Evaluation des propriétés immunomodulatrices de la bactérie
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UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs Laboratoire d’Allergologie Expérimentale Evaluation des propriétés immunomodulatrices de la bactérie lactique Lactobacillus plantarum NCIMB8826 dans le cadre de l'allergie aux acariens Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique Peter Rigaux 2008 Promoteur : Alain Jacquet Co-promoteur : Muriel Moser UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs Laboratoire d’Allergologie Expérimentale Evaluation des propriétés immunomodulatrices de la bactérie lactique Lactobacillus plantarum NCIMB8826 dans le cadre de l'allergie aux acariens Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique Peter Rigaux 2008 Promoteur : Alain Jacquet Co-promoteur : Muriel Moser Je tiens à remercier la Commission Européenne, le Fond pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (FRIA) et la Fondation Alice et David Van Buuren qui m’ont permis à travers leur programme de financement, de réaliser mes cinq années de thèse. Je remercie chaleureusement le Dr. Alain Jacquet, mon promoteur de thèse, de m’avoir accueilli au sein de son laboratoire, de m’avoir soutenu et guidé pendant toutes ces années. Merci à toute l’équipe du laboratoire d’Allergologie Expérimentale : Lida (une aide très précieuse), Louis pour tes différents coups de main et pour ton expertise technique, Manu (qu’ils sont beaux ces Western Blot !), Jonathan pour ton aide et tes conseils, Virginie pour ton aide et ta disponibilité, les étudiants de passage (Farshid, Céline C., Nicolas, Laurence) pour leur aide même si elle a parfois été ponctuée de quelques sueurs froides et tous les autres membres du laboratoire qui ont su y apporter une ambiance chaleureuse (Jean-François, Céline M., Céline B., David, Christelle, Virginie, Eugénie, Mauro, les inoubliables « Quoiquois » et Delphine) Je remercie le Dr. Bruno Pot de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je tiens à exprimer ma plus vive gratitude au Dr. Catherine Daniel pour son aide, sa gentillesse, ses conseils et sa disponibilité. Je remercie Michael Hisbergues pour le travail essentiel qu’il a fourni. Merci à tout le reste de l’équipe et en particulier à Sabine. Je remercie aussi nos colocataires pour leur convivialité. Je remercie vivement le Dr. Joel Pestel de m’avoir accueilli au sein de l’unité U416, d’avoir initié ce projet de collaboration, de m’avoir conseillé et de m’avoir soutenu. Je remercie également toute l’équipe de l’unité U416 et particulièrement Céline Ratajczak et Philippe Marquillies. Je remercie le Dr. Muriel Moser d’avoir accepté d’être la co-promotrice de cette thèse. Enfin, last but not least, je remercie ma famille pour m'avoir apporté un soutien affectif et matériel pendant toute cette aventure. ADN : Acide DésoxyriboNucléique APC : Antigen Presenting Cell BMDC : Bone Marrow-derived Dendritic Cell CD : Cluster of Differentiation CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CFSE : CarboxyFluoresceine Succinimidyl Ester CpG : deoxy-Cytidylate-phosphate-deoxyGuanylate DC : Dendritic Cell DC-SIGN : Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3 Grabbing Nonintegrin ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase GM-CSF : Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor IFN : InterFéroN IL : InterLeukin JNK : c-Jun N-terminal Kinase KO : Knock Out LPS : LipoPolySaccharide LTA : LipoTeichoic Acid MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MCP : Monocyte Chemotactic Protein MD-DC : Monocyte Derived Dendritic Cell MIP : Macrophage Inflammatory Protein MR : Mannose Receptor MyD88 : Myeloblast Differentiation factor 88 NK : Natural Killer ODN : OligoDeoxyNucleotide OVA : OVAlbumin PAMPs : Pathogen Associated Molecular Patterns PBMC : Peripheral blood mononuclear cells PG : ProstaGlandin PGN : PeptoGlycaN PRRs : Pattern Recognition Receptors RANTES : Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription TcR : T cell Receptor TGF : Tranforming Growth Factor TH : T Helper cell TIR : Toll/Interleukin-1 Receptor TLR : Toll Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor WT : Wild Type ZO-1 : Zonula Occludens 1 I. RESUME ............................................................................................................................ 1 II. A. INTRODUCTION.......................................................................................................... 3 L’allergie ...................................................................................................................................................... 4 Nomenclature ................................................................................................................................................ 4 Prévalence ..................................................................................................................................................... 4 Mécanismes de la réponse allergique............................................................................................................ 5 a) Les différentes phases de la réponse allergique ........................................................................................ 5 b) Intervenants ............................................................................................................................................... 6 (1) La cellule dendritique........................................................................................................................ 6 (2) Le lymphocyte T ............................................................................................................................. 11 (3) Autres principaux types cellulaires .................................................................................................16 4. Les allergènes .............................................................................................................................................. 19 a) Caractéristiques générales ....................................................................................................................... 19 b) Der p 1 ..................................................................................................................................................... 20 5. Facteurs de risque ou de protection............................................................................................................. 22 (1) Facteurs génétiques ......................................................................................................................... 22 (2) Facteurs environnementaux ............................................................................................................ 23 6. L’asthme allergique IgE-dépendant ............................................................................................................ 28 7. Stratégies actuelles de traitements contre l’allergie ................................................................................... 32 1. 2. 3. B. Les bactéries lactiques .............................................................................................................................. 35 Caractéristiques générales ........................................................................................................................... 35 Composants liés à l’immunité antibactérienne ........................................................................................... 36 a) Structure générale des bactéries lactiques............................................................................................... 36 b) Composants reconnus par le système immunitaire inné ......................................................................... 37 (1) Le peptidoglycan ............................................................................................................................. 37 (2) Les acides téichoïques..................................................................................................................... 38 (3) L’ADN ............................................................................................................................................ 39 (4) Autres composants .......................................................................................................................... 40 3. Interactions avec l’hôte ............................................................................................................................... 40 a) Localisation ............................................................................................................................................. 40 b) Tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales et nasales........................................................ 41 4. Bactéries lactiques et allergie...................................................................................................................... 43 5. Les bactéries lactiques en tant que vecteur de délivrance d’antigènes ....................................................... 46 a) Vecteurs d’expression ............................................................................................................................. 46 b) Localisation de l’antigène ....................................................................................................................... 48 1. 2. III. OBJECTIFS.................................................................................................................. 50 IV. RESULTATS ................................................................................................................ 51 A. Article I....................................................................................................................................................... 52 B. Article II ..................................................................................................................................................... 55 C. Résultats complémentaires ....................................................................................................................... 58 V. DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES .................................................. 64 VI. MATERIEL ET METHODES.................................................................................... 80 VII. BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................... 92 Les bactéries lactiques regroupent un ensemble hétérogène de bactéries dont certains genres comme les lactobacilles ou les bifidobactéries font partie de la flore commensale. Certains effets antiinflammatoires des bactéries lactiques sont attribuables à leur capacité à stimuler la cellule dendritique, une cellule présentatrice d’antigène qui joue un rôle clé dans la polarisation de la réponse immune. Les effets anti-allergiques des bactéries lactiques sont suggérés par plusieurs études épidémiologiques qui ont démontré qu’un défaut de colonisation par les lactobacilles et les bifidobactéries est associé à une plus forte incidence de l’allergie. De plus, des études menées sur des modèles expérimentaux d’asthme et des essais cliniques consacrés à la dermatite atopique montrent que certaines souches de bactéries lactiques réduisent les symptômes liés à l’allergie. Paradoxalement, les effets anti-allergiques des bactéries lactiques sont sous-exploités par les stratégies de traitement de l’allergie. D’autre part, les mécanismes empruntés par ces bactéries pour moduler l’allergie restent peu caractérisés. Dans un premier temps, nous avons analysé la capacité de L. plantarum à moduler l’activation de la cellule dendritique étant donné le rôle déterminant de cette cellule en immunologie. Nous avons également identifié les voies de signalisation responsables de cette activation. Nous montrons que L. plantarum induit, chez la cellule dendritique dérivée de la moelle osseuse, la production d’une forte quantité d’IL-12 p40, d’IL-12 p70, de TNF- et d’une quantité plus faible d’IL-10. Cette faculté à induire la sécrétion de cytokines polarisantes repose sur l’activation de TLR2 et de TLR9 et dépend de la protéine adaptatrice MyD88. Nous avons également démontré que l’acide lipotéichoïque et l’ADN génomique de L. plantarum sont respectivement des agonistes de TLR2 et TLR9 et qu’ils participent à l’activation de la cellule dendritique. L. plantarum provoque l’activation de plusieurs voies de signalisation intracellulaire : la voie NF-B et la voies des MAPKs (en particulier JNK, p38 et ERK 1/2) qui contribuent toutes deux au développement de la réponse cytokinique induite par cette bactérie lactique. Les récepteurs scavenger CD14 et CD36 facilitent l’établissement d’un contact entre L. plantarum et la cellule dendritique. La participation de CD14 améliore de manière significative la réponse TLR2-dépendante induite par L. plantarum. Enfin, il semblerait que ce soit la forme homodimérique de TLR2 (TLR2-TLR2) et non les formes hétérodimériques TLR1-TLR2/TLR2TLR6 qui soit la plus apte à reconnaître L. plantarum. Nous avons ensuite analysé le potentiel prophylactique d’une coadministration L. plantarum + Der p 1 dans un modèle murin d’allergie à Der p 1. Nous montrons que cette formulation prévient le développement de la réponse IgE Der p 1-spécifique et polarise la réponse IgG vers un profil TH1 caractérisé par une forte production d’anticorps IgG2a spécifiques. Au niveau de la réponse cellulaire, ce prétraitement induit le développment d’une réponse TH1 Der p 1-spécifique caractérisée par une forte production d’IFN- et une faible production d’IL-5. En parallèle, une baisse de l’éosinophilie 1 pulmonaire est observée. En revanche, l’administration de l’allergène seul ou par la bactérie seule n’a pas d’effets significatifs sur le développement de la réponse cellulaire ou sur l’inflammation du poumon. Le pré-traitement par Der p 1 réussit cependant à prévenir la production d’anticorps IgEspécifiques. Der p 1 étant un des allergènes d’acariens les plus immunodominants, cet ensemble de données montre donc que l’association de L. plantarum et de Der p 1 constitue un traitement prophylactique prometteur pour la prévention de l’allergie aux acariens. Comme la coadministration de L. plantarum + Der p 1 prévient les caractéristiques principales de l’allergie et comme des systèmes d’expression de protéines ont été développés pour L. plantarum, nous avons généré une bactérie recombinante produisant Der p 1 à partir de cette bactérie lactique dans la perspective de l’utiliser comme vecteur vivant de délivrance d’antigène. La forme recombinante de l’allergène que nous avons réussi à faire produire par L. plantarum correspond à une protéine de fusion entre la Maltose Binding Protein de E. coli et ProDer p 1 (le zymogène de Der p 1), la présence de ce partenaire de fusion étant indispensable à la production de ProDer p 1. Le prétraitement intranasal par la bactérie recombinante prévient le développment de la production d’anticorps IgE-Der p 1-spécifiques et stimule la production d’anticorps IgG2a spécifiques, reproduisant les effets de la coadministration L. plantarum + Der p 1. Le prétraitment par cette bactérie recombinante réduit de manière drastique la production d’IL-5 des cellules spléniques et des cellules ganglionnaires médiastinales. Ce prétraitment prévient aussi l’éosinophilie pulmonaire induite par inhalation d’extraits totaux d’allergènes après sensibilisation mais n’a pas d’effet sur l’hyperréactivité bronchique. En combinant les effets adjuvants de L. plantarum et une capacité à susciter une réponse antigénique forte, des souches recombinantes de L. plantarum exprimant des allergènes ouvrent de nouvelles perspectives dans la création de nouveaux traitements immunothérapeutiques contre l’allergie. Des manipulations complémentaires montrent que L. plantarum réoriente le profil de sécrétion de cytokines de splénocytes de souris sensibilisées à Der p 1 vers un profil TH1, démontrant que cette bactérie possède aussi un potentiel thérapeutique. Enfin, nous avons testé les propriétés immunomodulatrices de la bactérie recombinante chez l’homme par l’utilisation de cellules dendritiques dérivées de monocytes sanguins (MD-DC) et de lymphocytes T autologues. Des données préliminaires indiquent que la stimulation de MD-DC par L. plantarum (bactérie sauvage ou recombinante) provoque une forte production d’IL-12 et une faible production d’IL-10, des résultats qui sont analogues à ce que nous avons observé au niveau des DC murines. De manière intéressante, ces MD-DC stimulées par L. plantarum provoquent la prolifération des lymphocytes T naïfs ou mémoires autologues et induisent une forte sécrétion de cytokines TH1 (IFN-) mais pas de cytokines TH2 (IL-4 et IL-5). Les taux de proliférations et les profils de cytokines de la bactérie sauvage et de la bactérie recombinante sont identiques. Ces données suggèrent donc que nos données expérimentales obtenues chez la souris soient transposables chez l’humain. 2 3 1. Nomenclature L’allergie est une réaction immunitaire exacerbée qui est dirigée contre des antigènes environnementaux non-infectieux (allergènes) et dont le développement dépend de la production d’anticorps IgE allergène-spécifiques. Les allergènes sont presque exclusivement des protéines. Exceptionnellement, des substances de bas poids moléculaire, par exemple des isocyanates ou des anhydrides, jouant le rôle d'haptènes, peuvent être considérés comme des allergènes pour leur capacité à lier les anticorps IgE (1). Quelques fois, des structures glycaniques pures peuvent être considérées comme des allergènes. L’atopie, quant à elle, est une prédisposition personnelle et/ou familiale se manifestant le plus souvent durant l'enfance ou l'adolescence à produire des anticorps IgE spécifiques en réponse à une exposition naturelle à des allergènes. En conséquence de quoi, les individus développant ce type de réaction immunitaire peuvent exprimer des symptômes typiques d'asthme, de rhino-conjonctivite ou d'eczéma. L’asthme est un syndrome chronique affectant les voies aériennes faisant intervenir de nombreux types cellulaires dont, en particulier, les mastocytes les éosinophiles et les lymphocytes T. Cette inflammation chronique est liée à une hyperréactivité des voies aériennes (une sensibilité exagérée des voies aériennes caractérisée par la facilité et l'intensité avec lesquelles survient une broncho-constriction lors de stimulations diverses) et entraîne, chez certaines personnes, des épisodes répétés de sifflements, de dyspnée, d’oppression thoracique et de toux. Ces épisodes sont habituellement associés à une large mais variable limitation des débits aériens qui est réversible spontanément ou sous traitement. Bien qu’il existe des asthmes non-allergiques, l’asthme allergique IgE-dépendant est la forme d’asthme la plus répandue (2). 2. Prévalence L’European Community Respiratory Health Survey (ECRHS) est la première étude internationale évaluant la prévalence de l’allergie pour laquelle un protocole standardisé fut utilisé (3). Cette étude longitudinale (étude à long terme comprenant un suivi dans le temps) fut initiée en 1990 dans plusieurs centres internationaux (32 centres européens, 1 centre australien, 1 centre américain, 1 centre néo-zélandais) et porta sur plus de 10000 jeunes adultes. L’analyse des données recueillies nous indique que globalement 36 % des individus sont sensibilisés aux allergènes. Les plus faibles taux de sensibilisation sont observés à Albacete en Espagne (16% de moyenne) et les plus élevés à Cristchurch en Nouvelle Zélande (45% de moyenne) (figure 1). Cette étude démontre 4 également que l’allergie aux acariens (Dermatophagoides pteronyssinus) est de loin le type d’allergie le plus commun (21,7 % de la population sensibilisée) (4). De plus, le degré de sensibilisation à ce type d’allergie est fortement associé au développement de l’hyperréactivité bronchique (p<0,001) (5), une caractéristique de l’asthme. L’International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC), une seconde étude longitudinale standardisée, a analysé la prévalence de trois manifestations majeures de l’allergie (l’asthme, la rhinoconjuctivite atopique et l’eczéma atopique ) chez 700000 enfants répartis dans 56 pays (156 centres) (figure 2) (6, 7). Cette étude démontre que la prévalence de ces trois pathologies est particulièrement élevée dans les pays industrialisés anglo-saxons. Par ailleurs, leur fréquence varie considérablement d’un pays à l’autre atteignant parfois un facteur 10 de différence entre certains pays (figure 2). Récemment, ces résultats ont été réactualisés lors de la troisième phase de l’étude ISAAC(7). Les conclusions de cette étude sont que ces trois pathologies tendent à augmenter au niveau de l’échelle planétaire à l’exception de l’asthme pour la tranche d’âge 13-14 ans. Cependant, la situation s’améliore quelque peu dans certaines régions particulièrement touchées comme le Royaume-Uni, l’Irlande, l’Australie, les Etats-Unis et le Canada. 3. Mécanismes de la réponse allergique a) Les différentes phases de la réponse allergique La physiopathologie de l’allergie peut être scindée en trois phases successives (figure 3). La première phase est la phase de sensibilisation au cours de laquelle s’instaure la mémoire immunitaire. Cette phase est asymptomatique. Elle conduit à l’expansion clonale et à la différenciation des lymphocytes T spécifiques de l’allergène. Au cours de ce processus, les lymphocytes naïfs TH0 se différencient en lymphocytes TH2, producteurs d’IL-4, d’IL-5, d’IL-9 et d’IL-13. Par sa capacité, à produire ces différentes cytokines, le lymphocyte TH2 orcherstre littéralement la réponse allergique. L’IL-4 et l’IL-13 induisent des anticorps (de l’IgM vers l’IgE) et la prolifération de lymphocytes B producteurs d’IgE allergène-spécifiques. La stimulation des lymphocytes T naïfs et leur expansion clonale sont induites principalement par la cellule dendritique, une puissante cellule présentatrice d’antigène. Toutefois, des mécanismes de présentation antigénique impliquant les lymphocytes B mémoires ou facilités par la production d’IgE spécifique (présentation antigénique IgE-dépendante) peuvent intervenir ultérieurement après que la mémoire immunitaire soit constituée. Une source d’IL4 est également nécessaire à la différentiation du lymphocyte T naïf. Dans le cas des allergènes à activité protéolytique, cette fonction peut être assurée par le basophile (8). Les deux dernières phases qui sont les phases de réaction immédiate et retardée sont provoquées par une réexposition à l’allergène. La seconde phase (la phase de réaction immédiate) est à son paroxysme 15 minutes après une réexposition avec l’allergène et se résout en 2-3 heures. Elle est due au pontage des IgEs fixés au 5 récepteur FcRI (récepteur de haute affinité pour les IgE) présent à la surface des mastocytes et des basophiles. Le pontage des anticorps IgE est réalisé par les allergènes dont les épitopes fournissent les contraintes orientationelles nécessaires au rapprochement des anticorps IgE. Cette liaison à l’allergène provoque la dégranulation des mastocytes et basophiles, libérant de nombreux médiateurs de l’inflammation (histamine, prostaglandines, leucotriènes,…). La phase de réaction immédiate est suivie, chez une partie des individus, d’une troisième phase appelée réaction retardée. Celle-ci se déclare après 6-12 heures et s’éteint dans les 12-24 heures. Elle est caractérisée par la formation d’un œdème et est liée à l’infiltration des tissus enflammés par plusieurs types cellulaires dont les éosinophiles et les lymphocytes T qui vont être réactivés localement et libérer de nombreuses cytokines (principalement l’IL-4, l’IL-5, l’IL-9 et l’IL-13) (figure 3), pérénisant ainsi l’inflammation. Les inflammations tissulaires sont caractérisées par un œdème, de la douleur et un érythème. Au niveau du poumon, l’inflammation provoque un rétrécissement des voies respiratoires, une hypersécrétion de mucus et de l’hypreréactivité bronchique. b) Intervenants (1) La cellule dendritique Généralités Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) qui exercent à leur stade immature un rôle de surveillance immunitaire, capturant les antigènes étrangers et les antigènes du Soi. Leur fort potentiel de présentation antigénique et leur capacité à détecter diverses signatures microbiennes associées à des pathogènes en font un élément clé de la défense immunitaire. Basés sur leurs caractéristiques fonctionnelles, leur localisation et leur phénotype divers sous-types de cellules dendritiques ont été identifiés chez l’homme et chez la souris (9, 10) (tableau 1). La cellule dendritique ne possédant pas de marqueur(s) phénotypique(s) universel(s), les sous-populations de cellules dendritiques sont identifiés au moyen d’un ensemble de marqueurs de surface. On distingue deux types principaux de DCs : les DC myéloïdes (mDC) et les DC plasmacytoïdes (pDC). L’accès aux cellules dendritiques primaires étant un obstacle important à l’étude de la DC, des méthodes de culture permettant de générer des DCs in vitro ont été développées (9, 11, 12). Chez la souris les mDCs peuvent être générées à partir de la moelle osseuse ou à partir de monocyte sanguin à l’aide de GM-CSF ou de GM-CSF et d’IL-4. Les monocytes sanguins sont les précurseurs les plus utilisés chez l’homme pour générer les DCs. Une combinaison de GM-CSF et d’IL-4 différencie les monocytes en mDCs. Après différenciation ces cellules acquièrent le phénotype CD11c+ CD83+ CD1a+ CD14- CD86low MHCIIlow. L’ajout de TGF-1 conduit au développement de DCs apparentées aux cellules de Langerhans. Les DCs ont toutes pour origine de différenciation les cellules souches hématopoïétiques + CD34 (figure 4). Ces cellules sont les précurseurs des progéniteurs de cellules myéloïdes CD33+ 6 (Common Myeloid Precursor) et des progéniteurs de cellules lymphoïdes CD10+ (Common Lymphoid Progenitor). Les DCs ont à l’origine été considérées comme dérivant de la lignée myéloïde (comme les macrophages, monocytes, granulocytes et érythrocytes). Toutefois, l’expression de marqueurs lymphoïdes tels que CD8, CD4, CD2, BP1 et CD25 suggérait que certaines DCs pourraient avoir une origine lymphoïde (comme les lymphocytes B, lymphocytes T et les cellules NK). Aujourd’hui, il apparaît que les DCs de type myéloïde peuvent être dérivée de la lignée myéloïde ou de la lignée lymphoïde (13, 14). Capture de l’antigène A leur stade immature les cellules dendritiques capturent des antigènes présents dans leur environnement. Cette capture d’antigènes fait intervenir trois types de mécanismes : la pinocytose, l’endocytose par récepteurs interposés et la phagocytose. La pinocytose est un processus dépendant de l’actine qui consiste à former au niveau de la membrane cellulaire de petites vésicules entourant le liquide extracellulaire. Ces vésicules seront internalisées avec la portion de liquide qu’elles contiennent. L’endocytose par récepteurs interposés repose sur l’usage de récepteurs membranaires spécifiques des composés à endocyter. Ce processus dépend de la formation de puits tapissés de clathrine au niveau de la membrane plasmique. La phagocytose repose sur une réorganisation du cytosquelette dépendante de l’actine. Ce mode d’endocytose consiste à internaliser des composés qui se présentent sous la forme de particules. La DC exprime de nombreux récepteurs de l’immunité innée dénommés PRRs (Pathogen Recognition Receptors) qui ont la propriété de reconnaître une vaste gamme de motifs microbiens, les PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) (15). Ces récepteurs ont pour fonction d’endocyter les microorganismes et/ou d’activer la DC. Le PAMP est un composant microbien qui a pour caractéristique d’être à la fois spécifique de microorganisme, ce qui permet la discrimination entre le Soi et le non-Soi, d’être invariant au sein d’une même classe d’organisme et d’être essentiel à la physiologie du microorganisme dont il est le constituant. Les PRRs ne peuvent toutefois pas distinguer les agents pathogènes des microorganismes inoffensifs puisque ceux-ci partagent les même PAMPs. Il existe différents types de PRRs impliqués dans l’activation de la DC (16): Les Toll-Like Receptors (17) (figure 5). Cette famille de récepteurs membranaires reconnait un large spectre de composés microbiens (virus, bactéries, levures, parasites). TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR11 sont exprimés en surface tandis que TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9 se localisent dans les endosomes. TLR4 se présente sous la forme de dimères en complexe avec MD2 tandis que TLR2 peut s’associer avec TLR1 ou TLR6. Ces deux derniers hétérodimères reconnaissent respectivement les triacyl-lypopeptides et diacyl-lypopeptides. La transduction des signaux d’activation des TLRs s’effectue au niveau proximal par les protéines MyD88, MAL, TRIF et/ou TRAM et débouche, selon les TLRs, à l’activation des voies NF-B, JNK, p38 et/ou IRF7. 7 La famille de récepteurs NLR (Nod-Like Receptors). Ces récepteurs cytosoliques comprennent NOD1 et NOD2 qui sont impliqués dans la reconnaissance de peptidoglycanes bactériens. Les récepteurs RLR (RIG-1-Like receptor) et DAI (DNA-dependent Activator of IRFs). Ces récepteurs cytoplasmiques reconnaissent des acides nucléiques viraux (ARNs, ADNdb). D’autre part, certaines lectines de types C (des récepteurs reconnaissant des structures glycaniques) comme Dectin 1 ou DC-SIGN lient aussi des motifs glycaniques microbiens. D’autres récepteurs de l’immunité sont dédiés plus spécifiquement à l’endocytose des microorganismes. Parmi ceux-ci on trouve les scavengers receptors (CD14, CD36,…), les récepteurs Fc et les récepteurs liants des molécules du complément C3b et iC3b impliqués dans l’opsonisation des bactéries (CR1, CR3). Enfin, il existe une série de PRRs solubles qui comprennent les collectines (lectines de type C), principalement la MBP (Mannan-Binding Lectin), sécrétée dans le sang, et les protéines surfactantes SP-A (Surfactant Protein A) et SP-B (Surfactant Protein B) sécrétées dans les poumons (18). Elles reconnaissent divers résidus glucidiques spécifiques de microorganismes et lient des récepteurs exprimés par la DC comme CR1 et CD14. Quant à Der p 1, sa capture est facilitée par le récepteur à mannose (MR) (19). L’endocytose d’antigènes via ce récepteur conduit à une présentation antigénique particulièrement efficace (20). Cependant, ce récepteur membranaire n’exercerait pas de fonction de signaling. Mais il n’est pas exclu que la capture de Der p 1 fasse intervenir d’autres récepteurs. D’autre part, les poussières de maisons qui sont associées aux allergènes d’acariens sont de puissants activateurs de TLR2, TLR4 et TLR9 (21). Maturation et présentation de l’antigène La maturation de la DC est irréversible. Elle survient lorsque la DC est activée par les PAMPs. La DC perd alors progressivement ses capacités d’endocytose. En parallèle, le complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII), plusieurs molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86,…) et plusieurs molécules d’adhérence (CD54, DC-SIGN,…) voient leur expression augmentée à la surface de la DC. Les DCs matures entament un processus de migration vers les ganglions. Endéans les 12 heures les DCs atteignent la zone T des ganglions. Ces changements de marqueurs phénotypiques s’accompagnent d’un apprêtement des antigènes capturés qui conduira à leur présentation par le CMHII (22, 23). Les CMHII sont dénommés chez l’homme : HLA-DQ, HLA-DR, HLA-DP et chez la souris : I-A et I-E. La présentation de l’antigène au lymphocyte T est réalisée à travers la formation d’une synapse immunologique (24, 25), composée d’un ensemble de molécules d’adhésion, de molécules de co-stimulation et du complexe TCR-CMHII (figure 6) (26). L’intervention des molécules d’adhésion précède l’engagement du CMHII. Des récepteurs comme LFA-1 et DC-SIGN possèdent des domaines extracellulaires particulièrement importants (pointant au delà de la zone du glycocalix) et seraient 8 responsables de l’initiation des premiers contacts entre la cellule dendritique et le lymphocyte T. L’interaction entre ces deux cellules pourrait ensuite être stabilisée par la liaison LFA-3/CD2, des molécules de plus petite taille, conduisant à un rapprochement DC-T, nécessaire à la formation du complexe TCR- CMHII. La reconnaissance par le TCR du peptide apprêté par le CMHII assure la spécificité de la réponse T et constitue le premier signal d’activation du lymphocyte T. Pour une activation optimale, des signaux additifs sont cependant nécessaires. Le second signal d’activation est délivré par les molécules de co-stimulation (figure) (27, 28). L’absence de co-stimulation compromet la prolifération des lymphocytes T et la libération ultérieure de cytokines qui constitue le troisième signal d’activation. Après engagement du CMHII et reconnaissance du TCR, la DC stimule l’activation du lymphocyte T par liaison de CD80 et CD86 à CD28 (29), ce qui conduit le lymphocyte T à libérer de l’IL-2 (favorisant la prolifération) et à induire l’expression de CD40L. La reconnaissance de CD40 à CD40L amplifie le processus d’activation qui se poursuit par une plus forte production de cytokines et un recrutement de molécules de co-stimulation comme OX40L et 4-1BBL. Un rétro-contrôle négatif est exercé sur cette réaction par les molécules de co-stimulation CTLA-4, PD-1 et BTLA. Les cytokines sécrétées par la DC lors de la présentation antigénique (le TNF-, l’IL-1, l’IL-6, l’IL-10, l’IL-12, l’IL-15, l’IL-18, l’IL-23 et l’IL-27) conditionnent le développement du lymphocyte T naïf (30-32). Les principales cytokines dont dépend la polarisation de la réponse immune sont : L’IL-6 stimule l’activation des lymphocytes T, leur croissance et leur différenciation. En particulier, l’IL6 avec le TGF-est responsable de la différenciation des lymphocytes TH17 tandis que le TGF- seul induit l’expression du facteur de transcription Foxp3 par les précurseurs T naïfs et favorise le développement de T régulateurs. L’IL-6 est reconnue par un récepteur soluble, IL-6R. L’IL-10 a un effet inhibiteur sur la production de l’IL-2 et d’IFN- des lymphocytes TH1, d’IL-4 et d’IL-5 sur les lymphocytes TH2. Le fait que cette cytokine soit plus faiblement exprimée dans les poumons de patients atteints d’asthme et de rhinite atopique contribuerait chez ces individus au développement d’un environnement pulmonaire proinflammatoire. Par ailleurs, des DCs productrices d’IL-10 instaurent au niveau du poumon une tolérance envers les allergènes inhalés (33). Cette réaction tolérogène est bien dépendante de la production d’IL-10 et serait responsable du développement de population T régulatrice. L’IL-10, s’oppose à la maturation de la DC et inhibe la production d’IL-12 (34). La DC mature n’exprime pas le récepteur de l’IL-10 (35) ce qui exclus à ce stade d’activation tout effet direct de cette cytokine sur la DC. D’autre part, la stimulation de cellules dendritiques par l’allergène majeur Der p 1 provoque une plus forte libération d’IL-10 (mais pas d’IL-12) chez les patients allergiques (36). La stimulation de cellules T autologues par ces DCs est accompagnée d’une plus forte production de cytokines 9 TH2 (IL-4 et IL-5). L’IL-10 est également nécessaire au développement de l’hyperréactivité bronchique indépendamment du degré d’éosinophilie (37, 38). La famille de l’IL-12 comprend l’IL-12 et l’IL-23 (39). La forme active de l’IL-12 est un dimère formé des sous-unités p40 (sécrétée en excès) et p35 qui est produit principalement par les DC myéloïdes activées. Les homodimères p40-p40 sont en compétition avec l’IL-12 pour son récepteur (IL-12R) qui est composé des sous-unités IL-12R1 et IL-12R2. L’IL-12 joue un rôle clé dans la polarisation de la réponse immune en stimulant la différenciation et l’expansion des lymphocytes TH1. Cette cytokine exerce également une action positive sur la production d’INF des lymphocytes TH1 et s’oppose aux effets inhibiteurs de l’IL-4 sur l’activité de l’IFN De plus, l’IL-12 réduit la production d’IL-4 des cellules T mémoires quiescentes par un effet exercé sur les cellules présentatrices d’antigène (40). A l’inverse, l’absence d’IL-12 favorise le développement de cellule TH2. L’administration systémique de cette cytokine en combinaison avec l’IL-18 provoque dans un modèle murin d’asthme expérimental une diminution de la production d’anticorps IgE, de l’inflammation cellulaire et de l’hyperréactivité bronchique (41). Récemment, le rôle bénéfique de l’IL-12 dans la prévention de l’allergie a été confirmé in vivo au moyen d’anticorps neutralisant. Cependant, l’IL-12 est associée à l’exacerbation de l’asthme allergique pendant les phases de post-sensibilisation (42), cet effet proinflammatoire étant attribuable à l’activation de cellules productrices d’IFN. L’IL-23, formée des sous-unités p40 et p19, est reconnue par le complexe IL-23R composé des sousunités IL-121 et IL-23R. Cette cytokine est impliquée dans le développement de maladies autoimmunes en favorisant l’expansion de lymphocytes TH17 (producteurs d’IL-17). La différenciation de ces lymphocytes est inhibée par la production d’IFN, l’IL-4 et l’IL-2. Le rôle de ces lymphocytes dans l’allergie reste mal appréhendé. En combinaison avec l’IL-12, l’IL-23 est un inducteur de la production d’IFN L'IL-15 a une activité proche de celle de l’IL-2. Leurs récepteurs respectifs partagent les chaînes et Le récepteur de L’IL-5 se distingue de celui de l’IL-2 par la présence d’une chaîne unique. Au contraire de l’IL-2, les lymphocytes activés n’expriment pas l’IL-15. Cette cytokine est un facteur de croissance pour le lymphocyte T et exerce sur lui une action chimiotactique. L’IL-27 est une cytokine proinflammatoire qui en combinaison avec l’IL-12 induit la production d’INF- par les cellules NK. A son tour, cette source d’IFN- stimule la différenciation des lymphocytes TH1. L’addition d’IL-27 à des cultures de lymphocytes T naïfs soumis à un environnement cytokinique favorisant la polarisation TH2 freine l’expression du facteur de transcription GATA-3 et s’oppose à la production d’IL-4. 