Translecture - Sciencesconf.org

Etude du processus de translecture
chez S. cerevisiae
par spectrométrie de masse
David Cornu
La terminaison de la traduction
4. Recyclage
1.
2.
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
3.
Translecture et terminaison chez S. cerevisiae
Terminaison
ERREURS DE TRADUCTION DES
PROTEINES
Type
spontanées
Cible
tous les ARNm
contexte
programmés
spécifiques
Fréquence
< 10-4
compétition
0.5
tRNA suppresseur
Translecture
Codon
stop
 Le taux de translecture dépend du contexte nucléotidique du condon stop
Namy et al.,EMBO Rep, 2001, p 787-793
 Mécanismes moléculaires encore peu connus
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Intérets thérapeutiques de la translecture
traitement de maladies a codons stops prematures
Protéine
tronquée
AUG
stop
codon stop
prématuré
Myopathie de Duchenne
Mucoviscidose
Cancers
Protéine
entière
AUG
Translecture
Activité ?
 L’activité de la protéine dépend de la nature de l’acide aminé inseré
 Il est essentiel d’établir des règles prédictives de la nature de l’acide aminé
incorporé
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Etude de la translecture par spectrométrie de masse
● Identification des acides aminés incorporés au niveau des 3
codons stops UAA, UAG et UGA lors de la translecture
● Fréquence d’insertion des acides aminés au niveau de
chaque codon stop
● Influence du contexte nucléotidique du codon stop sur la
nature et le taux d’incorporation des acides aminés de
translecture
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Strategie analytique
QUANTIFICATION RELATIVE
DES PEPTIDES DE
TRANSLECTURE
IDENTIFICATION DES
ACIDES AMINES
INCORPORES POUR
CHAQUE CODON
STOP
²
TAUX
D’INCORPORATION IN
VIVO DES ACIDES
AMINES POUR CHAQUE
CODON STOP
+
DETERMINATION DES
FACTEURS CORRECTIFS
ANALYSE DES MELANGES PEPTIDIQUES ISSUS PROTEOLYSE IN-GEL
nanoLC-MS
(QTOF-Premier)
nanoLC-MS/MS
(QTOF-Premier, LTQ-Orbitrap)
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Expression et purification des protéines
issues de la translecture
• Construction d’un système rapporteur
GST
Promoteur
Sequence de translecture
AUAAAAAAUGAATAACAAAUAAACAAC
TAG
TGA
• Purification des protéines de translecture sur colonne d’affinité et gel d’éléctrophorèse
UAA
UAG UGA
25 kDa
coloration à l’argent
GQINNLSPILGYWK
MAREIKNEKQINNLSPILGYWK
MAREIKNERQINNLSPILGYWK
Q
...
X
MAREIKNE
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
GST
GST
GST
Détermination des acides aminés de translecture en
fonction du codon stop
UAA
UAG UGA
25 kDa
c
nanoLC-MS/MS apres digestion enzymatique par Trypsine ou LysN
Identification des peptides chevauchant le site de translecture
Codon Stop
UAA
UAG
UGA
Acide aminés
incorporés
Q, Y, K
Q, Y, K
C, W, R
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Spectres MS/MS des peptides de translecture
• Spectre MS/MS QTOF après trypsine
K
W
Y
G
L
I
P
100
876.52
b7
y7
NEQQINNLSPILGYWK
NEYQINNLSPILGYWK
QINNLSPILGYWK
UAA
Trypsine
L
N
N
I
Y
Q
1304.75
y11
EN
yMax
NEYQINNLSPILGYWK
244.10
b2
407.17
b3
553.30
y4
1417.84
y12
666.39
y5
KNEQQINNLSPILGYW
KNEYQINNLSPILGYW
KQINNLSPILGYW
LysN
S
963.57
y8
%
535.24
b4
333.21
292.14 y2
136.08
Y
1076.65
b9
y9
648.34
b5
216.11
a2
1305.83
877.58
496.28
y3
431.17
1190.72
y10
964.63
631.31
101.08
Q
K
859.39
730.42
955.52
858.51
1287.70
989.52
b8 1077.72
1418.92
1400.85
1191.64
1545.91
y13
1315.73
1173.70
b10
1708.97
y14
1547.00
1691.96
1527.96
1710.07
1952.10(M+H) +
1918.07
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
1952.98
M/z
2000
Extracted from: D:\retraitement_Protein_dicoverer\Namy-03AVR12\20120403_SICAPS_GST-IXR1-TAA_LysN.raw #4453 RT: 23.11
ITMS, CID, z=+2, Mono m/z=773.42529 Da, MH+=1545.84331 Da, Match Tol.=0.8 Da
• Spectre MS/MS LTQ-Orbitrap après LysN
y6?
