Détermination CMI
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ÉTUDE DE LA SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES : DÉTERMINATION DE LA CMI Un antibiotique est : • une substance naturelle ou synthétique • capable d’empêcher la multiplication de certaines bactéries (bactériostatique) ou de les détruire (bactéricide) • de mode d’action spécifique • actif à des concentrations faibles (de l’ordre du !g par mL ou mg/L) 1. Effets des antibiotiques sur la croissance bactérienne 1.1. Courbes expérimentales Logarithme de la concentration bactérienne exprimée en bactéries viables par mL Courbe de croissance SANS antibiotique 10 Les antibiotiques utilisés en pathologie humaine sont en général peu toxiques pour les cellules eucaryotes supérieures. Certaines antibiotiques antibactériens comme les sulfamides sont aussi actifs contre certains parasites eucaryotes (toxoplasme, Plasmodium du paludisme,…). La classification des antibiotiques n’est pas aisée mais est principalement basée sur leur nature biochimique. Le mode d’action des antibiotiques fait l’objet d’un chapitre dans le cours de Microbiologie de Terminale. Classe d’antibiotiques Exemples Aminosides Streptomycine, kanamycine, gentamicine, Tobramycine, Amikacine Noyau de type pénicilline ß-lactamines Pénicilline G, Pénicillines A (ampicilline, amoxicilline,…) Penicilline M (oxacilline,…) Mécillinam Ticarcilline Pipéracilline … Noyau de type céphalosporine Céphalosporines de 1ère génération : céfalotine,… Céphalosporines de 2ème génération : céfuroxime, céfoxitine,… Céphalosporines de 3ème génération : céfotaxime,… … 9 1 !g/mL 10 8 2 !g/mL 10 BACTÉRIOSTASE 7 10 4 !g/mL 6 Temps en heures 10 CMI 5 8 !g/mL Inoculum BACTÉRICIDIE 16 !g/mL Figure 2 : évolution de la croissance bactérienne en fonction du temps à différentes concentrations d’antibiotique 1.2. Notion de bactériostase et de bactéricidie Fosfomycine Fosfomycine Glycopeptides Vancomycine 1.2.1. Bactériostase Macrolides et apparentés Macrolides vrais : érythromycine, josamycine,… Lincosamides : lincomycine,… Streptogramines : pristinamycine,… Nitrofuranes Nitrofurantoïne Phénicolés Chloramphénicol Polypeptides Bacitracine, colistine, polymyxine Pour de faibles concentrations en antibiotique, la concentration bactérienne augmente mais d’autant plus lentement que la concentration en antibiotique augmente ; la croissance bactérienne est ralentie mais la concentration bactérienne en période stationnaire est inchangée. On dit que l’antibiotique a un effet bactériostatique. La bactériostase correspond à l’arrêt de la multiplication des bactéries. Quinolones Quinolones de 1ère génération :acide nalidixique,… Quinolones de 2ème génération ou fluoroquinolones : norfloxacine,… Sulfamides et sulfones Sulfaméthoxazole Triméthoprime,… Tétracyclines ou cyclines Tétracycline,… 1.2.2. Bactéricidie Pour de fortes concentrations en antibiotique, la concentration bactérienne diminue et ceci d’autant plus vite que la concentration en antibiotique augmente audessus d’une certaine valeur seuil. On dit que l’antibiotique a un effet bactéricide. La bactéricidie correspond à la destruction des bactéries. Figure 1 : principaux antibiotiques et leur classification C. LARCHER Détermination CMI – Page 1 / 6 – C. LARCHER Détermination CMI – Page 2 / 6 – 1.3. Notion de CMI On peut représenter la CMI de la manière suivante : Entre bactériostase et bactéricidie existe une concentration en antibiotique pour laquelle la concentration bactérienne ne varie sensiblement pas par rapport à celle de départ. Cette concentration difficile à déterminer par cette méthode correspond à la concentration minimale inhibitrice ou CMI. La CMI est la plus petite concentration en antibiotique pour laquelle la croissance bactérienne n’est plus visible, in vitro (pas de croissance mais 100 % des bactéries survivantes). À partir de la courbe de la figure 2, on peut tracer la courbe de la figure 3 en se plaçant à un temps fixé (pointillé vertical sur la figure 2). Cette courbe décrit alors l’évolution de la concentration bactérienne en fonction de la concentration en antibiotique. L’intersection de la courbe avec l’axe des abscisses permet de déterminer avec une relative précision la CMI. Logarithme de la concentration bactérienne exprimée en bactéries par mL 10 9 10 8 Présence de culture bactérienne CMI Absence de culture bactérienne 1.4. Notion de sensibilité et de résistance 1.4.1. Concentrations critiques inférieure et supérieure La CMI permet d’apprécier in vitro la sensibilité d’une souche vis-à-vis d’un antibiotique mais elle ne reflète pas la réalité thérapeutique. Sur le plan thérapeutique, des études statistiques chez un nombre significatif d’individus permettent de déterminer deux valeurs caractéristiques des concentrations plasmatiques obtenues suite à l’administration d’une posologie recommandée d’antibiotique : • la