10 Influence des allergènes sur la cellule dendritique Le pouvoir allergisant de certains allergènes dépend clairement des effets qu’ils exercent sur la DC. Dans le cas de Der p 1, des expériences ex vivo menées sur cellules de patients allergiques aux acariens montrent que l’exposition de cellules dendritiques à cet allergène induit la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes TH2 par un mécanisme reposant sur la production d’IL-10 et sur l’expression de CD86 (36). En parallèle, ces mêmes DCs sécrètent la production de chimiokines (TARC/CCL17, PARC/CCL18 et MDC/CCL22) impliquées dans le recrutement de cellules TH2 (43). En revanche, les DCs d’un individu sain sécrètent de plus fortes quantités d’IL-12 et de chimiokines pro-TH1 en réponse à Der p 1. In vitro, plusieurs allergènes à activité protéinase peuvent déclencher l’activation des récepteurs PARs (des récepteurs activés par les protéases) tel que PAR2 qui est exprimé par la DC mais aussi par d’autres types cellulaires comme la cellule épithéliale ou les éosinophiles (44-46). Der p 1, quant à lui, clive deux récepteurs de la cellule dendritique (CD40 et DC-SIGN) fortement impliqués dans la polarisation de la réponse immune (47, 48), ce qui pourrait expliquer la faculté de cet allergène à orienter la réponse immunitaire vers un profil TH2 chez les individus allergiques. Il existe également des mécanismes de sensibilisation faisant appel à des activités enzymatiques de nature non protéolytique. En effet, les pollens contiennent des NADPH oxydases qui par leur activité enzymatique génèrent différentes espèces de réactifs oxygénés capables de stimuler la DC (49). La libération de ces réactifs serait responsable du développement de réponses de type TH2. Enfin, un mécanisme non-enzymatique a également été décrit pour les E(1)-phytoprostanes dérivées de pollens (50) : l’homologie structurelle et fonctionnelle des ces composés avec la prostaglandine E2 a pour effet d’inhiber la production d’IL-12 par la DC et de favoriser la polarisation TH2. Par ailleurs, il ne peut être exclus que des composants associés aux allergènes comme les endotoxines ou le peptidoglycan puissent avoir un effet adjuvant sur la réponse allergène-spécifique en stimulant les récepteurs TLRs de la DC. Cependant, l’influence exacte de ces composants microbiens sur l’allergie reste mal caractérisée. (2) Le lymphocyte T Les lymphocytes T assurent avec les lymphocytes B la mémoire immunitaire et la spécificité antigénique, deux caractéristiques de la réponse immune adaptative. La réponse T CD4+ effectrice est hétérogène ; elle est basée sur le développement de plusieurs types cellulaires (TH1, TH2, TH17 et Treg) caractérisés, notamment, par la nature des cytokines qu’ils produisent (51-54). L’allergie est liée à une déviation particulière de la réponse T CD4+ (figure 7), la réponse TH2 (55). Il s’agit d’un processus au cours duquel les lymphocytes T CD4+ sont polarisés en lymphocytes TH2, des cellules qui produisent principalement de l’IL-4, de l’IL-5, de l’IL-13 et de l’IL-9 mais pas d’IFN- ni de TNF-. Le lymphocyte TH2 se positionne au centre du contrôle de la réaction allergique 11 et orchestre littéralement l’inflammation par la libération de cytokines impliquées dans la production d’anticorps d’isotype IgE (IL-4 et IL-13) et la mobilisation des éosinophiles (IL-5). La polarisation du lymphocyte TH2 (56) est induite lors de la présentation antigénique par les cytokines IL-4 et IL-25 (cf. paragraphe précédent). L’initiation de ce processus dépend du basophile qui constitue une source précoce d’IL-4 (8). En dehors de son rôle dans l’allergie, l’immunité TH2 est sollicitée dans des réponses dirigées contre les ectoparasites, en particulier, les nématodes intestinaux. Le recrutement des lymphocytes TH2 au site d’inflammation est médié par les récepteurs à chimiokines qu’ils expriment à leur surface. Il s’agit des récepteurs CCR3 reconnaissant l’éotaxine/CCL11, RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 et MCP-4/CCL13 ; CCR4 reconnaissant MDC/CCL22 et TARC/CCL17, CCR8 reconnaissant I-309/CCL1 ; le récepteur CrTh2 reconnaissant la PGD2 ; et CD4 qui lie l’IL-16 (51). Le lymphocyte TH2 est également caractérisé par l’expression des facteurs de transcription GATA-3, STAT6 et c-maf (55). Les effets des principales cytokines appartenant à l’immunité TH2 sont les suivants (31) : L’IL-4 de même que l’IL-13 active le changement de classe isotypique des lymphocytes B. En conséquence, ces cellules produisent non plus des anticops de type IgM mais des anticorps d’isotype IgE (57), le type d’anticorps caractéristique de l’atopie. Ces effets sont potentialisés par les cytokines IL-2, IL-5, IL-6 et IL-9. L’IL-4 induit la différenciation des lymphocytes TH0 en lymphocytes TH2 et prévient l’apoptose des lymphocytes T (58). Elle stimule l’expression du MHCII, de CD40, CD23 et des IgM de surfaces des cellules B et induit l’expression de CD23 et du MHCII par les macrophages, des effets qui favorisent la présentation d’antigènes. Son action induit l’expression de VCAM-1 par les cellules endothéliales, facilitant l’infiltration des éosinophiles, basophiles, monocytes et lymphocytes T (59). Elle induit l’expression du récepteur à l’IgE par les mastocytes et active chez ces cellules la production de la leukotriène synthétase (60), une enzyme nécessaire à la synthèse des leukotriènes. La présence d’IL-4 inhibe le développement du lymphocyte Th1 et dévie ce type d’immunité vers un profil moins polarisé (61). L’IL-5 stimule le développement des éosinophiles à partir de leur précurseur hématopoïétique (62). Cette cytokine active les éosinophiles (production de protéines cationiques), les préservent de l’apoptose et a sur eux une action chimiotactique (63). De plus, elle induit chez ces cellules l’expression des intégrines2 qui contribuent par leur liaison à VCAM-1 à faciliter la transmigration endothéliale (63). IL-9 stimule la production de protéases par les mastocytes pour lesquels elle est un facteur de croissance (64) et induit chez eux l’expression de la chaîne du récepteur de haute affinité pour les IgE (65). L’expression de cette cytokine est associée à l’expression de symptômes liés à l’asthme (production de mucus en excès, fibrose subépithéliale, augmentation des mastocytes 12 intraépithéliaux, éosinophilie pulmonaire et hyperréactivité bronchique) (66, 67). Cependant, ces effets semblent être dus à la production d’IL-4, IL-5 et IL-13 secondaire à l’IL-9 (68). L’IL-13 partage plusieurs modes d’action de l’IL-4. A savoir, elle induit le changement de classe isotypique vers l’IgE et induit l’expression de VCAM-1 par les cellules endothéliales (69). Le récepteur de l’IL-13 se compose de deux sous-unités qui sont l’IL-4R (partagé avec le récepteur de l’IL-4) et l’IL-13R1. Ce récepteur n’est pas exprimé par les lymphocytes ni par les mastocytes (au contraire du récepteur de l’IL-4) mais bien par les basophiles, les monocytes, les cellules endothéliales et les lymphocytes B. L’IL-13 provoque en combinaison avec l’IL-9 l’hyperplasie des cellules caliciformes, induit l’hyperréactivité bronchique par son action sur les muscles lisses et contribue au remodelage des voies aériennes (70). Le lymphocyte TH1 est, quant à lui, caractérisé par la sécrétion d’IFN-entraînant l’activation des macrophages), d’IL-2 et de TNF-Il exprime les récepteurs à chimiokines CCR5 qui lie RANTES/CCL5, MIP-1α/CCL3 et MIP-1β/CCL4 ; et CXCR3 qui lie CXCL4/PF4, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 et CXCL11/I-TAC (71). Cette cellule exprime spécifiquement les facteurs de transcription T-bet et STAT4 dont l’induction est dépendante de la présence d’IL-12 pendant la présentation antigénique (72). L’expression de T-bet inhibe celle du facteur de transcription TH2 GATA-3 (73). La présence d’IFN-dans l'environnement cellulaireest nécessaire au lymphocyte T pour qu’il exprime le récepteur de l’IL-12 nécessaire à la polarisation TH1. Dans ce processus, les cellules NK peuvent constituer des sources précoces d’IFN- et donc favoriser la voie TH1. Par ailleurs, la production d’IFN- inhibe la production d’IL-4. A l’inverse, la production d’IL-4 inhibe l’expression de la chaîne IL-12R2 du récepteur de l’IL-12 et favorise l’émergence d’un profil TH2 (74). Parce que les développements des réponses TH1 et TH2 sont antagonistes, et que parce que l’allergie est associée à un profil TH2, la réponse TH1 a longtemps été considérée comme bénéfique en allergie. L’allergie peut donc, d’un certain point de vue, être perçue comme un déséquilibre immunitaire lié à un manque de stimulation de l’immunité TH1. C’est le concept de balance TH1/TH2 (75). Toutefois, la manifestation cumulée des réponses TH1 et TH2 peut, sous certains aspects, s’avérer néfaste. Ainsi, le transfert adoptif de lymphocytes TH1 allergène-spécifiques à des souris manifestant de l’asthme expérimental contribue à amplifier l’inflammation pulmonaire par le recrutement de monocytes bien que cette inflammation soit également accompagnée d’une diminution de l’éosinophilie pulmonaire et de la production de mucus (76). D’autre part, la production constitutive d’IFN- dans le poumon favorise la production locale de cytokines TH2 (IL-5 et IL-13) mais réduit l’hyperréactivité bronchique et la production d’anticorps IgE allergène-spécifiques(77). Dans la dermatite atopique, la voie TH1 induit via la sécrétion d’IFN- l’apoptose des kératinocytes et 13 contribue au recrutement d’autres cellules T au site de l’inflammation (78). Dans l’asthme, la production locale d’IFN- induirait l’apoptose des cellules épithéliales bronchiques (79). Ces dernières années, un ensemble hétérogène de lymphocytes T à activité régulatrice (lymphocytes exerçant des actions suppressives sur les réponses T effectrices) a été identifié. Cet ensemble de cellules se compose des lymphocytes régulateurs naturels CD4+ CD25high Foxp3+ et des lymphocytes T régulateurs adaptatifs qui comprennent, les lymphocytes TR1, TH3, TH1reg et TH2reg. Les lymphocytes régulateurs naturels (naturally occuring Treg, nTreg) sont originaires du thymus et sont de phénotype CD4+ CD25+ CTLA-4+ GITR+ (80). Contrairement aux lymphocytes CD25+ activés induits dans la périphérie, les nTreg expriment peu le récepteur CD127 (chaîne du récepteur de l’IL7) et produisent constitutivement le facteur de transcription Foxp3 qui est nécessaire à leur développement (81, 82). Comme les autres lymphocytes T régulateurs ces cellules ont une faible capacité de prolifération. Le nTreg ne sécrète pas de cytokines mais produit du TGF- sous forme membranaire et celui-ci pourrait contribuer à ses propriétés suppressives (83). Cette activité repose sur l’établissement d’un contact du nTreg avec la cellule cible (84). Le rôle des nTreg dans l’allergie est suggéré par le développement de la dermatite atopique et de l’allergie alimentaire chez les patients atteints du syndrome IPEX (85) (Immune dysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X linked syndrome), une pathologie auto-immune mortelle. En effet, chez ces individus la protéine Foxp3 est tronquée. Bien que l’étude des nTreg soit rendue difficile par l’absence de marqueur phénotypique spécifique, les effets régulateurs de ces cellules dans l’allergie ont été analysés par plusieurs études. Celles-ci ont montré que les enfants dont l’allergie au lait est en rémission ont plus de cellules CD4+ CD25+ circulantes et répondent moins à la -lactoglobuline (prolifération de PBMCs). Ces CD4+ CD25+ exerce une activité de suppression de la prolifération cellulaire dépendant de leur mise en contact avec les lymphocytes CD4+ CD25-(86). De plus, il semblerait que l’activité de ces cellules régulatrices soit moins performante chez les patients atopiques. En effet, chez les individus atteints de rhume des foins, les cellules CD4+ CD25+ Foxp3+ suppriment avec moins d’efficacité la production d’IL-5 des lymphocytes CD4+ CD25-, cet effet étant plus marqué lors de la saison pollinique (87). Les lymphocytes TR1, quant à eux, sont de phénotype CD4+ Foxp3- et exercent leur activité suppressive par la libération d’IL-10 et peut-être de TGF-(88, 89). Cette population de T régulateurs serait prédominante dans le poumon (90). Son développement peut-être induit en présence d’IL-10 à partir de la stimulation de lymphocytes T naïfs ou de lymphocytes TH1/TH2 différenciés. Les TR1 régulent aussi bien les réponses auto-antigéniques de type TH1 (91) que les réponses pathogènes de type TH2 (92). Ces cellules seraient liées à la réussite du traitement de l’allergie par immunothérapie spécifique (désensibilisation des patients allergiques par administrations de doses croissantes d’allergènes) (88). Par la libération d’IL-10 et de TGF-en réponse aux allergènes, ces cellules joueraient un rôle clé dans l’établissement de la tolérance périphérique. Par ailleurs, les cellules dendritiques pulmonaires activées par administration intranasale d’ovalbumine génèrent des TR1 dont 14 l’action contribue à l’établissement de la tolérance pulmonaire. En effet, ceux-ci préviennent la manifestation de l’hyperréactivité bronchique. Le développement de cette population est dépendant de l’IL-10 produite par la DC et de l’interaction ICOS-ICOSL (93). Les lymphocytes TH3 sont impliqués dans des processus de tolérance orale (tolérance induite par ingestion d’antigène) (52). Cette forme de tolérance est active sur l’immunité TH1 et sur l’immunité TH2. Le lymphocyte TH3 se caractérise par une forte production de TGF- accompagnée de quantités variables d’IL-4 et d’IL-10. Les lymphocytes TH3 seraient générés à partir de DCs produisant du TGF- au niveau de l'intestin (90). L’expression transitoire de TGF- pendant la présentation antigénique différencie les lymphocytes TH0 en cellules régulatrices TH3 Foxp3+ CD25+ /(94). La restimulation répétitive de ces cellules entraîne une production durable de Foxp3 par les cellules TH3 qui exerce leur activité suppressive indépendamment de l’expression de CD25. Récemment, un nouveau type de lymphocyte T, le TH17, a été identifié. Ce lymphocyte se caractérise par la sécrétion d’IL-17 (IL-17A), d’IL-17F, d’IL-6, de TNF- et d’IL-12 (54). De plus, il exprime spécifiquement le facteur de transcription RORt. La différenciation des TH17 est dépendante de l’IL-6 et du TGF-(54)L'action de l'IL-6 inhibe complètement l’influence positive du TGF- sur le développement des lymphocytes T régulateurs. La phase de différenciation des TH17 est suivie d’une étape d’amplification (multiplication clonale) dépendante de la production autocrine d’IL-21 (95). Elle est elle-même suivie d’une étape de stabilisation dépendante de l’IL-23 durant laquelle le TH17 acquiert ses pleines capacités de production de cytokines. L’IL-4, cytokine TH2, l’IFN- et l’IL27, cytokines TH1, inhibent la différenciation des TH17 (96). La production d’IL17 est associée à plusieurs formes de maladies auto-immunes comme la myocardite (97) et l’arthrite rhumatoïdes (98). Comme l’IL-1 et le TNF-, l’IL-17 induit le recrutement des neutrophiles (99-101). L’inhalation de ces cytokines provoque la formation d’un infiltrat de neutrophiles au niveau du poumon. En allergie et plus particulièrement dans l’asthme allergique IgE-dépendant, les données actuelles suggèrent une implication des TH17 dans le recrutement des neutrophiles durant la phase aiguë de l’inflammation pulmonaire (102-104). L’IL-17 agit en synergie avec l’IL-6 pour provoquer la production de mucines (105) et avec l’IL-1 et le TNF- elle induit l’expression de facteur de croissance pour l’endothélium (106), des processus contribuant potentiellement à l’aggravation de l’asthme. Cependant, l’administration exogène d’IL-17 entraîne une baisse de l’éosinophilie et de l’hyperréactivité bronchique démontrant que les TH17 pourraient aussi exercer des effets bénéfiques sur l’expression de l’allergie (107). 15 (3) Autres principaux types cellulaires Les lymphocytes B Le lymphocyte B produit à son stade naïf des immunoglobulines de classes IgM et IgD sous forme membranaire. La liaison d’un antigène à ces récepteurs provoque successivement son internalisation, son apprêtement et sa présentation au lymphocyte T. Lorsque l’antigène est reconnu par le lymphocyte T, celui-ci soutient la prolifération du lymphocyte B par la sécrétion de cytokines (IL-4, IL-5, IL-6, IL-2 et IFN-(108). Les cytokines produites pendant la prolifération déclenchent le changement de classe isotypique. A ce niveau, l’IL-10 provoque l’expression d’immunoglobuline d’isotype IgG1 et IgG3 (chez l’homme), l’IL-4 et l’IL-13 induisent la production d’IgE et l’IFNsoutient la production d’IgG2 (chez l’homme) (109). En parallèle, les gènes codant pour les immunoglobulines subissent des mutations somatiques qui entraînent une modification de leur affinité antigénique (diversification de la spécificité antigénique). Par la suite, les lymphocytes B présentant une faible reconnaissance antigénique seront éliminés par apoptose (sélection des immunoglobulines de forte affinité). Rôle de l’IgE dans l’atopie La production d’anticorps IgE spécifiques (dirigés contre les allergènes) est une des caractéristiques principales de l’atopie. L’IgE est reconnue par les récepteurs FcRI (récepteur de haute affinité), CD23 (récepteur de faible affinité) et la galactin-3 qui lie également FcRI (110). La liaison de l’IgE au récepteur FcRI est une condition nécessaire au déclenchement de la phase d’hypersensibilité immédiate dont sont responsables les mastocytes et basophiles. L’expression de forme tétramérique 2 de ce récepteur est limitée à ces deux types cellulaires. Mais la forme trimérique de FcRI, 2, est produite par un panel bien plus large de cellules (monocytes, éosinophiles, plaquettes, muscles lisses,…) (111, 112). CD23 est, quant à lui, exprimé sous sa forme CD23a par le lymphocyte B activé (avant sa différenciation en plasmocyte) et sous sa forme CD23b par les lymphocytes B, les cellules épithéliales et une vaste gamme de cellules inflammatoires après leur activation par l’IL-4 (113). Bien qu’il soit qualifié de récepteur de « faible affinité », la force de liaison entre l’IgE et la forme trimérique de CD23 atteint presque celle de FcRI (Ka ≈ 108 – 109 M-1 versus Ka ≈ 1010 M-1). CD23 coopère avec CD11b (intégrine M2) et CD11c (intégrine X2), l’intégrine V3 et l’intégrine V5 dans sa liaison aux IgE (113) . CD23 existe également sous une forme soluble produite à partir du clivage de sa forme membranaire par ADAM-10 (114). Par ses interactions avec CD21 et avec l’IgE (forme membranaire et soluble), CD23 serait au centre d’un réseau complexe de régulation de la production d’IgE (113). Toutefois, le mécanisme exact de ce processus reste mal caractérisé. En sécrétant de l’IgE le lymphocyte B déclenche de nouveaux types de mécanismes de présentation antigénique. En effet, la liaison de l’IgE au récepteur FcRI porté par la cellule dendritique et la cellule de Langherans augmente leur potentiel de capture antigénique. D’autre part un 16 mécanisme de présentation antigénique facilitée (« facilitated antigen presentation ») a été mis en évidence au niveau des lymphocytes B activés, lesquels expriment CD23 (115). Ce processus est basé sur la capture des complexes IgE-antigène par CD23, ce qui conduit à la présentation de l’antigène aux lymphocytes TH2. On assiste aussi à une diversification des épitopes B reconnus par le système immunitaire (« epitope spreading ») (116) qui se traduit, en allergie, par une meilleure reconnaissance des allergènes auxquels les patients sont préalablement sensibilisés et à une sensibilisation progressive à de nouveaux allergènes. Les éosinophiles Les éosinophiles sont des granulocytes au noyau bilobé qui contiennent des granules préformés renfermant chez l’homme 4 protéines cationiques : la Major Basic Protein (MBP), l’Eosinophil Peroxidase (EPO), l’Eosinophil-Derived Neurotoxin/Eosinophil Protein X (EDN/EPX) et l’Eosinophil Cationic Protein (ECP). Chez la souris, les granules des éosinophiles ne contiennent pas d’EDN ni d’ECP mais des ribonucléases peu apparentées (> 50 % de divergence avec l’EDN et l’ECP) (117). En plus des protéines cationiques qu’ils sécrètent, les éosinophiles libèrent de nombreux médiateurs inflammatoires : composés lipidiques (leukotriènes, prostaglandines, platelet-activating factor), chimiokines (CCL11/éotaxine, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, IL-8, CCL3/MIP-1), cytokines (IL-3, IL-5, GM-CSF, IFN-, TNF-, IL-2, IL-4, IL-13, IL-6, IL-16, IL-17, IL-10, IL-12) et un nombre important de facteurs impliqués dans le remodelage tissulaire (Nerve Growth Factor, NGF ; Stem Cell Factor, SCF, Platelet-Derived Growth Factor, PDGF; Fibroblast Grow Factor, FGF, Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF ; Heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF ; les métalloprotéinases MMP9 et MMP17 et les inhibiteurs de métalloprotéinases TIMP-1 et TIMP-2) (118). In vitro, la dégranulation des éosinophiles a sur les helminthes des effets cytotoxiques avérés qui sont dépendant de l’IgE (119). Cependant, le rôle exact des éosinophiles dans les helminthiases est controversé (120). Les éosinophiles sont aussi capables de phagocyter les bactéries et d’activer des processus cytotoxiques par la libération du contenu de leurs granules dans leur phagosome (121). Les éosinophiles se développent à partir de leurs précurseurs hématopoiétiques sous l’influence de l’IL-3, de l’IL-5 et du GM-CSF (63). La survie des éosinophiles dans les tissus et leur maturation sont dépendants des chimiokines et cytokines sécrétées dans leur environnement immédiat: i) l’absence totale d’IL-5 induit spontanément leur apoptose (122) ii) l’IL-5, l’IL-3 et le GM- CSF prolonge leur survie (123, 124) iii) l’éotaxine a un effet antiapoptotique (125). De plus, l’interaction des éosinophiles avec la fibronectine et la laminine, des protéines associées à la matrice extracellulaire, prolonge aussi leur durée de vie (126). L’éosinophilie est une caractéristique principale de l’inflammation allergique et est le résultat de l’action synergique de l’IL-4, de l’IL-13, de l’IL-5 et des éotaxines. De nombreuses études ont démontré une corrélation positive entre l’activation des éosinophiles et la sévérité des symptômes allergiques (127). La contribution des éosinophiles à la manifestation de l’asthme est suggérée par i) 17 les effets toxiques de leurs protéines cationiques (destruction des cellules épithéliales) (128) et ii) le fait que la MBP et l’EPO provoquent de la bronchoconstriction et de l’hyperréactivité bronchique (administration directe) (129) iii) le fait que la formation d’un infiltrat de lymphocytes T dépend au préalable de la présence d’éosinophiles au site d’inflammation (130). Mais il apparaît aussi que certaines actions des éosinophiles (remodelage tissulaire, réparation et immunoregulation) sont bénéfiques à l’homéostasie immunitaire (131). Les mastocytes Les mastocytes se développent à partir des précurseurs hématopoïétiques c-Kit+ CD34+ (132) et se localisent préférentiellement dans la peau, le tractus respiratoire et le tractus gastrointestinal au niveau des espaces périvasculaires et des tissus conjonctifs (133). Les mastocytes produisent une vaste gamme de cytokines et de facteurs de croissance: IL-1, -2, -3, -5, -6, -8, -13, -16, GM-CSF, TNFbFGF (basic Fibroblast Growth Factor), VEGF (Vascular Endothelial cell Growth Factor) (134). Le pontage des anticorps IgE (fixés par FcRI) à la surface des mastocytes provoque la libération de granules préformés contenant de nombreux médiateurs de l’inflammation : histamine, protéases, cytokines, protéoglycans (principalement l’héparine). Le même stimulus déclenche la synthèse et la sécrétion d’écosanoïdes (leucotriènes LTB4 LTC4, LTD4 LTE4 et prostaglandine PGD2) (132). Ces composés provoquent le recrutement des neutrophiles, la constriction des muscles lisses, augmentent la motilité gastrointestinale, modifient le calibre des vaisseaux sanguins, augmentent la perméabilité vasculaire et induisent le recrutement des leucocytes (135). Indépendamment de la voie FceRI, l’activation des mastocytes peut être obtenue à l’aide de composants bactériens ou de parasites et par des produits issus de l’activation du complément (C3a et C5a) (134, 136). A leur tour, les mastocytes activent la maturation de la cellule dendritique (induction du CMHII et des molécules de costimulation CD80, CD86, CD40) via la production d’exosomes (137). En allergie, les mastocytes sont associés principalement à la réaction d’hypersensibilité immédiate. Cette réaction qui est propre aux individus sensibilisés est induite par la liaison des allergènes aux IgEs fixés à la surface des mastocytes. La phase de réaction immédiate coïncide avec la libération de l’histamine et de tryptase (médiateurs préformés) et avec la production de PGD2 et de LTC4 (médiateurs néoformés) (138-140). Les cytokines et les protéases sécrétées par ces cellules modulent la fonction de muscles lisses, induisent l’hyperplasie des cellules caliciformes (141) et participeraient au remodelage des voies aériennes (142), des facteurs contribuant au développement de l’asthme. 18 4. Les allergènes a) Caractéristiques générales Les allergènes sont des antigènes responsables d’allergies. Dans le cas de l’atopie, il s’agit de protéines solubles. Les tailles des allergènes sont variables allant de poids moléculaires inférieurs à 10 kDa (ex. : Api m 4, 3 kDa) à plus de 100 kDa (ex. : Der p 14, 117 kDa). De nombreux allergènes (Der p 1, Fel d 1, Phl p 1, Ara h 1, la -lactoglobuline bovine, Api m 4, …) forment des multimères. Cette propriété pourrait être une condition nécessaire à leur allergénicité comme démontré dans le cas de Bet v 1 (143). Les allergènes sont de natures et de sources très diverses. Beaucoup exercent une activité enzymatique comme, par exemple, des activités de sérine ou cystéine protéinases (tableau 2). Cependant, leur activité enzymatique ne saurait à elle seule expliquer les propriétés allergisantes de ces protéines car Der p 2, Fel d 1 et Amb a 5 sont des exemples d’allergènes majeurs alors qu’ils ne présentent aucune activité enzymatique. Certains types d’allergies comme l’allergie à l’acarien Dermatophagoides pteronyssinus, l’allergie étudiée dans ce travail ont une prévalence particulièrement élevée (4) et ont donc une grande importance sur le plan clinique. Selon les sources d’allergènes, de nombreux types d’allergènes peuvent être produits comme c’est le cas pour les fèces d’acariens ou au contraire un nombre restreint d’allergènes, parfois une seule protéine comme dans le cas des squames de chats. On fait la distinction entre les allergènes majeurs, des allergènes qui ont un fort pouvoir de liaison aux IgEs de patients allergiques (ils lient plus de 50% des IgEs de patients allergiques) et les allergènes mineurs. Les allergènes peuvent être classés selon leur voie d’introduction dans l’organisme. On distingue essentiellement les trophallergènes qui sont les allergènes alimentaires et les pneumallergènes qui sont aéroportés. Les allergies alimentaires sont prépondérantes durant la petite enfance (6% des enfants) tandis qu’elles n’affectent que seulement 2% de la population totale (144). Les sensibilisations aux allergies alimentaires les plus communes (85 % des allergies documentées) chez l’enfant sont : le lait de vache, les œufs, les arachides, le soja, le blé et le poisson. Les pneumallergènes sont soit saisonniers lorsqu’ils sont produits pendant certaines périodes de l’année (ex. : pollens) ou soit périannuels lorsque leur production est permanente (ex. : fèces d’acariens). Les pneumallergènes sont véhiculés sous la forme de particules. De manière générale, la taille de ces particules reste limitée à quelques dizaines de µm ce qui pourrait s’expliquer par un besoin d’être efficacement transporté par l’air et par la nécessité d’atteindre les zones distales du poumon. Il existe des réactions croisées entre pneumallergènes et trophallergène. Par exemple, la sensibilisation aux allergènes d’acariens favorise la sensibilisation à la papaye et aux escargots. Ce processus de sensibilisation survient quand différentes sources d’allergènes contiennent des allergènes de fortes homologies comme, par exemple, les cystéines protéinases papaïne (papaye) et Der p 1 (fèces d’acarien) ou des tropomyosines Tur c 1 (escargot) et Der p 10 (fèces d’acarien). 19 b) Der p 1 Der p 1 est une protéine de 25 kDa produite par l’acarien Dermatophagoides pteronyssinus. Dermatophagoides pteronyssinus est avec Dermatophagoides farinae l’acarien le plus fréquemment rencontré dans les poussières et les literies de nos habitations. 60 à 80% d’humidité et une température de 20-30 °C sont nécessaires à sa croissance. Il se nourrit principalement de squames produites par l’être humain. Der p 1 se localise dans les fèces excrétées par Dermatophagoides pteronyssinus. La faible taille des fèces de cet acarien (10-40 µm de diamètre) leur permet d’être facilement inhalés par l’homme et d’atteindre les parties les plus profondes du poumon. Parce que Der p 1 lie plus de 80% des IgEs sériques de patients allergiques à D. pteronyssinus (tableau 3) il est considéré comme un allergène majeur. Cette protéine appartient au groupe 1 des allergènes d’acariens, lequel est formé de cystéines protéinases de haut degré d’homologie séquentielle et structurelle. L’exposition à cet allergène est particulièrement élevée en Europe. En Belgique, plus de 80 % des poussières de maison contiennent Der p 1 (≥ 0,1 µg / gramme de poussière) tandis que son homologue Der f 1 produit par l’acarien Dermatophagoides farinae est détecté à hauteur de 50-80 % (145). Der p 1 appartient la famille C1 des cystéines protéinases dont l’archétype est la papaïne. Cet allergène est produit sous la forme d’un précurseur immature, PréProDer p 1. PréProDer p 1 se compose d’une préséquence de 18 acides aminés, correspondant à une séquence signal, suivie d’une proséquence de 80 acides aminés, elle-même suivie des 222 acides aminés correspondant à la forme mature de Der p 1 (figure 8). La proséquence de Der p 1 masque son site actif, empêchant toute activité enzymatique (figure 9) (146). Cette séquence peptidique serait aussi impliquée dans le processus de reploiement de Der p 1. La forme zymogène de Der p 1, ProDer p 1, possède deux sites de N-glycosylation. Le premier site est situé dans la proséquence (N16), le second dans séquence d’acides aminés de Der p 1 (N132). Lorsque le premier site est glycosylé, la maturation de Der p 1 par autocatalyse est inhibée(147). Der p 1 se compose de deux domaines globulaires et comporte 3 ponts disulfures (C4 et C117, C31 et C71, C65 et C103). Au contraire de ProDer p 1, Der p 1 a la possibilité de former des dimères (148). Cette dimérisation fait apparaître à la surface du complexe protéique un large sillon au sein duquel se logent les sites catalytiques (figure 10). Der p 1 contient un ion magnésium coordonné par un ensemble de résidus comprenant D56, E59 et E91 tandis que les résidus intervenant dans la réaction catalytique sont : E28, C34, H170, N190. Les épitopes conformationnels de Der p 1 ont été prédits sur base de la réactivité de peptides dérivés de la séquence protéique de Der p 1. Le positionnement de ces épitopes est représenté à la figure 10. Par son activité enzymatique protéolytique, Der p 1 clive plusieurs protéines clés intervenant dans la régulation de l’asthme et/ou de l’allergie. En conséquence, la fonction biologique de ces protéines, le plus souvent des récepteurs de surface, en est altérée. Ces protéines sont : 20 CD23 (149), le récepteur de faible affinité pour les IgEs (FcRII) (effet in vitro). Le clivage de ce récepteur entraîne sa libération dans le milieu extracellulaire. Par ailleurs, CD23 existe sous forme soluble (CD23s) à l’état natif. La production de CD23s est connue pour moduler la production d’IgE(150). Dès lors, des mécanismes régulateurs de la production d’IgE pourraient être affectés par le clivage de FcRII par Der p 1. CD25 (149), la sous unité du récepteur de l’IL-2 (effet in vitro). Ce récepteur est présent à la surface des lymphocytes T CD4+ activés et des T régulateurs naturels (CD4+ CD25+ Foxp3+). Le clivage de CD25 par Der p 1 entraîne une baisse de la prolifération des lymphocytes T (en réponse à l’IL-2 ou anticorps anti-CD3), associée à une baisse de la production d’IFN-. CD40 (48), une molécule de co-stimulation exprimée par la cellule dendritique (DC) (effet in vitro). La perte d’activation de la voie CD40-CD40L provoque une chute de la production d’IL-12. En conséquence, les lymphocytes T en contact de DCs traitées avec Der p 1 produisent moins d’IFN- et plus d’IL-4. DC-SIGN (47), une lectine de type C exprimée par la DC. La dégradation de DC-SIGN empêche sa liaison à ICAM-3 présent à la surface des lymphocytes T (effet in vitro). Hors, la liaison à cette molécule d’adhésion a un impact réel sur la production de cytokine (IL-10, TNF-) accompagnant la présentation antigénique. Par conséquent, l’orientation de la réponse immune pourrait s’en trouver modifiée. L’occludine (151), protéine membranaire impliquée dans la formation de jonction serrée (JS) au niveau de la cellule épithéliale (effet in vitro). L’action de Der p 1 provoque la dégradation des JSs et induit une réduction de leur contenu en ZO-1, une protéine de la plaque cytoplasmique des JSs. Il s’en suit une perte de la perméabilité de la barrière épithéliale pulmonaire, ce qui pourrait faciliter la diffusion de Der p 1 au sein de l’organisme. D’autre part, les JCs jouent un rôle de séquestration cytoplasmique de facteurs de transcriptions (ex : huASH1, ZONAB et SAF-B) et sont impliquées dans le maintien de la polarité cellulaire. Dés lors, le clivage des JCs par Der p 1 pourrait avoir de lourdes conséquences sur la physiologie du poumon. Des inhibiteurs d’élastases : l’h-A1-PI humain (-antitrypsine), le SLPI murin et l’hélafine humaine (152) (effet in vitro et ex vivo). Ces protéines sécrétées par le poumon inhibent l’activité de sérines protéases parmi lesquelles l’élastase des neutrophiles. Une déficience en h-A1-P1 est associée à l’emphysème pulmonaire, une pathologie caractérisée par une destruction des voies aériennes distales. SLPI et l’hélafine ont un effet activateur de l’inflammation. L’hélafine a également un effet chimioattractif sur les neutrophiles. Les protéines surfactantes SP-A et SP-D (153) (effet in vivo). Ces protéines appartiennent à la famille des collectines, des protéines liant les carbohydrates. La production de SP-D coïncide avec la résolution de l’asthme, suggérant que cette protéine participe à la guérison de cette pathologie (154). Les modèles murins d’allergie aux acariens ont démontré un rôle protecteur de SP-D durant 21 l’exposition secondaire aux allergènes d’acarien (155, 156). SP-A et SP-D lient toutes deux les formes glycosylées de Der p 1 (formes produites nativement par l’acarien D. pteronyssinus) par un mécanisme dépendant du calcium. In vitro, l’activité enzymatique de Der p 1 induit l’apoptose des cellules épithéliales pulmonaires (157) et stimule la production de chimiokines (MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 et IP10/CXCL10) impliquées dans le recrutement de précurseurs de cellules dendritiques (158). Cette même activité enzymatique accentue la réponse constrictive des muscles lisses bronchiques et atténue leur potentiel de relaxation (159), des effets contribuant à la manifestation de l’asthme. In vivo, l’activité enzymatique de Der p 1 exacerbe la réponse allergique (160) et favorise le développement de réactions croisées avec d’autres allergènes (161). 