Pourquoi développer la PCR digitale ? 228 kB

Pourquoi développer « La PCR digitale » ?
L'appareil que nous souhaitons acquérir repose sur une technologie tout à fait révolutionnaire: la
PCR digitale.
Le principe est d'obtenir une quantification absolue de cible d'ADN ou d'ARN à partir de
différents milieux biologiques comme le sang ou le liquide amniotique.
Cette technologie est appelée PCR digitale car elle consiste à amplifier un fragment d'ADN ou
d' ARN à partir d'un échantillon biologique que l'on veut quantifier de façon très précise.
La partition de la cible est réalisée à partir d'un générateur qui va donner naissance à 20 000
gouttelettes. Chaque gouttelette positive contenant au moins une copie d'ADN ou d' ARN est
révélée par une réaction de fluorescence positive. Elle est comparée aux gouttelettes négatives, ce
qui permet de quantifier précisément I' ADN ou l'ARN cible.
La compagnie Bio-Rad commercialise aujourd'hui cet appareil appelé QX200 qui a la plus grande
expérience et le plus grand nombre de publications dans le domaine .
!Les applications!
Deux grands champs d'application sont concernés :
1. le domaine des maladies génétiques,
2. le domaine du cancer .
1. Dans le domaine des maladies génétig ues :
a- les applications en diagnostic anténatal :
Ce repérage et cette quantification de la présence de mutations dans un gène de maladie se
transmettant selon un mode dominant ou récessif permet de savoir si l' ADN du fœtus qui circule en
petite quantité dans le sang de la mère est porteur ou non des mutations du gène identifié dans cette
famille à risque de donner naissance à un enfant porteur d'une maladie génétique. La
mucoviscidose en est un exemple concret.
C'est ce que l'on nomme le diagnostic non invasif qui permet d'éviter le recours à
l'amniocenthèse ou au prélèvement de trophoblaste pour le diagnostic anténatal.
C'est un enjeu majeur pour la recherche et le développement de la médecine fœtale.
b- la recherche génomique
La PCR digitale permet de quantifier et de valider les librairies que l'on prépare pour réaliser du
séquençage massif parallèle dit de nouvelle génération.
Cette technique permet aussi de quantifier précisément les variations structurales du génome et de
quantifier ainsi le nombre de copies d'un gène dans notre génome.
Ces approches vont nous permettre de mieux comprendre les maladies complexes, enjeux
majeurs de la médecine des 10 prochaines années.
2. Dans le domaine du cancer :
Depuis quelques années nous sommes entrés dans l'ère des thérapies ciblées du cancer .La
connaissance des mutations présentes dans certaines tumeurs permet de savoir si le patient va
pouvoir ou non bénéficier d'un traitement ciblé, adapté à son profil tumoral. Les applications sont
aujourd'hui à mettre en place pour le cancer du poumon (mutation cible T790M dans le gène EGFR
par exemple) ou le mélanome métastatique (mutation BRAF V600E).
Cette approche permet de rechercher la présence de la mutation tumorale dans le sang du patient, de
suivre l'évolution de la maladie résiduelle ou de détecter précocement une rechute de la maladie.
!Les« utilisateurs» potentiel
Cet appareil sera utilisé par l'Unité Inserm 1078, le laboratoire de Génétique du CHU (les 2
entités que je dirige aujourd'hui), ma,is ég alementpar le service d'hématologie biologique ou
d'immunolo g ie selon les besoins.
Cette PCR digitale pourra être mise à disposition :
soit du CHU, dans le laboratoire de génétique avec un accès à l'équipe Inserm. Dans ce cas,
l'hôpital en devient propriétaire et se charge de la maintenance.
soit de }'INSERM ou de l'Université. Dans ce cas, la maintenance n'est en général pas
assurée. Même si à l'achat on négocie quelques années de maintenance, la suite ne peut être
qu' à la charge de l'acquéreur ou l'appareil ne sera plus sous maintenance.
!Présentation plus détaillée de la technologie PCR digitale
:I
La puissance de la PCR digitale (PCRd) provient de sa capacité à partitionner un échantillon au sein
de milliers de compartiments distincts (Pekin et al, 2011). Chaque compartiment constitue un
réacteur de PCR indépendant, contenant des amorces oligonucléotidiques et une sonde spécifique
de la séquence étudiée. Si la cible est présente dans le compartiment, elle est amplifiée et un signal
fluorescent sera alors détectable. Au contraire, si le compartiment ne contient aucune cible, la sonde
fluorescente ne sera pas dégradée, et aucune fluorescence ne sera détectée. Après la PCR, chaque
compartiment est ainsi analysé par un lecteur de fluorescence, et le nombre de réactions positives et
négatives est compté. Après correction par la loi de Poisson, le ratio de réactions positives par
rapport aux réactions négatives permet une estimation précise du nombre de cibles d' intérêt dans
l'échantillon de départ. Ainsi, la PCRd permet non seulement de détecter qualitativement une
mutation préalablement connue (grâce à l' utilisation d'amorces spécifiques de l'allèle muté ou
sauvage), mais autorise également la quantification précise du ratio allélique au locus de la
mutation, nécessaire pour la stratégie directe de DPNI.
Avec l'avènement des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS), il est devenu
possible de « compter » des millions voire des milliards de molécules d'ADN (Schuster SC et al,
2008). Cette approche implique le séquençage de millions de molécules d'ADN dans le plasma
maternel. L'alignement des séquences générées sur le génome humain permet de déduire l'origine
chromosomique de ces séquences. En 2008, deux groupes ont montré que le séquençage de l'ADN
acellulaire du plasma maternel permettait de reconstruire l'ensemble de la carte génétique du fœtus
et de détecter les éventuelles perturbations quantitatives dues à la surreprésentation d'un
chromosome chez le fœtus (Chiu RWK, et al, 2008; Fan HC et al, 2008). Dans le cas des maladies
monogéniques telles que la mucoviscidose, l'intervalle génétique impliqué est, par définition, de
taille réduite. Les mutations pathogènes incriminées, ne concernent généralement qu ' un ou que
quelques nucléotides (mutations ponctuelles). Les stratégies consistant à séquencer le génome entier
permettent de détecter qualitativement les séquences normalement absentes du génome maternel,
mais ne permettent pas d'obtenir une profondeur de lecture suffisante pour pouvoir les quantifier de
façon statistiquement significative. Ainsi ont été développées des stratégies impliquant le
séquençage de régions cibles de l'ADN. Le séquençagetrès profond de régions encadrant la ou les
mutation(s) d'intérêt(s) permet l'étude quantitative des ratios alléliques au locus des mutations et
donc la mise en œuvre de la stratégie directe de DPNI. D'autre part, le séquençage d' une région
génomique plus large, telle que la région en 7q31 encadrant le gène CFTR, couplé à l'analyse de
plusieurs membres de la famille, permet l'étude quantitative des polymorphismes SNP de la
régions, et donc la reconstruction des haplotypes et l'étude de leur transmission au fœtus, nécessaire
à la mise en œuvre de la stratégie indirecte de DPNI.
Professeur Claude Férec