de crise… Merci également à Marie-Odile Fauvarque et toute l’équipe pour nous avoir accueillis à Grenoble, moi et mes charançons, pour le travail avec Pseudomonas. Merci à Vicente Pérez-Brocal, Amparo Lattore et Andrés Moya pour le séquençage des EST de charançon et de puceron et à Delphine Charif pour le travail qu’elle a effectué sur ces séquences. Enfin, je tiens à remercier Gérard Febvay et tous les membres du laboratoire pour leur accueil et leur soutien au cours de ces quatre années… avec une mention spéciale pour toutes les petites mains qui m’ont aidée à dissequer les grains de blé, pour Gaby, Isa et Heidi pour les séances “anti-stress” à la salle de sport et pour Alain qui a régulièrement fleuri mon bureau. Merci aussi à tous mes amis pour leur soutien, Merci à Federica pour avoir été là quand j’en avais besoin, Merci à Jeremy, mon complice, Et enfin merci à Frédéric, tout simplement. Sommaire ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 4 Sommaire ABREVIATIONS ................................................................................................................................................................8 INTRODUCTION ...............................................................................................................................................................9 SYMBIOSE ET IMMUNITE INNEE ............................................................................................................................... 12 1 CONTEXTE BIOLOGIQUE : LA SYMBIOSE ................................................................................ 13 1.1 Les différentes définitions et classifications de la symbiose .......................................... 13 1.2 La symbiose intracellulaire chez les insectes................................................................ 14 1.2.1 1.2.1.1 1.2.1.2 1.2.1.3 1.2.2 1.2.2.1 1.2.2.2 1.3 Caractéristiques du modèle Sitophilus spp. .................................................................. 22 1.3.1 1.3.1.1 1.3.1.2 1.3.1.3 1.3.2 1.3.2.1 1.3.2.2 1.3.3 1.3.3.1 1.3.3.2 2 Biologie de la symbiose intracellulaire chez les insectes .....................................................14 Niveau d’intégration des endocytobiotes .............................................................................14 Rôle des endocytobiotes primaires, impact physiologique ...................................................16 Aspects moléculaires des interactions hôte-symbiote...........................................................17 Evolution des génomes des bactéries symbiotiques intracellulaires......................................19 Augmentation de la vitesse d’évolution...............................................................................19 Réduction de la taille des génomes des endocytobiotes........................................................20 Développement de l’insecte et description des structures symbiotiques ...............................23 Transmission des symbiotes et embryogenèse .....................................................................24 Le développement du bactériome larvaire ...........................................................................24 Développement des bactériomes des cæcums mésentériques................................................25 Quelques aspects de l’interaction hôte-symbiote .................................................................26 Devenir des structures symbiotiques chez les insectes aposymbiotiques...............................26 Contrôle de la densité bactérienne par l’hôte .......................................................................26 Aspects évolutifs de la symbiose chez Sitophilus ................................................................27 Caractéristiques du génome de SOPE..................................................................................27 Histoire évolutive de la symbiose chez les Dryophthoridae..................................................27 L’ IMMUNITE INNEE .............................................................................................................. 30 2.1 La réponse cellulaire ................................................................................................... 33 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 La phagocytose par les plasmatocytes.................................................................................33 L’encapsulation par les lamellocytes ..................................................................................34 Les cellules à cristaux et la mélanisation ............................................................................34 La réponse humorale : synthèse des peptides antimicrobiens........................................ 34 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.4 2.3 2.4 Le corps gras : la réponse systémique .................................................................................35 La voie Toll .......................................................................................................................35 La voie Imd .......................................................................................................................38 Les épithéliums : la réponse locale .....................................................................................39 Reconnaissance des microorganismes .................................................................................40 Les GNBP..........................................................................................................................40 Les PGRP ..........................................................................................................................41 Elimination des microorganismes par les peptides antimicrobiens .......................................48 La réaction de mélanisation ......................................................................................... 50 Conclusion .................................................................................................................. 52 MATERIEL ET METHODES .......................................................................................................................................... 53 1 I NSECTES : ELEVAGE ET MATERIEL BIOLOGIQUE .................................................................... 54 1.1 Le charançon Sitophilus zeamais ................................................................................. 54 1.1.1 1.1.2 1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.2 1.2.1 1.2.2 2 Elevage..............................................................................................................................54 Matériel biologique ............................................................................................................54 Larves du quatrième stade et nymphes ................................................................................54 Embryons...........................................................................................................................54 Ovocytes et bactériomes larvaires .......................................................................................54 Le puceron Acyrthosiphon pisum ................................................................................. 55 Élevage..............................................................................................................................55 Matériel biologique ............................................................................................................55 TECHNIQUES HISTOLOGIQUES ............................................................................................... 55 2.1 Fixation des échantillons ............................................................................................. 55 2.2 Double inclusion et coupe ............................................................................................ 56 ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 5 Sommaire 2.3 “Fluorescence In Situ Hybridization” (FISH) sur coupes histologiques........................ 56 I NFECTION BACTERIENNE ..................................................................................................... 57 3.1 Culture des souches bactériennes utilisées ................................................................... 57 3.2 Infection des larves de charançon ................................................................................ 58 3.3 Mesure de la croissance bactérienne in larva............................................................... 58 3.4 Infection des pucerons ................................................................................................. 58 4 TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ............................................................................. 59 4.1 Extraction des acides nucléiques et électrophorèse sur gel d’agarose........................... 59 3 4.1.1 4.1.2 4.1.2.1 4.1.2.2 4.1.2.3 4.1.3 4.1.4 4.2 Northern Blot .............................................................................................................. 61 4.2.1 4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.2.3 4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 4.6 4.7 4.7.1 4.7.2 4.7.3 4.7.4 4.8 4.8.1 4.8.2 4.9 4.9.1 4.9.2 Extraction d’ADN génomique ............................................................................................59 Extraction d’ARN totaux....................................................................................................59 Extraction au Trizol® ..........................................................................................................60 Extraction "RNeasy Mini kit" (QIAGEN) ...........................................................................60 Traitement des échantillons à la DNase...............................................................................60 Electrophorèse sur gel d’agarose ........................................................................................60 Dosage des échantillons .....................................................................................................61 Préparation des membranes ................................................................................................62 Préparation des sondes radioactives ....................................................................................62 Amplification par PCR des fragments d’ADN .....................................................................62 Purification des fragments d’ADN amplifiés .......................................................................63 Marquage radioactif de la sonde .........................................................................................63 Hybridation et révélation....................................................................................................64 Préhybridation-hybridation .................................................................................................64 Lavages, exposition, révélation et normalisation .................................................................64 Soustraction d’ADNc (“Suppressive Subtractive Hybridization”) ................................. 65 Synthèse, amplification et purification des ADNc ...............................................................65 Digestion des ADNc, ligation aux adaptateurs et hybridations .............................................67 Amplification des ADNc soustraits.....................................................................................67 Obtention des séquences des ARNm à partir des EST (RACE)....................................... 68 Obtention des ADNc (RT-PCR)..........................................................................................68 Obtention des fragments d’ADNc (RACE PCR)..................................................................69 Amplification de fragment d’ADN génomique par longue PCR ..................................... 70 Marche sur le chromosome (“Genome Walking”) ........................................................ 70 Clonage des produits de PCR, préparation de l’ADN plasmidique et séquençage. ........ 71 Clonage par “TOPO cloning” (Invitrogen) ..........................................................................71 Transformation des cellules par électroporation ..................................................................72 Préparation d’ADN plasmidique .........................................................................................73 Séquençage des fragments d’ADN ......................................................................................73 RT-PCR quantitative en temps réel .............................................................................. 73 Rétrotranscription des ARNm.............................................................................................74 PCR en temps réel..............................................................................................................75 Macroarrays................................................................................................................ 76 Synthèse des sondes radioactives par rétrotranscription.......................................................76 Préparation des membranes ................................................................................................76 5 TECHNIQUES D ’ ANALYSE DE SEQUENCES .............................................................................. 77 5.1 Analyse des séquences à l’aide du programme Mac Molly Tetra (GeneSoft) ................. 77 5.2 Analyse des séquences par comparaison aux banques de données ............................... 77 5.3 Analyse des EST des banques soustraites ..................................................................... 78 6 TECHNIQUES DE BIOCHIMIE .................................................................................................. 78 6.1 Collecte d’hémolymphe et extraction des peptides ........................................................ 78 6.2 Séparation des peptides de l’hémolymphe par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) .............................................................................................................. 79 6.3 Test d’activité antibactérienne en milieu liquide .......................................................... 80 ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 6 Sommaire RESULTATS..................................................................................................................................................................... 81 1 I DENTIFICATION DES GENES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE DE L ’ HOTE ................................... 1.1 Gènes de la réponse immunitaire de Sitophilus zeamais ............................................... 1.2 Gènes de la réponse immunitaire d’Acyrthosiphon pisum ............................................ 1.3 Analyse et caractérisation des GRI .............................................................................. 1.3.1 1.3.1.1 1.3.1.2 1.3.2 1.3.2.1 1.3.2.2 1.3.2.3 1.3.2.4 2. 2.1 2.2 82 82 85 86 Analyse globale des banques soustraites .............................................................................86 Expression différentielle des EST de Sitophilus zeamais .....................................................87 Analyse de la banque d’Acyrthosiphon pisum......................................................................90 Caractérisation des GRI de Sitophilus zeamais ....................................................................90 Obtention et analyse des séquences complètes des transcrits des GRI ..................................90 Etude du profil d’expression des GRI .................................................................................97 Mise en place d’une procédure adaptée à l’analyse des séquences des banques soustraites. ..99 Tentative d’identification des peptides antibactériens par une approche biochimique .........100 S YMBIOSE ET IMMUNITE CHEZ S ITOPHILUS ZEAMAIS ..........................................................105 Expression des GRI de Sitophilus zeamais dans le bactériome larvaire .......................105 Caractérisation moléculaire du gène PGRP1 ..............................................................106 2.2.1 Expression du gène PGRP1 en relation avec la densité bactérienne. ..................................106 2.2.1.1 Mesure de la croissance bactérienne dans les larves ..........................................................107 2.2.1.2 Etude de l’expression du gène PGRP1 ..............................................................................108 2.2.2 Expression du gène PGRP1 au cours de développement de l’insecte..................................110 2.2.2.1 Expression du gène PGRP1 à différents stades de développement de l’hôte .......................110 2.2.2.2 Externalisation des endocytobiotes au stade nymphal ........................................................111 2.2.3 Epissage alternatif du gène PGRP1..........................................................................................113 2.2.3.1 Séquençage du gène PGRP1 .............................................................................................115 2.2.3.2 Quantification des deux transcrits alternatifs du gène PGRP1............................................116 DISCUSSION .................................................................................................................................................................. 118 1 2 LA REPONSE IMMUNITAIRE DE L ’ HOTE AUX BACTERIES G RAM (-) .........................................119 LA REPONSE IMMUNITAIRE DE S. ZEAMAIS AUX BACTERIES SYMBIOTIQUES ............................122 2.1 Réponse immunitaire et maintien de la symbiose dans le bactériome ...........................122 2.2 Externalisation des endocytobiotes et activation de la réponse immunitaire de l’hôte au stade nymphal ...............................................................................................................128 2.3 Une réponse immunitaire spécifique............................................................................129 CONCLUSION................................................................................................................................................................ 131 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES......................................................................................................................... 135 ANNEXES ....................................................................................................................................................................... 149 ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 7 Abréviations aa : acide aminé ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire ADNg : Acide DésoxyriboNucléique génomique ADNr : Acide DésoxyriboNucléique ribosomal ANOVA : ANalysis Of Variance ARN : Acide RiboNucléique ARNm : Acide RiboNucléique messager BET : Bromure d’EThidium BF2I : Biologie Fonctionnelle, Insectes et Interactions BLAST : Basic Local Alignment Search Tool BSA : Bovine Serum Albumine DAP : acide DiAminoPimélique DEPC : DiEthylPyroCarbonate DMSO : DiMéthylSulfOxyde DNase : DésoxyriboNucléase DTT : DiThioThréitol EDTA : acide EthylèneDiamineTétraAcétique EST : Expressed Sequence Tag gapdh : glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase gb : GenBank GNBP: Gram-Negative bacteria Binding Protein GRI : Gène de la Réponse Immunitaire GSP: Gene Specific Primer HPLC : High Performance Liquid Chromatography hr : humidité relative IAGC : International Aphid Genomic Consortium IL-1R : InterLeukin-1 Receptor imd : immune deficiency IRAK : IL-1 Receptor Associated Kinase kb : kilobase LPS : LipoPolySaccharide MA : Million d’Années Mb : Mégabase NF-κB : Nuclear Factor-Kappa B ORF : Open Reading Frame p : poids PAMP : Pathogen Associated Molecular Pattern PASS : Pea Aphid Secondary Symbiont PBS: Phosphate Buffer Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PGN : PeptidoGlycaN PGRP : PeptidoGlycan Recognition Protein PO : PhénolOxydase PPAE (F) : ProPhenoloxydase Activating Enzyme (Factor) PRR : Pattern-Recognition Receptor qsp: quantité suffisante pour RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends RNAi : RiboNucleic Acid interference RNase : RiboNucléase RT : Reverse-Transcriptase SDS : Sodium Dodécyl Sulfate SOPE : Sitophilus oryzae Primary Endosymbiont sp : Swiss-Prot SPE : Sitophilus Primary Endosymbiont spp. : abréviation utilisée pour désigner plusieurs espèces d’un même genre SSC : Saline Sodium Citrate SSPE : Saline Sodium Phosphate EDTA SSTT : Système de Sécrétion de Type Trois SZPE: Sitophilus zeamais Primary Endosymbiont TAE : Tris Acétate EDTA TLR : Toll-Like Receptor TNF-α : Tumor Necrosis Factor alpha UPM : Universal Primers Mix v: volume 8 Introduction ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 9 INTRODUCTION “On peut concevoir la symbiose, à l’origine, comme une infection bactérienne au sens pathologique du mot. La lente adaptation de ces bactéries à un même organisme a progressivement diminué leur virulence jusqu’à les rendre complètement inoffensives pour l’hôte.” A. PAILLOT, “L’infection chez les insectes : immunité et symbiose” (1933). L’intérêt de cet entomologiste lyonnais pour l’étude des “maladies des insectes” est né en 1912, dans le cadre d’un projet visant à utiliser des parasites microbiens dans la lutte contre les insectes nuisibles. Pensant qu’aucun résultat ne serait obtenu avec les microorganismes sans la connaissance des phénomènes pathologiques qu'ils entraînent, A. Paillot entreprend alors l’étude de l'immunité des insectes. Au cours de ses recherches, il constate “l’existence de processus différents de ceux qui ont été mis en évidence chez les vertébrés supérieurs”, processus qu’il décrit dans son livre “L'infection chez les Insectes” (Paillot, 1933). A la même époque, P. Buchner publie un ouvrage recouvrant l’ensemble des connaissances acquises sur la symbiose chez les insectes (Buchner, 1930). Fasciné par l’origine bactérienne des symbiotes chez le puceron, A. Paillot consacre une partie de ses recherches à l’étude de la symbiose dans ce groupe d’insectes ravageurs des cultures. Non convaincu par le rôle des symbiotes dans le métabolisme de leur hôte, A. Paillot rapproche les processus symbiotiques des processus infectieux. Il pense que la symbiose “ne devrait plus être considérée, chez les pucerons tout au moins, comme une association étroite de deux êtres vivants retirant chacun un égal bénéfice de la vie en commun, mais comme une infection bactérienne normale, équilibrée par des réactions d’immunité semblables à celles qui se produisent dans l’organisme des insectes inoculés avec des bacilles peu pathogènes”. Bien qu’A. Paillot ait très largement sous-estimé l’impact des symbiotes sur les caractères de fitness de leur hôte, il a eu le mérite d’introduire dans la symbiose les notions d’infection et d’équilibre assuré par les réactions immunitaires. Ces notions, qui ont ouvert des perspectives nouvelles sur la conception générale de la symbiose, ont néanmoins été très peu abordées jusqu’à nos jours. Chez les insectes, de nombreuses espèces nécessitent pour leur survie et leur reproduction, la présence de bactéries symbiotiques intracellulaires (ou endocytobiotes). Les bactéries sont localisées dans des cellules spécialisées, appelées bactériocytes, qui sont parfois groupées entre elles pour former un organe, le bactériome (Buchner, 1965). Ces vingt dernières ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 10 INTRODUCTION années, la recherche sur les symbioses d’insectes s’est principalement focalisée sur la physiologie des interactions, la phylogénie des symbiotes et l’évolution moléculaire des génomes bactériens, en relation avec les contraintes du milieu intracellulaire. L’étude des endocytobiotes d’insectes 1 a notamment permis d’étayer l’hypothèse de leur origine “pathogène” en raison de leur proximité phylogénétique avec des bactéries parasites ou pathogènes (Charles et al., 2001 ; Dale et al., 2002 ; Lefèvre et al., 2004). Par ailleurs, deux études sur les interactions moléculaires hôtesymbiote, menées récemment chez le charançon Sitophilus zeamais et le puceron Acyrthosiphon pisum, ont mis en évidence, pour la première fois dans les symbioses d’insectes, la surexpression de gènes de la réponse immunitaire dans les bactériocytes (Heddi et al., 2005 ; Nakabachi et al., 2005). La surexpression de ces gènes dans l’organe symbiotique suscite de nombreuses interrogations concernant le mode de perception des endocytobiotes, leur persistance dans les bactériocytes, et le rôle éventuel de l’immunité innée dans le contrôle des endocytobiotes. L’objectif de ma thèse était de caractériser les aspects immunitaires de l’interaction hôte-symbiote, et leur évolution en relation avec l’évolution des capacités infectieuses des endocytobiotes. Dans ce travail, nous nous sommes d’abord attachés à identifier et caractériser, chez le charançon S. zeamais et le puceron A. pisum, les gènes de la réponse immunitaire par une approche de soustraction d’ADNc. L’analyse du profil d’expression des gènes de la réponse immunitaire dans le bactériome du charançon a ensuite permis d’aborder les mécanismes immunitaires qui permettraient le maintien de la symbiose. Cette analyse nous a également permis d’émettre l’hypothèse d’un contrôle de la localisation des endocytobiotes par l’immunité de l’hôte. Enfin, j’ai complété cette étude par l’analyse d’un gène de la famille des “PeptidoGlycan Recognition Proteins” (PGRP), qui pourrait représenter un gène essentiel dans l’adaptation de la réponse immunitaire de l’hôte au maintien de la symbiose. Pour introduire ce travail sur la symbiose et l’immunité de l’insecte, il me paraît nécessaire de présenter d’abord certains aspects de la symbiose intracellulaire et de décrire les mécanismes généraux de la réponse immunitaire des insectes. 1 On désigne ici par “pathogène”, un microorganisme possédant les gènes nécessaires à l’invasion de l’hôte et éventuellement, à la pathogénicité. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 11 Symbiose et Immunité innée ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 12 Symbiose et Immunité innée 1 Contexte biologique : La symbiose Le terme de symbiose a été introduit pour la première fois en biologie par Frank (1877) et De Bary (1879) pour désigner une association entre deux organismes spécifiquement distincts. Cette définition, très générale, inclut donc aussi bien les associations mutualistes, où les deux partenaires bénéficient de l’association, que les associations parasitaires, où l’un des partenaires vit aux dépens de l’autre. Depuis cette définition, le terme de symbiose a engendré de nombreuses confusions, probablement du fait de l’utilisation de ce terme dans des expressions socioculturelles pour évoquer des relations plutôt harmonieuses. Il en résulte qu’au sein de la communauté scientifique, la notion de symbiose est souvent rapprochée de celle de mutualisme et, de ce fait, opposée à celle de parasitisme (Nardon et Grenier, 1993). Dans cette thèse, je désignerai donc par le terme de symbiose, les associations qui se placent dans un continuum phénotypique allant du parasitisme au mutualisme. 1.1 Les différentes définitions et classifications de la symbiose La symbiose est un phénomène largement répandu dans la nature et qui se manifeste par une grande diversité aussi bien dans les partenaires impliqués, que dans les formes d’associations. Elle implique généralement des organismes phylogénétiquement distants, et l’association peut se limiter à deux partenaires (monosymbiose) ou impliquer plusieurs partenaires (plurisymbiose). Il existe aussi des situations d’hypersymbiose, comme chez les aleurodes qui hébergent une β-protéobactérie à l’intérieur de laquelle vit une γ-protéobactérie (von Dohlen et al., 2001). Par ailleurs, on peut distinguer les ectosymbioses, où le symbiote est à l’extérieur de son hôte, et les endosymbioses où le symbiote vit à l’intérieur de l’hôte. La localisation du symbiote dans l’organisme hôte donne lieu à une seconde distinction entre les endosymbioses extracellulaires comme la symbiose digestive, et les endocytobioses, où le symbiote vit à l’intérieur des cellules de l’hôte (Schwemmler, 1980). Toutefois, le terme “endosymbiont” regroupe, dans la littérature anglophone, à la fois les endosymbiotes et les endocytobiotes, alors que les symbiotes du tube digestif qui sont extracellulaires sont qualifiés de “gut symbionts”. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 13 Symbiose et Immunité innée 1.2 La symbiose intracellulaire chez les insectes Il est difficile de dire avec précision quand les premiers insectes sont apparus, mais les éléments fossiles apportent la preuve de leur existence dès le dévonien (de -408 MA à -360 MA environ). Les insectes ont traversé plusieurs âges géologiques et constituent aujourd’hui le groupe animal le plus représenté sur terre. Il existe actuellement plus de 1,4 millions d’espèces d’insectes décrites, ce qui représente environ 80% de la biodiversité totale. Ce nombre qui est certainement sous-estimé, pourrait atteindre entre 30 et 50 millions d’espèces selon Erwin (1997). Cette forte représentation des insectes résulte de leur capacité de diversification et d’adaptation à différentes niches écologiques, y compris celles qui sont nutritionnellement déficientes. La conquête de ces niches déficientes, comme la sève phloémienne des végétaux, les grains de céréales, ou encore le sang des mammifères, aurait été facilitée par la présence de bactéries symbiotiques intracellulaires (Buchner, 1965). Grâce aux nouvelles capacités physiologiques apportées par la bactérie, l’endocytobiose constitue un élément essentiel dans le pouvoir adaptatif des insectes. Aujourd’hui, on estime à plus de 10% le nombre d’espèces qui dépendent d’endocytobiotes pour leur viabilité et leur reproduction (Buchner, 1965 ; Moran et Telang, 1998 ; Moran et Baumann, 2000). Dans cette partie, il ne s’agit pas de développer de manière exhaustive tous les aspects de la symbiose intracellulaire d’insectes, mais de présenter les aspects en relation avec le travail réalisé dans cette thèse. Ces aspects seront abordés essentiellement à travers le modèle Sitophilus“Sitophilus Primary Endosymbiont” (SPE), mais les caractéristiques d’autres modèles de symbioses seront également évoquées. 1.2.1 Biologie de la symbiose intracellulaire chez les insectes 1.2.1.1 Niveau d’intégration des endocytobiotes Chez les insectes, on distingue différents types d’endocytobioses bactériennes en fonction de la représentation des symbiotes dans les populations d’insectes et de leur impact sur la physiologie et la reproduction de l’hôte. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 14 Symbiose et Immunité innée 1.2.1.1.1 Les symbioses primaires La symbiose est qualifiée de primaire lorsque l’hôte dépend du symbiote pour sa survie et sa reproduction, et lorsque le symbiote est représenté dans toutes les populations de l’espèce d’insecte. Parmi les caractéristiques de ces symbioses, il existe une localisation des bactéries dans des cellules spécialisées appelées bactériocytes. La localisation des bactériocytes et leur organisation présentent une grande variabilité entre les différents groupes d’insectes (Buchner, 1965). Ainsi, chez les glossines (Aksoy, 2000) et les charançons (Nardon et Wicker, 1981), les bactériocytes sont regroupés pour former un organe, le bactériome. On observe également un regroupement des bactériocytes chez les pucerons, mais la structure reste plus lâche (Buchner, 1965). Chez les fourmis et les blattes, en revanche, les bactériocytes ne sont pas regroupés en un organe mais disséminés entre les cellules intestinales et les cellules adipeuses, respectivement (Buchner, 1965). A l’intérieur des bactériocytes, les bactéries sont soit libres dans le cytoplasme comme chez les charançons, soit entourées d’une membrane de type vacuolaire appelée M3 comme chez les pucerons ; M1 et M2 étant les deux membranes des bactéries Gram (-). L’autre caractéristique des endocytobiotes primaires est leur transmission maternelle. Le mode le plus fréquent est la transmission par voie ovocytaire, mais il existe d’autres modes comme la transmission par contamination intra-utérine chez les larves de glossines (Aksoy, 2000) ou encore la réinfection des jeunes embryons parthénogénétiques à un stade très précoce chez les pucerons (Buchner, 1965 ; Braendle et al., 2003 ; Miura et al., 2003). Les mécanismes de ces réinfections embryonnaires restent pour l’instant mal caractérisés. Il pourrait s’agir d’un phénomène passif, par endocytose, ou actif, par l’utilisation d’un système bactérien impliqué dans l’invasion cellulaire. Chez le puceron, la présence de la membrane M3 suggère que ce processus d’infection implique l’endocytose de Buchnera. Cette hypothèse semble confirmée par les résultats de microscopie électronique obtenus récemment par l’équipe de T. Fukatsu (Koga et al., 2006). 1.2.1.1.2 Les symbioses secondaires En plus des endocytobiotes primaires obligatoires, les insectes peuvent posséder des symbiotes dont la fonction et l’impact sur la physiologie de l’hôte restent mal élucidés. Ces symbiotes, dits secondaires ou facultatifs, ne sont pas présents dans toutes les populations d’insectes, sont transmis aussi bien verticalement qu’horizontalement et ne possèdent pas toujours de spécificité tissulaire. Chez les pucerons, les symbiotes secondaires occupent des ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 15 Symbiose et Immunité innée bactériocytes dits secondaires, différents des bactériocytes renfermant le symbiote primaire Buchnera (Fukatsu et al., 2000 ; Koga et al., 2003). Chez la glossine, le symbiote secondaire, Sodalis, infecte les cellules de divers tissus, principalement l’intestin, et peut aussi se retrouver libre dans l’hémolymphe de l’insecte. 1.2.1.1.3 Les symbioses à Wolbachia De très nombreuses espèces d’insectes (15-20%), ainsi que d’autres invertébrés, vivent également en symbiose facultative avec Wolbachia. Cette bactérie, qui appartient au groupe des α-protéobactéries et qui est très proche des Rickettsia, est connue pour son impact sur la reproduction des invertébrés (Werren, 1997 ; Jeyaprakash et Hoy, 2000). Elle manipule la reproduction de son hôte en faveur de sa transmission à la descendance, via quatre mécanismes connus : l’incompatibilité cytoplasmique, la parthénogenèse, la féminisation des mâles génétiques et le “male-killing” (Breeuwers et Werren, 1990 ; Rigaud et al., 1991 ; Stouthamer et al., 1999 ; Fialho et Stevens, 2000). Contrairement aux endocytobiotes primaires, Wolbachia infecte l’ensemble des tissus de son hôte. Elle se trouve néanmoins souvent à forte densité dans la lignée germinale, où elle exerce son rôle sur la reproduction (Dobson et al., 1999). Elle est transmise verticalement aux descendants, comme les symbiotes primaires, mais elle peut utiliser également des transferts horizontaux pour infecter de nouvelles populations (Vavre et al., 1999). Bien que Wolbachia soit généralement sans effet sur la fitness de l’hôte, il existe toutefois quelques exemples de souches indispensables à la reproduction de leur hôte comme chez Asobara tabida (Hymenoptera, Braconidae) où Wolbachia est nécessaire à l’ovogenèse (Dedeine et al., 2001). Il existe également des souches pathogènes qui entraînent la mort de l’hôte (McGraw et O'Neill, 2004). 1.2.1.2 Rôle des endocytobiotes primaires, impact physiologique Les premières études consacrées à la symbiose chez les insectes étaient essentiellement centrées sur des travaux histologiques. La symbiose était une curiosité biologique et les chercheurs, fascinés par les structures symbiotiques, tentaient de décrire ces structures et de comprendre le processus de transmission des symbiotes à la descendance, ainsi que leur interaction avec l’embryogenèse. Les études du rôle des endocytobiotes sur la physiologie et la reproduction de leur hôte, se sont développées plus récemment grâce à ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 16 Symbiose et Immunité innée l’obtention, en laboratoire, de souches dépourvues artificiellement de symbiote (souches aposymbiotiques). La comparaison des souches apo- et symbiotique a ainsi permis de mettre en évidence l’impact du symbiote sur les caractères de fitness de l’hôte. Chez le charançon Sitophilus oryzae par exemple, l’élimination de l’endocytobiote entraîne une augmentation de la durée de développement, une baisse de la fertilité et la perte de l’aptitude au vol chez les adultes (Nardon et Wicker, 1981 ; Grenier et al., 1994). Des perturbations physiologiques similaires ont aussi été observées chez d’autres insectes symbiotiques comme les blattes, les punaises ou les glossines. Chez le puceron, l’élimination des endocytobiotes entraîne, en plus, la stérilité de l’hôte (Sasaki et al., 1991 ; Rahbé et al., 1993 ; Iimura et al., 1995). Puisque la plupart des insectes symbiotiques se développent dans des milieux pauvres ou déséquilibrés nutritionnellement, les causes de ces perturbations physiologiques ont été recherchées au niveau d’éventuelles complémentations nutritionnelles par le symbiote. Ainsi, grâce à des approches biochimiques, il a été montré que les endocytobiotes fournissaient à leur hôte des nutriments comme les vitamines ou les acides aminés. Buchnera, le symbiote du puceron, fournit à son hôte les acides aminés essentiels comme la thréonine, la lysine et l’isoleucine dont est dépourvue la sève phloémienne (Sasaki et Ishikawa, 1994 ; Febvay et al., 1995). Wigglesworthia, le symbiote de la glossine, fournit également à son hôte les vitamines sous représentées dans le sang des mammifères (Aksoy, 2000). Chez Sitophilus, les endocytobiotes fournissent à leur hôte des vitamines indispensables telles que la riboflavine, l’acide pantothénique et la biotine (Wicker, 1983). Par le biais de ces vitamines, il a été montré que le symbiote influence le métabolisme mitochondrial en augmentant les activités enzymatiques spécifiques du cycle de Krebs et de la chaîne respiratoire (Heddi et al., 1993). Ces améliorations du métabolisme énergétique ont un impact direct sur l’aptitude au vol des souches symbiotiques (Grenier et al., 1994). 1.2.1.3 Aspects moléculaires des interactions hôte-symbiote La première étude de l’interaction moléculaire hôte-symbiote au niveau des bactériocytes a été réalisée, chez le charançon, par une approche de soustraction d’ADNc (Heddi et al., 2005). Grâce à cette approche, qui consiste à identifier les gènes de l’hôte surexprimés dans le bactériome, il a été montré qu’une proportion importante de gènes surexprimés correspond à des gènes impliqués dans le transport et le métabolisme des sucres. Ceci est probablement lié à une absorption importante de sucres par le bactériome qui est accolé au tube digestif. Une analyse par HPLC a permis d’étayer ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 17 Symbiose et Immunité innée cette hypothèse grâce à la mise en évidence d’une accumulation de fructose et de polyols (sorbitol et mannitol) dans le bactériome (Heddi et al., 2005). L’assimilation de ces sucres serait réalisée en partie par l’endocytobiote SPE qui a conservé les gènes impliqués dans le catabolisme des sucres dérivés des plantes et les gènes impliqués dans le transport des polyols (Rio et al., 2003 ; séquençage en cours du génome). L’approche soustractive a également mis en évidence la surexpression de gènes de stress et de gènes impliqués dans le trafic vésiculaire. La surexpression des premiers a été interprétée comme un moyen de limiter les effets nocifs du métabolisme intense des sucres et de la synthèse de réactifs oxygénés. Pour les seconds, ils seraient impliqués dans l’exportation, vers l’insecte, des métabolites synthétisés dans les bactériocytes. Enfin, contrairement à ce qui a été décrit jusqu’à présent dans les autres modèles de symbiose, le bactériome des charançons du genre Sitophilus surexprime au moins un gène de la réponse immunitaire. Il s’agit d’un gène de la famille des “PeptidoGlycan Recognition Proteins” (PGRP) homologue du PGRP-LB de Drosophila melanogaster (Heddi et al., 2005). Une autre étude du profil transcriptionnel des bactériocytes a également été réalisée chez le puceron, par l’équipe de Fukatsu (Nakabachi et al., 2005), à travers une analyse des EST bactériocytaires par PCR quantitative en temps réel. En accord avec le rôle nutritionnel de Buchnera, plusieurs gènes impliqués dans l’utilisation des acides aminés essentiels synthétisés par le symbiote sont surexprimés dans les bactériocytes. En revanche, puisque le puceron fournit à Buchnera des acides aminés non essentiels que le symbiote ne peut pas synthétiser, ce sont les gènes impliqués dans la synthèse et non dans l’utilisation de ces derniers qui sont surexprimés dans ces cellules. Les bactériocytes surexpriment également des gènes impliqués dans le transport mitochondrial et le transport vésiculaire, ce qui souligne le rôle des bactériocytes dans l’échange de métabolites et de substrats entre l’hôte et le symbiote. Enfin, le gène le plus exprimé dans les bactériocytes code un lysozyme de type i, une enzyme bactériolytique qui pourrait jouer un rôle dans le contrôle et le maintien des endocytobiotes (Nakabachi et al., 2005). Les études d’Heddi et al. (2005) et de Nakabachi et al. (2005) rapportent des résultats similaires qui soulignent la surexpression de gènes impliqués dans le transport et dans le métabolisme des sucres et des acides aminés, respectivement, en relation avec le rôle nutritif des symbiotes. Ces deux études ont également mis en évidence la surexpression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte, ce qui suggère l’implication des voies immunitaires dans le contrôle et le maintien des symbiotes dans le bactériome. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 18 Symbiose et Immunité innée 1.2.2 Evolution des génomes des bactéries symbiotiques intracellulaires Ces dix dernières années, les données issues de la génomique et de la postgénomique ont permis de mettre en évidence que le génome des bactéries strictement intracellulaires est soumis à une évolution différente de celle du génome des bactéries libres. 1.2.2.1 Augmentation de la vitesse d’évolution Le mode de vie strictement intracellulaire conduit à un isolement des endocytobiotes qui empêche toute recombinaison avec des bactéries libres. Par ailleurs, le mode de transmission maternel des endocytobiotes est responsable d’un fort goulot d’étranglement : à chaque génération, seul un petit nombre de bactéries est transmis à la génération suivante pour engendrer la population bactérienne de la descendance. Associés au “cliquet de Muller” (c’est-à-dire l’accumulation de mutations de manière irréversible du fait de l’absence de recombinaison), ces goulots d’étranglement successifs vont accélérer les effets de la dérive génétique et favoriser la fixation de mutations délétères (Moran, 1996). L’isolement des endocytobiotes dans les bactériocytes et leur transmission strictement maternelle augmentent donc de façon drastique la vitesse d’évolution des génomes, ce qui augmente l’influence des biais mutationnels. On observe ainsi chez toutes les bactéries intracellulaires, des compositions en bases A et T très fortes (Tableau I). Ce biais de composition vers les bases A et T s’expliquerait par le moindre coût métabolique pour la synthèse de ces deux bases (Rocha et Danchin, 2002). Par ailleurs, on observe également une réduction de la taille des génomes chez ces bactéries (Tableau I). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 19 Symbiose et Immunité innée Buchnera (M) Insecte hôte du (Gil génome Taux de(Akman GC Référence (Charles et Ishikawa,Taille 1999) et al., 2002) et al., 2002) (Gil et al., 2003) (Charles et al., 1997) (Heddi et al., 1998) Ch arles et al. (1999) Pucerons d e 450 à 670 kb 26% (Toh et al., 2006) (Sun et al., 2001) (Smith et al., 1987)Gil et al. ( 2002) Wigglesworthia (M) Bloch m annia (M) Mouche tsé-tsé Fourmis de 697 à 770 kb 705 kb 22 à 40% 27% S0PE (M) Charançon 3 Mb 54% Sodal i s (M) Wol b achia (P) E. coli K-12 Mouche tsé-tsé Invertébrés Bactérie libre 4,2 Mb de 0,95 à 1,66 Mb 4,6 Mb 55% 40% 53% Akman et al. (2002) Gil et al. (2003) Charles et al. (1997) Heddi et al. (1998) Toh et al. (2006) Sun et al. (2001) Smith et al. (1987) Tableau I : Taille du génome bactérien et contenu en bases G et C de quelques symbiotes intracellulaires d’insectes. M, bactérie mutualiste ; P, bactérie parasitaire. Une autre conséquence évolutive de l’isolement et de la transmission verticale des endocytobiotes est la mise en place d’une co-spéciation entre l’hôte et son symbiote comme le montre la congruence des arbres phylogénétiques des hôtes et ceux des endocytobiotes. 1.2.2.2 Réduction de la taille des génomes des endocytobiotes La plupart des bactéries intracellulaires obligatoires se caractérisent par un génome très réduit par rapport aux bactéries libres, qu’il s’agisse de bactéries mutualistes ou de bactéries parasitaires (Tableau I). Cette caractéristique s’expliquerait par la perte de gènes devenus “inutiles” dans la nouvelle unité co-évolutive. Cette perte serait due à un relâchement de la pression de sélection sur les gènes qui, via l’accumulation de mutations, deviendraient non fonctionnels et finiraient par être éliminés du génome bactérien. Le séquençage des génomes de bactéries pathogènes et de plusieurs symbiotes primaires (Buchnera, (Shigenobu et al., 2000), Wigglesworthia (Akman et al., 2002) et Blochmannia (Gil et al., 2003)), et secondaires (Sodalis (Toh et al., 2006)), ont permis de déterminer quels étaient les gènes affectés par la réduction du génome et donc, par conséquent, d’identifier les gènes essentiels à l’interaction hôte-symbiote. En effet, les données de génomique comparative entre les bactéries symbiotiques et les bactéries intracellulaires pathogènes (Rickettsia, Mycoplasma et Chlamydia) montrent que les délétions géniques ne se font pas d’une façon aléatoire, mais qu’elles sont soumises à des pressions de sélection exercées par le mode d’interaction entre l’hôte et la bactérie (résumé dans Wernegreen, 2002). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 20 Symbiose et Immunité innée - gènes des voies métaboliques Contrairement aux bactéries pathogènes dont les capacités métaboliques ont été largement altérées puisqu’elles vivent aux dépens de l’hôte, les endocytobiotes mutualistes ont conservé les fonctions de biosynthèse des constituants nécessaires à la survie et à la reproduction de leur hôte. Ils auraient, en revanche, perdu les gènes des voies métaboliques redondantes avec le métabolisme de l’hôte, ou inutiles par rapport au milieu nutritionnel dans lequel l’insecte se développe (Shigenobu et al., 2000 ; Rio et al., 2003 ; Toh et al., 2006). A titre d’exemple, Buchnera a perdu les gènes codant les voies de biosynthèse des acides aminés non essentiels pour le puceron, mais elle a conservé les voies de biosynthèse des acides aminés essentiels que le puceron ne peut pas synthétiser (Shigenobu et al., 2000). Un autre exemple concerne le symbiote secondaire de la glossine qui a perdu les gènes codant des enzymes glycolytiques, comme la galactosidase et la glucosidase, qui sont inutiles compte tenu du faible taux des substrats de ces enzymes dans le sang des mammifères (Toh et al., 2006). La perte de gènes métaboliques contribue grandement à la dépendance de l’endocytobiote vis-à-vis de son hôte, ce qui explique, en partie, que la plupart des endocytobiotes ne soient pas cultivables in vitro. - gènes impliqués dans les processus d’invasion cellulaire Dans toutes les symbioses d’origine ancienne, les génomes bactériens semblent être dépourvus des systèmes de sécrétion et des gènes de virulence qui leur sont associés (Shigenobu et al., 2000 ; Akman et al., 2002 ; Gil et al., 2003). La délétion de ces gènes serait le résultat d’un relâchement de la pression de sélection sur le pouvoir infectieux de la bactérie. Toutefois, la transmission de certains symbiotes d’insecte d’une génération à l’autre, implique des phases d’infection (ou de réinfection) de certaines cellules comme chez les glossines et les pucerons. Il a de ce fait été suggéré que chez ces symbiotes, le système flagellaire pourrait assurer le rôle de système de sécrétion (Young et al., 1999 ; Akman et al., 2002 ; Majander et al., 2005). En effet, malgré son génome très réduit, Wigglesworthia aurait conservé l’ensemble des gènes constituant le système flagellaire, alors que ni flagelle, ni motilité n’ont été observés chez ce symbiote. Chez Buchnera, le système flagellaire est également conservé mais il est dépourvu du filament responsable de la motilité, et il a été suggéré que ce système pourrait servir de transporteur (Shigenobu et al., 2000). Chez les endocytobiotes, le système flagellaire pourrait donc sécréter des protéines impliquées dans les processus d’infection des bactériocytes. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 21 Symbiose et Immunité innée Dans le cas d’associations plus récentes, où les symbiotes peuvent présenter des phases extracellulaires, le génome bactérien possède des systèmes d’invasion similaires aux systèmes employés par les bactéries pathogènes. A titre d’exemple, le génome du symbiote secondaire de la glossine, Sodalis, code trois systèmes de sécrétion de type III (SSTT), similaires des SSTT de Yersinia enterocolitica et Salmonella spp., comprenant les protéines de structure, les régulateurs, ainsi que certains effecteurs. Chez Sodalis, une étude préliminaire de deux SSTT a mis en évidence le rôle du système codé par la “Sodalis symbiosis Region-1” (SSR-1) dans l’invasion cellulaire, et celui du système codé par la SSR-2 dans la survie intracellulaire du symbiote, deux processus nécessaires au maintien de cette symbiose secondaire (Dale et al., 2005 ; Toh et al., 2006). - gènes de la paroi bactérienne Les composants de la paroi bactérienne constituent les principaux éléments qui sont reconnus par le système immunitaire de l’hôte. Ces éléments varient d’une bactérie à l’autre et, de ce fait, peuvent engendrer différentes réponses immunitaires (voir chapitre “Immunité”). Ainsi, pour échapper au système immunitaire de l’hôte, les pathogènes intracellulaires investissent une proportion considérable de leur génome réduit pour synthétiser une paroi élaborée et limiter leur reconnaissance par l’hôte. Dans le cas des endocytobiotes, le séquençage du génome de Wigglesworthia révèle que cet endocytobiote primaire de la glossine a conservé les gènes de la synthèse de la paroi bactérienne (Akman et al., 2002) alors que chez Buchnera, les gènes codant certains éléments de la paroi comme les lipopolysaccharides et les phospholipides, sont absents du génome (Shigenobu et al., 2000). Shigenobu et al. (2000) suggèrent que la délétion de ces gènes pourrait être liée à la séquestration de Buchnera dans une membrane vacuolaire d’origine eucaryotique (M3) qui isole la bactérie de l’environnement extérieur. 1.3 Caractéristiques du modèle Sitophilus spp. Les charançons (Curculionidea) constituent la plus grande superfamille de coléoptères. Le genre Sitophilus appartient à la famille des Dryophthoridae qui compte plus de 140 genres et 500 espèces. Les insectes de cette famille se développent sur diverses parties des plantes comme les tiges, les stipes ou les graines. Bien que la symbiose soit très répandue dans ce groupe d’insectes (Lefèvre et al., 2004), les charançons des céréales du genre Sitophilus sont les mieux caractérisés de par leur caractère cosmopolite et leur importance économique. En effet, les trois espèces céréalières, Sitophilus oryzae, Sitophilus zeamais et Sitophilus granarius, sont responsables d’une ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 22 Symbiose et Immunité innée perte de denrées stockées qui peut atteindre 40% dans les pays tropicaux (Grenier et al., 1986). La symbiose dans le genre Sitophilus a été découverte par Pierantoni en 1927. Depuis, de nombreux auteurs ont participé à la caractérisation de ce modèle de symbiose (Mansour, Scheinert, Murray et Tiggs, Musgrave, Nardon…) (Nardon et Grenier, 1988). Les charançons du genre Sitophilus, à l’exception d’une espèce, Sitophilus linearis, vivent tous en symbiose intracellulaire avec une γ-protéobactérie nommée SPE pour “Sitophilus Primary Endosymbiont” (Heddi et al., 1998). Les bactéries sont localisées, chez les larves, dans le bactériome situé à la jonction de l’intestin antérieur et de l’intestin moyen, et chez les adultes, dans les bactériomes des cæcums mésentériques. On les trouve également chez les femelles, dans des bactériomes situés à l’apex des ovarioles (Figure 1). Les différentes études moléculaires n’ont pas identifié de symbiote secondaire chez Sitophilus, mais plus de la moitié des souches étudiées hébergent Wolbachia (Heddi et al., 1999). Contrairement au symbiote SPE, Wolbachia est présente dans tous les tissus de l’insecte, y compris les bactériocytes. Cette bactérie, comme chez la plupart des insectes, provoque des incompatibilités cytoplasmiques partielles (Heddi et al., 1999). 1.3.1 Développement de l’insecte et description des structures symbiotiques Les trois espèces céréalières de Sitophilus présentent des cycles de développement similaires. Grâce à leur rostre, les femelles perforent le grain de céréale et y déposent leurs œufs. Le trou est ensuite rebouché par une sécrétion mucilagineuse de l’oviducte qui durcit rapidement à l’air. Le développement des quatre stades larvaires et du stade nymphal se déroule à l’intérieur du grain et l’adulte émerge quelques jours après la nymphose. Pendant les vies larvaire et nymphale, le grain apporte à l’insecte à la fois nourriture et protection. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 23 Symbiose et Immunité innée Figure 1 : Localisation des endocytobiotes chez Sitophilus. Chez le charançon, les symbiotes sont localisés dans un organe spécialisé appelé bactériome. ia, intestin antérieur ; im, intestin moyen ; ip, intestin postérieur ; cm, cæcums mésentériques ; o, ovarioles ; r, rostre. 1.3.1.1 Transmission des symbiotes et embryogenèse L’endocytobiote SPE est présent d’une façon permanente dans les ovaires du charançon (Pierantoni, 1927 ; Mansour, 1930 ; Murray et Tiegs, 1935 ; Nardon et Wicker, 1981). Au cours de l’embryogenèse, la lignée germinale qui est située au pôle postérieur de l’embryon est contaminée très tôt par des symbiotes (Nardon, 1971). Ainsi, au moment de leur formation, les cellules entraînent des symbiotes mêlés au déterminant germinal. Si les symbiotes persistent dans la lignée germinale femelle, ils sont en revanche éliminés de la lignée germinale mâle par un processus encore méconnu (Musgrave et Miller, 1953 ; Nardon et al., 1998). En plus de la lignée germinale, les symbiotes contaminent également une lignée somatique qui se différencie, au troisième jour de développement (à 27,5°C et 70% hr), en bactériocytes localisés au niveau du tube digestif antérieur de la future larve. 1.3.1.2 Le développement du bactériome larvaire Chez la larve, le bactériome apparaît sous forme d’un collier bilobé à la jonction de l’intestin antérieur (stomodeum) et de l’intestin moyen (mésentéron) (Figure 1 et Figure 2-A). Il est constitué de bactériocytes et de cellules interstitielles, dont la cohésion est assurée par une enveloppe constituée de cellules aplaties. Bien que le bactériome soit accolé à l’intestin, il ne semble pas posséder de connexion avec le tube digestif (Nardon et Wicker, 1981). Au cours des quatre stades larvaires, la taille du bactériome augmente par mitose (Murray et Tiegs, 1935) et polyploïdisation, d’environ ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 24 Symbiose et Immunité innée quatre à cinq fois. Dans le même temps, le nombre de bactéries symbiotiques passe de 2×104 dans l’œuf à 3×106 dans la larve de quatrième stade (Nardon, 1978). Ceci correspond à sept cycles de divisions bactériennes dans une période de vingt jours, si on considère que toutes les bactéries persistent durant la vie larvaire. La multiplication des symbiotes semble donc très limitée, en comparaison avec une bactérie libre comme E. coli. Toutefois, ce faible nombre de divisions est à relativiser du fait de l’augmentation de la taille des bactéries. En effet, les endocytobiotes primaires chez S. oryzae (SOPE) et S. granarius (SGPE) sont très pleïomorphes, avec une taille variant de 5 à 30 µm de longueur. Ils sont plus ou moins flexueux et peuvent aussi se présenter sous forme de chaînettes (Figure 2-B). Chez S. zeamais (SZPE), le caractère flexueux s’accentue et les symbiotes se présentent sous forme hélicoïdale, la spirale pouvant dépasser 10 µm de long (Figure 2-B). Le pleïomorphisme de taille et la forme des endocytobiotes pourraient être liés à une inhibition de la septation des endocytobiotes au cours de leur développement dans le bactériome larvaire. Cette hypothèse n’a cependant pas encore été vérifiée. A) B) trachée 10 µm 100 µm 10 µm Figure 2 : Bactériome larvaire et pleïmorphisme des endocytobiotes chez Sitophilus. A) Bactériome larvaire observé sous la loupe binoculaire. B) Endocytobiotes de S. zeamais (en haut) et S. oryzae (en bas) après coloration de Gram. 1.3.1.3 Développement des bactériomes des cæcums mésentériques Pendant la nymphose, le bactériome se désintègre et libère les bactériocytes dont une partie va dégénérer, et l’autre va s’insinuer entre l’intestin imaginal en cours de formation et sa tunique musculaire (Nardon et Grenier, 1989). Les bactériocytes vont ainsi migrer vers l’arrière du corps de l’insecte et s’incorporer dans les cæcums mésentériques au cours de leur formation (Pierantoni, 1927 ; Tarsia In Curia, 1933 ; Murray et Tiegs, 1935 ; Nardon et Nardon, 1998). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 25 Symbiose et Immunité innée Très abondants chez les jeunes adultes, les endocytobiotes disparaissent chez les adultes âgés de plus de trois semaines par un mécanisme inconnu. Néanmoins, ils demeurent chez les femelles dans des bactériomes situés à l’apex des ovarioles et dans les ovocytes, ce qui assure leur transmission à la génération suivante. 1.3.2 Quelques aspects de l’interaction hôte-symbiote 1.3.2.1 Devenir des structures symbiotiques chez les insectes aposymbiotiques Comme cela a déjà été évoqué, il existe certaines souches de charançons naturellement non symbiotiques, mais il est aussi possible d’obtenir en laboratoire des souches aposymbiotiques par traitement à la chaleur ou à l’aide d’antibiotique. Dans une souche non symbiotique de S. granarius découverte en Egypte, Mansour (1927, 1935) décrit la présence d’un bactériome parfaitement formé, mais moins volumineux que celui des souches symbiotiques. Nous avons également constaté la présence d’un bactériome larvaire résiduel dans une souche aposymbiotique de S. oryzae obtenu récemment au laboratoire. Toutefois, il semblerait que ce bactériome se perde au cours des générations puisque les souches aposymbiotiques plus anciennes sont totalement dépourvues de bactériome larvaire. La présence des symbiotes ne semble donc pas être nécessaire à la différenciation du bactériome larvaire mais plutôt au maintien de cet organe au cours des générations successives. Néanmoins, les endocytobiotes sont indispensables à la différenciation de l’organe symbiotique dans les phases précoces de l’association. Aussi, la différenciation des bactériocytes observées en leur absence pourrait être due à un “signal moléculaire”, qui serait transmis maternellement au cours des premières générations puis qui finirait par disparaître. Des observations similaires ont été faites chez les pucerons non symbiotiques où les bactériocytes se différencient et persistent à l’échelle de l’individu, mais disparaissent au cours de l’évolution (Braendle et al., 2003). 1.3.2.2 Contrôle de la densité bactérienne par l’hôte Le dénombrement des bactéries symbiotiques dans les ovaires de S. oryzae révèle que le nombre d’endocytobiotes varie d’une souche à l’autre mais reste relativement stable dans une souche donnée. A partir de cette constatation, Nardon et al. (1998) ont émis l’hypothèse selon laquelle le nombre de symbiotes serait contrôlé génétiquement par l’hôte. Des expériences de ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 26 Symbiose et Immunité innée croisements entre une souche à forte densité bactérienne (110 000 ± 4 000) et une souche à faible densité bactérienne (41 200 ± 3 000) ont montré que les individus de la génération F1 présentaient une densité bactérienne avoisinant la moyenne des souches parentales (75 000 ± 5 000). Ce résultat, appuyé par des expériences de rétrocroisements et d’irradiation, suggère que l’hôte contrôle la densité de la population bactérienne par un facteur chromosomique (Nardon et al., 1998). 1.3.3 Aspects évolutifs de la symbiose chez Sitophilus 1.3.3.1 Caractéristiques du génome de SOPE L’étude des endocytobiotes de charançon du genre Sitophilus a principalement été réalisée chez l’espèce S. oryzae. Contrairement aux autres symbiotes primaires d’insectes, le génome de SOPE semble présenter des caractéristiques proches de celles des bactéries libres. En effet, le génome de SOPE est peu réduit, avec une taille estimée à 3 Mb (Charles et al., 1997), et un taux en bases GC de 54% (Heddi et al., 1998). Par ailleurs, le génome de SOPE code un système de sécrétion de type III fonctionnel, similaire à celui de la bactérie pathogène Salmonella (Dale et al., 2002). Compte tenu de ces particularités, un projet de séquençage complet du génome de SOPE a été entrepris en collaboration avec A. Latorre et A. Moya à l’université de Valence (Espagne). Plus de la moitié du génome est actuellement séquencée. Une analyse préliminaire montre que SOPE aurait conservé plusieurs gènes impliqués dans les voies métaboliques, la virulence, la motilité, le stress… Par ailleurs, plus de 20% des séquences correspondent à des séquences d’insertion ce qui témoigne d’une forte plasticité génomique dans les phases précoces de la symbiose intracellulaire. 1.3.3.2 Histoire évolutive de la symbiose chez les Dryophthoridae Les caractéristiques du génome de SOPE, proches de celles des bactéries libres, suggèrent une association récente entre SPE et Sitophilus. En revanche, sa transmission maternelle, sa localisation dans les bactériomes et son rôle dans la physiologie de l’hôte évoquent plutôt une longue co-évolution entre les deux partenaires. L’apparente contradiction entre les caractéristiques du génome de SOPE et celles de l’association S. oryzae-SOPE a été clarifiée par l’étude des aspects évolutifs de la symbiose chez les Dryophthoridae (Lefèvre et al., 2004). L’étude phylogénétique basée sur l’ADN 16S des bactéries symbiotiques révèle que, dans la plupart des familles d’insectes, la symbiose ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 27 Symbiose et Immunité innée s’est établie lors d’une infection bactérienne ancestrale unique qui a ensuite conduit à une divergence parallèle des hôtes et des symbiotes (co-spéciation). Dans la famille des Dryophthoridae, en revanche, l’étude phylogénétique des bactéries symbiotiques a mis en évidence l’existence de trois clades d’endocytobiotes nommés D (Diocalandra), R (Rhynchophorus) et S (Sitophilus) (Lefèvre et al., 2004). Les endocytobiotes des Dryophthoridae dériveraient donc de trois espèces bactériennes distinctes ayant établi une symbiose avec trois espèces ancêtres distinctes (Figure 3). Les endocytobiotes du clade R montrent les caractéristiques évolutives associées aux symbioses anciennes. Ils présentent un taux de substitution relatif élevé et leur génome est riche en bases AT (59,6% au niveau de l’ADN 16S). Par ailleurs, la congruence entre l’arbre des hôtes et celui des endocytobiotes de ce clade traduit une évolution parallèle entre les insectes et leur symbiote. Les endocytobiotes du clade R seraient de ce fait les descendants actuels directs de l’endocytobiote ancestral. D’après les données fossiles d’insectes, la symbiose entre l’ancêtre des endocytobiotes du clade R et l’ancêtre des Dryophthoridae se serait établie il y a près de 100 MA (O’Meara et Farell, communication personnelle). Le nom de Candidatus Nardonella a été proposé pour cet endocytobiote ancestral, en l’honneur du Professeur Nardon (Lefèvre et al., 2004). Les endocytobiotes des clades D et S présentent, quant à eux, des taux de GC proches des bactéries libres (Figure 3). Les endocytobiotes de ces clades se sont donc associés plus récemment, probablement suite au remplacement d’endocytobiotes plus anciens. Dans le cas du clade S, l’âge de la symbiose a été estimé autour de 25 MA. Le remplacement des endocytobiotes pourrait être une conséquence de la réduction drastique des génomes bactériens intracellulaires, et donc de la perte de leurs capacités évolutives qui pourrait favoriser l’acquisition de nouveaux potentiels évolutifs à travers le recrutement d’autres symbiotes. La présence de symbiotes secondaires plus compétitifs pourrait alors aboutir à l’élimination du symbiote primaire. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 28 Symbiose et Immunité innée Figure 3 : Arbre phylogénétique des endocytobiotes de Dryophthoridae. Arbre phylogénétique basé sur la séquence du gène codant l’ADNr 16S des endocytobiotes des Dryophthoridae et de quelques γ-protéobactéries, obtenu par la méthode de maximum de vraisemblance. Les identifiants dans la base GenBank des séquences de l’ADNr 16S des différentes bactéries sont donnés sur la figure. “P-endosymbiont”, endocytobiote primaire ; “S-endosymbiont”, endocytobiote secondaire. D’après Lefèvre et al. (2004). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 29 Symbiose et Immunité innée Il existe de plus en plus d’arguments en faveur de l’existence de remplacement des symbiotes primaires par les symbiotes secondaires dans d’autres modèles. Par exemple, Koga et al. (2003) ont clairement montré que chez les pucerons, l’endocytobiote secondaire PASS (“Pea Aphid Secondary Symbiont”) pouvait, en conditions de laboratoire, remplacer Buchnera. En effet, des injections de PASS dans des pucerons monosymbiotiques ont mis en évidence une compétition entre les symbiotes qui aboutit à l’élimination de Buchnera. De plus, lors d’une injection dans une souche dépourvue de Buchnera, PASS infecte le cytoplasme des bactériocytes et compense partiellement l’absence du symbiote primaire, en termes de survie et de reproduction de l’insecte, pendant quelques générations. L’étude phylogénétique menée par Lefèvre et al. (2004) révèle également la proximité phylogénétique des endocytobiotes du clade D et des bactéries parasitaires des genres Haemophilus et Pasteurella, ce qui étaye l’hypothèse de l’origine “pathogénique” de la symbiose. En effet, l’acquisition de symbiotes sous-entend que le futur endocytobiote ait des capacités “pathogéniques” pour pouvoir envahir le milieu cellulaire sans être éliminé par le système immunitaire de l’hôte (Charles et al., 2001). Cette hypothèse est également soutenue par la présence d’un système de sécrétion de type III fonctionnel chez Sodalis et SOPE qui pourraient donc avoir conservé des capacités infectieuses (Dale et al., 2002). L’étude de la symbiose chez les Dryophthoridae révèle donc que la symbiose est très ancienne dans cette famille d’insectes, mais que l’association Sitophilus-SPE est néanmoins plus récente, probablement suite à un remplacement de symbiotes. Les structures symbiotiques observées chez Sitophilus spp. sont donc le résultat d’une longue co-évolution avec une bactérie symbiotique ancêtre, aujourd’hui remplacée par SPE. Ce remplacement ayant eu lieu il y a moins de 25 MA, le génome de SPE ne présente pas une réduction de taille et un biais vers les bases A+T aussi drastiques que ceux des génomes des endocytobiotes établis depuis plus de 100 MA. 2 L’immunité innée Les êtres vivants évoluent dans des milieux environnementaux “hostiles” comportant de nombreux microorganismes, véritables menaces pour leur survie. Aussi, les mécanismes visant à les protéger des invasions par les microorganismes sont d’une importance primordiale pour leur développement et leur évolution. Ces mécanismes sont regroupés au sein d’une fonc- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 30 Symbiose et Immunité innée tion assurée par le système immunitaire. L’immunité comporte d’une part la reconnaissance des éléments étrangers, ce qui implique la capacité à reconnaître le Soi du Non-Soi, et d’autre part, la mise en place de voies cellulaires ou humorales, visant à éliminer de l’organisme ces éléments étrangers. Deux types d’immunité sont à distinguer : l’immunité innée et l’immunité acquise (ou adaptative). La première fait intervenir, pour la reconnaissance et l’élimination des corps étrangers, des facteurs codés dans la lignée germinale, alors que la seconde produit, par des réarrangements géniques somatiques, des récepteurs qui reconnaissent des antigènes spécifiques et qui permettent à l’organisme de développer une mémoire immunitaire (Fearon, 1997). Ces deux types d’immunité ne sont pas indépendants puisque l’immunité innée est essentielle pour l’activation des premières étapes de l’immunité acquise (Fearon, 1999). L’immunité acquise a suscité beaucoup d’intérêt dans le passé du fait de sa spécificité et de son efficacité. Seulement, étant apparue chez les ancêtres des poissons cartilagineux (Hoffmann et Reichhart, 2002), l’immunité acquise est absente chez de nombreux organismes (au moins 80% des espèces) qui ne possèdent pas les enzymes nécessaires aux réarrangements géniques somatiques (Ferrandon et Royet, 2002). Bien que ces organismes ne disposent que de l’immunité innée, ils présentent une efficacité remarquable dans la lutte contre les agents pathogènes, ce qui laisse supposer que l’immunité innée joue un rôle plus important que celui qui lui a été attribué par le passé. Récemment, les études des mécanismes de la réponse immunitaire de la drosophile ont permis d’identifier de nombreuses familles de protéines qui s’avèrent être bien conservées au cours de l’évolution, puisque de nombreuses homologies ont été observées notamment avec les mammifères (Kang et al., 1998 ; Horng et Medzhitov, 2001 ; Vasselon et Detmers, 2002) et les végétaux (Kistner et Parniske, 2002). Chez les invertébrés, les premières défenses immunitaires sont assurées par des barrières physiques telles que la cuticule et les épithéliums de l’intestin, de la trachée ou du tractus génital (Figure 4). Certaines cellules épithéliales ont également la capacité de sécréter des peptides antimicrobiens qui permettent d’éliminer les microorganismes pathogènes (Ferrandon et al., 1998 ; Tzou et al., 2000). Lorsque ces derniers réussissent à échapper à ces peptides et qu’ils pénètrent dans l’hémocoele, deux voies de défense se mettent en place : une voie cellulaire et une voie humorale systémique qui coopèrent pour combattre l’infection (Braun et al., 1998 ; Basset et al., 2000 ; Elrod-Erickson et al., 2000 ; Lavine et Strand, 2002) (Figure 4). La voie cellulaire implique les hémocytes, parmi lesquels se distinguent les plasmatocytes qui phagocytent les bactéries, les lamellocytes ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 31 Symbiose et Immunité innée qui forment une capsule autour des particules trop volumineuses pour être phagocytées, et les cellules à cristaux qui interviennent dans la synthèse de mélanine lors de l’encapsulation et de la cicatrisation (Meister, 2004). La voie systémique humorale, quant à elle, comprend d’une part des cascades protéolytiques non spécifiques (coagulation et mélanisation locales), et d’autre part, la synthèse et la sécrétion dans l’hémolymphe de peptides antimicrobiens par le corps gras (analogue fonctionnel du foie des vertébrés) (Hoffmann, 2003). Compte tenu de la diversité et de la complexité des mécanismes de l’immunité innée, j’ai choisi de n’exposer dans cette partie bibliographique que les voies immunitaires en relation avec les travaux réalisés dans cette thèse. Je décrirai donc principalement la réponse humorale, systémique ou locale, et plus particulièrement la synthèse des peptides antibactériens régulée par les voies Toll et Imd (“Immune deficiency”) décrites chez la drosophile. Je rappellerai néanmoins succinctement quelques notions sur la réponse cellulaire et j’évoquerai autant que possible les éléments de la réponse immunitaire décrits chez d’autres insectes. Figure 4 : La réponse immunitaire chez la drosophile. Lorsqu’un corps étranger comme un microorganisme franchit les premières barrières physiques de l’insecte et pénètre dans l’hémocoele, il induit un ensemble de réactions de la réponse immunitaire. Une coagulation et une mélanisation locale au niveau des tissus endommagés vont permettre de limiter la perte d’hémolymphe. Des peptides antimicrobiens synthétisés par les épithéliums, le corps gras et les hémocytes vont assurer l’élimination du microorganisme. Ces microorganismes peuvent également être phagocytés par les plasmatocytes. Si le corps étranger est trop volumineux pour être phagocyté, comme dans le cas d’un œuf de parasitoïde, celui-ci est encapsulé par les lamellocytes et la capsule est ensuite mélanisée. Ce schéma général de la réponse immunitaire est probablement similaire pour l’ensemble des insectes holométaboles. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 32 Symbiose et Immunité innée 2.1 La réponse cellulaire Chez la drosophile, la réponse cellulaire repose sur trois types d’hémocytes : les plasmatocytes, équivalents des macrophages des mammifères, les lamellocytes et les cellules à cristaux qui n’auraient, quant à eux, pas d’équivalents (Meister, 2004). Une première population d’hémocytes se différencie au cours de l’embryogenèse puis, une deuxième population se différencie, chez la larve, à partir de l’organe hématopoïétique. Cet organe disparaît ensuite pendant la métamorphose et seuls les plasmatocytes d’origines embryonnaire et larvaire persistent chez l’adulte (Lanot et al., 2001 ; Holz et al., 2003). Chez les larves, la population hémocytaire comprend majoritairement des plasmatocytes et, en plus faible quantité, des cellules à cristaux (5 %). En revanche, les lamellocytes sont rarement représentés dans les larves saines. Ces cellules plates et adhérentes se différencient massivement à la suite d’une infection par des parasites (Lanot et al., 2001). Chez les adultes, les hémocytes sont peu nombreux du fait de l’absence d’organe hématopoïétique. 2.1.1 La phagocytose par les plasmatocytes Les plasmatocytes seraient responsables de la phagocytose, non seulement des cellules étrangères (Figure 4), mais également des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. Ce processus emprunterait des mécanismes similaires aux macrophages des mammifères (Ramet et al., 2002b). Les plasmatocytes joueraient donc un rôle important dans la réponse immunitaire, le développement et l’homéostasie des tissus. La phagocytose est initiée par la reconnaissance de la cellule (ou de la particule) cible et sa liaison à la cellule phagocytaire. Il s’ensuit une réorganisation du cytosquelette permettant l’internalisation de la cible et son transport vésiculaire jusqu’au phagosome, où elle est éliminée. L’étape de reconnaissance implique des récepteurs qui peuvent se lier directement aux éléments de la surface du microorganisme ou se lier à des opsonines, qui sont des protéines qui entourent et, de ce fait, “marquent” la cible (Stuart et Ezekowitz, 2005). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 33 Symbiose et Immunité innée 2.1.2 L’encapsulation par les lamellocytes L’encapsulation semble être une réponse spécifique des invertébrés. Elle se met en place lorsque des corps étrangers, trop volumineux pour être phagocytés, sont présents dans l’organisme (Meister, 2004). C’est notamment le cas de l’encapsulation des œufs d’hyménoptères parasitoïdes par les diptères et les lépidoptères (Schmidt et al., 2001). Quand les plasmatocytes circulants détectent la présence d’un œuf d’hyménoptère dans la larve, il s’ensuit une différenciation massive des lamellocytes (Lanot et al., 2001). Les lamellocytes libérés dans l’hémolymphe forment une capsule autour de l’œuf qui va ensuite noircir, probablement suite à l’accumulation de mélanine (Figure 4). L’élimination du parasite serait alors due soit à une asphyxie, soit aux intermédiaires toxiques synthétisés lors de la production de mélanine (§ 2.3). 2.1.3 Les cellules à cristaux et la mélanisation Les cellules à cristaux jouent un rôle de stockage à l’interface des réponses cellulaire et humorale (Meister, 2004). En effet, les inclusions cristallines de ces cellules sont en fait une forme cristallisée de la prophénoloxydase. Cette enzyme intervient dans la synthèse de mélanine dans l’hémolymphe (§ 2.3), au niveau d’une blessure ou de la capsule formée par les lamellocytes. Bien que la phagocytose, l’encapsulation et la synthèse de la prophénoloxydase constituent les fonctions majeures des hémocytes, ces cellules interviennent également dans d’autres fonctions, souvent en interaction avec la réponse humorale. Les hémocytes interviennent notamment dans la réaction de coagulation qui permet de limiter la perte d’hémolymphe et la dissémination de microorganismes dans l’hémocoele. 2.2 La réponse humorale : synthèse des peptides antimicrobiens La synthèse des peptides antimicrobiens constitue actuellement la réponse immunitaire la mieux caractérisée, du fait de la spécificité et de l’importance de ces peptides dans la résistance des insectes aux infections microbiennes (Lemaitre et al., 1997 ; Tzou et al., 2002). Les peptides antimicrobiens sont sécrétés dans l’hémolymphe par les cellules du corps gras, des épithéliums et par les hémocytes, principalement en réponse à une in- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 34 Symbiose et Immunité innée fection. Toutefois, comme cela sera discuté plus loin, ces peptides peuvent également être sécrétés constitutivement par les épithéliums. Les gènes codant les peptides antimicrobiens peuvent être induits lors d’une réponse systémique quand le microorganisme est présent dans l’hémocoele, comme lors de piqûres septiques utilisées pour l’étude de la réponse immunitaire. Ils peuvent également être induits lors d’une réponse locale, au niveau des épithéliums, généralement lors des infections naturelles de l’intestin, de la trachée ou du tractus génital. 2.2.1 Le corps gras : la réponse systémique La synthèse des peptides antimicrobiens en réponse à une infection systémique se fait principalement dans le corps gras, suite à l’activation des voies appelées Toll et Imd. Ces deux voies comportent de nombreuses protéines homologues aux protéines des voies “Nuclear Factor-Kappa B” (NF-κB) des mammifères impliquées dans la réponse inflammatoire. La voie Toll présente des homologies avec les voies des “Toll-Like Receptors” (TLR)/“InterLeukine-1 Receptor” (IL-1R) alors que la voie Imd est plus proche de la cascade du “Tumor Necrosis Factor Receptor” (TNFR1). L’activation de l’une ou l’autre des voies Toll et Imd est fonction du microorganisme infectant. La voie Toll est principalement activée en réponse à la présence de champignons ou de bactéries Gram (+), alors que la voie Imd est activée lors d’une infection par des bactéries Gram (-) (Hoffmann, 2003). 2.2.1.1 La voie Toll D’abord connue pour son rôle dans la mise en place de l’axe dorso-ventral lors du développement embryonnaire de la drosophile (St Johnston et Nusslein-Volhard, 1992), elle a ensuite été étudiée pour son rôle dans la réponse immunitaire de l’insecte (Lemaitre et al., 1996). La protéine Toll est un récepteur membranaire présentant un domaine extracellulaire riche en leucine (LRR, “Leucine-Rich-Repeats”), et un domaine intracellulaire similaire au récepteur de l’interleukine-1 des mammifères (TIR, “Toll-IL-1 Receptor domain”). Toll est le récepteur de la protéine Spätzle, issue du clivage de la protéine pro-Spätzle par une cascade de protéases à sérine activées en réponse à une infection (Figure 5). Si le ligand du récepteur Toll et certaines protéines de la cascade sont activés quel que soit le microorganisme (bactéries Gram (+) ou champignons), d’autres protéines de cette cascade sont activées soit par les bactéries Gram (+), soit par les champignons, assurant ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 35 Symbiose et Immunité innée ainsi la spécificité de la réponse (Lemaitre et al., 1996 ; Levashina et al., 1999 ; Ligoxygakis et al., 2002a ; Robertson et al., 2003 ; Kambris et al., 2006). La liaison Spätzle-Toll induit la dimérisation du récepteur et la formation d’un complexe récepteur-adaptateur composé des protéines dMyD88, Tube et de la protéine kinase Pelle (Horng et Medzhitov, 2001 ; Sun et al., 2002). La transduction du signal se poursuit par la phosphorylation de l’inhibiteur Cactus, un analogue de la protéine I-κB (“Inhibitor of NF-κB”) des mammifères, par des intermédiaires encore non caractérisés. Cette phosphorylation est suivie par la dégradation de l’inhibiteur par le protéasome (Figure 5), la libération et la translocation nucléaire du facteur de transcription de la famille NF-κB : DIF (“Dorsal related Immune Factor”). Une fois dans le noyau, DIF assure la transcription des gènes codant certains peptides antimicrobiens, ainsi que d’autres gènes de la réponse immunitaire (De Gregorio et al., 2002a). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 36 Symbiose et Immunité innée Figure 5 : La reconnaissance des microorganismes et la transduction des signaux par les voies Toll et Imd chez la drosophile. La présence de bactéries Gram (+) ou de champignons induit une cascade de protéases à sérine aboutissant au clivage de la protéine Spätzle qui active ensuite le récepteur Toll. Cette activation entraîne la libération du facteur de transcription DIF via la dégradation de la protéine Cactus. La présence de bactéries Gram (-) entraîne l’activation de la voie IMD par les PGRP-LC et -LE et la libération du domaine Rel du facteur de transcription Relish. Il existe un sous-embranchement de la voie Imd qui la relie à la voie des Jun kinase (JNK). d, drosophile ; DIF, “Dorsal-related Immunity Factor” ; DREDD, “Death-related ced-3/Nedd2-like” ; FADD, “Fas-Associated DeathDomain-containing protein” ; GNBP, Gram-Negative bacteria-Binding Protein” ; IKK, “Inhibitor κB Kinase” ; IMD, “Immune Deficiency” ; MyD88, “Myeloid Differentiation Factor 88” ; PGN, Peptidoglycane ; PGRP, “PeptidoGlycan Recognition Protein” ; TAK, “Transforming growth factor β Activated Kinase” ; Ubc, “Ubiquitin-conjugating enzyme” ; Uev1A, “Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1 isoform A”. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 37 Symbiose et Immunité innée 2.2.1.2 La voie Imd La seconde voie de signalisation impliquée dans la synthèse des peptides antimicrobiens a été identifiée lors de l’étude du phénotype imd caractérisé par une diminution de l’inductibilité des peptides après une infection par des bactéries Gram (-) (Lemaitre et al., 1995). L’activation de la voie Imd implique la reconnaissance directe (contrairement à la voie Toll) du peptidoglycane (PGN) bactérien par le récepteur membranaire de cette voie, le PGRP-LC (Figure 5). La voie de signalisation aboutissant à la libération du facteur de transcription n’est pas encore parfaitement caractérisée, mais elle impliquerait un complexe comprenant les protéines Imd, dFADD et la caspase DREDD (Leulier et al., 2000 ; Leulier et al., 2002). Ce complexe serait responsable de l’activation ubiquitine-dépendante (dUbc13/dUev1A) d’une cascade de kinases incluant la protéine dTAK1 et le complexe IKK (Wang et al., 2001 ; Zhou et al., 2005). Cette cascade aboutit à la phosphorylation du facteur de transcription Relish. Une fois phosphorylé, Relish serait clivé, soit directement par la caspase DREDD, soit par une autre caspase activée par cette protéine (Stoven et al., 2000). La dissociation des domaines Iκ-B-like et Rel (domaine de liaison à l’ADN) permet la translocation nucléaire du facteur de transcription et l’induction de peptides antibactériens et de gènes de la réponse immunitaire (De Gregorio et al., 2002a). Il existe également d’autres sous-embranchements de la voie Imd permettant notamment d’activer les mécanismes de l’apoptose (Georgel et al., 2001) et la voie des JNK (“Jun N-terminal kinase”) impliquée dans le réarrangement du cytosquelette et la réparation des tissus (Boutros et al., 2002 ; Ramet et al., 2002a). Les voies décrites ci-dessus récapitulent les étapes générales des voies Toll et Imd. Toutefois, il est intéressant de signaler qu’il existe également des interactions et des recouvrements entre ces dernières, puisque certains gènes impliqués dans une voie sont régulés par l’autre, et qu’il existe des gènes co-régulés par les deux voies. La distinction entre les bactéries Gram (+)/champignons et les bactéries Gram (-) au niveau de l’activation des voies Toll et Imd est donc parfois trop restrictive, et la réponse à certains pathogènes peut impliquer une activation simultanée des deux voies (De Gregorio et al., 2002a). Par ailleurs, d’autres facteurs seraient susceptibles d’activer les voies Toll et Imd. Par exemple, tous les peptides antimicrobiens sont faiblement induits lors d’une blessure stérile, probablement pour prévenir une infection par un microorganisme opportuniste qui pourrait profiter de la rupture des barrières physiques. Cette induction préventive suggère l’existence de signaux indépendants des micro- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 38 Symbiose et Immunité innée organismes, probablement liés à l’altération des tissus, qui pourraient activer les voies Toll et/ou Imd ou activer d’autres voies de signalisation encore non identifiées (Boutros et al., 2002 ; De Gregorio et al., 2002a). 2.2.2 Les épithéliums : la réponse locale Bien que la synthèse des peptides antimicrobiens par le corps gras ait largement été décrite, très peu d’études se sont consacrées à la synthèse de ces peptides par les épithéliums. En effet, les études de la réponse immunitaire ont principalement été réalisées par l’introduction des microorganismes directement dans l’hémocoele (piqûre septique) et ne font donc pas intervenir les premières défenses assurées par les épithéliums. Pourtant, hormis quelques souches bactériennes dont certaines espèces d’Erwinia, la plupart des bactéries n’induisent pas de réponse systémique lors d’infections naturelles par ingestion (Basset et al., 2000). Il semble donc que la réponse locale constitue un mécanisme de défense efficace pour lutter contre la majorité des infections naturelles chez les insectes. Chez la drosophile, les épithéliums en contact avec l’environnement externe (trachée, intestin, tractus génital) sont capables d’exprimer des peptides antimicrobiens en réponse à une infection naturelle (Tzou et al., 2000). Toutefois, contrairement à l’induction observée dans le corps gras, l’induction des peptides dans ces épithéliums dépendrait uniquement de la voie Imd, et ce, même dans le cas de la drosomycine, pourtant sous le contrôle de la voie Toll dans la réponse systémique (Ferrandon et al., 1998). D’autre part, puisque la réponse épithéliale n’est pas induite par l’injection de bactéries dans la cavité abdominale, elle pourrait impliquer des mécanismes d’activation tissu-spécifiques, probablement via des récepteurs spécifiques des cellules épithéliales (Tzou et al., 2000). Toutefois, l’équipe de B. Lemaitre a récemment mis en évidence le rôle du PGRP-LC dans l’activation de la réponse locale de l’intestin (ZaidmanRemy et al., 2006). Par ailleurs, un autre membre de la famille des PGRP impliqué dans l’activation de la voie Imd, le PGRP-LE, pourrait être impliqué dans la réponse de la trachée, en synergie avec le PGRP-LC (Takehana et al., 2004). Il semblerait donc que les mêmes récepteurs soient impliqués dans les réponses systémique et locale. Tzou et al. (2000) ont également mis en évidence l’expression constitutive de peptides dans certains épithéliums, indépendamment des gènes Toll ou imd. Cette expression ne serait donc pas sous le contrôle des facteurs de transcription NF-κB, mais d’autres facteurs. Ryu et al. (2004) ont ainsi mis en évidence le rôle du gène homéotique Caudal dans l’expression constitutive de deux peptides antimicrobiens : la cécropine ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 39 Symbiose et Immunité innée dans le canal éjaculatoire et la drosomycine dans les glandes salivaires. Toutefois, dans le tractus génital femelle, l’expression de la drosomycine est indépendante de Caudal, suggérant l’existence d’autres voies de signalisation. 2.2.3 Reconnaissance des microorganismes Bien que la notion de “non spécificité” de la réponse immunitaire soit largement répandue, la majorité des mécanismes immunitaires des insectes sont non constitutifs, et le spectre de peptides antimicrobiens synthétisés diffère selon l’agent pathogène. Il existe donc des éléments fonctionnels qui permettent non seulement de détecter la présence des microorganismes, mais également de les différencier pour activer les réponses adaptées à la nature des microorganismes détectés. Cette fonction serait assurée par un ensemble de récepteurs (PRR, “Pattern-Recognition Receptors”) capables de reconnaître certaines composantes spécifiques des microorganismes (PAMP, “Pathogen Associated Molecular Patterns”) (Janeway, 1989). De nombreux facteurs pouvant jouer le rôle de PRR ont été identifiés chez les insectes : l’hémoline, les “Thiolester containing proteins” (TEP), les lectines, les “β-1,3-Glucan Recognition Proteins” (βGRP), les “Gram-Negative bacteria-Binding Proteins” (GNBP) et les PGRP. Les PRR peuvent jouer le rôle d’opsonines dans l’activation de la réponse cellulaire comme l’hémoline chez les lépidoptères (Kanost et al., 2004) ou les TEP chez l’anophèle (Levashina, 2004), et probablement aussi la drosophile (De Gregorio et al., 2001). Les PRR jouent également un rôle important dans l’activation de la réponse humorale. Chez les lépidoptères, les lectines et les βGRP interviennent dans l’activation de la réaction de mélanisation en réponse aux LipoPolySaccharides (LPS) des bactéries Gram (-), et aux β-1,3-glucanes des champignons, respectivement (Kanost et al., 2004). Les rôles des deux derniers types de récepteurs, les GNBP et surtout les PGRP, ont été relativement bien décrits chez la drosophile. 2.2.3.1 Les GNBP La famille des GNBP, spécifique des invertébrés et proche de la famille des βGRP, a été initialement identifiée chez Bombyx mori pour sa capacité de liaison aux bactéries Gram (-) (Lee et al., 1996). Toutefois, il semblerait que les protéines de cette famille soient capables de se lier à différents composants. Chez la drosophile, trois gènes GNBP et deux gènes GNBP-like ont été identifiés. Un de ces gènes, le GNBP1 (osiris), avait été décrit dans ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 40 Symbiose et Immunité innée des cellules immunocompétentes comme un élément de reconnaissance des LPS des bactéries Gram (-) et des β-1,3-glucanes des champignons (Kim et al., 2000). Pourtant, Pili-Floury et al. (2004) ont ensuite montré in vivo, en utilisant le RNAi (ARN interférence), que la protéine GNBP1 était en fait impliquée dans la reconnaissance des bactéries Gram (+) et l’activation de la voie Toll (Figure 5). En ce qui concerne les autres GNBP(-like), seul le GNBP3 a été étudié pour son rôle dans l’activation de la voie Toll par les champignons (Ferrandon, 2006). Les GNBP constituent donc une famille encore relativement méconnue, mais les résultats apparemment contradictoires des études évoquées précédemment soulignent la complexité des interactions PRR/PAMP et l’implication probable des GNBP dans la reconnaissance de différentes classes de microorganismes. 