5. Facteurs de risque ou de protection L’allergie est une maladie multifactorielle qui présente une composante génétique complexe tout en dépendant également de nombreux facteurs environnementaux. (1) Facteurs génétiques L’allergie est clairement favorisée par un contexte familial atopique. Cette composante héréditaire de l’allergie se manifeste notamment chez les vrais jumeaux : chez eux on observe que lorsqu’un des frères est allergique, il y a un grand risque pour que son jumeau le soit également (ce risque est moins élevé chez les faux jumeaux) (162). Toutefois, les vrais jumeaux présentent rarement les mêmes formes d’allergie. Les garçons ont également un plus grand risque de développer de l’allergie que les filles. (163). Les variants polymorphiques de nombreux gènes (de l’ordre d’une centaine) et de nombreux loci génétiques (164, 165) aggravent significativement le risque de développer l’allergie. Mais ces effets ne sont parfois perceptibles que chez certains groupes ethniques(166). Les gènes dont le polymorphisme influence significativement le dévelopement de l’allergie: IL4 (IL-4), IL13 (IL-13), CD14 (CD14), ADRB2 (récepteur 2 adrénergique) situés sur le chromosome 5q HLA-DRB1 (HLA-DRB1), HLA-DQB1 (HLA-DQB1), TNF (TNF-) situés sur le chromosome 6p FCER1B (chaîne du récepteur FcRI) situé sur le chromosome 11q IL4RA (chaîne du récepteur de l’IL-4) situé sur le chromosome 16p ADAM33 (desintegin and metalloproteinase domain 33) situé sur le chromosome 20p 22 Les loci les plus fréquemment identifiés sont situés sur les chromosomes suivants : 2q dont la région 2q32-2q33 contient le gène codant pour CTLA-4 impliqué dans l’activation des lymphocytes T 5q dont la région 5q31 contient les gènes codants pour l’IL-4, L’IL-13, l’IL-5, CD14 et le GM-CSF 6q où se situent les gènes du complexe majeur d’histocompatibilité 11q où est localisé le gène de la chaîne du récepteur FcRI 12q dont la région 12q13 contient le gène codant pour STAT6 13q dont la région 13q14 a été démontrée comme impliquée dans la production d’IgE et IgA Concernant l’allergie aux acariens qui est le sujet de ce travail, une étude ciblant le polymorphisme génétique associé à une réponse IgE spécifique de Dermatophagoides pteronyssinus (allergènes Der p 1 et Der p 2) est à mentionner (167). Dans cette étude, un lien avec la production d’anticorps IgEs spécifiques a été montré pour les régions 2q21-q23, 6p21 et 13q32-q34 chez les sujets caucasiens et 8p23-p21, 5q23-q33 chez les sujets afro-américains. Les auteurs concluent qu’il n’existe aucun locus génétique présentant un lien universel évident avec la réponse IgE D. pteronyssinus spécifique. (2) Facteurs environnementaux Pollution atmosphérique Plusieurs études épidémiologiques à court terme ont mis en évidence une relation entre la pollution atmosphérique et la sévérité des symptômes associés à l’asthme (168). Les polluants impliqués sont : le dioxyde de souffre (SO2), les particules fines en suspension (PS), les oxydes d’azote(NOx), l’ozone (O3) et le monoxyde de carbone (CO). Les particules fines issues de la combustion diesel et plus particulièrement les hydrocarbures polyaromatiques (DEP-PAH, Diesel Exhaust Particles Polyaromatic Hydrocarbons) exercent des propriétés activatrices sur de nombreux types cellulaires (lymphocytes, monocytes, macrophages, mastocytes, basophiles, neutrophiles, éosinophiles, cellules épithéliales, cellules endothéliales). Les effets de ces composés aromatiques provoquent la libération d’une grande variété de médiateurs inflammatoires (IL-4, IL-5, IL-8, IL-13, GM-CSF, TNF-RANTES/CCL5, PARC/CCL18)qui favorisent le développement de réponses immunes de type Th2, le profil immunitaire associé à l’allergie (169, 170). En particulier, les PBMCs activées par les DEP-PAH produisent des taux élevés de PARC/CCL18 par un mécanisme médié par l’IL-13 et de plus faibles taux d’IP-10/CXCL10, ce qui entraine un recrutement accru de lymphocytes 23 TH2 (170). Par ailleurs, un effet adjuvant des DEP-PAHs sur la sensibilisation aux allergènes a été mis en évidence (171). Tabagisme L’exposition in utero et postnatale au tabagisme maternel est décrite comme un facteur de risque pour le développement de l’asthme chez l’enfant. De plus, elle favorise l’apparition d’une sensibilisation persistante aux allergènes (172). Le tabagisme conduit à une aggravation de la fonction respiratoire chez les individus présentant de l’hyperréactivité bronchique (173). Il accroît la sévérité de l’asthme et diminue la réponse des patients aux traitements médicamenteux par glucocoticostéroïdes (174). Alimentation Une alimentation riche en allergènes alimentaires (trophallergènes) favorise le développement des allergies alimentaires. Celles-ci touchent 2% de la population (175). De nombreux ingrédients et additifs entrant dans la composition des aliments peuvent constituer des sources cachées d’allergènes. Les préparations de lactose, par exemple, ne sont purifiées qu’à 95% et sont, par conséquent, contaminées par des allergènes de lait de vache comme la -lactoglobuline. L’allaitement est probablement le mode alimentaire le plus étudié pour ses effets potentiels sur l’atopie. Cependant, les nombreuses études épidémiologiques consacrées à l’allaitement conduisent à des résultats parfois contradictoires (176-178). Au niveau expérimental, les choses semblent plus claires. En effet, la transmission via le lait maternel d’allergènes inhalés par la mère a récemment été démontrée (179). Ce mode de contact avec les allergènes d’origine maternelle induit chez le nouveauné une réponse tolérogène (tolérance orale) dépendante de la présence de TGF- dans le lait maternel. 24 Exposition aux microorganismes ou à leurs composants L’hypothèse de l’hygiène Les modes de vie des pays industrialisés sont caractérisés par de hauts standards d’hygiène et par de faibles taux d’infections, des conditions qui semblent propices au développement de l’allergie (180, 181). Une base théorique, l’hypothèse de l’hygiène, a donc été proposée pour expliquer ces observations (figure 11). Cette théorie stipule qu’un défaut d’exposition microbienne durant la petite enfance favorise le développement de l’allergie. Cette théorie est validée notamment par les effets anti-allergiques de nombreux microorganismes (ceux-ci sont mentionnés plus bas dans cette section). Beaucoup de leurs effets bénéfiques sont attribuables à la capacité de ces microorganismes à stimuler les récepteurs TLRs (182, 183). De plus, des études épidémiologiques démontrent que des modes de vies facilitant les contacts microbiens sont associés à un plus faible risque de contracter de l’allergie. En effet, au sein des mêmes communautés rurales, les enfants élevés à la ferme (ces enfants sont soumis à une charge microbienne importante) présentent un moindre risque de développer l’atopie (184). De même, le mode de vie anthroposophique qui est caractérisé par des soins de santé restreints (faible pratique de vaccinations, faible usage d’antibiotiques et d’antipyrétiques) et une consommation de végétaux fermentés spontanément (riches en lactobacilles) est associé à une moins grande prévalence de l’atopie (185). Enfin, chez les jeunes enfants, un nombre élevé de frères et sœurs (facteur favorisant les épisodes infectieux précoces) est inversement proportionnel à la prévalence de la rhinite atopique (180). Cependant, les bases immunologiques de l’hypothèse de l’hygiène sont soumises à controverse. L’immunité du nouveau-né est polarisée vers un profil TH2. Selon une première interprétation de l’hypothèse de l’hygiène, l’exposition à de nombreux composants microbiens durant l’enfance induirait une déviation de l’immunité vers un profil TH1, un profil protecteur de l’atopie. Cette théorie est confortée par le fait que de nombreuses cytokines parmi lesquelles l’IL-12, l’IL-18, l’IFN- et l’IFN- induisent une déviation de la réponse TH2 allergène-spécifique vers un profil TH1 (186). De plus, la stimulation des récepteurs TLRs par différents composants microbiens comme le LPS, les ARNs doubles brins ou par des oligos CpG stimulent la production de nombreuses cytokines parmi lesquelles l’IL-12, une des plus importantes cytokines pro-TH1 (75). Il faut aussi noter que les néphropathies TH1 sont en augmentation dans les pays en voie de développement et les néphropathies TH2 en augmentation dans les pays développés (187), des observations qui tentent à démontrer qu’un défaut de déviation de l’immunité TH2 existe chez les populations des pays développés. Toutefois, la prévalence de l’allergie est particulièrement faible dans les régions où les infections par les helminthes sont endémiques or ces pathogènes suscitent de fortes réponses TH2. A l’évidence, les effets anti-allergiques des helminthes ne sont pas liés à l’immunité TH1. C’est pourquoi, des mécanismes immunologiques alternatifs ont été proposés pour l’hypothèse de l’hygiène: il a été suggéré qu’une forte exposition aux microorganismes durant l’enfance puisse induire la mise en place 25 de mécanismes régulateurs capables de prévenir l’allergie. Cette seconde interprétation de l’hypothèse de l’hygiène fait donc appel aux activités suppressives des lymphocytes T régulateurs. Ce type de mécanisme immunitaire est suggéré par le fait qu’une exposition à des charges importantes de pathogènes peut entraîner une forte production de cytokines régulatrices comme l’IL-10 et le TGF. De plus, des études épidémiologiques démontrent un accroissement de l’incidence de la maladie de Crohn (pathologie à dominante TH1) et du diabète sucré (pathologie auto-immune) dans les pays développés (189), des pathologies liées à une régulation défaillante de l’immunité. Effets des différents microorganismes Les infections chroniques d’helminthes des genres Ascaris, Trichuris, Ancylostoma, Schistosoma et Filaria protègent de l’allergie (190, 191). Une production accrue d’IgE polyclonale liée à la présence du parasite ne suffirait pas à expliquer les effets bénéfiques observés. Les infections par les helminthes entrainent une production accrue d’IL-10 et une plus faible réactivité des lymphocytes T (192, 193). Des mécanismes régulateurs dépendant de l’IL-10 sont démontrés dans le cas de l’infection par Schistosoma mansoni (194). Lorsque l’infection par ce parasite entre en phase chronique l’éosinophilie pulmonaire, l’hyperréactivité bronchique et l’inflammation péribronchique (des caractéristiques de l’asthme) sont diminuées. Pendant la phase d’infection chronique les titres anticorps dirigés contre les antigènes du parasite et contre les allergènes sont réduits. D’autres formes d’helminthiases sont, par contre, associées à une plus grande incidence de l’allergie (195). Plusieurs pathogènes dont le mode de contamination utilise la voie digestive sont associés à une protection contre l’atopie. En effet, l’asthme allergique IgE-dépendant et la rhinite atopique sont moins fréquents chez des individus exposés à des infections par Helicobacter pylori (bactérie), Toxoplasma gondii (protozoaire) et au virus de l’hépatite A (HAV) (196). Récemment, certains variants polymorphiques du récepteur ciblé par le HAV, Tim-1, ont été identifiés comme étant fortement associés à une réponse protectrice de l’atopie (197). Cet effet protecteur n’est présent que chez les individus exposés au virus. Pour ce virus, les facteurs génétiques et environnementaux liés à l’atopie sont donc clairement en interférence. Tim-1 est une molécule de costimulation exprimée par le lymphocyte T. La liaison de Tim-4 (exprimé par la DC) à Tim-1 provoque l’expansion des lymphocytes T et active leurs fonctions effectrices (198). L’expression de ce récepteur chez les lymphocytes TH2 est supérieure à celle des lymphocytes TH1. Différents éléments accréditent la thèse selon laquelle la prévalence de l’atopie serait influencée par la flore normale du système digestif : d’une part, des expériences menées dans des modèles murins démontrent que les mécanismes de tolérance d’ordinaire activés par l’ingestion d’allergènes sont absents chez les souris axéniques dont les conditions d’élevages empêchent la flore commensale de s’établir (199). D’autre part, la flore intestinale des individus atopiques présente une composition distincte de celle des individus sains (200) et des facteurs affectant la flore endogène tels que l’usage d’antibiotiques (185) sont associés à une plus grande prévalence de l’atopie. Enfin, le rôle 26 bénéfique des lactobacilles, constituants majeurs de la flore commensale, sur l’atopie est démontré par de nombreuses études tant du point de vue épidémiologique (200) qu’expérimental (modèles murins (201), essais cliniques (202), études in vitro (203)). Ce dernier point sera développé plus loin dans ce travail dans le chapitre consacré aux bactéries lactiques. Plusieurs virus à tropisme pulmonaire (rhinovirus, metapneumovirus, entérovirus, coronavirus et virus respiratoire syncytial) ont cependant un effet néfaste sur l’asthme. En effet, ces infections sont plus fréquentes chez les patients asthmatiques que chez les individus sains (204, 205). De toutes ces infections, l’infection à rhinovirus est la plus répandue et montre une nette association avec l’exacerbation de l’asthme. Un lien entre les infections par RSV avec les épisodes de respiration sifflante et d’asthme chez les jeunes enfants a également été démontré (206). D’autre part, des effets néfastes sont documentés pour Candida albicans. Cette levure a la faculté de coloniser la muqueuse intestinale et d’y susciter des réponses favorisant l’expression de l’asthme allergique (207). Par ailleurs, la production d’écosanoïdes (prostaglandines PGE2, PGD2, PGF2 et leucotriènes CysLT, LTB4) par plusieurs pathogènes fongiques (208) parmi lesquels la levure Candida albicans pourrait avoir un impact significatif sur le développement de l’atopie, ces composés étant des médiateurs de l’inflammation allergique. 27 6. L’asthme allergique IgE-dépendant L’asthme est une inflammation chronique des voies aériennes caractérisée par un infiltrat inflammatoire polymorphe (209, 210). Celui-ci se compose d’éosinophiles activés, de lymphocytes T, de neutrophiles, de mastocytes, de macrophages, de cellules dendritiques et de cellules NKT. La région externe des bronchioles membranaires est le principal siège de l’infiltrat cellulaire inflammatoire. Toutefois, chaque type cellulaire a son propre profil de distribution (210). Ainsi, les mastocytes et les neutrophiles se localisent également dans les régions péribronchiales tandis que les éosinophiles présentent une distribution assez large allant de la muqueuse nasale aux régions distales du poumon. L’inflammation s’accompagne d’une obstruction réversible et diffuse des voies aériennes (figure 12) qui est secondaire à : 1) Un œdème pariétal. 2) Une bronchoconstriction induite par la contraction des muscles lisses bronchiques 3) Une hypersécrétion de mucus par les cellules caliciformes et les glandes sous-muqueuses L’asthme est également caractérisé par une hyperréactivité bronchique à des stimuli très variés tels que les allergènes, des bronchoconstricteurs, des changements de température ou l’exercice. L’asthme évolue vers un remodelage progressif des voies aériennes au cours duquel on assiste aux processus suivants (211) : 1) Une hyperplasie des glandes mucosales et des cellules caliciformes, un processus lié à la production d’IL-13 et d’IL-9. 2) Une hypertrophie épithéliale. L’épithélium activé produit du TGF- et des médiateurs proinflammatoires comme l’IL-8 et le GM-CSF. 3) Un épaississement de la membrane basale dû au dépôt de protéines fibreuses et de protéines de matrice (collagène de type I, III, V, ténascine, fibronectine). 4) Une hypertrophie des muscles lisses. 5) Une néovascularisation de la muqueuse dépendante de la production de VEGF et de FGF2, des facteurs de croissance sécrétés par les éosinophiles, les macrophages et les muscles lisses. Le rôle des DCs lors de la phase de sensibilisation aux allergènes est bien connu (56). Mais ces cellules participent également à la réaction retardée de l’asthme (212). En effet, l’asthme est caractérisé par un recrutement des DCs au niveau du poumon comme le démontrent les éléments suivants : Des biopsies bronchiques révèlent un nombre accru de mDCs CD1a+ MHCII+ dans l’épithélium et la lamina propria des patients atopiques asthmatiques (213). 28 Dans des modèles animaux d’asthme expérimental, l’éosinophilie s’accompagne d’une augmentation de la population de DC pulmonaires (214). Ces DC sont localisées dans les infiltrats cellulaires péribronchiaux et périvasculaires où elles forment de multiples contacts avec lymphocytes T (215). De plus, l’implication des DCs dans l’asthme est attestée par les éléments suivants : Le transfert adoptif de mDCs à des souris SCIDs (Severe Combined Immunodeficiency Mice, souris immunodéprimées) reconstituées à l’aide de PBMCs de patients allergiques aux acariens provoque une augmentation des titres en anticorps IgE spécifiques de l’allergène Der p 1 (216). Une déplétion sélective des mDCs pulmonaires chez des souris sensibilisées (OVA) est associée à une absence d’inflammation pulmonaire lorsque ces souris sont exposées à des aérosols d’allergène (OVA). Cette inflammation peut être restaurée par administration intratrachéale de mDCs (215). Une déplétion sélective des pDCs chez la souris naïves entraîne une rupture de la tolérance à l’OVA En effet, lorsque ces souris sont exposées à des aérosols d’OVA elles développent spontanément de l’asthme. A l’opposé, le transfert adoptif de pDCs pulsées à l’OVA instaure un état de tolérance à cet allergène qui prévient l’expression de l’asthme chez des souris sensibilisées (217). L’injection intraveineuse de DCs isolées du tractus respiratoire et pulsées à l’OVA induit le développement d’une réponse humorale et cellulaire de type Th2 (profil associé à l’allergie) spécifique de l’OVA (218). L’administration intratrachéale de mDCs pulsées à l’OVA induit une sensibilisation à cet allergène chez la souris. Ces souris reproduisent des manifestations de l’asthme comme l’éosinophilie pulmonaire et l’hyperplasie des cellules caliciformes lorsqu’elles sont par la suite soumises à des aérosols d’OVA. Une même inflammation peut être obtenue uniquement en administrant des DCs par voie intratrachéale (sans aérosol) chez ces souris sensibilisées (215). Quant à l’implication des lymphocytes TH2 dans l’asthme allergique IgE-dépendant, elle est attestée par les éléments suivants: L’asthme est caractérisé par une production de cytokines de type TH2 (219). Les cellules CD4+ du sang périphérique de patients allergiques sont activées pendant les phases d’exacerbation de l’asthme (220). Des infiltrats de cellules TH2 activées sont présents dans les tissus et lavages broncholavéolaires des individus asthmatiques (atopique et non-atopique) (221-223). Ces infiltrats sont également présents chez l’animal durant la manifestation de l’asthme expérimental (224). 29 Un transfert adoptif de lymphocytes TH2 spécifiques isolés de souris sensibilisées à des souris saines induit chez ces dernières une production d’IgE, une éosinophilie pulmonaire, une hyperplasie des cellules caliciformes et de l’hyperréactivité (225). Certaines études montrent une corrélation entre le nombre de cellules activées et les manifestations de l’asthme telle que l’hyperréactivité bronchique, le degré d’éosinophilie et le rétrécissement des voies respiratoires (222, 223, 226). La déplétion des cellules CD4+ dans les modèles animaux d’asthme supprime l’hyperréactivité bronchique et l’inflammation pulmonaire (227). De manière analogue, la déplétion de cellules CD4+ chez les patients asthmatiques a des effets bénéfiques sur la fonction pulmonaire et la manifestation des symptômes liés à l’asthme (228). Le développement de l’asthme allergique IgE-dépendant repose sur l’intervention des DCs, des lymphocytes T, des lymphocytes B, des éosinophiles et des mastocytes, des cellules dont le rôle a été décrit dans le chapitre précédent consacré aux différentes manifestations de l’allergie. Cependant, d’autres populations cellulaires doivent aussi être prises en compte dans l’asthme. Citons notamment, les cellules NKT qui jouent un rôle prépondérant dans l’hyperréactivité bronchique et les cellules épithéliales qui ont une forte influence sur l’activité de la cellule dendritique. Les cellules NKT regroupent une population de lymphocytes T qui expriment des marqueurs de surface propres aux cellules T conventionnelles et aux cellules NK. Les NKT expriment les TCR mais chez une majorité de ces cellules la chaîne est invariante. Chez la souris cette chaîne est appelée V14J18 (ou J281) et s’associe majoritairement avec V8.2 et chez l’homme elle est appelée V24J18 (ou JQ) et s’associe préférentiellement à V11 (53). Ce récepteur reconnaît les glycolipides (ex. : -galactosyl-céramide, -GalCer) présentés par CD1d, un récepteur non polymorphique apparenté au MHC de classe I. Cette présentation antigénique entraîne l’activation des NKTs et induit la libération d’une forte quantité de cytokines (IL-4, IL-13, IL-10 et/ou IFN-. Chez les patients asthmatiques, 60% des cellules pulmonaires CD4+ CD3+ sont des cellules NKT V24+ produisant de l’IL-4 et de l’IL-13 mais pas d’IFN-(229). Chez la souris, la déficience en cellules NKT abolit l’hyperréréactivité bronchique mais n’affecte pas le développement de la réponse TH2 ni l’éosinophilie, démontrant l’implication de ces cellules dans l’hyperréactivité bronchique (230). L’hyperréactivité bronchique pouvant être induite par les cellules NKT en absence totale d’immunité adaptative (231), les cellules NKTs semblent médier de nouvelles voies effectrices contribuant à la pathogénèse de l’hyperréactivité bronchique. De plus l’implication des NKTs dans l’hyperréactivité bronchique est supportée par plusieurs études utilisant l’administration d’-GalCer, un glycolipide activant les NKTs : i) l’administration intranasale d’-GalCer suffit à induire l’hyperréactivité bronchique et l’inflammation pulmonaire (231) ii) l’administration de doses plus importantes de ce stimulus 24 h avant challenge aérosol à l’OVA prévient toute hyperréactivité 30 bronchique dans un modèle murin de sensibilisation à l’OVA, probablement par un mécanisme entraînant l’anergie des NKTs (232) iii) la coadministration d’-GalCer avec l’OVA provoque une sensibilisation à cet antigène et favorise le développement de l’hyperréactivité bronchique (induite par challenge aérosol à l’OVA) (233). Les lipides présents dans les pollens de cyprès induisant une forte activation des cellules NKT humaines (234), un mécanisme de sensibilisation dépendant de la stimulation de ces cellules a été proposé pour les allergènes de cyprès. La première ligne de défense du poumon est son épithélium. Ce tissu constitué de cellules épithéliales étroitement juxtaposées joue le rôle de barrière physique contre les antigènes et les microorganismes inhalés. L’étanchéité de cette barrière est assurée par des protéines de surface comme l’occludine et les claudines (impliquées dans la formation des jonctions serrées) et par des protéines intracellulaires d’échafaudages comme ZO-1 (235). La cellule épithéliale interagit de façon étroite avec la cellule dendritique au niveau du poumon (236). En effet, la cellule dendritique échantillonne le contenu de la lumière des voies respiratoires en insinuant ses dendrites à travers la barrière épithéliale, une fonction qui permet une surveillance immunitaire optimale. Comme la DC exprime également l’occludine, plusieurs claudines et ZO-1, l’intégrité de la barrière est préservée au cours de ce processus (236). De plus, la cellule dendritique se lie à la cellule épithéliale par la formation de liens homotypiques entre l’E-cadhérine qu’elle exprime à sa surface et l’E-cadhérine exprimée en surface de la cellule épithéliale. La cellule épithéliale joue aussi un rôle de senseur : en exprimant les TLRs et les récepteurs PARs, les cellules épithéliales sont capables de reconnaître de nombreux motifs microbiens et répondent à l’activité de nombreuses protéases extracellulaires. La stimulation de ces récepteurs conduit à la production de chimiokines (TARC/CCL17, MIP-3/CCL-20) impliquées dans le recrutement de monocytes, de neutrophiles et de DC, de cytokines ou de composants proinflammatoires (TSLP, GM-CSF, IL-1, ATP, TNF-, IL-6, IL-25, IL-33 et l’ostéopontine) conduisant à l’activation de la cellule dendritique. La TSLP (thymic stromal lymphopoietin) semble être particulièrement impliquée dans l’asthme puisque sous son influence, la cellule dendritique favorise la différenciation de lymphocytes TH2 producteurs d’IL-4, d’IL-5, d’IL-13, de TNF- mais pas d’IL-10 et exprimant le récepteur CRTH2 (récepteur de la prostaglandine D2) (237), un phénotype que l’on peut aussi observer chez les lymphocytes T pulmonaires des patients asthmatiques. Ce processus de polarisation repose sur l’engagement du récepteur OX40L, une molécule de costimulation particulièrement impliquée dans le dévelopement de la réponse TH2 (238). La TSLP provoque la dégranulation immédiate des mastocytes, libérant ainsi de nombreuses cytokines (IL-5, IL-13,…) et médiateurs inflammatoires (prostaglandines, leucotriènes,…) impliqués dans l’asthme. Les souris surexprimant conditionnellement cette cytokine dans les poumons développent une réponse TH2 vigoureuse (239) alors que les souris Tslpr-/- sont incapables de développer une réponse TH2 dans les poumons, indiquant bien que cette cytokine est fortement impliquée dans l’asthme (240). 31 De nombreux allergènes interfèrent avec la cellule épithéliale. Der p 1 (241), Pen ch 13 (allergène de Penicillium chrysogenum) (242), des allergènes de pollens de nature indéfinie (extraits de pollen d’ambroisie et de bouleau) (243), des allergènes de blattes de nature indéfinie (extraits de blattes) (244) clivent les protéines de jonction épithéliale, entraînant une rupture de la barrière épithéliale avec pour conséquence la diffusion de l’allergène dans l’organisme. D’autres allergènes ou sources d’allergènes (Der p 3, les extraits de blattes) stimulent par leur activité protéolytique les récepteurs PARs présents à la surface de la cellule épithéliale (46, 245). Certains contaminants (endotoxines, peptidoglycan) associés aux allergènes peuvent cibler les TLRs exprimés par la cellule épithéliale. 7. Stratégies actuelles de traitements contre l’allergie Les corticostéroïdes inhalés et les 2-mimétiques à courte (SABA, short-acting 2adrenoceptor agonist) et longue durée d’action (LABA, long-acting 2-adrenoceptor agonist) sont actuellement les médicaments recommandés pour le traitement de l’asthme. Dans le cas de la rhinite, des agonistes du récepteur -adrénergique sont utilisés pour réduire la congestion nasale et des H1antihistaminiques et des corticostéroïdes sont utilisés pour le traitement de fond. Les corticostéroïdes Les corticostéroïdes diffusent à travers la membrane cytoplasmique pour atteindre le récepteur intracellulaire aux glucocorticostéroïdes (GR, glucocorticosteroid receptor). La stimulation de ces récepteurs entraîne leur translocation dans le noyau où ils modulent l’activité de nombreux gènes par des mécanismes de transactivation et de transrépression (246). Dans l’asthme allergique, les corticostéroïdes ont pour effets d’inhiber l’expression de cytokines de chimiokines et de molécules d'adhésion (247). Leur action provoque une inhibition de l’inflammation pulmonaire. Cependant les corticostéroïdes n’ont pas de réelle influence sur le développement de l’allergie (ils ne traîtent que les symptômes) (248) et n’ont pas d’effet sur le remodelage tissulaire (une caractéristique importante de l’asthme). Les 2-mimétiques La stimulation du récepteur 2-adrénergique par ces agonistes stimule l’activation de l’adénylate cyclase et donc la formation de cAMP qui à son tour active la protéine kinase A. Ce processus a pour effet d’induire la relaxation des muscles lisses par i) la phosphorylation de la kinase de la chaîne légère de la myosine ii) l’ouverture de canaux KCa. En conséquence, la bronchoconstriction diminue. Les SABAs inhalés tels que le sulbatemol et la tulbutaline sont utilisés pour l’atténuation rapide des symptômes de l’asthme. Les LABA inhalés tels que le formotérol et le 32 salmeterol induisent de la bronchodilatation pendant plus de 12 heures (249) et sont utilisés dans les cas d’asthmes non contrôlés par les traitements par corticostéroïdes. Les antagonistes et inhibiteurs de synthèse Les antagonistes des récepteurs H1 de l’histamine atténuent les symptômes de l’asthme. Les antihistaminiques de première génération présentant des effets sédatifs et anti-cholinergique, ils ont été remplacés par les antihistaminiques de seconde génération (cetirizine, loratadine,…) qui présentent une meilleure efficacité, une meilleure sélectivité et plus faible toxicité cardiaque (250). Les antagonistes des récepteurs à leukotriènes (CysLTR1) peuvent être utilisés pour le traitement de la rhinoconjuctivite mais ne sont pas indiqués pour le traitement de la dermatite atopique. Leur usage dans le traitement de l’asthme se fait en général en complément aux thérapies par corticostéroïdes (251). Un seul inhibiteur de la 5-lipooxygénase (une enzyme impliquée dans la synthèse des leucotriènes) a actuellement réussi à passer les essais cliniques (252). Les inhibiteurs de phosphodiestérases Les propriétés bronchodilatatrices de la théophylline ont été utilisées pour le traitement de l’asthme. La théophylline est à la fois un inhibiteur de la cAMP phosphodiestérase et un antagoniste des récepteurs de l’adénosine. Ses effets néfastes sur le système nerveux central et sur le cœur ont progressivement conduit à son abandon (253). L’immunothérapie allergène-spécifique L’immunothérapie allergène-spécifique (SIT, allergen-specific immunotherapy) est le seul traitement curatif de l’allergie actuellement disponible, les autres traitements ne s’attaquant qu’aux symptômes de l’asthme. La SIT consiste à administrer des doses croissantes d’extraits d’allergènes ou d’allergènes recombinants de manière à susciter une réponse tolérogène allergène spécifique, ce qui peut prendre plusieurs jours ou plusieurs mois selon le régime utilisé. L’approche la plus répandue consiste en une phase de croissance (injections hebdomadaires) suivie d’une phase de maintenance (injections mensuelles). La SIT modifie tant la réponse humorale que la réponse cellulaire aux allergènes (254). La SIT diminue la proportion de cellules TH2 et induit le développement d’une population de cellules régulatrices CD4+CD25+FOXP3+ produisant de fortes quantités d’IL-10 et de TGF-. La production d’IL-10 par les monocytes et macrophages est augmentée. Le changement de classe isotypique vers l’IgA, l’IgG1 et l’IgG4 est induit, notamment via la production d’IL-10 (IgG4) et de TGF-IgA. Les anticorps IgG4 induits par la SIT sont considérés comme des anticorps bloquants qui entrent en compétition avec les IgE pour les épitopes des allergènes, empêchant ainsi la formation des complexes IgE-allergènes responsables de la dégranulation des mastocytes. Le nombre de mastocytes et leur faculté à relarguer des médiateurs inflammatoires sont réduits. Le recrutement des éosinophiles et des neutrophiles au site d’inflammation est également diminué. 