concentration critique inférieure (CCinf ou c) représente la concentration plasmatique moyenne minimale habituellement obtenue chez un patient suite à l’administration d’une posologie recommandée d’antibiotique • la concentration critique supérieure (CCsup ou C) représente la concentration plasmatique moyenne maximale habituellement obtenue chez un patient suite à l’administration d’une posologie recommandée d’antibiotique 1.4.2. Souche sensible CCinf 10 CCsup 7 Présence de culture bactérienne 10 6 Concentration en antibiotique (en !g/mL) 10 5 1 2 4 8 16 CMI Absence de culture bactérienne Si CMI " CCinf, la souche est sensible car dans l’organisme, les bactéries sont en contact avec une concentration en antibiotique supérieure à la CMI où leur croissance est inhibée. 1.4.3. Souche résistante CMI CCinf Figure 3 : évolution de la croissance bactérienne en fonction de la concentration en antibiotique CCsup Présence de culture bactérienne CMI Absence de culture bactérienne Si CMI > CCsup, la souche est résistante car dans l’organisme, les bactéries sont en contact avec une concentration en antibiotique inférieure à la CMI où leur croissance n’est pas inhibée. C. LARCHER Détermination CMI – Page 3 / 6 – C. LARCHER Détermination CMI – Page 4 / 6 – 1.4.4. Souche intermédiaire 2.2. Méthode en milieu gélifié CCsup CCinf Présence de culture bactérienne CMI Absence de culture bactérienne Si CCinf < CMI " CCsup, la souche est intermédiaire car dans l’organisme, les bactéries sont en contact avec une concentration en antibiotique où il n’est pas possible de dire s’il y aura croissance ou non. Certains microbiologistes préfèrent dans ce cas-là rendre la souche résistante. 2. Détermination de la CMI Déterminer la CMI consiste à déterminer la concentration en antibiotique inhibant la croissance bactérienne. Les dilutions d’antibiotique sont incorporées dans des géloses de Mueller-Hinton maintenues en surfusion qui sont ensuite coulées en boîte de Pétri. Chaque boîte contient une concentration d’antibiotique différente. La surface de la gélose est ensemencée par des stries de suspension à environ 105 bactéries par mL à l’aide d’une anse calibrée de 10 !L. Une dizaine de souches peuvent être testées sur une boîte. La CMI correspond à la plus petite concentration en antibiotique qui inhibe la croissance bactérienne (aucune colonie sur la strie). 2.3. Méthode Etest® Une bandelette est imprégnée de quantités croissantes d’antibiotique. Elle est placée sur une gélose pour antibiogramme ensemencée classiquement (voir TP 9 : antibiogramme standard) ; l’antibiotique diffuse en formant un gradient de concentration : la zone d’inhibition a la forme d’une ellipse et la lecture est alors directe sur la bandelette là où celle-ci rencontre la zone d’inhibition. 2.1. Méthode de dilution en milieu liquide En milieu liquide, la croissance bactérienne se visualise par un trouble ou un culot bactérien. On réalise une gamme d’antibiotique de concentrations décroissantes par dilutions successives de raison 1/2 à partir d’une solution mère d’antibiotique. 2.1.1. Préparation d’un inoculum à 105 bactéries par mL (absence de trouble) L’inoculum bactérien est préparé à partir d’une culture de 24 h en milieu liquide. Introduire 0,1 mL (3 gouttes de pipette Pasteur) d’une culture de 24 heures de la souche étudiée dans 25 mL de bouillon Mueller-Hinton. Au final, cette suspension correspond à une concentration bactérienne de 105 à 6 10 bactéries par mL et constitue l’inoculum. 2.1.2. En macrométhode Figure 4 : schéma de la méthode Etest® La gamme d’antibiotique est réalisée en tubes à hémolyse. L’inoculum standard est mis en contact avec des concentrations croissantes en antibiotique. Après 24 heures d’incubation à 37 °C, la CMI correspond à la concentration en antibiotique du premier tube ne présentant ni trouble ni culot bactérien. Voir protocole du TP 8 : détermination de la CMI en milieu liquide 2.1.3. En microméthode La gamme d’antibiotique est réalisée en microplaque de 96 puits à fond en U. L’inoculum standard est mis en contact avec des concentrations croissantes en antibiotique. La CMI correspond à la concentration en antibiotique du premier puits ne présentant ni trouble bactérien ni culot bactérien. Voir protocole du TP 8 : détermination de la CMI en milieu liquide C. LARCHER Détermination CMI – Page 5 / 6 – Bibliographie : • Activités technologiques en Microbiologie Terminale BGB de G. Leyral, C. et J.N. Joffin, E. Verne-Bourdais, J.P. Larpent (CRDP Aquitaine 1994) • Microbiologie technique Tome 1 Dictionnaire des techniques de J.N. Joffin et G. Leyral (CRDP Aquitaine 2006) • Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Recommandations 2007 http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2 • Image de l’Etest® : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq/figcinq.html C. LARCHER Détermination CMI – Page 6 / 6 –