2.2.3.2 Les PGRP Les PGRP, comme leur nom l’indique, sont des protéines de reconnaissance des éléments composant le peptidoglycane (PGN) bactérien. Largement étudiée depuis la caractérisation d’un PGRP chez B. mori en 1996 par Yoshida et al. (1996), la famille des PGRP est représentée aussi bien chez les invertébrés que chez les vertébrés, et elle comporte une grande variété d’isoformes et de fonctions (Dziarski, 2004). Certains PGRP sont impliqués dans l’activation de la cascade de mélanisation et/ou des voies de synthèse des peptides antimicrobiens (Michel et al., 2001 ; Takehana et al., 2002 ; Takehana et al., 2004). D’autres assurent la régulation de ces voies de synthèse (Bischoff et al., 2006 ; Zaidman-Remy et al., 2006). Enfin, certains PGRP auraient un rôle dans la phagocytose (Ramet et al., 2002b ; Garver et al., 2006). Chez les mammifères, les PGRP peuvent posséder des activités bactéricides ou bactériostatiques (Liu et al., 2000 ; Tydell et al., 2006). Les protéines de la famille PGRP se caractérisent par la présence d’un domaine très conservé de 160-165 acides aminés qui présente une homologie avec le lysozyme du bactériophage T7, une N-acétyl-muramyl-Lalanine amidase (Kang et al., 1998). Toutefois, si tous les PGRP ont apparemment conservé leur capacité de liaison au PGN, ce n’est pas le cas pour leur activité amidasique. De plus, lorsqu’elle est conservée, l’activité amidasique des PGRP est moins forte que celle du lysozyme phagique (Yoshida et al., 1996 ; Kang et al., 1998 ; Michel et al., 2001 ; Kim et al., 2003 ; Mellroth et al., 2003 ; Wang et al., 2003). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 41 Symbiose et Immunité innée Bien que la question de la reconnaissance des bactéries Gram (-) par les PGRP via les LPS soit restée longtemps en suspens du fait de la contamination des préparations commerciales de LPS par du PGN, il est aujourd’hui admis que la reconnaissance des bactéries se fait plutôt au niveau de leur PGN (Leulier et al., 2003). En effet, le PGN des bactéries Gram (+) diffère de celui des bactéries Gram (-) et de celui de quelques espèces de Bacillus au niveau du troisième acide aminé du pont peptidique. Il s’agit d’une lysine pour les premières, et d’un acide meso-diaminopimélique (DAP) pour les autres (Leulier et al., 2003). On distingue de ce fait deux types de PGN, le PGN de type Lysine et le PGN de type DAP (Figure 6). Ainsi, la réponse immunitaire dirigée contre les bactéries Gram (+) est activée par les PGRP présentant une affinité pour le PGN de type Lysine, alors que ceux ayant une affinité pour le PGN de type DAP activeront la réponse anti-Gram (-). Figure 6 : Structure du peptidoglycane (PGN) bactérien. Le PGN est un polymère constitué de chaînes polysaccharidiques composées d’une alternance de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique, reliées par des ponts peptidiques dont l’unité de base est un tétrapeptide (cadre pointillé). Dans le PGN des bactéries Gram (-) et des bactéries Gram (+) du genre Bacillus, le tétrapeptide comporte en troisième position un acide meso-diaminopimélique (PGN de type DAP, à gauche). Les tétrapeptides sont reliés entre eux par une liaison directe entre le résidu DAP d’une unité et le résidu terminal d’une autre. Dans le cas des bactérie Gram (+), le résidu DAP est remplacé par un résidu lysine (PGN de type Lysine, à droite) et les liaisons interpeptidiques sont assurées par des résidus variables en fonction de l’espèce bactérienne. Par exemple, le peptide de liaison du PGN de Staphylococcus aureus (représenté à droite) comporte un chaînon de cinq résidus glycine. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 42 Symbiose et Immunité innée Chez la drosophile, treize gènes, dont certains possèdent des transcrits alternatifs, codent des protéines de la famille des PGRP (Werner et al., 2000 ; Werner et al., 2003). Bien que cette famille soit très diversifiée tant par les profils d’expression des gènes, que par la distribution tissulaire des protéines, elle peut être divisée en deux sous-familles : les formes courtes (PGRP-S), sécrétées dans l’hémolymphe, et les formes longues (PGRP-L), dont certaines possèdent des domaines transmembranaires (PGRP-LA,-LC, -LD, -LF). Cette première classification basée sur la structure des transcrits reste encore très utilisée. Toutefois, avec les progrès réalisés ces trois dernières années, il est également possible de classer les protéines de cette famille en fonction de leur activité, PGRP récepteurs ou PGRP enzymatiques. 2.2.3.2.1 Les PGRP récepteurs, activateurs de la réponse immunitaire C’est à partir de l’année 2001 que les résultats des cribles génétiques de mutants de drosophile ont permis d’attribuer le rôle de récepteurs à certains membres de la famille des PGRP. Le PGRP-SA (semmelweis) est le premier PGRP caractérisé chez la drosophile pour son implication dans la résistance aux bactéries Gram (+) (Michel et al., 2001). La mutation de ce gène, qui n’affectait ni la réponse aux champignons ni la réponse aux bactéries Gram (-), avait mis en évidence, non seulement le rôle de ce PGRP, mais également la spécificité de reconnaissance des microorganismes par les PGRP. Il a ensuite été montré que la protéine PGRP-SA active la voie Toll en interaction avec la protéine GNBP1 qui hydrolyserait le PGN et faciliterait ainsi sa reconnaissance par le PGRP-SA (Pili-Floury et al., 2004 ; Filipe et al., 2005). Toutefois, Bischoff et al. (2004) ont montré que la voie Toll était activée par certaines bactéries Gram (+) indépendamment du complexe PGRP-SA/GNBP1. L’implication du PGRP-SD dans la réponse à ces bactéries a alors été mise en évidence, attribuant à un autre PGRP le rôle de récepteur. Si les PGRP-SA et -SD sont des protéines sécrétées dans l’hémolymphe et induites par une infection bactérienne Gram (+), le PGRP-LC, en revanche, est une protéine transmembranaire constitutive. Ce dernier est en fait le récepteur de la voie Imd impliquée dans la réponse aux infections bactériennes Gram (-) (Choe et al., 2002 ; Gottar et al., 2002 ; Choe et al., 2005) (Figure 4). Le gène PGRP-LC présente également la particularité de posséder trois transcrits alternatifs dont deux, PGRP-LCx et -LCa, ont été impliqués dans la réponse aux bactéries Gram (-). Ces ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 43 Symbiose et Immunité innée transcrits présentent des domaines intracellulaire et transmembranaire communs mais un domaine PGRP extracellulaire variable. Ceci permet d’assurer une variabilité supplémentaire dans les mécanismes de reconnaissance du PGN (Werner et al., 2003 ; Chang et al., 2005). Parallèlement à son rôle dans l’activation de la voie Imd, le PGRP-LC pourrait également intervenir dans la phagocytose des bactéries Gram (-) (Ramet et al., 2002b). Toutefois, des résultats obtenus in vivo suggèrent que la phagocytose des bactéries Gram (-) impliquerait plutôt d’autres récepteurs, notamment le PGRP-SA (Garver et al., 2006), ce qui pourrait remettre en cause les résultats obtenus en culture cellulaire par Ramet et al. (2002). La reconnaissance du PGN du type DAP des bactéries Gram (-) fait également intervenir une autre protéine exprimée constitutivement : le PGRP-LE (Takehana et al., 2002 ; Takehana et al., 2004 ; Kaneko et al., 2006). Bien que la protéine ait été initialement prédite intracellulaire sur la base de la séquence nucléotidique (Werner et al., 2000), celle-ci peut être détectée dans l’hémolymphe et serait donc sécrétée par un processus encore non élucidé (Takehana et al., 2004). De plus, Takehana et al. (2004) ont montré que ce PGRP agit à la fois en amont et en parallèle du PGRP-LC, dans l’activation de la voie Imd. Le mode d’action du PGRP-LE, en relation avec sa localisation cellulaire, a alors été caractérisé par l’étude de Kaneko et al. (2006). La protéine PGRP-LE peut être soit intracellulaire, soit extracellulaire, sous une forme tronquée comportant uniquement le domaine PGRP. Ainsi, le PGRP-LE pourrait fonctionner, parallèlement au PGRP-LC, comme un récepteur intracellulaire du PGN monomérique, et en amont du PGRP-LC, en se liant au PGN de l’hémolymphe et en facilitant sa liaison au PGRP-LC (Kaneko et al., 2006). Le PGRP-LE pourrait également jouer un rôle dans l’activation de la cascade de mélanisation en réponse à une infection par E. coli (Takehana et al., 2004). 2.2.3.2.2 Les PGRP enzymatiques, régulateurs de la réponse immunitaire Compte tenu de l’homologie de séquence entre les PGRP et les N-acétylmuramyl-L-alanine amidases, l’activité enzymatique des premiers PGRP identifiés chez les insectes a bien entendu été testée. Ces tests se sont révélés négatifs jusqu’aux travaux de Mellroth et al. (2003) qui ont montré que le PGRP-SC1 clive les peptidoglycanes bactériens (Figure 7) avec une efficacité variable selon l’origine bactérienne. Toutefois, le PGRP-SC1 ne présente pas d’activité bactéricide in vitro et ne pourrait donc pas cliver le PGN de la paroi bactérienne, à moins d’une synergie in vivo avec une autre ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 44 Symbiose et Immunité innée protéine immunitaire. Sachant que le clivage du PGN diminue son pouvoir immunogène, les auteurs ont suggéré que le PGRP-SC1 serait impliqué dans le contrôle de l’infection bactérienne, plutôt que dans l’élimination des bactéries. Figure 7 : Sites de coupure du peptidoglycane (PGN) bactérien par quelques enzymes. Les protéines de la famille PGRP présentent une homologie avec le lysozyme du bactériophage T7, une N-acétyl-muramyl-L-alanine amidase. Contrairement au lysozyme du blanc d’œuf qui clive la chaîne polysaccharidique (liaison osidique entre le NAM et NAG), le lysozyme phagique et certains membres de la famille des PGRP clivent le PGN au niveau de la liaison entre le pont peptidique et le NAM. L’activité des PGRP varie en fonction du type de PGN (lysine ou DAP) et de l’espèce bactérienne. A titre d’exemple, le PGRP-LB serait 100 à 1000 fois plus actif sur le PGN de type DAP que sur le PGN de type Lysine (Zaidman-Remy et al., 2006), alors que les différences d’activité observées sur ces deux types de PGN sont relativement faibles dans le cas du PGRP-SC1 (Mellroth et al., 2003). L’analyse de la séquence du PGRP-SC1 montre qu’il a conservé, contrairement aux PGRP-SA et -LCx, quatre des cinq résidus du site actif du lysozyme du bactériophage T7. Au niveau du cinquième résidu, il présente une mutation d’une lysine en thréonine qui permet de conserver une activité, toutefois réduite par rapport à l’activité du lysozyme phagique (Cheng et al., 1994). C’est donc une mutation de l’un de ces résidus qui entraîne la perte d’activité amidasique observée chez les PGRP récepteurs. Grâce à cette étude, Mellroth et al. (2003) ont mis en évidence une nouvelle classe de PGRP ayant conservé les résidus du site actif, et ont suscité ainsi un nouvel intérêt pour l’activité enzymatique potentielle des PGRP. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 45 Symbiose et Immunité innée L’importance de la conservation des cinq résidus dans l’activité amidasique a ensuite été confirmée au niveau structural, grâce à la cristallisation du PGRP-LB (Kim et al., 2003). L’obtention de la structure de ce PGRP a confirmé l’homologie des PGRP avec le lysozyme phagique au niveau du site de liaison au PGN, et a révélé, sur la face opposée à ce site de liaison, la présence d’un segment N-terminal spécifique des PGRP. Compte tenu de la conformation des PGRP au niveau de ce segment, cette zone pourrait constituer un site de liaison protéique qui conférerait aux PGRP leur(s) fonction(s) supplémentaire(s), comme l’activation de la synthèse des peptides antimicrobiens (Kim et al., 2003). Concernant le rôle in vivo de ces PGRP enzymatiques, deux études ont permis de confirmer la fonction immuno-modulatrice des PGRP amidasiques, PGRP-SC1/2 et -LB (Bischoff et al., 2006 ; Zaidman-Remy et al., 2006). Ces deux études ont mis en évidence une suractivation spécifique de la voie Imd après une infection bactérienne, locale ou systémique, en l’absence des PGRP-SC1/2 et -LB par rapport aux témoins. Elles ont également montré que la régulation n’était pas due à l’élimination des bactéries, confirmant ainsi l’absence d’activité bactéricide observée in vitro, mais à la diminution de l’immunogénicité du PGN dégradé. Les PGRP-SC1/2 et -LB sont principalement exprimés dans l’intestin, où l’épithélium est en contact permanent avec la flore bactérienne. Ils pourraient donc limiter l’activation de la réponse immunitaire de l’hôte. Sur la base de leurs derniers résultats, Zaidman-Remy et al. (2006) ont proposé un modèle pour expliquer le rôle du PGRP-LB dans la régulation de la réponse locale de l’intestin. L’activation de la voie Imd serait réalisée en fonction de la croissance de la population bactérienne de l’intestin via la détection du PGN libéré par les bactéries en division (Figure 8). Il est intéressant de mentionner ici que ce modèle, qui est décrit pour expliquer le maintien de la flore intestinale, serait potentiellement adapté à la régulation et au maintien des bactéries symbiotiques d’insectes. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 46 Symbiose et Immunité innée Figure 8 : Modèle de l’activation de la voie Imd par les bactéries Gram (-). Lorsque les bactéries se divisent, le PGN libéré est dégradé par le PGRP-LB pour bloquer l’activation de la voie Imd par le PGRP-LC (1). En cas d’infection, la quantité de PGN libérée lors de la multiplication bactérienne dépasse les capacités du PGRP-LB et le PGN se lie au PGRP-LC (2). L’activation de la voie Imd entraîne l’induction de la synthèse des peptides antibactériens pour éliminer les bactéries (3), et l’induction du PGRP-LB pour éliminer le PGN libre (1) et ainsi terminer la réaction immunitaire. Dans l’intestin, le PGRP-LB jouerait un rôle important dans la prévention de l’activation des réponses immunitaires locale et systémique par des bactéries de la flore commensale. D’après Zaidman-Remy et al. (2006). Une autre étude par mutagenèse a mis en évidence le rôle de l’activité amidasique du gène PGRP-SC1a dans la phagocytose de Staphylococcus aureus (Garver et al., 2006). Cette étude montre également la sensibilité des mutants à une infection par S. aureus (>80 % de mortalité en 24 heures) et leur incapacité à activer la voie Toll, ce qui est en contradiction avec les résultats de Bischoff et al. (2006). L’implication du PGRP-SC1 dans l’activation de la voie Toll reste donc controversée et il serait intéressant de déterminer si les différences observées sont liées à l’approche technique (mutation vs RNAi), à la présence de la protéine PGRP-SC2 dans l’étude de Garver et al. (2006) ou à d’autres différences dans les souches utilisées ou dans les techniques d’infection et de détection. Pour conclure ce paragraphe sur les PGRP enzymatiques, il faut signaler l’existence d’une autre activité enzymatique, l’activité L,D-carboxypeptidase, mise en évidence pour la protéine PGRP-SA ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 47 Symbiose et Immunité innée (Figure 7) par Chang et al. (2004). La protéine PGRP-SA peut se lier aux deux types de PGN, mais la liaison au PGN de type lysine entraîne l’activation de la voie Toll alors que la liaison au PGN de type DAP entraîne la dégradation de ce PGN. La protéine PGRP-SA assure donc des fonctions différentes en fonction du type de PGN auquel elle se lie, ajoutant ainsi un autre degré dans la diversité et la complexité des fonctions assurées par les PGRP. Les protéines PGRP, qu’il s’agisse des PGRP récepteurs ou des PGRP enzymatiques, permettent à la drosophile de différencier les microorganismes et d’induire une réponse immunitaire adaptée, permettant ainsi l’élimination des pathogènes tout en limitant les effets létaux occasionnés par une suractivation de la réponse immunitaire (Bischoff et al., 2006). Les nombreuses données apportées par les études structurales devraient permettre de caractériser les interactions PGN-PGRP et d’éclairer les processus de reconnaissance et de régulation des voies immunitaires. 2.2.4 Elimination des microorganismes par les peptides antimicrobiens La production de peptides antimicrobiens est un moyen de défense très conservé depuis les microorganismes jusqu’aux plantes et aux mammifères (Bulet et al., 2004). Chez les insectes, la synthèse de ces peptides au niveau des réponses locale et systémique constitue un moyen rapide et efficace pour l’élimination des microorganismes. Cette efficacité est liée au large spectre de peptides exprimés par l’hôte, à la forte concentration des peptides sécrétés dans l’hémolymphe (jusqu’à 300 µM), mais également à la spécificité de la réponse engendrée par les voies Toll et Imd (Hoffmann et Reichhart, 2002). Les peptides antimicrobiens sont de petites protéines (moins de 100 acides aminés) dont l’activité requiert une charge globale cationique à pH physiologique et une proportion suffisante de résidus hydrophobes (>50%), pour permettre une interaction avec la membrane anionique des microorganismes. Une fois l’interaction peptide-membrane établie, deux mécanismes d’action ont été décrits jusqu’à présent : (i) la création de pores qui déstabilisent la membrane et entraînent la mort du microorganisme, (ii) la translocation cytoplasmique du peptide et son interaction avec une cible intracellulaire (Powers et Hancock, 2003 ; Ganz, 2004). Les peptides antimicrobiens peuvent présenter des propriétés bactéricides et/ou fongicides avec un spectre d’action plus ou moins large. Par ailleurs, il est souvent difficile d’attribuer une activité globale à un peptide. Son activité peut en effet varier en fonction de sa concentration et de la physiologie du microorganisme. A titre d’exemples, les défensines sont ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 48 Symbiose et Immunité innée moins efficaces vis-à-vis des bactéries métaboliquement inactives (manque de nutriments, inhibiteurs métaboliques) que vis-à-vis des bactéries actives (Ganz, 2004) ; la coléoptéricine A d’Allomyrina dichotoma présente une activité bactéricide contre S. aureus et B. subtilis mais inhibe la division d’E. coli (Sagisaka et al., 2001) ; la cécropine A peut induire chez la bactérie, à des concentrations sub-létales, des changements transcriptionnels (Hong et al., 2003). L’activité d’un peptide antimicrobien nécessite donc souvent d’être évaluée au cas par cas. Les peptides antimicrobiens actifs sont généralement obtenus suite au clivage in vivo d’un précurseur comportant un peptide signal et parfois un propeptide (motifs R-x-(K/R)-R) en amont ou en aval du peptide mature (Hosaka et al., 1991 ; Lazzaro et Clark, 2003). Au niveau structural, ces peptides sont regroupés en familles : les peptides à hélice-α comme la cécropine ou la sarcotoxine, les peptides de la famille des défensines stabilisés par des ponts disulfures, et les peptides linéaires sans structure secondaire caractéristique du fait de leur richesse en résidus proline et/ou glycine comme la drosocine, la metchnikowine ou les coléoptéricines (Powers et Hancock, 2003 ; Bulet et Stocklin, 2005). Chez la drosophile, on distingue actuellement sept types différents de peptides inductibles, d’une taille allant de 20 à 50 acides aminés et classés selon leur spectre d’activité : antibactérien Gram (+), antibactérien Gram (-) et antifongique (Tableau II). Le rôle et l’importance des différents peptides antimicrobiens dans la réponse immunitaire ont été mis en évidence en exprimant constitutivement, par transgenèse, ces différents peptides dans des double-mutants Imd-Spätzle, où les deux voies de biosynthèse des peptides antimicrobiens sont non fonctionnelles. La défensine et la drosomycine sont les principaux peptides assurant la défense, respectivement, contre les bactéries Gram (+) et les champignons, alors que dans le cas des bactéries Gram (-), aucun peptide n’est capable, à lui seul, de restaurer une résistance similaire à celle observée chez les insectes sauvages (Tzou et al., 2002). Chez les autres insectes, de nombreux peptides ont également été caractérisés avec parfois des spécificités au niveau de l’ordre, comme les lébocines décrites chez les lépidoptères, ou encore les coléoptéricines décrites chez les coléoptères. Actuellement, plus de 300 peptides différents ont été caractérisés essentiellement chez les diptères et les lépidoptères. En revanche, très peu de données sont disponibles sur d’autres ordres, notamment sur les insectes hétérométaboles comme les homoptères ou les orthoptères. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 49 Symbiose et Immunité innée Nombre de gè ne s Famille de pe ptide s antimicrobie ns Principale activité biologique e n conce ntration physiologique Par gé nome Diptéricine Antibactérien, Gram (-) 2 Conce ntration dans l’hé molymphe (ré ponse systé mique ) Exprimé s 2 Epithé lium e xprimant dive rs pe ptide s antimicrobie ns 0,5 µM mésentéron calyx, o viducte, trachée calyx, oviducte, spermathèque, réceptacle séminal spermathèque, réceptacle séminal, glandes labiales Attacine Antibactérien, Gram (-) 4 4 Drosocine Antibactérien, Gram (-) 1 1 40 µM Cécropine Antibactérien, Gram (-) 4 4 50 µM Défensine Antibactérien, Gram (+) 1 1 1 µM Metchnikowine Antifongique 1 1 40 µM glandes labiales 100 µM spermathèque, réceptacle séminal, trachée, glandes salivaires et labiales Drosomycine Antifongique 7 Tableau II : Peptides antimicrobiens D’après Hoffmann et Reichhart (2002). 2 inductibles mésentéron chez la drosophile. En conclusion, l’élimination des microorganismes chez les invertébrés est principalement assurée par l’activité des peptides antimicrobiens, que ce soit dans l’immunité systémique ou dans l’immunité locale. Toutefois, il existe également d’autres molécules aux propriétés antimicrobiennes, comme les lysozymes. 2.3 La réaction de mélanisation La mélanisation (ou cascade prophénoloxydase (proPO)) est une réaction de défense spécifique des invertébrés qui aboutit à la synthèse de mélanine au niveau d’une blessure, ou à la surface de corps étrangers comme des parasites ou des microorganismes. Cette synthèse, activée par la présence de tissus endommagés ou de corps étrangers, est assurée par la phénoloxydase (PO) qui oxyde la tyrosine et d’autres groupements phénols pour former des quinones. Ces quinones vont ensuite spontanément polymériser pour former la mélanine. Parallèlement à la synthèse de mélanine, la réaction produit des intermédiaires cytotoxiques pour les microorganismes mais également pour l’hôte, ce qui impose une régulation efficace du système d’activation de la proPO. La régulation de la PO est assurée par une cascade de protéases à sérine aboutissant au clivage de la proPO par une (ou plusieurs) “ProPhenoloxydase Activating Enzyme(s)” (PPAE) (Cerenius et Soderhall, 2004). En ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 50 Symbiose et Immunité innée l’absence d’infection, ces enzymes, comme la PO, sont présentes sous forme inactive, ce qui permet de limiter la synthèse de mélanine. Toutefois, ces enzymes sont également régulées par des inhibiteurs de protéases de la famille des serpines (inhibiteurs de protéases à sérine) qui jouent un rôle important dans le contrôle et la terminaison de la réaction pour éviter une mélanisation excessive (Zhu et al., 2003 ; Cerenius et Soderhall, 2004 ; Tong et Kanost, 2005). Différents modèles d’activation de la proPO ont été décrits chez les insectes. Chez Manduca sexta, les études menées par l’équipe de M. Kanost (Kanost et al., 2004), ont montré que l’hydrolyse de la proPO implique un complexe protéique comprenant trois “Prophenol Activating Proteinases” (PAP) et des cofacteurs de la famille des Homologues des Sérines Protéases (SPH), dépourvus d’activité enzymatique. Un complexe similaire serait également impliqué chez le coléoptère Holotrichia diomphalia (Lee et al., 1998). Chez M. sexta, ces cofacteurs pourraient se lier aux immulectines, des protéines de reconnaissance, et aux PPAE pour former un complexe à la surface des microorganismes. En ce qui concerne les éventuelles protéases à sérine et serpines impliquées dans l’activation et la régulation de la cascade, 22 ADNc codant des protéases nommées “hemolymph proteinases” (HP) et cinq gènes codant des serpines ont été identifiés. Si l’implication et le rôle des diverses HP nécessitent encore d’être caractérisés, l’inhibition de la voie proPO par les serpines, au niveau des PPAE ou d’autres protéases encore non identifiées, a clairement été démontrée (Zhu et al., 2003 ; Tong et Kanost, 2005). Chez H. diomphalia, il existe deux proPO dont l’activation est assurée en deux étapes de protéolyse impliquant trois “ProPhenoloxydase Activating Factors” (PPAF) (Kim et al., 2002). Chez la drosophile, trois gènes, dont deux sont exprimés dans les cellules à cristaux, codent la proPO. Ces cellules libèrent facilement la proPO inactive dans l’hémolymphe (Meister, 2004). Le contrôle de la cascade proPO est assuré par la serpine Spn27A, dont la mutation se traduit par une mélanisation excessive des insectes (De Gregorio et al., 2002b ; Ligoxygakis et al., 2002b ). Compte tenu de l’interaction de la Spn27A avec les PPAE d’autres insectes, cette serpine assurerait l’inhibition d’une PPAE encore non identifiée chez la drosophile (De Gregorio et al., 2002b). Lors d’une infection, la serpine Spn27A est éliminée de l’hémolymphe, suite à l’activation de la voie Toll, par une protéine synthétisée de novo (Ligoxygakis et al., 2002b). Cette élimination serait due à la formation d’un complexe PPAE-Spn27A instable, rapidement éliminé de l’hémolymphe (Ligoxygakis et al., 2002b). Il est donc probable que l’activation de la voie Toll augmente le taux de PPAE active dans ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 51 Symbiose et Immunité innée l’hémolymphe, ce qui entraîne l’élimination de la Spn27A. L’excès de PPAE active alors la prophénoloxydase. La fin de la réaction serait assurée par la protéine Spn27A qui réapparaît dans l’hémolymphe 17 heures après l’infection (Ligoxygakis et al., 2002b), suite à l’induction du gène par la voie Toll (De Gregorio et al., 2002b). La Spn27A interviendrait également dans la limitation de la réaction à une zone proche du microorganisme (De Gregorio et al., 2002b). 2.4 Conclusion La réponse immunitaire des insectes implique de nombreuses réactions cellulaires et humorales, qui, par leurs interactions et leur complémentarité, assurent une réponse efficace contre les agents infectieux. Bien que ces réactions soient du domaine de l’immunité innée, les insectes sont capables de contrôler et d’adapter les réactions immunitaires en fonction du microorganisme grâce à la mise en place de systèmes de régulations complexes. La caractérisation des mécanismes de reconnaissance a notamment souligné l’importance des familles multigéniques et l’intérêt de l’épissage alternatif pour assurer la reconnaissance des agents infectieux et activer/réguler une réponse adaptée. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 52 Matériel et Méthodes ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 53 Matériel et Méthodes 1 Insectes : élevage et matériel biologique 1.1 Le charançon Sitophilus zeamais 1.1.1 Elevage Les charançons Sitophilus zeamais de la souche Lagoa (Açores) sont élevés au laboratoire sur grains de blé à 27,5°C et à 70% d’humidité relative (hr) (Laviolette et Nardon, 1963). La souche aposymbiotique a été obtenue par traitement de la souche symbiotique un mois à 35°C et à 90% hr (Nardon, 1973). Elle est viable, fertile et élevée dans les mêmes conditions que la souche symbiotique. Afin d’obtenir des cohortes d’individus relativement synchrones, les charançons sont mis à pondre sur de nouveaux grains de blé tous les deux jours. 1.1.2 Matériel biologique 1.1.2.1 Larves du quatrième stade et nymphes Les charançons se développant à l’intérieur des grains de blé, les larves de quatrième stade et les nymphes sont récoltées par dissection des grains de blé, respectivement 18 et 22 jours après la ponte pour les insectes symbiotiques et 21 et 25 jours pour les insectes aposymbiotiques. 1.1.2.2 Embryons Les embryons ne pouvant être récoltés à partir des grains de blé, de jeunes adultes (deux à quatre semaines) sont conservés deux à quatre heures sur des grains d’amidon pour que les femelles y déposent leurs œufs. Les embryons sont récoltés après trois jours par dissolution à l’eau des grains d’amidon sur un tamis fin. 1.1.2.3 Ovocytes et bactériomes larvaires Les ovocytes et les bactériomes larvaires sont obtenus par dissection respectivement des femelles adultes et des larves du quatrième stade dans un tampon isoosmotique A (25 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 250 mM saccharose, 35 mM Tris-HCl, pH7,5) sous la loupe binoculaire. Les échantillons sont ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 54 Matériel et Méthodes centrifugés (10 000 g, 1 min) et les organes du culot sont utilisés immédiatement ou, au besoin, conservés à -80°C jusqu’à utilisation. 1.2 Le puceron Acyrthosiphon pisum 1.2.1 Élevage Les pucerons symbiotiques sont issus du clone parthénogénétique LL01 obtenu lors d’une infestation de luzerne à Lusignan en 1986. Les pucerons sont élevés sur des plants de fèves dans des cages en plexiglas. Ces cages sont maintenues en conditions contrôlées (21°C, 70% hr, photopériode de 16 h) pour obtenir des pucerons se reproduisant par parthénogenèse. Afin d’obtenir des cohortes relativement synchrones d’individus, les pucerons adultes sont mis à pondre 24 h sur plante hôte avant d’être retirés des plantes. 1.2.2 Matériel biologique Les pucerons aposymbiotiques stériles sont obtenus, pour chaque expérimentation, à partir des pucerons symbiotiques par un traitement à la rifampicine selon la procédure décrite par Rahbé et al. (1994). Les bactériocytes sont disséqués à partir de larves symbiotiques du quatrième stade dans le tampon A et sont traités comme décrit précédemment pour les bactériomes du charançon. 2 2.1 Techniques histologiques Fixation des échantillons Les larves de quatrième stade et les nymphes sont fixées immédiatement après récolte dans une solution alcoolique de Bouin dont la formule a été modifiée au laboratoire (20 ml d’éthanol 80° contenant 0,7% d’acide picrique, 5 ml d’une solution de formol neutre à 40% (addition de CaCO3 au formol commercial jusqu’à saturation et filtration), 2 ml d’acide acétique glacial et H2 O qsp 50 ml). Afin de faciliter la pénétration du fixateur dans les tissus de l’insecte, les larves et les nymphes sont piquées respectivement du coté postérieur et derrière la capsule céphalique après une première étape de fixation de 4 h pour éviter toute réaction consécutive à la piqûre. Les individus sont ensuite conservés dans le fixateur à 4°C pour une durée minimale de 36 h. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 55 Matériel et Méthodes 2.2 Double inclusion et coupe Après fixation, les individus sont lavés dans trois bains successifs de 15 min dans l’éthanol 70° puis réhydratés dans trois bains d’eau. L’excédent d’eau est éliminé à l’aide d’un papier absorbant et les individus sont inclus une première fois dans de la gélose (1,3% agar). Les blocs de gélose sont ensuite découpés et déshydratés par des bains successifs de 30 min dans l’éthanol 70° puis 95° et enfin 100°. Les blocs sont ensuite lavés par 2 bains de butan-1-ol et conservés dans le butan-1-ol à 4°C en attendant l’inclusion en paraffine. Cette étape permet ainsi de ramollir les tissus pour faciliter les coupes ultérieures. Avant la seconde inclusion, les blocs de gélose subissent d’abord un bain de 30 min à 60°C (50% butan-1-ol, 50% paraffine) puis deux bains successifs d’une heure dans la paraffine pure. A la sortie du deuxième bain, les blocs sont emparaffinés et, après refroidissement, les blocs de paraffine sont conservés à 4°C. Des sections de 5 à 10 µm sont réalisées sur les pièces de paraffine à l’aide d’un microtome. Les rubans de paraffine sont étalés sur des lames recouvertes de poly-L-lysine (POLYSINETM, Menzel-Glaser®) à l’aide d’une goutte d’eau puis l’eau est éliminée et les pièces sont fixées sur la lame sur une plaque chauffante à 60°C. Les lames peuvent ainsi être conservées plusieurs mois. 2.3 “Fluorescence In Situ Hybridization” (FISH) sur coupes histologiques La FISH est une technique d’hybridation in situ ADN/ARN (sonde/cible) très spécifique. Elle permet de détecter et de localiser sur des coupes histologiques ou des tissus en suspension la présence d’une ou plusieurs espèces bactériennes cibles à l’aide d’une sonde ADN marquée par un fluorochrome. Toutes les étapes de cette expérience sont réalisées en l’absence de RNase pour éviter toute dégradation de l’ARN cible. La première étape consiste à déparaffiner les lames dans le méthylcyclohexane (2×15 min). Les lames sont ensuite déshydratées par deux bains de 10 min dans l’éthanol 100° avant d’être séchées sous hotte. Les membranes des tissus sont perméabilisées à l’aide d’une goutte d’acide acétique 70% (v/v) déposée sur les coupes. Après séchage complet à l’étuve (45°C), les coupes sont rincées au PBS (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM Na2 HPO4 , 2 mM KH2 PO4, pH7,4) puis déshydratées à nouveau par des bains d’éthanol 100° de 2 min. Les coupes sont ensuite déprotéinisées 30 min à 37°C dans une solution d’HCl 0,01 M contenant 100 µg.ml-1 de pepsine avant de subir une nouvelle étape de rinçage-déshydratation. Les ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 56 Matériel et Méthodes lames sont enfin préhybridées 30 min à 45°C sous agitation dans le tampon H [0,7 M NaCl, 15,8 mM Tris-HCl, 4 mM EDTA, 0,1% SDS, Denhardt 10X (Ficoll 0,2% (p/v), polyvinylpyrrolidone 0,2% (p/v) ; BSA, 0,2% (p/v))] avant d’être hybridées entre lame et lamelle dans le tampon H additionné de la sonde marquée (12,5 ng.µl-1 ) pendant trois heures à 45°C dans une chambre noire humide. Les lames sont finalement lavées dans deux bains de 15 min à 45°C dans un tampon de lavage (0,9 M NaCl, 29,8 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,1% SDS) avant d’être rincées au PBS et montées entre lame et lamelle dans le VectashieldTM (Vector Laboratories) contenant 3 µg.ml-1 de DAPI (4’-6-diamidino-2-phenylindole). Les lames peuvent être conservées quelques jours à 4°C à l’obscurité. Observées sous un microscope à épifluorescence avec les filtres adaptés, les sondes marquées à la rhodamine restituent une fluorescence rouge alors que les structures nucléiques marquées au DAPI restituent une fluorescence bleue. La sonde utilisée dans cette étude est une sonde spécifique de l’ARNr 16S bactérien, dirigée contre des régions variables de l’ARNr 16S de SPE (5’-ACC-CCC-CTC-TAC-GAG-AC-3’). Cette sonde a été synthétisée et marquée en 5’ à la rhodamine par la société Eurogentec (Angers, France). 3 3.1 Infection bactérienne Culture des souches bactériennes utilisées Trois souches bactériennes ont été utilisées : Escherichia coli (TOP 10, Invitrogen), bactérie Gram-négative, souche non pathogène. Bacillus megaterium (souche 526.86, UMR 5557 CNRS UCBL), bactérie Gram-positive, souche non pathogène. 2 Pseudomonas aeruginosa (PAO1, CEA Grenoble) , bactérie Gram-négative, souche pathogène pour D. melanogaster. Toutes les souches bactériennes sont cultivées à 37°C sous agitation (250 rotations par minute) dans le milieu de culture de Luria Bertoni (LB). 2 Toutes les expérimentations avec P. aeruginosa ont été réalisées au CEA de Grenoble en collaboration avec M.O. Fauvarque. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 57 Matériel et Méthodes Afin de tester également la réponse de l’hôte vis-à-vis de son endocytobiote, un culot de bactéries a été préparé extemporanément à partir d’une centaine de bacteriomes de larves de S. zeamais disséquées dans le tampon A comme décrit précédemment. Après centrifugation, le culot de bactériomes est repris dans 400 µl de milieu LB, les bactériomes sont broyés au potter et centrifugés (7000 g, 10 min) afin d’obtenir le culot bactérien. 3.2 Infection des larves de charançon Des larves aposymbiotiques du quatrième stade extraites des grains de blé sont maintenues sur le flanc à l’aide d’une pince souple. Elles sont ensuite piquées, au niveau de l’extrémité abdominale postérieure, à l’aide d’une épingle d’entomologie stérilisée à la flamme ou d’une épingle stérilisée puis trempée dans un culot bactérien obtenu par centrifugation d’une culture d’une nuit (E. coli ou B. megaterium) ou obtenu à partir de bactériomes disséqués (endocytobiote). Dans le cas de l’infection par P. aeruginosa, la bactérie doit être en phase de croissance exponentielle pour que l’infection soit efficace. Les larves ont donc été infectées par les bactéries d’une culture de DO600nm=0,8. Des larves témoins, non piquées, sont également traitées en parallèle. Les larves sont ensuite placées dans les puits d’une microplaque de titration sous atmosphère humide, dans l’étuve à 27,5°C et à 70% hr. Après une période d’incubation de 1 à 12 h, les larves sont récoltées puis congelées à -80°C dans des microtubes Eppendorfs. 3.3 Mesure de la croissance bactérienne in larva Des lots de cinq larves ont été broyés dans 200 µl de LB et après centrifugation (300 g, 10 min) pour séparer les bactéries des débris cellulaires, le surnageant est prélevé et dilué en série (jusqu’à 10 000 fois). 100 µl de chaque dilution sont ensuite étalés sur boîtes LB-agar et, après une nuit à 37°C, le nombre de colonies est estimé à partir de la (des) dilution(s) la (les) plus appropriée(s) pour des temps d’incubation de six et vingt-quatre heures. 3.4 Infection des pucerons Des pucerons aposymbiotiques du quatrième stade larvaire sont piqués au niveau de l’abdomen à l’aide d’une épingle stérilisée puis trempée dans un culot bactérien d’E. coli obtenu par centrifugation d’une culture d’une nuit. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 58 Matériel et Méthodes Les pucerons sont ensuite placés sur les plants de fève, dans une cage de plexiglas à 21°C et à 70% d’hr, sous éclairage artificiel. Après une période d’incubation de 1 à 12 h, les pucerons sont récoltés puis congelés à -80°C dans des Eppendorfs. 4 Techniques de biologie moléculaire 4.1 Extraction des acides nucléiques et électrophorèse sur gel d’agarose 4.1.1 Extraction d’ADN génomique Les extractions d’ADN génomique (ADNg) ont été réalisées à partir de larves de quatrième stade pouvant être broyées en Eppendorf à l’aide de simples pistons. Les tissus sont homogénéisés dans 500 µl d’une solution STE (100 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA, 10 mM Tris HCl pH8). La lyse cellulaire est assurée par un traitement au SDS 0,5% (m/v) et à la protéinase K (120 ng.µl-1 ) deux heures à 55°C. Les ARN sont ensuite dégradés par traitement à la RNase A (50 ng.µl-1 ) une heure à 37°C. Les protéines sont éliminées par précipitation au cours d’une extraction phénol/chloroforme (500 µl). Après centrifugation (10 000 g, 2 min) la phase supérieure aqueuse est transférée dans un nouvel Eppendorf et l’ADN est précipité une heure à 20°C par addition de deux volumes d’éthanol 100° et de 1/10 de volume d’acétate de sodium 3 M. Le culot d’ADN obtenu après centrifugation (10 000 g, 15 min) est ensuite lavé à l’éthanol 70° (10 000 g, 5 min) et séché sous hotte. L’ADN est resuspendu dans 50 µl d’eau ultra pure (QBiogen). 4.1.2 Extraction d’ARN totaux Toutes les expérimentations menées sur les ARN seront réalisées avec des gants, des consommables exempts de RNase et avec de la verrerie et du matériel autoclavés (115°C, 20 min) ou traités 10 minutes à la soude 0,1 M et rincés à l’eau traitée au Diéthylpyrocarbonate 0,1% (v/v) (H2 O DEPC). Toutes les solutions, si elles ne sont pas fournies avec les kits utilisés, sont également traitées au DEPC 0,1% (v/v) et autoclavées (120°C, 15 min) après une incubation d’au moins six heures. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 59 Matériel et Méthodes 4.1.2.1 Extraction au Trizol® Les échantillons congelés sont broyés dans 1 ml de Trizol® Reagent (Invitrogen) à l’aide d’un homogénéiseur Dounce, puis le broyat est transféré dans des microtubes Eppendorf. Après 5 min, 200 µl de chloroforme sont ajoutés et après 3 min d’incubation, les échantillons sont centrifugés (10 000 g, 15 min). La phase aqueuse contenant les ARN est transférée dans un nouveau tube, puis les ARN sont précipités pendant 10 min en présence de 500 µl d’isopropanol. Le culot d’ARN obtenu après centrifugation (10 000 g, 10 min) est lavé à l’éthanol 70°, séché à température ambiante, puis repris dans 50 µl d’H2 O DEPC 0,1% (v/v). Les ARN sont quantifiés puis stockés à -80°C jusqu’à utilisation. 4.1.2.2 Extraction "RNeasy Mini kit" (QIAGEN) Cette technique de purification sur colonne est préférée à l’extraction Trizol lorsque l’extraction est réalisée sur de faibles quantités de tissus (ovocytes, embryons, bactériomes). Les ARN sont extraits à partir des tissus selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, les échantillons sont lysés et homogénéisés dans un volume de tampon contenant du β-mercaptoéthanol et du thiocyanate de guanidine. Après centrifugation (10 000 g, 3 min), le surnageant, additionné d’un volume d’éthanol 70°, est déposé sur une colonne RNeasy retenant spécifiquement les ARN lors de la centrifugation (10 000 g, 15 s). Les contaminants sont éliminés par lavages, et les ARN élués par 40 µl d’H2 O dépourvues de RNase (10 000 g, 1 min). 4.1.2.3 Traitement des échantillons à la DNase A l’exception des échantillons utilisés pour les Northern blot, les échantillons d’ARN sont soumis à un traitement à la DNase. La digestion de 40 µg d’acides nucléiques est réalisée pendant 10 min à 37°C en présence de 40 unités de DNAse (Promega) dans le tampon de digestion de l’enzyme (H2 O DEPC qsp 100 µl). Après digestion, l’enzyme et les sels du tampon sont éliminés par purification de l’ARN sur colonne à l’aide du kit “RNeasy mini kit” (Qiagen). 4.1.3 Electrophorèse sur gel d’agarose L’électrophorèse des produits de l’extraction est effectuée sur un gel d’agarose-TAE (Tris-HCl 1,6 mM, acétate de sodium 1,6 mM, EDTA 0,04 mM pH8, agarose 1% (p/v), bromure d’éthydium (BET) 0,5 µg.ml-1 ). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 60 Matériel et Méthodes Une fraction des échantillons (généralement 10%) est additionnée de solution de dépôt orangé G 6X (orange G 0,25% (p/v), glycérol 50% (v/v)) pour l’ADN ou de bleu de dépôt 5X (bleu de bromophénol 0,25% (p/v), xylène cyanol 0,25% (p/v), EDTA 50 mM, glycérol 50% (v/v), H2 0 DEPC) pour l’ARN, et déposée sur le gel. La migration se déroule dans le tampon TAE sous une tension de 100 volts et peut être suivie grâce à la présence des colorants. Les fragments d’ADN (ou d’ARN) sont ensuite visualisés par exposition du gel sur une table UV équipée d’une caméra. Dans le cas de l’ADN, la taille est estimée par comparaison à un marqueur de taille déposé sur le gel. Dans le cas de l’ARN, ce type d’électrophorèse en conditions non dénaturantes ne permet pas l’estimation de la taille des transcrits. Elle permet néanmoins d’estimer la qualité de l’ARN à partir des transcrits ribosomaux. 4.1.4 Dosage des échantillons Les quantités d’acides nucléiques obtenues peuvent être estimées à l’aide du gel d’électrophorèse ou dosées précisément par spectrophotométrie. Pour une estimation des quantités relatives, l’image du gel obtenue avec le logiciel Bio-CAPT peut être traitée à l’aide du logiciel Bio-1D (Bio-profil, Vilber Lourmat). Ce logiciel permet de quantifier l’ADN (ou l’ARN) à partir de l’intensité des bandes par comparaison à l’intensité des bandes du marqueur de taille ou d’un échantillon de référence de quantité connue. Pour une mesure fiable de la concentration des échantillons, les solutions sont dosées à l’aide du NanoDrop® ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware USA.). 4.2 Northern Blot Le Northern blot est une technique permettant de quantifier le taux de transcrits d’un gène à un instant et dans des conditions donnés. Cette technique est basée sur la dénaturation et la séparation des ARN sur gel d’agarose, le transfert et la fixation de ces ARN sur une membrane de nylon, et enfin sur l’hybridation d’une sonde ADN radioactive avec les transcrits du gène étudié. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 61 Matériel et Méthodes 4.2.1 Préparation des membranes La première étape du Northern blot consiste à séparer les ARN par électrophorèse sur un gel d’agarose 1% (p/v) dans du tampon phosphate 0,01 M (pH7) en conditions dénaturantes. Pour cela, 15 µg d’ARN (qsp H2 O DEPC 7,4 µl) sont dénaturés pendant 30 min à 55°C en présence de 24,6 µl d’une solution de dénaturation (glyoxal désionisé 1M, DMSO 50% (v/v), tampon phosphate 0,01 M pH7, H2 0 DEPC) puis refroidis dans la glace. Les échantillons additionnés de solution de dépôt sont déposés sur gel. Chaque gel comporte 3 µg d’ARN dénaturés du marqueur de taille (0.24-9.5 Kb RNA ladder, Invitrogen), ainsi qu’un échantillon choisi comme contrôle interne afin de normaliser les données obtenues sur différentes membranes. La migration s’effectue à 80 volts dans le tampon phosphate 0,01M pH7 avec une recirculation constante du tampon de la cathode à l’anode pour éviter l’acidification du tampon de migration. Après migration, la portion de gel contenant le marqueur de tailles d’ARN est colorée au BET (0,5 µg.ml-1 ) afin de déterminer la correspondance entre la taille des transcrits (en kb) et leur distance de migration (en cm) par photographie sous UV du gel en présence d’une règle fluorescente. Les ARN des échantillons sont transférés par capillarité sur une membrane de nylon (HybondTM-N, Amersham) en présence de SSC 20X (Sigma). Après une nuit de transfert, les ARN sont fixés sur la membrane par traitement à 80°C pendant deux heures. La membrane peut ensuite être conservée plusieurs semaines. 