33 L’immunothérapie sous-cutanée (SCIT, subcutaneous immunotherapy) est cliniquement efficace mais est limitée par le risque de choc anaphylactique qui touche de 0,1-5% des patients (255). C’est pourquoi les nouvelles stratégies tentent d’améliorer l’efficacité et l’innocuité de la SIT. Cellesci sont basées sur différentes approches : peptides immunoréactifs, variants hypoallergéniques des allergènes, allergènes modifiés chimiquement (allergoïdes), remplacement des adjuvants basés sur l’hydroxyde d’aluminium (adjuvant TH2) par ceux basés sur du phosphate de calcium ou de la tyrosine, utilisation de composés immunomodulateurs comme le monophosphoryl lipid A (MPL) (256). L’immunothérapie sublinguale (sublingual immunotherapy, SLIT), quant à elle, requiert de plus fortes doses d’allergènes que la SCIT mais ses effets secondaires sont particulièrement faibles (257). Bien qu’elle soit utilisée depuis plusieurs années en Europe, la SLIT n’est toujours pas acceptée par la FDA notamment à cause de problèmes de standardisation d’extraits d’allergènes. Les médicaments ciblant l’IgE Les anticorps IgG ciblant le domaine C3 de l’IgE et bloquant la liaison de l’IgE à FcRI et FcRII inhibent les réponses inflammatoires induites par les allergènes (113). L’Omalizumab, un anticorps IgG1 humanisé IgE spécifique induit une diminution du taux d’IgE sérique et décroît le taux d’IgE lié aux récepteurs FcRI et FcRII présents à la surface des mastocytes, des basophiles et des éosinophiles. L’Omalizumab réduit aussi le taux d’expression du récepteur FcRI, entraînant un affaiblissement des mécanismes de présentation antigénique facilités par les IgE. L’administration de cet anticorps ( administration sous-cutanée 2-4 fois par semaine) à des enfants, des adolescents et des adultes présentant un asthme allergique IgE-dépendant mal contrôlé améliore le contrôle de l’asthme et permet aux patients d’être traités par de plus faibles doses de corticostéroïdes (258). Les inhibiteurs de mastocytes Le nedocromil et le cromoglicate de sodium inhibent le flux des ions chlorides des mastocytes, diminuant ainsi leur sensibilité à la dégranulation. L’inhalation de ces deux médicaments inhibe la phase précoce et tardive de l’allergie dans les parties distales et proximales du poumon et dans la conjonctive (259). 34 1. Caractéristiques générales Chez les bactéries lactiques, la fermentation des hexoses produit principalement de l’acide lactique. Ce processus de fermentation est qualifié d’homofermentaire si l’acide lactique représente le seul métabolite produit ou d’hétérofermentaire si la fermentation des sucres produit d’autres métabolites comme le CO2, l’acétate ou l’éthanol (figure 13) (260). Les bactéries lactiques sont anaérobes, micro-aérophiles ou aéro-tolérantes et ont, en outre, pour caractéristiques communes d’être Gram-positives et catalase négatives. Sous l’appellation « bactéries lactiques » sont regroupés les genres Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus et Carnobacterium (appartenant à l’ordre des Lactobacillales, contenu de l’ADN en G + C < 50%) et le genre Bifidobacterium (appartenant à l’ordre des Bifidobacteriales, contenu de l’ADN en G + C > 50%). Ces différentes bactéries sont généralement non mobiles, non sporulantes et très rarement pathogènes. Les bactéries lactiques possèdent en effet un statut GRAS (Generally Recognized As Safe) qui autorise officiellement leur usage dans les applications alimentaires et qui témoigne de leur parfaite innocuité. Elles sont utilisées pour la préservation des aliments ainsi que pour l’amélioration de leurs qualités structurelles et organoleptiques. Cependant, peu de bactéries lactiques survivent au passage du tractus intestinal. Les bactéries lactiques colonisent des habitats variés mais riches en composés organiques comme les produits alimentaires (viande, vin, lait, choucroute, cacao,…), les ensilages, le fumier, les tractus gastrointestinal et génital (animal et homme). Ces dernières années, les génomes d’une vingtaine de bactéries lactiques ont été entièrement séquencés. La taille de leur génome varie de 1,8 Mb pour Oenococcus oeni à 3,3 Mb pour Lactobacillus plantarum. Beaucoup de ces bactéries présentent de faibles capacités de biosynthèse, ce qui reflète leur adaptation à des environnements riches en nutriments. Plusieurs analyses génomiques comparatives ont été réalisées (261). Celles-ci ont conduit à l’élaboration d’arbres phylogénétiques (figure 14) et ont servi à reconstituer le patrimoine génétique ancestral des bactéries lactiques. L. plantarum est particulièrement flexible au niveau des ses exigences métaboliques en hydrocarbones et manifeste très peu d’auxotrophies : seul des apports en pentothénate de calcium (vitamine B5, indispensable à la formation du coenzyme-A) et en niacine (vitamine B3, précurseur du NADH) sont nécessaires à sa croissance. Un nombre remarquablement élevé de transporteurs de sucres a été localisé dans son chromosome : plus de 25 complexes PTS (Phosphotransferase System) complets auxquels pourraient s’ajouter 30 transporteurs de sources carbonées de spécificité inconnue (262). Contrairement aux autres bactéries lactiques, L. plantarum ne possède pas de gène codant pour la protéinase extracellulaire Prt, l’enzyme principal de dégradation des larges polypeptides. Mais L. 35 plantarum exprime les transporteurs peptidiques Opp et Dtp ainsi que 19 peptidases intracellulaires de différentes spécificités permettant l’assimilation d’une large gamme de peptides de petite taille (262). Plusieurs protéines de surface de L. plantarum sont homologues à des protéines de liaison au mucus, de liaison à la fibronectine, d’adhésion intercellulaire et d’agglutination, suggérant des fonctions d’interaction avec les protéines ou cellules de l’environnement (262). La Sdr, une autre protéine de surface de cette espèce, contiendrait des structures glycaniques proches de celles des mucines (263), ce qui faciliterait l’interaction de L. plantarum avec les muqueuses de son hôte. Administré à la souris par voie orale, L. plantarum persiste dans le tractus intestinal pendant plus d’une semaine démontrant de fortes capacité à résister et à coloniser cet environnement (264). Les conditions du tractus digestif induisent l’expression de plusieurs de ses protéines parmi lesquelles des transporteurs de sucres (ribose, cellobiose, sucrose, sorbitol), quatre protéines de surfaces potentiellement impliquées dans des interactions avec l’hôte et quatre protéines de stress (265). In vitro, L. plantarum montre des facultés de résistance aux sels biliaires et à la pancréatine mais manifeste une légère sensibilité à la pepsine (266). In vitro toujours, L. plantarum présente des capacités modérées d’adhérence à l’épithélium (266). 2. Composants liés à l’immunité antibactérienne a) Structure générale des bactéries lactiques Les bactéries sont constituées d’une enveloppe, d’un cytosol et d’une série d’éléments ultrastructurels internes : les granules intracytoplasmiques (responsables du stockage de polymères énergétiques comme le glycogène), les polysomes (renfermant de nombreux ribosomes) et le nucléoïde, une structure dense associée à l’ADN chromosomique de la bactérie. On trouve également pour certaines bactéries d’autres éléments structurels comme un flagelle, une vacuole gazeuse, des pili, une capsule ou des éléments associés à la sporulation mais ces composants sont absents chez les bactéries lactiques. L’enveloppe des bactéries lactiques est typique des bactéries Gram-positives (267). Elle se compose d’une membrane plasmique superposée d’une épaisse couche de peptidoglycan. Leur membrane plasmique est constituée d’une bicouche phospholipidique dépourvue de stérols. Elle séquestre les ancres hydrophobes des acides lipotéichoïques et abrite diverses protéines intégrales. Le peptidoglycan des bactéries lactiques est associé à des acides teichoïques, à de multiples protéines, à des polysaccharides neutres et est surmonté, chez certaines espèces, d’une couche de protéines assemblées sous forme paracristalline (S-layer). 36 b) Composants reconnus par le système immunitaire inné Les propriétés stimulatrices de plusieurs constituants de bactéries lactiques ont été démontrées. Il s’agit, dans la plupart des cas, d’éléments structurels nécessaires à la survie de ces bactéries (268). D’une espèce à l’autre, ces composants bactériens présentent de légères disparités structurelles qui peuvent affecter considérablement leurs capacités immunostimulatrices. (1) Le peptidoglycan Le peptidoglycan est probablement le composant le mieux conservé de tous les constituants de l’enveloppe bactérienne. Chez les bactéries Gram-positives son épaisseur atteint typiquement 50 nm. Sa fonction première est de s’opposer aux tensions exercées par la pression osmotique. Il permet à la bactérie de supporter des pressions allant jusqu’à 20 atmosphères pour les bactéries Gram-positives et 5 atmosphères pour les bactéries Gram-négatives. Ce composant détermine également la forme de la bactérie. Le peptidoglycan est un large polymère formé à partir de deux unités saccharidiques : l’acide N-acétylmuraminique et l’acide N-acétylgalactosamine (figure 15) (267). Le groupe carboxylique de l’acide N-acétylmuramidique est lié à un groupement peptidique (stem peptide) constitué de 4 à 5 acides aminés qui alternent les formes stéréoisomériques L et D. Chez les bactéries lactiques, la séquence consensus de ce peptide est : L-alanine/D-glutamate/acide méso-diaminopimélique ou Llysine (deux diaminoacides)/D-alanine/D-alanine. Lorsque la D-alanine terminale est substituée par du L-lactate (une caractéristique du peptidoglycan de L. plantarum) le groupement peptides-L-lactate est appelé pentadepsipeptide. Les penta(depsi)peptide sont reliés entre eux soit directement, soit indirectement par l’intermédiaire d’un (le plus souvent l’acide D-asp) ou plusieurs acides aminés (267). Les peptidoglycans subissent principalement quatre modifications secondaires. La première de ces modifications est la déacétylation (identifiée chez Lactibacillus fermentum) (269), ce qui leur confère une résistance à de nombreuses muramidases. La seconde modification est l’acétylation de l’acide N-acétylglucosamine (6-O-acétylation), ce qui inhibe également l’activité de plusieurs muramidases à l’exception notoire de la mutanolysine (270). Ce deuxième type de modification a été identifié chez plusieurs espèces de LABs comme Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus casei. La troisième modification est la liaison des acides téichoïques et téichunoriques au carbone n°6 de l’acide N–acétylglucosamine (267). Enfin, les penta(depsi)peptides non pontés peuvent se lier à différentes protéines possédant la séquence consensus LPXTG (271), ce qui les ancre au protéoglycan. La reconnaissance du peptidoglycan bactérien par le système immunitaire de l’hôte mobilise plusieurs récepteurs de l’immunité innée. TLR2 est le plus ancien récepteur identifié mais sa 37 participation à la reconnaissance du peptidoglycan a plusieurs fois été remise en question. En effet, des artéfacts liés à la présence d’impuretés ont été identifiés dans plusieurs études (272). Toutefois, les capacités stimulatrices du peptidoglycan sur TLR2 sont aujourd’hui clairement démontrées (273). NOD1 et NOD2 (Nucleotide-binding Oligomerisation Domain) sont deux autres récepteurs reconnaissant spécifiquement le peptidoglycan. Ces récepteurs intracellulaires reconnaissent respectivement le dipeptide -D-glutamyl-meso-diaminopimélique (plus répandu chez les bactéries Gram-négatives) et le muramyl dipeptide des peptidoglycans (274). Ces ligants sont relargués par les bactéries dans leur environnement, suggérant que les bactéries puissent stimuler le système immunitaire de l’hôte sans qu’un contact physique ne soit établi avec lui (275). (2) Les acides téichoïques Les acides téichoïques constituent le second composant majeur de la paroi des bactéries Grampositives dont ils peuvent représenter plus de la moitié du poids sec. Les acides téichoïques sensu lato se présentent sous trois formes principales : acides téichoïques associés au peptidoglycan, acides lipotéichoïques associés à la membrane et acides téchunoriques (présents uniquement chez certaines espèces comme Bacillus subtilis) (figure 16) (267, 276). Les acides téichoïques sont très diversifiés sur le plan structurel. Leur abondance et leur structure sont fonction de la souche bactérienne mais aussi des conditions environnementales : pH, source de carbohydrates, disponibilité en phosphates,… Ce sont des polymères chargés qui séquestrent les cations (en particulier Mg2+) dans la paroi bactérienne et qui forment des complexes avec les protéines résidentes. Ces composants bactériens sont impliqués dans diverses activités biologiques comme la régulation de la balance cationique, la division cellulaire et l’autolyse du peptidoglycan (277-279). L’unité polymérique de base des acides téichoïques et lipotéichoïques est constituée d’un groupement ribitol ou glycérol phosphate substitué à des résidus glucose, D-alanine et/ou acide Nacétylgalactosamine (276). Dans le cas des acides téichoïques, l’ensemble du polymère est associé à une unité de liaison responsable de l’ancrage au peptidoglycan. La structure de cette unité de liaison semble particulièrement conservée au sein des différences espèces de bactéries lactiques et se compose d’un groupement disaccharidique (N-acétylmannosaminyl(1→4)glucosamine associé à un glycérolphosphate. Dans le cas des acides lipotéichoïques, la chaîne polymérique est liée via son extrémité réductrice à une ancre lipidique dont la nature précise varie d’une espèce à l’autre. Cette ancre est généralement constituée d’un diacylglycérol lié à un di- ou tri-saccharide dont l’unité saccharidique terminale est elle-même liée à des acides gras. L’ancre lipidique des acides lipotéichoïques permet l’adhésion de ces composants à la membrane bactérienne. Cependant une fraction d’entre eux peut-être détectée sous forme libre dans l’environnement extracellulaire. Le potentiel immunostimulateur de l’acide téichoïque a été clairement démontré par plusieurs études qui ont également mis en évidence l’engagement de TLR2 dans la reconnaissance de ce 38 composant bactérien (280). Ces résultats obtenus initialement à partir de composants bactériens purifiés ont été confirmés par la suite par l’emploi d’analogues synthétiques (281). L’ancre hydrophobe des acides lipotéichoïques est responsable d’une partie de leur activité immunostimulatrice mais celle-ci dépend aussi de composants structurels additionnels situés sur leur chaîne polymérique (281). En particulier, la substitution des acides (lipo)téichoïques par des résidus D-alanyl ester est essentielle à la stimulation de TLR2 (282, 283). La perte de ce type de substituant provoque une diminution drastique des propriétés inflammatoires bactériennes (284). Ce type de mutation entraîne également, chez les bactéries qui la portent, une augmentation de leur susceptibilité aux peptides cationiques antimicrobiens (défensines) (285) et altère leurs capacités d’adhésion aux cellules de l’hôte (286). L’incorporation des résidus D-Alanine aux acides (lipo)téichoïques est réalisée par les produits de l’opéron dlt (figure 17) (287). Cet opéron regroupe les gènes dltA, dltB, dltC, dltD qui sont tous indispensables à la D-alanyl-estérification des acides (lipo)téichoïques. (3) L’ADN Les propriétés proinflammatoires des ADNs bactériens contribuent au développement de diverses formes de pathologies comme l’arthrite(288), l’hypersensibilité de contact (289) et certains types d’inflammation cutanée (290). Mais, paradoxalement, des effets anti-inflammatoires sont aussi rapportés. En particulier, les ADNs bactériens favorisent la rémission de colites expérimentales en induisant la production d’interférons de type I (291)La force de ces effets immunostimulateurs varie suivant les espèces bactériennes (292). Les ADNs d’autres organismes tels que les levures, les insectes et les nématodes ont également des effets activateurs sur le système immunitaire. Les propriétés stimulatrices des ADNs sont attribuables à la présence de motifs CpG (séquence nucléotidique Cytosine-Guanosine) non méthylés. Bien que les génomes des mammifères contiennent ce type de motifs, chez les mammifères la fréquence des motifs CpG est relativement faible (elle n’atteint que 23% de la fréquence attendue pour une séquence aléatoire) (293) et ces motifs sont méthylés à 70-80% (294). De plus, la présence de séquences riches en guanosine comme GGAGGGG dans le génome des vertébrés contribue aussi à affaiblir le pouvoir activateur de leur ADN (295). Toutefois l’ADN génomique des cellules de mammifères conserve une faible force d’activation qui pourrait jouer un rôle dans la réparation des dommages tissulaires (296). Les motifs CpG sont reconnus spécifiquement par le récepteur intracellulaire TLR9 (localisé à l’état basal dans les endosomes) (297). La reconnaissance de ces séquences nucléotidiques requiert donc leur internalisation préalable qui se fait par phagocytose pour les bactéries ou par endocytose pour les analogues synthétiques des ADN bactériens (CpG ODN, oligonucléotides à motifs CpG). L’activation de TLR9 est initiée au sein de vésicules intracellulaires de type lysosomial où se colocalisent les motifs CpG (298). 39 (4) Autres composants Les lipoprotéines bactériennes sont des composants pro-inflammatoires exposés en surface des bactéries. Ces protéines subissent au cours de leur biosynthèse des étapes secondaires de lipidation qui permettent leur ancrage à la membrane bactérienne (299). Elles possèdent toutes à leur stade immature un peptide signal (lipobox) positionné à leur extrémité aminoterminale. La lipobox est la cible d’étapes de maturation qui conduisent à l’ajout d’un résidu diacylglycéryl au résidu cystéine du peptide signal. Les autres résidus de la lipobox sont ensuite clivés (300). Ce processus se termine à ce stade chez les bactéries Gram-positives mais se poursuit chez les bactéries Gram-négatives par l’ajout d’un troisième acide gras. Ces deux types de motifs lipidiques sont reconnus spécifiquement par TLR2 qui peut agir en coopération avec TLR1 (reconnaissance spécifique de triacyl-lipopeptides d’origine Gram-négative) ou TLR6 (reconnaissance spécifique de diacyl-lipopeptides) (301). Le rôle de TLR2 dans la reconnaissance de ce type de lipopeptide a été est confirmé à l’aide de composés synthétiques comme le Pam2CysSK4 ou le Pam3CysSK4 qui miment la structure aminoterminale des lipoprotéines (302). A noter qu’une fraction des lipoprotéines est libérée dans l’espace extracellulaire (303). Les bactéries produisent également des peptides formylés au niveau des méthionines (ex. : fMet-Ile-Leu-Phe) qui ont des effets chimiotactiques sur les neutrophiles (304). 3. Interactions avec l’hôte a) Localisation Certaines espèces de bactéries lactiques font parties intégrantes de la flore commensale des mammifères. Ces populations de microorganismes sont associées à différents sites anatomiques, comme les muqueuses du tractus digestif où elles forment un écosystème particulièrement dense et complexe. Mais ces microorganismes colonisent également la peau, la cavité nasale et la muqueuse vaginale. Le tractus digestif est rapidement colonisé à la naissance par des bactéries anaérobes facultatives dont en particulier certaines espèces de bactéries lactiques. Les bactéries anaérobes strictes sont le second type de bactéries à y élire domicile (endéans 2 semaines après la naissance). La composition de la flore commensale évolue ensuite fortement jusque vers l’âge de 2 ans où elle atteint un équilibre (climax) proche de celui de l’adulte (305). Les bactéries sont les principaux microorganismes colonisant le tractus digestif mais des protozoaires et des fungi peuvent aussi y être identifiés (306, 307). Au niveau de l’estomac, on dénombre moins de 104 bactéries par gramme de contenu luminal (Helicobacter pylori est la seule bactérie formellement identifiée). Plus loin dans le tractus digestif, au niveau de l’iléon, des densités allant de 104 à 107 bactéries/g (Streptocoques, lactobacilles, coliformes, entérocoques, Bacterioides) sont atteintes mais les densités les plus élevées sont observées dans le colon (1010 – 1012 bactéries/g correspondant à plus de 400 espèces cultivables ex vivo) où se localisent principalement des bactéries 40 anaérobes strictes (Bacteroides, Clostridia, bifidobactéries, fusobactéries, peptostreptocoques,…), les anaérobes facultatifs comme les lactobacilles y étant minoritaires (106 – 108 bactéries/g) (308, 309) (figure 18 et tableau 4). En dehors de ces caractéristiques générales, la composition exacte de la flore commensale varie fortement en fonction des individus (310). b) Tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales et nasales Les muqueuses constituent la principale interface de l’organisme avec l’environnement. Ces sites anatomiques sont associés à différentes structures lymphoïdes (MALT, Mucosa-Associated Lymphoid Tissue) capables de générer des réponses immunes vigoureuses (311). Celles-ci sont nécessaires pour faire face aux nombreux pathogènes dont les muqueuses sont la cible. Mais ces tissus lymphoïdes doivent aussi faire face à une multitude d’antigènes inoffensifs pour l’organisme, comme les produits de la digestion ou la flore commensale. Dès lors, des réponses adaptées à ce dernier type d’antigènes sont aussi nécessaires (tolérance, ignorance,…) (306). En effet, des réponses inflammatoires chroniques sont potentiellement dommageables pour l’organisme (nécroses des tissus, perte de la fonction digestive,…) comme c’est le cas dans la maladie de Crohn. De façon remarquable, la flore commensale conditionne l’activité du système immunitaire associé aux muqueuses. En particulier, les propriétés stimulatrices de ces microorganismes sont indispensables au développement du système immunitaire associé à la muqueuse intestinale (311). En conséquence, la flore commensale participe indirectement à la défense immunitaire contre les pathogènes. La flore commensale est également nécessaire au maintien de l’homéostasie immunitaire (312) et induit des mécanismes de tolérance immunitaire dirigés contre les antigènes étrangers inoffensifs. Cette « tolérance mucosale » est un processus actif caractérisé par une suppression des réponses cellulaires et humorales antigènes-spécifiques, un processus particulièrement intéressant dans le cadre d’une perspective de traitement de l’allergie (313). Le GALT (Gut-Associated Lymphoid Tissue) (figure 19) (314), le tissu lymphoïde associé à la muqueuse intestinale, est le tissu lymphoïde en contact avec les plus fortes densités de microorganismes. Sa première ligne de défense repose sur des mécanismes d’exclusions qui limitent l’accès des microorganismes à la muqueuse : production abondante de mucus (sécrété par les cellules caliciformes) à la surface de l’épithélium et un renouvellement rapide de la surface épithéliale par division cellulaire au niveau de la partie basale des cryptes. Un second mécanisme de défense consiste à libérer des composés antimicrobiens au niveau de la lumière intestinale. Ces composés sont les défensines et le lysozyme sécrétés par les cellules de Paneth et les IgA produits par les lymphocytes B au niveau de la lamina propria et libérés dans le lumen par les cellules épithéliales. Des structures lymphoïdes constituent la troisième ligne de défense de l’organisme et sont responsables de l’induction des réponses immunitaires. Au niveau macroscopique, il s’agit des plaques 41 de Peyer et des ganglions mésentériques (311, 315). Les plaques de Peyer sont constituées d’un ensemble de follicules regroupant les lymphocytes B et de zones interstitielles où se localisent les lymphocytes T (TDA, T-cell Dependent Area). Ces zones lymphoïdes sont surmontées d’une zone plus diffuse, le dôme subépithélial (SED, Subépithelial Dome). L’ensemble de cette structure est recouverte par un épithélium prismatique simple (FAE, Follicule-Associated Epithelium) qui est infiltré par de nombreux types cellulaires (lymphocytes B, lymphocytes T, macrophages et DCs). L’épithélium du FAE abrite de nombreuses cellules M (microfold). Celles-ci sont dépourvues de bordure en brosse (formée par les microvilosités) et ne sécrètent pas de mucus. Ces cellules ont la particularité de pouvoir transférer par trancytose les antigènes de la lumière intestinale au dôme subépithélial où résident différents types d’APCs professionnelles (DCs, macrophages,…). Cette voie est notamment utilisée par différentes bactéries pathogènes (Yersinia, Salmonella,…) pour entrer dans l’organisme (316, 317). Des structures lymphoïdes plus petites ressemblant à des plaques de Peyer microscopiques sont aussi distribuées tout le long de l’intestin. Les lymphocytes activés dans les plaques de Peyer migrent vers les ganglions mésentériques par un processus dépendant de l’expression de l’intégrine 77 et du récepteur CCR9. Les lymphocytes y stimulent alors l’expansion et la différenciation des lymphocytes B. Ces derniers migrent alors vers la lamina propria où ils se différencient en plasmocytes sécréteurs d’IgA. De manière alternative, les DCs chargées d’antigènes au niveau des plaques de Peyer ont elles aussi la possibilité de migrer vers les ganglions médiastinaux pour y stimuler les lymphocytes T locaux. En effet, les plaques de Peyer contiennent différents types de cellules dendritiques (tableau 5) (311) susceptibles de remplir cette fonction. Ces populations de DCs se distinguent des populations périphériques par certaines singularités, la plus remarquable étant la production d’IL-10 par la population prédominante CD8- CD11b+ (318). Les ganglions mésentériques semblent également jouer un rôle clé d’interface avec l’immunité systémique. Les lymphocytes gagnent ensuite la muqueuse via le canal thoracique pour y assurer leurs fonctions effectrices. Les lymphocytes CD8+ sont majoritaires au niveau de l’épithélium et représentent 40% de la population lymphocytaire de la lamina propria. Les populations de lymphocytes T intraépithéliaux (IEL, Intraepithelial Lymphocytes) contiennent des lymphocytes de phénotype sans équivalent au niveau systémique, les lymphocytes T CD8 (ils expriment la forme homodimérique du récepteur CD8) (319). D’autre part, beaucoup d’IELs expriment une forme duTCR associée à des chaînes et (TCR) alors qu’au niveau systémique l’TCR est plus fréquent (320). Contrairement aux ganglions, il semblerait que les plaques de Peyer ne soient pas essentielles à l’immunité intestinale comme le suggèrent les études menées chez des animaux où ces structures lymphoïdes sont déficientes (311). Par ailleurs, l’immunité intestinale peut être induite par des voies alternatives. En effet, les cellules dendritiques ont la capacité d’insinuer leur prolongement cytoplasmique entre les cellules épithéliales et d’échantillonner directement le contenu du lumen, y 42 compris les bactéries commensales (321). Ce processus dépend de l’expression de protéines de jonction par la cellule dendritique et préserve l’intégrité de la barrière épithéliale (322). D’autre part, les cellules épithéliales exercent aussi des fonctions de présentation d’antigènes particulières (elles utilisent simultanément des CMHII et des CMHI non classiques mais n’expriment pas de molécules de co-stimulation) (323) et produisent des exosomes qui pourraient aussi contribuer au développement des réponses immunes intestinales (324). Comparée à la muqueuse intestinale, la muqueuse nasale est beaucoup plus sensible à la stimulation antigénique et constitue donc une voie à privilégier pour la vaccination (325). De plus, cette muqueuse est un site important pour la génération de mémoire immunitaire à long terme. Tout comme la muqueuse intestinale, la muqueuse nasale est associée à des tissus lymphoïdes, le NALT (Nasal-Associated Lymphoid Tissue). Le NALT correspond chez l’homme aux anneaux de Waldeyer (amygdales palatines, amygdales pharyngées, amygdales linguales, végétations adénoïdes) et chez la souris à une paire de structures lymphoïdes situées dans la cavité nasale (326). Même si le NALT est beaucoup moins bien caractérisé que le GALT, il apparaît au regard de nos connaissances actuelles que les structures lymphoïdes de ces deux tissus muqueux sont très similaires. L’épithélium du NALT se compose d’un grand nombre de cellules ciliées, de cellules prismatiques, de quelques cellules caliciformes et de cellules M. Les cellules M du NALT ressemblent à leurs homologues intestinaux tant au niveau de leur ultrastructure que de leur fonction (endocytose des antigènes et transport de ceux-ci aux tissus sous-jacents) (327). La muqueuse nasale draine vers les ganglions cervicaux superficiels et jugulaires internes (328). Une ablation de ceux-ci, empêche l’établissement de réponses mucosales tolérogènes (tolérance mucosale) à partir de la muqueuse nasale. Les cellules présentatrices d’antigènes (DCs et macrophages CD11b+ Ia+) sont présentes dans le NALT (329) et des populations CD8+ et CD8+ y ont été identifiées (330). Contrairement au GALT dont le développement est initié durant la formation de l’embryon, le développement du NALT débute à la naissance et atteint sa maturité après 8 semaines chez la souris (325). 4. Bactéries lactiques et allergie Les bactéries lactiques exercent au sein de l’intestin des activités anti-inflammatoires utilisées pour le traitement de maladies telles que la colite ulcérative ou la pochite (inflammation du réservoir iléal). Cependant, les effets de ces bactéries ne se limitent pas aux sites anatomiques qu’elles colonisent mais s’étendent également au niveau systémique. C’est dans ce contexte que des effets sur l’allergie ont été rapportés. Une vingtaine d’études épidémiologiques tentant d’associer des profils particuliers de composition de la flore intestinale et le développement de l’atopie ont été conduites. Globalement, certains profils de composition microbienne semblent avoir des effets préventifs sur l’allergie. En effet, les enfants atopiques sont fortement colonisés par les Clostridia et E. coli alors que les enfants 43 sains sont préférentiellement colonisés par les bifidobactéries et les lactobacilles (200, 331-334). Cependant, il faut noter que les résultats de ces différentes études sont très hétérogènes, ce qui pourrait en partie être expliqué par des différences entre les techniques de caractérisation utilisées (cultures bactériennes ou techniques moléculaires) et les populations d’individus étudiées. Sur la base de ces observations, des études expérimentales (évaluation clinique et modèles animaux d’allergie) ont été conduites pour évaluer les propriétés préventives ou inhibitrices des bactéries lactiques sur l’allergie. Au niveau de la prévention de l’allergie, une première évaluation clinique portant sur l’administration de Lactobacillus rhamnosus GG à des mères (2 à 4 semaines avant leur accouchement) et à leurs enfants (jusqu’à l’âge de 6 mois) a démontré une réduction de 50% de l’incidence de l’eczéma à l’âge de 2 ans (335). La persistance dans le temps de cet effet préventif (à 4 et 7 ans) a pu être démontré par la suite par deux autres études portant sur les mêmes populations d’individus (202, 336). Un second essai clinique utilisant un mélange de bactéries lactiques et de galacto-oligosaccharides démontre aussi une réduction de l’eczéma atopique (traitement des mères 2 à 4 semaines avant l’accouchement, traitement des enfants pendant 6 mois et évaluation à l’âge de 2 ans) (337). Une troisième étude utilisant un traitement par Lactobacillus reuteri a pu mettre en évidence des effets bénéfiques de cette bactérie au niveau de l’incidence de l’eczéma atopique et de la sensibilisation des enfants de mères atopiques (traitements des mères 4 semaines jusqu’à l’accouchement, traitement des enfants jusqu’à 12 ans, évaluation à l’âge de 2 ans) (338). Cependant, des effets négatifs sont parfois aussi rapportés comme dans le cas d’une expérience portant sur l’administration de Lactobacillus acidophilus (augmentation du niveau de sensibilisation des enfants) (339). Au niveau des essais thérapeutiques, une première étude a démontré une amélioration de 50% de l’index SCORAD (Scoring Atopic Dermatitis, un score qui évalue la gravité de la dermatite atopique) et de l’allergie au lait chez des enfants nourris par une formule hydrolysée de protéines supplémentées en bactéries lactiques (Lactobacillus rhamnosus GG) (340). Une seconde expérience consacrée à des enfants présentant un niveau modéré de dermatite atopique (SCORAD de 16) a mis en évidence une résolution rapide et complète des symptômes chez les enfants nourris par un formule hydrolysée additionnée de Lactobacillus rhamnosus GG ou Bifidobacterium lactis (1 mois de traitement).Un troisième essai clinique a montré une amélioration de l’index SCORAD chez des enfants sensibilisés qui ont été traités pendant 4 semaines par Lactobacillus rhamnosus GG (341). Une quatrième étude montre une amélioration de l’eczéma chez 56% des patients traités par Lactobacillus rhamnosus GG et Lactoibacillus reuteri (à comparer aux 15% du groupe placebo) (342). Une dernière expérience démontre une amélioration de l’index SCORAD chez 95% des enfants traités par Lactobacillus fermentum (à comparer aux 63% du groupe placebo) (343). Même s’il existe aussi de nombreuses études ne démontrant aucun effet des lactobacilles sur l’allergie (344, 345), globalement les résultats précités tentent à démontrer que les lactobacilles représentent une voie de traitement prometteuse de l’allergie. Les effets bénéfiques qui ont pu être mis en évidence se limitent pour l’instant à des périodes de traitement prénatales/périnatales et se sont focalisés principalement à 44 l’eczéma atopique, une des manifestations les plus précoces de l’allergie. L’efficacité clinique de ces traitements pour d’autres types d’allergie reste à déterminer. Chez la souris, l’ingestion périnatale de Lactobacillus rhamnosus GG prévient l’apparition de l’eczéma atopique de manière analogue à ce qui peut être observé en essai clinique (346). Une deuxième étude démontre que l’administration périnatale de la même souche bactérienne (administrée uniquement aux mères porteuses) protège les souris nouveaux-nés de l’apparition symptomatique de deux caractéristiques de l’asthme allergique, l’inflammation péribronchique et l’hyperplasie des cellules caliciformes (modèle d’asthme expérimental à l’OVA) (347). Une troisième étude complète encore un peu plus la caractérisation de cette souche bactérienne en démontrant ses effets bénéfiques en administration néonatale (modèle d’asthme expérimental à l’OVA) : inhibition de l’hyperréactivité bronchique, de l’éosinophilie pulmonaire, chute des titres IgE sériques allergènes-spécifiques, diminution de la production de cytokines de Type Th2 au niveau de la réponse cellulaire (348). De manière intéressante, cette étude met aussi en évidence l’émergence d’une population CD4+ CD3+ sécrétant le TGF- dans les ganglions mésentériques après traitement par Lactobacillus rhamnosus GG. Mais les effets bénéfiques d’autres espèces de bactéries lactiques (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Bifidobacterium bifidum) ont aussi pu être mis en évidence (201, 349-353), la plupart des études portant sur la prévention de l’asthme allergique chez l’adulte. En particulier, l’administration orale de Lactobacillus reuteri mais pas de Lactobacillus salivarius prévient l’hyperréactivité bronchique liée à l’asthme allergique et réduit la production d’IL-5, d’IL-13, de TNF-, MIP-1 au niveau des poumons (201). Cette protection est dépendante de TLR9 et est associée à une augmentation de l’activité indolamine 2,3-dioxigénase (IDO) plasmique. Les qualités prophylactiques de différentes bactéries lactiques sont donc démontrées pour différentes formes expérimentales d’allergies. Toutefois, le potentiel thérapeutique des bactéries lactiques reste à appréhender. L’intérêt des bactéries lactiques repose aussi sur le fait qu’elles participent au développement du système immunitaire et à l’établissement de mécanismes de tolérance mucosale (cf. supra). En effet, le développement de ce type de mécanisme peut être induit chez les souris gnotobiotiques colonisées par la bactérie lactique Bifidobacterium infantis mais pas par d’autres types de bactéries comme Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus (354). Cette forme de tolérance joue un rôle important dans l’élaboration de la mémoire immunitaire et prévient le développement de l’allergie. 45 5. Les bactéries lactiques en tant que vecteur de délivrance d’antigènes a) Vecteurs d’expression Ces 20 dernières années une série de vecteurs d’expression a été développé pour la production de protéines recombinantes en bactéries lactiques (tableau 6). Ces plasmides bactériens sont construits sur la base d’éléments génétiques homologues de bactéries lactiques (plasmides endogènes ou ADN chromosomique de bactéries lactiques). Mais des séquences nucléotidiques hétérologues sont parfois incluses dans ces vecteurs d’expression pour leur permettre de se maintenir chez E. coli étant donné que cette bactérie est souvent utilisée comme hôte intermédiaire dans les étapes de constructions génétiques. La spécificité d’hôte des vecteurs d’expression pour bactéries lactiques est fonction du réplicon (éléments génétiques permettant la réplication) qu’ils utilisent. Ces séquences nucléotidiques particulières sont généralement dérivées des plasmides pWV01, pAM1, pSH71, pLP1et pLAB1000 (355-359). Historiquement, Lactococcus lactis a été la première bactérie lactique pour laquelle des systèmes d’expression ont été développés. Certains de ces systèmes d’expression ont été exportés par la suite chez d’autres bactéries lactiques. Des taux élevés de production de protéines hétérologues ont été obtenus chez L. lactis soit par l’utilisation de promoteurs inductibles soit par l’utilisation de promoteurs constitutifs. Au niveau des promoteurs constitutifs, un ensemble de 38 promoteurs dont les forces respectives diffèrent de 3-4 log a été obtenu (360). Ils ont été identifiés à l’aide de trois approches différentes : i) par des vecteurs de screening utilisant des gènes rapporteurs (chloramphénicol, galactosidase, -glucoronidase,…) ii) l’utilisation de promoteurs contrôlant des gènes dont l’expression constitutive était déjà référencée iii) le screening de promoteurs synthétiques générés à partir de la séquence consensus des promoteurs de L. lactis (variation des bases non conservées). Un exemple de systèmes d’expressions constitutifs est le système pTREX basé sur le promoteur P1 (isolé chez Lactococcus lactis) (361). L’expression des protéines TTFC (Tetanus Toxin Fragment C) et P28 atteint 1-3% des protéines cellulaires totales chez Lactococcus lactis avec ce système d’expression. L’expression de la TTFC par le même système d’expression a ensuite été détectée chez les lactobacilles Lb. gasseri, Lb. johnsonii, et Lb. paracasei. Il n’est donc pas toujours nécessaire de modifier les systèmes d’expression pour les adapter à chaque bactérie lactique. D’autre part, dans certains cas de figure l’expression constitutive peut ne pas être désirée. En particulier, si la production de protéine recombinante altère la croissance bactérienne, le système peut être rendu inutilisable. C’est pourquoi des systèmes d’expression inductibles ont été développés. 46 Le système NICE (Nisin-Controlled Expression, figure 20) est un système d’expression inductible particulièrement répandu (362). L’inducteur de ce système est la nisine, une bactériocine de la classe des lantibiotiques (bactériocines de classe I). Ces composés sont formés à partir de peptides modifiés et contiennent des acides aminés inhabituels : lanthionine, -methyllanthionine, déhydroalanine et déhydrobutyrine (362). L’activité bactéricide de la nisine repose sur la formation d’un complexe avec le lipide II, un composant bactérien impliqué dans la synthèse du peptidoglycan. La première conséquence de la formation de ce complexe est une inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne. Les complexes Lipide II-nisine s’assemblent ensuite pour former des pores au niveau de la membrane cytoplasmique. De petites molécules cytoplasmiques comme l’ATP diffusent alors à travers cette nouvelle voie de passage et se répandent dans le milieu extracellulaire. Leur perte entraîne la mort de la bactérie (363). Ces propriétés bactéricides sont exploitées notamment en industrie alimentaire pour la conservation des aliments (additif alimentaire E234). Le système d’expression NICE est dérivé du cluster génétique nisine qui a été isolé chez Lactococcus lactis. Il code pour un ensemble de protéines ou de peptides liés la production de nisine : le précurseur peptidique de la nisine, des protéines de maturation et de sécrétion de la nisine, des protéines formant un système d’autorégulation sensible à la nisine et des protéines conférant à la bactérie une protection contre les effets bactéricides de la nisine (figure 20 B) (364). La nisine contrôle donc l’expression de son propre cluster génétique. En fait, elle agit comme une phérormone en induisant sa propre sécrétion chez les bactéries de l’espèce Lactococcus lactis (du moins les souches qui portent le cluster génétique nisine). Comme ce mécanisme de régulation répond à la densité de la population bactérienne il est qualifié de « Quorum sensing ». Le système d’expression NICE utilise deux composants du cluster génétique nisine : l’opéron NisRK qui code pour les protéines NisR et NisK et le promoteur PnisA (360). La protéine NisR est une protéine membranaire de type histidine kinase qui reconnaît spécifiquement la nisine. Cette liaison récepteur-ligand provoque la phosphorylation de NisR qui à son tour active l’activateur transcriptionel NisK par transfert de son groupement phosphate. NisK induit ensuite l’expression du gène d’intérêt placé sous la dépendance du promoteur PNisA. Ensemble, les protéines NisR et NisK forment un système à deux composants qui régulent l’expression du cluster génétique nisine à partir des promoteurs PNisA et PNisF (le promoteur PnisRK n’est pas affecté). Le système NICE a tout d’abord été développé pour Lactococcus lactis. Les gènes NisR et NisK ont été insérés dans le chromosome de Lactococcus lactis subsp. cremonis MG1363 (cette souche ne contient pas le cluster génétique nisine à l’état sauvage). L’intégration a été réalisée au niveau du gène pepN, générant la souche NZ9000 (362). Le système complet comprend le gène d’intérêt sous la dépendance du promoteur PNisA intégrés dans un plasmide (série pNZ) ou dans le chromosome bactérien. L’expression de la protéine recombinante est induite par l’ajout de nisine dans le milieu de culture à un niveau inférieur à la dose inhibitrice. Ce système permet d’atteindre des taux d’expression remarquablement élevés allant jusqu’à 50% du contenu en protéines totales (dans le cas 47 de l’aminopeptidase N) (365). En utilisant un double système de plasmide (pNZ9520/30 et un des vecteurs d’expression basé sur le promoteur PNisA) la fonctionnalité du système NICE a pu être démontrée chez d’autres souches de bactéries lactiques (Leuconostoc lactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus zooepidemicus, Enterococcus faecalis et B. subtilis) (362). Chez Lactobacillus plantarum et Lactobacillus gasseri, les gènes NisR et NisK ont été introduits en simple copie dans le chromosome bactérien avec pour conséquence une augmentation de la vitesse de croissance bactérienne et une réduction de la fuite d’expression en absence d’inducteur (366, 367). Comme les mécanismes de régulation de la production de bactériocines à deux composants sont très fréquents chez les bactéries Gram-positives, d’autres systèmes d’expression analogues à celui de la nisine ont été développés. En particulier, un système SURE (Subtilin Regulated gene Expression) a été développé pour B. subtilis (368) et un système d’expression inductible par la sakacin P a été développé pour Lactobacillus sakei et Lactobacillus plantarum (369). Mais d’autres systèmes d’expression inductibles sont aussi utilisés (360, 370). Le premier de ces systèmes utilise le gène de la T7 RNA polymérase (phage T7 d’E. coli) sous le contrôle du promoteur du gène lacA de lactococcus lactis (360). L’expression de ce système d’expression est induite par la présence de lactose dans le milieu de culture. Par contre, en présence de glucose, le produit du gène lacR réprime la transcription du promoteur PlacA. Ce système d’expression est donc comparable au système T7 polymérase développé pour E. coli. Un second système, dit « explosif », repose sur l’emploi du bactériophage 31 et plus particulièrement d’un de ses promoteurs, P8625 (371). L’infection par le phage 31 induit l’activation du promoteur P8625 utilisé par le système d’expression. La lyse de la bactérie provoquée par le phage provoque le relargage des protéines recombinantes dans le milieu extracellulaire. Un troisième système d’expression inductible est basé sur l’utilisation du gène P2 du bactériophage rlt (372). Le répresseur de ce gène Rro a été modifié dans ce système d’expression (variant Rro 12) pour le rendre thermosensible. Une augmentation de la température de 24°C à 42°C (température non permissive) induit l’expression de la protéine d’intérêt. Un quatrième système se base sur le promoteur Pgad impliqué dans des réponses au stress cellulaire (373). Il est activé par des variations de pH, par le glutamate et par les ions chlorure. La production de protéines recombinante est induite lorsque la concentration en NaCl est portée à à 0,5 M. b) Localisation de l’antigène Un paramètre à prendre en considération dans l’élaboration de bactéries recombinantes à destinée vaccinale est le choix du compartiment cellulaire vers lequel la protéine recombinante doit être ciblée. Trois possibilités sont offertes : la production cytoplasmique, la sécrétion ou l’ancrage de la protéine au niveau de la paroi bactérienne (370). La voie cytoplasmique est la plus simple à obtenir puisqu’elle est la voie suivie par défaut (en l’absence de peptide signal). 48 Pour que la protéine d’intérêt soit sécrétée, elle doit comporter un peptide signal de sécrétion à son extrémité amino-terminale. Chez les bactéries, la majorité des protéines sécrétées est prise en charge par la machinerie Sec (374). Le peptide signal a pour effet de retarder le reploiement de la protéine à laquelle il est associé. Des chaperonines Sec-spécifiques stabilisent cet état conformationnel. De manière générale, les peptides signaux de sécrétion sont peu conservés. Cependant, ils possèdent tous une extrémité amino-terminale chargée positivement, un segment hydrophobe et une extrémité carboxyterminale neutre ou chargée négativement. Le peptide signal le plus utilisé est celui de la protéine Usp45 de Lactococcus lactis qui est abondamment sécrétée par cette bactérie dans le milieu extracellulaire (370). La séquence signal de la protéine PrtP qui est ancrée à la paroi de Lactococcus lactis est plus rarement employée. Des voies de sécrétion Secindépendantes, utilisant des transporteurs ABC spécifiques ont également été utilisées pour l’export de bactériocines (375). La fixation des protéines recombinantes à la paroi bactérienne peut être obtenue en fusionnant à leur extrémité aminoterminale une séquence signal de sécrétion et une séquence signal d’ancrage. Le procédé d’ancrage le plus fréquent est basé sur la sortase (376), une protéine qui reconnaît spécifiquement des séquences signal composées d’un motif LPXTG suivi d’un fragment transmembranaire et d’une extrémité carboxy-terminale chargée. La sortase clive les motifs LPXTG entre les résidus T et G et lie la thréonine libérée au pont interpeptidique du peptidoglycan par transpeptidation. Les motifs LPXTG de l’extrémité carboxy-terminale de la protéine PrtP de lactococcus lactis et de la protéine A de Staphylococcus aureus ont été utilisés avec succès pour l’ancrage de protéines hétérologues comme la streptavidine. De même, l’ancre carboxy-terminale de l’autolysine AcmA de lactococcus lactis a aussi été utilisée avec succès pour l’ancrage de protéines bien que son mécanisme de fixation au peptidoglycan soit inconnu (indépendant de la sortase) (377). Les modes d’expression sous forme cytoplasmique et ancrée ont été comparés dans le cas de la production de la TTFC par L. lactis (378, 379). Dans ces études, il apparaît que l’ancrage de la TTFC à la surface des bactéries lactiques est avantageux pour l’immunisation par voie systémique mais pas par voie mucosale. A l’opposé, la production intracellulaire est avantageuse pour l’immunisation par voie mucosale mais pas pour l’immunisation par voie systémique. Par conséquent, la localisation de l’antigène influence clairement l’immunogénicité de la bactérie recombinante. D’autres études ont rapporté que la sécrétion de protéines ou leur expression en surface pouvait améliorer les effets prophylactiques des souches recombinantes (380). Mais comme les modes d’expression cytoplasmique, sécrétés ou ancrés ne présentent jamais des taux de production identiques les effets observés pourraient être dus à la dose de l’antigène plutôt qu’à sa localisation. 49 L’allergie est une des maladies chroniques les plus répandues. L’expression de cette pathologie est fonction de facteurs génétiques qui assurent un terrain propice à son développement et des facteurs environnementaux déclencheurs comme la pollution, le tabagisme ou certaines infections. A l’inverse, certains microorganismes présentent des propriétés immunomodulatrices capables de prévenir l’allergie. C’est pourquoi les nouveaux standards d’hygiène adoptés par les sociétés industrialisées sont soupçonnés de favoriser le développement de l’allergie (« hypothèse de l’hygiène »). Cette absence de stimulation microbienne serait même une des causes principales de l’émergence des maladies atopiques observée ces 20 dernières années. Les bactéries lactiques sont des bactéries non-pathogènes et non-invasives qui font partie de la flore commensale. Les effets anti-allergiques de ces bactéries sont suggérés par des études épidémiologiques montrant une nette association entre l’expression de l’allergie et un défaut de colonisation de la flore intestinale par les lactobacilles et les bifidobactéries. De plus, les effets antiallergiques de certaines souches de bactéries lactiques ont été démontrés dans des modèles expérimentaux d’asthme et dans des essais cliniques portant sur la dermatite atopique. Dans le cadre de cette thèse, nous tenterons d’appréhender les mécanismes immunomodulateurs de la bactérie lactique Lactobacillus plantarum NCIMB8826. Pour ce faire, nous caractériserons les effets de cette bactérie sur la cellule dendritique, vu le rôle crucial que joue cette cellule dans la polarisation TH1, TH2, Treg et TH17 des réponses immunitaires. Concrètement, nous analyserons les changements phénotypiques provoqués par Lactobacillus plantarum NCIMB8826 et les profils de sécrétion de cytokines induits par cette bactérie. A cette occasion, nous aurons l’opportunité d’examiner si Lactobacillus plantarum NCIMB8826 peut potentiellement orienter la réponse immune vers un profil protecteur de l’allergie. Nous tenterons également de corréler l’activation des cellules dendritiques par L. plantarum à la stimulation des voies de signalisation TLR. En second lieu, les propriétés immunomodulatrices des bactéries lactiques étant peu exploitées pour la prévention de l’allergie aux acariens, nous examinerons le potentiel vaccinal d’une coadministration intranasale de L. plantarum avec l’allergène majeur d’acarien Der p 1 dans un modèle murin de cette forme d’allergie. Si les propriétés adjuvantes de L. plantarum s’avèrent bénéfiques, la construction d’une souche recombinante de L. plantarum produisant Der p 1 sera envisagée. Les effets prophylactiques de ce vecteur de délivrance d’antigène seront alors évalués. Pour donner quelques perspectives à nos futurs résultats le potentiel thérapeutique de Lactobacillus plantarum NCIMB8826 sera évalué sur splénocytes de souris sensibilisées à Der p 1. De plus, nous examinerons aussi les effets immunomodulateurs de cette bactérie lactique sur cellules dendritiques humaines et lymphocytes T autologues de manière à vérifier si des résultats similaires peuvent être obtenus chez l’homme. 50 51 Introduction à l’article I L’allergie est une pathologie multifactorielle dont l’incidence est fortement influencée par des facteurs environnementaux tels que la pollution, certaines infections ou l’exposition à certains microorganismes non-pathogènes. Ces dix dernières années la prévalence de cette pathologie a considérablement augmenté dans les pays industrialisés, un phénomène qui serait attribuable à un manque de stimulation microbienne lié à de nouveaux standards d’hygiène (hypothèse de l’hygiène). Cette absence de stimulation d’origine microbienne empêcherait la mise en place de mécanismes immunitaires protecteurs de l’allergie. Des études épidémiologiques analysant la composition de la flore intestinale, des essais cliniques consacrés à la dermatite atopique et des modèles expérimentaux d’asthme allergique suggèrent que les propriétés immunomodulatrices des bactéries lactiques, des bactéries commensales non-pathogènes et non-invasives, puissent avoir un rôle préventif sur l’allergie. Cependant, leur potentiel préventif sur les réponses induites par les aéroallergènes reste mal exploité. De plus, les mécanismes empruntés par ces bactéries pour moduler l’allergie sont peu caractérisés. Pour tester l’opportunité d’utiliser les bactéries lactiques dans la formulation de’un traitment prophylactiques contre l’allergie aux acariens nous évaluerons, dans cette première étude, la capacité d’une bactérie lactique modèle (Lactobacillus plantarum NCIMB8826) à prévenir la réponse allergique induite par Der p 1, un aéroallergène majeur de l’acarien Dermatophagoides pteronyssinus. A cette fin, les effets préventifs d’une coadministration L. plantarum + Der p 1 sera évalué dans un modèle de sensibilisation à Der p 1 de manière à vérifier le potentiel prophylactique de cette association. Les effets de ce traitement seront comparés à celui de l’allergène seul pour analyser les propriétés adjuvantes de L. plantarum sur la réponse Der p 1-spécifique. Des souris seront donc traitées par Der p 1 seul, par L. plantarum seul comme contrôle ou par ces deux traitements simultanément (coadministration) avant d’être sensibilisées à Der p 1 et ensuite exposées à des aérosols d’extraits totaux d’allergènes d’acariens. La voie d’administration intranasale étant un mode d’immunisation qui allie efficacité et innocuité, nous l’avons adoptée pour la phase de prétraitement. La réponse immune des souris sera suivie par l’analyse de la réponse humorale et de la réponse cellulaire spécifique (production de cytokines par les cellules spléniques restimulées par Der p 1) de même que par la caractérisation des infiltrats cellulaires présents dans les lavages bronchoalvéolaires. La deuxième partie de cet article tentera d’appréhender le potentiel thérapeutique de L. plantarum en analysant ses propriétés immunomodulatrices sur splénocytes de souris sensibilisées à Der p 1. Un dosage des principales cytokines TH2, TH1 et régulatrices nous indiquera si L. plantarum est capable de moduler une réponse allergique préétablie. 52 La troisième partie de ce travail investiguera les voies d’activations empruntées par L. plantarum pour moduler l’activité de la cellule dendritique, cette cellule jouant un rôle déterminant dans la polarisation de la réponse immune. Les cytokines conditionnant la polarisation de la réponse immune seront dosées de manière à caractériser le profil immunitaire induit par L. plantarum. Nous examinerons également l’implication des voies d’activations TLR2-, TLR4- et MyD88-dépendantes, étant donné leur importance dans le déclenchement de l’immunité innée anti-microbienne. 53 Conclusions de l’article I Dans cette première étude, nous avons examiné si les effets immunomodulateurs d’une bactérie lactique modèle, L. plantarum NCIMB8826, pouvaient être exploités à des fins prophylactiques dans le cadre du traitement de l’allergie aux acariens. L’évaluation des effets prophylactiques d’une coadministration par L. plantarum NCIMB8826 + Der p 1 dans un modèle murin d’allergie à Der p 1 nous a permis de clairement démontrer les effets bénéfiques de cette formulation vaccinale. En effet, les paramètres principaux de la réaction allergique ont nettement été atténués. Au niveau de la réponse anticorps, on constate une nette baisse de la production d’IgE spécifiques anti-Der p 1 (les anticorps anaphylactiques associés à l’allergie) et une réorientation de la réponse IgG vers un profil TH1. L’effet bénéfique de la coadministration par L. plantarum NCIMB8826 + Der p 1 est aussi perceptible au niveau de la réponse cellulaire où l’émergence d’un profil TH1 est observée et au niveau de l’inflammation pulmonaire où une réduction des infiltrats d’éosinophiles a été détectée. Ensemble, ces données indiquent que les propriétés adjuvantes de la bactérie lactique L. plantarum NCIMB8826 contribuent de manière prononcée à prévenir la réponse allergique Der p 1-spécifique. En considérant le fait que Der p 1 soit un des allergènes d’acariens les plus immunodominants, le recour à ce type de traitement semble être une approche prometteuse pour le traitement prophylactique de l’allergie aux acariens. Les profils de cytokine induits par restimulation de splénocytes de souris sensibilisées par Der p 1 + L. plantarum nous indiquent que cette bactérie a un réel potentiel thérapeutique. En effet, la réponse TH2 induite par restimulation des splénocytes de souris sensibilisées par Der p 1 en l’absence de L. plantarum est caractérisée par une forte production d’IL-5 (cytokine TH2) et une absence de production d’IL-10 (cytokine TH2/régulatrice), d’IFN- (cytokine TH1) et d’IL-12 (cytokine TH1). A l’opposé lorsque ces cellules sont restimulées en présence de L. plantarum la réponse induite se caractérise par une très faible production d’IL-5, une forte production d’IFN- et d’IL-10 et une légère production d’IL-12. Ces données indiquent donc que L. plantarum a la capacité de réorienter une réponse TH2 préétablie vers un profil TH1 ou régulateur. Les manipulations conduites sur cellules dendritiques murines nous montrent que l’activité de ces cellules présentatrices d’antigène professionnelles est fortement modulée par L. plantarum. En effet, la stimulation par cette bactérie provoque la libération d’une forte quantité d’IL-12 et d’une légère production d’IL-10, un profil qui favorise le développement d’un profil TH1. Par l’utilisation de souris sauvages, TLR2 -/-, TLR4 -/- et MyD88 -/- nous montrons que cette réponse cytokinique dépend de l’activation de TLR2 et de la protéine adaptatrice MyD88 dont dépend la voie d’activation TLR2dépendante mais pas de TLR4. Ces données suggèrent donc que certains composants de L. plantarum sont des agonistes de TLR2 responsables tout ou en partie des caractéristiques immunomodulatrices de L. plantarum. 54 Introduction à l’article II Dans ce deuxième article, nous poursuivrons la caractérisation des propriétés immunomodulatrices de L. plantarum. Pour ce faire, des cellules HEK recombinantes exprimant TLR2 et transfectées par d’un système rapporteur NF-B seront incubées avec la souche L. plantarum NCIMB8826. Par cette technique expérimentale, nous examinerons donc si le fait d’exprimer TLR2 rend la cellule réactive à L. plantarum et si ce mécanisme est suffisant à l’induction de la voie NF-Bdépendante, une voie de signalisation intracellulaire essentielle à l’immunité bactérienne. Nous examinerons également si TLR9 contribue à la reconnaissance de cette souche bactérienne par l’utilisation de souris TLR9 -/- . L’acide lipotéichoïque de L. plantarum et son ADN génomique pouvant potentiellement être reconnus par TLR2 et TLR9, respectivement, nous déterminerons si ces composants de L. plantarum activent effectivement la cellule dendritique d’une manière TLR2 et TLR9 dépendante, respectivement. La stimulation des TLRs entraînant l’activation de voies de signalisations intracellulaires comme la voie NF-B ou les MAPKs, nous examinerons si ces voies de signalisations sont nécessaires à l’établissement de la réponse cytokinique par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de ces voies d’activation. En second lieu, nous élaborerons une bactérie lactique recombinante produisant Der p 1 dans le but de l’utiliser comme vecteur vivant de délivrance d’antigène. Comme nous avons montré dans l’article I que les propriétés immunomodulatrices de L. plantarum NCIMB8826 ont un effet protecteur sur l’allergie et comme des systèmes d’expression de protéines recombinantes sont disponibles pour cette souche bactérienne, une bactérie recombinante sera dérivée de L. plantarum NCIMB8826. Ensuite, nous analyserons si cette bactérie recombinante peut constituer un traitement prophylactique efficace contre l’allergie aux acariens en testant les effets bénéfiques de cette souche dans notre modèle murin d’allergie à Der p 1. 55 Conclusions de l’article II Dans ce deuxième article, nous avons identifié différents mécanismes immunomodulateurs de L. plantarum. Nos premiers résultats obtenus sur BMDC TLR2-/- et sur cellules HEK recombinantes exprimant constitutivement TLR2 confirment la capacité de L. plantarum à stimuler TLR2. De plus, l’utilisation d’un système rapporteur dépendant de NK-B nous a permis de mettre en évidence l’implication de la voie NF-B dans l’activation TLR2-dépendante induite par L. plantarum. Nous montrons également par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques que la voie NF-B contribue fortement au développement de la réponse cytokinique sollicitée par L. plantarum. L’emploi d’inhibiteurs de MAPKs montres que JNK et p38 participent aussi à la réponse cytokinique. Mais une réduction moins prononcée est observée pour l’inhibiteur spécifique de MEK 1/2 suggérant que ERK 1/2, la MAPK activée par MEK 1/2, ait peu d’impact sur la production de cytokines induite par L. plantarum. La forte chute de production de cytokines observée pour les souris TLR9-/- nous indique que ce TLR est également stimulé par L. plantarum et que la production de cytokines induites par cette bactérie est fortement dépendante de cette voie d’activation. Les profils de sécrétion induits par une souche mutante déficiente pour la déalanylation des acides lipotéichoïques étant bien inférieurs à ceux de la bactérie L. plantarum sauvage, la composition des acides lipotéichoïques de L. plantarum influence clairement les propriétés immunomodulatrices de cette bactérie. Nous montrons également par l’utilisation de cellules HEK exprimant constitutivement TLR2 que ce changement structurel réduit partiellement la capacité de L. plantarum à stimuler TLR2. Enfin, nous avons démontré que l’ADN génomique de L. plantarum est capable d’activer la cellule dendritique par un processus TLR9dépendant.. Les effets immunomodulateurs de L. plantarum identifiés dans l’article I et II ayant potentiellement une action antiallergique et vu les effets bénéfiques de la coadministration intranasale de L. plantarum + Der p 1 sur l’allergie aux acariens, nous avons entrepris l’élaboration d’une bactérie recombinante dérivée de L. plantarum et produisant Der p 1. L’antigène recombinant que nous avons réussi à produire correspond à une protéine fusion entre la Maltose Binding Protein de E. coli et ProDer p 1, la présence de ce partenaire de fusion étant indispensable à la production de ProDer p 1. Des expériences menées à l’aide de cellule dendritique montrent que la bactérie recombinante conserve les propriétés immunomodulatrices de la bactérie sauvage comme en témoigne les profils de cytokines (IL-12 p40, IL-12 p70, TNF-, IL-10) et les taux d’expression des marqueurs de surfaces de la DC observés après stimulation de la DC par ces deux souches bactériennes. Les effets prophylactique de cette bactérie lactique recombinante sont visibles au niveau de la réponse humorale où le traitement par cette bactérie prévient le développement de la production d’anticorps IgE Der p 1-spécifiques et stimule la production d’anticorps IgG2a Der p 1-spécifiques, ces effets étant favorisés par l’expression de l’antigène recombinant. Les bénéfices de ce prétraitement ont aussi été démontrés au niveau de la réponse cellulaire où l’on observe une réduction drastique de 56 la production d’IL-5 des cellules spléniques et des cellules ganglionnaires restimulées par ProDer p 1. Cet effet bénéfique n’ayant pas été obtenu pour la coadministration par L. plantarum + Der p 1 il semblerait que les propriétés prophylactiques de la bactérie recombinante soient supérieures à celle de la coadministration. Nos données expérimentales montrent aussi que le prétraitement par la bactérie lactique recombinante atténue l’inflammation pulmonaire comme en atteste la réduction des taux d’infiltration d’éosinophiles au niveau des poumons, un effet en partie attribuable aux propriétés adjuvantes de L. plantarum NCIMB8826. Ces différents effets bénéfiques démontrent que la bactérie lactique recombinante décrite dans cet article constitue un traitement prophylactique prometteur contre l’allergie aux acariens. 57 C. Résultats complémentaires Récepteurs reconnaissant Lactobacillus plantarum Comme démontré à la figure 1C et 1D de l’article II, l’activation de la cellule dendritique par L. plantarum dépend du récepteur TLR2 puisque les propriétés d’activation de cette bactérie sont fortement diminuées chez les souris déficientes pour ce récepteur. Dans le cas de L. plantarum, la voie TLR2 est donc nécessaire à la pleine activation de la DC. De plus, nous avons démontré par l’emploi de cellules HEKs recombinantes que l’expression de TLR2 seul rend la cellule HEK susceptible à l’activation par L. plantarum (figure 1E et 1F, article II), confirmant le fait que la voie TLR2 est activée par L. plantarum et démontrant qu’elle est suffisante à sa reconnaissance. Cependant, TLR2 semble peu efficacement activé par L. plantarum au niveau de la cellule HEK. En effet, à quantités égales (L. plantarum, 10×106 CFU /mL ; Pam2CysSK4, 100 ng/mL) le taux d’activation induit par L. plantarum sur la cellule HEK exprimant TLR2 est plus de 20 fois inférieur à celui du Pam2CysSK4 (agoniste TLR2) alors que sur BMDCs le taux d’activation de L. plantarum et plus de 7 fois supérieur à celui du ligand Pam2CysSK4 (données non montrées). C’est pourquoi, l’influence de récepteurs auxiliaires pouvant potentiellement faciliter la reconnaissance de L. plantarum au niveau de la DC a été évalué. La contribution des récepteurs scavenger CD14 et CD36 a d’abord été analysée (figure 21). En effet, précédant leur activation, les TLRs s’associent avec des molécules résidant dans les radeaux lipidiques comme CD14 et CD36(381). CD36, en particulier, interagit avec l’acide lipotéichoïque (un agoniste de TLR2) de Staphylococcus aureus, facilitant la phagocytose de cette bactérie(382). CD14, quant à lui, lie le LPS et l’acide lipotéichoïque(383). Deux approches ont été suivies. La première approche à consisté a analyser le pouvoir de capture de la cellule dendritique en incubant une suspension cellulaire de DC avec des bactéries marquées par un fluorochrome (figure 21 A). Nos résultats démontrent clairement qu’une déficience en CD14 ou CD36 affecte significativement le potentiel de liaison de L. plantarum à la cellule dendritique (des différences significatives sont observées à 30, 120 et 240 minutes). Dans une seconde série d’expériences nous nous sommes intéressés au rôle qu’occupent ces récepteurs dans le processus d’activation de la DC (figures 21 B et 20 C). Les données recueillies sur BMDC indiquent que CD14 participe à l’activation cellulaire induite par L. plantarum (figure B, P < 0,001 ; figure C, P < 0,001). Les résultats obtenus sur cellules HEK exprimant constitutivement TLR2 confirment la forte contribution de CD14 (figure 21 D, P < 0,01 ; figure 21 E, P < 0,001) et démontrent que CD14 participe à l’activation de la voie NF-B. Aucune contribution de CD36 n’a pu être mise en évidence au niveau de l’activation cellulaire. Ensuite, nous avons examiné le rôle des récepteurs TLR1 et TLR6. En effet, le récepteur TLR2 existe sous différentes formes au niveau de la membrane cellulaire : sous la forme d’homodimères (TLR2-TLR2) ou sous la forme d’hétérodimères avec TLR1 (TLR2-TLR1) ou TLR6 58 (TLR2-TLR6)(302). La formation de ces hétérodimères permet au TLR2 d’élargir la gamme de composés qu’il est susceptible de reconnaître. Certains triacylglycérides comme le Pam2Oct2C-SK4 (ligand synthétique) et certains diacylglycérides comme le MALP2 (lipoprotéine isolée de Mycoplasma fermentans) sont spécifiquement reconnus par ces hétérodimères. A l’opposé, d’autres ligands de TLR2 comme le Pam2CysSK4 (ligand synthétique) ne sont reconnus que par la forme homodimérique de TLR2. Dès lors, la participation de TLR1 et de TLR6 au processus d’activation induit par L. plantarum a été évaluée. Cette question a été abordée par l’utilisation de cellules HEK recombinantes exprimant constitutivement TLR2 et transfectées par des plasmides exprimant TLR1, TLR6 ou TLR2 (comme contrôle). Par cette technique, l’expression simultanée de ces différents TLRs provoque leur colocalisation au niveau de la membrane cellulaire(384), rendant possible la formation d’hétérodimères. Nos résultats (figure 22) montrent que ni TLR1, ni TLR6 ne contribuent positivement au processus d’activation induit par L. plantarum. Au contraire, la coexpression de TLR6 diminue la réponse de la cellule HEK (P < 0,001). L’activation de la voie TLR2 induite par L. plantarum reposerait donc sur la formation d’homodimères TLR2-TLR2 et non pas d’hétérodimères (TLR2TLR1 ou TLR2/TLR6). MAPKs activées par L. plantarum Nous avons montré que la réponse de la cellule dendritique induite par L. plantarum dépend de l’activation des MAPKs ERK1/2, p38 et JNK (figure 2, article II). En effet, une chute de la production de cytokines peut être provoquée par l’usage d’inhibiteurs spécifiques de ces MAPKs. De même, l’activation de la voie NF-B a été mise en évidence par l’emploi d’un inhibiteur du protéasome, d’un inhibiteur de phosphorylation d’IkB- (une protéine qui en empêchant l’importation nucléaire de NF-B joue le rôle d’inhibiteur de cette voie d’activation) et par l’utilisation d’un système rapporteur NF-B-luciférase. Cependant, il nous manquait une analyse directe de l’activation de des MAPKs ERK1/2, p38 et JNK. Ce point est abordé par la manipulation suivante (figure 23) où l’activation de ces MAPKs a été analysée à l’aide d’anticorps dirigés contre leur forme phosphorylées (leur forme activée). Nos résultats montrent bien une activation des trois MAPKs. La phosphorylation de ERK1/2 est maximale à 10 minutes d’incubation. L’activation de p38 est tardive et n’est détectée qu’à 120 minutes. Une très légère activation de JNK est détectée à 10 minutes. L’activation de ces MAPKs est donc confirmée et leur cinétique d’activation déterminée. On peut remarquer que cette cinétique