4.2.2 Préparation des sondes radioactives Les sondes nucléotidiques utilisées sont obtenues par une étape de PCR et une étape de marquage, à partir des clones bactériens comportant les ADN complémentaires des transcrits étudiés. 4.2.2.1 Amplification par PCR des fragments d’ADN Les réactions de PCR ont été effectuées dans le thermocycleur TGradient (Biometra, Goettingen, Germany) avec les amorces du plasmide pCR®2.1TOPO® : le T7 forward (5’-TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG-3’) et le M13 reverse (5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-3’) dans les conditions décrites ci-après. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 62 Matériel et Méthodes Conditions de PCR : Amorce T7 forward 300 nM Amorce M13 reverse 300 nM dNTPs 200 µM (chacun) Tampon PCR 1X MgCl2 2 mM Taq uptitherm (Upthima) 1,25 U H20 qsp 50 µl 25 cycles 5’ 30’’ 30’’ 7’ 92°C 30’’ 72°C 54°C ADN matrice : une pointe de clone bactérien 4.2.2.2 Purification des fragments d’ADN amplifiés La purification des produits de PCR est réalisée sur colonne à l’aide du kit “MinElute Gel Extraction” (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. La totalité de la réaction de PCR préalablement contrôlée est déposée sur gel d’agarose pour une électrophorèse (§ 4.1.3). La bande de gel contenant l’ADN d’intérêt est découpée sous UV. L’agarose contenant les fragments d’ADN est dissous, additionné d’isopropanol, et déposé sur une colonne fixant l’ADN. Après centrifugation, l’agarose est éliminé puis, après une étape de lavage, l’ADN est élué dans 10 µl d’eau ultra pure. 4.2.2.3 Marquage radioactif de la sonde Le marquage radioactif est effectué une heure à température ambiante sur 50 ng d’ADN (H2 0 qsp 5 µl), dénaturés 5 min à 100°C puis refroidis immédiatement dans la glace, selon la procédure du kit Prime-a-Gene® Labeling System (Promega). Mélange réactionnel pour une réaction : ADN dénaturé (10 ng.µl -1 ) 5 µl Tampon de marquage 5X 10 µl dATP, dGTP, dTTP (500 µM chacun) 2 µl 5 µl α32P-dCTP (10µCi.µl -1 ) ADN polymérase I, Large (Klenow) fragment (5U.µl -1 ) 1 µl BSA dépourvue de nucléase (10 mg.ml -1 ) H20 dépourvue de nucléase qsp 50 µl 2 µl La sonde est ensuite purifiée par filtration sur gel sur une colonne de Sephadex G50 (Quick SpinTM columns, Boehringer Mannheim) pour éliminer les nucléotides non incorporés. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 63 Matériel et Méthodes 4.2.3 Hybridation et révélation 4.2.3.1 Préhybridation-hybridation La membrane de nylon est d’abord réhydratée dans du SSC 2X, enroulée avec une feuille de nylon puis introduite dans une bouteille d’hybridation. Pour saturer les sites aspécifiques de la membrane, une étape de préhybridation est réalisée pendant 24 h à 50°C en présence d’une solution d’hybridation (formamide désionisé 50% (v/v), SDS 0,2% (p/v), Denhardt 5X (Ficoll 0,1% (p/v), polyvinylpyrrolidone 0,1% (p/v) ; BSA, 0,1% (p/v)), SSPE 5X, H2 0 DEPC) additionnée d’un mélange d’ADN de sperme de hareng et de saumon (0,5% (p/v) chacun) dénaturé pendant 15 min à 100°C et refroidi immédiatement dans la glace. L’hybridation est ensuite réalisée pendant 24 h à 42°C dans un nouveau tampon d’hybridation additionné d’ADN de sperme de hareng/saumon dénaturé extemporanément et de la totalité de la sonde radioactive dénaturée extemporanément à 100°C pendant 5 min et refroidie immédiatement dans la glace. 4.2.3.2 Lavages, exposition, révélation et normalisation Pour éliminer les hybridations non spécifiques de la sonde, la membrane subit plusieurs lavages de stringence croissante jusqu’à ce que le signal soit clairement différencié du bruit de fond. Généralement, deux lavages de 15 min à 52°C (SSC 2X, SDS 0,1%, H2 0 DEPC) suivis de deux lavages de 15 min à 52°C (SSC 0,2X, SDS 0,1%, H2 0 DEPC) et éventuellement de deux lavages de 15 min à 60°C (SSC 0,1X, SDS 0,1%, H2 0 DEPC) sont suffisants pour éliminer le bruit de fond et les hybridations non spécifiques. Le suivi des lavages étant réalisé grâce à un compteur Geiger. La membrane est ensuite enveloppée dans un film de SARAN (Dow), mise en contact 4 à 12 h avec un écran qui est ensuite scanné dans un appareil STORMTM (Amersham) pour obtenir une image numérique des signaux radioactifs présents sur la membrane. Afin de normaliser les données obtenues, la membrane est stockée pour décroissance de la radioactivité pendant environ deux mois, puis réhybridée comme précédemment avec un gène de normalisation. Les données sont ensuite traitées à l’aide du logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). Les intensités des bandes obtenues pour les transcrits d’intérêt sont d’abord corrigées par rapport au bruit de fond de chaque membrane. La normalisation entre les échantillons s’effectue ensuite en divisant l’intensité corrigée de l’échantillon par celle obtenue avec le gène de nor- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 64 Matériel et Méthodes malisation. Enfin, la normalisation entre membranes s’effectue en divisant l’intensité normalisée de l’échantillon par celle du témoin interne. 4.3 Soustraction d’ADNc (“Suppressive Subtractive Hybridization”) La soustraction d’ADNc permet d’isoler des séquences présentes dans une population d’ARNm, mais absentes ou faiblement représentées dans une autre. La technique consiste à mélanger une préparation d’ADNc appelée “tester” obtenue à partir d’une population d’ARNm d’intérêt, avec un excès d’ADNc obtenus à partir d’une seconde population d’ARNm appelée “driver”. Dans ce type de méthode, les séquences communes entre les deux populations sont éliminées (d’où le terme de soustraction) par hybridation des ADNc communs aux deux populations. En utilisant ensuite la technique de PCR associée à des jeux d'adaptateurs spécifiques, seuls les ADNc spécifiques de l'une des deux conditions (“tester”) sont amplifiés par PCR. La soustraction d’ADNc a été réalisée à l’aide du kit “PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit” (BD Biosciences Clontech). 4.3.1 Synthèse, amplification et purification des ADNc La synthèse des ADNc correspondants aux deux populations d’ARN (“tester” et “driver”) est réalisée à l’aide du kit “BD SMARTTM PCR cDNA synthesis kit” (BD Biosciences Clontech) selon les recommandations du fournisseur. Ce kit permet grâce à un oligo(dT) de synthétiser les ADN complémentaires des ARNm à partir d’ARN totaux et, grâce à l’activité terminale transférase de la rétrotranscriptase, d’incorporer un adaptateur synthétique spécifiquement en 5’ pendant la synthèse de l’ADNc (Figure 9). Un jeu d’amorces s’hybridant au niveau de cet adaptateur et de l’oligo(dT) permet ensuite d’amplifier les ADNc complets. Ce jeu d’adaptateurs permet ainsi de diminuer considérablement la proportion de fragments d’ADNc obtenue généralement lors de la rétrotranscription et donc, d’enrichir la population d’ADNc en ADNc complet. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 65 Matériel et Méthodes Figure 9 : Principe de la rétrotranscription des ARNm à l’aide du kit “BD SMARTTM PCR cDNA synthesis kit” (BD Biosciences Clontech). 1-L’oligo(dT) spécialisé s’amorce sélectivement aux ARNm de l’échantillon d’ARN total. L’oligo contient une séquence pour la PCR et un site de restriction RsaI. 2-La rétrotranscriptase (RT) atteint l’extrémité 5’ de l’ARNm matrice et ajoute une série de cytosines grâce à son activité terminale transférase. 3-Un oligo SMARTTM spécialisé s’hybride au niveau des cytosines, créant une nouvelle matrice pour la RT. Cette dernière poursuit la synthèse d’ADNc jusqu’à l’extrémité de l’oligo SMART incorporant la séquence de celui-ci. Ainsi, les deux extrémités de l’ADNc comportent un adaptateur. 4-Les ADNc double brins sont ensuite amplifiés par PCR avec les amorces correspondant aux séquences de l’adaptateur. L’oligo SMART et l’oligo(dT) contiennent également un site de restriction RsaI. Les ADNc sont synthétisés à partir de 1 µg d’ARN (H2 0 qsp 4 µl) incubé en présence de 1 µl d’amorce oligo(dT) (12 µM) et de 1 µl de l’adaptateur SMART (12 µM) 2 min à 70°C. Le mélange est ensuite refroidi rapidement sur glace. Sont alors ajoutés au mélange : 2 µl du tampon 5X, 1 µl de DTT (20 mM), 1 µl de dNTP (10 mM chacun) et 1 µl de rétrotranscriptase. La réaction est réalisée une heure à 42°C puis le mélange est refroidi rapidement sur glace avant d’être dilué par addition de 40 µl de tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris pH7,6). Les PCR sont réalisées à partir de 1 µl du produit de la rétrotranscription, dans un volume final de 100 µl, à l’aide du kit “BD AdvantageTM 2 PCR” (BD Biosciences Clontech). Après optimisation du nombre de cycles de PCR (conservation des proportions initiales d’ADNc), les PCR sont réalisées comme décrit ci-après. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 66 Matériel et Méthodes Conditions de PCR : Amorces PCR primers 240 nM dNTPs (chacun) 200 µM Tampon PCR 1X BD Advantage 2 polymerase mix 1X ADNc monobrin dilué 1 µl H20 PCR qsp 99 µl 17 cycles 1’ 15’’ 6’ 95°C 30’’ 72°C 65°C Les produits de PCR sont ensuite purifiés par addition d’un volume de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). Après centrifugation (10 000 g, 10 min), la phase supérieure est prélevée et ajoutée à 700 µl de butanol. Après une nouvelle centrifugation (10 000 g, 1 min), la phase supérieure est purifiée par filtration sur gel sur une colonne “BD chromaspin 1000” (BD Biosciences Clontech). Après purification, les produits de PCR sont collectés dans 380 µl de TNE (10 mM Tris-HCl pH8, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA,). 4.3.2 Digestion des ADNc, ligation aux adaptateurs et hybridations Après purification, les ADNc sont digérés trois heures à 37°C par 10 unités de l’enzyme RsaI puis purifiés sur colonne à l’aide du kit “GenElute PCR clean-up” (Sigma) selon les recommandations du fournisseur. Deux échantillons de 300 ng d’ADN du “tester” digérés par l’enzyme de restriction RsaI sont ensuite liés aux adaptateurs 1 et 2R respectivement, une nuit à 16°C. Un contrôle de soustraction réalisé à partir d’un mélange des deux milieux réactionnels (comportant donc les deux adaptateurs) est également soumis à une ligation durant la nuit. La soustraction proprement dite est réalisée par deux hybridations successives. La première hybridation est réalisée pour chaque échantillon (1 et 2R), entre l’ADNc “tester” et l’ADNc “driver” dans un rapport 1:30 (p/p) pendant huit heures à 68°C après 1,5 min de dénaturation à 98°C. La seconde hybridation est réalisée une nuit à 68°C entre les deux échantillons issus de la première hybridation additionnés d’ADNc “driver” dénaturé extemporanément (rapport final 1:25). A l’issue de la seconde hybridation, l’échantillon est dilué dans 200 µl de tampon (20 mM HEPES pH6,6, 20 mM NaCl, 0,2 mM EDTA pH8) et incubé 7 min à 68°C. 4.3.3 Amplification des ADNc soustraits Les ADNc soustraits, ainsi que le contrôle de soustraction, sont amplifiés par deux réactions de PCR successives précédées de la synthèse de la sé- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 67 Matériel et Méthodes quence complémentaire des adaptateurs à l’extrémité des brins hybridés, par une incubation de 5 min à 75°C. Au cours de la première PCR, seuls les ADNc comportant les deux adaptateurs sont amplifiés. La seconde PCR est une PCR nichée qui permet de réduire le bruit de fond et d’enrichir l’échantillon en ADNc soustraits. A l’issue de la seconde PCR, les produits de PCR sont analysés sur gel d’électrophorèse pour comparer le profil des ADNc soustraits et celui du contrôle non soustrait. Si les profils sont bien différents, les ADNc soustraits sont purifiés sur colonne à l’aide du kit “GenElute PCR cleanup” (Sigma) selon les recommandations du fournisseur. La banque soustraite est ensuite obtenue par clonage des produits de PCR purifiés dans le vecteur pCR®2.1-TOPO® (§ 4.7.1). Conditions de PCR 1: Amorces PCR primer1 400 nM dNTPs 200 µM (chacun) Tampon PCR 1X 50X Advantage polymerase Mix 1X ADNc dilué 1 µl H20 PCR qsp 25 µl 27 cycles 25’’ 10’’ 5’ 1’30’’ 94 °C 30’’ 75°C 66°C Conditions de PCR 2: Amorce Nested PCR primer1 400 nM Amorce Nested PCR primer 2R 400 nM dNTPs 200 µM (chacun) Tampon PCR 1X 50X Advantage polymerase Mix 1X PCR 1 diluée 10 fois 1 µl H20 PCR qsp 25 µl 4.4 72°C 12 cycles 10’’ 1’30’’ 94 °C 30’’ 72°C 68°C Obtention des séquences des ARNm à partir des EST (RACE) Les séquences complètes des ADNc sont obtenues à partir des EST à l’aide du kit “BD smart Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) cDNA amplification” (BD Biosciences Clontech), grâce à la technologie SMART décrite précédemment (Figure 9). 4.4.1 Obtention des ADNc (RT-PCR) La première étape de la réaction consiste à rétrotranscrire les ARNm contenus dans l’échantillon d’ARN utilisé comme “tester” dans la technique de PCR soustractive. Deux rétrotranscriptions sont réalisées en parallèle, l’une pour l’incorporation de l’adaptateur contenant la séquence SMART à ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 68 Matériel et Méthodes l’extrémité 5’ des ARNm (5’ADNc) comme décrit précédemment, et l’autre, pour introduire la séquence SMART à l’extrémité 3’ de l’ARNm (3’ADNc) grâce à une amorce oligo(dT)-SMART (Figure 9). Brièvement, pour chaque réaction, 1 µg d’ARN est incubé en présence des adaptateurs associés (1,2 µM chacun) puis la réaction s’effectue 1,5 h à 42°C dans le milieu réactionnel (Reverse transcriptase, tampon 1X, 2 mM DTT, 1 mM dNTP mix). Les ADNc sont ensuite dilués par addition de 100 µl de tampon Tricine-EDTA (10 mM Tricine-KOH pH8,5, 1mM EDTA) et incubés 7 min à 72°C. Ces deux échantillons, 5’ADNc et 3’ ADNc sont alors prêts pour l’amplification respective des extrémités 5’ et 3’ des ADNc d’intérêt. 4.4.2 Obtention des fragments d’ADNc (RACE PCR) Les fragments d’ADN situés de part et d’autre de l’EST sont obtenus par PCR grâce à la combinaison d’une amorce spécifique (GSP, “Gene Specific Primer”) et d’une amorce universelle (UMP, “Universal Primer Mix”). Les PCR sont réalisées comme décrit ci-dessous. Condition de 5’ RACE PCR (ou 3’ RACE PCR) : Amorce GSP1 (ou GSP2) 200 nM 5 cycles 5 cycles 25 cycles Amorce UPM 1X Tampon PCR 1X 30’’ 30’’ 30’’ 50X Advantage polymerase Mix 1X 3’ 3’ 3’ 30’’ dNTPs 200 µM (chacun) 94°C 94°C 94°C 30’’ 72°C 72°C 72°C 5’ ADNc (ou 3’ADNc) 2,5 µl 70°C H20 PCR qsp 50 µl 68°C Les premiers cycles de PCR sont réalisés à haute température d’hybridation (72 et 70°C) pour favoriser la spécificité de la PCR au niveau de l’hybridation de l’amorce GSP (l’amorce UMP s’hybridant à l’extrémité de tous les ADNc). Après l’amplification préférentielle des fragments d’intérêt dans le mélange d’ADNc initial, l’amplification est réalisée avec une température d’hybridation plus basse (68°C) pour favoriser l’efficacité de la PCR. Après vérification de la présence d’une bande majoritaire par électrophorèse sur gel d’agarose, celle-ci est purifiée à partir du gel et le fragment d’ADN est cloné et séquencé comme décrit plus loin (§ 4.7). Si la première PCR ne permet pas d’obtenir une bande majoritaire facilement isolable, une seconde PCR peut être réalisée, dans les mêmes conditions, avec une amorce spécifique située à l’intérieur du fragment amplifié lors de la première PCR et de l’amorce NUP (“Nested Universal Pri- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 69 Matériel et Méthodes mer”). Les séquences des amorces utilisées dans ce travail sont données dans l’Annexe I. 4.5 Amplification de fragment d’ADN génomique par longue PCR L’amplification des fragments d’ADN à partir d’ADN génomique a été réalisée à l’aide du kit “Expand long template PCR system” (Roche applied science). Ce système est composé d’un mélange de deux polymérases thermostables, une Taq polymérase classiquement utilisée en PCR et une Tgo polymérase avec une activité 3’-5’ exonucléase permettant d’augmenter la fidélité de l’amplification. De plus, la combinaison de ces deux enzymes permet d’augmenter le rendement de la PCR et d’amplifier des fragments allant jusqu’à 22 kb. Les PCR ont été réalisées selon les recommandations du fournisseur en testant pour chaque PCR les trois milieux réactionnels disponibles. 4.6 Marche sur le chromosome (“Genome Walking”) La marche sur le chromosome est une approche qui permet d’obtenir la séquence complète d’un gène, à partir d’une partie de la séquence, grâce à l’amplification, de proche en proche, des fragments d’ADN. Cette approche est basée sur la digestion de l’ADNg par une enzyme de restriction et la ligation d’adaptateurs aux extrémités des fragments obtenus. L’utilisation d’ADNg digéré permet ainsi de réduire la taille des fragments à amplifier. Un premier fragment est amplifié à l’aide d’une amorce spécifique et d’une amorce s’hybridant au niveau de l’adaptateur. L’obtention de la séquence de ce fragment permet alors de définir une nouvelle amorce spécifique et de réaliser une nouvelle PCR sur une autre digestion d’ADNg. L’utilisation de différentes enzymes de restriction à bouts francs (“blunt ends”) permet ainsi d’amplifier et de séquencer progressivement le gène d’intérêt. Les enzymes utilisées sont : AluI, DraI, EcoRV, PvuII, ScaI et StuI. 2,5 µg d’ADNg sont digérés une nuit à 37°C par 80 unités d’enzyme de restriction dans 100 µl du tampon de digestion. Après vérification de l’efficacité de la digestion par électrophorèse, l’enzyme et les sels sont éliminés par une extraction phénol-chloroforme-alcool-isoamylique de l’ADNg redissous dans un volume de 20 µl (§ 4.1.1). L’adaptateur est obtenu par une étape d’hybridation de 30 min à 28°C des deux oligonucléotides (1 mM chacun) synthétisés par la société Eurogentec : adaptator1 (5’-GTA-ATA-CGA-CTC-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TGG-TCG-ACGGCC-CGG-GCT-GGT-3’) et adaptator2 (5’-ACC-AGC-CC-3’, amine C7 en 3’). La ligation à l’adaptateur (5,9 µM) est réalisée par la T4 DNA Ligase (Promega) une nuit à 16°C dans un volume de 8 µl contenant 4 µl ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 70 Matériel et Méthodes d’ADNg. La réaction est achevée par l’inactivation de l’enzyme 5 min à 72°C et la dilution par dix du produit de ligation dans du TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH7,5). Les fragments d’ADNg sont ensuite amplifiés par PCR nichées dans les conditions décrites ci-dessous. Conditions de PCR 1: Amorce GSP1 200 nM Amorce AP1 200 nM dNTPs 200 µM (chacun) Tampon PCR 1X 50X Advantage polymerase Mix 1X ADNg-adaptateur 1 µl H20 PCR qsp 50 µl 7 cycles 2’’ 32 cycles 2’’ 3’ 94 °C 72°C 94 °C 3’ 4’ 67 °C Conditions de PCR 2: Amorce GSP2 200 nM Amorce AP2 200 nM dNTPs 200 µM (chacun) Tampon PCR 1X 50X Advantage polymerase Mix 1X PCR 1 diluée 50 fois 1 µl H20 PCR qsp 50 µl 4.7 5 cycles 2’’ 20 cycles 2’’ 3’ 94 °C 72°C 94 °C 3’ 4’ 67 °C Clonage des produits de PCR, préparation de l’ADN plasmidique et séquençage. 4.7.1 Clonage par “TOPO cloning” (Invitrogen) La technique de “TOPO cloning” est une technique permettant de cloner des fragments de PCR sans avoir recours à des étapes de digestion par des enzymes de restriction. Le plasmide classique pCR®2.1-TOPO® et le plasmide pCR®-XL-TOPO® approprié au clonage des fragments obtenus par longue PCR, sont disponibles sous forme linéarisée avec, à leurs extrémités 3’, une désoxythymidine et une topoisomérase I associée de manière covalente. Lors de l’amplification par PCR, la polymérase utilisée ajoute une désoxyadénosine aux extrémités 3’ des produits de PCR permettant l’insertion de ces produits dans le vecteur grâce à la désoxythymidine aux extrémités 3’ de ce dernier. Lors de l’insertion, la topoisomérase est libérée et exerce alors son activité de ligase. La ligation dans le vecteur pCR®2.1-TOPO® est réalisée 30 min à température ambiante à partir de 2 à 4 µl d’ADN purifié (H 2 O qsp 4 µl) et de 1 µl du tampon contenant le vecteur pCR®2.1 (10 ng.µl-1 plasmide, 50% glycérol, 50 mM Tris-HCl pH7,4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 100 µg.ml-1 BSA) additionnés de 1 µl de solution saline (300 mM ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 71 Matériel et Méthodes NaCl, 15 mM MgCl2 ). La ligation dans le vecteur pCR®-XL-TOPO® est réalisée 5 min à température ambiante à partir de 4 µl d’ADN purifié et de 1 µl du tampon contenant le vecteur pCR®XL (10 ng.µl-1 plasmide, 50% glycérol, 50 mM Tris-HCl pH7,4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 100 µg.ml-1 BSA). Après les 5 min d’incubation, la réaction est arrêtée par l’ajout d’1 µl de “stop solution” (300 mM NaCl, 60 mM MgCl2 ). 4.7.2 Transformation des cellules par électroporation L’électroporation est une technique de transformation, utilisant un courant électrique pour perméabiliser la membrane des bactéries compétentes (E. coli, TOP10, Invitrogen) afin d’y faire pénétrer de l’ADN. Cette étape d’électroporation est réalisée grâce au système Gene Pulser II (Biorad). 4.108 bactéries compétentes sont soumises à une décharge électrique en présence de 2 µl du produit de ligation. Après l’impulsion électrique, les bactéries sont incubées 1 h à 37°C dans 250 µl de milieu SOC (2% tryptone, 0,5% extrait de levure, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 10 mM MgSO4 , 20 mM glucose) afin de permettre aux cellules transformées d’exprimer le gène de résistance à un antibiotique présent sur le plasmide. Les cultures sont ensuite étalées sur milieu sélectif, LB-agar (Sigma) additionné d’antibiotique, où seules les bactéries transformées peuvent se développer. Après une nuit à 37°C, les boites sont conservées à 4°C. Lorsque les fragments sont clonés dans le pCR®2.1 porteur d’un gène de résistance à l’ampicilline, les cultures sont étalées sur un milieu sélectif contenant de l’ampicilline (50 µg.ml-1 ) sur lequel ont préalablement été étalés 40 µl d’une solution à 40 mg.ml-1 de Xgalactose (Xgal) dans du diméthylformamide. La distinction entre les cellules possédant un plasmide vide et celle possédant un plasmide porteur d’un insert est ensuite réalisée par α-complémentation. Le vecteur pCR2.1 possède un fragment du gène LacZ codant pour la protéine de la β-galactosidase, une enzyme qui dégrade le chromogène X-gal présent dans le milieu en un produit bleu. Durant l’étape de ligation, le produit de PCR cloné s’insère dans le vecteur au sein de ce gène altérant le codage du gène LacZ (clones LacZ -) : le chromogène n’est donc pas hydrolysé et les colonies apparaissent blanches. Pour obtenir les plasmides recombinants, seules les colonies blanches sont sélectionnées. Dans le cas d’un clonage dans le vecteur pCR-XL-TOPO, la sélection des bactéries possédant un plasmide recombinant est réalisée grâce à la présence d’un gène de résistance à la kanamycine et d’un gène létal, le gène ccdB d’E. coli. Lors de l’étape de ligation, le produit de PCR s’insère dans le vecteur au sein du gène létal ccdB ce qui altère le codage du gène et ainsi ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 72 Matériel et Méthodes permet à la bactérie de se développer. Ainsi, seules les bactéries recombinantes pourront se développer sur un milieu LB gélosé additionné de kanamicyne (50 µg.ml-1 ) Les colonies bactériennes possédant les plasmides recombinants peuvent être conservées à -80° à partir d’un volume d’une culture d’une nuit additionnée d’un volume de solution de glycérol (glycérol 65%, 0,1 mM MgSO4 , 25 mM Tris-HCl pH8). 4.7.3 Préparation d’ADN plasmidique L’extraction d’ADN plasmidique est réalisée par lyse alcaline à l’aide du kit “Nucleospin plasmid” (Macherey-Nagel) sur 1,5 ml d’une culture d’une nuit. Cette technique est basée sur une dénaturation différentielle entre l’ADN plasmidique superenroulé et l’ADN chromosomique de structure relâchée, suivie d’une purification de l’ADN plasmidique sur colonne. Brièvement, le culot de bactéries est suspendu dans un premier tampon additionné de RNases puis les bactéries sont lysées, et l’ADN dénaturé, par l’ajout d’un tampon contenant du SDS et de la soude. Enfin, l’ajout d’une solution de neutralisation entraîne la formation d’un précipité de protéines et d’ADN chromosomique alors que l’ADN plasmidique reprend sa forme soluble native. L’ADNg et le complexe SDS-protéine sont éliminés par centrifugation (10 000 g, 10 min) et le surnageant contenant l’ADN plasmidique est déposé sur colonne pour purification. Après lavage, l’ADN plasmidique est élué dans 50 µl de tampon Tris-HCl 5 mM, pH8,5. 4.7.4 Séquençage des fragments d’ADN La réaction de séquençage est généralement effectuée sur séquenceur automatique par la société Génome Express (Meylan, France) à l’exception des EST des banques soustraites qui ont été séquencées par Vicente PérèzBrocal, en collaboration avec A. Moya et A. Latorre, à “l’Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva”, Université de Valence (Espagne). 4.8 RT-PCR quantitative en temps réel La technique de RT-PCR quantitative en temps réel est une technique permettant de quantifier précisément les ARN d’un échantillon. Elle comprend une étape de rétrotranscription des ARNm et une étape de PCR en temps réel qui permet, comme son nom l’indique, de suivre l’accumulation des ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 73 Matériel et Méthodes produits d’amplification. Parmi les différents systèmes de PCR en temps réel disponibles actuellement, nous avons utilisé le système LightCycler® (Roche applied science) disponible dans la plateforme du DTAMB (Développement de Techniques et Analyse Moléculaire de la Biodiversité) de l’IFR 41 (Instituts Fédératifs de Recherche, université Claude Bernard Lyon 1). Les PCR sont réalisées à l’aide du kit “LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I” (Roche applied science). Le principe de ce système est basé sur une molécule, le SYBR Green, qui n’émet de la fluorescence que lorsqu’elle est liée à de l’ADN double brin. Au cours de l’élongation, le SYBR green se lie progressivement à l’ADN double brin nouvellement formé. La PCR peut donc être suivie en temps réel par l’accumulation de la fluorescence qui est directement proportionnelle à la quantité d’ADN double brin. Pour quantifier les produits de PCR, la fluorescence est mesurée à la fin de l’étape d’élongation de chaque cycle. La dénaturation de l’ADN entraîne ensuite la libération des molécules de SYBR green et la chute de la fluorescence. L’utilisation du SYBR green permet également, à la fin de la PCR, de vérifier la spécificité de la réaction et l’absence de dimères des amorces par la réalisation d’une courbe de fusion. Pour cela, la température du mélange réactionnel est élevée progressivement entraînant la dénaturation des produits de PCR et donc la chute de la fluorescence à la température d’hybridation de l’ADN (Tm). Chaque Tm étant spécifique du produit de PCR (ou du dimère des amorces), une chute de fluorescence correspond à un produit de PCR donné. La mesure de la fluorescence permet ainsi de déterminer le nombre de produits de PCR obtenus en fin de réaction. 4.8.1 Rétrotranscription des ARNm La rétrotranscription des ARNm est réalisée à l’aide du kit “Super ScriptTM First strand synthesis system for RT-PCR” (Invitrogen) à partir de 1 µg d’ARN. L’ARN est dénaturé 5 min à 65°C en présence de 0,5 µg d’amorce oligo(dT) et de 10 nmol de dNTP puis le mélange (10 µl) est refroidi sur glace. La rétrotranscription est ensuite réalisée 1 h à 42°C dans un volume final de 20 µl de milieu réactionnel (tampon 1X, MgCl2 5 mM, DTT 10 mM, RNaseOUTTM 1/20 (v/v), SuperScriptTM II RT 50 U). La réaction est achevée par 15 min d’incubation à 70°C. Les ARN de la matrice sont ensuite dégradés par une incubation de 20 min à 37°C en présence de deux unités de RNase H. Les ADNc sont enfin dilués dans 4 volumes d’H2 O puis aliquotés pour limiter leur dégradation par congélations-décongélations. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 74 Matériel et Méthodes 4.8.2 PCR en temps réel Pour permettre la quantification des ADNc, une gamme étalon est réalisée à partir d’un fragment d’ADN correspondant au transcrit étudié. Ce fragment est obtenu par PCR à partir de l’EST (ou de l’ADNc) cloné dans le vecteur pCR2.1 avec les amorces du vecteur T7 et M13 rev (§ 4.2.2.1). Après purification du produit de PCR, celui-ci est dosé et ajusté à une concentration de 2 ng.µl-1 . Lors de la PCR en temps réel, les cinq points de la gamme sont obtenus par dilution successive de la solution à 2 ng.µl-1 . Les PCR sont réalisées dans des capillaires à partir de 2 µl de matrice (PCR diluée pour la gamme ou ADNc de la rétrotranscription diluée pour les échantillons à quantifier) dans l’appareil LightCycler dans les conditions décrites ci-dessous, avec Tx la température d’hybridation des amorces utilisées. Conditions de PCR : Amorce Forw ar d Amorce Reve r se MgCl 2 LightCycler FastStart DNA master SYBR Green 1* ADN matrice H20 PCR 500 nM 500 nM 3,5 mM 1X 39 cycles 8’ 95°C 2 µl qsp 18 µl * contient la polymérase, le tampon, les dNTPs et le SYBR green 10’’ 95°C 30’’ 20’’ 72°C Tx°C 15’’ (Tx+10)°C 40°C Amplification Fusion Mesure de la fluorescence Les séquences des amorces utilisées dans ce travail sont données dans l’Annexe II. A l’issue de la PCR, les données sont traitées à l’aide du logiciel LightCycler3. Ce logiciel permet d’analyser la spécificité des produits de PCR à l’aide de la courbe de fusion et de sélectionner les points fiables de la gamme étalon (absence de dimères des amorces). En fonction de l’ensemble des données, le logiciel définit un seuil de détection (méthode du maximum de dérivée seconde) et le nombre de cycles à partir duquel les échantillons sont détectés. Ce nombre de cycles est ensuite converti en quantité d’ADN à partir des points sélectionnés de la gamme étalon. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 75 Matériel et Méthodes 4.9 Macroarrays La technique de macroarray est une méthode permettant d’étudier le profil d’expression d’un ensemble de gènes dans différentes conditions physiologiques. Cette technique est basée sur la fixation sur une membrane de nylon des produits de PCR correspondant aux gènes étudiés puis, à l’hybridation d’une sonde radioactive constituée d’un mélange d’ADNc correspondant à une condition physiologique donnée. 4.9.1 Synthèse des sondes radioactives par rétrotranscription La synthèse des sondes radioactives est réalisée à l’aide du kit “Super ScriptTM First strand synthesis system for RT-PCR” (Invitrogen) à partir des échantillons d’ARN utilisés dans la technique de PCR soustractive et d’ARN de bactériomes. 10 µg d’ARN sont dénaturés 5 à 10 min à 65°C en présence de 1 µg d’amorce oligo(dT) puis refroidis sur glace. La rétrotranscription est ensuite réalisée 1,5 h à 42°C en présence de dCTP radioactif dans 40 µl de milieu réactionnel (tampon 1X, MgCl2 5mM, DTT 10 mM, RNaseOUTTM 1/20 (v/v), dATP 1 mM, dTTP 1 mM, dGTP 1 mM, α32 P-dCTP 100 µCi, SuperScriptTM II RT 200U). La réaction est arrêtée par 15 min d’incubation à 70°C. La sonde est ensuite purifiée par filtration sur gel (“Quick spin”, Roche Molecular Biochemicals) et la radioactivité est comptée pour vérifier l’équivalence des sondes synthétisées. 4.9.2 Préparation des membranes Les EST des clones de la banque soustraite sont amplifiées à partir des stocks bactériens conservés à -80°C (§ 4.7.2). Les PCR sont réalisées avec les amorces de la soustraction, Nested PCR primer 1 et 2R dans les conditions décrites dans le paragraphe 4.2.2.1 à une température d’hybridation de 68°C. Les produits de PCR sont ensuite contrôlés par électrophorèse et un volume fixe de 10 µl de chaque PCR non purifiée a été utilisé pour chaque dépôt. Les membranes sont réalisées à l’aide du système de microfiltration Bio-Dot® (Biorad) qui permet la réalisation de membranes comportant 96 dépôts. Les membranes de nylon (HybondTM-N, Amersham) préalablement humidifiées dans un tampon SSC 6X sont montées dans le système Bio-Dot selon les recommandations du fournisseur. Après l’application de ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 76 Matériel et Méthodes 100 µl/puits de SSC 6X et élimination sous vide, 10 µl/puits de produit de PCR sont déposés sur la membrane. La solution est ensuite éliminée sous vide alors que l’ADN est retenu sur la membrane. Après un lavage par 100 µl/puits de SSC 6X, la membrane est transférée 10 min dans de la soude 0,6 M pour dénaturer l’ADN, puis dans un tampon Tris-HCl 0,5 M pH7,5 avant d’être rincée dans des bains de SSC 2X. L’ADN est fixé sur la membrane par traitement à 80°C pendant deux heures. Les membranes sont ensuite préhybridées (24 heures), hybridées (48 heures), puis lavées et révélées comme décrit dans le paragraphe 4.2.3. L’analyse quantitative des membranes est réalisée à l’aide du logiciel ImageQuant (Molecular Dynamics). La normalisation des données s’effectue en divisant l’intensité du signal de l’EST par celle obtenue avec le gène de normalisation. 5 5.1 Techniques d’analyse de séquences Analyse des séquences à l’aide du programme Mac Molly Tetra (GeneSoft) La première étape de l’analyse des résultats du séquençage consiste à identifier les différents éléments qui constituent la séquence : le vecteur de clonage, les amorces spécifiques ou universelles, les adaptateurs, les séquences connues et les nouvelles séquences. Cette première analyse est réalisée par alignement des séquences à l’aide des applications du programme Mac Molly Tetra (GeneSoft). Les séquences peuvent alors être nettoyées des éléments issus de la construction (vecteur, amorces universelles, adaptateurs) et intégrées aux séquences déjà identifiées dans le cas de la reconstitution d’une séquence complète d’un ADNc (RACE) ou d’un gène. Les séquences peuvent ensuite être analysées par comparaison aux banques de données. 5.2 Analyse des séquences par comparaison aux banques de données La recherche de séquences homologues dans les banques de données est réalisée grâce à l’application BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”) disponible sur le site NCBI (“National Center of Biotechnology Information”, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). L’analyse au niveau des protéines théoriques (traduction, composition en acides aminés, localisation cellulaire putative…) a été réalisée à l’aide d’applications disponibles sur le site ExPASy (“Expert Protein Analysis System”, http://us.expasy.org). La recherche des motifs ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 77 Matériel et Méthodes lysis System”, http://us.expasy.org). La recherche des motifs protéiques a ensuite été réalisée à l’aide d’un programme qui combine différentes méthodes d’identification des domaines protéiques décrits dans les bases de données : l’InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan). 5.3 Analyse des EST des banques soustraites Les séquences des EST sont nettoyées manuellement et les sites de restriction RsaI sont identifiés pour décomposer les séquences lorsque celles-ci sont le résultat de la ligation de plusieurs EST (chimères). Les protéines putatives définies par les six phases de lecture possibles des EST sont ensuite comparées aux banques protéiques (BLASTx) à l’aide d’une application disponible sur la plateforme du Pôle BioInformatique Lyonnais (PBIL). Contrairement aux applications du site NCBI qui ne permettent de traiter qu’une séquence à la fois, l’application utilisée, dans cette analyse, permet de traiter l’ensemble des EST en une seule requête. A partir des identifiants des protéines issues du BLASTx, les informations associées à ces protéines sont obtenues grâce au “Sequence Retrieval System” (SRS) disponible sur le site ExPaSy (http://us.expasy.org/srs5). Les résultats obtenus, comme l’identifiant, la E-value, ainsi que la description des protéines, les mots-clés qui leur sont associés et l’organisme dont elles proviennent, sont organisés dans un tableau de données pour visualiser l’ensemble des données et accéder à la banque Swiss-Prot-trEMBL à l’aide de liens hypertextes. 6 6.1 Techniques de biochimie Collecte d’hémolymphe et extraction des peptides Le système de collecte d’hémolymphe est constitué d’un cône de 1 ml placé, grâce à un adaptateur (microtube 0,5 ml Eppendorf coupé), sur un tube Eppendorf contenant 30 µl d’acide trifluoroacétique (TFA) 0,1 % et 10 µl d’une solution saturée de phénylthiourée (PTU) (5 mg.ml-1 ). Le PTU est un inhibiteur de la phénoloxydase qui limitera la mélanisation de l’hémolymphe et qui servira d’étalon interne pour la Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC). Des lots de 25 larves sont déposés dans les cônes et les larves sont ensuite blessées à l’aide d’une aiguille d’entomologie pour faciliter l’extraction. La collecte de l’hémolymphe est réalisée par une centrifuga- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 78 Matériel et Méthodes tion des systèmes Eppendorf-cône (10 000 g, 1 min) permettant de broyer/presser les larves lors du passage par l’extrémité du cône et d’éliminer ensuite les débris larvaires. Le surnageant contenant l’hémolymphe est additionné de 70 µl de TFA 0,1% et centrifugé de nouveau (15 000 g, 10 min). Le deuxième surnageant est collecté à la seringue Hamilton et conservé trois heures à 4°C pour favoriser la précipitation des protéines. L’extraction est achevée par une dernière centrifugation (15 000 g, 10 min) pour éliminer le culot protéique. Le dernier surnageant contenant les peptides de l’hémolymphe est collecté à la seringue Hamilton et évaporé sous vide d’air au Speed-Vac. 6.2 Séparation des peptides de l’hémolymphe par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) La technique d’HPLC est une technique de séparation basée sur la différence de polarité des composants d’un échantillon. La séparation des peptides de l’hémolymphe est réalisée en phase inverse grâce à une phase stationnaire apolaire (C18) et une phase mobile polaire (H2 0 90%, CH3 CN 10%, TFA 0,1%) dont on diminue progressivement la polarité en augmentant la proportion d’acétonitrile (CH3 CN). Les peptides sont ainsi élués progressivement (et donc séparés) en fonction de leur polarité. Les extraits d’hémolymphe sont repris dans 130 µl de phase mobile initiale et la solution est ensuite filtrée (0,45 µm). 100 µl sont injectés sur une colonne Nucléosil C18 (250×4,6 mm, 5 µm, 300Å). Les paramètres chromatographiques (gradient d’élution, débit et détection) sont donnés cidessous. Le solvant des fractions collectées à la sortie de la chaîne est évaporé sous vide d’air et les échantillons sont conservés à -20°C. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 79 Matériel et Méthodes 6.3 Test d’activité antibactérienne en milieu liquide Les fractions testées sont resuspendues dans 50 µl de PBS et additionnées à 50 µl d’une solution à 6×107 bactéries.ml-1 obtenue par dilution d’une culture d’E. coli (TOP 10, Invitrogen) en phase exponentielle. Le test est réalisé en plaque de titration 96 puits à 37°C sous agitation. L’absorbance à 595 nm est mesurée dans un lecteur de plaques PowerWave x (Bio-Tek) toutes les 20 min sur une durée de cinq heures. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 80 Résultats ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 81 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1 Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte L’étude moléculaire de la perception des endocytobiotes par l’hôte et de sa réponse immunitaire exige la connaissance des gènes impliqués dans la reconnaissance et l’élimination des bactéries. Chez le charançon S. zeamais, aucune séquence de gènes de la réponse immunitaire n’était connue, à l’exception d’un gène de la famille des PGRP (Heddi et al., 2005). L’enjeu principal de cette thèse était donc d’identifier des gènes de la réponse humorale activée par les bactéries Gram (-). Dans le but d’intégrer notre étude de la réponse immunitaire de l’hôte dans un cadre évolutif, et de comprendre comment évolue l’interaction hôte-symbiote parallèlement à la réduction de la taille du génome bactérien, une étude comparative a été initiée entre le modèle S. zeamais-SZPE et le modèle A. pisum–Buchnera dont la symbiose remonte à 150-200 MA, et où le génome bactérien ne code ni SSTT, ni certains éléments de la paroi bactérienne comme les LPS et les phospholipides. 1.1 Gènes de la réponse immunitaire de Sitophilus zeamais Pour identifier les Gènes de la Réponse Immunitaire (GRI) du charançon S. zeamais, j’ai réalisé une soustraction d’ADNc entre des larves aposymbiotiques infectées par E. coli et des larves aposymbiotiques témoins (non traitées). Afin d’obtenir un large spectre de gènes intervenant dans plusieurs phases de la réponse immunitaire (i.e. reconnaissance du microorganisme, transmission du signal, élimination du microorganisme et régulation de la réponse), la soustraction a été réalisée avec un ADNc “tester” synthétisé à partir d’un mélange en quantités égales de trois échantillons d’ARN extraits 3, 6 et 12 h après infection par E. coli. Après les étapes de digestion par l’enzyme de restriction RsaI et de purification des ADNc (voir Matériel et Méthodes), la quantité d’ADNc “driver” obtenue à partir des larves aposymbiotiques témoins était inférieure à la quantité recommandée par le fournisseur pour poursuivre la soustraction. Les quantités d’ADNc du “tester” et du “driver” utilisées dans la suite de la soustraction ont donc été adaptées en fonction des quantités disponibles, pour pouvoir conserver la proportion entre le “tester” et le “driver”. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 82 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte A l’issue de cette soustraction, 527 clones ont été isolés, et, après vérification de leur contenu plasmidique, 513 plasmides ont été envoyés à Valence (Espagne), où ils ont été séquencés dans le cadre d’une collaboration. Après élimination des séquences du vecteur et des amorces, j’ai obtenu 507 séquences d’EST. Ces séquences ont été analysées par comparaison aux banques de données protéiques, sans limitation du degré de similitude (Evalue<10), et les EST présentant une similitude de séquence avec d’autres organismes ont été répertoriées dans le Tableau A-III présenté en annexe. Le classement des ces EST par catégories fonctionnelles a mis en évidence l’efficacité de la soustraction puisque 12,7 % des EST de la banque soustraite correspondent à des peptides antibactériens et 5,7 % des EST à d’autres protéines de la réponse immunitaire (Figure 10). Il est important de signaler que dans le cas des EST présentant des similitudes avec des séquences de bactéries, de virus ou de champignons, ces similitudes sont le plus souvent non significatives (Evalue>1) (Tableau A-III) et sont généralement obtenues sur des EST correspondant à des séquences courtes ou non codantes. Figure 10 : Distribution en catégories fonctionnelles des EST de la banque soustraite de S. zeamais. Les EST présentant une similitude de séquence avec des peptides ou des protéines de l’immunité sont répertoriées dans le Tableau III. Ces peptides et protéines incluent des peptides antibactériens, des lysozymes, une protéine homologue de la thaumatine de plantes, des protéines de la famille PGRP, une protéine homologue d’un régulateur de la réponse immunitaire des mammifères (Tollip) et enfin, des protéases et des inhibiteurs de protéases dont des éléments de la cascade prophénoloxydase (PPAF, Serpines). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 83 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Peptides antibactériens Lysozymes Thaumatine PGRP Régulateur Protéases et inhibiteurs de protéases EST INF-18 INF-42 INF-145 INF-163 INF-165 INF-217 INF-479 INF-152 INF-282 INF-475 INF-9 INF-441 INF-359 INF-20 INF-74 INF-91 INF-161 INF-258 INF-459 INF-506 Protéine Coleoptericin Diptericin A Acaloleptin A Cecropin A1 precursor Sarcotoxin II-1 Precursor Tenecin-1 precursor Luxuriosin Lysozyme i homologue Lysozyme C-1 precursor Pathogenesis-related-5-like protein PGRP PGRP Toll interacting protein (Tollip) homologue Inducible metalloproteinase inhibitor Serpin-4A Cysteine-rich venom-like protein Serpin 3a (Serpin 3b) Pattern recognition serine proteinase Hemolymph proteinase 17 ProPhenoloxidase Activating Factor (PPAF) NC 3 11 7 4 13 10 3 1 1 5 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 Organisme Zophobas atratus Glossina morsitans Acalolepta luxuriosa Drosophila mauritiana Sarcophaga peregrina Tenebrio molitor Acalolepta luxuriosa Anopheles gambiae Anas platyrhynchos Diaprepes abbreviatus Anopheles gambiae Anopheles gambiae Anopheles gambiae Galleria mellonella Manduca sexta Aedes albopictus Manduca sexta Manduca sexta Manduca sexta Holotrichia diomphalia E-value SP-AC 5,0E-16 P80032 1,30 Q8WTD5 1,0E-15 Q76K70 0,35 P81685 0,26 P24491 1,0E-13 Q27023 0,78 Q60FC9 1,0E-11 Q7QF28 3,0E-17 P00705 1,0E-107 Q5I208 8,0E-55 Q7PUB3 1,0E-35 Q7PP76 3,0E-52 Q7QAN1 2,0E-12 Q67FQ9 2,0E-21 Q6Q2D8 3,0E-09 Q5MIW2 9,0E-52 Q867T1 5,0E-28 Q69BL0 1,0E-10 Q5MPB8 1,0E-15 Q9GRW0 Tableau III : Tableau récapitulatif des EST de la banque soustraite de S. zeamais présentant une similitude de séquence avec des protéines de la réponse immunitaire ou potentiellement impliquées dans cette réponse. Les similitudes ont été obtenues par comparaison des six phases de lecture des séquences des EST aux banques de données protéiques. NC, nombre de copies de l'EST identifiées dans la banque soustraite ; SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque de données Swiss-Prot. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 84 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte On constate que la plupart des similitudes de séquence sont significatives (Evalue<1×10-9 ). En revanche, certaines similitudes avec des peptides antibactériens, tels que la cécropine, la diptéricine et la sarcotoxine, sont peu significatives (Evalue>0). Compte tenu de la redondance de ces EST dans la banque soustraite (4, 11 et 13 clones respectivement), nous avons choisi de poursuivre l’étude des gènes correspondants. 1.2 Gènes de la réponse immunitaire d’Acyrthosiphon pisum La seconde soustraction d’ADNc a été réalisée entre des larves de pucerons aposymbiotiques témoins et des larves aposymbiotiques infectées par E. coli, selon le même plan expérimental que celui établi pour le charançon. A l’issue de cette soustraction, 521 clones ont été isolés et après vérification de leur contenu plasmidique, 509 plasmides ont été séquencés à Valence (Espagne). Après l’analyse des 192 premières séquences, aucune EST ne présentait une homologie avec un gène immunitaire connu. Aussi, afin de vérifier l’efficacité de la soustraction avant de séquencer le reste des clones, nous avons choisi d’utiliser une méthode indirecte en comparant les 192 premières EST obtenues à la banque d’EST du Consortium International de la Génomique des Aphides (IAGC). Cette banque comptait près de 40 000 EST au moment de cette analyse (Sabater-Munoz et al., 2006). La comparaison de ces deux banques a révélé que seulement 50% des EST de la banque soustraite présentaient une similitude de plus de 90% avec des EST de l’IAGC. Ceci nous a laissés supposer que l’absence de similitude avec des gènes de la réponse immunitaire ne serait pas le résultat d’un problème technique lié à la soustraction et nous a encouragés à poursuivre le séquençage des EST de la banque d’A. pisum. A l’issue du séquençage complet, la moitié des séquences seulement trouve leur homologue dans la banque de l’IAGC. La comparaison des 494 séquences du puceron aux banques de données protéiques, n’a permis d’identifier aucun peptide antibactérien, ni lysozyme, ni PGRP. En revanche, certaines EST présentent des similitudes de séquence avec des éléments des voies de signalisation immunitaire des mammifères telles que les protéines “TNF Receptor Associated Factor 3 interacting protein” (Evalue=3×10-9 ) et “Immune signaling kinase MEK3” (Evalue=2×10-52) (Tableau A-IV en annexe). De plus, il existe une faible redondance des EST de la banque du puceron par rapport au nombre d’EST redondantes obtenues dans la banque soustraite du charançon. Par ailleurs, 210 séquences (soit 42% des EST) ne présentent aucune similitude significative avec des séquences des banques de données protéiques (Evalue>1). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 85 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3 Analyse et caractérisation des GRI 1.3.1 Analyse globale des banques soustraites Suite à l’analyse in silico des EST de la banque soustraite d’A. pisum qui n’a pas révélé de gènes de la réponse immunitaire, nous avons mesuré, par macroarray, l’expression des EST obtenues chez les insectes témoins et les insectes infectés par E. coli afin de vérifier le caractère différentiel des EST. Cette expérience a aussi été réalisée sur les EST du charançon S. zeamais pour tenter d’identifier d’éventuels gènes sans homologie avec des GRI connus mais qui seraient induits par l’infection bactérienne. Ainsi, 268 EST non redondantes du charançon et 344 EST non redondantes du puceron ont été analysées. Les membranes de Dot blot ont été réalisées en double exemplaire, l’une a été hybridée avec une sonde radioactive obtenue par rétrotranscription à partir des ARN extraits des insectes témoins (sonde “témoin”) et l’autre, avec une sonde radioactive obtenue à partir des ARN extraits des insectes infectés (sonde “infectée”). Les résultats obtenus sur quatre des quatorze membranes sont présentés dans la Figure 11. Les autres membranes sont présentées dans l’Annexe III. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 86 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte S. zeamais A. pisum Larves témoins Larves témoins Larves infectées par E. coli Larves infectées par E. coli Figure 11 : Membranes de Dot-blot comportant les EST des banques soustraites de S. zeamais (à gauche) et d’A. pisum (à droite). Chaque membrane, réalisée en double exemplaire, comporte un témoin négatif correspondant à une amplification réalisée en absence d’ADN (en rouge) et un témoin de normalisation (gapdh, en bleu). Les membranes du haut ont été hybridées avec une sonde obtenue à partir des larves témoins et celles du bas, avec une sonde obtenue à partir des larves piquées par une aiguille infectée par E. coli. Chaque dépôt correspond à un volume fixe de 10 µl et seules les comparaisons intermembranes sont possibles. 1.3.1.1 Expression différentielle des EST de Sitophilus zeamais Une première analyse qualitative des membranes révèle l’existence de plusieurs signaux d’intensité différente entre les membranes hybridées par la sonde “témoin” et celles hybridées par la sonde “infectée”. Nous avons ensuite commencé une analyse quantitative des résultats, mais nous avons été confrontés à des difficultés liées à la variabilité de l’intensité entre les signaux et à l’encombrement des signaux sur la membrane. En effet, l’analyse des signaux de faible intensité nécessite l’augmentation du contraste de l’image de la membrane. Cependant, cette augmentation amplifie également l’intensité de signaux déjà très forts, et, du fait de l’encombrement stérique, ces signaux vont alors interférer avec les signaux environnants. Par ailleurs, sur certaines membranes, l’intensité du signal obtenu pour le gène de normalisation (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase) est trop faible pour permettre une quantification satisfaisante du signal et donc, une normalisation des données de ces membranes. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 87 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Toutes les EST de la banque soustraite ne pouvant être analysées quantitativement, aucune estimation objective du pourcentage d’EST différentielles ne peut être donnée à partir de cette analyse. Nous avons donc simplement identifié qualitativement les EST correspondant aux signaux qui présentent un différentiel important entre les deux membranes. Nous avons ainsi identifié 28 signaux présentant un différentiel important entre les membranes hybridées par la sonde “témoin” et celles hybridées par la sonde “infectée”. Les EST correspondantes ainsi que les résultats de leurs comparaisons aux banques de données sont répertoriés dans le Tableau IV. Parmi les EST correspondant aux signaux différentiels, on peut distinguer des similitudes avec des peptides antibactériens et d’autres protéines associées à la réponse immunitaire, ainsi que des similitudes avec des protéines associées au stress. On peut distinguer également des EST présentant une faible similitude avec des protéines de microorganismes et enfin, des EST qui ne présentent aucune similitude de séquence dans les banques de données. L’analyse globale des EST de la banque soustraite du charançon S. zeamais nous a donc permis d’une part, de confirmer le caractère différentiel des EST qui présentaient une faible similitude de séquence avec la diptéricine et la cécropine et, d’autre part, de mettre en évidence d’autres gènes qui présentent une similitude faible (Evalue>0), ou qui ne présentent pas de similitude avec des séquences des banques de données. Pour ces derniers, des études biochimiques et moléculaires sont nécessaires pour déterminer s’il s’agit de nouvelles familles de GRI. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 88 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte EST Peptides antibactériens INF-42 (inf-138) Protéine Organisme Evalue SP-AC 1,3 Q8WTD5 Diptericin Glossina morsitans INF-145 Acaloleptin Acalolepta luxuriosa 1,00E-15 Q76K70 INF-163 C ecropin Anopheles gambiae 0,35 Q7QEE3 INF-217 Tenecin-1 Tenebrio molitor 1,00E-13 Q27023 INF-314 C oleoptericin Zophobas atratus 1,00E-15 P80032 Immunité INF-198 Pathogenesis-related protein 5 Arabidopsis thaliana 4,00E-24 P28493 INF-182 C ysteine-rich venom-like protein 2,00E-10 Q5MIW2 Protéase INF-117 Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis 6,00E-16 Q64ID5 Stress INF-248 28 kDa desiccation stress protein Tenebrio molitor 5,00E-09 Q27014 INF-290 Putative alcohol dehydrogenase Gryllotalpa orientalis 2,00E-20 Q6RUR3 Mitochondrie INF-113 C ytochrome oxidase subunit I Sitophilus zeamais 1,00E-136 Q7YB50 Autres INF-284 Hypothetical protein Aedes aegypti 0,21 Q16KR0 INF-454 cDNA FLJ41170 fis Homo sapiens 0,068 Q6ZWF7 INF-4 Hypothetical cytosolic protein Fusobacterium nucleatum 0,011 Q8RH51 INF-57 (inf-77) Envelope glycoprotein Feline immunodeficiency virus 0,005 Q9WAV5 INF-65 Hypothetical protein Psychromonas ingrahamii 37 0,047 Q1FS83 INF-168 (inf-98) Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa 0,2 Q8NIQ6 Aedes albopictus INF-101 - - - - INF-255 - - - - INF-234 séquence non codante INF-310 (inf-81) séquence non codante INF-147 séquence non codante INF-235 (inf-213) séquence non codante Tableau IV : EST de la banque soustraite de S. zeamais présentant une expression différentielle entre les larves témoins et les larves infectées par E. coli. Les EST issues d’un même transcrit ont été regroupées et la présence/absence de cadre de lecture ouvert analysée. Les similitudes de séquence ont été obtenues par comparaison des six phases de lecture des séquences des EST aux banques de données protéiques. SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque de données Swiss-Prot. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 89 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3.1.2 Analyse de la banque d’Acyrthosiphon pisum Contrairement aux résultats obtenus sur le charançon, les membranes obtenues à partir des EST du puceron paraissent très similaires et aucun signal n’apparaît nettement différentiel (Figure 11 et Annexe III). Ceci suggère que la banque soustraite comporte peu de différentiel et donc que la soustraction réalisée chez A. pisum n’a pas permis d’obtenir de gènes surexprimés après l’infection par E. coli. L’analyse in silico des EST de la banque soustraite d’A. pisum d’une part, et l’analyse de leur profil d’expression d’autre part, n’ont pas permis d’identifier des gènes de la réponse immunitaire chez le puceron. Nous avons donc choisi de continuer le travail de thèse sur notre premier modèle d’étude, le charançon S. zeamais. 1.3.2 Caractérisation des GRI de Sitophilus zeamais Pour la suite de l’étude de la réponse immunitaire du charançon, nous avons choisi d’obtenir les séquences complètes des transcrits des GRI par la technique de RACE afin de confirmer les similitudes de séquence et d’obtenir la séquence des protéines. Par ailleurs, puisque les GRI des insectes peuvent être induits différemment à la suite d’une blessure ou d’infections par divers microorganismes, nous avons également décidé de caractériser le profil d’expression des gènes de Sitophilus, par la technique de RT-PCR quantitative. Ces deux approches ne permettant pas d’analyser un grand nombre de gènes, nous avons privilégié les EST présentant une similitude de séquence avec des protéines de fonction(s) connue(s). 1.3.2.1 Obtention et analyse des séquences complètes des transcrits des GRI Pour cette étude, notre choix s’est porté sur les EST codant des protéines dont la fonction putative présente un intérêt direct dans l’étude de la réponse immunitaire de l’hôte dans le contexte de la symbiose. Nous avons sélectionné les homologues des PGRP puisqu’un PGRP est surexprimé dans le bactériome (Heddi et al., 2005), et l’homologue de Tollip (Burns et al., 2000 ; Zhang et Ghosh, 2002), qui pourrait assurer une inhibition, partielle ou totale, de la réponse immunitaire dans l’organe symbiotique. Nous avons également considéré les EST correspondant aux effecteurs de la réponse immunitaire connus pour leur activité antibactérienne : les lysozymes et les peptides antibactériens, particulièrement les EST inf-42, inf-163 et inf-165 dont la similitude de séquence est très faible. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 90 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Les résultats de la comparaison des séquences complètes des ADNc aux bases de données, et de l’analyse in silico des séquences protéiques sont présentés dans le Tableau V et la Figure 12. Figure 12 : Représentation schématique des protéines théoriques de la réponse immunitaire identifiées chez S. zeamais. Les séquences protéiques ont été déduites des séquences des ADNc obtenues par RACE. Les domaines identifiés par la comparaison aux banques de domaines protéiques (InterProScan) ainsi que la E-value associée sont donnés pour chaque protéine (régions hachurées). Toutes les E-values présentées ici sont inférieures au seuil de significativité défini pour chaque famille de domaine, dans l’application InterProScan. Les peptides signaux (en noir) ont été identifiés par le programme TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP) et les domaines propeptides (en gris) ont été prédits à partir des motifs de coupure R-x(K/R)-R. La taille des protéines et des différents domaines peut être estimée à partir de l’échelle donnée en haut de la figure. Coleoptericin, IPR009382 ; Defensin, IPR001542 ; Kunitz, IPR002223 ; Lysozyme, IPR000974 ; Destabilase, IPR008597 ; PGRP, IPR002502 ; C2, IPR000008 ; CUE, IPR003892. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 91 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte EST Peptides antibactériens INF-18 INF-42 Protéine Coleoptericin Diptericin DipA INF-145 Acaloleptin A precursor INF-163 Cecropin A1 INF-165 Sarcotoxin II-1 precursor INF-217 Tenecin-1 precursor INF-479 Luxuriosin Lysozymes PGRP Régulateur INF-152 Lysozyme i-1 INF-282 Lysozyme C NC Organisme 3 Zophobas atratus 11 Glossina morsitans Acalolepta luxuriosa 3 Drosophila mauritiana 13 Sarcophaga peregrina 10 Tenebrio molitor 3 Acalolepta luxuriosa E-value 38/70 (54%) 7,00E-16 SP-AC P80032 22/53 (37%) 0,002 Q8WTD5 38/76 (50%) 1,00E-15 Q76K70 19/44 (43%) 0,46 P81685 22/81 (27%) 0,023 P24491 32/48 (66%) 8,00E-14 Q27023 45/106 (42%) 4,00E-16 Q60FC9 37/99 (37%) 3,00E-17 Q6GU90 3,00E-25 P00705 7 1 1 Anopheles gambiae Anas platyrhynchos PGRP 1 INF-441 PGRP 1 Anopheles gambiae Anopheles gambiae INF-359 Toll-interacting protein 1 Mus musculus INF-9 Identité de séquence 60/135 (44%) 95/169 (56%) 81/166 (48%) 127/275 (46%) 2,00E-54 Q7PUB3 2,00E-41 Q7PP76 4,00E-63 Q9QZ06 Tableau V : Résultats de la recherche d’homologie des séquences protéiques théoriques des GRI de S. zeamais. Les similitudes de séquence ont été obtenues par comparaison des séquences protéiques prédites à partir des ADNc obtenus par RACE, aux banques de données protéiques. L’identité de séquence est donnée sous la forme du nombre de résidus identiques sur le nombre total de résidus du fragment présentant des similitudes de séquence. NC, nombre de copies de l'EST identifiées dans la banque soustraite ; SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque de données Swiss-Prot. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 92 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3.2.1.1 Reconnaissance des microorganismes et régulation de la réponse immunitaire: les PGRP et Tollip Les PGRP Parmi les EST de la banque soustraite, deux EST présentent une similitude de séquence avec les PGRP : inf-9 dont la séquence correspond à celle de l’EST obtenue dans la banque soustraite du bactériome (Heddi et al., 2005), et inf-441 qui correspond à un deuxième gène PGRP. L’analyse des séquences obtenues par RACE, montre que le premier PGRP code pour une protéine de 262-aa sans séquence signal, et que le second code pour une protéine de 187-aa avec un peptide signal. Les deux protéines présentent 30% d’identité et possèdent toutes les deux le domaine caractéristique de la famille PGRP (IPR006619) et les cinq résidus nécessaires à l’activité amidasique (Kim et al., 2003) (Figure 13). Les protéines codées par les deux gènes PGRP identifiés dans la banque soustraite auraient donc une activité amidasique. En revanche, un seul des deux gènes (inf-441, PGRP2) possède une séquence de peptide signal et coderait donc une protéine sécrétée dans l’hémolymphe. L’autre protéine PGRP (inf-9, PGRP1) serait intracellulaire. La comparaison de la séquence protéique prédite des deux PGRP par BLAST a confirmé que le gène PGRP1, identifié dans la banque soustraite du bactériome, serait l’homologue du PGRP-LB de la drosophile puisqu’il présente un pourcentage de similitude par longueur de 51% (92/179 résidus, Evalue=1×10-52). En ce qui concerne le gène PGRP2, l’analyse de la séquence protéique par BLAST n’a pas permis d’identifier un homologue précis chez la drosophile. En effet, l’homologie la plus élevée est obtenue avec le PGRP-LCx (72/161 résidus, Evalue=2×10-37), mais l’alignement entre ce dernier et la protéine PGRP2 du charançon se limite au domaine PGRP (161/500 résidus). Ainsi, si la séquence complète de la protéine est considérée, le PGRP2 du charançon serait plus proche du PGRP-SC2 (71/161 résidus pour un total de 184 résidus, Evalue=2×10-35). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 93 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte INF-441 INF-9 Dm PGRP-LB INF-441 INF-9 Dm PGRP-LB INF-441 INF-9 Dm PGRP-LB 10 20 30 40 50 60 | | | | | | MSS-LSFVIV-----------------IVLNIG--IVIATCPAILKRAEWGARPALSTSL MSSKQSRSIVPTCECKFEKMEEIGEKKVELNIVANSFVCTDPEIVTRDEWGAKPPTGVEN +++R +WGA+ P VE+ (32) LLSRSDWGARLPKSVEH 70 80 90 100 110 120 | | | | | | LRQEPAPFVLVHHSDTP-QCINEVACKTRLHGIQNYHMDQKGWDDIGYNFMIGGDGTIFE LT-LPVPYVVIHHSYIPAACSTKEECINDMQWMQNYHQQNNSWCDIGYNFAVGGDNRIYV P PYV+IHHSY+PA C + +C+ M+ MQ++HQ W DIGY+F +GGD IY FQGPAPYVIIHHSYMPAVCYSTPDCMKSMRDMQDFHQLERGWNDIGYSFGIGGDGMIYT 130 140 150 160 170 180 | | | | | | GRGWGLTGAHAVKYNSLSIGICLLGNFQETNPSAAQLTALESLIECGVKEEKIHTQYRLM GRGWTAVGAHAPRYNARSIGIVLIGDWTEILPPESQMLAAKQLINMGIRDGYISENYKLI GRG+ +GAHAP+YN +S+GIVLIGDW LPP+ + AAK LI G+ GYI YKL+ GRGFNVIGAHAPKYNDKSVGIVLIGDWRTELPPKQMLDAAKNLIAFGVFKGYIDPAYKLL Dm PGRP-LB 190 200 210 220 230 240 | | | | | | GHRQVSATACPGDKLFRVLSHMPNFVRT----------------------------------GHRQVRETECPGEALYKEIQTWPHWI---DNPSLEDEVIPVVPLDKEDLKPDPREDSDASLAS GHRQVR+TECPG L+ EI +WPH+ D + PVVP GHRQVRDTECPGGRLFAEISSWPHFTHINDTEGVSSTTAPVVP (210) INF-441 INF-9 250 260 | | ----------------------EDNKIKRHSSTDKEESTSRSIKQ INF-441 INF-9 Figure 13 : Alignement des séquences protéiques des deux PGRP de S. zeamais et du PGRP-LB de D. melanogaster. Les cinq résidus nécessaires à l’activité amidasique qui ont été identifiés chez le lysozyme du phage T7, et qui sont conservés chez les PGRP amidasiques, sont surlignés en bleu. Tollip Une des EST de la banque soustraite, inf-359, présente une homologie très significative avec un régulateur négatif de la voie des “Toll-Like Receptors” identifié chez les mammifères : la protéine Tollip (Burns et al., 2000 ; Zhang et Ghosh, 2002). L’analyse du cadre de lecture ouvert (“Open Reading Frame”, ORF) obtenu par RACE prédit une protéine de 274-aa. La protéine Tollip du charançon présente les deux domaines caractéristiques du Tollip des mammifères, un domaine C2 impliqué dans les interactions avec les phospholipides membranaires (IPR000008) et un domaine C-terminal de liaison à l’ubiquitine (CUE, IPR003892). Aucune séquence signal n’ayant été mise en évidence, la protéine serait cytoplasmique. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 94 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3.2.1.2 Les effecteurs : lysozymes et peptides antibactériens Les lysozymes Deux EST (inf-152 et inf-282) présentant des similitudes de séquence avec des lysozymes ont été identifiées dans la banque soustraite. La première présente une homologie avec les lysozymes de type i caractérisés chez les invertébrés et la seconde, une homologie avec les lysozymes de type c, dont l’un des membres a été caractérisé chez le poulet. L’analyse des ADNc obtenus par RACE montre que le premier code une protéine putative de 178-aa avec un peptide signal et un domaine destabilase (IPR008597) correspondant à une activité peptidase identifiée chez un lysozyme de type i (Zavalova et al., 2000). Ce même domaine est présent chez le lysozyme i1 de A. gambiae. Le second lysozyme de S. zeamais code une protéine de 146-aa, caractérisée par la présence d’un peptide signal et d’un domaine lysozyme caractéristique des lysozymes de type c (IPR000974). Les peptides antibactériens Les coléoptéricines Deux EST (inf-18 et inf-145) de la banque soustraite présentent une homologie avec des membres d’une famille de peptides antibactériens spécifique des coléoptères, les coléoptéricines. L’ADNc obtenu par 5’RACE à partir de l’EST inf-18 possède une ORF de 126-aa. L’EST inf-145 correspond à un ADNc complet avec une ORF de 115-aa. Les deux protéines présentent 40% d’identité et codent un peptide signal et un domaine propeptide (motif RxRR). Les peptides matures de 75-aa et de 67-aa comportent tous les deux un domaine coléoptéricine (IPR009382). La luxuriosine Parmi les EST présentant une homologie avec les peptides antibactériens, inf-479 semble être un homologue de la luxuriosine, un peptide original caractérisé par la présence d’un domaine inhibiteur de protéases (Kunitz, IPR002223). La protéase cible et le rôle de ce peptide, récemment identifié chez le longicorne Acalolepta luxuriosa, n’ont pas encore été caractérisés (Ueda et al., 2005). Chez Sitophilus, le peptide inf-479 correspondrait à un peptide sécrété de 90-aa comportant, comme la luxuriosine, un domaine Kunitz. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 95 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Les défensines L’ADNc obtenu par 5’RACE à partir de l’EST inf-217 est un homologue de la ténécine, un peptide de la famille des défensines. L’ADNc comporte une ORF de 83-aa avec un peptide signal, un propeptide (motif RQKR) et un peptide mature de 44-aa. Les six cystéines impliquées dans les trois ponts disulfures caractéristiques des défensines (IPR001542) sont conservées chez le peptide du charançon. Les autres peptides potentiellement antimicrobiens Dans le cas des EST inf-42, -163 et -165, la séquence complète des ADNc n’apporte pas d’amélioration quant à leur similitude de séquence avec des peptides antibactériens (Tableau V). De plus, aucun domaine de peptide antibactérien connu n’a été identifié lors de l’analyse des séquences par InterProScan. L’ADNc obtenu à partir de l’EST inf-42 présente une ORF de 133-aa constituée d’un peptide signal et d’un propeptide (domaine RQKR). Le peptide mature prédit de 91-aa serait sécrété dans l’hémolymphe. Il est riche en résidus glycine (27,5 %) et pourrait être cationique, puisqu’il possède huit résidus positifs et six résidus négatifs (pI=9,23). En ce qui concerne l’EST inf-163, l’ADNc code un peptide de 69-aa avec une séquence signal. Un motif minimal de clivage (RxxR) a été mis en évidence en combinaison avec une arginine en position P6 (RxxRxR), ce qui pourrait favoriser la coupure du peptide. Dans ce cas, le peptide inf-163 serait sécrété dans l’hémolymphe sous forme d’un peptide mature de 26-aa, riche en résidus glycine (15,4 %). Enfin, l’analyse in silico de l’ADNc obtenu à partir de l’EST inf-165 prédit l’existence d’une protéine de 181-aa avec une séquence signal et un motif RTKR. La protéine mature de 125-aa est, là encore, riche en résidus glycine (20,8 %) et possède onze résidus positifs et seulement huit résidus négatifs (pI=9,35). L’analyse des séquences de ces trois peptides révèle plusieurs caractéristiques des peptides antibactériens en relation avec la structure peptide signal-propeptide-peptide et la richesse en résidus glycine. Toutefois, il n’est pas possible, sur la base de l’analyse in silico, de les classer dans la catégorie des peptides antibactériens. L’étude de leur activité devrait permettre de mieux caractériser ces nouveaux peptides potentiellement antimicrobiens. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 96 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3.2.2 Etude du profil d’expression des GRI Pour confirmer l’induction des GRI suite à une infection bactérienne, j’ai mesuré leur taux de transcrits par RT-PCR quantitative dans les larves aposymbiotiques témoins (non traitées) et dans les larves infectées par E. coli ou par B. megaterium, six heures après l’infection. Le taux de transcrits des GRI a également été mesuré sur des larves piquées par une aiguille stérile pour tester l’effet lié à la blessure provoquée par la piqûre. Au total, 22 EST ont été sélectionnées pour cette analyse (Tableau VI). La spécificité de l’amplification a été testée pour chaque couple d’amorces grâce à la courbe de fusion. Lorsque plusieurs produits de PCR ont été détectés, de nouvelles amorces ont été définies sur d’autres régions des séquences. Ainsi, sur les 22 EST sélectionnées, seuls les transcrits correspondant aux EST inf-475 et inf-258 n’ont pu être quantifiés. L’amplification des ADNc correspondant à l’EST inf-475 ne présentait pas de spécificité malgré plusieurs changements d'amorces, alors que le gène correspondant à l’EST inf-258 ne serait pas suffisamment exprimé pour que le taux de transcrits soit quantifiable. Les résultats obtenus sur les différents échantillons ont été normalisés par l’expression du gène gapdh. Pour l’ensemble des gènes étudiés, les résultats obtenus après l’infection par E. coli et ceux obtenus après l’infection par B. megaterium sont très similaires. Aussi, pour la suite de l’analyse, nous ne considérerons que l’infection par E. coli. Les valeurs des taux de transcrits obtenues dans les différentes conditions expérimentales ont été analysées à l’aide du test non paramétrique de Wilcoxon. Les résultats de cette analyse ainsi que les rapports entre les taux des transcrits mesurés après traitement et le taux de transcrits mesuré dans les larves témoins (taux de base) sont présentés dans le Tableau VI. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 97 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Induction / témoin Peptides antibactériens Lysozymes Thaumatine PGRP Régulateur Protéases et inhibiteurs de protéases Protéase digestive Cytosquelette EST INF-18 INF-42 INF-145 INF-163 INF-165 INF-217 INF-479 INF-152 INF-282 INF-475 INF-9 INF-441 INF-359 INF-20 INF-74 INF-91 INF-258 INF-459 INF-506 INF-515 INF-13 - Protéine Organisme Zophobas atratus Glossina morsitans Acalolepta luxuriosa Drosophila mauritiana Sarcophaga peregrina Tenebrio molitor Acalolepta luxuriosa Coleoptericin Diptericin Acaloleptin Cecropin Sarcotoxin Tenecin-1 Luxuriosin Lysozyme i-1 Lysozyme C Pathogenesis-related-5-like protein PGRP PGRP Anas platyrhynchos Diaprepes abbreviatus Anopheles gambiae Anopheles gambiae Toll-interacting protein IMPI Serpin-4A Cysteine-rich venom-like protein Pattern recognition serine proteinase Hemolymph proteinase 17 PPAF Trypsin-like serine proteinase profilin actin Mus musculus E-value 7,00E-16 0,002 1,00E-15 0,46 0,023 8,00E-14 4,00E-16 3,00E-17 3,00E-25 1,00E-107 2,00E-54 2,00E-41 4,00E-63 Galleria mellonella Manduca sexta Aedes albopictus Manduca sexta Manduca sexta Holotrichia diomphalia Anthonomus grandis Apis mellifera Sitophilus zeamais 2,00E-12 2,00E-21 3,00E-09 5,00E-28 1,00E-10 1,00E-15 3,00E-27 3,00E-30 - Anopheles gambiae SP-AC P80032 Q8WTD5 Q76K70 P81685 P24491 Q27023 Q60FC9 Q6GU90 P00705 Q5I208 Q7PUB3 Q7PP76 Q9QZ06 piqûre stérile piqûre infectée 11,4* > 10* 1,8 1 0,8 9,7* 2,8* 7,8* 7,1* ND 2,3* 7,8* 1,2 86,1* (*) > 300* (*) 43,1* 31,5* 31,6* 314,9* (*) 4,5* 5,2* 5,4* ND 6,7* (*) 11,6* 1,7 Q67FQ9 Q6Q2D8 Q5MIW2 Q69BL0 Q5MPB8 Q9GRW0 Q64ID5 Q6QEJ7 - 2,3* 2,8* 3,4* ND 1,7 2,8* 1,4 0,9 1 3,4* 2,9* 7,5* (*) ND 4,4 2,7* 1,1 0,8 1,3 Tableau VI : Analyse du profil d'expression des EST de la banque soustraite de S. zeamais. Le taux de transcrits correspondant aux différentes EST a été quantifié par RT-PCR quantitative dans des larves aposymbiotiques non traitées (témoins), des larves piquées à l'aide d'une aiguille stérile et des larves piquées à l'aide d'une aiguille infectée par E. coli. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque échantillon et les données ont été normalisées par le taux de transcrits du gène gapdh. Les rapports entre la moyenne du taux de transcrits mesuré dans les larves piquées et la moyenne du taux de transcrits mesuré dans les larves témoins sont donnés dans les deux dernières colonnes. Les moyennes des taux de transcrits mesurés dans les différents échantillons ont été comparées grâce au test non paramétrique de Wilcoxon. Les différences significatives entre les larves témoins et les larves piquées sont indiquées par une astérisque (p<0,05). Les différences significatives entre les larves piquées stérilement et les larves infectées par E. coli sont indiquées par une deuxième astérisque (p<0,05). SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque Swiss-Prot ; ND, non déterminé. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 98 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Tous les peptides antibactériens putatifs, à l’exception de la luxuriosine, sont induits après l’infection par E. coli avec des variations très importantes des taux de transcrits allant de 30 à plus de 300 fois le taux de base. Dans le cas des EST inf-18, inf-42, et inf-217, on observe également une induction à la suite de la blessure occasionnée par la piqûre stérile avec des variations néanmoins plus faibles (10 à 30 fois le taux de base). Les gènes codant la luxuriosine, les lysozymes, les homologues des protéines de la voie prophénoloxydase (inf-506 et inf-74) et de la métalloprotéase (inf-20) sont induits par la blessure, indépendamment de l’infection (2 à 8 fois le taux de base). En ce qui concerne les deux gènes PGRP, ils sont induits par la blessure mais seul le gène correspondant au PGRP1 (inf-9) est induit à la suite de l’infection par E. coli. Enfin, aucune variation significative n’a été observée dans le cas des homologues de Tollip, de deux protéases (inf-459 et inf-515) et des éléments du cytosquelette. 1.3.2.3 Mise en place d’une procédure adaptée à l’analyse des séquences des banques soustraites. A la suite du travail réalisé au cours de la thèse, nous avons été contactés par l’équipe de F. Fleury (Biologie et Biométrie Evolutive, UCBL) qui souhaitait utiliser la technique de PCR soustractive dans leur projet de recherche. Nous avons profité de ces échanges pour développer avec D. Charif (IE, CNRS), une procédure d’analyse de séquences adaptée aux EST des banques soustraites. Cette procédure permet d’éliminer les séquences contaminantes, de séparer les séquences chimères (voir Matériel et Méthodes) et de regrouper en clusters les EST issues d’un même transcrit. Après cette étape, la banque soustraite est constituée par les singletons et par les contigs représentés par les séquences consensus associées aux groupes d’EST. Les séquences des singletons et les séquences consensus sont ensuite comparées aux banques de données pour rechercher des homologies de séquence. Une interface Web, accessible aux deux équipes, a également été développée pour faciliter l’accès à la description de la procédure et des outils informatiques utilisés, ainsi qu’aux résultats de l’analyse des séquences. Une deuxième analyse des banques immunitaires soustraites a donc été réalisée par la procédure mise en place par D. Charif. Dans le cas de la banque soustraite de Sitophilus, le regroupement des EST a permis de réduire le nombre de séquences à 283 avec 226 singletons et 57 contigs correspondant à des regroupements de 2 à 22 séquences. Dans le cas d’A. pisum, les séquences obtenues ont été rassemblées en 425 singletons et 21 contigs, ce qui confirme le manque de redondance de cette banque par rapport à la banque de S. zeamais. Globalement, les deux analyses, indivi- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 99 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte duelle ou après regroupement, ont permis d’obtenir des résultats similaires avec toutefois quelques différences au niveau des EST qui composent les contigs. Ces différences se sont avérées sans conséquence sur le résultat des analyses des banques soustraites. 1.3.2.4 Tentative d’identification des peptides antibactériens par une approche biochimique La plupart des peptides antibactériens d’insectes ont été isolés à partir de l’hémolymphe, par purification par HPLC et mesure in vitro de l’activité antibactérienne. Pour utiliser une telle approche sur les modèles charançon et puceron, où les quantités d’hémolymphe sont faibles, une méthode rapide de collecte en masse d’hémolymphe et d’extraction des peptides à l’acide trifluoroacétique (TFA) a été mise au point au laboratoire BF2I par Y. Rahbé et G. Duport. Parmi les GRI de Sitophilus, trois gènes correspondant aux EST inf-42, inf-163 et inf-165 qui sont surexprimés après l’infection bactérienne pourraient, d’après l’analyse in silico de leur séquence, coder de nouveaux peptides antimicrobiens. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons donc utilisé une approche biochimique pour tenter d’identifier les peptides antimicrobiens du charançon. 1.3.2.4.1 Identification des peptides induits dans l’hémolymphe des larves infectées par E. coli. Afin d’identifier les peptides induits dans l’hémolymphe lors de la réponse immunitaire de l’insecte, les peptides de larves non traitées (témoins) et de larves infectées par E. coli ont été extraits de l’hémolymphe 18 heures après l’infection. Ces peptides ont ensuite été analysés par HPLC et les chromatogrammes obtenus ont été superposés afin d’identifier d’éventuels pics différentiels (Figure 14). Quatre pics, un réprimé et trois induits par l’infection ont ainsi été identifiés de façon reproductible sur les trois répétitions réalisées pour cette étude. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 100 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Figure 14 : Identification des peptides induits par une infection des larves de S. zeamais par E. coli. Les chromatogrammes obtenus à partir des extraits peptidiques de l’hémolymphe de larves témoins (en bleu) et de larves infectées par E. coli 18h après l’infection (en rouge) ont été superposés en fonction du temps de rétention de l’étalon interne (PTU, phénylthiourée). Les pics différentiels sont repérés par des flèches dans l’agrandissement situé dans l’encart en haut à droite du chromatogramme. Nous avons collecté les trois fractions correspondant aux pics induits pour une analyse en spectrométrie de masse. Un spectre de masse a également été réalisé sur un extrait total de peptides de larves infectées. La comparaison des spectres de masse obtenus aux masses prédites in silico n’a pas permis d’établir de correspondance entre les trois pics du chromatogramme et les peptides identifiés par l’expérience de soustraction d’ADNc. En revanche, deux pics du spectre de masse de l’extrait total (7056 et 7567 Da) pourraient correspondre aux masses prédites pour les homologues de la ténécine et d’une coléoptéricine (7063 et 7561 Da, respectivement). L’absence de correspondance, pour les autres peptides, entre les masses prédites et le spectre de masse pourrait s’expliquer soit, au niveau des masses prédites, par des erreurs de prédiction ou des modifications post-traductionnelles, soit au niveau du spectre de masse, par une quantité trop faible des peptides dans l’extrait d’hémolymphe. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 101 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte 1.3.2.4.2 Tests d’activité antibactérienne des extraits d’hémolymphe Test d’activité des extraits totaux d’hémolymphe Les tests d’activité antibactérienne ont été réalisés, dans un premier temps, sur des extraits totaux d’hémolymphe afin de déterminer la quantité d’hémolymphe nécessaire pour détecter une activité antibactérienne. Les tests ont été réalisés sur des quantités extraites à partir de lots de 10 et 50 larves témoins et de lots de 5, 10, 25 et 50 larves infectées. Les échantillons extraits des lots de 5 et 10 larves infectées ne présentaient pas d’activité antibactérienne, probablement à cause des faibles quantités d’hémolymphe obtenues. Pour les échantillons extraits à partir des lots de 25 et 50 larves, nous nous sommes confrontés à des problèmes de turbidité des échantillons qui masquait la croissance bactérienne et donc, la mesure d’activité antibactérienne. Aussi, pour tester l’activité de quantités plus importantes d’hémolymphe, et s’affranchir de ces problèmes de turbidité, nous avons réalisé des tests d’activité sur des fractions HPLC collectées lors de la purification de l’hémolymphe. Test d’activité des fractions obtenues par HPLC Bien que les pics différentiels aient été identifiés de manière reproductible, les différents chromatogrammes réalisés pour cette étude ont montré qu’il existait une variabilité de l’amplitude des pics (Figure 15). Pour le test d’activité, nous avons donc sélectionné les échantillons dont les pics avaient la plus forte amplitude. Figure 15 : Chromatogrammes obtenus à partir d’extraits peptidiques de l’hémolymphe de larves de charançon infectées par E. coli. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 102 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Cinq échantillons d’hémolymphe ont été extraits et purifiés à partir de lots de 25 larves infectées par E. coli, pour avoir, après regroupement des fractions, l’équivalent de 125 larves par fraction. Pour tester spécifiquement les pics différentiels, mais également tous les autres constituants de l’hémolymphe, les fractions ont été collectées toutes les minutes pendant les sept premières minutes, puis, en fonction des pics du chromatogramme entre la septième et la onzième minute, et à nouveau toutes les minutes, jusqu’à la trentième minute (Figure 16). Les résultats obtenus pour le test d’activité de ces fractions sont présentés sur le chromatogramme de la Figure 16. Cinq échantillons d’hémolymphe extraits et purifiés à partir de lots de 25 larves témoins ont été traités en parallèle. L’inhibition de la croissance bactérienne a été observée au niveau des premières (1 à 5 min) et des dernières (12 à 16 min) fractions collectées dans les larves infectées, mais également dans les larves témoins. Cette inhibition serait donc due soit à des artefacts liés à l’expérimentation, soit à des peptides synthétisés constitutivement. Aucune activité antibactérienne n’a, en revanche, été observée sur les fractions correspondant aux trois pics induits par l’infection bactérienne. Ceci est peut-être dû à des quantités trop faibles de peptides. Toutefois, il est également possible que les pics différentiels ne correspondent pas à des peptides antibactériens mais à d’autres peptides présents dans l’hémolymphe en réponse à l’infection bactérienne. Il pourrait notamment s’agir de produits libérés à la suite du clivage d’un précurseur de la réponse immunitaire. Bien que nous n’ayons pas pu confirmer l’activité antibactérienne des trois peptides correspondant aux EST inf-42, inf-163 et inf-165, cette étude nous a permis de détecter une activité antibactérienne dans des fractions de l’hémolymphe. Nos conditions chromatographiques ne permettant pas de séparer les composés de ces fractions, une nouvelle mise au point devrait donc être envisagée pour séparer ces composés. Nous pourrons ainsi identifier les composés qui sont responsables de l’activité antibactérienne observée et déterminer s’il s’agit, ou non, d’un artefact. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 103 Résultats : Identification des gènes de la réponse immunitaire de l’hôte Figure 16 : Test d’activité antibactérienne des fractions d’hémolymphe de larves infectées par E. coli. Cinq extraits peptidiques de l’hémolymphe de 25 larves infectées par E. coli ont été séparés par HPLC. Les fractions ont été collectées toutes les minutes ou en fonction du chromatogramme, puis regroupées pour les tests d’activité. Une activité antibactérienne a été détectée pour les fractions collectées entre 1 et 5 minutes et entre 12 et 16 minutes. Une activité antibactérienne a également été observée pour les fractions correspondantes des larves témoins. PTU, phénylthiourée. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 104 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais 2. Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Après avoir identifié les gènes de la réponse humorale activée par les bactéries Gram (-) chez S. zeamais, je me suis intéressée à leur régulation dans le bactériome larvaire, en présence des bactéries symbiotiques. Cette étude avait notamment pour but de déterminer si des gènes impliqués dans l’élimination des bactéries, comme les peptides antibactériens et les lysozymes, étaient exprimés dans le bactériome du charançon. Parmi les gènes identifiés, un intérêt particulier a été accordé au gène PGRP1 qui est surexprimé dans le bactériome larvaire (Heddi et al., 2005), et qui appartient à une famille de gènes très diversifiés de par leur(s) fonction(s) dans la réponse immunitaire innée (Dziarski, 2004 ; Steiner, 2004 ; Bischoff et al., 2006 ; Zaidman-Remy et al., 2006). 2.1 Expression des GRI de Sitophilus zeamais dans le bactériome larvaire Dans cette partie, le taux de transcrits de chacun des 20 gènes étudiés précédemment (Tableau VI) a été mesuré dans le bactériome larvaire et a ensuite été comparé au taux de transcrits des larves aposymbiotiques à l’aide du test non paramétrique de Wilcoxon. Les valeurs moyennes obtenues après normalisation des données ainsi que les différences significatives entre les taux de transcrits sont présentées dans la Figure 17. Cette analyse révèle que de nombreux homologues putatifs des peptides antibactériens (inf-145, -163, -165 et inf-217), ainsi que celui de l’inhibiteur de métalloprotéase (inf-20), ne présentent pas de différence d’expression significative entre les larves aposymbiotiques et les bactériomes. En revanche, les lysozymes (inf-152 et inf-282), le PGRP2 (inf-441), l’homologue du gène luxuriosine (inf-479) et les homologues putatifs des protéases et des inhibiteurs de protéases (inf-506, -74, -91, -459 et inf-515) sont sous-exprimés, voire non-exprimés, dans le bactériome. Une sousexpression inattendue des éléments du cytosquelette (inf-13 et β-actine) a également été mise en évidence. Enfin, parmi tous les gènes étudiés, trois seulement sont surexprimés dans le bactériome : le gène coléoptéricine (inf-18 ; 10 fois), le gène PGRP1 (inf-9 ; 39 fois) déjà identifié dans la banque soustraite du bactériome et l’homologue de Tollip (inf-359 ; 9,5 fois). ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 105 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Figure 17 : Quantification du taux de transcrits dans les larves aposymbiotiques et dans les bactériomes larvaires chez S. zeamais. La mesure du taux de transcrits correspond à la moyenne de trois répétitions. Les erreurs-types sont représentées par les barres d’erreur. Les différences significatives par rapport au témoin (p<0,05) sont signalées par une astérisque. Les gènes surexprimés dans le bactériome larvaire sont indiqués par une flèche (voir Tableau VI pour l’identification des EST). 2.2 Caractérisation moléculaire du gène PGRP1 Parmi les trois gènes surexprimés dans le bactériome, le gène PGRP1 est le seul gène qui est induit par les bactéries Gram (-), et qui coderait une protéine cytoplasmique (§ 1.3.2.). La protéine PGRP1 serait donc potentiellement en contact avec les endocytobiotes et pourrait jouer un rôle direct dans la perception de ces derniers. 2.2.1 Expression du gène PGRP1 en relation avec la densité bactérienne. Pour approcher l’hypothèse selon laquelle le gène PGRP1 serait impliqué dans la perception des endocytobiotes et la régulation de la réponse immunitaire dans le bactériome, j’ai dans un premier temps étudié la régulation de son expression en relation avec la densité bactérienne (Anselme et al., 2006). Pour cela, j’ai infecté des larves de charançons aposymbiotiques avec deux souches bactériennes sélectionnées en fonction des résultats obtenus chez D. melanogaster : une souche non pathogène d’E. coli qui est rapidement éliminée par l’insecte, et une souche pathogène de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) qui se multiplie rapidement dans l’insecte et qui tue la drosophile en moins de 18 h (Fauvarque et al., 2002). Pour chacune des deux souches bactériennes, nous avons mesuré la croissance bacté- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 106 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais rienne in larva et le taux de transcrits PGRP1 après différents temps d’infection. 