d’activation est singulièrement différente de celle du LPS, un composant immunostimulateur majeur des bactéries Gram-négatives utilisés ici comme contrôle d’activation de ces MAPKs. Nous envisageons à présent de confirmer l’activation de la voie NK-B par gel retard. Nous incuberons donc les extraits nucléraires des BMDCs stimulées par L. plantarum avec sondes 59 nucléotidiques radioactives contenant le site B. Nous examinerons ensuite si NF-B se lie aux sondes marquées. Elaboration d’une bactérie produisant une forme recombinante de Der p 1 Comme mentionné dans l’article II, une souche recombinante produisant MBP-ProDer p 1 a été obtenue. Cette section décrit les étapes qui ont conduit à l’élaboration et à l’obtention de cette souche. Ce travail s’est basé sur des systèmes d’expression adaptés à la production de protéines recombinantes en bactérie lactique (figure 24). Ces plasmides comportent les éléments réplicatifs (réplicon pWV01 ou pLAB1000) et les marqueurs de résistance (ermB ou cat) nécessaires à leur maintient en bactéries lactiques. Les systèmes d’expression utilisés sont soit basés sur le promoteur PLdh (isolé chez L. plantarum) qui est de type constitutif soit basé sur le promoteur PNisA (isolé chez Lactococcus Lactis) qui est de type inductible. Les plasmides pNZ8040 et pGIT032, en particulier, permettent des fusions amino-terminales avec l’aminopeptidase N de L. lactis ou avec la lactate déshydrogénase de L. plantarum. Des expériences conduites précédemment au laboratoire d’Allergologie Expérimentale ont démontré qu’il était particulièrement difficile de produire Der p 1 en bactérie (production intracellulaire)(385). C’est pourquoi nous avons décidé de ne pas nous limiter au simple clonage de Der p 1 mais de diversifier les formes recombinantes à tester. Deux formes recombinantes supplémentaires ont été choisies : ProDer p 1 et une version tronquée de Der p 1 allant des acides aminés 1 à 166. ProDer p 1 à l’avantage d’être enzymatiquement inactif. Cette propriété permettrait de contourner d’éventuels effets cytotoxiques liés à l’activité cystéine protéinase de Der p 1. De plus, la proséquence de ProDer p 1 participe au reploiement conformationnel de Der p 1 et la bonne conformation de l’allergène est désirée pour susciter une réponse immune optimale. Der p 1 tronqué (acides aminés 1-166), quant à lui, est une forme réduite de Der p 1 qui conserve les épitopes T immunodominants identifiés pour un haplotype H-2b (acides aminés 30-53, 75-98 et 108-134)(386). Cette forme recombinante permettrait donc de susciter une réponse T Der p 1-spécifique. Les constructions obtenues (ProDer p 1, Der p 1 entier, Der p 1 tronqué ; figure 25) ont été testées sans succès. Comme aucune expression de Der p 1 n’avait été mise en évidence (figure 26), une seconde série de constructions génétiques a été envisagée. Ces constructions sont basées sur des protéines de fusion entre Der p 1 ou ProDer p 1 et des protéines homologues (lactate déshydrogénase de L. plantarum, Ldh ; aminopeptidase N de lactococcus lactis, pepN) ou hétérologues (Maltose Binding Protein de E. coli, MBP) de bactéries lactiques (figure 24). Les vecteurs d’expression pGIT032 (codant pour la Ldh), pNZ8040 (codant pour pepN) et pNZ8037 ont été choisis à cet effet, les rendements d’expression référencés pour ces vecteurs étant particulièrement élevés. Cependant, parmi les différentes constructions obtenues (figure 25), une seule s’est révélée être fonctionnelle 60 (figure 26). Il s’agit de la construction codant pour MBP-ProDer p 1 et utilisant le promoteur PNisA inductible à la nisine. Il apparaît donc qu’un partenaire de fusion est indispensable à la production de Der p 1 en bactérie lactique. L’analyse par Western Blot de la production de MBP-ProDer p 1 indique que cette protéine est produite à la taille attendue (bande immunoréactive à 73 kDa). Un produit de dégradation conservant un pouvoir de liaison aux anticorps ProDer p 1-spécifiques est aussi détecté. Comme le rendement de production des bactéries recombinantes influence fortement leur potentiel vaccinal (314), nous avons entrepris d’optimiser le taux de production des bactéries recombinantes obtenues (figure 27). De notre analyse, il ressort que les conditions optimales de production sont atteintes lorsque la température d’incubation est de 37°C, la culture inoculée à une DO600nm de 0,1 (la plus faible DO testée), la production induite par 50 ng/mL de nisine directement après inoculation et en incubant la culture pendant un temps de 3 heures (le plus faible temps testé). Ensuite, la solubilité de la protéine recombinante à été analysée (figure 28) par fractionnement des constituants cellulaires. Nos données indiquent que la protéine est produite à la fois sous forme soluble et à la fois sous forme insoluble (forme dominante). La stabilité de la souche L. plantarum[pMEC240] a été analysée par la suite. En l’absence d’antibiotique, une perte du plasmide a été mise en évidence. En effet, seulement 0,36 % des bactéries conservaient le plasmide après 10 passages de la culture à une dilution 1/50. Par contre, la production de MBP-ProDer p 1 peut être induite de façon reproductible comme en témoigne l’analyse des préparations administrées dans le modèle d’allergie à Der p 1 (figure 34). Une estimation par Western blot du rendement de production de la bactéries L. plantarum[pMEC240] (figure 29) nous indique que MBP-ProDer p 1 est produit à hauteur de 10 ± 2,5 µg pour 109 CFU de bactéries, soit de l’ordre de 20% du contenu total en protéine (dosage par la méthode de Bradford), ce qui est considérable. 61 Immunogénicité de la bactérie lactique recombinante produisant MBP-ProDer p 1 L’immunogénicité de la bactérie recombinante L. plantarum[pMEC240] a été testée (figure 29). Il s’agit par cette expérience d’évaluer la capacité de cette souche à produire une réponse allergène-spécifique en conditions de polarisation Th2. A cet effet, les préparations de bactéries et les différents contrôles ont été adjuventés d’alum. Dans ces conditions expérimentales, la bactérie L. plantarum[pMEC240] intacte ne produit aucune réponse ProDer p 1-spécifique détectable (titre < 20 UAE, figure 30 A et 30 D). Par contre, des anticorps dirigés contre la forme entière de la protéine recombinante (MBP-ProDer p 1) ont été produits (figure 30 C), un résultat qui peut être attribuable au développement d’une réponse humorale MBP-spécifique (figure 30 B). Contrastant avec les résultats obtenus pour la souche recombinante intacte, une réponse humorale ProDer p 1-spécifique a été obtenue pour la bactérie recombinante lysée (figure 30 A). Une réponse humorale ProDer p 1spécifique est également détectée dans le cas du traitement combinant bactérie contrôle (non productrice) et antigène purifié (figure 30 A). La réponse humorale s’accompagne, dans ce dernier cas, d’une faible réponse cellulaire (figure 30 D). La bactérie recombinante présente donc de faibles capacités immunogènes. Ces propriétés sont propres à ProDer p 1, l’antigène recombinant testé, et liées au fait que l’antigène produit soit compartimenté au niveau intracellulaire. Prévention de l’allergie par la bactérie lactique recombinante produisant MBP-ProDer p 1 : effets sur l’hyperréactivité bronchique Comme le démontrent les résultats publiés dans l’article II, la bactérie lactique recombinante Lactobacillus plantarum[pMEC240] a des effets préventifs sur l’allergie aux acariens. Les qualités prophylactiques de cette bactérie ont été caractérisées au niveau de la réponse humorale (production d’anticorps spécifiques), de la réponse cellulaire (production de cytokines par les cellules spléniques et par les cellules ganglionaires) et de l’inflammation pulmonaire (infiltrats cellulaires). Ces données ont été complétées par une mesure de la fonction respiratoire. Pour cela, les souris ont été exposées à des aérosols de métacholine (un bronchoconstricteur) à concentrations croissantes. En parallèle, l’hyperréactivité bronchique a été quantifiée par mesure de l’indice penH (figure 31). Cette analyse n’a pas pu mettre en évidence d’effets significatifs attribuable à la bactérie recombinante. 62 Résultats préliminaires obtenus chez l’homme au niveau de la cellule dendritique Pour compléter les manipulations faites chez la souris et les étendre à l’homme, les propriétés immunomodulatrices de la bactérie L. plantarum[pMEC240] produisant MBP-ProDer p 1 ont été testées sur cellules dendritiques humaines. Les effets de cette bactérie ont aussi été étudiés au niveau des lymphocytes T mémoires et naïfs par des expériences de co-cultures mettant les MD-DCs pulsées en présence de lymphocytes T autologues. Comme contrôle, nous avons également testé une bactérie non productrice et l’antigène MBP-ProDer p 1 seuls ou en combinaison. Actuellement, une seule expérience a été conduite dans son entièreté chez un sujet sain. A terme, il s’agira non seulement de vérifier la reproductibilité de ces résultats mais aussi d’appréhender les effets de cette bactérie chez des patients allergiques. Les taux d’expression de HLA-DR (CMH de classe II) et des molécules de co-stimulation CD40, CD80 et CD86 ont tout d’abord été mesurés (figure 32 A). De manière intéressante, la bactérie recombinante induit un phénotype proche de celui observé pour la bactérie contrôle. Ces bactéries induisent une augmentation de l’expression de HLA-DR, CD40, CD80 et CD86. Ce phénotype est similaire à celui induit par le LPS (utilisé comme témoin de maturation) et témoigne de l’activation de la cellule dendritique. A l’inverse, l’antigène purifié MBP-ProDer p 1 n’influence pas le phénotype de la DC. Comme la polarisation de la réponse immune est conditionnée par les cytokines produites durant la présentation antigénique, nous avons dosé l’IL-10 et l’IL-12 p70 produites par la DC (figures 32 B et 32 C). La bactérie recombinante et la bactérie contrôle provoquent toutes deux une forte production d’IL-12 associée à une production modérée d’IL-10, des conditions qui favorisent le développement d’un profil Th1. MBP-ProDer p 1 ne stimulent ni la production d’IL-12 ni la production d’IL-10, indiquant que cet antigène n’exerce aucune activité stimulatrice sur la DC. Pour évaluer les effets de la bactérie recombinante sur la polarisation de la réponse immune, les cellules dendritiques pulsées par cette bactérie ou par différents contrôles (cf. supra) ont été recueillies après 24 heures et placées en co-culture avec des lymphocytes T naïfs ou mémoires pendant des temps respectifs de 5 et 2 jours (figure 33). La prolifération des lymphocytes T (naïfs et mémoires) est induite par la bactérie recombinante comme par la bactérie contrôle (figures 33 A et 33 B). Cette prolifération s’accompagne d’une forte production de cytokine (figures 33 C et 33 D). Mais seul de l’IFN- (cytokine Th1) est produit. Aucune sécrétion d’IL-4 ni d’IL-5 (deux cytokines Th2) n’a été détectée démontrant une nette polarisation de la réponse cellulaire vers un profil Th1. L’antigène MBP-ProDer p 1, quant-à lui, n’induit la production d’aucune cytokines. Il n’a donc pas d’influence pas la réponse des lymphocytes T. 63 Les bactéries lactiques regroupent un large ensemble de bactéries Gram-positives dont certains genres comme les lactobacilles et les bifidobactéries font partie intégrante de la flore commensale. En participant à l’élaboration de la microflore du tractus gastrointestinal, ces bactéries contribuent de manière significative au maintien de l’homéostasie immunitaire (312). En dehors des effets antagonistes qu’elles exercent sur les pathogènes (387), les effets probiotiques des bactéries lactiques sont particulièrement perceptibles dans diverses pathologies inflammatoires comme la colite ulcérative (388) et la pouchite (389). De plus, ces dernières années, il est apparu que ces bactéries avaient également une influence bénéfique sur l’allergie. Au niveau épidémiologique, la composition de la flore gastrointestinale des enfants allergiques présente des densités bactériennes plus faibles de lactobacilles et de bifides mais est enrichie en bactéries Escherichia coli et Clostridia (200, 331-334), suggérant que les lactobacilles et les bifidobactéries puissent prévenir l’allergie chez les individus sains. Les effets préventifs des bactéries lactiques ont été démontrés dans plusieurs études précliniques menées chez la souris et ce pour différentes manifestations de l’allergie comme l’eczéma atopique et l’asthme allergique IgE-dépendant (201, 346, 349-353). Au niveau des études cliniques, les effets bénéfiques observés se limitent pour l’instant à l’eczéma atopique tant en ce qui concerne les traitements prophylactiques (202, 335-338) que thérapeutiques (340-343). Etant donné que les mécanismes immunomodulateurs empruntés par les bactéries lactiques pour moduler l’allergie sont méconnus, notre étude a tout d’abord caractérisé les propriétés immunomodulatrices d’une bactérie lactique modèle, L. plantarum NCIMB8826, en examinant ses effets sur la cellule dendritique (article I, II et résultats complémentaires). La cellule dendritique (DC) est une cellule présentatrice d’antigène professionnelle particulièrement apte à stimuler les lymphocytes T naïfs et à conditionner leur différenciation. Cette fonction assure le développement de la mémoire immunitaire et est responsable, dans l’allergie, de la sensibilisation aux allergènes (56, 212, 390). Les DC immatures résident dans les différents sites anatomiques de l’organisme où elles jouent un rôle de sentinelle : elles capturent les antigènes présents dans leur environnement (des allergènes ou d’autres protéines) et répondent aux signatures microbiennes (PAMP, pathogenassociated molecular pattern). Il est donc envisageable dans une perspective de traitement de l’allergie d’orienter de manière contrôlée la réponse de la DC en stimulant cette cellule par des composants microbiens choisis de manière appropriée. Il apparaît, par ailleurs, que les bactéries lactiques présentent des propriétés stimulatrices capables de moduler la fonction des cellules dendritiques et de favoriser par cette action le développement de réponses anti-inflammatoires tant au niveau cellulaire (391-393) qu’à l’échelle corporelle (394-396). C’est pourquoi, nous nous sommes particulièrement intéressés à cette cellule. 64 Nos résultats démontrent clairement que la souche L. plantarum NCIMB8826 stimule une forte production d’IL-12 (cytokine pro-TH1) mais aussi une faible production d’IL-10 (cytokine régulatice/pro-TH2) (article I et II). Le haut rapport IL-12/IL-10 observé favorise donc le développement d’un profil TH1. En supposant que l’induction d’une réponse TH1 soit capable de contrebalancer l’émergence d’une réponse TH2 (concept de balance TH1 - TH2), on peut considérer que les réponses TH1 ont potentiellement une action anti-allergique (75). Cette hypothèse est attestée par de nombreuses études montrant que les réponses TH1 et TH2 sont mutuellement antagonistes. Les cytokines TH1 IL-12, IL18, IFN- et IFN- favorisent aussi bien le développement de la réponse TH1 qu’elles n’inhibent le développement de la réponse TH2 (397-401). Cette polarisation de l’immunité est favorisée par la libération des chimiokines MIP-1/CCL3 et IP-10/CXCL10 (produites par différents types cellulaires parmi lesquels la cellule dendritique) qui ont pour effet d’induire la sécrétion de cytokines pro-TH1 (402-404). Il est même possible, au moins in vitro, de complètement réorienter le profil des lymphocytes TH2 vers un profil TH1 (405). De nombreux microorganismes, composés microbiens ou même des composés synthétiques capables d’interagir avec les récepteurs TLRs induisent la production de cytokines TH1 comme l’IL-12 et l’IFN-et dévient ainsi l’immunité TH2 vers un profil moins polarisé ou vers l’immunité TH1 (406-408). Les motifs CpG, en particulier, induisent le développement de réponses antiallergiques en stimulant TLR9 et en provoquant l’expression du facteur de transcription T-bet lequel est indispensable au développement des lymphocytes TH1 mais contrecarre le développement des lymphocytes TH2 (409). De manière intéressante, les sujets allergiques présentent une sous-expression de ce facteur de transcription en comparaison aux sujets sains (410). Par ailleurs, les sujets atteints de scléroses multiples, une maladie autoimmune caractérisée par une forte production d’IL-12 sont préservés de l’allergie (411). Toutefois, il est aussi important de noter que les sujets sains (non-allergiques) sont réactifs aux allergènes mais contrairement aux sujets allergiques qui développent des réponses immunes TH2-spécifiques, les sujets sains produisent une réponse TH1 en l’absence de toute réaction allergique et de toute autre réaction inflammatoire (75). De plus, comme démontré dans le cas de l’allergie aux arachides, les réponses immunitaires des individus dont l’allergie a été résolue sont déviées vers un profil immunitaire caractérisé par une forte production d’IFN-. Cependant, cette dernière étude n’examinant pas la composante régulatrice de la réponse immune, il ne peut être exclus que les effets observés soient médiés en tout ou en partie par des cellules régulatrices productrices d’IFN- comme les TH1 reg Foxp3+ IFN- IL-10+ (53). Comme ces différentes observations indiquent que la voie TH1 peut être empruntée pour le traitement de l’allergie, on peut considérer, de par le profil de sécrétion de cytokines induit par L. plantarum au niveau de la DC, que cette bactérie lactique est potentiellement capable de moduler la réponse allergique. 65 Alternativement, une réponse de type régulatrice pourrait aussi être indiquée pour le traitement de l’allergie. Les réponses régulatrices reposent sur l’activité suppressive de différents types cellulaires (Treg naturel CD25+ Foxp3+, Tr1, TH3,…) qui semblent influencer à des degrés divers la réponse allergique (53). Le rôle exact des T régulateurs naturels CD25+ Foxp3+ dans l’allergie n’est pas clairement identifié. La déplétion de cette population cellulaire chez la souris stimule le développement des lymphocytes TH1 mais freine la différentiation des lymphocytes TH2 antigènespécifiques, suggérant que les Treg naturels puissent favoriser le développement de l’allergie (413). Les lymphocytes TH2 sont également moins susceptibles que + les lymphocytes TH1 à l’activité + suppressive des thymocytes CD4 CD25 (414). Pourtant l’émergence de populations régulatrices CD4+ CD25+ est décrite chez les individus devenu tolérants à l’allergie (86). De plus, la résolution de l’asthme expérimental induit par Der p 1 est médié chez la souris par des cellules CD4+ CD25+ Foxp3+ (415). Les Treg adaptatifs allergène-spécifiques sécrétant l’IL-10 et/ou le TGF- semblent avoir une grande importance dans la régulation de l’allergie. En effet, les éleveurs d’abeilles piqués à de nombreuses reprises présentent des cellules T réfractaires à la restimulation par les allergènes d’abeilles, une réaction médiée dans leur cas par l’IL-10 (416). Chez les individus sains, une population de cellules régulatrices exprimant CTLA-4, CD25, PD-1, les récepteurs I et II du TGF- et sécrétant l’IL-10 est capable de supprimer les réponses allergène-spécifiques (53). L’induction de tolérance par administration orale d’antigène dépend de l’activité suppressive de lymphocytes TH3 (91). De plus, l’administration de peptides par voie sous-cutanée (417) ou à l’aide de pompes osmotiques (418), l’administration d’antigène dans le tractus respiratoire ou l’administration d’antigènes en présence de bactéries Lysteria monocytogenes (419) induisent le développement de Treg Foxp3+ antigènes-spécifiques. Certaines de ces populations de cellules régulatrices produisent de l’IL-10 (93), d’autres le TGF- (420) ou encore l’IL-10 et l’IFN- simultanément (419) et beaucoup d’entre elles sont capables d’inhiber l’hyperréactivité bronchique liée à l’asthme allergique (93, 419, 420). Il apparaît donc que les effets bénéfiques des Treg sur l’allergie ne sont pas médiés par une population particulière de lymphocytes T mais par un ensemble de différentes populations de cellules T régulatrices. Il convient aussi de relativiser les propriétés régulatrices de l’IL-10 puisque dans certains modèles murins l’IL-10 exerce une activité pro-TH2. Cette propriété est notamment nécessaire au développement de la réponse TH2 pendant l’infection par Leishmania major (421). On doit aussi noter que l’invalidation du gène de l’IL-10 provoque une augmentation significative de la production d’IFN-mais une réduction de la production d’IL-4 et de l’éosinophilie cutanée dans un modèle de dermatite atopique (422), ce qui démontre que l’IL-10 peut avoir une action néfaste sur les individus atopiques. Il est important de noter que les propriétés immunomodulatrices des bactéries lactiques dépendent du type de souche considéré, en particulier en ce qui concerne leurs effets sur l’allergie (423). De plus, les tendances générales identifiées pour les bactéries lactiques ne peuvent être 66 extrapolées à d’autres types de bactéries (comme E. coli, par exemple) (423). C’est pourquoi, il pourrait être envisagé de susciter des réponses de types régulatrices à l’aide d’autres bactéries que L. plantarum NCIMB8826. Sur bases des cytokines (en particulier l’IL-10 et l’IL-12) et chimiokines qu’elles induisent les bactéries lactiques peuvent être classées en bactéries immunogènes ou tolérogènes (424). De manière intéressante, ces propriétés immunomodulatrices caractérisées in vitro corrèlent avec les effets tolérogènes observés in vivo dans des modèles murins d’inflammation. Dans une étude précédente, Rigbby et al. suggéraient déjà que la capacité de certaines souches de bactéries lactiques à induire la production de l’IL-10 semblait être souche spécifique plutôt qu’une caractéristique générale des bactéries Gram-positives (425). Dans un deuxième temps, l’activation des voies de signalisation TLR par L. plantarum a été analysée (article I, article II et résultats complémentaires). Dans ce cadre, nous nous sommes particulièrement intéressés à la contribution des récepteurs TLR2, 4 et 9. Comme ces voies d’activation dépendent toutes de la protéine intracellulaire MyD88, le rôle de cette protéine a aussi été étudié. Les expériences conduites sur souris sauvages et déficientes (TLR2 -/- , TLR4 -/-, TLR9 -/- ou MyD88 -/-) indiquent que L. plantarum active la cellule dendritique via TLR2, TLR9 et MyD88 mais pas via TLR4 (article I et article II). Comme la stimulation de la cellule dendritique par L. plantarum repose sur l’activation de TLR2 et TLR9, il y a lieu de penser que ces récepteurs pourraient être responsables des effets bénéfiques de cette bactérie sur l’allergie. Des résultats préliminaires obtenus in vivo chez des souris déficientes pour TLR2 et TLR9 semblent conforter cette hypothèse. Les effets bénéfiques de ces voies d’activation sont suggérés par des études comparatives portant sur le polymorphisme génétique de ces récepteurs. L’étude internationale ALEX qui porte sur les variations nucléotidiques du gène TLR2 chez des enfants vivant dans des communautés rurales démontre que les allèles AT et TT en position -16934 sont associés à une moins grande prévalence de l’asthme, de sensibilisation aux allergènes et du rhume des foins (182). De façon remarquable, cet effet protecteur n’est détecté que dans le cas d’enfants vivant à la ferme, un environnement favorisant les contacts avec les produits microbiens. Une seconde étude a montré que l’allèle A en position +2257 de TLR2 est plus fréquent chez les patients atteints de dermatite atopique (426). De plus, les patients portant cette variation nucléotidique présentent des symptômes de plus forte gravité. Ces études comparatives démontrent donc l’influence de TLR2 sur l’allergie. Mais le rôle exact de ce récepteur nous est suggéré par des études menées à l’aide d’agonistes de TLR2. Administré au moment de la sensibilisation (modèle murin de sensibilisation à l’ovalbumine (OVA)), le ligand TLR2 Pam3Cys exacerbe la réponse TH2 et conduit à une aggravation de l’asthme (427). De même, l’immunisation intranasale par le peptydoglycan de Staphylococcus aureus (un autre ligand TLR2) en présence d’OVA induit la sensibilisation à cet allergène entraîne une augmentation de l’inflammation pulmonaire liée à l’asthme et une perte de la fonction respiratoire (428). A contrario, l’administration de ce même peptidoglycan ou de Pam3Cys avant sensibilisation a pour effet de prévenir l’inflammation provoquée par l’allergène. Il apparaît donc que l’activation de TLR2 par des agonistes 67 spécifiques peut selon les cas exacerber ou atténuer l’allergie. En ce qui concerne le récepteur TLR9, l’allèle C en position -1237 est associé à un haut risque de contracter de l’asthme parmi la population européano-américaine (429). Les agonistes de TLR9, quant à eux, présentent la particularité d’être efficaces tant en prophylaxie qu’en thérapie. Les ligands TLR9 ont une habilité particulière à induire l’activation de l’indolamine 2,3-dioxigénase (IDO) (430), une enzyme produite par la DC et dont l’activité provoque la déplétion des cellules T autoréactives et induit le développement de lymphocytes T régulateurs. L’injection intraveineuse d’oligos CpG (agoniste TLR9) induit une forte augmentation de l’activité d’IDO au niveau du poumon. Utilisés dans le traitement de l’asthme allergique, ces oligonucléotides préviennent la production de cytokines TH2 (IL-5, IL-13), réduisent l’infiltration de cellules inflammatoires dans le poumon et améliorent la fonction pulmonaire. Les premiers essais cliniques utilisant des oligo-CpG seuls ou comme adjuvant pour l’immunothérapie ont conduit à des résultats prometteurs mais qui se limitent pour l’instant à l’allergie aux pollens d’ambroisie. L’utilisation d’Amb a 1 (allergène d’ambroisie) conjugué à un oligo CpG comme traitement contre l’allergie aux pollens d’ambroisie instaure une protection élevée contre les symptômes de la rhinite allergique et a amélioré la qualité de vie des patients (évaluation par questionnaire) pendant plusieurs saisons polliniques (431, 432). Cet ensemble de résultats montre donc l’intérêt potentiel d’un traitement prophylactique ciblant de manière combinée TLR2 et TLR9, ce que fait L. plantarum. Des études récentes ont montré que les capacités stimulatrices de préparations hautement purifiées d’acides lipotéichoïques (LTA) biologiquement actifs sont TLR2-dépendantes (280). Pour cette raison nous avons comparé les propriétés immunomodulatrices de L. plantarum NCIMB8826 avec celles d’un mutant de parois de cette même bactérie déficient dans la D-alanylation des LTA (mutant dlt-), une mutation qui abolit les propriétés stimulatrices du LTA de L. plantarum (article II) (433). Par l’emploi de BMDCs TLR2- et TLR9-déficientes et de cellules HEK exprimant constitutivement le TLR2 humain, nous observons que les deux souches présentent une même dépendance vis-à-vis de TLR2 et TLR9. Ces données diffèrent des résultats précédemment publiés avec les mêmes souches bactériennes où aucune dépendance vis-à-vis de TLR2 n’avait été démontrée pour la souche dlt- (433). Il doit être noté que, dans cette étude, le mutant de parois L. plantarum dlt- a été recueilli en fin de phase stationnaire de croissance (48 h) tandis que dans notre étude la même bactérie a été récoltée en phase exponentielle de croissance (3 h). Or, la phase stationnaire de la bactérie dlt- se caractérise par une autolyse très marquée de la paroi bactérienne et par l’apparition de profonds changements morphologiques (277). Il ne peut être exclus que cet état favorise la libération et/ou l’exposition de composés microbiens, ce qui entrainerait plus que probablement une modification des propriétés immunomodulatrices de la bactérie. De plus, l’utilisation dans notre étude de BMDCs générées à partir de souris sauvages ou déficientes pour TLR2 au lieu de précurseurs cellulaires isolés de la moelle osseuse pourrait aussi expliquer la différence de réactivité cellulaire. L’activation TLR2-dépendante résiduelle de L. plantarum pourrait être attribuée à d’autres ligands 68 TLR2 comme le peptidoglycan (273) ou les lipoprotéines de surfaces (301). Mais cette hypothèse doit être confirmée dans le cas de L. plantarum puisque le pouvoir immunostimulateur de ces composants peut être considéré comme souche-dépendant. L’acide lipotéichoïque étant reconnu par plusieurs corécepteurs de capture de la cellule dendritique (CD14 et CD36) (434), une modification de ce composant bactérien pourrait affaiblir la force de liaison de la bactérie à la cellule dendritique, un facteur qui pourrait aussi expliquer la faible capacité stimulatrice de la souche mutante dlt-. Quel que soit le rôle exact de l’acide lipotéichoïque de L. plantarum nos résultats montrent clairement qu’il participe fortement à l’activation de la cellule dendritique. On notera aussi que les propriétés thérapeutiques du LTA ont été mises en évidence chez des patients allergiques aux acariens (183), ce qui prouve l’intérêt de ce type de composés pour le traitement de l’allergie aux acariens. Le second composant dont les propriétés immunomodulatrices ont été examinées est l’ADN de L. plantarum (article II). Nos données montrent clairement que l’ADN purifié de L. plantarum contribue au processus d’activation de la cellule dendritique via la voie TLR9-dépendante. Cette propriété permet donc d’expliquer la dépendance des effets immunomodulateurs de L. plantarum visà-vis de TLR9. Comme expliqué plus haut, cette propriété pourrait conférer à L. plantarum des effets anti-allergiques. Comme TLR2 s’associe au cours du processus d’activation avec des co-récepteurs résidant dans les radeaux lipidiques comme CD14 et CD36 (381), nous avons examiné si ces récepteurs influencent la réponse induite par L. plantarum (résultats complémentaires). Nos données obtenues sur BMDC CD14- et CD36-déficientes montrent que ces deux récepteurs sont impliqués dans la capture de L. plantarum. Cependant, des expériences complémentaires réalisées à partir de cellules HEK recombinantes exprimant TLR2+CD14 ou TLR2+CD36 montrent que seul CD14 contribue de manière effective à l’activation de TLR2. En cohérence avec ces résultats, nous observons au niveau de la DC (utilisation de BMDC CD14-déficientes) que CD14 amplifie la réponse cytokinique induite par L. plantarum. Comme il a été récemment démontré que CD14 et CD36 lient l’acide lipotéichoïque et qu’ils participent à l’activation des voies TLR2-dépendantes induites par ce composé on pourrait imaginer que l’acide lipotéichoïque de L. plantarum puisse faciliter la capture de cette bactérie en liant CD14 et CD36 et que ces récepteurs puissent faciliter la reconnaissance de l’acide lipotéichoïque de L. plantarum par TLR2. Cette hypothèse permettrait d’expliquer pourquoi l’expression de CD14 amplifie la réponse induite par L. plantarum. Cependant, dans nos manipulations nous n’observons aucune contribution de CD36 à l’activation cellulaire. TLR2 se présente sous trois formes différentes à la surface de la cellule : sous forme d’homodimère TLR2-TLR2 ou sous formes d’hétérodimères TLR1-TLR2 ou TLR2-TLR6. Des études menées à l’aide de lipoprotéines indiquent que l’association de TLR2 avec TLR1 ou TLR6 permet respectivement la reconnaissance de triacylgycérides (composants de bactéries Gram-négatives) ou de diacylglycérides (composants de bactéries Gram-positives) (301). Cette propriété permet à TLR2 de sensiblement élargir l’éventail de composants qu’il est susceptible de reconnaître. Mais certaines 69 lipoprotéines (diacyl ou triacyglycérides) sont exclusivement reconnues par la forme homodimérique de TLR2. Nos résultats issus de cellules HEK TLR2 transfectées avec des plasmides d’expression codant pour TLR1, TLR2 ou TLR6 semblent indiquer que seule la forme homodimérique de TLR2 interagit avec L. plantarum (résultats complémentaires). De façon surprenante, l’expression de TLR6 a une influence négative sur la réponse induite par L. plantarum suggérant que les hétérodimères TLR2TLR6 soient très peu sensibles à la stimulation de L. plantarum. D’autres données expérimentales ont démontré que l’activation de cet hétérodimère dépend de CD36, alors que ce n’est pas le cas pour TLR1-TLR2. CD36 ne semble donc définitivement pas participer au processus d’activation provoqué par L. plantarum. Un constat qui contraste avec les résultats obtenus par Stuart et al. avec la bactérie pathogène Gram-positive Staphyloccocus aureus (382) et qui démontre donc la spécificité des propriétés immunomodulatrices de L. plantarum. CD36 jouant un rôle prépondérant dans la phagocytose de certaines bactéries Gram-positives on pourrait imaginer que sa fonction biologique se limite dans le cas de L. plantarum à la phagocytose de cette bactérie. Comme l’activation des PRRs entraîne à son tour l’activation de voies de signalisation intracellulaire (435), nous avons analysé l’activation des MAPKs et de la voie NF-B après stimulation par L. plantarum (article II et résultats complémentaires). Nous avons pu montrer que l’activation de TLR2 induite par L. plantarum sollicite la voie NF-B et que, la sécrétion d’IL-12 induite par L. plantarum (réponse cytokinique de la DC) repose sur l’activation des MAPKs JNK, ERK1/2 et p38 et sur l’activation de NK-B. Toutefois, ERK1/2 semble avoir moins d’impact sur la sécrétion d’IL-12 que JNK et p38. Des résultats complémentaires ont pu confirmer par une analyse directe que ces MAPKs étaient bien activées par L. plantarum. La littérature aborde peu les voies de signalisation intracellulaire activées par les bactéries lactiques. Une étude conduite avec L. plantarum ATCC8014 montre que cette bactérie inhibe la translocation de NK-B induite par le TNF- et réduit la dégradation d’IB-induite par cette cytokine pro-inflammatoire (436). Une seconde étude consacrée à la colite ulcérative montre que l’administration orale de la souche L. plantarum HY115 inhibe l’activation de NF-B induite pendant l’inflammation intestinale (437). Ces données suggèrent donc que certaines souches L. plantarum soient capables de réguler l’activation de NF-B en conditions pro-inflammatoires. Cependant, des effets souche-spécifiques ne peuvent être exclus. Les effets NF-B-dépendants de L. plantarum NCIMB8826 pourraient être liés à son habilité particulière à stimuler TLR2 et TLR9, la littérature indiquant que ce processus déclenche des mécanismes de signalisation reposant sur le recrutement de NF-B (435). En ce qui concerne les MAPKs, bien que leur activation ait été démontrée pour Lactobacillus acidophilus (438) et Lactobacillus casei (439), aucune donnée n’existait pour L. plantarum. Nos résultats obtenus in vitro suggéraient que les propriétés immunomodulatrices de L. plantarum puissent orienter la réponse immune vers un profil protecteur de l’allergie, comme nous le montre sa capacité à induire la production d’IL-12. C’est pourquoi les effets immunomodulateurs de 70 cette bactérie ont été ensuite évalués dans le contexte de l’allergie aux acariens (article I). Nos données expérimentales portant sur l’évaluation du potentiel prophylactique de la coadministration L. plantarum + Der p 1 (coadministration intranasale) montrent que l’effet adjuvant de L. plantarum se manifeste par une réorientation de la réponse humorale en faveur d’un profil TH1 (données recueillies après l’étape de prétraitement mais avant l’étape de sensibilisation à Der p 1). En effet, une plus faible production d’anticorps IgG1-spécifiques (associés à un profil TH2) est observée dans le cas de la coadministration L. plantarum + Der p 1 et elle s’accompagne d’une production d’anticorps IgG2a (associés à un profil TH1). Ce type de traitemement semble être bien toléré par les souris puisqu’aucune mortalité n’a été constatée dans nos manipulations. Lorsque L. plantarum est administré à forte densité (109 CFU de bactéries) au niveau de la muqueuse nasale de très faibles quantités de bactéries réussissent à traverser la barrière épithéliale (un maximum de 103 CFU de bactéries) (440). Ce phénomène est résolu endéans les 180 minutes, ce qui démontre que cette bactérie lactique est particulièrement peu invasive. Après l’étape de sensibilisation, la réponse TH1 Der p 1-spécifique mesurée chez les souris coadministrées par Der p 1 + L. plantarum se renforce et se caractérise par la production d’anticorps d’isotype IgG2a et d’IFN-. Cette même réponse prévient la production d’anticorps IgE spécifiques et la production d’IL-5 des cellules spléniques restimulées par Der p 1. Ces résultats montrent donc l’intérêt d’utiliser cette souche comme adjuvant dans la formulation de traitement prophylactiques contre l’allergie aux acariens. Bien que les effets bénéfiques des anticorps IgG2a spécifiques ne soient pas clairement établis chez la souris, leur affinité pour Der p 1 suggère qu’ils puissent entrer en compétition avec les anticorps IgE pour les épitopes de Der p 1 (anticorps bloquants). Chez l’homme, les anticorps IgG (plus particulièrement les IgG4 (441)) bloquants induits par l’immunothérapie spécifique ou par une exposition naturelle aux allergènes présentent de réels bénéfiques sur l’allergie (254). Il a été montré que ces anticorps IgG réduisent la dégranulation IgE-dépendante des mastocytes et des basophiles atténuant ainsi les réactions inflammatoires liées à l’allergie (442-444). Une autre étude montre que les IgGs bloquants produits par sécrétions respiratoires réduisent les symptômes associés à l’allergie (445). Les effets bloquants des anticorps IgG pourraient aussi limiter les mécanismes de présentation antigénique facilitée par les IgEs (446) et inhiber la stimulation des lymphocytes B naïfs en empêchant que l’allergène ne se lie à leurs immunoglobulines de surface (447). De manière à étendre la portée de nos résultats nous envisageons à présent de tester si les anticorps induits par le traitement Der p 1 + L. plantarum sont réellement bloquants. Ce paramètre peut être testé au moyen de tests de dégranulation de lignées de basophiles (RBL, Rat Basophil Leukemia assay) ou de basophiles isolés de patients allergiques (cette dégranulation est induite par la liaison de l’allergène aux IgEs fixés à la surface du basophile). Alternativement, les effets bloquants de ces anticorps au niveau de la réactivité IgE de Der p 1 peuvent être mesurés dans des tests ELISA de compétition. 71 Nous avons analysé la production de l’IL-5 car c’est une cytokine-clé de la réponse allergique et qu’elle est corrélée à l’éosinophilie pulmonaire. En effet, cette cytokine provoque la différenciation des éosinophiles (62) à partir de leurs précurseurs hématopoïétiques et prolonge leur durée de vie (63). En cohérence avec la baisse de production d’IL-5 observée au niveau de la réponse cellulaire, nous observons dans notre étude que la coadministration par Der p 1 + L. plantarum atténue l’éosinophilie pulmonaire provoquée par une exposition à des aérosols d’extraits d’allergènes. L’éosinophilie pulmonaire est une caractéristique importante de l’asthme allergique et est nécessaire au recrutement des lymphocytes TH2 dans le poumon (130). En conséquence de quoi, l’IL-5 et l’éosinophilie pulmonaire peuvent être considérés comme de bons marqueurs de l’allergie. Néanmoins, le développement de la réaction allergique ne dépend pas uniquement que de cette cytokine. L’IL-4 et l’IL-13 jouent un rôle prépondérant dans le changement de classe isotypique des anticorps (de IgM vers l’IgE) (57). L’IL-13 induit également l’hyperréactivité bronchique (70). Dés lors, il serait intéressant de doser ces cytokines lors de nos prochains développements expérimentaux. L’IFN- a été choisi pour le suivi de la réponse TH1 vu le rôle central de cette cytokine dans l’immunité TH1. Le suivi de la production d’IL-10 serait également utile étant donné que les effets curatifs de l’immunothérapie spécifique semblent dépendre de cette cytokine (254). D’autres manipulations dont nous maîtrisons à présent les techniques expérimentales sont envisageables pour compléter nos résultats : mesure de l’hyperréactivité bronchique pour avoir une analyse de la fonction respiratoire et mesure de réponse cellulaire au niveau des ganglions drainant le poumon (ces deux types d’analyses ont été introduits dans nos manipulations les plus récentes). Dans la perspective de nouveaux résultats, nous pourrions aussi réaliser des coupes histologiques du poumon de manière à analyser les sécrétions de mucus, l’hyperplasie des cellules caliciformes et l’obstruction des bronches de cette organe, ce qui nous aiderait à mieux caractériser l’inflammation des voies aériennes. Avant toute évaluation de L. plantarum en tant que traitement thérapeutique (traitement après sensibilisation), les propriétés immunomodulatrices de cette bactérie lactique ont été testées sur des splénocytes de souris sensibilisées à Der p 1 pendant la restimulation antigénique (splénocytes restimulés par L. plantarum + Der p 1, article I). Les résultats obtenus montrent que L. plantarum modifie le profil cytokinique induit par la restimulation antigènique et l’oriente vers un profil caractérisé par de faibles taux de cytokines TH2 (IL-5) et de forts taux de cytokines TH1 (IFN-) et régulatrices (IL-10) alors qu’en l’absence de bactéries les splénocytes restimulés par Der p 1 sécrètent de fortes quantités d’IL-5 mais pas d’IFN- ni d’IL-10. Curieusement, les plus fortes doses de bactéries n’induisent pas les plus forts taux de production de cytokines TH1 ou régulatrices. Ce manque de réactivité cellulaire pourrait traduire une réponse anti-inflammatoire ou anergique. Par ailleurs, l’activité protéinase de Der p 1 pourrait affecter L. plantarum et entraîner une libération accrue de composants immunomodulateurs. Prises dans leur globalité, ces données suggèrent que L. plantarum peut avoir une action thérapeutique sur l’allergie aux acariens. Nous proposons donc d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette souche dans nos prochaines manipulations. 72 Depuis quelques dizaines d’années, de nombreux vecteurs d’expression adaptés à la production de protéines hétérologues en bactéries lactiques ont été développés (à noter qu’il n’existe pas, à l’heure actuelle, de systèmes hétérologues commerciaux pour la production de protéines recombinantes en bactéries lactiques). Les bactéries recombinantes générées à partir de ces systèmes d’expression sont utilisées de manière intensive comme vecteur de délivrance d’antigène dans des stratégies de vaccination mucosale (314). Les applications sont multiples: vaccination contre Helicobacter pylori (le principal agent responsable de l’ulcère gastrique) par administration d’une souche recombinante produisant l’uréase B, vaccination contre la toxine tétanique par administration d’une souche recombinante produisant la TTFC (le fragment C de la toxine tétanique),…. Combinée aux effets immunomodulateurs des bactéries lactiques, cette approche vaccinale pourrait s’avérer être efficace pour le traitement de l’allergie. Les effets prophylactiques de la caodministration L. plantarum NCIMB8826 + Der p 1 sur la réponse allergique Der p 1-spécifique ayant été démontrés dans notre travail, nous nous avons entrepris l’élaboration d’une bactérie lactique recombinante produisant Derp 1 et dérivée de la souche L. plantarum NCIMB8826 dans la perspective de l’utiliser comme traitement prophylactique et/ou thérapeutique contre l’allergie aux acariens (article II et résultats complémentaires). Différents paramètres doivent être envisagés dans l’élaboration de ce type de traitement comme le montrent les données fournies par la littérature où la TTFC a été utilisée comme modèle d’antigène recombinant. Dans ce contexte, une étude récente a montré que des mutants de parois de Lactococcus lactis et de Lactobacillus plantarum (déficient pour l’alanine racémase) exprimant la TTFC induisent une réponse anti-TTFC beaucoup plus importante que les souches sauvages correspondantes (282), indiquant que les propriétés immunomodulatrices intrinsèques des bactéries lactiques doivent être prises en considération dans l’élaboration de souches recombinantes à destinée vaccinale. Cette conclusion est confirmée par une autre étude qui a comparé des souches recombinantes dérivée de L. lactis et L. plantarum produisant la TTFC à des taux identiques. Cette étude montre que la bactérie L. plantarum recombinante génère des titres plus importants que la seconde souche (immunisation par administration intragastrique) (448). On peut donc considérer que le pouvoir vaccinal de ces vecteurs vivants d’antigènes est réellement influencé par leurs propriétés immunomodulatrices intrinsèques. C’est pourquoi, nous avons d’abord voulu mettre en évidence les effets anti-allergiques de L. plantarum NCIMB8826 avant de procéder à l’élaboration d’une bactérie recombinante dérivée de cette souche. D’autre part, une troisième étude a montré que les bactéries lactiques L. plantarum et L. lactis utilisées pour la production recombinante de la TTFC induisent le développement d’une réponse mixte TH1-TH2 caractérisée par la production combinée d’anticorps IgG2a et IgG1 (449), indiquant que ces deux bactéries ont bel et bien un effet adjuvant sur la réponse antigénique puisque l’administration de TTFC seule n’induit pas de réponse anticorps. Plusieurs voies d’administration avaient été comparées dans cette même étude. De manière intéressante, l’injection parentérale favorise une forte production d’IgG1 (anticorps associés à un profil TH2) contrairement aux autres types 73 d’immunisation, indiquant que le choix de la voie d’administration influence la réponse suscitée par la bactérie recombinante. Par ailleurs, il apparaît que la voie d’administration orale est très peu immunogénique comme en attestent plusieurs études ayant évalué ce mode d’administration (450, 451). C’est pourquoi, nous avons choisi dans notre travail de privilégier une voie d’administration mucosale plus efficace : l’administration intranasale, lors de l’étape de traitement des souris (modèle expérimental d’allergie à Der p 1). En comparant les réponses générées par administration intragastrique de souches L. lactis recombinantes produisant à différents taux la TTFC, J. Wells et al. démontrèrent que les titres antigène-spécifiques générés sont proportionnels à la quantité d’antigène produit par les bactéries recombinantes (314), une observation reproduite par la suite par d’autres études (452). Dés lors, nous ne nous sommes pas contentés d’obtenir une bactérie lactique recombinante produisant Der p 1 mais nous avons également recherché à maximiser le rendement de production de cet antigène, de manière à faciliter l’induction d’une réponse antigène-spécifique. La localisation cellulaire de l’antigène produit est un autre paramètre influençant la réponse immune. Comparant les modes de production intracellulaires et ancrés à la paroi bactérienne pour des souches L. lactis recombinantes produisant la TTFC, Norton et al. ont montré que la souche produisant la TTFC sous forme ancrée était plus immunogène par voie systémique que la souche recombinante produisant la TTFC au niveau intracellulaire (379). De manière intéressante, une autre étude montre l’effet inverse pour l’immunisation par voie mucosale (378), suggérant que la production intracellulaire est mieux adaptée à ce deuxième mode de traitement. Il se pourrait, en effet, que les antigènes produits au niveau intracellulaire soient moins susceptibles d’être dégradés par les protéases extracellulaires présentes au niveau des muqueuses. C’est pourquoi, le mode de production intracellulaire a été choisi dans nos manipulations. Enfin, le dernier paramètre susceptible d’influencer la réponse immune pourrait être la viabilité de la bactérie utilisée pour vaccination puisque des composés immunomodulateurs (LTA, peptidoglycan) sont relargués par les bactéries métaboliquement actives (275). Cependant, au regard des données fournies par la littérature, la viabilité des bactéries recombinantes ne semble pas clairement améliorer leur pouvoir vaccinal. Dans une étude comparant l’immunogénicité de souche L. lactis recombinantes produisant la TTFC, le fait de tuer les bactéries à la formaline ou à la mytomycine C n’affectait en rien leur immunogénicité (453). Une deuxième étude, évaluant l’immunogénicité de bactéries recombinantes produisant la TTFC dérivée de L. plantarum a cependant montré un légère baisse des titres anti-TTFC lorsque les bactéries sont tuées aux U.V. (448). Une autre étude, évaluant l’immunogénicité d’une souche L. lactis recombinante produisant la PspA (Pneumococcal Surface Protein A) de Streptococcus pneumoniae montre qu’une réponse en anticorps plus importante est obtenue en tuant cette souche recombinante par la mitomycine C (454). Cependant, dans cette dernière étude, l’efficacité de la vaccination antistreptocoque induite par la souche tuée était inférieure à celle de la souche vivante. Par ailleurs, il ne peut être exclu que la méthode choisie pour tuer les bactéries puisse modifier spécifiquement leurs capacités immunomodulatrices. Dans notre cas, nous avons choisi d’administrer des bactéries vivantes 74 en considérant que cet état pouvait améliorer leur potentiel prophylactique. Néanmoins, nous n’avons pas eu l’occasion de vérifier si leur viabilité a réellement une influence sur leur pouvoir prophylactique. Nous avons donc entrepris l’élaboration d’une bactérie lactique recombinante produisant Der p 1 au niveau intracellulaire (article II et résultats complémentaires). Il faut noter qu’au moment où ces manipulations ont été initiées la production recombinante de Der p 1 en bactérie n’était pas décrite par la littérature. De plus, la difficulté de produire Der p 1 en bactérie était connue, une raison pour laquelle des systèmes d’expression eucaryote avaient été développés pour la production de cet allergène (385, 455). Dès lors, l’expression de Der p 1 par L. plantarum représentait un réel défi. Plusieurs cassettes d’expression ont été construites et, parmi celles-ci, une seule s’est avérée fonctionnelle. Dans cette construction, la forme recombinante de Der p 1 produite avec succès correspond à une protéine fusion entre la Maltose Binding Protein (MBP) de E. coli et la ProDer p 1, le zymogène de Der p 1. Contrairement à ce qui a été publié pour les allergènes Bet v 1 ou Der p 5, nous montrons que la présence d’un partenaire de fusion (MBP) est critique à l’expression de Der p 1 en bactérie lactique étant donné qu’aucune production n’a été obtenue dans le cas de la forme mature de Der p 1 ou de la ProDer p 1 seule. Cette absence de production est probablement due à la toxicité cystéine protéinase-dépendante de la forme mature de Der p 1 correctement reployée ou à un reploiement inapproprié de Der p 1 ou de ProDer p 1 dans L. plantarum. La MBP-ProDer p 1 est produite majoritairement par L. plantarum sous forme insoluble, ce qui suggère fortement que la protéine recombinante n’adopte pas le folding de l’allergène natif. Les propriétés immunomodulatrices de cette souche recombinante ont ensuite été testées sur les cellules dendritiques (article II). Nos résultats démontrent que l’état d’activation de la DC (mesuré par l’expression des marqueurs de surfaces (I-Ad, CD40, CD80, CD86) et les profils de cytokines induits par la bactérie recombinante (IL-12p40, IL-12p70, IL-10, TNF-) sont identiques à ceux de la bactérie sauvage. On peut donc considérer que la bactérie recombinante conserve les propriétés immunomodulatrices de la souche sauvage. Ensuite, nous avons examiné l’immunogénicité de la bactérie recombinante obtenue (résultats supplémentaires). Nous montrons qu’une réponse humorale antigène-spécifique est induite par cette bactérie. Mais celle-ci est dirigée principalement contre MBP (les titres ProDer p 1-spécifiques sont en-dessous de la limite de détection). La faible immunogénicité de notre bactérie recombinante est également visible au niveau de la réponse cellulaire où aucune production de cytokine TH2 n’a pu être détectée après restimulation antigénique par ProDer p 1. Des résultats complémentaires suggèrent que cette absence de réactivité vis-à-vis de ProDer p 1 soit liée à la compartimentation intracellulaire de l’antigène produit puisqu’une réponse anticorps ProDer p 1-spécifique peut être induite en lysant la bactérie recombinante. L’exposition des épitopes conformationnels de ProDer p 1 étant nécessaire à l’induction d’une réponse anticorps ProDer p 1-spécifique, deux autres paramètres supplémentaires pourraient expliquer la faiblesse de la réponse anticorps ProDer p 1-spécifique observée dans nos 75 manipulations: i) MBP pourrait masquer les épitopes conformationnels de ProDer p 1 puisque la taille de MBP (42 kDa) n’est pas négligeable comparée à celle de ProDer p 1 (33 kDa) ii) un reploiement inapproprié de ProDer p 1 pourrait altérer ses épitopes conformationnels. Une mauvaise conformation de l’antigène recombinant est d’ailleurs suggérée par le fait qu’il soit produit majoritairement sous forme insoluble. Notre laboratoire ayant démontré qu’une déstabilisation de la structure de ProDer p 1 rend cet allergène hypoallergénique (456), on pourrait penser que l’allergène produit par nos bactéries recombinantes puisse correspondre à une forme hypoallergénique de Der p 1. Toutefois, cette propriété reste à déterminer. De manière intéressante, la dénaturation de ProDer p 1 en condition réductrice améliore les propriétés thérapeutiques de cet antigène. Cependant, il se pourrait que le bon reploiement de Der p 1 soit nécessaire à l’induction d’une réponse anti-allergique optimale, un paramètre qu’il serait intéressant d’examiner dans nos futures expériences. Nous pourrions envisager d’améliorer la solubilité de l’antigène recombinant en jouant sur la quantité d’antigènes produits, le système d’expression que nous employons étant finement régulé par la nisine (366). De manière alternative, d’autre protéine de fusion pourraient peut-être permettre d’améliorer la solubilité/le folding de Der p 1. Toutefois, comme nous l’avons démontré, il apparaît que l’éventail des partenaires de fusion permettant l’expression effective de Der p 1 est très restreint. Nous examinons actuellement les propriétés d’une seconde forme recombinante de Der p 1 constituée de la fusion du peptide signal de Usp45 (Unknown secreted protein 45 de Lactococcus lactis) et de ProDer p 1 (PSUSP45-ProDer p 1) (données non montrées). La faible taille du peptide signal (3 kDa) limitant le risque que les épitopes de Der p 1 soient masqués, cet antigène pourrait avoir des qualités prophylactiques supérieures à celle de MBP-ProDer p 1. Les qualités prophylactiques de la bactérie lactique recombinante obtenue ont été testées dans un modèle murin de sensibilisation à Der p 1 (article II et résultats supplémentaires). Nos résultats montrent que l’administration intranasale de cette souche prévient la réponse allergique par une réduction drastique de la production d’anticorps IgE-spécifiques concomitante à une production d’anticorps protecteurs d’isotype IgG2a. Comme discuté préalablement pour le traitement basé sur la coadministration L. plantarum + Der p 1, ces anticorps IgGa pourraient avoir une action bloquante sur les IgE. Mais leur capacité à entrer en compétition avec les IgE pour les épitopes de Der p 1 reste à déterminer. En revanche, la production d’anticorps IgG1 n’est pas altérée par la souche L. plantarum recombinante probablement parce que de l’alum, un adjuvant induisant de hauts titres IgG1, a été utilisé pour l’étape de sensibilisation à Der p 1. Au niveau de la réponse cellulaire, le traitement par la bactérie recombinante inhibe la production d’IL-5 des cellules spléniques et des cellules ganglionnaires restimulées par Der p 1. En toute cohérence, l’éosinophilie pulmonaire provoquée par les aérosols d’extraits d’allergènes d’acariens est également inhibée (l’IL-5 est nécessaire au développement de l’éosinophilie). Cependant, aucun effet bénéfique n’a pu être observé au niveau de l’hyperréactivité bronchique. Comme les cellules NKT qui représentent 60 % des cellules pulmonaires CD4+ CD3+ des patients asthmatiques jouent un rôle prépondérant dans l’expression de 76 l’hyperréactivité bronchique (457), il serait intéressant d’examiner au cours de nos prochains développements expérimentaux si notre bactérie recombinante parvient ou non à moduler l’activité de ces cellules. Une approche pourrait consister à rendre les cellules NKT anergiques par l’administration massive d’-GalCer et d’examiner si dans ces conditions la bactérie lactique recombinante réussit à prévenir l’hyperréactivité bronchique. Le mécanisme d’action des cellules NKT reposant sur la production locale d’IL-4 et d’IL-13, il serait intéressant de doser ces cytokines dans les lavages bronchoalvéolaires ou, de manière alternative, d’examiner le taux de transcription des gènes de l’IL-4 et de l’IL-13 au sein du poumon par RT-PCR. En comparant les deux traitements par bactérie lactique (contrôle et recombinante) on constate que seule la souche recombinante a une réelle incidence sur la réponse anticorps Der p 1-spécifique. En effet seule la bactérie recombinante provoque une chute significative de la production d’anticorps IgE spécifiques et seule cette souche stimule la production d’anticorps IgG2a spécifiques, ce qui démontre que notre bactérie recombinante assure sa fonction de vecteur de délivrance d’antigène et que cette stimulation antigénique a un réel impact sur la réponse allergique. Néanmoins, il serait intéressant d’analyser dans nos prochaines manipulations si la bactérie recombinante suscite une réponse MBP-ProDer p 1-spécifique au site de traitement (c.-à-d. au niveau de la muqueuse nasale) par un dosage des anticorps IgA spécifiques produits localement. Au niveau de la réponse cellulaire (production d’IL-5), on constate une influence marquée des propriétés immunomodulatrices intrinsèque de L. plantarum NCIMB8826. L’expression de l’antigène recombinant permet d’améliorer les effets prophylactiques de la bactérie lactique sur la réponse des cellules ganglionnaires médiastinales (réduction de la production d’IL-5). En revanche, les effets bénéfiques de la bactérie recombinante sur l’éosinophilie pulmonaire sont entièrement attribuables à ses propriétés immunomodulatrices intrinsèques. Globalement, ces différents résultats démontrent que cette souche bactérienne constitue un traitement prophylactique prometteur contre l’allergie aux acariens. Cette approche offre divers avantages : i) Elle est sans danger. En effet, la traitement par voie mucosale limite le risque de choc anaphylactique puisque l’antigène recombinant n’est pas introduit directement dans la circulation sanguine, d’une part, et puisque d’autre part, les bactéries lactiques possèdent un statut GRAS (Generally Recognised as Safe) qui témoigne de leur innocuité. ii) Les bactéries lactiques semblent avoir des effets immunitaires capables de moduler l’expression de l’allergie (cf. introduction). De plus l’administration de ces bactéries recombinantes a deux avantages majeurs sur le traitement par coadministration (bactérie lactique + allergène) : i) Comme l’allergène est produit au niveau intracellulaire, il est relativement bien protégé de l’action des protéases extracellulaires. Ceci pourrait expliquer le fait que la production de cytokines TH2 ne soit inhibée uniquement dans le cas du traitement par la bactérie recombinante mais pas dans le cas du traitement par coadministration L. plantarum + Der p 1 ii) Le coût raisonnable de ces bactéries recombinantes, l’élaboration de ce traitement ne nécessitant pas de mettre en œuvre un processus de purification pour l’allergène. Cependant, ce traitement prophylactique a pour désavantage de se baser sur un antigène 77 recombinant peu immunogène (résultats complémentaires), une caractéristique qui pourrait limiter le pouvoir prophylactique de la bactérie recombinante. Des résultats similaires ont été publiés par d’autres études en utilisant des bactéries recombinantes dérivées de Lactococcus lactis et Lactobacillus plantarum produisant respectivement la -lactoglobuline (458) ou Bet v 1 (440). Le prétraitement par ces bactéries lactiques recombinantes prévient la production d’anticorps IgE spécifiques et induit le développement d’une réponse de type Th1. La deuxième étude montre également que la souche L. plantarum recombinante prévient l’éosinophilie pulmonaire et la production locale d’IL-5 au niveau du poumon. A noter que contrairement à la forme recombinante produite dans nos manipulations (MBP-ProDer p 1), Bet v 1 recombinant adopte la conformation de l’allergène natif et induit une forte réponse Bet v 1-spécifique en immunisation. Une troisième étude a investigué les effets de bactéries recombinantes (Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus) produisant Der p 5 (pneumallergène d’acarien) par rapport à des bactéries contrôles non productrices(459). L’administration orale de ces bactéries après sensibilisation améliore la fonction pulmonaire (réduction de l’hyperréactivité bronchique) et diminue l’inflammation pulmonaire. A nouveau, une baisse des titres en anticorps IgE-spécifiques est observée au niveau systémique. Cependant une telle bactérie ne peut être complètement efficace pour le traitement de l’allergie aux acariens étant donné que seulement 40 à 50 % des séra de patients allergiques aux acariens réagissent à Der p 5. En comparaison à Der p 5, Der p 1 est beaucoup plus relevant sur le plan clinique (cet allergène est reconnu par plus de 80% patients allergiques aux acariens). Etant donné que Der p 1 représente l’un des allergènes d’acariens les plus immunodominants, notre étude décrit pour la première fois l’élaboration et la caractérisation immunologique d’une bactérie lactique recombinante produisant un allergène majeur d’acariens sous forme entière. Les tentatives précédentes de production de Der p 1 en cellule procaryote ont probablement échoué à cause de la toxicité de son activité protéolytique et de l’absence de proséquence qui dans le cas de Derp 1 joue le rôle de chaperonine. Contrairement à la -lactoglobuline, Bet v 1 ou Der p 5, Der p 1 possède une capacité intrinsèque à stimuler le développement de l’immunité TH2 (160, 161), une singularité qui est attribuable à son activité enzymatique cystéine protéinase. Il faut aussi noter que notre modèle d’allergie comporte 4 challenges aérosols alors que l’étude menée sur Bet v 1 n’en comporte que deux. Nos conditions expérimentales sont donc particulièrement plus allergisantes que celles de l’étude consacrée à Bet v 1. Une quatrième étude a évalué les propriétés thérapeutiques d’une souche recombinante de L. lactis sécrétant l’ovalbumine chez des souris transgéniques (DO11.10) exprimant un récepteur T spécifique de l’ovalbumine(460). Le traitement oral par cette bactérie induit une production locale d’ovalbumine au niveau du tractus intestinal qui est associée au développement d’une tolérance orale à l’ovalbumine. Cet état de tolérance se manifeste par une suppression de la réaction d’hypersensibilité retardée et est médié par la fraction CD25- des lymphocytes T par un mécanisme dépendant du TGF-. Ces résultats restent 78 cependant à étendre à des souris non transgéniques. Enfin, on peut citer une dernière étude portant cette fois-ci sur l’évaluation du potentiel thérapeutique d’une bactérie recombinante dérivée de L. plantarum 256 produisant un épitope T immunodominant de Der p 1 (acides aminés 111-139) (461). Après immunisation des souris par le peptide 111-139 adjuvanté d’IFA (Incomplete Freund’s Adjuvent, un adjuvant induisant une réponse de profil mixte TH1-TH2), l’administration de la bactérie recombinante provoque une réduction significative de la production d’IL-5 et d’IFN- mais sans modification de la réponse anticorps. L’inflammation pulmonaire n’a pas été examinée. Ces résultats indiquent donc que des bactéries lactiques recombinantes peuvent être employées pour l’inhibition de réponses T Der p 1-spécifique. Cependant, il serait nécessaire dans le cadre du traitement de l’allergie d’également cibler la réponse humorale et l’inflammation pulmonaire. C’est pourquoi, il conviendrait de tester la bactérie recombinante que nous avons générée en mode de traitement thérapeutique pour vérifier si, en utilisant un allergène sous forme entière, de meilleurs effets curatifs peuvent être obtenus. Lors de nos prochaines manipulations il s’agira aussi de vérifier si les effets de notre bactérie recombinante se prolongent à long terme. Nos résultats recueillis in vitro au niveau de la DC nous montrant que les propriétés immunomodulatrices de L. plantarum dépendent de TLR2 et TLR9 (article I et article II), il serait aussi intéressant d’analyser le rôle de ces voies d’activations in vivo de manière à déterminer si elles sont responsables des effets anti-allergiques de L. plantarum. Une autre stratégie de traitement pourrait consister à faire produire des cytokines pro-TH1 (IL-12) ou antiinflammatoires (IL-10, TGF-, IL-1Ra) par la bactérie lactique de manière à augmenter ou réorienter ses capacités immunomodulatrices. Nous souhaitons également étendre nos résultats à l’homme par des manipulations ex vivo menées sur cellules dendritiques et sur lymphocytes T autologues. Comme le montrent nos résultats complémentaires, ce travail à été amorcé. Nos données préliminaires semblent montrer que la bactérie recombinante induit chez les individus sains une forte réponse TH1 (IFN-) en l’absence de toute réponse TH2 (IL-4, IL-5) et que cette réponse est identique à celle induite par la bactérie lactique sauvage, indiquant que les propriétés immunomodulatrices de L. plantarum sont préservées également chez l’homme. Il s’agit à présent de compléter ces résultats et d’appréhender les propriétés immunomodulatrices de notre bactérie recombinante sur cellules de patients allergiques aux acariens. Malgré tout, ces résultats préliminaires indiquent bien que la bactérie lactique recombinante dérivée de L. plantarum peut constituer la base de nouveaux traitements immunothérapeutiques contre l’allergie chez l’homme. 79 Bactéries et conditions de culture Les souches bactériennes utilisées sont listées au tableau 7. Escherichia coli TG1, E. coli Nissle 1917, Lactobacillus plantarum NCIMB8826 (WT), L. plantarum EP007 (dlt -), L. plantarum NC7 ont été cultivées selon les protocoles standards(433, 440, 462) comme suit. Les souches TG1 et Nissle 1917 d’E. coli sont cultivées à 37°C sous agitation en bouillon de culture LB (Luria-Bertani). Les souches NCIMB8826, EP007 et NC7 de L. plantarum sont cultivées à 37°C en bouillon de culture MRS (Man-Rogosa-Sharpe). Les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes : 20 µg/ml chloramphénicol et 100 µg/ml ampicilline pour E. coli; 10 µg/ml chloramphénicol et 5 µg/ml érythromycine pour L. plantarum. Les stocks de bactéries sont préparés en inoculant un volume de milieu frais à une densité optique de 0,15 mesurée à 600 nm (DO600). Les bactéries sont récoltées 3 heures après par centrifugation (11 min à 2500 g, L. plantarum; 15 minutes à 6000 g, E. coli) et préparées pour leur stockage selon les protocoles standards(433).Après 2 lavages en D-PBS les bactéries sont reprises à 109 CFU/mL (valeur estimée par mesure de la DO600) en D-PBS 20% glycérol et stockées à -80°C. Le contenu en endotoxines des préparations de L. plantarum était inférieur à 5.8 EU/mL (déterminé par test limulus). Tableau 7. Caractéristiques des souches bactériennes Souches bactériennes Propriétés Références E. coli TG1 supE hsd 5 thi [lac-proAB] F [traD36 proAB lacIq lacZ M15] (463) E coli Nissle 1917 Isolée de fèces humains. (464) L. plantarum NCIMB8826 Isolée de la salive humaine L. plantarum NCIMB8826 Int-1 NCIMB8826 contenant les gènes nisRK intégrés stablement dans le locus NCIMBa (366) Ser tRNA . L. plantarum EP007 Mutant NCIMB8826 délété dans l’opéron dlt qui présente des acides (433) téichoïques déplétés en résidus D-Alanyl ester. a NCIMB, National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Terry Research Station, Aberdeen, Scotland. Extraction d’ADN plasmidique L’extraction d’ADN plasmidique à partir d’une souche E. coli s’effectue à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN plasmidique selon les recommandations du fabricant (Quiagen). Un protocole similaire est suivi pour l’extraction de plasmide à partir de L. plantarum mais celui-ci est précédé des étapes suivantes : Centrifuger 10 mL de culture de bactéries arrivée à saturation (11 min, 2500 g). Reprendre le culot dans 400 µL du tampon suivant : 10 mM Tris pH 8 12 % PEG 20000 2,5 mg/mL lysosyme 50000 U mutanolysine Incuber 2 heures (37°C). Centrifuger (11 min, 2500 g). L’extraction d’ADN s’effectue alors de la même façon que pour E. coli mais en tenant compte du volume initial de 10 mL au lieu des 5 mL utilisés dans les protocoles standards (volumes de tampons doublés jusqu’au chargement sur colonne de purification). 80 Préparation de cellules E. coli électrocompétantes Les bactéries électrocompétantes ont été préparées comme décrit précédemment(465) avec quelques modifications. Le mode opératoire utilisé est le suivant: Inoculer 500 mL de bouillon de culture LB liquide préchauffé à 37°C par 5 mL de préculture. Incuber à 37°C sous agitation jusqu’à obtenir une DO600 de 1. Incuber sur glace pendant une durée de 30 à 60 minutes. Centrifuger (15 minutes, 4000 g, 4°C). Reprendre le culot dans 500 mL d’eau distillée stérile portée préalablement à 4°C en agitant dans un bain de glace. Incuber 30 minutes à 4°C. Centrifuger (15 minutes, 4000 g, 4°C). 2 lavages dans 250 mL d’eau distillée stérile (4°C). Centrifuger (15 minutes, 4000 g, 4°C). Reprendre le culot dans 10 mL d’eau distillée stérile 10% glycérol (4°C). Centrifuger (15 minutes, 4000 g, 4°C). Reprendre le culot dans 2 à 3 mL d’eau distillée 10% glycérol (4°C). Aliquoter par volume de 50 µL. Stocker à -80°C. Préparation de cellules L. plantarum électrocompétantes Les bactéries électrocompétantes ont été préparées comme décrit précédemment(466) avec quelques modifications. Le mode opératoire utilisé est le suivant: TEN : 0,1 M Tris pH 7,4 ; 0,1 M EDTA ; 0,15 M NaCl Innoculer 500 mL de bouillon de culture MRS liquide préchauffé à 37°C par 10 mL de préculture. Incuber à 37°C sous agitation (150 à 180 rpm) jusqu’à obtenir une DO600 entre 0,5 et 0,7. Centrifuger (11 min, 2500 g). Les étapes de centrifugation se font toutes à température ambiante. Reprendre par agitation modérée le culot bactérien dans 500 mL de TEN. Centrifuger (11 min, 2500 g). 