2.2.1.1 Mesure de la croissance bactérienne dans les larves La densité in larva de chacune des deux souches bactériennes, a été estimée à partir du nombre de colonies (cfu) formées sur boîte après l’étalement d’un broyat de larves infectées. Dans le cas de larves aposymbiotiques témoins non infectées, aucune colonie n’a été observée sur boîte. Ceci est en accord avec des travaux réalisés au laboratoire qui ont conclu à l’absence de bactéries dans le tube digestif des larves (Nardon, communication personnelle). Les larves ont été infectées par des bactéries en phase de croissance exponentielle pour permettre une activation plus rapide des systèmes de virulence bactériens. Cependant, devant l’incapacité de la souche d’E. coli à infecter l’hôte dans ces conditions, les infections par E. coli ont été réalisées avec un culot de bactéries obtenu à partir d’une culture d’une nuit, pour augmenter le nombre de bactéries. Les résultats obtenus dans ces conditions sont présentés dans la Figure 18. Deux heures après l’infection, le nombre de colonies par larve est supérieur pour E. coli par rapport à P. aeruginosa, ce qui est cohérent avec la différence de concentration des solutions bactériennes utilisées pour l’infection des larves. Le nombre d’E. coli reste ensuite constant pendant toute la durée de l’expérimentation avec, toutefois, une légère diminution entre 12 h et 24 h. En revanche, la bactérie P. aeruginosa prolifère rapidement dans la larve avec un nombre de colonies multiplié par près de 10 4 entre 2 h et 24 h. Figure 18 : Croissance bactérienne mesurée dans les larves aposymbiotiques infectées par E. coli et P. aeruginosa. La densité bactérienne a été estimée par le nombre de colonies (cfu) formées sur boîte après l’étalement d’un broyat de larves infectées. Les mesures ont été effectuées 2, 6, 12 et 24 h après l’infection. Les valeurs correspondent à la moyenne de deux répétitions. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 107 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais L’ensemble de ces résultats suggère que la capacité d’infection de la souche PAO1 de P. aeruginosa est bien supérieure à celle de la souche non pathogène d’E. coli. Toutefois, on notera que le taux de survie des larves infectées par PAO1 est semblable au taux de survie obtenu après une piqûre stérile, pour la durée de l’expérimentation. Cette bactérie serait donc moins pathogène pour le charançon que pour la drosophile. 2.2.1.2 Etude de l’expression du gène PGRP1 Le taux de transcrits du gène PGRP1 a été mesuré par la technique de Northern blot dans des larves aposymbiotiques non traitées (contrôle) et des larves piquées à l’aide d’une aiguille stérile ou d’une aiguille infectée par E. coli ou P. aeruginosa. Les variations dans le temps du taux de transcrits ont été analysées en effectuant des mesures 1, 2, 6 ou 12 h après la piqûre. Les membranes réalisées dans cette expérimentation sont présentées dans la Figure 19-A. Pour chaque échantillon, l’intensité du signal radioactif obtenu a été corrigée par rapport au bruit de fond et normalisée par l’intensité du signal obtenu avec la β-actine. Une normalisation inter-membranes a ensuite été réalisée à l’aide d’un échantillon calibrateur. Les résultats obtenus par cette démarche (Figure 19-B) indiquent clairement une variation du taux de transcrits PGRP1 différente pour chaque traitement, ce qui traduit une interaction entre le facteur temps et le facteur traitement. Afin de prendre en compte cette interaction, les résultats ont été analysés par des tests paramétriques. La confirmation de la significativité de l’interaction par une ANOVA (p<3,5×10-8 ) a conduit à une analyse des effets simples (analyse de l’effet d’un facteur pour chaque modalité de l’autre facteur). Les premiers résultats ne montrent aucune différence significative entre les échantillons une heure après traitement (p=0,80). L’effet du traitement n’est donc visible que pour des temps d’incubation de plus de deux heures. Concernant la variation du taux de transcrits dans le temps, celui-ci reste constant dans les larves non traitées (p=0,13) et les larves piquées stérilement (p=0,15). En revanche, il augmente jusqu’à 5,5 fois après l’infection par E. coli (p=1,7×10 -6 ) et jusqu’à 8,5 fois après l’infection par P. aeruginosa (p=3,7×10 -11). D’après un test de comparaison de Dunnett utilisant le taux de transcrits estimé une heure après l’infection comme référence, le taux de transcrits estimé douze heures après l’infection par E. coli n’est plus significativement différent du taux de base. En revanche, ce même test reste significatif douze heures après l’infection par P. aeruginosa. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 108 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Figure 19 : Quantification du taux de transcrits PGRP1 chez les larves aposymbiotiques. A) Membranes de Northern blot hybridées avec les sondes obtenues à partir de l’ADNc des transcrits PGRP1 et β-actine. Cal, calibrateur ; C, contrôle (larves non traitées) ; S, piqûre stérile ; E, piqûre infectée par E. coli ; P, piqûre infectée par P. aeruginosa. Trois répétitions (1, 2 et 3) ont été réalisées pour chaque échantillon. Les ARN ont été extraits des larves 1, 2, 6 et 12 h après traitement. B) Taux de transcrits PGRP1 normalisé par le taux de transcrits β-actine. Les valeurs correspondent à la moyenne de trois répétitions. Les écarts-types sont représentés par les barres d’erreur. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 109 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Quelle que soit la souche bactérienne utilisée, le gène PGRP1 est donc induit par l’infection. Toutefois, une différence entre les souches est visible au niveau de la variation du taux de transcrits dans le temps. Dans le cas de l’infection par E. coli, le taux de transcrits décroît après six heures d’infection et retrouve, après douze heures, le taux de transcrits mesuré en l’absence d’infection. Suite à l’infection par P. aeruginosa, en revanche, le taux de transcrits augmente encore après six heures d’infection pour atteindre, à douze heures, la valeur maximale obtenue dans cette expérimentation. L’analyse conjointe des résultats de la croissance bactérienne in larva (Figure 18) et du taux de transcrits PGRP1 (Figure 19) après un temps d’infection donné, suggère donc que l’expression du gène PGRP1 est régulée en fonction de la densité bactérienne (Anselme et al., 2006). 2.2.2 Expression du gène PGRP1 au cours de développement de l’insecte En mesurant l’expression des gènes inv/spa du SSTT de SZPE au cours du développement du charançon, Dale et al. (2002) ont mis en évidence une forte induction des gènes du SSTT au stade nymphal. Ce résultat suggère un changement dans la physiologie bactérienne, et donc dans l’interaction hôte-symbiote au cours de la métamorphose. Aussi, pour déterminer si ce changement a des conséquences sur la réponse immunitaire de l’hôte, nous avons étudié l’expression du gène PGRP1 à différentes étapes du développement de l’insecte. 2.2.2.1 Expression du gène PGRP1 à différents stades de développement de l’hôte Le taux de transcrits PGRP1 a été quantifié par PCR en temps réel chez les individus apo- et symbiotiques dans les ovocytes, les embryons de trois jours (lors de la formation du bactériome), les larves du quatrième et dernier stade, les nymphes au moment de la transition du bactériome larvaire aux bactériomes des cæcums mésentériques, et enfin, dans les adultes âgés de plus de trois semaines qui sont dépourvus de bactériomes des cæcums mésentériques. Les résultats obtenus après normalisation des données sont présentés dans la Figure 20. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 110 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Figure 20 : Quantification du taux de transcrits dans les insectes apo- et symbiotiques. La mesure du taux de transcrits correspond à la moyenne de trois répétitions. Les écarts-types sont représentés par les barres d’erreur. Les différences significatives entre les insectes apo- et symbiotiques (p<0,05) sont signalées par les astérisques. On constate tout d’abord un taux important de transcrits dans les ovocytes, indépendamment du statut symbiotique de l’insecte. Ces transcrits seraient d’origine maternelle et seraient exprimés dans les ovocytes pour assurer une fonction dans le développement et/ou l’immunité de l’embryon avant la mise en place de son propre système immunitaire. Par une analyse des effets simples, la comparaison entre les individus apo- et symbiotiques montre que le stade nymphal est le seul stade, parmi ceux considérés, qui présente une différence significative des taux de transcrits (p=2,12×10-5 ). A titre de remarque, il faut signaler que malgré la surexpression du gène PGRP1 dans le bactériome des larves symbiotiques, aucune différence significative n’est observée au stade larvaire entre les individus apo- et symbiotiques. Ceci est probablement dû à une faible représentation des transcrits du bactériome par rapport aux transcrits de la larve, et donc à une dilution de ces transcrits. 2.2.2.2 Externalisation des endocytobiotes au stade nymphal La surexpression du gène PGRP1 au stade nymphal chez l’insecte coïncide avec la surexpression, au même stade, des gènes du SSTT inv/spa de la bactérie symbiotique (Dale et al., 2002). Une des hypothèses qui peut expliquer l’induction simultanée d’un gène immunitaire de l’hôte et de gènes bactériens impliqués dans l’invasion cellulaire est la présence de bactéries libres dans la nymphe. Afin de vérifier cette hypothèse, des expériences de ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 111 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais FISH ont été réalisées sur des nymphes pour localiser les symbiotes et compléter les études histologiques menées précédemment au laboratoire sur les autres stades de développement (Figure 21). Figure 21 : Etude histologique par FISH de la localisation des endocytobiotes au cours du développement de S. zeamais. Coupes d’embryons âgés de 30 minutes (1), six heures (2), trois jours (3) et de larves de premier stade âgées de quatre jours (4), marquées au DAPI (en bleu). (5), (6) et (7) correspondent aux agrandissements des zones signalées par des flèches dans les images 1, 2, et 3, respectivement, et la visualisation de la sonde spécifique de SZPE (en rouge). (8) larve du quatrième stade, (9, 10, 11) nymphes, (12) fin du stade nymphal, (13) jeunes adultes. cc, capsule céphalique ; bl, bactériome larvaire ; mb, migration bactérienne ; ab, agrégat bactérien ; b, bactériocyte ; l, lumen ; ta, tissu adipeux ; bm, bactériome des cæcums mésentériques, PA, pôle antérieur ; PP, pôle postérieur. Dans les premières heures après la ponte, les endocytobiotes sont concentrés au niveau du pôle postérieur des ovocytes et des jeunes embryons (Figure 21-1 et 21-5). Six-sept heures après la ponte, la segmentation de l’embryon commence (Figure 21-2) et les symbiotes débutent leur migration vers la partie centrale de l’embryon (Figure 21-6) où ils forment un agrégat, au troisième jour de développement, juste avant l’apparition du bactériome (Figure 21-3 et 21-7). A partir du quatrième jour et jusqu’au dernier stade larvaire, le bactériome est parfaitement structuré et il est intimement accolé à l’intestin, à la jonction intestin antérieur- intestin moyen (Figure 21-8). Jusqu’à ce stade, aucun symbiote n’a été mis évidence en dehors des bactériocytes. En revanche, lorsque le bactériome larvaire se dissocie au début de la nymphose, les symbiotes sont visibles en dehors des bactériocytes (Figure 21-9 et 21-10). Par la suite, les bactéries ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 112 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais libres sont moins nombreuses et les bactériocytes sont alignés le long de l’intestin évoquant la migration bactériocytaire de l’ancien bactériome larvaire vers les cæcums mésentériques (Figure 21-11). A la fin de la métamorphose, les bactériocytes se regroupent pour former les bactériomes des cæcums mésentériques chez les jeunes adultes, et tous les symbiotes sont à nouveau intracellulaires. 2.2.3 Epissage alternatif du gène PGRP1 Pour poursuivre la caractérisation du gène PGRP1 et aborder sa fonction, nous avons exprimé la protéine dans un système hétérologue pour obtenir des anticorps, et étudier l’activité amidasique prédite sur la base de la séquence protéique. Au cours du clonage du transcrit PGRP1, deux fragments d’ADN ont été amplifiés par PCR (Figure 22). Ces derniers ont été clonés et séquencés. Les deux produits de PCR correspondent à deux transcrits PGRP1 de 789 et 903 pb, respectivement, qui ne diffèrent qu’au niveau d’une séquence de 114 pb située en amont du domaine PGRP dans le transcrit de 903 pb (Figure 23). Ceci suggère l’existence d’un épissage alternatif du gène PGRP1 et pour tester cette hypothèse, le séquençage du gène et l’analyse de ces deux transcrits ont été réalisés. Figure 22 : Gel d’électrophorèse des produits de l’amplification de l’ADNc du gène PGRP1. (M) Marqueur de tailles, (1) Produit de PCR, (2) et (3) Produits de purification sur gel des deux fragments de PCR. La PCR a été réalisée sur les ADNc du bactériome, avec des amorces situées de part et d’autre de la séquence codante de l’ADNc obtenu à partir de l’EST inf-9. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 113 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais 5’-ATGTCCAGTA AGCAATCACG GTCGATAGTA CCCACGTGCG AGTGTAAGTT CGAAAAAATG ^||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 5’-ATGTCCAGTA 60 AGCAATCACG GTCGATAGTA CCCACGTGCG AGTGTAAGTT CGAAAAAATG 60 61 GAAGAAAATG AAGAGAAAAG AGTTGAATTA AATATAG |||||||?|| ?||||||||? |||||||||| ||||||| 61 GAAGAAATTG GAGAGAAAAA AGTTGAATTA AATATAGTAC CCCAGGTTGC TCCACATTAC 97 120 121 CCCCAGAATT CCTGGAGGAG TTTATTAACA AAATCAAGAA TAATTCTAAT TGTGACAGTG 180 98 TTGCGAACA GCTTCGTATG TACAGACCCG ||||||||| |||||||||| |||||||||| 181 TTAGTCATCG CAGTCATCAT ATGTGCAACA TTTGCGAACA GCTTCGTATG TACAGACCCG 126 127 GAAATAGTTA CGAGGGACGA ATGGGGTGCC AAACCACCCA CGGGCGTGGA AAACTTAACT |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 241 GAAATAGTTA CGAGGGACGA ATGGGGTGCC AAACCACCCA CGGGCGTGGA AAACTTAACT 186 187 CTACCAGTCC CTTACGTCGT CATACACCAC AGTTATATAC CTGCAGCTTG TTCAACAAAA |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |?|||||||| |||||||||| 301 CTACCAGTCC CTTACGTCGT CATACACCAC AGTTATATAC CCGCAGCTTG TTCAACAAAA 246 247 GAGGAATGTA TAAATGACAT GCAATGGATG CAAAACTATC ATCAACAAAA TAATTCATGG |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 361 GAGGAATGTA TAAATGACAT GCAATGGATG CAAAACTATC ATCAACAAAA TAATTCATGG 306 307 TGCGATATTG GATATAATTT CGCTGTTGGA GGGGACAACA GAATTTACGT TGGACGAGGT |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 421 TGCGATATTG GATATAATTT CGCTGTTGGA GGGGACAACA GAATTTACGT TGGACGAGGT 366 367 TGGACAGCTG TAGGAGCCCA CGCTCCCCGT TACAATGCCA GAAGCATTGG AATCGTCCTG |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 481 TGGACAGCTG TAGGAGCCCA CGCTCCCCGT TACAATGCCA GAAGCATTGG AATCGTCCTG 426 427 ATAGGAGATT GGACAGAAAT ATTACCTCCA GAGAGTCAAA TGTTAGCAGC AAAACAATTG |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||?|| 541 ATAGGAGATT GGACAGAAAT ATTACCTCCA GAGAGTCAAA TGTTAGCAGC AAAACAACTG 486 487 ATTAATATGG GAATCAGAGA CGGCTATATA AGTGAAAACT ACAAATTAAT TGGTCATAGG |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||?|||||| 601 ATTAATATGG GAATCAGAGA CGGCTATATA AGTGAAAACT ACAAATTAAT TGGGCATAGG 546 547 CAAGTCCGAG AAACAGAATG TCCAGGAGAA GCATTATATA AGGAGATCCA AACGTGGCCT |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |?|||||||| |||||||||| 661 CAAGTCCGAG AAACAGAATG TCCAGGAGAA GCATTATATA AAGAGATCCA AACGTGGCCT 606 607 CACTGGATAG ACAACCCCAG CCTCGAGGAC GAGGTCATTC CTGTAGTACC TCTAGACAAA |||||||||| ||||?||?|| ||||||?||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 721 CACTGGATAG ACAATCCTAG CCTCGACGAC GAGGTCATTC CTGTAGTACC TCTAGACAAA 666 667 GAAGACCTTA AACCAGATCC CAGAGAGGAT TCTGATGCCA GCTTGGCATC TGAAGATAAT |||||||||| |||||||||| |||||||||| ||||?|||?| |||||||||| |||||||||| 781 GAAGACCTTA AACCAGATCC CAGAGAGGAT TCTGGTGCTA GCTTGGCATC TGAAGATAAT 726 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 727 AAAATTAAAC GACATAGTTC TACAGACAAA GAGGAAAGTA CGTCGAGGAG TATAAAACAG |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| |||||||||| 841 AAAATTAAAC GACATAGTTC TACAGACAAA GAGGAAAGTA CGTCGAGGAG TATAAAACAG 786 787 TAA-3’ ||| 789 901 TAA-3’ 903 900 Figure 23 : Alignement des séquences des fragments de 789 pb (en noir) et de 903 pb (en bleu) obtenus lors de l’amplification de la séquence codante du gène PGRP1. L’alignement au niveau de la séquence codante du domaine PGRP est indiqué en rouge. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 114 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais 2.2.3.1 Séquençage du gène PGRP1 Le séquençage du gène PGRP1 de S. zeamais a été réalisé par deux approches différentes (Figure 24). Une approche par longues PCR, à partir d’amorces définies sur la séquence des transcrits, et une approche de marche sur le chromosome qui permet de réduire la taille des fragments de PCR par l’utilisation d’enzymes de restriction et d’adaptateurs. Figure 24 : Epissage alternatif du gène PGRP1 de S. zeamais. Le gène (représenté en haut) a été séquencé à partir de fragments d’ADNg obtenus par longue PCR et “Genome Walking” (GW). La taille des introns (traits) et des exons (rectangles) est donnée en nombre de paires de bases. Le séquençage de l’intron 2 n’a pas été achevé. Les deux transcrits obtenus par l’épissage alternatif du gène sont représentés au-dessous du gène. Les longues PCR ont été réalisées en testant différentes combinaisons d’amorces, différentes températures d’hybridation, et enfin différentes polymérases. La plupart des fragments d’ADN ont été amplifiés grâce aux polymérases et aux différents milieux réactionnels du kit “Expand long template PCR system” (Roche applied science). Les premières longues PCR ont d’abord permis d’obtenir les séquences des introns 1, 3 et 4 de 1224, 392 et 3020 pb, respectivement, et de confirmer l’épissage alternatif du gène en obtenant le début de la séquence de l’intron 2 (Figure 24). Toutefois, le produit de PCR de 5518 pb correspondant à la fin de l’exon 2 et au début de l’intron 2 a été amplifié suite à une hybridation aspécifique de l’amorce anti-sens dans l’intron 2. D’autres amorces ont ensuite été définies à partir de cette séquence mais l’approche par longues PCR s’est avérée inefficace pour obtenir la fin de l’intron 2. Grâce à l’utilisation d’une seule amorce spécifique, sens ou antisens, définie aux extrémités des exons 1, 2 et 3, la marche sur le chromo- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 115 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais some a permis d’obtenir une séquence de 1153 pb en amont du codon initiateur des transcrits et de progresser dans le séquençage de l’intron 2. La séquence obtenue à partir de l’extrémité 5’ de l’exon 3 a permis d’obtenir les 1497 dernières paires de bases de l’intron 2 (Figure 24). En ce qui concerne la séquence de 2223 pb obtenue à partir de l’extrémité 3’ de l’exon 2, une comparaison avec la séquence obtenue par longue PCR a révélé de nombreuses différences entre ces deux séquences. Ces différences correspondent non seulement à des substitutions ou des insertions/délétions ponctuelles mais également à des insertions/délétions de fragments plus importants. Si la taille de ces fragments est en général de 20 à 30 pb, il existe des insertions/délétions de plusieurs centaines de nucléotides pouvant aller jusqu’à 700 pb. Le cumul des insertions/délétions aboutit à une différence de près de 2 kb entre les deux séquences. Le séquençage de l’intron 2 a ensuite nécessité la définition des amorces au niveau de séquences non codantes du gène, séquences riches en bases AT. Les PCR réalisées avec ces amorces se sont révélées vaines, quelle que soit l’approche utilisée. Le séquençage du gène n’a donc pas été achevé, mais le but de ce travail a toutefois été atteint puisque l’épissage alternatif du gène est confirmé. Par ailleurs, l’analyse de l’exon 2 révèle que la séquence de 114 pb code une région aux propriétés transmembranaires (Méthode SOPMA ; Geourjon et Deleage, 1995). Sur la base des séquences nucléotidiques, l’épissage alternatif du gène conduit donc à deux protéines qui auraient des localisations cellulaires différentes, une protéine PGRP intracellulaire et une protéine PGRP transmembranaire. 2.2.3.2 Quantification des deux transcrits alternatifs du gène PGRP1 Dans les études précédentes de l’expression du gène PGRP1, les amorces utilisées pour les expériences de PCR quantitative ont été définies, en aval de l’exon 2, sur une région commune aux deux transcrits PGRP1. Dans ces conditions, aucune distinction entre les deux transcrits alternatifs ne pouvait être faite lors de la quantification du taux de transcrits du gène PGRP1. La surexpression de ce gène dans les larves infectées, le bactériome et les nymphes symbiotiques a donc été reconsidérée pour différencier les deux transcrits, et déterminer s’il existe une régulation au niveau de l’épissage du gène. Pour cela, une nouvelle amorce a été définie au niveau de l’exon 2 pour permettre la quantification spécifique du transcrit de 903 pb. Pour chaque échantillon, nous avons quantifié, comme précédemment, la totalité des transcrits PGRP1, et nous avons également quantifié spécifiquement le transcrit de 903 pb en utilisant l’amorce située dans l’exon 2. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 116 Résultats : Symbiose et immunité chez Sitophilus zeamais Les résultats obtenus dans ces conditions sont présentés dans la Figure 25. A la suite de l’infection bactérienne, le taux du transcrit de 903 pb reste relativement constant alors que le taux de la somme des transcrits est multiplié 5,4 fois, ce qui suggère une augmentation du taux du transcrit de 789 pb. Dans le bactériome, en revanche, la surexpression du gène PGRP1 se traduit par une accumulation du transcrit de 903 pb. Enfin, au niveau du stade nymphal, c’est également le transcrit de 903 pb qui est majoritairement représenté dans les nymphes symbiotiques. Il semble donc que la régulation de l’épissage du gène PGRP1 soit en faveur du transcrit de 903 pb en présence des endocytobiotes mais du transcrit de 789 pb en cas d’infection par E. coli. Figure 25 : Quantification du taux des transcrits PGRP. Le taux des transcrits PGRP1 et le taux du transcrit de 903 pb ont été mesurés, par RT-PCR quantitative, dans les larves non traitées (Témoins), les larves infectées par E. coli, dans le bactériome et dans les nymphes aposymbiotiques (ApoSym) et les nymphes symbiotiques (Sym). La mesure du taux de transcrits correspond à la moyenne de trois répétitions. Les écarts-types sont représentés par les barres d’erreur. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 117 Discussion ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 118 Discussion L’étude de l’interaction moléculaire hôte-symbiote menée au laboratoire BF2I sur le modèle Sitophilus-SPE a mis en évidence la surexpression d’un gène immunitaire de la famille des PGRP dans le bactériome (Heddi et al., 2005). Par ailleurs, les études du transcriptome des bactériocytes du puceron menées par l’équipe de T. Fukatsu ont révélé la surexpression d’un lysozyme, un autre gène de la réponse immunitaire (Nakabachi et al., 2005). Etant donné les fonctions des homologues de ces gènes chez d’autres insectes, leur surexpression dans l’organe symbiotique du charançon et du puceron suscite de nombreuses interrogations sur la persistance des bactéries, mais également sur le rôle de cette réponse immunitaire dans les bactériocytes. Au cours de ma thèse, j’ai entrepris l’étude des aspects immunitaires de l’interaction hôte-symbiote chez les insectes, pour aborder les questions de la régulation de la population bactérienne dans les bactériocytes, et du rôle de la réponse immunitaire dans le maintien de la symbiose intracellulaire. Pour étudier ces aspects et les intégrer dans le processus évolutif des bactéries intracellulaires, une étude comparative a été initiée entre les modèles S. zeamais-SZPE et A. pisum-Buchnera. 1 La réponse immunitaire de l’hôte aux bactéries Gram (-) La première étape de cette étude a consisté à identifier les gènes de la réponse immunitaire (GRI) du charançon et du puceron. En raison de l’absence de séquences génomiques, j’ai utilisé une approche de soustraction d’ADNc pour identifier les gènes surexprimés après une infection des larves par E. coli. L’objectif de ce travail n’était pas d’étudier la réponse immunitaire de ces insectes, mais d’identifier des gènes de la réponse humorale induits par les bactéries Gram (-) afin d’étudier ensuite leur profil d’expression dans le bactériome, et leur rôle éventuel dans la symbiose intracellulaire. Grâce à la comparaison des séquences des banques soustraites aux bases de données protéiques, j’ai identifié chez S. zeamais une vingtaine d’EST présentant des similitudes de séquence avec des GRI décrits chez d’autres insectes. Pour confirmer l’expression différentielle des EST et identifier les GRI, au-delà de la simple similitude de séquence, j’ai analysé la banque soustraite par la technique de macroarray. J’ai ainsi confirmé l’expression différentielle de nombreuses EST et identifié des EST qui pourraient correspondre à des peptides ou à des protéines spécifiques de la ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 119 Discussion réponse immunitaire du charançon (§ 1.3.1.1 et 1.3.2.1.2). Toutefois, le caractère différentiel de toutes les EST n’a pas pu être analysé car cette technique ne semble pas être bien adaptée aux transcrits faiblement exprimés et/ou lorsque le différentiel est faible, du fait notamment de l’encombrement stérique des signaux sur la membrane. Aussi, pour exploiter pleinement la banque soustraite, une seconde analyse globale devrait être réalisée avec la technique de Reverse Northern (Heddi et al., 2005). Cette technique permet de séparer les produits de PCR par électrophorèse avant leur transfert sur membranes. Cette séparation permettrait ainsi de diminuer l’encombrement des signaux sur la membrane et d’analyser l’ensemble des EST. Si la soustraction a permis l’identification des GRI de S. zeamais, les résultats de l’analyse de la banque soustraite d’A. pisum soulèvent, en revanche, quelques questions. Aucune EST de cette banque ne présente de similitude avec des gènes codant des récepteurs, des peptides antibactériens, des lysozymes ou des éléments de la cascade prophénoloxidase. De plus, la faible redondance des EST dans la banque d’A. pisum, et l’absence d’EST nettement différentielle mise en évidence par l’analyse par macroarray, suggèrent un manque d’efficacité de la soustraction. Ceci pourrait s’expliquer simplement par un problème technique au cours d’une des étapes de la soustraction, mais il est aussi possible que l’approche soustractive ne soit pas adaptée au modèle biologique. En effet, lorsque la différence entre les transcriptomes des deux conditions étudiées est faible, les gènes cibles sont peu représentés dans la banque soustraite. Ainsi, si la réponse immunitaire du puceron à l’infection par E. coli implique des gènes exprimés constitutivement, ou faiblement induits, les GRI ne peuvent être obtenus par une approche soustractive. Par ailleurs, il faut noter que la réponse immunitaire du puceron est actuellement méconnue car il semble qu’il existe peu d’homologie entre les protéines immunitaires du puceron (homoptère) et celles de diptères ou de lépidoptères ; les pucerons étant phylogénétiquement très éloignés de ces ordres d’insectes (300 MA environ). En effet, seuls un lysozyme de type i (Nakabachi et al., 2005) et un peptide antifongique (Megourine, swiss-prot P83417-9), qui ne présente aucune similitude avec une autre protéine d’insecte, ont jusqu’à présent été identifiés chez les Aphididae. De plus, chez A. pisum, les EST de l’IAGC comprennent 59% de séquences orphelines et aucun homologue de gènes de la réponse immunitaire n’a été identifié, ni parmi ces EST, ni parmi les EST d’une banque de tube digestif infecté par Erwinia chrysanthemi (Y. Rahbé, communication personnelle). Les défenses immunitaires du puceron pourraient donc être assurées par des voies différentes de celles décrites, jus- ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 120 Discussion qu’à présent, dans d’autres modèles. Le séquençage complet du génome du puceron devrait permettre de confirmer ou infirmer cette hypothèse. Quelle qu’en soit la cause, technique ou biologique, la soustraction chez A. pisum n’a pas permis d’identifier les GRI du puceron. Les aspects comparatifs de la réponse immunitaire de l’hôte en relation avec la l’évolution du génomes des endocytobiotes n’ont donc pas pu être abordés, mais cette banque d’EST nous aura tout de même permis d’obtenir de nouvelles séquences d’A. pisum, absentes des EST séquencées par le consortium international. Dans le cadre de cette thèse, l’étude des aspects immunitaires de l’interaction hôte-symbiote a donc été recentrée sur le modèle S. zeamais-SZPE. A l’issue de la soustraction menée chez le charançon, nous disposions d’un ensemble d’EST correspondant à des gènes induits suite à la piqûre des larves par une aiguille infectée par E. coli. Les GRI pouvant être induits par la blessure provoquée par la piqûre et/ou par l’infection bactérienne, j’ai étudié plus précisément le profil d’expression des GRI du charançon. En effet, pour aborder l’hypothèse d’une éventuelle induction des GRI par l’endocytobiote SZPE dans le bactériome, il était nécessaire de distinguer dans un premier temps, parmi les GRI identifiés, les gènes induits par les bactéries Gram (-). Pour cette analyse, notre choix s’est porté sur la technique de PCR quantitative, et nous avons donc dû recentrer notre étude sur une vingtaine de gènes candidats. La sélection de ces gènes pouvait être guidée par l’homologie des EST et/ou par les résultats de l’analyse globale par macroarray. Nous avons cependant choisi de limiter cette première étude aux gènes présentant une homologie, même faible, à des GRI d’autres insectes. Nous avons ainsi confirmé que tous les GRI sélectionnés étaient bien surexprimés dans les larves six heures après la blessure et/ou l’infection par E. coli, à l’exception des EST inf-515 et inf-459. Toutefois, les EST de la banque soustraite ayant été obtenues en considérant des temps post-infection de trois, six et douze heures, l’absence d’induction de ces deux gènes doit encore être vérifiée par une quantification des taux de transcrits trois et douze heures après l’infection. L’analyse des taux de transcrits des larves piquées stérilement et des larves infectées nous a ensuite permis de définir deux catégories de gènes : ceux qui étaient induits par l’altération des tissus indépendamment de l’infection, comme les lysozymes (inf-152, -282), le PGRP2 (inf-441) et les homologues putatifs des protéases et des inhibiteurs de protéases (inf-20, -74, -91, -479 et inf-506), et ceux qui étaient induits par E. coli ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 121 Discussion comme les peptides antibactériens putatifs (inf- 18, -42, -145, -163, -165 et inf-217) et le PGRP1 (inf-9). Pour compléter l’étude du profil d’expression des GRI de S. zeamais, nous avions également choisi de mesurer leur taux de transcrits après une infection par une bactérie Gram (+) puisque la réponse immunitaire varie en fonction des microorganismes infectants (Hoffmann, 2003). Notre choix s’était alors porté sur une souche de Bacillus megaterium, une bactérie non pathogène, qui pouvait être manipulée dans notre laboratoire. Cependant, lorsque nous avons choisi cette souche, il n’avait pas encore été montré que l’induction différentielle des voies Toll et Imd était liée au type de peptidoglycane bactérien (Leulier et al., 2003). En accord avec les résultats décrits chez la drosophile, nous n’avons obtenu aucune différence significative entre l’infection par E. coli et l’infection par B. megaterium qui possède un PGN de type DAP comme les bactéries Gram (-). Ceci suggère que, si le charançon met effectivement en place une réponse adaptée au type de bactérie, la reconnaissance de ces bactéries se ferait également au niveau du type de PGN. La confirmation de cette hypothèse nécessiterait une étude du profil d’expression des GRI en réponse à une infection par une bactérie possédant un PGN de type Lysine. Cette première partie de la thèse avait pour objectif principal d’identifier les GRI de S. zeamais. Un ensemble de gènes homologues de GRI décrits dans d’autres modèles a été obtenu et la caractérisation du profil d’expression de ces gènes a permis de déterminer ceux qui étaient induits par les bactéries Gram (-). Grâce à ce travail, j’ai donc pu aborder la seconde partie de la thèse sur les aspects immunitaires de l’interaction hôtesymbiote, dans le modèle S. zeamais, par l’étude de la réponse immunitaire de l’hôte en présence des endocytobiotes. 2 2.1 La réponse immunitaire de S. zeamais aux bactéries symbiotiques Réponse immunitaire et maintien de la symbiose dans le bactériome L’analyse de l’expression des gènes de la réponse immunitaire de S. zeamais dans le bactériome a confirmé la surexpression du gène PGRP1 et a révélé la surexpression de deux autres gènes : un peptide antibactérien de la famille des coléoptéricines et un homologue d’un inhibiteur de la voie des TLR des mammifères nommé Tollip. Cette analyse met donc en évidence l’existence d’une réponse immunitaire dans l’organe symbiotique du ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 122 Discussion charançon, avec la surexpression notamment d’un peptide antibactérien. Toutefois, il s’agit d’une réponse modérée en comparaison de la réponse observée à la suite d’une infection par E. coli. En effet, en dehors de la coléoptéricine, les peptides antibactériens induits chez la larve par E. coli ne sont pas induits dans le bactériome. A titre de remarque, en accord avec leur profil d’expression, les GRI induits par l’altération des tissus provoquée par la piqûre, et non par les bactéries Gram (-), sont sous-exprimés voire non-exprimés dans le bactériome. Une des questions suscitées par la mise en évidence de la surexpression de trois gènes de la réponse immunitaire dans le bactériome, concerne la régulation de ces gènes. En effet, dans les épithéliums qui, comme le bactériome, sont en contact permanent avec des microorganismes, il a été montré que les gènes impliqués dans la réponse immunitaire locale pouvaient être exprimés constitutivement ou être induits par ces microorganismes (Ferrandon et al., 1998 ; Tzou et al., 2000 ; Werner et al., 2000 ; Ryu et al., 2004 ; Bischoff et al., 2006 ; Zaidman-Remy et al., 2006). Aussi, la question se pose de savoir si les gènes surexprimés dans le bactériome sont induits par les endocytobiotes ou s’il s’agit d’une expression constitutive. Dans le cas de l’homologue du gène Tollip, nous avons montré que, contrairement aux gènes coléoptéricine et PGRP1, ce gène n’est pas induit par une infection des larves aposymbiotiques par E. coli ou par B. megaterium. Par ailleurs, Tollip est exprimé constitutivement chez la souris (Burns et al., 2000 ; Li et al., 2004 ; Didierlaurent et al., 2006). Il est donc probable que l’homologue du gène Tollip soit exprimé constitutivement dans le bactériome du charançon. Dans le cas de la coléoptéricine et du PGRP1, en revanche, il est plus difficile de privilégier l’une ou l’autre de ces hypothèses au vu des données dont nous disposons. Pour déterminer si l’expression des GRI dans le bactériome est induite ou constitutive, l’approche la plus appropriée serait de comparer leur taux de transcrits entre les bactériomes de larves symbiotiques et les bactériomes vides de larves aposymbiotiques. Cette approche reste toutefois délicate car les souches aposymbiotiques sont généralement dépourvues de bactériome (§ 1.3.2.1). De plus, les bactériomes vides présents dans une souche obtenue récemment au laboratoire sont fragiles et de taille très réduite. Ils sont, de ce fait, difficiles à isoler en quantité suffisante pour une étude par RT-PCR quantitative. Une alternative à la PCR quantitative et à la dissection des bactériomes vides, serait d’utiliser des approches d’hybridation in situ sur des coupes de larves aposymbiotiques pour déterminer si ces gènes s’expriment dans le bactériome vide. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 123 Discussion Une question sous-jacente à l’hypothèse d’une induction des gènes coléoptéricine et PGRP1 dans le bactériome, consiste à savoir si les endocytobiotes sont perçus ou non par l’hôte. Pour tenter de répondre à cette question, nous avons quantifié le taux de transcrits des GRI dans les larves aposymbiotiques après une “infection” par SZPE, pour déterminer si ces gènes sont induits par le symbiote. Aucune différence significative n’a été observée entre le taux de transcrits obtenu après une piqûre stérile et celui obtenu après une piqûre infectée par SZPE. Toutefois, nous ne pouvons pas conclure à la non induction des GRI sans vérifier l’efficacité de “l’infection” par une mesure de la densité bactérienne dans les larves. En effet, l’absence d’induction des GRI pourrait s’expliquer par une quantité trop faible de bactéries qui n’arriveraient pas à se multiplier à l’intérieur de la larve. Cette dernière hypothèse semble être confirmée par les résultats obtenus lors de l’étude du stade nymphal, qui seront discutés plus loin et qui suggèrent l’induction d’une réponse immunitaire de l’hôte par les symbiotes. La réponse immunitaire observée dans le bactériome pourrait donc être constitutive et/ou induite par les endocytobiotes, notamment en cas de risque d’invasion des autres tissus de l’insecte par l'endocytobiote. Dans ce cas, l’induction dans le bactériome impliquerait alors l’existence d’un récepteur intracellulaire, comme le PGRP-LE de la drosophile (Kaneko et al., 2006) ou encore les récepteurs “Nucleotide-binding Oligomerization Domain proteins” (NOD) décrits chez les mammifères (Strober et al., 2006). En ce qui concerne le rôle de la réponse immunitaire dans les bactériomes, nous ne pouvons que spéculer, dans l’état actuel de nos connaissances, sur la fonction des trois gènes surexprimés dans cet organe en fonction des données obtenues sur leurs homologues. Il est toutefois important de garder à l’esprit que, dans le contexte symbiotique, la réponse immunitaire de Sitophilus pourrait impliquer des processus spécifiques en relation avec la localisation intracellulaire des symbiotes. Le gène Tollip Tollip est une protéine des voies de signalisation immunitaire situées en aval des récepteurs membranaires IL-1RI (“Interleukin-1 Receptor type I”), TLR2 et TLR4 (“Toll-Like Receptors”). Elle est décrite comme un inhibiteur de la réponse immunitaire innée des mammifères, car sa surexpression conduit à une inhibition de l’activation de ces voies (Burns et al., 2000 ; Zhang et Ghosh, 2002). En l’absence de stimulation, Tollip inhiberait l’activité de la protéine “Interleukin-1 Receptor Associated Kinase-1” (IRAK-1), une kinase nécessaire à la transduction du signal aboutissant à ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 124 Discussion l’activation de la voie NF-κB (Croston et al., 1995). Il a été suggéré que Tollip pourrait permettre d’une part, de maintenir les cellules immunitaires en état de quiescence en absence d’infection, et d’autre part, de faciliter la terminaison de la réaction immunitaire (Zhang et Ghosh, 2002). Toutefois, le mécanisme d’action de cette protéine n’a pas encore été caractérisé, et les résultats obtenus chez des souris déficientes pour le gène Tollip suggèrent une fonction beaucoup plus complexe de ce gène (Didierlaurent et al., 2006). L’absence de Tollip résulte en une atténuation de la production de l’IL-6 et du TNF-α, ce qui suggère que cette protéine régulerait la magnitude de la réponse inflammatoire. La concentration cellulaire de Tollip pourrait donc jouer un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire (Didierlaurent et al., 2006). Chez les insectes, la recherche de similitude de séquences révèle l’existence d’homologues de Tollip chez Anopheles gambiae (sp Q7QAN1, identité : 83/166), Tribolium castaneum (gb XM_970075.1, identité : 138/273), Apis mellifera (gb XM_624414, identité : 117/222) et donc chez S. zeamais (inf-359), mais pas chez D. melanogaster. Par ailleurs, Burns et al. (2000) ont constaté l’absence d’interaction entre la protéine Tollip de la souris et un homologue de la kinase IRAK chez la drosophile : la protéine Pelle (Hoffmann, 2003). Les auteurs suggèrent que la protéine Tollip pourrait assurer une fonction équivalente au domaine C-terminal inhibiteur du récepteur Toll de la drosophile, qui est absent des TLR (Shen et Manley, 1998). Ceci pourrait alors expliquer l’absence d’homologue de Tollip chez cet insecte. Compte tenu de l’ensemble de ces données, la surexpression d’un homologue de Tollip dans le bactériome de S. zeamais pourrait assurer une inhibition de l’activation de la réponse immunitaire, voire une régulation fine de cette réponse. Le gène coléoptéricine Les coléoptéricines sont des peptides antibactériens d’environ 70 résidus, qui sont riches en résidus glycine, et qui sont spécifiques des coléoptères (Bulet et al., 1991 ; Lee et al., 1994 ; Yang et al., 1998 ; Imamura et al., 1999 ; Sagisaka et al., 2001). L’activité antibactérienne anti-Gram (-) ou anti-Gram (+) de ces peptides est variable. La plupart sont actifs contre les bactéries Gram (-), mais la rhinocérosine d’Oryctes rhinoceros présente également une activité antibactérienne anti-Gram (+) (Yang et al., 1998). Dans le cas de la coléoptéricine d’ Allomyrina dichotoma, il a même été montré que ce peptide présente une forte activité antibactérienne anti-Gram (+), mais qu’il inhibe la division bactérienne d’E. coli (Sagisaka et al., 2001). Les bactéries se présentent alors sous forme de chaînettes qui ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 125 Discussion rappelle les observations faites sur les endocytobiotes du charançon (Figure 26). Si la coléoptéricine du charançon possède une activité semblable à celle de la coléoptéricine d’A. dichotoma, sa surexpression dans le bactériome pourrait alors expliquer en partie le pleïomorphisme des endocytobiotes observé chez Sitophilus spp. Ce peptide pourrait inhiber la division des endocytobiotes et assurer ainsi une forme de contrôle de la population bactérienne. Bien sûr, il ne s’agit là que de spéculations dans l’attente d’une étude fonctionnelle de la coléoptéricine du charançon. D’après l’analyse in silico de sa séquence, la coléoptéricine serait sécrétée en dehors des bactériocytes, et ne serait donc pas en contact avec les endocytobiotes. Néanmoins, comme cela a été mis en évidence au stade nymphal, il est possible que des endocytobiotes se retrouvent à l’extérieur des bactériocytes. La coléoptéricine pourrait alors prévenir l’invasion des tissus environnants en éliminant ces symbiotes, ce qui expliquerait qu’aucun symbiote ne soit détecté en dehors des bactériocytes chez la larve. La coléoptéricine pourrait alors permettre à l’hôte de contrôler la localisation des symbiotes. Figure 26 : Morphologie d’E. coli avant et après traitement par la coléoptéricine d’A. dichotoma (en haut) et morphologie des endocytobiotes de Sitophilus spp. (en bas) . Observation en microscopie à contraste de phase d’une culture d’une nuit d’E. coli en l’absence (a) et en présence de la coléoptéricine d’A. dichotoma (1µg/50µl) (b), d’après Sagisaka et al. (2001). Coloration de Gram des endocytobiotes de S. zeamais (c) et S. oryzae (d). Le gène PGRP La famille des PGRP comporte une grande variété d’isoformes et de fonctions. Certains PGRP sont des activateurs de la réponse immunitaire alors que d’autres sont, au contraire, des régulateurs négatifs de cette réponse, par le biais d’une activité amidasique. L’homologue du PGRP1 du charançon chez la drosophile, le PGRP-LB, est l’un de ces régulateurs négatifs (Zaidman-Remy et al., 2006). Les études menées sur ce PGRP et le ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 126 Discussion PGRP-SC1/2, un autre PGRP amidasique de la drosophile, ont montré que l’activité enzymatique de ces PGRP diminue l’immunogénicité du PGN bactérien, régulant ainsi négativement la réponse immunitaire (Bischoff et al., 2006 ; Zaidman-Remy et al., 2006). Principalement exprimés dans l’intestin, où l’épithélium est en contact permanent avec la flore bactérienne, ces PGRP pourraient limiter l’activation de la réponse immunitaire de l’hôte. Le PGRP1 du charançon, comme le PGRP-LB de la drosophile, a conservé les résidus nécessaires à l’activité amidasique et pourrait donc cliver les PGN bactériens. Ces prédictions ont récemment été confirmées 3 par des mesures d’activité enzymatique sur la protéine PGRP1 produite dans un système hétérologue bactérien. Aussi, le modèle proposé par Zaidman-Remy et al. (2006) pour expliquer le rôle du PGRP-LB dans la régulation de la réponse locale de l’intestin chez la drosophile (Figure 8) pourrait s’appliquer au PGRP1 du charançon. Le PGRP1 pourrait, via la dégradation du PGN de SZPE, moduler la réponse immunitaire de l’hôte dans les bactériocytes et assurer le maintien de la symbiose chez le charançon. Cette régulation serait d’autant plus efficace que le gène PGRP1 est régulé en fonction de la densité bactérienne (Figure 18 et Figure 19). Toutefois, l’épissage alternatif du gène PGRP1, la localisation prédite in silico des deux protéines PGRP et la localisation intracellulaire des symbiotes suscitent un grand nombre d’interrogations. L’étude de l’expression du gène PGRP1 a montré que le transcrit de 789 pb, codant une amidase intracellulaire, est induit par l’infection bactérienne des larves aposymbiotiques. Ceci suggère que la protéine codée par ce transcrit ait un rôle dans la réponse immunitaire du charançon, indépendamment de la symbiose. Toutefois, pour assurer ce rôle, la protéine devrait être présente dans l’hémolymphe. Il est donc probable que la protéine soit sécrétée à la suite d’une infection bactérienne, par un processus qu’il reste à déterminer. Dans le bactériome, en revanche, la protéine PGRP1 intracellulaire serait en contact direct avec SZPE, et pourrait donc dégrader le PGN libéré par les endocytobiotes. Toutefois, la prévention de l’activation de la réponse immunitaire par le PGN d’une bactérie intracellulaire, implique l’existence d’un récepteur intracellulaire ou encore que le PGN puisse traverser la membrane cellulaire. Ces deux hypothèses n’ont pas encore été vérifiées. Par ailleurs, la forme intracellulaire ne serait pas majoritaire dans 3 L’étude de l’activité amidasique de la protéine PGRP du charançon est réalisée par Mireille Hervé à l’Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire Cellulaire, à Orsay, dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de Dominique Mengin-Lecreulx. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 127 Discussion le bactériome si l’on se réfère aux résultats obtenus par RT-PCR quantitative (Figure 25). En effet, dans cet organe, l’épissage du gène PGRP1 génère le transcrit de 903 pb, qui code une amidase dont la localisation transmembranaire suscite un certain nombre de questions. Il est peu probable que ce PGRP soit un récepteur car aucun élément n’a été obtenu en ce sens lors de l’analyse in silico. Dans ce cas, quel rôle joue la localisation membranaire du PGRP en relation avec l’activité amidasique ? Le domaine PGRP est-il intra- ou extracellulaire ? D’après les prédictions in silico, ce domaine serait extracellulaire. Il ne serait donc pas impliqué dans la perception des symbiotes à l’intérieur des bactériocytes. Des données supplémentaires sont donc nécessaires pour émettre une hypothèse sur la fonction du PGRP transmembranaire, et sur son rôle dans la symbiose du charançon. 2.2 Externalisation des endocytobiotes et activation de la réponse immunitaire de l’hôte au stade nymphal Parallèlement aux travaux de Dale et al. (2002) qui ont mis en évidence au stade nymphal une induction des gènes du SSTT inv/spa, nous avons observé la surexpression, à ce stade, du gène PGRP1. Des résultats préliminaires, non présentés dans cette thèse, suggèrent également une expression différentielle entre les nymphes symbiotiques et aposymbiotiques, de la coléoptéricine (jusqu’à 15 fois) et des peptides potentiellement antibactériens, inf-163 et inf-165 (jusqu’à 5 fois). Puisque la taille du bactériome n’augmente pas au-delà du dernier stade larvaire et que l’expression des gènes du bactériome n’est pas perceptible au niveau de la comparaison des larves apo- et symbiotiques (Figure 20), la surexpression des GRI dans les nymphes symbiotiques serait due à l’activation de la réponse immunitaire de l’hôte. Des expériences d’hybridation in situ permettraient de déterminer s’il s’agit d’une réponse locale, dans le bactériome, et/ou d’une réponse systémique. Parallèlement à l’induction des GRI de S. zeamais et des gènes inv/spa de SZPE au stade nymphal, nous avons également mis en évidence, par les expériences de FISH, la présence de symbiotes en dehors des bactériocytes, ce qui n’avait jamais été décrit chez Sitophilus. Bien que nous ne puissions exclure un rôle actif de SZPE, il est probable que la libération des endocytobiotes soit liée à la dissociation du bactériome larvaire, et à la lyse de quelques bactériocytes, au cours des réarrangements cellulaires pendant la métamorphose. L’expression des GRI de S. zeamais et des gènes du SSTT de SZPE serait alors la conséquence de la libération des endocytobiotes. Il semble donc que l’hôte perçoive les symbiotes en dehors des bactériocytes, ce que nous n’avions pas pu mettre en évidence par des expériences d’infection des larves aposymbiotiques par SZPE. Les GRI de l’insecte ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 128 Discussion seraient alors exprimés pour éliminer les symbiotes libres. La surexpression des gènes du SSTT des symbiotes, quant à elle, pourrait être interprétée comme un changement physiologique des bactéries qui leur permettrait de réinfecter de nouvelles cellules de l’hôte. Dans ce cas, la formation des bactériomes des cæcums mésentériques chez l’adulte ne serait pas seulement due à la migration des bactériocytes larvaires (Nardon et Nardon, 1998), mais pourrait impliquer des phénomènes de réinfection cellulaire. Par ailleurs, l’induction des gènes du SSTT de SZPE, au stade nymphal uniquement, suggère que l’expression des gènes impliqués dans l’invasion cellulaire est réprimée dans les bactériocytes larvaires. Cette répression pourrait être due à un système de régulation bactérien à deux composantes impliqué dans la perception du milieu environnant (comme le système PhoPQ) qui permettrait à la bactérie de déterminer sa localisation cellulaire et de moduler, en fonction, l’expression des gènes du SSTT. Ainsi, lorsque SZPE est libéré dans l’hémolymphe au stade nymphal, les gènes du SSTT s’expriment pour permettre à SZPE de réinfecter une nouvelle cellule. Bien que cette hypothèse paraisse vraisemblable, il n’est pas exclu que l’hôte puisse inhiber les gènes de virulence bactériens. Leur induction au stade nymphal serait alors due à une levée de l’inhibition à la suite de la libération des symbiotes. 2.3 Une réponse immunitaire spécifique Avant la mise en évidence d’un épissage alternatif du gène PGRP1, la surexpression de ce gène dans le bactériome larvaire avait été considérée comme une réponse immunitaire de l’hôte, semblable à celle observée après une infection bactérienne (Heddi et al., 2005). La quantification du taux des deux transcrits alternatifs par RT-PCR quantitative montre que le gène est surexprimé sous la forme d’un transcrit de 903 pb dans le bactériome alors que c’est le transcrit de 789 pb qui est épissé à la suite d’une infections des larves par E. coli ou B. megaterium (Figure 25). La réponse immunitaire de l’hôte dans l’organe symbiotique serait donc différente de celle observée après une infection bactérienne. Bien que le rôle de ces deux transcrits ne soit pas encore élucidé, deux hypothèses pourraient expliquer cette différence. La première serait qu’il existe un mécanisme de régulation au niveau de l’épissage du gène PGRP1 qui produit le transcrit de 903 pb dans les bactériocytes, et le transcrit de 789 pb dans les autres cellules immunocompétentes. La réponse immunitaire observée dans les bactériocytes serait alors tissu-spécifique. La seconde hypothèse repose sur l’existence d’une réponse immunitaire spécifique aux symbiotes, à travers une régulation de l’épissage du gène PGRP1 qui privilégierait le transcrit de 903 pb en présence de SZPE. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 129 Discussion Pour déterminer quel type de régulation est à l’origine de la réponse observée dans le bactériome, il faudrait déterminer quel transcrit est épissé par les cellules immunocompétentes lors d’une “infection” par SZPE. Les expériences de RT-PCR quantitative et de FISH ont mis en évidence l’induction du transcrit PGRP1 de 903 pb au stade nymphal, où des symbiotes sont présents en dehors des bactériocytes. L’étude de ce stade par des approches d’hybridation in situ permettrait de déterminer si le transcrit de 903 pb est épissé uniquement dans les bactériocytes (réponse locale), ou s’il est épissé dans d’autres cellules immunocompétentes à la suite de la libération des symbiotes. L’existence de deux transcrits PGRP1, l’un épissé dans la réponse aux infections bactériennes, et l’autre épissé spécifiquement dans la réponse aux symbiotes (bactériome larvaire et stade nymphal), suggère que l’épissage alternatif du gène PGRP1 constitue une forme d’adaptation de la réponse immunitaire du charançon au maintien de la symbiose. Les études histologique (immunolocalisation) et fonctionnelle (test d’activité, RNAi) menées actuellement au laboratoire devraient permettre de caractériser le rôle des deux protéines codées par le gène PGRP1 dans la réponse immunitaire aux bactéries symbiotiques intracellulaires. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 130 Conclusion ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 131 Conclusion L’immunité est un domaine qui est resté longtemps négligé chez les insectes en comparaison de l’intérêt porté aux modèles de vertébrés. Cependant, depuis une dizaine d’années, ce domaine a connu un développement considérable chez les insectes, notamment grâce aux données apportées par les travaux de génétique menés chez la drosophile et par le séquençage du génome complet de cet insecte. Ces données ont révélé l’existence de nombreuses familles de gènes de la réponse immunitaire souvent conservées chez les mammifères, ce qui a engendré un intérêt grandissant pour la caractérisation de la fonction de ces gènes. Chez les insectes symbiotiques, les premières évidences de l’implication de l’immunité dans la perception et le contrôle des endocytobiotes n’ont été publiées que très récemment (Heddi et al., 2005 ; Nakabachi et al., 2005). En effet, très peu de travaux ont été consacrés aux aspects immunitaires de la symbiose bactérienne intracellulaire des insectes. Ceci est probablement dû à une conception qui consiste à séparer les bactéries mutualistes des bactéries pathogènes. Pourtant, la proximité phylogénétique des endocytobiotes avec des bactéries parasites ou pathogènes étaye l’hypothèse d’une origine “pathogène” de ces bactéries mutualistes (Charles et al., 2001 ; Dale et al., 2002 ; Lefèvre et al., 2004), et les données cellulaires et moléculaires récentes montrent que les interactions hôtebactérie, qu’elles soient pathogènes ou mutualistes, impliquent des gènes et des voies cellulaires très similaires. L’étude menée au cours de cette thèse a permis d’identifier les gènes de la réponse immunitaire du charançon, et a mis en évidence l’existence d’une réponse immunitaire de l’hôte dans l’organe symbiotique, le bactériome. Toutefois, cette réponse ne correspond pas à la réponse immunitaire observée chez les larves, à la suite d’une infection bactérienne. Les premiers résultats de ce travail suggèrent donc l’existence d’une réponse immunitaire spécifique dans le bactériome, avec la surexpression d’un seul peptide antibactérien, une coléoptéricine, d’un homologue de Tollip, et surtout la surexpression et l’épissage alternatif du gène PGRP1. La coléoptéricine pourrait prévenir l’invasion de l’hôte par les symbiotes, et les gènes PGRP1 et Tollip auraient quand à eux un rôle immunomodulateur qui permettrait de modérer la réponse immunitaire dans l’organe symbiotique. Enfin, l’épissage spécifique d’un des deux transcrits du gène PGRP1 dans la réponse aux symbiotes suggère que l’épissage de ce gène constitue une forme d’adaptation de la réponse immunitaire dans le contexte symbiotique. La fonction des trois gènes surexprimés dans le bactériome reste cependant spéculative et de nombreux aspects de la réponse immunitaire doivent encore être caractérisés (réponse induite ou constitutive, spécificité ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 132 Conclusion liée à l’organe ou à l’endocytobiote...). Les travaux menés au laboratoire devraient permettre, par des approches fonctionnelles (RNAi, test d’activité) et histologiques (hybridation in situ, immunolocalisation), de tester les différentes hypothèses formulées dans cette thèse. Cette première étude des aspects immunitaires de l’interaction hôte-symbiote chez le charançon apporte des éléments en faveur d’une adaptation de la réponse immunitaire de l’hôte au maintien de la symbiose intracellulaire. Ces éléments suggèrent notamment que la différenciation du bactériome ne permet pas simplement d’isoler les endocytobiotes du système immunitaire de l’insecte mais que cet organe possède une réponse immunitaire adaptée à ces bactéries symbiotiques. L’existence de cette réponse ouvre de nouvelles perspectives quant aux mécanismes qui pourraient assurer le contrôle des endocytobiotes dans le bactériome, mais également l’élimination de ces derniers dans les bactériomes des cæcums mésentériques des adultes âgés de plus de trois semaines et dans la lignée germinale mâle, un phénomène qui demeure encore méconnu. L’intérêt du modèle charançon, par rapport à d’autres modèles comme celui du puceron, tient au fait que SPE n’a intégré la symbiose intracellulaire que depuis 25 MA, probablement suite à un remplacement de symbiote (Lefèvre et al., 2004). SPE possède des structures similaires aux bactéries libres, notamment en ce qui concerne la paroi bactérienne (reconnaissance par les PRR) et le système de sécrétion de type III (invasion cellulaire). Les résultats obtenus dans ce modèle devraient permettre de comprendre les aspects immunitaires impliqués dans les phases précoces de l’interaction hôte-symbiote. Une des questions qui reste posée concerne l’évolution de la réponse immunitaire de l’hôte parallèlement à la dégénérescence du génome des endocytobiotes qui engendre des modifications profondes dans la structure de la paroi bactérienne et dans les modes de transmission et d’invasion cellulaire. Il serait alors intéressant de mener une étude comparative entre le modèle S. zeamais-SZPE et un autre modèle appartenant au clade ancestral des Dryophthoridae, où l’endocytobiote (Candidatus Nardonella) aurait intégré la symbiose il y a près de 100 MA (Lefèvre et al., 2004). Chez le puceron, dont la symbiose remonte à 150-200 MA, une réponse immunitaire semble subsister dans les bactériocytes avec la surexpression d’un lysozyme dont la fonction, en relation avec la symbiose, reste encore à caractériser (Nakabachi et al., 2005). Pour déterminer si la différence observée entre le modèle puceron et le modèle charançon est due à l’absence, chez Buchnera, de système de sécrétion (excepté peut être le système flagellaire) et de certains constituants de la paroi bactérienne (LPS et phospholipides), nous avions abordé une étude comparative entre ces ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 133 Conclusion deux modèles. Cependant, en l’absence d’homologues de gènes de la réponse immunitaire décrits chez les insectes holométaboles, comme les peptides antibactériens ou les PGRP, une étude comparative qui inclurait le modèle puceron semble difficilement envisageable. En effet, la différence observée entre le puceron et le charançon pourrait être due à une différence dans les gènes de la réponse immunitaire de l’insecte. Dès lors, il serait plus judicieux de considérer pour une étude comparative des modèles de symbiose primaire chez des insectes holométaboles, comme les diptères ou les coléoptères, où des gènes homologues interviennent dans la réponse immunitaire de l’hôte. Par ailleurs, il serait intéressant d’envisager une étude de la réponse immunitaire des insectes holométaboles en présence de Buchnera afin de déterminer si la dégénérescence du génome du symbiote altère sa perception par le système immunitaire de l’hôte. Cette étude nous permettrait ainsi de savoir si la réponse observée dans les bactériocytes du puceron est liée au système immunitaire de l’insecte ou aux caractéristiques de l’endocytobiote. Les éléments apportés par ce travail de thèse suggèrent que la réponse immunitaire ne se limite pas à un ensemble de processus permettant à l’hôte d’éliminer les microorganismes. Cette définition trop réductrice qui semblait incompatible avec le maintien de la symbiose, à moins que le symbiote n’échappe au système immunitaire de l’hôte, est probablement responsable du faible nombre d’études consacrées aux aspects immunitaires de la symbiose chez les insectes. Comme le suggérait A. Paillot, déjà en 1933, la symbiose devrait être considérée comme une infection bactérienne non pathogène qui résulte d’un “équilibre” entre la réponse immunitaire de l’hôte et la virulence du symbiote. Les notions d’immunité et de virulence ne devraient alors pas être restreintes à une conception où la fonction des gènes impliqués dans ces processus se limiterait à l’élimination des bactéries et à l’envahissement de l’hôte, respectivement. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 134 Références bibliographiques ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 135 Références bibliographiques Akman, L., Yamashita, A., Watanabe, H., Oshima, K., Shiba, T., Hattori, M. and Aksoy, S. (2002) Genome sequence of the endocellular obligate symbiont of tsetse flies, Wigglesworthia glossinidia. Nat Genet. 32: 402-407. Aksoy, S. (2000) Tsetse - A haven for microorganisms. Parasitology today. 16: 114-118. Anselme, C., Vallier, A., Balmand, S., Fauvarque, M.O. and Heddi, A. (2006) Host PGRP gene expression and bacterial release in endosymbiosis of the weevil Sitophilus zeamais. Appl Environ Microbiol. 72: 6766-6772. Basset, A., Khush, R.S., Braun, A., Gardan, L., Boccard, F., Hoffmann, J.A. and Lemaitre, B. (2000) The phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora infects Drosophila and activates an immune response. 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ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 148 Annexes Annexes Annexe I Tableau A-I : Amorces utilisées pour l’obtention des séquences complètes des ADNc (RACE). Les amorces GSP1 et GSP2 ont été utilisées pour l’obtention des séquences en 5’ et 3’ des EST, respectivement. L’amorce 441-GSPN2 a été utilisée lors de la seconde PCR (voir Matériel et Méthodes). Amorce Inf-9-GSP1 Séquence (5’ - 3’) TGTTTCTCGGACTTGCCTATGACC Inf-9-GSP2 CTCTACCAGTCCCTTACGTCGTC Inf-18-GSP1 GCCATTGATGTTCTTGCCCCAGC Inf-18-GSP2 TGGGAGGTAAGACCAGACCTGTC Inf-42-GSP1 CCAACACGTTTGTCACCGGTGTG Inf-152-GSP2 GGACGCCAGTCAGGTGACTCTAC Inf-165-GSP1 CGTGGTCAGCACCAACGCCCAAA Inf-165-GSP2 CATCACCTCGACGGTTCTGGCTA Inf-217-GSP1 AATGGGCCGCACAAGCTGAATCG Inf-282-GSP1 GAGAATTCCGTAGTCGCCGGTCT Inf-359-GSP2 CACCTACGGACCCTAATGGTGGC Inf-441-GSP1 CCCAACCCTTCTGGTCCATGTGG Inf-441-GSP2 CCTTCTGCTGCACAGTTGACGGC Inf-441-GSPN2 CAGCAACTGCCTGCCCTGGTGAC Inf-479-GSP2 GGGTCTCACGGCGAATACAGAGAC ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 150 Annexes Annexe II Tableau A-II : Amorces utilisées dans les expériences de PCR quantitative. Amorce 5’inf-9 Séquence (5’- 3’) Amorce Séquence (5’- 3’) ATAATTTCGCTGTTGGAGGG 5’inf-165 AGTCACAAAGGAACAATTTTGG 3’inf-9 TCTCGGACTTGCCTATGACC 3’inf-165 AGAAGCCGTCACGTCCGTTC 5’inf-13 GAAGAGGTGAGGATGTCCT 5’inf-217 ACGCTGTAGTGATAAGTGCA 3’inf-13 ACATGAGTTGGCAGGATTAC 3’inf-217 CACACGTACAGGTCCTTCT 5’inf-18 GAATAGATACAACGGGGGTCA 5’inf-282 GCGGGGAAAAAAAGTGGCGTA 3’inf-18 CTACCATCTGACACTTCCTC 3’inf-282 CCATCGGGATTGTGGTTTTTAG 5’inf-20 ACCCTGGACCTAACGATCC 5’inf-359 AAGAGCGACGCAATAGGGT 3’inf-20 TACTGCTACAAACGAACATTG 3’inf-359 CATTAGGGTCCGTAGGTGT 5’inf-42 TCAGGATGAAGATGGCCAAG 5’inf-441 TGCAAGGCCTGCCCTTAGT 3’inf-42 ACACTGGTACTCTGGCATCT 3’inf-441 GTGCCATCTCCTCCAATCAT 5’inf-74 TCTGTTGTATGGCATTCCGA 5’inf-459 CAACAAATCCAGACGAGCC 3’inf-74 AGCGCTTGAAGTATCGAACT 3’inf-459 ACCACCGCATAGCCATCG 5’inf-91 GATCGGTATACTTCAGCGAA 5’inf-479 ACCTTCACGACCCACACAT 3’inf-91 AACGCATCTACCAGTTCTGT 3’inf-479 GTCATACGATACGTTTTCAGT 5’inf-145 TCGGCATCCCCTAATCCAGAC 5’inf-506 CAATCGTTTATGGTCAGGAC 3’inf-145 CTACCAGCGGATGGCGCCACC 3’inf-506 GGAATTCCACAACAAACGTC 5’inf-152 CTCTCCGTCACCTCGTGTTAT 5’inf-515 GGTTCGAACGCCGTCAGA 3’inf-152 TCCTGCTCGTTCTTTGTCAT 3’inf-515 TCACGGAGATGTCGTTAGC 5’inf-163 GTCCTGTTAGTTGTGGCAGTA Actine-for CAACTTCCCTAGAAAAGAGC 3’inf-163 TTATCTTCCAGGCACCAATCC Actine-rev TTCCTTCTGCATCCTGTCGG PGRP-903-For TTACCCCAGGTTGCTCCAC PGRP-903-Rev ATTGCATGTCATTTATACATTCCTC ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 151 Annexes Annexe III Figure A-1 : Membranes de Dot-blot comportant les EST des banques soustraites de S. zeamais (A) et d’A. pisum (B). Chaque membrane, réalisée en double exemplaire, comporte un témoin négatif correspondant à une amplification réalisée en absence d’ADN (en rouge) et un témoin de normalisation (gapdh, en bleu). Les membranes du haut ont été hybridées avec une sonde obtenue à partir des larves témoins (T) et celles du bas, avec une sonde obtenue à partir des larves piquées par une aiguille infectée par E. coli (i). Chaque dépôt correspond à un volume fixe de 10 µl et seules les comparaisons intermembranes sont possibles. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 152 Annexes Annexe IV Tableau A-III : Tableau récapitulatif des EST de la banque soustraite de S. zeamais. Les similitudes de séquence ont été obtenues par comparaison des six phases de lecture des séquences des EST aux banques de données protéiques. SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque de données Swiss-Prot. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 153 Annexes EST SP-AC INF-1 P95860 INF-10 Q7RN79 INF-101 P29818 INF-102 Q7Q3J6 INF-103 Q9V8I7 INF-105 Q8WTD5 INF-106 Q6CQF3 INF-107 Q8IDK4 INF-109 Q9VCI5 INF-110 Q9WAV5 INF-111 Q9WAV5 INF-113 Q7YB50 INF-114 Q9V3Y4 INF-115 Q8IHS8 INF-116 P24491 INF-117 Q64ID5 INF-118 Q8IHX4 INF-121_1 Q4U8R3 INF-121_2 Q9VNE2 INF-122 Q9WAV5 INF-123 Q7QCW3 INF-124 Q8WX82 INF-125 Q9WAV5 INF-126 Q660N7 INF-128 Q9W4U6 INF-13 Q6QEJ7 INF-131 Q7S0L8 INF-132 Q7PX08 INF-133 Q7Q8H9 INF-134 Q8T5I7 INF-135 Q45958 INF-136 P18459 INF-138 P18684 INF-14_1 Q5BR89 E-value 4.4 4.4 5.6 7,00E-24 3,00E-04 0.67 2,00E-20 5.6 2,00E-26 3.3 0.40 1,00E-136 1,00E-26 4.3 0.021 6,00E-16 1.5 0.031 2,00E-17 0.39 2,00E-47 0.56 0.51 0.30 0.39 5,00E-31 5.8 1,00E-15 0.17 1,00E-130 2.5 8,00E-30 0.68 0.003 Description organisme Orf c06013 protein Sulfolobus solfataricus Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii Hypothetical G2R protein Amsacta moorei entomopoxvirus AgCP11395 (Fragment) Anopheles gambiae CG5224-PA (LD18692p) Drosophila melanogaster Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Chromosome D of strain NRRL Y-; 1140 Kluyveromyces lactis Hypothetical protein MAL13P1249 Plasmodium falciparum Putative succinate dehydrogenase Drosophila melanogaster Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Cytochrome oxidase subunit I (Fragment) Sitophilus zeamais Mitochondrial carrier homolog Drosophila melanogaster Hypothetical protein Plasmodium falciparum Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis Hypothetical protein Plasmodium falciparum Hypothetical protein Theileria annulata Elongation initiation factor 5C Drosophila melanogaster Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus AgCP1865 (Fragment) Anopheles gambiae Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Exodeoxyribonuclease V, gamma chain Borrelia garinii Pbi CG14421-PA Drosophila melanogaster Profilin Apis mellifera Predicted protein Neurospora crassa AgCP12509 (Fragment) Anopheles gambiae AgCP15249 Anopheles gambiae Putative TPR-containing phosphoprotein Anopheles gambiae Orf 130 Coxiella burnetii Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster Diptericin D precursor Protophormia terraenovae Hypothetical protein Schistosoma japonicum Keywords HYPOTHETICAL PROTEIN; HYPOTHETICAL PROTEIN; HYPOTHETICAL PROTEIN ELECTRON TRANSPORT; HEME; HYPOTHETICAL P ENVELOPE PROTEIN; ENVELOPE PROTEIN; COPPER; ELECTRON TRANSPORT; HEME; INNER M TRANSMEMBRANE; TRANSPORT; HYPOTHETICAL PROTEIN; AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE; HYPOTHETICAL PROTEIN; COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN INITIATION FACTOR ENVELOPE PROTEIN; ENVELOPE PROTEIN; ACTIN-BINDING; REPEAT; TPR REPEAT; PLASMID; ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN AMIDATION; ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUEN HYPOTHETICAL PROTEIN 154 Annexes EST SP-AC INF-14_2 Q93125 INF-140_1 Q9BMN0 INF-141 Q8KWP5 INF-143 Q892V9 INF-145 Q76K70 INF-148 O18598 INF-149 Q6FKI3 INF-150 Q7Q158 INF-151 Q67QX8 INF-152 Q7QF28 INF-153 Q8IAD8 INF-154_1 Q85C71 INF-154_2 Q9Y0D2 INF-155 Q8RGM2 INF-158 Q27023 INF-160 Q7NI81 INF-161 Q867T1 INF-162 Q6K777 INF-163 P81685 INF-164 Q8ILJ8 INF-165 P24491 INF-167 Q4FKB4 INF-168 Q8NIQ6 INF-169 P24491 INF-17 Q8MUW9 INF-170 Q6ZTE4 INF-171 Q7PPE7 INF-174 Q9WAV5 INF-179 Q8I361 INF-18 P80032 INF-180 P18459 INF-181 Q66BH8 INF-182 Q5MIW2 INF-183 Q76K70 E-value 7,00E-49 0.58 1.5 2.0 1,00E-15 3,00E-09 0.67 3,00E-60 8.3 1,00E-11 6,00E-10 0.77 2,00E-14 3.3 4,00E-15 7.4 9,00E-52 1.5 0.35 0.061 0.26 0.001 0.10 0.17 2,00E-13 0.89 2,00E-57 1.2 0.23 5,00E-16 1,00E-29 0.89 2,00E-10 1,00E-15 Description organisme Keywords Green fluorescent protein mutant 3 Aequorea victoria JH-inducible protein Galleria mellonella Putative CPS repeating unit polymerase Cps 9 Streptococcus pneumoniae Carbon starvation protein A Clostridium tetani COMPLETE PROTEOME; Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa ALLERGEN; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; TRANS Glutathione S-transferase Blattella germanica Similar to sp; Q04638 Saccharomyces cerevisCandida glabrata CBS138 ENSANGP00000022338 (Fragment) Anopheles gambiae Glutamate synthetase Symbiobacterium thermophilum AgCP13679 (Lysozyme i homologue) Anopheles gambiae EGF-LIKE DOMAIN; HYDROLASE; LECTIN; PROTEAS Mannose-binding lectin-associated serine prot Halocynthia roretzi DNA-directed RNA polymerase Anthoceros formosae CHLOROPLAST; DNA-DIRECTED RNA POLYMERAS Cysteine proteinase Hypera postica HYDROLASE; PROTEASE; THIOL PROTEASE; Transposase Fusobacterium nucleatum COMPLETE PROTEOME; ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Glr2302 protein Gloeobacter violaceus COMPLETE PROTEOME; Serpin 3a (Serpin 3b) Manduca sexta PROTEASE INHIBITOR; SERINE PROTEASE INHIBITO Putative DNA polymerase epsilon catalytic su Oryza sativa DNA REPLICATION; DNA-BINDING; DNA-DIRECTED D Cecropin-A1 [Precursor] Drosophila mauritiana AMIDATION; ANTIBIOTIC; ANTIMICROBIALl; DIRECT P Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN; Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT; AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Ferritin 2 Apriona germari IRON; Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens ENSANGP00000021580 (Fragment) Anopheles gambiae GLYCOLYSIS; KINASE; MAGNESIUM; TRANSFERAS Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Hypothetical protein PFI0440w Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN; ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; HEMO Coleoptericin Zophobas atratus Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN Putative phage protein Yersinia pseudotuberculosis Cystein-rich venom-like protein Aedes aldopictus Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa 155 Annexes EST SP-AC INF-184 Q8MUW9 INF-185 Q6LFI5 INF-186 Q9W6Y1 INF-188 Q8IDK4 INF-189 Q95G05 INF-19 Q6ZTE4 INF-190 Q7YNA6 INF-191 Q89181 INF-192 O94823 INF-193 Q6ZTE4 INF-194 Q7YWD4 INF-195 P33502 INF-197 P18459 INF-198 P28493 INF-199 Q25813 INF-20_1 Q67FQ9 INF-20_2 Q76K70 INF-200 Q82I11 INF-201 Q9WAV5 INF-203 P28493 INF-205 Q6CNS4 INF-206 Q7P568 INF-207_1 Q54904 INF-207_2 Q9WAV5 INF-208 Q6P2V4 INF-209 P24491 INF-211 P12606 INF-214 O46030 INF-215 Q7PHT5 INF-217 Q27023 INF-22 Q8IQU4 INF-221 P24491 INF-223 Q7YXM2 INF-225 Q8I2N7 E-value 1,00E-22 3.4 2,00E-24 5.6 0.40 4,00E-07 1.1 2.0 9.7 1.5 1,00E-05 3,00E-16 1,00E-29 4,00E-24 1.2 2,00E-12 1,00E-14 4,00E-05 0.99 1,00E-14 0.30 3.3 1.1 0.99 4,00E-42 0.060 4,00E-25 5,00E-23 4.0 1,00E-13 4,00E-24 0.047 2,00E-63 0.001 Description organisme Keywords Ferritin 2 Apriona germari IRON; Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN; Heat shock cognate 71 kDa protein (Hsc701) Oryzias latipes ATP-BINDING; HEAT SHOCK; MULTIGENE FAMILY; Hypothetical protein MAL13P1249 Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN; Maturase (Fragment) Aristolochia maxima CHLOROPLAST; Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens NADH dehydrogenase subunit F (Fragment) Teucrium canadense CHLOROPLAST; NAD; NADP; OXIDOREDUCTASE; P A51R protein (Putative 349k protein) (Hypothe Vaccinia virus HYPOTHETICAL PROTEIN; Potential phospholipid-transporting ATPase VBHomo sapiens ALTERNATIVE SPLICING; ATP-BINDING; HYDROLAS Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens 12 kDa hemolymph protein e precursor (FragmTenebrio molitor SIGNAL; NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1 Anopheles quadrimaculatus MITOCHONDRION; NAD; OXIDOREDUCTASE; TRANS Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN Pathogenesis-related protein 5 precursor (PR- Arabidopsis thaliana APOPLAST; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; PATHO Rps8 protein Plasmodium falciparum Inducible metalloproteinase inhibitor Galleria mellonella GLYCOPROTEIN; METALLOPROTEASE INHIBITOR; S Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa Putative aldehyde dehydrogenase Streptomyces avermitilis COMPLETE PROTEOME; OXIDOREDUCTASE; Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Pathogenesis-related protein 5 precursor (PR- Arabidopsis thaliana APOPLAST; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; PATHO Similar to sgd|S0002474 Saccharomyces cereKluyveromyces lactis Hypothetical protein Fusobacterium nucleatum HYPOTHETICAL PROTEIN; NanA gene Streptococcus pneumoniae Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Hgd protein Brachydanio rerio Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Integrin beta-1 precursor Xenopus laevis CELL ADHESION; GLYCOPROTEIN; INTEGRIN; PHOS Cysteine proteinase Sitophilus zeamais HYDROLASE; PROTEASE; THIOL PROTEASE; ENSANGP00000023188 Anopheles gambiae Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC CG9449-PB Drosophila melanogaster Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Putative thioredoxin perxidase Apis mellifera ligustica OXIDOREDUCTASE; PEROXIDASE; Hypothetical protein PFI1335w Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN; 156 Annexes EST SP-AC INF-226 P81682 INF-227 Q60FC9 INF-229_1 Q5MGF4 INF-229_2 Q9GNP5 INF-23 Q8GUF5 INF-231 Q7PYK6 INF-233 Q9VFY2 INF-234 Q06689 INF-236 Q8I361 INF-237 P18459 INF-238 Q69JY6 INF-239 Q7YB50 INF-240 Q9V4T5 INF-243 Q7Q9L2 INF-245 Q4FKE3 INF-246 P34842 INF-247 P52159 INF-248 Q27014 INF-25 Q83CD5 INF-250 Q27023 INF-251 Q7RN92 INF-253 ZNF142 INF-254 O42930 INF-256 Q8RG71 INF-258 Q69BL0 INF-259 Q9CDJ7 INF-260 Q60FC9 INF-261 ZNF142 INF-262 Q7QC88 INF-263 Q6LFE7 INF-264 Q07171 INF-265 Q8WTD5 INF-266 Q8WTD5 INF-269 Q7QDE8 E-value 0.23 0.090 3,00E-19 6.6 3,00E-05 0.045 5,00E-31 1.1 0.28 2,00E-29 4,00E-18 3,00E-62 2,00E-19 2,00E-66 0.58 1,00E-34 4,00E-20 5,00E-09 3.8 4,00E-15 9,00E-06 1,00E-14 4.7 7.7 5,00E-28 0.56 0.090 2,00E-14 7,00E-32 0.005 2,00E-22 0.88 0.88 9,00E-40 Description organisme Cecropin-A1 [Precursor] Drosophila mauritiana Luxuriosin Acalolepta luxuriosa Hypothetical protein Lonomia obliqua Galectin LEC-4 Caenorhabditis elegans Putative reverse transcriptase (Fragment) Cicer arietinum AgCP12379 (Fragment) Anopheles gambiae CG8483-PA (LD39025p) Drosophila melanogaster Ylr413wp Saccharomyces cerevisiae Hypothetical protein PFI0440w Plasmodium falciparum Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster Putative thaumatin-like protein Oryza sativa Cytochrome oxidase subunit I (Fragment) Sitophilus zeamais Probable cytochrome P450 4e1 Drosophila melanogaster AgCP14967 (Fragment) Anopheles gambiae Hyothetical protein Trypanosoma brucei Cytochrome c oxidase polypeptide III Anopheles gambiae Cornichon protein Drosophila virilis 28 kDa desiccation stress protein Tenebrio molitor Excinuclease ABC, C subunit Coxiella burnetii Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii Zinc finger protein 142 (HA4654) Homo sapiens Pep1 protein Schizosaccharomyces pombe Hypothetical protein FN0446 Fusobacterium nucleatum Pattern recognition serine proteinase Manduca sexta Glucosyltransferase-S (EC 2415) Lactococcus lactis Luxuriosin Acalolepta luxuriosa Zinc finger protein 142 (HA4654) Homo sapiens AgCP1223 (Fragment) Anopheles gambiae Homologue of human HSPC025 Plasmodium falciparum Gelsolin precursor Drosophila melanogaster Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans AgCP10112 (Fragment) Anopheles gambiae Keywords AMIDATION|ANTIBIOTIC|ANTIMICROBIALl|DIRECT PR HYPOTHETICAL PROTEIN LECTIN RNA-DIRECTED DNA POLYMERASE| HYPOTHETICAL PROTEIN| ALTERNATIVE SPLICING|CATECHOLAMINE BIOSYN COPPER|ELECTRON TRANSPORT|HEME|INNER ME ENDOPLASMIC RETICULUM|HEME|HYPOTHETICAL REPEAT|WD REPEAT| MITOCHONDRION|OXIDOREDUCTASE|TRANSMEMB DEVELOPMENTAL PROTEIN|TRANSMEMBRANE| COMPLETE PROTEOME ANTIBIOTIC|DEFENSIN|DIRECT PROTEIN SEQUENCI HYPOTHETICAL PROTEIN| DNA-BINDING|METAL-BINDING|NUCLEAR PROTEIN|R COMPLETE PROTEOME| SIGNAL; COMPLETE PROTEOME|TRANSFERASE| DNA-BINDING|METAL-BINDING|NUCLEAR PROTEIN|R ACTIN-BINDING|ALTERNATIVE SPLICING|CALCIUM|C 157 Annexes EST INF-270 INF-272 INF-273 INF-274 INF-275 INF-276 INF-277 INF-278 INF-279 INF-28 INF-280 INF-282_1 INF-282_2 INF-284 INF-286 INF-287_1 INF-288_1 INF-288_2 INF-289 INF-290 INF-293 INF-295 INF-296 INF-297 INF-30 INF-304 INF-307 INF-308 INF-309_1 INF-309_2 INF-312 INF-313 INF-314 INF-315 SP-AC Q9LZX8 Q9VEN1 Q6ZTE4 P88984 Q4T1H2 Q7PW17 Q9VQ29 Q7QAG1 Q76K70 Q6ZTE4 Q24618 P00705 Q5MGF4 Q16KRO Q8NIQ6 O76281 Q94R69 Q9VZY2 Q6ZTE4 Q6RUR3 Q8IHX4 P24491 Q6Q2D8 Q9V4K3 Q8WTD5 P25867 Q9MGM9 Q7QCC6 Q64ID5 Q9B2B8 Q7KW97 Q91697 P80032 Q5MIW2 E-value 0.18 2,00E-68 0.004 9.6 1,00E-05 8,00E-17 0.005 0.39 1,00E-15 1.5 8,00E-13 3,00E-17 2,00E-06 0.21 0.10 1,00E-22 1,00E-115 8.5 0.88 2,00E-20 1.6 0.049 5,00E-16 6,00E-19 0.88 6,00E-49 4,00E-77 4,00E-18 3,00E-17 2,00E-57 6,00E-74 0.54 1,00E-15 7,00E-06 Description organisme Guanine nucleotide exchange factor-like prot e Arabidopsis thaliana CG3937-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Uracil DNA glycosylase (46) Murid herpesvirus 4 (MuHV-4) Chromosome undetermined SCAF10578 Tetraodon nigroviridis ENSANGP00000010625 Anopheles gambiae CG7361-PB Drosophila melanogaster AgCP7935 (Fragment) Anopheles gambiae Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Maternal exuperantia 1 protein Drosophila pseudoobscura Lysozyme C-1 precursor Anas platyrhynchos Hypothetical protein Lonomia obliqua Hypothetical protein Aedes aegypti Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa Projectin (Fragment) Drosophila melanogaster Cytochrome b Tribolium castaneum CG32296-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Putative alcohol dehydrogenase Gryllotalpa orientalis Hypothetical protein Plasmodium falciparum Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Serpin-4A Manduca sexta CG1707-PA Drosophila melanogaster Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Ubiquitin-conjugating enzyme E2-17 kDa Drosophila melanogaster Cytochrome c oxidase subunit III Drosophila mauritiana ENSANGP00000012173 Anopheles gambiae Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis Cytochrome oxidase subunit II (Fragment) Sitophilus zeamais BG:DS009298 protein Drosophila melanogaster Peptidylhydroxyglycine N-C lyase precursor Xenopus laevis Coleoptericin Zophobas atratus Cystein-rich venom-like protein Aedes aldopictus Keywords DNA DAMAGE; DNA REPAIR; GLYCOSIDASE; HYDR ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE; DEVELOPMENTAL PROTEIN; RNA-BINDING; BACTERIOLYTIC ENZYME; DIRECT PROTEIN SEQUE HYPOTHETICAL PROTEIN TRANSMEMBRANE; TRANSPORT; ATP-BINDING; IMMUNOGLOBULIN DOMAIN; KINASE ELECTRON TRANSPORT; HEME; MITOCHONDRION; COMPLETE PROTEOME OXIDOREDUCTASE; HYPOTHETICAL PROTEIN AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM PROTEASE INHIBITOR; SERINE PROTEASE INHIBITO CELL CYCLE; CELL DIVISION; LIGASE; MEIOSIS; MU MITOCHONDRION; OXIDOREDUCTASE; TRANSMEM HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE COPPER; ELECTRON TRANSPORT; INNER MEMBRA LYASE; SIGNAL ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; HEMO 158 Annexes EST SP-AC INF-318 P81683 INF-319 Q7YWD4 INF-320 P24491 INF-321_1 Q9VLN6 INF-321_2 Q9VAN4 INF-323 Q9VTB5 INF-325 Q75D00 INF-325 Q5WM41 INF-326 Q8MPP0 INF-33 Q8LX86 INF-330 Q9WAV5 INF-331 Q8WX82 INF-332 Q9N327 INF-333 Q64ID5 INF-334 Q7KQW7 INF-339 Q8WX82 INF-34 Q7RH26 INF-340 Q9KHC4 INF-341 P46150 INF-346 Q6ZTE4 INF-347 O88321 INF-348 Q6CUV7 INF-349_1 Q7QJQ9 INF-349_2 Q9ESX7 INF-350_1 Q977X7 INF-350_2 Q9P337 INF-350_3 Q7Z9G4 INF-351_1 Q9W198 INF-351_2 Q9C8T4 INF-354 Q6RUR3 INF-355 Q83CD5 INF-356 P24491 INF-358 Q8MY06 INF-359 Q7QAN1 E-value 0.93 5,00E-04 0.048 1,00E-33 0.091 8,00E-31 5,00E-38 7,00E-23 7,00E-31 2.5 0.42 0.65 0.008 5,00E-18 3,00E-15 0.65 9.6 2,00E-13 2,00E-10 0.32 8,00E-51 0.012 1,00E-14 3.0 3,00E-04 6,00E-59 3,00E-05 4,00E-05 4.5 2,00E-20 8.0 0.18 8,00E-16 3,00E-52 Description organisme Keywords AMIDATION; ANTIBIOTIC; ANTIMICROBIALl; DIRECT P Cecropin-A1 [Precursor] Drosophila mauritiana 12 kDa hemolymph protein e [Precursor] Tenebrio molitor AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina CG7627-PA Drosophila melanogaster ATP-BINDING; COMPLETE PROTEOME; MEMBRANE CG11898-PA Drosophila melanogaster ATP-BINDING; COMPLETE PROTEOME; MEMBRANE Ninjurin A gamma Drosophila melanogaster Actin Ashbya gossypii STRUCTURAL PROTEIN Putative esterase (EC 3111) Tribolium castaneum HYDROLASE Ninjurin A alpha (CG6449-PB, isoform B) Drosophila melanogaster Cytochrome oxidase I (Fragment) Chaoborus astictopus COPPER; ELECTRON TRANSPORT; HEME; INNER M Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Hypothetical protein Y59E9AL1 Caenorhabditis elegans HYPOTHETICAL PROTEIN Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE CG1441-PA, isoform A Drosophila melanogaster Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens RNA recognition motif, putative Plasmodium yoelii yoelii SocE Myxococcus xanthus ACTIN-BINDING; ALTERNATIVE SPLICING; CYTOSKE Moesin/ezrin/radixin homolog 1 Drosophila melanogaster Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Antisecretory factor Rattus norvegicus Similar to sp|P53835 Saccharomyces cerevisiKluyveromyces lactis ENSANGP00000010942 (Fragment) Anopheles gambiae ANK REPEAT; ION TRANSPORT; IONIC CHANNEL; T TRPC6 cation channel Cavia porcellus Formate dehydrogenase beta-subunit (FragmeMethanococcus voltae Actin (Fragment) Pichia guilliermondii STRUCTURAL PROTEIN ATP-BINDING; CYTOSKELETON; NUCLEOTIDE-BIND Actin (Fragment) Citeromyces matritensis CG3363-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein F9N128 Arabidopsis thaliana HYPOTHETICAL PROTEIN Putative alcohol dehydrogenase Gryllotalpa orientalis OXIDOREDUCTASE Excinuclease ABC, C subunit Coxiella burnetii COMPLETE PROTEOME AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Acid phosphatase (EC 3132) Drosophila virilis HYDROLASE ENSANGP00000011858 (TOLLIP homologue) Anopheles gambiae 159 Annexes EST INF-36 INF-362 INF-363 INF-365 INF-366 INF-367 INF-370 INF-371 INF-372 INF-373 INF-375 INF-378 INF-379 INF-38 INF-380 INF-382 INF-383 INF-39 INF-391 INF-394 INF-395 INF-398 INF-399 INF-4 INF-400 INF-401 INF-403 INF-404 INF-407 INF-408 INF-41_1 INF-41_2 INF-410 INF-411 SP-AC Q7Q3G4 P25159 Q8RHK3 Q8NIQ6 Q27023 P82963 P32583 Q27018 Q9NDA8 Q61PG3 Q95V37 Q8NIQ6 Q8NIQ6 Q9WAV5 Q8WX82 P24491 P56518 Q84LS0 Q8WRD2 Q9WAV5 Q7NI81 Q22225 Q9PLI5 Q8RH51 Q9G5I4 Q70KP4 Q8NIQ6 Q8MUW9 Q7YXL5 Q8NIQ6 Q54TJ5 P80032 Q8A4H9 Q8WX82 E-value 1,00E-27 4,00E-04 0.032 0.11 4,00E-14 0.004 0.31 5,00E-04 8,00E-32 6,00E-04 1,00E-17 6.0 0.084 0.46 0.59 0.19 4.6 2.5 6.1 0.42 1.2 2.1 9.9 0.0011 2,00E-32 2.1 0.11 1,00E-15 7,00E-33 0.11 0.008 3,00E-14 6.1 0.63 Description organisme Keywords AgCP11115 (Fragment) Anopheles gambiae Maternal effect protein staufen Drosophila melanogaster 3D-STRUCTURE; ALTERNATIVE SPLICING; COMPLE Valyl-tRNA synthetase (EC 6119) Fusobacterium nucleatum COMPLETE PROTEOME Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Chaoptin (Photoreceptor cell-specific membra Tribolium castaneum CELL ADHESION; GLYCOPROTEIN; LEUCINE-RICH R Suppressor protein SRP40 Saccharomyces cerevisiae B2 protein precursor (Fragment) Tenebrio molitor GLYCOPROTEIN; MULTIGENE FAMILY; SIGNAL 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthDendroctonus jeffreyi Hypothetical protein CBG07555 Caenorhabditis briggsae HYPOTHETICAL PROTEIN Ribosomal protein L29 Spodoptera frugiperda RIBOSOMAL PROTEIN Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Histone deacetylase 1 (HD1) Strongylocentrotus purpuratus CHROMATIN REGULATOR; HYDROLASE; NUCLEAR Hypothetical protein Arabidopsis thaliana HYPOTHETICAL PROTEIN; Cysteine repeat modular protein 1 PbCRM1 Plasmodium berghei Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN Glr2302 protein Gloeobacter violaceus COMPLETE PROTEOME Hypothetical protein T05C124 Caenorhabditis elegans HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein TC0114 Chlamydia muridarum COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical cytosolic protein Fusobacterium nucleatum COMPLETE PROTEOME; Cytochrome b (Fragment) Anolis acutus ELECTRON TRANSPORT; HEME; MITOCHONDRION; Hemagglutinin-esterase protein Porcine torovirus Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Ferritin 2 Apriona germari IRON Membrane alanyl aminopeptidase (EC 34112) Tenebrio molitor AMINOPEPTIDASE; HYDROLASE Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Hypothetical protein Dictyostelium discoideum HYPOTHETICAL PROTEIN ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUENCING; HEMO Coleoptericin Zophobas atratus Alpha-glucosidase Bacteroides thetaiotaomicron COMPLETE PROTEOME Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens 160 Annexes EST SP-AC INF-413 P33508 INF-414 Q6B512 INF-415 Q7R9U2 INF-416 Q6ZTE4 INF-417 Q91UJ3 INF-418 Q7PMY0 INF-42 Q8WTD5 INF-420 Q8N2G4 INF-421 Q27023 INF-423_1 Q8IS50 INF-423_2 Q9PYP1 INF-425 Q76K70 INF-426 Q5ZEX9 INF-427 Q9W4U6 INF-429 Q95V37 INF-43 Q8MRI7 INF-430 Q8WX82 INF-431 Q9WAV5 INF-432 Q6ZTE4 INF-434 Q8WX82 INF-436 Q68XF8 INF-437 Q5WM41 INF-438 P34846 INF-439 Q7RST1 INF-44 Q27023 INF-440 Q7PJP4 INF-441 Q7PP76 INF-442 Q9VHT5 INF-443 Q6RUR3 INF-444 Q8NIQ6 INF-445 Q64ID5 INF-446 Q64ID5 INF-447 Q69JY6 INF-448 Q7ZTW9 E-value 3,00E-76 8,00E-21 0.29 0.017 0.48 2,00E-28 1.3 3,00E-05 4,00E-15 3,00E-27 0.005 1,00E-15 4,00E-04 0.41 2,00E-24 4,00E-52 0.65 1.0 2,00E-04 0.65 7.8 7,00E-15 4,00E-22 0.54 4,00E-14 6,00E-42 1,00E-35 1,00E-11 2,00E-20 0.11 1,00E-21 1,00E-21 4,00E-18 3,00E-15 Description organisme Keywords Cytochrome c oxidase polypeptide III Anopheles quadrimaculatus MITOCHONDRION; OXIDOREDUCTASE; TRANSMEM General transcription factor II B Oreochromis mossambicus Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens 223K Aconitum latent virus ENSANGP00000020507 (Fragment) Anopheles gambiae GTP-BINDING Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Hypothetical protein PSEC0181 Homo sapiens Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC Serpin 4 (Fragment) Ctenocephalides felis PROTEASE INHIBITOR; SERINE PROTEASE INHIBITO ORF155 Xestia c-nigrum granulosis virus Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa Esterase (EC 3111) (Fragment) Tribolium castaneum HYDROLASE CG14421-PA Drosophila melanogaster Ribosomal protein L29 Spodoptera frugiperda RIBOSOMAL PROTEIN LD22095p Drosophila melanogaster Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Hypothetical protein Rick ettsia typhi COMPLETE PROTEOME Putative esterase (EC 3111) Tribolium castaneum HYDROLASE NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1 Anopheles gambiae MITOCHONDRION; NAD; OXIDOREDUCTASE; TRANS Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii HYPOTHETICAL PROTEIN Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC ENSANGP00000024978 (Fragment) Anopheles gambiae ENSANGP00000012978 (PGRP) Anopheles gambiae CG7494-PA (LD31571p) Drosophila melanogaster Putative alcohol dehydrogenase Gryllotalpa orientalis OXIDOREDUCTASE Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE Putative thaumatin-like protein Oryza sativa Similar to asparagine synthetase Brachydanio rerio 161 Annexes EST INF-449 INF-45 INF-450 INF-451 INF-452 INF-453 INF-454 INF-455 INF-456 INF-459 INF-46_1 INF-46_2 INF-460 INF-461 INF-462 INF-463 INF-464 INF-465 INF-467 INF-468 INF-47_1 INF-47_2 INF-470 INF-471 INF-472 INF-474 INF-475 INF-476_1 INF-476_2 INF-476_3 INF-477 INF-478 INF-479 INF-48_1 SP-AC P24491 Q9B2B8 Q8WTD5 P18684 Q7NC05 Q9B2B9 Q6ZWF7 Q6R7M3 O96054 Q5MPB8 Q9F0H0 Q27826 Q9XYN3 Q5TSB6 Q27023 Q7QTE5 Q7PW39 Q9VLX0 Q8WX82 Q5WM41 P18459 Q55B32I Q8WX82 Q70KP4 Q99323 Q5ZEX9 Q5I208 P46223 Q5GN70 Q4U8R3 Q5ZJ73 P24491 Q60FC9 Q5CC73 E-value 0.18 5,00E-68 0.70 0.71 6.0 1,00E-41 0,068 8,00E-32 0.29 1,00E-10 0.054 4.9 6,00E-37 5,00E-14 5,00E-15 1.7 5,00E-07 0.91 0.65 6,00E-18 7,00E-05 8.6 0.63 2.1 3,00E-70 2,00E-47 1,00E-107 5,00E-21 5,00E-13 0.031 1,00E-37 0.063 0.78 3,00E-10 Description organisme Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Cytochrome oxidase subunit II (Fragment) Sitophilus zeamais Antimicrobial peptide diptericin DipA (Fragment Glossina morsitans morsitans Diptericin D precursor Protophormia terraenovae Unique hypothetical Mycoplasma gallisepticum Cytochrome oxidase subunit I (Fragment) Sitophilus zeamais cDNA FLJ41170 fis Homo sapiens Cytochrome P450 9E1 Diploptera punctata MBF2 Samia cynthia Hemolymph proteinase 17 Manduca sexta Type III secretion protein HrcT Pseudomonas syringae DNA-directed RNA polymerase (EC 2776) Euplotes octocarinatus Antennal-enriched UDP-glycosyltransferase Drosophila melanogaster ENSANGP00000012166 Anopheles gambiae Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor GLP_622_26115_23638 Giardia lamblia ATCC 50803 ENSANGP00000016599 (Fragment) Anopheles gambiae CG7144-PA Drosophila melanogaster Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Putative esterase (EC 3111) Tribolium castaneum Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster Hypothetical protein Dictyostelium discoideum Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Hemagglutinin-esterase protein Porcine torovirus Myosin heavy chain, non-muscle Drosophila melanogaster Esterase (EC 3111) (Fragment) Tribolium castaneum Pathogenesis-related-5-like protein (Thaumatin)Diaprepes abbreviatus 60S ribosomal protein L7a Drosophila melanogaster Esterase (EC 3111) Tribolium castaneum NanA gene Streptococcus pneumoniae Hypothetical protein Gallus gallus Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Luxuriosin Acalolepta luxuriosa Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase Otiorhynchus sulcatus Keywords AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM COPPER; ELECTRON TRANSPORT; INNER MEMBRA AMIDATION; ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUEN COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN COPPER; ELECTRON TRANSPORT; HEME; INNER M HEME; MONOOXYGENASE; OXIDOREDUCTASE HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE COMPLETE PROTEOME; TRANSMEMBRANE; DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE; METAL-BINDIN GLYCOSYLTRANSFERASE; TRANSFERASE ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC HYDROLASE ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN HYPOTHETICAL PROTEIN ACTIN-BINDING; ALTERNATIVE SPLICING; ATP-BIND HYDROLASE RIBOSOMAL PROTEIN HYDROLASE HYPOTHETICAL PROTEIN AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM GLYCOSIDASE; HYDROLASE 162 Annexes EST INF-48_2 INF-480 INF-481 INF-482 INF-484 INF-485 INF-486 INF-487 INF-488 INF-489 INF-49_1 INF-49_2 INF-490 INF-491 INF-492 INF-493 INF-495 INF-496 INF-497 INF-498 INF-499 INF-5_1 INF-50 INF-500 INF-501 INF-502 INF-503 INF-504 INF-505 INF-506 INF-507 INF-509 INF-51 INF-510 SP-AC Q5I4H5 Q76K70 Q6XPZ9 Q8IJJ6 Q8NIQ6 Q9VX26 Q6XJ36 Q8WX82 Q6CQE0 Q8WTD5 Q4S9U5 Q4TWA9 Q9VE10 Q964T2 Q9VYV6 Q98QQ2 Q27023 Q61VH9 Q8IAU5 Q9WAV5 Q27023 P34842 Q6XIJ0 Q5WPV0 Q8WPC2 Q64ID5 P81684 Q91W60 P18459 Q9GRW0 Q7Q158 Q73CH5 Q6HE37 Q9B2B9 E-value 0.089 4,00E-15 5,00E-39 0.32 0.11 0.002 5,00E-07 0.65 7,00E-19 0.93 1.3 4,00E-76 1,00E-17 4,00E-35 0.32 2.0 4,00E-15 0.033 0.14 0.87 4,00E-15 4,00E-33 8,00E-23 5,00E-08 0.004 1,00E-21 0.24 5,00E-18 1,00E-29 1,00E-15 3,00E-60 0.14 7,00E-04 7,00E-33 Description organisme Tyrosine hydroxylase Apis mellifera Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa Cathepsin B Fundulus heteroclitus Hypothetical protein Plasmodium falciparum Putative Na+/H+ antiporter Pichia farinosa CG32556-PA, isoform A Drosophila melanogaster Similar to Drosophila melanogaster RpL1 Drosophila yak uba Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Similarities with sp|Q9Y071 Periplaneta ameri Kluyveromyces lactis Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Chromosome undetermined SCAF14694 Tetraodon nigroviridis Cytochrome c oxidase subunit III Haematobia irritans CG14285-PA Drosophila melanogaster Cytochrome P450 9e2 Blattella germanica CG2444-PA (LP01642p) Drosophila melanogaster Hypothetical protein MYPU_3090 Mycoplasma pulmonis Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Hypothetical protein CBG04830 Caenorhabditis briggsae Cullin-like protein, putative Plasmodium falciparum Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Cytochrome c oxidase polypeptide III Anopheles gambiae Similar to Drosophila melanogaster CG10731 Drosophila yak uba 163 kDa salivary protein Lutzomyia longipalpis Odorant-binding protein-related protein Aedes aegypti Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis Cecropin-A1 [Precursor] Drosophila mauritiana Inter alpha-trypsin inhibitor, heavy chain 4 Mus musculus Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster Prophenoloxidase activating factor Holotrichia diomphalia ENSANGP00000022338 (Fragment) Anopheles gambiae Sensor histidine kinase/response regulator Bacillus cereus Hypothetical protein Bacillus thuringiensis Cytochrome oxidase subunit I (Fragment) Sitophilus zeamais Keywords HYDROLASE; PROTEASE; THIOL PROTEASE HYPOTHETICAL PROTEIN TRANSMEMBRANE; TRANSPORT ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING MITOCHONDRION REPEAT; WD REPEAT ENDOPLASMIC RETICULUM; HEME; MEMBRANE; M COMPLETE PROTEOME COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC HYPOTHETICAL PROTEIN ENVELOPE PROTEIN ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC MITOCHONDRION; OXIDOREDUCTASE; TRANSMEM HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE AMIDATION; ANTIBIOTIC; ANTIMICROBIALl; DIRECT P ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE COMPLETE PROTEOME; KINASE; PHOSPHORYLAT COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN; COPPER; ELECTRON TRANSPORT; HEME; INNER M 163 Annexes EST INF-511 INF-513 INF-514 INF-515 INF-516 INF-517 INF-518 INF-520 INF-521 INF-522 INF-523 INF-524 INF-525 INF-526 INF-527 INF-56 INF-57 INF-58 INF-59 INF-6 INF-60_1 INF-60_2 INF-63 INF-65 INF-66 INF-67 INF-68 INF-69 INF-7 INF-70 INF-72 INF-74 INF-75 INF-76 SP-AC Q6ZTE4 P18459 P24491 Q64ID5 Q8WTD5 Q8WX82 Q9WAV5 Q7QJG7 Q642H5 Q7YB51 Q23944 Q76K70 Q8IJJ6 Q7QDK4 Q5WM41 O88325 Q9WAV5 Q6T2X7 Q7QJM0 O46030 Q7PYA6 Q86P08 Q7QAX2 Q1FS83 Q9WAV5 Q27023 Q7NC05 Q96PN6 P24491 Q6EV24 Q8SYJ2 Q6Q2D8 Q6Q2D8 P18684 E-value 0.001 1,00E-29 0.18 4,00E-28 0.71 0.65 1.1 1,00E-21 1,00E-25 8,00E-45 7,00E-12 1,00E-15 0.32 2,00E-15 6,00E-18 1,00E-34 0.005 2,00E-11 0.002 3,00E-23 2,00E-25 3,00E-21 1,00E-58 0.047 0.80 1,00E-13 5.7 1.2 0.061 4,00E-43 1,00E-14 2,00E-21 2,00E-21 0.68 Description organisme Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Tyrosine 3-monooxygenase Drosophila melanogaster Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Trypsin-like serine proteinase Anthonomus grandis Antimicrobial peptide diptericin DipA (FragmenGlossina morsitans morsitans Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus ENSANGP00000019069 (Fragment) Anopheles gambiae Zgc:92493 Brachydanio rerio Cytochrome oxidase subunit I (Fragment) Sitophilus oryzae Apolipophorin-III (Fragment) Derobrachus geminatus Acaloleptin A Acalolepta luxuriosa Hypothetical protein Plasmodium falciparum ENSANGP00000015026 (Fragment) Anopheles gambiae Putative esterase (EC 3111) Tribolium castaneum Alpha-N-acetylglucosaminidase Mus musculus Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Troponin T-3 Drosophila virilis AgCP3253 (Fragment) Anopheles gambiae Cysteine proteinase Sitophilus zeamais AgCP12648 (Fragment) Anopheles gambiae RE03380p (Fragment) Drosophila melanogaster AgCP6710 (Fragment) Anopheles gambiae Hypothetical protein Psychomonas ingrahamii 37 Envelope glycoprotein (Fragment) Feline immunodeficiency virus Tenecin 1 precursor Tenebrio molitor Unique hypothetical Mycoplasma gallisepticum Testicular soluble adenylyl cyclase Homo sapiens Sarcotoxin II-1 precursor Sarcophaga peregrina Ribsomal protein S20e Papilio dardanus RE56733p Drosophila melanogaster Serpin-4A Manduca sexta Serpin-4A Manduca sexta Diptericin D precursor Protophormia terraenovae Keywords ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE ENVELOPE PROTEIN COPPER; ELECTRON TRANSPORT; HEME; INNER M HYPOTHETICAL PROTEIN HYDROLASE ENVELOPE PROTEIN; HYDROLASE; PROTEASE; THIOL PROTEASE; HYDROLASE HEME; MONOOXYGENASE; OXIDOREDUCTASE; HYPOTHETICAL PROTEIN; ENVELOPE PROTEIN; ANTIBIOTIC; DEFENSIN; DIRECT PROTEIN SEQUENC COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN; LYASE; AMIDATION; ANTIBIOTIC; HEMOLYMPH; INSECT IMM PROTEASE INHIBITOR; SERINE PROTEASE INHIBITO PROTEASE INHIBITOR; SERINE PROTEASE INHIBITO AMIDATION; ANTIBIOTIC; DIRECT PROTEIN SEQUEN 164 Annexes EST INF-77 INF-78 INF-79 INF-82 INF-83 INF-84 INF-86 INF-87 INF-89 INF-9 INF-91 INF-92 INF-94 INF-95 INF-96 INF-97 INF-99 SP-AC Q39682 Q8WX82 Q95P67 Q94R70 Q8V4V4 Q9VNZ4 P18459 Q9WAV5 Q7P568 Q7PUB3 Q5MIW2 Q9WAV5 Q9BLI1 P20007 Q6C8B1 Q9V7Z2 Q8T9B4 E-value 0.45 0.63 9,00E-09 1,00E-05 8.2 9.9 7,00E-25 0.39 2.5 8,00E-55 3,00E-09 0.40 2,00E-14 8,00E-21 7.4 1,00E-17 2,00E-54 Description organisme Glycine-rich protein (Fragment) Daucus carota Beta I spectrin form betaI sigma3 (Fragment) Homo sapiens Ribosomal protein S11 Heliothis virescens NADH dehydrogenase subunit 6 Tribolium castaneum A24R Monk eypox virus CG11247-PA (Cg11247-pb) Tyrosine 3-monooxygenase Envelope glycoprotein (Fragment) Hypothetical protein ENSANGP00000013948 (PGRP) Cystein-rich venom-like protein Envelope glycoprotein (Fragment) TRASDJ protein (Fragment) Phosphoenolpyruvate carboxykinase Chromosome D CG15918-PA SD08921p Keywords RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOMAL PROTEIN; MITOCHONDRION; Drosophila melanogaster ALTERNATIVE SPLICING; CATECHOLAMINE BIOSYN Drosophila melanogaster Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Fusobacterium nucleatum HYPOTHETICAL PROTEIN; Anopheles gambiae PGRP Aedes aldopictus Feline immunodeficiency virus ENVELOPE PROTEIN; Saturnia japonica RNA-DIRECTED DNA POLYMERASE; TRANSFERAS Drosophila melanogaster DECARBOXYLASE; GLUCONEOGENESIS; GTP-BIND Yarrowia lipolytica CLIB99 Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster ATP-BINDING; 165 Annexes Annexe V Tableau A-IV : Tableau récapitulatif des EST de la banque soustraite d’A. pisum. Les similitudes de séquence ont été obtenues par comparaison des six phases de lecture des séquences des EST aux banques de données protéiques. SP-AC, identifiant de la protéine dans la banque de données Swiss-Prot. ANSELME Caroline Thèse au laboratoire BF2I / 2006 Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 166 Annexes EST PUC-101 PUC-102_2 PUC-104 PUC-105 PUC-106 PUC-109 PUC-11 PUC-114 PUC-115 PUC-116 PUC-118 PUC-12 PUC-121 PUC-122 PUC-123_1 PUC-126 PUC-127 PUC-128 PUC-129 PUC-13 PUC-130 PUC-131 PUC-132 PUC-133 PUC-134_2 PUC-136 PUC-138 PUC-139_1 PUC-139_2 PUC-14 PUC-140 PUC-141 PUC-142 PUC-146 SP -AC Q4YMT3 Q6PPH3 Q5CA54 Q9LZF3 Q7RLL0 Q7QUA2 Q8IDW8 Q9V5J5 Q6LF96 Q7Q6I5 Q4YVC1 Q8I2B2 Q7QBM5 P27393 Q7Q7W5 Q7RKI4 Q8MYQ4 Q7Q8H9 Q4FKE1 Q6D4W6 Q6R5A9 Q7KN85 Q5MIR1 Q9C724 Q9V375 Q5MIR6 O76518 Q7XJ31 Q24527 Q9W3F6 Q9V6L6 Q528F2 Q8HZZ5 Q17058 E-value 0.015 2,00E-37 7,00E-26 3.8 1.7 8.3 4.9 3,00E-12 0.018 2,00E-16 2.9 4.9 5,00E-16 5,00E-40 3,00E-10 0.25 8,00E-78 9,00E-15 3,00E-04 0.34 9,00E-16 3,00E-28 3,00E-08 2.2 5,00E-05 9,00E-15 1.7 0.46 6,00E-09 0.006 3,00E-04 6.5 1.2 1.0 Description organisme Hypothetical protein Plasmodium berghei Putative vacuolar ATP synthase subunit E Homalodisca coagulata Cytochrome b Aulacorthum solani Hypothetical protein Arabidopsis thaliana Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii GLP_155_30673_36963 Giardia lamblia Hypothetical protein MAL13P1 181 Plasmodium falciparum CG12909-PA (LD31988p) Drosophila melanogaster Hypothetical protein Plasmodium falciparum ENSANGP00000004475 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium berghei Hypothetical protein PFA0140c Plasmodium falciparum ENSANGP00000020445 Anopheles gambiae Collagen alpha 2(IV) chain precursor Ascaris suum ENSANGP00000011457 Anopheles gambiae Arabidopsis thaliana T13D8 31 Plasmodium yoelii yoelii Ubiquitin protein 1, isoform c Caenorhabditis elegans ENSANGP00000013196 Anopheles gambiae Hypothetical protein Trypanosoma brucei Ribulokinase (EC 2 7 1 16) Erwinia carotovora Tenebrin Tenebrio molitor LD21334p Drosophila melanogaster Ribosomal protein L24 Aedes albopictus Hypothetical protein Arabidopsis thaliana CG11546-PA, isoform A Drosophila melanogaster 60S ribosomal protein L17 Aedes albopictus Hemicentin precursor (Hypothetical protein) Caenorhabditis elegans Hypothetical protein Arabidopsis thaliana CG9218-PA, isoform A (Cg9218-pe, isoform e Drosophila melanogaster CG1440-PA (LD46760p) Drosophila melanogaster CG4630-PA (GH27944p) Drosophila melanogaster Hypothetical protein Magnaporthe grisea 70-15 Hypothetical protein Macaca fascicularis Alpha-glucosidase precursor Apis mellifera Keywords HYPOTHETICAL PROTEIN ELECTRON TRANSPORT; HEME; IRON; METAL-BINDING HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN GTP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING ALTERNATIVE SPLICING; BASEMENT MEMBRANE; COL OXYGEN TRANSPORT COMPLETE PROTEOME COMPLETE PROTEOME HYPOTHETICAL PROTEIN ARABINOSE CATABOLISM; CARBOHYDRATE METABOL RIBOSOMAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOMAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN; SIG HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN DIRECT PROTEIN SEQUENCING; GLYCOPROTEIN; GLYC 167 Annexes EST PUC-148 PUC-149 PUC-15 PUC-150 PUC-153 PUC-155 PUC-156 PUC-157 PUC-158 PUC-159_1 PUC-16 PUC-160 PUC-161 PUC-162 PUC-163 PUC-164 PUC-167 PUC-168 PUC-17 PUC-172 PUC-173 PUC-175 PUC-177 PUC-18 PUC-180_1 PUC-180_2 PUC-181 PUC-182 PUC-183 PUC-185 PUC-186 PUC-188 PUC-189 SP-AC Q7RHY8 Q8MRK2 Q8R235 Q5E0S4 Q4RZH4 Q9D4D4 Q9VJ38 Q4QR39 Q9LKL6 Q51GF2 Q55E87 Q9VX34 Q7QK53 Q7R7Q6 Q9C0I4 Q1HPK8 Q8I3G4 Q4YMU5 Q7ZWS1 Q4YQH2 Q8A4M2 Q8IBH6 Q9VTM6 Q6EV05 Q95WV0 Q7PW38 Q55E87 Q70MT4 Q7PUM1 Q5CLT2 Q7QCC2 Q6BFC8 Q8IL08 E-value 6.5 0.17 8.4 6.4 7.5 4,00E-20 8,00E-08 2,00E-31 0.26 3,00E-05 1.7 3,00E-57 7,00E-05 3.8 3,00E-16 0.006 1.7 6.4 1,00E-47 1.7 0.76 3.8 1,00E-06 1,00E-83 1.7 3,00E-04 1.7 1,00E-07 5,00E-07 6.2 5,00E-24 2.4 6.5 Description Hypothetical protein GH28840p C730025P13Rik protein Methyl-accepting chemotaxis protein Chromosome undetermined SCAF14924 Adult male testis cDNA 39S ribosomal protein L13, mitochondrial Hypothetical protein DEAD box protein P68 Viral A-type inclusion protein repeat, putative Hypothetical protein CG5800-PA (RE19835p) ENSANGP00000019362 Hypothetical protein KIAA1679 protein Arginine/serine-rich splicing factor 7 Hypothetical protein Hypothetical protein tRNA-dihydrouridine synthase 3-like Hypothetical protein Hypothetical protein Hypothetical protein PF07_0118 CG6038-PA (GH23035p) S3e ribosomal protein Biniou ENSANGP00000015959 Hypothetical protein Ribosomal protein S10 ENSANGP00000020393 Hypothetical protein ENSANGP00000012175 Hypothetical protein Hypothetical protein organisme Plasmodium yoelii yoelii Drosophila melanogaster Mus musculus Vibrio fischeri Tetraodon nigroviridis Mus musculus Drosophila melanogaster Xenopus laevis Pisum sativum (Garden pea) Entamoeba histolytica Dictyostelium discoideum Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Plasmodium yoelii yoelii Homo sapiens Bombyx mori Plasmodium falciparum Plasmodium berghei Xenopus laevis Plasmodium berghei Bacteroides thetaiotaomicron Plasmodium falciparum Drosophila melanogaster Carabus granulatus Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Dictyostelium discoideum Crassostrea gigas Anopheles gambiae Cryptosporidium hominis Anopheles gambiae Paramecium tetraurelia Plasmodium falciparum Keywords COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN METAL-BINDING; NUCLEAR PROTEIN; REPEAT; ZINC COMPLETE PROTEOME CALCIUM; CALCIUM CHANNEL; CALCIUM TRANSPO MITOCHONDRION; RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOM HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; DNA-BINDING; HELICASE; HYDROLAS HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; HELICASE; HYDROLASE; RNA-BINDIN G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR; RECEPTOR; TRA COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN FAD; FLAVOPROTEIN; METAL-BINDING; OXIDOREDU HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; HYDROLASE; HYPOTHETI HYPOTHETICAL PROTEIN RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOMAL PROTEIN DNA-BINDING; DEVELOPMENTAL PROTEIN; NUCLEA HYPOTHETICAL PROTEIN RIBOSOMAL PROTEIN ANTIOXIDANT HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN; METAL-BINDING; UBL CO HYPOTHETICAL PROTEIN 168 Annexes EST PUC-192 PUC-195 PUC-196 PUC-197 PUC-199 PUC-2 PUC-20 PUC-201 PUC-202 PUC-203 PUC-206 PUC-207 PUC-208 PUC-209 PUC-210 PUC-213 PUC-214 PUC-215 PUC-216 PUC-219 PUC-22 PUC-221 PUC-224 PUC-225 PUC-226 PUC-227_2 PUC-228 PUC-229 PUC-23 PUC-230 PUC-232 PUC-233 PUC-235 SP-AC Q54EQ0 Q4PLU5 Q9NDS8 Q7Q3D8 Q6MTS6 Q4RER2 Q4FKB6 Q7QUA2 Q8SXJ8 Q7PVA9 Q85QQ1 Q7QA05 O95995 Q5UEM9 Q8IJF3 Q5KEA4 O01677 Q9V6Q7 Q7Q8A9 Q5XXS3 Q9VVA5 Q6LFD1 Q43S93 P40456 Q8IM74 Q8IER9 Q8VQB8 Q4FKE1 Q7S8D5 Q9Z0L1 Q4Y1L9 Q6CB32 Q7QC01 E-value 3.8 1,00E-35 0.090 1,00E-50 4.8 3,00E-12 0.004 8.3 3,00E-25 2,00E-16 8,00E-35 5,00E-13 0.033 8,00E-54 6.6 7,00E-24 7,00E-07 4,00E-17 6,00E-06 3,00E-09 5,00E-08 0.090 1.3 3.8 8.5 2.2 9,00E-07 5,00E-05 1.6 0.59 0.78 0.35 1,00E-53 Description organisme Hypothetical protein Dictyostelium discoideum Myosin VI Chlamys farreri Ecdysteroid-inducible angiotensin-converting eBombyx mori ENSANGP00000018531 Anopheles gambiae Conserved hypothetical transmembrane protei Mycoplasma mycoides Chromosome 13 SCAF15122 Tetraodon nigroviridis Hypothetical protein Trypanosoma brucei GLP_155_30673_36963 Giardia lamblia RE19335p (CG17493-PA 3) Drosophila melanogaster ENSANGP00000013352 Anopheles gambiae Cytochrome oxidase subunit I Diuraphis noxia ENSANGP00000011737 Anopheles gambiae Growth-arrest-specific protein 8 Homo sapiens Vacuolar ATP synthase subunit d 1 Toxoptera citricida Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransPlasmodium falciparum Hypothetical protein Cryptococcus neoformans P260 Bombyx mori CG6050-PA Drosophila melanogaster ENSANGP00000011098 Anopheles gambiae Putative mitochondrial ATP synthase gamma- Oncometopia nigricans CG13024-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein Plasmodium falciparum Hypothetical protein Solibacter usitatus Ellin6076 Hypothetical 128 7 kDa protein Saccharomyces cerevisiae Lysophospholipase, putative Plasmodium falciparum Hypothetical protein MAL13P1 25 Plasmodium falciparum IntI Citrobacter freundii Hypothetical protein Trypanosoma brucei Hypothetical protein Neurospora crassa Sphingosine 1-phosphate receptor Edg-6 Mus musculus Hypothetical protein Plasmodium chabaudi Similarity Yarrowia lipolytica ENSANGP00000014258 Anopheles gambiae Keywords HYPOTHETICAL PROTEIN GLYCOLYSIS; LYASE; MAGNESIUM COMPLETE PROTEOME HYPOTHETICAL PROTEIN CALCIUM; REPEAT MITOCHONDRION COILED COIL; CYTOSKELETON; FLAGELLUM; MICROTU AMINOTRANSFERASE; TRANSFERASE COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL HYDROLASE HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN; REPEAT; WD REPEAT G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR; GLYCOPROTEIN; LI HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME Tumor necrosis factor alpha converting enzyme homologue 169 Annexes EST PUC-237 PUC-238_1 PUC-239 PUC-24 PUC-240 PUC-242 PUC-243 PUC-244 PUC-245 PUC-247 PUC-248 PUC-249 PUC-25 PUC-250 PUC-251 PUC-252 PUC-253 PUC-256 PUC-257 PUC-258 PUC-259_2 PUC-26 PUC-261 PUC-262 PUC-263 PUC-264 PUC-265 PUC-266 PUC-267 PUC-268 PUC-269_2 PUC-270 PUC-271 PUC-272 SP-AC Q6GZT3 Q9VJ75 Q6XHI8 Q8HIH5 Q4GXP7 Q7PRK5 Q9Y132 Q7Q9J1 Q8T4U2 Q9V7W7 O02339 Q7PM18 Q57VG4 Q7Q1K2 Q8DJI3 Q7KUZ0 Q57VD0 Q59IU3 Q95S27 Q57J74 Q5TP04 Q51PK9 Q7QKW6 Q699M8 Q5TTM1 Q9TXW0 Q7QFV6 Q9V4Z4 Q4RJG7 Q4Z508 Q4FKB4 Q95RH0 Q9VC99 Q8I1Q7 E-value 8,00E-06 1,00E-05 6,00E-25 0.12 3,00E-41 4,00E-33 7,00E-22 2,00E-26 3,00E-31 9,00E-23 1.0 0.17 6.4 9,00E-36 3.9 2,00E-28 8.6 6.3 2.9 3,00E-19 3,00E-07 2.9 4,00E-23 9,00E-24 0.090 2.2 6,00E-17 5,00E-42 2.9 0.77 0.053 2,00E-69 3,00E-30 0.77 Description Hypothetical protein CG10413-PA (GH08340p) Similar to Drosophila melanogaster eIF5 NADH dehydrogenase subunit 5 Ribosomal protein S19e ENSANGP00000016697 CG5815-PB, isoform B ENSANGP00000003742 Chitin synthase (EC 2 4 1 16) CG9000-PA (LD04933p) Hypothetical protein ENSANGP00000022326 Hypothetical protein ENSANGP00000010180 Tlr1240 protein CG9126-PB, isoform B Hypothetical protein Vitellogenin GM13370p (CG9772-PC, isoform C) Hypothetical protein ENSANGP00000028331 Hypothetical protein ENSANGP00000002090 Cytochrome b ENSANGP00000026284 Seven tm receptor protein 16 ENSANGP00000005606 CG8258-PA (LD24495p) Chromosome 18 SCAF15038 Hypothetical protein Hypothetical protein LD30157p Probable uridine-cytidine kinase Hypothetical protein PFD0846w organisme Frog virus 3 Drosophila melanogaster Drosophila yak uba Noteroclada confluens Georissus sp APV-2005 Anopheles gambiae Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Manduca sexta Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans Anopheles gambiae Trypanosoma brucei Anopheles gambiae Synechococcus elongatus Drosophila melanogaster Trypanosoma brucei Saturnia japonica Drosophila melanogaster Salmonella choleraesuis Anopheles gambiae Magnaporthe grisea 70-15 Anopheles gambiae Schizaphis graminum Anopheles gambiae Caenorhabditis elegans Anopheles gambiae Drosophila melanogaster Tetraodon nigroviridis Plasmodium berghei Trypanosoma brucei Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Plasmodium falciparum Keywords HYPOTHETICAL PROTEIN TRANSMEMBRANE; TRANSPORT MITOCHONDRION RIBOSOMAL PROTEIN GLYCOSYLTRANSFERASE; TRANSFERASE HYDROLASE; METALLOPROTEASE; PROTEASE; ZINC COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN ELECTRON TRANSPORT; HEME; IRON; METAL-BINDING COMPLETE PROTEOME; RECEPTOR ATP-BINDING; CHAPERONE; NUCLEOTIDE-BINDING HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; HYPOTHETICAL PROTEIN; KINASE; NUCL HYPOTHETICAL PROTEIN 170 Annexes EST PUC-273 PUC-274 PUC-275 PUC-276 PUC-278 PUC-279 PUC-28 PUC-280 PUC-281 PUC-282 PUC-283 PUC-284 PUC-285 PUC-287 PUC-288 PUC-289_1 PUC-29 PUC-290 PUC-292 PUC-293 PUC-294 PUC-295 PUC-296_2 PUC-297 PUC-298 PUC-3 PUC-30 PUC-300 PUC-301 PUC-302 PUC-303 PUC-304 PUC-306_2 PUC-308 SP-AC Q49M29 Q6FSE3 Q5TX48 Q7RT40 Q4RY99 Q5QBM1 O30626 Q9L8V9 Q8IEQ0 Q8I361 O61305 Q7Q4D9 Q13561 Q4XYU9 Q6GZT3 Q6VQ13 Q5R619 Q9VJG0 Q8D1V7 Q24319 Q9XZE4 Q8NYL4 Q962T2 Q597Q0 Q55E87 Q4RWL6 Q4PLZ1 Q9V3L3 Q67EX4 Q7PMI1 Q4FKE1 Q8IJE7 Q7V9H1 Q9VUB8 E-value 3,00E-34 0.032 2,00E-07 4.9 0.018 4,00E-08 2.9 0.052 4.9 0.37 3,00E-09 2,00E-08 8,00E-21 0.20 4,00E-06 3,00E-33 2,00E-47 4,00E-35 1.2 2,00E-27 3,00E-40 1.00 1,00E-12 2,00E-28 1.7 0.014 3,00E-04 3,00E-20 2,00E-52 3,00E-18 4,00E-06 7.8 5.1 0.031 Description Myosin light chain Chromosome H complete sequence ENSANGP00000028287 GTP-binding protein-related Chromosome 3 SCAF14978 ADP/ATP translocase Putative O-antigen polymerase 87-kDa surface lipoprotein precursor Hypothetical protein MAL13P1 32 Hypothetical protein PFI0440w DEAD-box helicase Dbp80 ENSANGP00000019506 Dynactin subunit 2 Hypothetical protein Hypothetical protein ADP/ATP translocase Hypothetical protein DKFZp459J0215 CG6291-PA (LD20901p) (Aminopeptidase P) MreD protein Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein gly Phosphate transporter Hypothetical protein MW0176 60S ribosomal protein L28 Collagen type IV alpha 3 chain Hypothetical protein Chromosome 3 SCAF14987 Signal sequence receptor delta CG10913-PA (Serpin-6) Immune signaling kinase MEK3 ENSANGP00000012267 Hypothetical protein Hypothetical protein Polyphosphate kinase CG6513-PA, isoform A organisme Gryllotalpa orientalis Candida glabrata Anopheles gambiae Plasmodium yoelii yoelii Tetraodon nigroviridis Culicoides sonorensis Escherichia coli Mycoplasma hyorhinis Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Homo sapiens Plasmodium chabaudi Frog virus 3 Apis mellifera Pongo pygmaeus Drosophila melanogaster Wigglesworthia glossinidia Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Staphylococcus aureus Spodoptera frugiperda Canis familiaris Dictyostelium discoideum Tetraodon nigroviridis Ixodes scapularis Drosophila melanogaster Aedes aegypti Anopheles gambiae Trypanosoma brucei Plasmodium falciparum Prochlorococcus marinus Drosophila melanogaster Keywords CALCIUM; REPEAT COMPLETE PROTEOME COMPLETE PROTEOME TRANSMEMBRANE; TRANSPORT LIPOPROTEIN; SIGNAL HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; HELICASE; HYDROLASE; NUCLEAR P ATP-BINDING; KINASE; NUCLEOTIDE-BINDING; TRA COILED COIL; CYTOSKELETON; DYNEIN; MEMBRAN HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN TRANSMEMBRANE; TRANSPORT HYPOTHETICAL PROTEIN AMINOPEPTIDASE; HYDROLASE COMPLETE PROTEOME ENDOPLASMIC RETICULUM; SIGNAL; TRANSFERAS TRANSMEMBRANE; TRANSPORT COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOMAL PROTEIN COLLAGEN HYPOTHETICAL PROTEIN RECEPTOR PROTEASE ATP-BINDING; KINASE; NUCLEOTIDE-BINDING; SER HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; KINASE; TRANSFERASE 171 Annexes EST PUC-31 PUC-310_1 PUC-310_2 PUC-311 PUC-313 PUC-314 PUC-315 PUC-316 PUC-317_1 PUC-318 PUC-321 PUC-322 PUC-323 PUC-324 PUC-325 PUC-328 PUC-329 PUC-330 PUC-331_2 PUC-331_3 PUC-333 PUC-334 PUC-335 PUC-336 PUC-337 PUC-338 PUC-339 PUC-34 PUC-340 PUC-342 PUC-343_1 PUC-343_2 PUC-344 PUC-345 SP-AC Q9V375 Q7QB79 Q9VX77 Q5TTG2 Q8BMT0 Q7PWB8 Q53I77 Q6LF29 Q50UY4 Q9V5J5 Q08095 Q7QET4 Q7Q097 Q7PXJ3 Q5HAU8 Q4PD91 Q7QDD3 Q5M9Z9 Q4RHN0 Q5SP50 Q9VP19 Q7QBJ6 Q4HIF0 Q9VX24 Q8IAL4 Q7PTG7 Q7QG15 Q6F447 Q6FWF5 Q4PM71 P08478 Q4QJA1 Q5TNR5 Q8CAB6 E-value 1,00E-04 5,00E-13 5,00E-11 6,00E-40 6,00E-20 7,00E-27 7,00E-18 1.5 0.89 3,00E-12 5.0 2,00E-61 4,00E-13 6,00E-09 1.4 8.3 2,00E-65 3,00E-04 1,00E-28 3,00E-10 0.043 2,00E-20 7.4 5,00E-26 2.3 0.33 9,00E-08 0.040 0.76 1,00E-36 0.074 8.3 1,00E-18 3,00E-33 Description organisme CG11546-PA, isoform A Drosophila melanogaster ENSANGP00000011707 Anopheles gambiae CG5010-PA (RE73921p) Drosophila melanogaster ENSANGP00000028024 Anopheles gambiae 18 days pregnant adult female placenta and e Mus musculus ENSANGP00000006535 Anopheles gambiae Exportin-6-A Xenopus laevis Hypothetical protein Plasmodium falciparum Protein kinase, putative Entamoeba histolytica CG12909-PA (LD31988p) Drosophila melanogaster Dynein heavy chain Tripneustes gratilla ENSANGP00000008130 Anopheles gambiae ENSANGP00000009009 Anopheles gambiae ENSANGP00000009689 Anopheles gambiae Putative competence protein Ehrlichia ruminantium Hypothetical protein Ustilago maydis 521 ENSANGP00000017175 Anopheles gambiae Hypothetical protein orf106b Nicotiana tabacum Chromosome 19 SCAF15045 Tetraodon nigroviridis Novel protein similar to vertebrate MADP-1 proDanio Rerio CG7181-PA (GH15688p) Drosophila melanogaster ENSANGP00000016513 Anopheles gambiae Probable integral membrane protein Campylobacter coli RM2228 CG8173-PA (RE25723p) Drosophila melanogaster Hypothetical protein PF08_0134 Plasmodium falciparum ENSANGP00000009538 Anopheles gambiae ENSANGP00000015314 Anopheles gambiae Elongation factor 1 beta' Plutella xylostella Similar to Q07458 Saccharomyces cerevisiae Candida glabrata SCF ubiquitin ligase complex Ixodes scapularis Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenXenopus laevis Methyltransferase-like protein Leishmania major ENSANGP00000024148 Anopheles gambiae Adult male hypothalamus cDNA Mus musculus Keywords AMINOTRANSFERASE; PYRIDOXAL PHOSPHATE; T TRANSMEMBRANE; TRANSPORT NUCLEAR PROTEIN; PROTEIN TRANSPORT; TRANS HYPOTHETICAL PROTEIN KINASE ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING MITOCHONDRION TRAF 3 rattus norvegicus homologue COMPLETE PROTEOME HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN; MITOCHONDRION METAL-BINDING; RNA-BINDING; ZINC; ZINC-FINGER. ATP-BINDING; KINASE; NUCLEOTIDE-BINDING; SER HYPOTHETICAL PROTEIN ELONGATION FACTOR; PROTEIN BIOSYNTHESIS COMPLETE PROTEOME LIGASE ALTERNATIVE SPLICING; COPPER; GLYCOPROTEIN METHYLTRANSFERASE; TRANSFERASE KINASE 172 Annexes EST PUC-346 PUC-347 PUC-348 PUC-349 PUC-35 PUC-350 PUC-351 PUC-352 PUC-353 PUC-354 PUC-356 PUC-358 PUC-359 PUC-360 PUC-361 PUC-362 PUC-363_2 PUC-365 PUC-367 PUC-368 PUC-369 PUC-37 PUC-370 PUC-371 PUC-372 PUC-373 PUC-374 PUC-375 PUC-376 PUC-377 PUC-378 PUC-379 PUC-38 PUC-384 SP-AC Q8HXX8 Q9NA03 Q7QE45 Q7PTN3 Q6BMT4 Q5TN81 Q9SWU8 O08915 Q7Q3L6 Q9YVK0 Q4SGE3 Q8IEN1 Q7Q5N2 Q9VHY6 Q8I6V4 Q4FKE1 Q4FKB8 Q9P6K0 Q9TYA3 Q9Z2G8 Q4DKV4 Q4FKB8 Q4FKE4 Q9V7K2 Q68DI5 Q8IJE7 P05049 Q76BX2 Q7Q4R7 Q7M451 Q6AWN9 Q9VZL1 Q613I5 Q4H2Q8 E-value 1,00E-05 2,00E-33 1,00E-83 2,00E-53 1.6 2.7 2.2 2,00E-09 2,00E-26 0.12 5,00E-12 1.7 5,00E-18 6,00E-11 4,00E-08 7,00E-05 0.001 4,00E-13 0.068 4,00E-10 4.0 0.019 1,00E-06 1,00E-92 1.1 7.7 8,00E-17 7,00E-39 1,00E-18 3,00E-19 1,00E-67 1,00E-07 5,00E-39 3,00E-13 Description organisme Keywords FAD; FLAVOPROTEIN; MITOCHONDRION; OXYDORE Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial prMacaca fascicularis Actin Daphnia magna STRUCTURAL PROTEIN ATP-BINDING; HELICASE; HYDROLASE; NUCLEOTID ENSANGP00000016791 Anopheles gambiae ENSANGP00000018620 Anopheles gambiae ATP-BINDING; MAGNESIUM; METAL-BINDING; NUCL Chromosome F Debaryomyces hansenii COMPLETE PROTEOME ENSANGP00000026423 Anopheles gambiae ATP-BINDING; KINASE; NUCLEOTIDE-BINDING; REC Receptor-like kinase Oryza sativa AH receptor-interacting protein (AIP) Mus musculus REPEAT; TPR REPEAT ENSANGP00000010081 Anopheles gambiae Putative inhibitor of apoptosis protein (IAP) Melanoplus sanguinipes entomopoxvirus Chromosome 17 SCAF14597 Tetraodon nigroviridis Hypothetical protein MAL13P1 39 Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000012986 Anopheles gambiae CG2943-PA Drosophila melanogaster Beta-I tubulin Callinectes sapidus Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN SPAC1527 03 protein Schizosaccharomyces pombe COMPLETE PROTEOME Copper chaperone Caenorhabditis elegans COMPLETE PROTEOME Rattus norvegicus LIPOPROTEIN; NUCLEAR PROTEIN; PHOSPHORYLA Nucleosome assembly protein 1-like 1 Hypothetical protein Trypanosoma cruzi HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN CG8443-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein DKFZp781H1425 Homo sapiens HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN Serine protease snake precursor Drosophila melanogaster DEVELOPMENTAL PROTEIN; HYDROLASE; PROTEA Phosphoinositide dependent kinase-1 Asterina pectinifera ATP-BINDING; KINASE; NUCLEOTIDE-BINDING; SER ENSANGP00000021416 Anopheles gambiae ENDOPLASMIC RETICULUM Phosphogluconate dehydrogenase Ascidia sydneiensis samea GLUCONATE UTILIZATION; NADP; OXIDOREDUCTAS RE56857p Drosophila melanogaster ATP-BINDING; HELICASE; HYDROLASE; NUCLEOTID CG14981-PA, (Mitochondrial import protein) Drosophila melanogaster Hypothetical protein CBG16372 Caenorhabditis briggsae COLLAGEN; COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICA Ci-SWI/SNF protein Ciona intestinalis 173 Annexes EST PUC-385 PUC-386 PUC-387 PUC-389 PUC-39 PUC-390 PUC-392 PUC-393 PUC-394 PUC-395 PUC-396 PUC-397 PUC-398 PUC-4 PUC-40 PUC-401 PUC-402 PUC-404 PUC-405 PUC-407 PUC-408 PUC-41 PUC-410 PUC-411 PUC-412 PUC-413 PUC-414_1 PUC-414_2 PUC-415 PUC-416 PUC-419 PUC-420 PUC-423 SP-AC Q4QNT7 Q9XTL9 Q4YUF2 Q4ABH1 Q7S0Y7 Q7QIC5 Q5KTT4 Q9U1Q8 Q7Q3J6 Q8IJE7 Q4FKG3 Q8SXB4 Q6NN26 Q7QKL1 Q4U9F3 Q8L5Q4 Q7PZ52 Q9VYQ8 Q9BLQ0 Q6BRB2 Q6ZPG9 Q5WRL3 Q4RSN7 Q5B1Y9 Q641S4 Q8IJE7 Q6RSS9 Q7QG53 Q9VDK7 Q7PTH7 Q59DP5 Q4S0Q2 Q9VF20 E-value 1,00E-04 5,00E-93 1.00 4,00E-57 1.3 1,00E-17 2,00E-13 4.9 7,00E-27 9.6 0.001 5,00E-09 1,00E-49 0.014 1.3 8,00E-17 3,00E-38 1,00E-16 7,00E-23 0.58 4,00E-19 5.0 8,00E-11 2,00E-39 0.005 7.2 8,00E-06 3,00E-14 3,00E-24 3,00E-07 2,00E-06 1,00E-17 5,00E-39 Description organisme Keywords TonB Haemophilus influenzae COMPLETE PROTEOME Glycogen phosphorylase (EC 2 4 1 1) Drosophila melanogaster CARBOHYDRATE METABOLISM; GLYCOGEN META Hypothetical protein Plasmodium berghei HYPOTHETICAL PROTEIN CG33715-PD, isoform D Drosophila melanogaster CYTOSKELETON Predicted protein Neurospora crassa ENSANGP00000020214 Anopheles gambiae FAD; FLAVOPROTEIN; OXIDOREDUCTASE Hypothetical protein dNAT1 Drosophila melanogaster HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Caenorhabditis elegans COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000010151 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN GH11346p Drosophila melanogaster TRANSMEMBRANE; TRANSPORT RE18634p Drosophila melanogaster ENSANGP00000012930 Anopheles gambiae DEVELOPMENTAL PROTEIN; HYDROLASE; PROTEA Ubiquitin protein ligase E3 component Theileria annulata LIGASE Putative adenosine kinase (EC 2 7 1 20) Cicer arietinum KINASE; TRANSFERASE ENSANGP00000014036 Anopheles gambiae CG1490-PB Drosophila melanogaster Cytochrome p450 Myzus persicae HEME; MONOOXYGENASE; OXIDOREDUCTASE COMPLETE PROTEOME Similar to CA5182; IPF11093 Candida albican Debaryomyces hansenii MKIAA1861 protein Mus musculus Hypothetical protein srz-102 Caenorhabditis elegans COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN Chromosome 12 SCAF14999 Tetraodon nigroviridis SH3 DOMAIN Hypothetical protein Aspergillus nidulans FGSC A4 HYPOTHETICAL PROTEIN; RIBONUCLEOPROTEIN; R LOC494630 protein Xenopus laevis Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN Cniwi Podocoryne carnea ENSANGP00000011087 Anopheles gambiae CG5434-PA Drosophila melanogaster ENSANGP00000010728 Anopheles gambiae ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING CG17964-PH, isoform H Drosophila melanogaster Chromosome 2 SCAF14781 Tetraodon nigroviridis ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING; REPEAT; TRA CG4225-PA (SD08058p) Drosophila melanogaster 174 Annexes EST PUC-424 PUC-426 PUC-427 PUC-428 PUC-429 PUC-43 PUC-430 PUC-431 PUC-433 PUC-434 PUC-435 PUC-436 PUC-439 PUC-44 PUC-441 PUC-442_2 PUC-444 PUC-445 PUC-446 PUC-447_1 PUC-447_2 PUC-448 PUC-449 PUC-450 PUC-451 PUC-452 PUC-454 PUC-455 PUC-456 PUC-460_2 PUC-461 PUC-462 PUC-464 SP-AC Q69I00 Q8T4F7 Q6SHL3 Q7Z1B8 Q94518 Q86AF5 Q95V16 Q8T103 Q7Q7V5 Q4FKG1 Q7Q0A5 Q7SXX6 Q9VCQ7 Q7PFX4 Q7PW86 Q8GUF5 O45280 Q51GM3 O61577 Q85QQ1 Q5MGI8 Q6I6Y5 Q55Q38 Q8Y4V0 Q8IP01 P51953 Q9U505 Q7Q068 Q4RWW5 Q9W6Y1 Q8IGP0 Q4S7E0 Q8IFW7 E-value 5,00E-28 0.35 0.56 6,00E-17 6,00E-42 0.004 3,00E-04 6,00E-74 5,00E-09 1,00E-06 7,00E-63 1,00E-14 4,00E-48 4,00E-23 9,00E-10 7,00E-13 2.9 5.5 1,00E-10 8,00E-35 7,00E-10 8,00E-09 0.34 3.8 1,00E-81 1,00E-07 4,00E-24 0.089 2.9 2,00E-08 0.98 8.4 5,00E-09 Description organisme Cytochrome c oxidase subunit I Forda riccobonii SD08336p Drosophila melanogaster Hypothetical protein uncultured bacterium 314 Protein transport protein Gryllotalpa orientalis Nascent polypeptide-associated complex alphDrosophila melanogaster Similar to P. falciparum protein kinase Dictyostelium discoideum Cuticular protein Myzus persicae BMKETTIN Bombyx mori ENSANGP00000002478 Anopheles gambiae Hypothetical protein Trypanosoma brucei ENSANGP00000008996 Anopheles gambiae Zgc:63693 Danio rerio CG4656-PA (LD40758p) Drosophila melanogaster ENSANGP00000023020 Anopheles gambiae ENSANGP00000016560 Anopheles gambiae Putative reverse transcriptase Cicer arietinum Hypothetical protein srbc-83 Caenorhabditis elegans Rho guanine nucleotide exchange factor, puta Entamoeba histolytica Katanin p60 ATPase-containing subunit Strongylocentrotus purpuratus Cytochrome oxidase subunit I Diuraphis noxia Myosin 2 light chain (Myosin 1 light chain) Lonomia obliqua Macrophage migration inhibitory factor Ascaris suum Hypothetical protein Cryptococcus neoformans Lmo2330 protein Listeria monocytogenes CG17927-PK, isoform K Drosophila melanogaster Cell division protein kinase 7 Carassius auratus ATP synthase lipid-binding protein Manduca sexta ENSANGP00000016590 Anopheles gambiae Chromosome 15 SCAF14981 Tetraodon nigroviridis Heat shock cognate 71 kDa protein (Hsc70 1) Oryzias latipes RE56164p Drosophila melanogaster Chromosome 13 SCAF14715 Tetraodon nigroviridis Eukaryotic translation initiation factor 4H Chironomus tentans Keywords MITOCHONDRION NUCLEAR PROTEIN; PROTEIN TRANSPORT; TRANS HYPOTHETICAL PROTEIN ENDOPLASMIC RETICULUM; PROTEIN TRANSPORT DEVELOPMENTAL PROTEIN; PROTEIN TRANSPORT KINASE IMMUNOGLOBULIN DOMAIN HYPOTHETICAL PROTEIN CYTOSKELETON; MEMBRANE LIM DOMAIN; METAL-BINDING; ZINC RNA-DIRECTED DNA POLYMERASE COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN GUANINE-NUCLEOTIDE RELEASING FACTOR ATP-BINDING; CELL CYCLE; CELL DIVISION; DIRECT MITOCHONDRION CALCIUM; REPEAT HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME ATP-BINDING; CELL CYCLE; CELL DIVISION; KINASE CF(0); HYDROGEN ION TRANSPORT; ION TRANSPO ATP-BINDING; HEAT SHOCK; MULTIGENE FAMILY; N MITOCHONDRION INITIATION FACTOR 175 Annexes EST PUC-466 PUC-467 PUC-468 PUC-469 PUC-47 PUC-471 PUC-474 PUC-475 PUC-476 PUC-477 PUC-478 PUC-481 PUC-482 PUC-483 PUC-484_1 PUC-485 PUC-486 PUC-487 PUC-488 PUC-489 PUC-49 PUC-490 PUC-491 PUC-495 PUC-496 PUC-497 PUC-498 PUC-499 PUC-5 PUC-50 PUC-500 PUC-501 PUC-502 PUC-504 SP-AC Q9VN03 Q4FKB1 Q7QCC6 Q4XML3 Q96IX5 Q7PUV9 Q7Q6P6 Q8IHQ3 Q7PTN3 5R4R2 Q8IEH2 Q54904 Q4GXU3 Q54QN3 Q7Q7W5 Q7RGY3 Q25825 Q9VP61 Q201V8 Q7QCI0 Q4XW61 Q4FKE1 Q7QB96 Q5DGY9 Q7Q967 Q5TSW5 Q7PTI1 Q4FKB5 Q7QFN1 Q4XH81 P21798 Q9LYB2 Q24735 Q6ZTE4 E-value 1,00E-38 2.9 2,00E-19 8.5 4,00E-05 3,00E-05 6,00E-40 2.9 5,00E-42 1,00E-30 7.2 0.005 2,00E-35 8.6 3,00E-10 2.3 8.4 2,00E-81 3,00E-42 7,00E-52 0.14 4,00E-05 2,00E-10 2,00E-20 2,00E-07 5,00E-30 2,00E-63 0.46 6,00E-10 2.2 2,00E-08 6.6 0.001 0.34 Description organisme CG9791-PA Drosophila melanogaster Hypothetical protein Trypanosoma brucei ENSANGP00000012173 Anopheles gambiae Delta tubulin, putative Plasmodium chabaudi Upregulated during skeletal muscle growth 5 Homo sapiens ENSANGP00000022173 Anopheles gambiae ENSANGP00000018717 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium falciparum ENSANGP00000018620 Anopheles gambiae Histidyl-tRNA synthetase Pongo pygmaeus Hypothetical protein PF13_0080 Plasmodium falciparum NanA gene Streptococcus pneumoniae Ribosomal protein S4e Mycetophagus quadripustulatus Hypothetical protein Dictyostelium discoideum ENSANGP00000011457 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii ORF105 protein Plasmodium falciparum Acetyl-coenzyme A synthetase Drosophila melanogaster Putative elongin c protein Acyrthosiphon pisum ENSANGP00000020975 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium chabaudi Hypothetical protein Trypanosoma brucei ENSANGP00000020344 Anopheles gambiae Hypothetical protein Schistosoma japonicum ENSANGP00000013076 Anopheles gambiae ENSANGP00000027535 Anopheles gambiae ENSANGP00000017139 Anopheles gambiae Hypothetical protein Trypanosoma brucei ENSANGP00000007356 Anopheles gambiae Hypothetical protein Plasmodium chabaudi Troponin C, isoform 2 Balanus nubilis Hypothetical protein Arabidopsis thaliana 60A protein precursor (Glass bottom boat prot Drosophila virilis Hypothetical protein FLJ44741 Homo sapiens Keywords HYDROLASE HYPOTHETICAL PROTEIN GTP-BINDING; NUCLEAR PROTEIN; NUCLEOTIDE-BI HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN; LEUCINE-RICH REPEAT; ATP-BINDING; MAGNESIUM; METAL-BINDING; NUCL AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE; ATP-BINDING; LIG HYPOTHETICAL PROTEIN RNA-BINDING; RIBOSOMAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN OXYGEN TRANSPORT COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN ALTERNATIVE SPLICING; LIGASE HYPOTHETICAL PROTEIN; METHYLTRANSFERASE; HYPOTHETICAL PROTEIN ATP-BINDING; HYPOTHETICAL PROTEIN; NUCLEOTI HYPOTHETICAL PROTEIN HYPOTHETICAL PROTEIN ACETYLATION; CALCIUM; DIRECT PROTEIN SEQUE HYPOTHETICAL PROTEIN CYTOKINE; GLYCOPROTEIN; GROWTH FACTOR; SI 176 Annexes EST PUC-505 PUC-506 PUC-507 PUC-508 PUC-509 PUC-51 PUC-510 PUC-511 PUC-512 PUC-513 PUC-515_1 PUC-516 PUC-517 PUC-518 PUC-521 PUC-53 PUC-54 PUC-56 PUC-59 PUC-6 PUC-60 PUC-61 PUC-63 PUC-64 PUC-65 PUC-67 PUC-70 PUC-71 PUC-72 PUC-74 PUC-75 PUC-76 PUC-78 PUC-8 SP-AC Q7YJ58 Q94760 Q9H797 Q7RP04 Q7QA69 Q8DWZ6 Q4LB02 Q8IKF7 Q7QAJ0 Q7QK73 O97272 Q54S12 Q8I5X3 Q7Q6B5 Q86GL0 Q6PPH4 Q9I9B9 Q97A Z5 Q8VQB8 Q5UQH0 Q5TNA8 Q94517 Q8IT93 Q4FKB8 P47947 P22700 Q95V16 Q4Z093 Q6BPK2 Q4WU10 Q7PPM5 Q4U9F3 Q86GL0 Q5UQH1 E-value 1.3 1,00E-16 4,00E-05 6.5 1,00E-24 5,00E-15 3,00E-54 2.8 3,00E-06 2,00E-30 0.88 0.89 0.20 3,00E-14 0.031 6,00E-54 5,00E-09 2.9 2,00E-04 3.9 2,00E-39 2,00E-72 3,00E-12 3,00E-06 2,00E-08 3,00E-42 3,00E-04 0.12 2.9 8.4 0.31 0.59 7,00E-16 3.9 Description organisme Keywords Maturase K Casuarina equisetifolia CHLOROPLAST; MRNA PROCESSING Mitochondrial ATP synthase alpha subunit preStrongylocentrotus purpuratus TRANSIT PEPTIDE Hypothetical protein FLJ21128 Homo sapiens Hypothetical protein Plasmodium yoelii yoelii COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000003764 Anopheles gambiae Pathogenicity protein, putative Streptococcus agalactiae seroty CELL WALL; COMPLETE PROTEOME Ribosomal protein S24e Carabus granulatus RIBOSOMAL PROTEIN Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000019635 Anopheles gambiae ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING ENSANGP00000013416 Anopheles gambiae Hypothetical protein MAL3P5 21 Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Dictyostelium discoideum HYPOTHETICAL PROTEIN Hypothetical protein Plasmodium falciparum HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000004563 Anopheles gambiae Cuticle protein Rhopalosiphum maidis Putative vacuolar ATP synthase subunit D Homalodisca coagulata Torpedo marmorata MEMBRANE; TRANSMEMBRANE; TRANSPORT Choline transporter-like protein 1. TVG0660406 protein Thermoplasma volcanium COMPLETE PROTEOME IntI Citrobacter freundii Hypothetical sel1-like repeat protein R815 Mimivirus HYPOTHETICAL PROTEIN; REPEAT ENSANGP00000028900 Anopheles gambiae HYDROLASE; PROTEASE; SERINE PROTEASE Histone deacetylase Rpd3 (HD) (dRPD3) Drosophila melanogaster CHROMATIN REGULATOR; HYDROLASE; NUCLEAR Y-box protein Ct-p50 Chironomus tentans Hypothetical protein Trypanosoma brucei HYPOTHETICAL PROTEIN Troponin C, isoform 1 Drosophila melanogaster CALCIUM; MULTIGENE FAMILY; MUSCLE PROTEIN; ALTERNATIVE SPLICING; ATP-BINDING; CALCIUM; C Calcium-transporting ATPase sarcoplasmic/enDrosophila melanogaster Cuticular protein Myzus persicae Hypothetical protein Plasmodium berghei HYPOTHETICAL PROTEIN COMPLETE PROTEOME; DNA-BINDING; METAL-BIN Similar to CA1344|IPF14623 Candida albicansDebaryomyces hansenii Hypothetical protein Aspergillus fumigatus Af293 HYPOTHETICAL PROTEIN ENSANGP00000011052 Anopheles gambiae Ubiquitin protein ligase E3 component Theileria annulata LIGASE Cuticle protein Rhopalosiphum maidis Hypothetical sel1-like repeat protein R815 Mimivirus HYPOTHETICAL PROTEIN; REPEAT 177 Annexes EST PUC-80 PUC-81 PUC-82 PUC-86 PUC-87 PUC-88 PUC-89 PUC-9 PUC-90 PUC-91 PUC-92 PUC-93 PUC-94 PUC-95 PUC-96_2 PUC-97 PUC-98 SP-AC Q95V16 Q7P2A6 Q9VZ57 Q7QDW9 Q6YPV6 Q9VYM3 Q6BGY0 Q7PHW7 Q7Q5L5 Q7PTH7 Q6PPH4 Q7PHW7 Q8IJF3 Q57J74 Q4H450 Q8IPZ7 Q7RHV7 E-value 3,00E-09 2.9 2,00E-05 4,00E-06 1.1 2.5 6.5 1,00E-06 5,00E-06 3,00E-07 5,00E-39 1,00E-06 6.6 3,00E-19 6,00E-09 0.018 0.16 Description organisme Cuticular protein Myzus persicae Ser/Thr and Tyr protein phosphatase Fusobacterium nucleatum CG1637-PA, isoform A Drosophila melanogaster ENSANGP00000013749 Anopheles gambiae Type I restriction-modification system methylt Onion yellows phytoplasma CG15730-PA Drosophila melanogaster Similar to CA3283|IPF6274 Candida albicans Debaryomyces hansenii ENSANGP00000025159 Anopheles gambiae ENSANGP00000013033 Anopheles gambiae ENSANGP00000010728 Anopheles gambiae Putative vacuolar ATP synthase subunit D Homalodisca coagulata ENSANGP00000025159 Anopheles gambiae Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransPlasmodium falciparum Hypothetical protein Salmonella choleraesuis Ribosomal protein S18 Crassostrea gigas CG31950-PA Drosophila melanogaster TAP1 protein Plasmodium yoelii yoelii Keywords COMPLETE PROTEOME COMPLETE PROTEOME TRANSMEMBRANE; TRANSPORT ATP-BINDING; NUCLEOTIDE-BINDING TRANSMEMBRANE; TRANSPORT AMINOTRANSFERASE; TRANSFERASE COMPLETE PROTEOME; HYPOTHETICAL PROTEIN RIBONUCLEOPROTEIN; RIBOSOMAL PROTEIN COLLAGEN; COMPLETE PROTEOME 178 FOLIO ADMINISTRATIF THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON NOM : ANSELME Prénoms : Caroline DATE de SOUTENANCE : 06/12/06 TITRE : Réponse immunitaire de l’hôte dans la symbiose bactérienne intracellulaire du charançon Sitophilus zeamais. NATURE : Doctorat Numéro d’ordre : 06-ISAL-00107 Ecole doctorale : Evolution, Ecosystèmes, Microbiologie et Modélisation (E2M2) Spécialité : Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques Cote B.I.U. – Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE : RESUME : De nombreuses espèces d’insectes dépendent de bactéries symbiotiques intracellulaires (ou endocytobiotes) pour leur survie et leur reproduction. Ces bactéries sont transmises maternellement et sont localisées dans le bactériome, un organe spécialisé qui se différencie chez l’embryon en présence des symbiotes. Bien que la symbiose ait largement été étudiée depuis les années trente, le mode de perception des endocytobiotes par l’hôte et les aspects immunitaires de ces associations mutualistes demeurent inconnus. Pour aborder ces aspects, nous avons utilisé chez le charançon Sitophilus zeamais une approche de soustraction d’ADNc (SSH) pour identifier les gènes de la réponse immunitaire (GRI) de l’insecte. Cette approche a permis d’obtenir un large spectre de gènes présentant des similitudes de séquence avec des peptides antibactériens, des lysozymes, des éléments de la cascade prophénoloxydase et des régulateurs de la réponse immunitaire. La surexpression de ces gènes après une infection des larves par des bactéries Gram (-) a ensuite été confirmée par RTPCR en temps réel. La quantification du taux de transcrits des GRI a révélé l’existence d’une réponse immunitaire de l’hôte dans le bactériome larvaire. Cette réponse est toutefois modérée puisqu’à l’exception d’une coléoptéricine, les peptides antibactériens ne sont pas induits par la présence des endocytobiotes. On observe en revanche la surexpression d’un homologue de Tollip, un inhibiteur de la réponse immunitaire décrit chez les mammifères, et la surexpression d’un gène de la famille des “Peptidoglycan recognition proteins” (PGRP) dont l’homologue chez la drosophile (PGRP-LB) est un régulateur négatif de la réponse immunitaire. L’étude du gène PGRP montre qu’il est induit par les bactéries Gram (-), et que son niveau d’expression dépend de la densité bactérienne. Par ailleurs, au cours du développement de l’insecte, ce gène est induit au stade nymphal. Des expériences de FISH ont révélé que cette induction serait liée à la libération d’endocytobiotes à la suite de l’altération du bactériome au cours de la métamorphose. Enfin, nous avons montré l’existence de deux transcrits alternatifs du gène PGRP. Un des transcrit coderait une protéine intracellulaire, et l’autre une protéine transmembranaire. L’analyse du taux de ces deux transcrits révèle que le premier est épissé après une infection des larves par E. coli, alors que le second est épissé majoritairement dans le bactériome larvaire, en présence des endocytobiotes. L’ensemble des données présentées dans ce travail révèle l’existence d’une réponse immunitaire modérée dans l’organe symbiotique, et suggère que la régulation moléculaire de cette réponse serait adaptée au maintien de la symbiose intracellulaire. MOTS CLES : Symbiose intracellulaire / Immunité innée / Insectes / Sitophilus spp. / PGRP Laboratoire(s) de recherches : Laboratoire de Biologie Fonctionnelle, Insectes et Interactions UMR INRA/INSA de Lyon 0203 Directeur de thèse : A. Heddi Président du jury : Composition du jury Rapporteurs : D. Bouchon, B. Lemaitre Examinateurs : F. Fleury, A. Moya, A.N. Volkoff Directeur : A. Heddi