2 lavages dans 250 mL d’eau distillée stérile (température ambiante). Reprendre par agitation modérée le culot bactérien dans 5 mL d’eau distillée stérile (température ambiante). Centrifuger (11 min, 2500 g). Reprendre le culot bactérien dans 2,5 mL d’eau distillée stérile 30% PEG 1000 (4°C, filtrée à 0,2 µm, préparé extratemporanément). Aliquoter par volume de 100 µL. Stocker à -80°C. Transformation de cellules électrocompétantes La solution dans laquelle est dissoute l’ADN à électroporer doit être dépourvue de sels pour éviter la formation d’arcs électriques lors de l’étape d’électroporation. Si du sel est présent il est éliminé en dialysant la solution d’ADN comme suit : Remplir une boîte de Pétri d’eau miliQ jusqu’à couvrir toute surface de la boîte. Déposer une membrane à dialyse à la surface de l’eau. Déposer la solution d’ADN sur la membrane reposant sur l’eau. Incuber 30 minutes. Récupérer la solution d’ADN dialysée. Les solutions d’ADN dépouvues de sels, procéder aux étapes suivantes : Placer les bactéries électrocompétantes et les cuvettes d’électroporations sur glace. Après décongélation mélanger les bactéries et la solution d’ADN. Transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation (2 mm). Eliminer les microbulles en tapotant la cuvette d’életroporation. Electroporer les bactéries. Conditions d’électroporation : E. coli: 2,5 kV, 200 Ω, 25 µF. 81 L. plantarum: 1,7 kV, 400 Ω, 25 µF Après électroporation, régénérer les bactéries par addition de milieu de culture : E. coli : 450 µL de milieu LB L. plantarum : 900 µL de milieu MRS Incuber les cellules : E. coli : 45 minutes sous agitation L. plantarum : 2 heures Etaler les cellules sur milieu sélectif solide. Construction de souches L. plantarum produisant Der p 1 Des cellules électrocompétantes E. coli TG1 ont été utilisées comme hôte intermédiaire de clonage. Les caractéristiques des plasmides à la base de ce travail sont décrites au tableau 8. Les séquences codantes des différents plasmides utilisés pour le clonage de Der p 1 sont amplifiées par PCR selon un protocole standard(463) et les produits PCR sont sousclonés dans les vecteurs mentionnés au tableau 10 selon les recommendations des fabricants (pMOSblue, Amersham ; pCR2.1-TOPO, Invitrogen). Les amorces PCR, les ADNs matrices correspondants, les restrictions enzymatiques utilisées sont spécifiés au tableau 10 pour chaque construction génétique. Les inserts obtenus à partir des produits PCR sont vérifiés par séquençage. Après restriction enzymatique (cf. tableau 10), les inserts sont introduits dans différents vecteurs adaptés à la production de protéines recombinantes par L. plantarum (cf. tableau 9). Les caractéristiques des constructions produites sont décrites au tableau 9. Tableau 8. Plasmides utilisés pour le clonage de Der p 1 Plasmide Propriétés Hôte Référence pNIV4847 Contient la cassette d’expression codant pour ProDer p 1. Résistance à l’ampicilline. Contient la cassette d’expression codant pour la protéine fusion MBP-ProDer p 1 sous le contrôle du promoteur Ptac. Résistance à l’ampicilline. Réplicon pSH71 de Lactococcus lactis. Permet la fusion traductionnelle au promoteur nisA de L. lactis (PnisA). Site multiple de clonage. Resistance au chloramphénicol. Réplicon pLAB1000 de L. lactis. Contient le promoteur constitutif Pldh de L. plantarum. Résistance à l’érythromycine et ampicilline. Réplicon pSH71 de L. lactis. Contient le gène pepN de L. lactis sous la dépendance du promoteur PnisA de L. lactis. Resistance au chloramphénicol. Réplicon pLAB1000 de L. lactis. Contient le gène ldh de L. plantarum sous la dépendance du promoteur Pldh de L. plantarum. Résistance à l’érythromycine et ampicilline. Réplicon pSH71 de L. lactis. Permet la fusion traductionelle au peptide signal de sécrétion de la protéine Usp45 (SPUsp45) sous la dépendance du promoteur nisA de L. lactis. Contient le gène nuc de staphylococcus aureus fusionné à SPUsp (SPUsp45-NUC). Resistance au chloramphénicol. E. coli (455) pNIV4854 pNZ8037 pMEC127 pNZ8040 pGIT032 pSec:Nuc 82 E. coli Non publié L. plantarum (365) L. plantarum (448, 467) L. plantarum (365) L. plantarum (468, 469) L. plantarum (467) Tableau 9. Plasmides obtenus pour la production de Der p 1 par L. plantarum Plasmide obtenu Cassette importée Plasmide(s) d’expression Production Inductibilité - pMEC226 Der p 1 pMEC127 - pMEC227 Der p 1 tronqué (acides aminés1-166) pMEC127 - - pMEC228 Der p 1 fusionné à un fragment N-terminal de PepN (PepN-Der p 1) pNZ8040 - + pMEC229 Der p 1 fusionné à la LDH (LDH-Der p 1) pGIT032 - - pMEC230 Der p 1 pNZ8037 - + pMEC231 ProDer p 1 fusionné à la MBP (MBP-ProDer p 1) pNZ8037 + + pMEC232 ProDer p 1 fusionné à la LDH tronqué (LDH-ProDer p 1) pGIT032 - - pMEC233 SPUsp fusionné à ProDer p 1 (SPUsp-ProDer p 1) pSec:Nuc + + pMEC234 ProDer p 1 pNZ8037 - + Tableau 10. Stratégies de clonages utilisées Plasmide obtenu ADN matrice pMEC226 pNIV4847 pMEC227 pNIV4847 pMEC228 pNIV4847 pMEC229 pGIT032 Amorces PCR (5’ – 3’) TCATGACCAACGCCTGCAGTATCAACGGCAATGC Plasmide de sous-clonage Restriction(s) enzymatique(s) Produit PCR Plasmide d’expression pMOSblue BspHI XbaI NcoI XbaI pMOSblue BspHI XbaI NcoI XbaI pMOSblue EcoRI XhoI EcoRI XhoI pMOSblue BamHI PstI PvuII XbaI pMOSblue BspHI XbaI NcoI XbaI pMOSblue BspHI XbaI NcoI XbaI pMOSblue PvuII XbaI PvuII XbaI pMOSblue NsiI HindIII NsiI HindIII TCTAGACTCGAGGGGATCCTTTACAGG TCATGACCAACGCCTGCAGTATCAACGGCAATGC TCTAGATTACTGATATCCGTTGTCGCGCTGGATG GGAATTCACACCAACGCCTGCAGTATCAACGGC CCGCTCGAGTTACAGGATCACCACGTACGGG CAGCTGACGAACTCAAGAAGATGCAAGATTGC CTGCAGGCGTTGGTTTTATTTTCTAATTCAGCTAAACCGT C pMEC230 pNIV4847 TCATGACCAACGCCTGCAGTATCAACGGCAATGC TCTAGACTCGAGGGGATCCTTTACAGG pMEC231 pNIV4854 pMEC232 pNIV4847 pMEC233 pNIV4847 pMEC234 pNIV4847 CTAGTCATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGG GCTCTAGACTCGAGGGGATCCTTTACAGG CGCAGCTGACCGGCCGAGCTCCATTAAGACC TCTAGACTCGAGGGGATCCTTTACAGG CCAATGCATCACGGCCGAGCTCCATTAAGACC GATATCAAGCTTACAGGATCACCACGTACGGGTACT AATCATGAGACCGAGCTCCATTAAGACC pCR2.1-TOPO BspHI XbaI NcoI XbaI GCTCTAGACTCGAGGGGATCCTTTACAGG Dans le cas du vecteur pMEC229 des étapes supplémentaires ont été réalisées. L’insert préparé à partir du produit PCR obtenu selon conditions décrites au tableau 10 est transféré dans le vecteur pBS(SK+) (digestion enzymatiques des 2 vecteurs par BamHI et PstI). Dans le vecteur obtenu est inséré un autre fragment d’ADN issu du vecteur pMEC226 et correspondant à Der p 1 tronqué (digestion enzymatique des 2 vecteurs par PstI et XbaI). De cette fusion est produit un nouvel insert codant pour Der p 1 fusionné à un fragment Cterminal de la LDH. Cet insert est introduit dans le vecteur pGIT032 produisant ainsi le vecteur pMEC229 (digestion enzymatique des 2 vecteurs par PvuII et XbaI). Les différents plasmides obtenus sont introduits dans la souche L. plantarum NCIMB8826 Int-1 par électroporation. Cette souche possède les gènes NisR et NisK intégrés dans le locus tRNASer de son ADN chromosomique. La présence de ces deux gènes est nécessaire à 83 la production de protéines recombinantes. La souche contrôle non productrice est générée en transformant L. plantarum NCIMB8826 Int-1 par le plasmide pNZ8037. Préparation de souches L. plantarum produisant MBP-ProDer p 1 L’induction de la production de protéine recombinante par L. plantarum a été réalisée selon les protocoles standards(366) avec quelques modifications. La culture est préparée à partir d’une préculture sur la nuit de L. plantarum NCIMB8826 Int-1[pMEC240] arrivée à saturation. Les paramètres optimaux conduisant à une production maximale ont été recherchés (analyse par western blot). Le maximum de production de la protéine MBP-ProDer p 1 est atteint par induction de la souche recombinante à une DO600 de 0,15 et avec les paramètres de culture suivants: 37°C, 3 heures d’incubation, 50 ng/mL de nisine. Les bactéries sont ensuite récoltées par centrifugation (11 min à 2500 g, L. plantarum), lavées 2× (D-PBS) et reprises soit à 1011 CFU/mL (traitement prophylactique in vivo) soit à 1010 CFU/mL (études mécanistiques in vitro). Les concentrations en bactéries sont systématiquement vérifiées par dilutions sérielles de la culture à analyser (1 :10, PBS), mise en culture sur milieu sélectif solide et comptage des colonies de bactéries obtenues. La production d’antigène recombinant est systématiquement vérifiée par western blot. Analyse de la production de protéines recombinantes par L. plantarum L’analyse de la production intracellulaire de protéines recombinantes par L. plantarum nécessite de lyser les bactéries. Ceci peut se faire selon 2 techniques différentes : lyse au Cell Disrupter ou lyse alkaline. Au préalable, la culture de bactéries dont la production a été induite est centrifugée (15 minutes, 4000 g, 4°C). Les bactéries sont lavées en solution PBS, reprises à 2×109 CFU/mL (PBS) et stockée (20°C) jusqu’à analyse. L’analyse de la production de protéines recombinantes sécrétées se fait quant à elle par précipitation des protéines du milieu de culture. Lyse au Cell disrupter Le volume minimal à engager dans le Cell Disrupter est de 10mL. Ajouter le cocktail d’inhibiteurs de protéases (Complete, Boehringer Mannheim). Lyser les cellules par passage au Cell Disrupter (1,8 kbar, 4°C). Au besoin, stocker les lysats à -20°C jusqu’à analyse. Au besoin, la fraction soluble du lysat bactérien peut être séparée de la fraction insoluble par ultracentrifugation (150000 g, 40 minutes, 4°C). Lyse alkaline Protoplast lysis buffer : 375 mM Tris pH 7,6 ; 10% glycérol ; 2% SDS Centrifuger 300 µL de la culture de bactéries (15 minutes, 4000 g, 4°C). Reprendre les bactéries dans une solution de Tris 10 mM pH 8 additionnée de lysosyme (1 mg/mL). Incuber 30 minutes à 37°C Centrifuger (15 minutes, 4000 g) Laver les cellules dans une solution Tris 10 mM pH 8 (reprendre délicatement les bactéries) Centrifuger (15 minutes, 4000 g) Lyser les bactéries dans 30 µL de protoplast lysis buffer préparé extratemporanément. Au besoin, stocker les lysats à -20°C jusqu’à analyse. Précipitation de protéines Mélanger 1 mL de la solution contenant les protéines à 120 µL d’acide trichloroacétique. Incuber 30 minutes sur glace. Centrifuger (15 minutes, 16000 g). (Optionnel) Laver le culot 1× à l’acétone et 1× à l’éther pour éliminer l’acide trichloroacétique. Centrifuger (15 minutes, 16000 g). Reprendre le culot dans 40 µL d’une solution 1 M Tris pH 9,5. Au besoin, stocker les échantillons à -20°C jusqu’à analyse. Les westerns blots sont réalisées selon les techniques standards. Les bandes immunoréactives sont détectées par un sérum polyclonal de souris anti-ProDer p 1 (1 : 2000) ou un anticorps monoclonal de souris anti-MBP (New England Biolabs). Un anticorps antiIgG (souris) couplé à l’horseradish peroxidase (HRP) est utilisé comme anticorps secondaire. 84 Production et purification d’antigènes Extraits d’acariens Déposer 2 mg de culture épuisée d’acariens dans un tube à ultracentrifugation Lancer un premier cycle d’extraction : Ajouter 20 mL de D-PBS (Invitrogen). Placer le tube sur roue tournante pendant la nuit (4°C). Ultracentrifuger à 45000 rpm (120000 g, 40 minutes, 4°C). Récupérer le surnageant et le stocker à -20°C. Ajouter 20 mL de D-PBS et recommencer un cycle d’extraction. Après 7 cycles d’extraction, les échantillons sont dosés pour leur contenu en Der p 1 par ELISA (Indoor biotechnologie). Préparation d’extrait d’acarien pour nébulisation : Rassembler les différentes fractions extraites et ajuster la concentration finale à 10 µg/mL par ajout de D-PBS. Filtrer sur 0,2 µm. Stocker à -20° par aliquot de 14 mL. Der p 1 Der p 1 est purifié à partir d’extraits d’acariens comme décrit précédemment(456). Le mode opératoire est le suivant : Tampon éthylène glycol: 50% éthylène glycol ; 5 mM glycine pH 10 Equilibrer la colonne d’immunoaffinité (résine Activated CH4B Sepharose de Amersham couplé à l’anticorps 4C1 de Indoor Biotechnologie) avec du PBS. Charger les extraits d’acariens préalablement filtrés sur 0,2 µm. Laver la colonne par du PBS porté à 0,5 M NaCl. Eluer par du tampon éthylène glycol. Les fractions éluées sont neutralisées par ajout préalable de tampon phosphate 0,2 M pH 7 (Na2HPO4/NaH2PO4). Laver la colonne par du PBS. Rassembler les fractions les plus concentrées identifiées préalablement par analyse SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. Dialyser pendant la nuit contre du PBS. Après concentration du dialysat, doser les protéines par microBCA (Pierce), aliquoter la solution de protéines et stocker à -20°C. ProDer p 1 ProDer p1 est sécrété dans les surnageants de culture par des cellules CHO-K1 recombinantes(455) et est purifié comme décrit précédemment(455). Le mode opératoire est le suivant : Diluer les surnageants de cultures contenant ProDer p 1 (1 :1) avec de l’eau et ajuster à pH 7,2. Charger les surnageants modifiés sur colonne de Q sepharose fast flow (5×10 cm, Pharmacia) équilibrée en tampon 20 mM TrisHCl pH 7.2 et couplée à une colonne hydroxyapatite (2.6×15 cm, Bio-Rad) conditionnée dans le même tampon. Le flow-through des deux colonnes contenant ProDer p 1 est ajusté à pH 9 et chargé sur colonne Q sepharose fast flow (1.6×10 cm, Pharmacia) équilibrée en tampon 20 mM Tris-HCl pH 9. Laver la colonne avec le tampon de départ et avec le même tampon additionné de 100 mM NaCl. Eluer ProDer p 1 par un gradient NaCl linéaire (100-300 mM, 15 volumes colonnes). Rassembler les fractions enrichies en ProDer p 1 et les concentrer par ultrafiltration sur membrane Filtron (Omega serie, cut-off: 10 kD). Purifier ProDer p 1 en chargeant les fractions concentrées sur colonne de chromatographie d’exclusion superdex-75 (1×30 cm, Pharmacia) équilibrée par du PBS (pH 7,3). Après concentration des fractions éluées contenant ProDer p 1, doser les protéines par microBCA (Pierce), aliquoter la solution de protéines et stocker à -20°C. 85 MBP-ProDer p 1 Le mode opératoire est le suivant : Ensemencer du bouillon de culture LB avec ampiciline (37°C) par la souche E. coli[pNIV4854]. Incuber pendant la nuit jusqu’à saturation de la culture. Diluer la culture (1 :100) et cultiver à 37°C jusqu’à atteindre une DO600 de 0,4-0,6. Induire la production de MBP-ProDer p 1 par 0,3 M IPTG. Après 2 heures, centrifuger (15 minutes, 6000 g).. Reprendre les culots dans 20 mM Tris-HCl pH 7.5 Ajouter le cocktail d’inhibiteurs de protéases (Complete, Boehringer Mannheim). Lyser les cellules par passage au Cell Disrupter (1,8 kbar, 4°C). Ultracentrifuger le lysat (150000 g, 40 minutes). Reprendre le culot dans 20 mM Tris-HCl pH 7.5. Ultracentrifuger le lysat (150000 g, 40 minutes). Reprendre le culot dans 20 mM Tris-HCl pH 7.5 ; 6 M urée. Extraire les protéines du culot en plaçant sur roue tournante pendant la nuit (4°C). Ultracentrifuger le lysat (150000 g, 40 minutes). Dialyser le surnageant pendant la nuit contre 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA. Après centrifugation, appliquer la solution de protéine sur résine d’amylose (NEB) équilibrée dans le même tampon. Après lavage de la colonne par le même tampon, éluer par addition de 10 mM maltose dans le même tampon. Après concentration des fractions éluées contenant MBP-ProDer p 1, doser les protéines par microBCA (Pierce), aliquoter la solution de protéines et stocker à -20°C. Animaux Des souris femelles Balb/c et C57BL/6 (agées de 6 semaines) ont été obtenues chez Harlan. Les souris déficientes pour TLR2, TLR9, MyD88, CD14 et CD36 (fond génétique C57BL/6) nous ont été généreusement fournies par le Dr S. Akira (TLR2, TLR9, MyD88 K.O.), Dr M. Moser (CD14 K.O.) et Dr P. Besnard (CD36 K.O.). Les expérimentations animales ont été réalisées en accordance avec les directives légales (licence de laboratoire n°LA 1500474). Traitement prophylactique par L. plantarum recombinant dans un modèle expérimental d’allergie à Der p 1 Saignées Prétraitement Jours 0-3 Sensibilisation 6-10 8 × i.n. Lp rec ou contrôles 17 24 31 3 × Der p 1 / Alum 38 Inflamation pulmonaire 43-45 47 48 4 × nébulisation d’extraits de D. pteronyssinus Figure 34. Schéma de traitement par L. plantarum recombinant (prophylaxie) dans un modèle expérimental d’allergie à Der p 1. i.n. : intranasal, Lp rec : L. plantarum recombinant Tampon ACK : 0,15 M NH4Cl ; 0,1 mM EDTA; 1 mM KHCO4 Milieu de culture complet: RPMI 1640 2 mM L-glutamine 1% sérum de souris Pénicilline/Streptomycine 1 mM pyruvate de sodium acides aminés non essentiels 0,05 mM -mercaptoéthanol 86 Prélèvements Le schéma de traitement est détaillé à la figure 33. 109 CFUs (15 µL/narine) de bactéries recombinantes L. plantarum, de bactéries contrôles L. plantarum seules, en coadministration de 10 µg de MBP-ProDer p 1 purifié ou une solution saline (PBS) sont administrés par voie intranasale (15 µL/narine) à des souris Balb/c femelles (6 semaines, n= 9-10) sous anesthésie. L’expression de MBP-ProDer p 1 est vérifiée pour toutes les préparations de bactéries recombinantes administrées (figure 35). Les souris sont anesthésiées par injection intrapéritonéale du mélange suivant : 30 µL Ketalar, 10 µL Rompun, 260 µL d’eau LAL. 7 jours après le dernier traitement intranasal (jour 17), les animaux sont sensibilisés à Der p 1 par voie intrapéritonéale (3 injections à 1 semaine d’intervalle, 2 µg de Der p 1 formulée dans l’alum, ratio allergène/adjuvant : 1/50). L’inflammation pulmonaire est ensuite induite au 43ème jour en exposant les souris à des aérosols d’extraits de cultures épuisées de D. pteronyssinus contenant 10 µg/mL de Der p 1 pendant 4 jours (30 minutes/jour). Les séra des souris sont récoltés le 38ème jour. Au 48ème jour les rates sont prélevées individuellement tandis que les ganglions médiastinaux sont collectés par groupes de 2 souris. Après dissociation mécanique des cellules de rates ou de ganglions, les globules rouges présents sont lysés par traitement au tampon ACK. Les cellules isolées à partir des ganglions et des rates sont ensuite ensemencées respectivement à 2 × 105 ou 3 × 105 cellules/puits en plaque 96 puits à fond rond en triplicat. La réponse cellulaire est induite par restimulation antigénique comme décrit précédemment(456). La thymidine triciée est ajoutée 48 heures après mise en culture des cellules et stimulation cellulaire (doses croissantes de ProDer p 1 correspondant à 0 ; 1,25 ; 5 ; 20 µg/mL). Après 16 heures d’incubation les taux d’incorporation de thymidine sont mesurés par dosage de la radioactivité (récolte au Cell Harvester et lecture au compteur beta, PerkinElmer). Les surnageants de cultures sont récoltés 72 heures après mise en culture et stimulation des cellules (20 µg/mL ProDer p 1). Ces surnageants sont stockés jusqu’à analyse à -80°C après clarification par centrifugation. Mode opératoire d’immunisation et analyse de la réponse allergène spécifique Jours 0 14 Lp rec ou contrôles / Alum 28 Lp rec ou contrôles / Alum 35 Prélèvements Lp rec ou contrôles / Alum Figure 36. Schéma d’immunisation par L. plantarum recombinant Le schéma de traitement est détaillé à la figure 35. 109 CFUs de bactéries recombinantes L. plantarum intactes ou lysées au Cell Disrupter (1,8 kbar, 4°C), de bactéries contrôles L. plantarum seules ou en coadministration de 10 µg de MBP-ProDer p 1 purifié, de ProDer p 1 purifié ou une solution saline (PBS) sont administrés (formulation dans 100 µg d’Alum) à des souris Balb/c femelles (6 semaines, n= 6) sous anesthésie. L’expression de MBP-ProDer p 1 est vérifiée pour toutes les préparations de bactéries recombinantes administrées (figure 35). Les souris sont anesthésiées par injection intrapéritonéale du mélange suivant : 30 µL Ketalar, 10 µL Rompun, 260 µL d’eau LAL. Les souris sont immunisées à J0, 14 et 26 tandis que le sang et les rates sont prélevés à J35. Les cellules isolées des rates sont mises en culture selon le même mode opératoire que pour l’étude des propriétés prophylactiques de L. plantarum recombinant dans un modèle expérimental d’allergie à Der p 1 (cf. supra). L’analyse de la réponse immune est également identique. Test ELISAs Les titres anticorps, exprimés en unités arbitraires ELISA (U.A.E.), correspondent pour chaque échantillon à la valeur de la dilution produisant une DO410 à 50% de la valeur maximale. Les titres sont calculés à partir du logiciel Prism (Graphpad) Tampon phosphate : 10 mM Phosphate de sodium pH 6.4 Tampon carbonate : 0,1 M Carbonate de Na pH 9,5 Tampon TBS : 0,05 M Tris pH 7,5 ; 0,15 M NaCL Tampon diéthanolamine : Mélanger : 97 mL diéthanolamine ; 0,101 g MgCl2.6H2O ; 0,2 g NaN3 Ajuster à pH 9,8 (HCl 1 M) Analyse de la production IgG ProDer p 1-spécifique Ajouter 100 µL/puits (plaques 96 puits pour test ELISA, Nunc maxisorb) de tampon Phosphate contenant 5 µg/mL de ProDer p 1. Incuber pendant la nuit (4°C). Laver les plaques 3× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/ puits de solution de saturation (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). 87 Incuber 1 heure (37°C). Ajouter les séra à tester aux dilutions désirées (100 µL/puits ; TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 100 µL/puits d’une dilution 1 : 2000 (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) d’anticorps anti-IgG couplé à la phosphatase alcaline (Sigma, #A-9316) Incuber 30 minutes (37°C). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/puits de solution de révélation. Incuber 30 minutes (température ambiante). Ajouter 40 µL de NaOH 3 M. Lire les densités optiques : (longueur d’onde de travail : 410 nm ; longueur d’onde de référence : 630 nm). Analyse de la production IgG2a et IgG1 ProDer p 1-spécifique Ajouter 100 µL/puits (plaques 96 puits pour test ELISA, Nunc maxisorb) de tampon Phosphate contenant 5 µg/mL de ProDer p 1. Incuber pendant la nuit (4°C). Laver les plaques 3× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/ puits de solution de saturation (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Ajouter les séra à tester aux dilutions désirées (100 µL/puits ; TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 100 µL/puits d’une dilution 1 : 7000 (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) d’anticorps monoclonal biotinilé anti-IgG2a (Biosource, #AMI2329) ou anti-IgG1 (Biosource, #AMI2319). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 100 µL/puits d’une dilution 1 : 1000 (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline (Amersham, #RPN1234). Incuber 30 minutes (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/puits de solution de révélation. Incuber 30 minutes (température ambiante). Ajouter 40 µL de NaOH 3 M. Lire les densités optiques : (longueur d’onde de travail : 410 nm ; longueur d’onde de référence : 630 nm). Analyse de la production IgE ProDer p 1-spécifique Ajouter 100 µL/puits (plaques 96 puits pour test ELISA, Nunc maxisorb) de tampon carbonate contenant 5 ng/mL d’anticorps (rat) anti-IgE (Southern Biotechnology Associates, #1130-01, 1 :100). Incuber pendant la nuit (4°C). Laver les plaques 3× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/ puits de solution de saturation (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Ajouter les séra à tester aux dilutions désirées (100 µL/puits ; TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/puits de solution de saturation (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) contenant 5 µg/mL de ProDer p 1. Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). 88 Ajouter 100 µL/puits d’une dilution 1 : 1000 (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) d’anticorps monoclonal biotinilé 4C1 (Indoor Bio, # MA-4C1-1). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 100 µL/puits d’une dilution 1 : 1000 (TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA) de streptavidine couplée à la phosphatase alcaline (Amersham, #RPN1234). Incuber 30 minutes (37°C). Laver les plaques 5× (TBS 0,1% Tween 80). Ajouter 150 µL/puits de solution de révélation. Incuber 30 minutes (température ambiante). Ajouter 40 µL de NaOH 3 M. Lire les densités optiques : (longueur d’onde de travail : 410 nm ; longueur d’onde de référence : 630 nm). Analyse de la production d’IFN- Ajouter 50 µL/puits (plaques 96 puits pour test ELISA, Nunc maxisorb) de tampon carbonate contenant 1,5 µg/mL d’anticorps anti-IFN- murin (BD). Incuber pendant la nuit (4°C). Laver les plaques 3× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 150 µL/ puits de solution de saturation (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Ajouter les échantillons à tester aux dilutions désirées (50 µL/puits ; TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Réaliser 7 dilutions sérielles (1 :2) d’une solution standard d’IFN- (BD, # 554587)à partir de 4,5 ng/mL et un blanc. Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 4× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 50 µL/puits d’une dilution 1 : 1000 (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA) d’anticorps monoclonal biotinilé anti- IFN- (BD, #554410). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 4× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 50 µL/puits d’une dilution 1 : 5000 (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA) de streptavidine couplée l’HRP (Amersham, # AX01-0401X). Incuber 30 minutes (37°C). Laver les plaques 8× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 50 µL/puits de solution de TMB (Sigma, # T8665). Incuber 20 minutes (température ambiante). Ajouter 50 µL d’H2SO4 0,4 M. Lire les densités optiques : (longueur d’onde de travail : 450 nm ; longueur d’onde de référence : 630 nm). Analyse de la production d’IL-5 Ajouter 50 µL/puits (plaques 96 puits pour test ELISA, Nunc maxisorb) de tampon carbonate contenant 1 µg/mL d’anticorps antiIL-5 murin (BD). Incuber pendant la nuit (4°C). Laver les plaques 3× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 150 µL/ puits de solution de saturation (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA). Incuber 1 heure (37°C). Ajouter les échantillons à tester aux dilutions désirées (50 µL/puits ; TBS 0,1% Tween 80 ; 1% BSA). Réaliser 7 dilutions sérielles (1 :2) d’une solution standard d’IL-5 (BD, # 554581) à partir de 2 ng/mL et un blanc. Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 4× (TBS 0,05% Tween 20). 89 Ajouter 50 µL/puits d’une dilution 1 : 500 (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA) d’anticorps monoclonal biotinilé anti- IL-5 (BD, # 554397). Incuber 1 heure (37°C). Laver les plaques 4× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 50 µL/puits d’une dilution 1 : 5000 (TBS 0,05% Tween 20 ; 1% BSA) de streptavidine couplée l’HRP (Amersham, # AX01-0401X). Incuber 30 minutes (37°C). Laver les plaques 6× (TBS 0,05% Tween 20). Ajouter 50 µL/puits de solution de TMB (Sigma, # T8665). Incuber 20 minutes (température ambiante). Ajouter 50 µL d’H2SO4 0,4 M. Lire les densités optiques : (longueur d’onde de travail : 450 nm ; longueur d’onde de référence : 630 nm). Lavages bronchoalvéolaires Les poumons de souris sont lavés 3× par 1 mL HBSS (sans Ca, Mg) 0,5 mM EDTA 5% BSA (administration intratrachéale). Centrifuger les cellules (10 minutes, g, 4°C). Reprendre les cellules dans 300 µL de tampon HBSS 2% sérum. Compter les cellules à l’hémocytomètre (coloration au bleu trypan). Monter les lames (cytoslide, Shandon) de microscope dans le cytofunnel (Shandon). Déposer 100 µL d’une suspension cellulaire (30000 cellules/mL) sur lame. Centrifuger 3 minutes à 300 rpm dans le cytospin (Shandon). Colorer les lames par immersion dans un bain de May-Grünwald (Sigma) pendant 4 minutes. Laver dans un bain de tampon Weise (pH 6,8 ; VWR). Colorer les lames par immersion dans un bain de Giemsa (Gurr's Giemsa R66, VWR) dilué (33 mL Gurr's Giemsa R66 ; 172 mL tampon Weise) pendant 15 minutes. Laver brièvement à l’eau distillée. Laisser sécher. Monter une lamelle en déposant une goutte de liquide de montage (Eukitt, VWR) sur la lame. Dénombrer les populations cellulaires au microscope. Préparation de cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes Les DCs ont été obtenues à partir du sang de sujets sains comme décrit précédemment. Ces donneurs sont sélectionnés sur la base d’un taux sérique d’anticorps IgE totaux < 20 kU/L et d’une absence d’anticorps Der p 1 spécifiques (< 0,35 kU/L). Après centrifugation du sang (120 g) la phase supérieure du sang correspondant à du plasma riche en plaquettes est éliminée. La fraction résiduelle est diluée dans du RPMI 1640 (1:1) et déposé sur un gradient de Ficoll. Après centrifugation (400 g), les PBMCs sont recueillies, lavées et resuspendues dans une solution PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA. Les PBMCs sont ensuite incubées avec des billes magnétiques couplées à un anticorps antiCD14 (Miltenyi Biotec) suivant les recommandations du fabricant. Après lavage, les cellules sont disposées sur une colonne placée dans un séparateur MACS (Miltenyi Biotec). La fraction éluée CD14+ est resuspendue dans du milieu RPMI 1640 10% SVF additionné d’antibiotiques. Les cellules sont ensuite ensemencées en plaques 6 puits à 3 × 106 cellules/puits (3 mL) dans du milieu RPMI 1640 10% SVF, 20 ng/mL GM-CSF humain, 200 IU/mL IL-4 humain et additionné d’antibiotique pendant 6 jours. Au bout de cette période plus de 95% de la population cellulaire était de phénotype CD14- CD1a+ HLA-DR+ CD80/C86low. Afin d’isoler les lymphocytes T naifs (CD4+ CD45RA+) et T mémoires (CD4+ CD45RO+) la fraction CD14- précédemment éluée est incubée avec un mélange d’anticorps biotinylés (anti-CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR γ/δ et Glycophorin A) additionné soit d’anticorps anti-CD45RO soit d’anticorps anti-CD45RA et de billes magnétiques couplées à la streptavidine (Miltenyi Biotec). Après lavage, les cellules sont disposées sur une colonne placée dans un séparateur MACS (Miltenyi Biotec).et la fraction négative est récoltée. Les lymphocytes T sont ensuite congelés jusqu’à utilisation dans un milieu SVF 10% DMSO et stockés à -80°C. 90 Activation des MD-DCs Les MD-DCs (1×106 cellules /puits, 1 mL en 48 puits) sont stimulées en milieu RPMI 1640 10% SVF, 150 µg/mL gentamycine 6 par 10×10 bactéries, MBP-ProDer p 1 purifié (100 ng/mL), ces 2 stimuli simultanément ou du LPS (1µg/mL) utilisé comme contrôle positif de maturation. Après 24 heures de stimulation les surnageants de cultures sont prélevés, centrifugés avant stockage à -80°C et les CDs sont récoltées. Les productions d’IL-10 et d’IL-12 p70 sont par la suite analysées par ELISA (Diaclone). Une fraction des CDs est lavée 2 fois en solution PBS 2% SVF et incubée pendant 30 minutes sur glace avec les anticorps suivants : anti-CD86 couplé à l’APC, anti-CD80 couplé au PE, anti-HLA-DR couplé au cychrome et anti-CD40 couplé au FITC ou les isotypes contrôles correspondants (anticorps irrelevants couplés aux mêmes fluorochromes). Après lavages les cellules sont fixées à la PFA (1%) et analysées par la suite au cytomètre de flux (FACS Calibur). Une fraction des MD-DCs stimulées est incubées avec les lymphocytes T mémoires (CD4+ CD45RO+) ou naïfs (CD4+ CD45RA+) autologues précédemment isolés et marqués au CFSE à un ratio de 1:10 (MD-DC:T). Le marquage au CFSE s’effectue par incubation des lymphocytes T dans une solution PBS, 0,1 mM CFSE pendant 10 minutes à 37°C. Cette étape est suivie d’un lavage des cellules 2 fois en milieu RPMI 1640 10% SVF. Après un temps d’incubation de 2 et 5 jours, respectivement, les surnageants de co-cultures MD-DC-T sont recueillis et centrifugés avant stockage à -80°C. La production d’IL-10, d’IL-4, d’IL-5 et d’IFN-de ces échantillons est par la suite testée par ELISA (Diaclone). Les cellules sont recueillies et marquées par un anticorps anti-CD3 couplé au cychrome. La prolifération cellulaire des cellules CD3+ est évaluée par cytométrie de flux. L’index de stimulation correspond au rapport du pourcentage de cellules CD3+ CFSE+en prolifération sur le pourcentage total de cellules CD3+ CFSE+. Préparation de cellules dendritiques murines à partir de la moelle osseuse Après sacrifice des souris, leurs pattes postérieures sont dépiautées et détachées du tronc. Le fémur et le tibia des 2 pattes sont disloqués et isolés des muscles. Après section du col du fémur et de l’extrémité distale du tibia, la moelle osseuse est récoltée par injection de PBS dans les os, désagrégée mécaniquement, et passée sur tamis cellulaire (ouverture de maille de 70 µm). Après traitement par tampon ACK et lavage des cellules en milieu RPMI 1640 10% SVF, les cellules de moelle osseuses sont ensemencées en plaques 6 puits à 1,2×106cellules/mL (4 mL) en milieu RPMI 1640 complet (2 mM L-glutamine, 10% SVF, 150 µg/mL gentamycine, 20 ng/mL GM-CSF murin, 1 mM pyruvate de sodium, 0,05 mM -mercaptoéthanol, acides aminés non essentiels). A J3 un volume de 4 mL/puits de milieu complet est ajouté tandis qu’à J6 et J8 un volume de 4 mL/puits est renouvelé. Les BMDCs sont différentiées et utilisées à J9. Au bout de cette période plus de 95% de la population cellulaire était de phénotype CD11c+ CMHII+ (Balb/c, I-Ad+ ; C57BL/6, I-Ek+) CD80/CD86low Activation des BMDCs Les cellules sont ensemencées en plaques 24 puits (1×106 cellules/puits, 1 mL) et stimulées pendant 24 heures avec 10×106 CFU de bactéries en milieu BMDC complet. Comme contrôle, les BMDC ont été stimulées à l’aide de Pam2CysSerLys4 (100 ng/mL), CpG ODN 1826 (1µg/mL) ou du LPS (0,1 µg/mL). Lorsque c’est précisé, les BMDCs ont été prétraitées 1 heure avec des inhibiteurs de MAPKs (U0126, 25µM; SB203580, 25µM; SP6001125, 25µM) ou de la voie NF-B (MG132, 25µM; BAY-11–7082, 25µM). Dans ce cas-ci, les BMDCs ont été stimulées pendant 6 heures avec 100×106 CFU de bactéries. Après stimulation, les surnageants de cultures sont collectés et centrifugés avant stockage à -80°C. Ces échantillons sont testés par la suite pour l’IL-12 p40, l’IL-12p70, l’IL-10, et le TNF- par ELISA (Becton Dickinson). Les BMDCs stimulées sont recueillies, lavées 2× en solution PBS 2% SVF et incubées pendant 30 minutes sur glace avec les anticorps suivant: anti-CD40, CD86, CD80 ou I-Ad couplés au PE et anti-CD11c couplé au FITC (Becton Dickinson). Après 2 lavages les cellules sont fixées à la PFA (1%) pour ensuite être analysées par cytométrie de flux (FACS Canto, Becton Dickinson). Capture de bactéries marquées Les étapes de marquage et de capture s’effectuent à l’obscurité. Les bactéries (109 CFU/mL) sont marquées au FITC (0,5 mg/mL à partir d’une solution stock 10 mg/mL en DMSO) en tampon PBS (1 heure, température ambiante) comme décrit précédemment(391). Les bactéries marquées sont lavées 3×. Les BMDCs immatures (106 cellules) générées à partir de souris sauvages C57BL/6 ou déficientes pour CD14 ou CD36 (fond génétique C57BL/6) sont incubées avec 100×106 CFU de bactéries marquées dans un volume de 1 mL pendant les temps spécifiés (37°C) en tampon PBS 0,5 % BSA. Après lavage, les BMDCs sont analysées par cytométrie de flux. Les réglages d’acquisition des données sont sélectionnés pour exclure les bactéries sur la base de leurs valeurs « forward scatter » et « side scatter ». Analyse statistique Les données sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM). Les analyses statistiques sont effectuées à l’aide du test t de Student. 91 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. Johansson SG, Bieber T, Dahl R, Friedmann PS, Lanier BQ, Lockey RF, et al. 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