748.39
70
60
b7?
798.44
b10?
1121.56
K
Q I N N L S P I L G Y W
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9b10b11b12
Intensity [counts] (10^3)
Recouvrement
des acides
aminés de
translecture
necessaire
pour eviter les
ambiguites
b12²?‐H2O
662.68
y12y11y10y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2
50
b9?
1008.53
b6?
711.38
40
y7?
835.37
b11?
1178.55
30
20
10
y2?
368.23
b4²?
242.14
b2?
257.27
y5²?
326.21
y4?
538.20
y3?
425.23
y6²?
375.36
b5?
597.53
b11²?
589.73
b9?‐H2O
990.52
b8?
895.40
b4?
484.32
y8?
948.44
b12?
1341.63
y9?
1062.49
y11?
1289.61
y9?‐H2O
1044.39
y12?
1417.80
0
200
400
600
800
1000
m/z
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
1200
1400
Ambiguités sur la nature des acides aminés incorporés
à partir des spectres MS/MS
Spectre MS/MS QTOF: ambiguité Cystéine/Glutamine
Pas de recouvrement de C ou Q
• ∆m= 4 ppm/Ion score= 26
•
• pas de
* ∆m= 14 ppm/Ion score= 37
→
NEQQSNLSPILGYWK : m1
perte de O2
• • * *•
* *
*•
2 Ox
m1= m2
* perte de O → NECQSNLSPILGYWK: m2
2
Cam
Spectre MS/MS LTQ-Orbitrap: pas d’ambiguité Cystéine/Glutamine
∆m= 0.4 ppm
Recouvrement de Q
D’autres
ambiguités ont été
relevées à partir de
spectres MS/MS
LTQ -Orbitrap
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Mesure du taux d’incorporation des acides aminés de
translecture par LC-MS
NanoLC-MS : XIC des peptides chevauchant le site de translecture
• Réponse MS du peptide de translecture dépend de l’acide aminé incorporé
→ Détermination d’un facteur correctif de l’efficacite d’ionisation et de digestion
Expression des 6 protéines recombinantes…KNE
Q
Y
K
C
W R
Q QINN…
Y
K
C
W
R
LC-MS sur 5 réplicats → XIC des peptides avec Q, Y, K, C, W et R
Peptides standards de translecture
facteur
correctif
KNEQQINNLSPILGYW
1.65 ± 0.1
KNEYQINNLSPILGYW
1.09 ± 0.06
KQINNLSPILGYW
KNECQINNLSPILGYW
KNEWQINNLSPILGYW
KNERQINNLSPILGYW
3.7 ± 0.05
1.04 ± 0.04
0.57 ± 0.02
0.7 ± 0.03
+n octyl glucopyranoside
Normalisation par la moyenne des intensités des 3 peptides
les plus intenses (N)
Correction des données quantitatives
de translecture acquises dans une
meme série d’analyse
Facteur Correctif pour chaque peptide standard = XIC/N
UAA
25 kDa
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
UAG UGA
Mesure du taux d’incorporation des acides aminés de
translecture par LC-MS
Q
Y
Y
UAG
UAA
40%
58%
8%
Q
Q
Y
Y
K
K
89%
K
K
Q
W
20%
UGA
C
C
W
77%
R
R
→ Résultats en accord avec les regles d’appariement codon/anticodon?
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
tRNAs suppresseurs naturels potentiels impliqués
dans la translecture
Il existe plusieurs tRNAs naturels proches cognats par codon stop. Plusieurs acides amines peuvent etre potentiellement
incorpores au sein d’un meme codon
Affinités des tRNAs suppresseurs potentiels.
UAA
Gln (2 tRNAs)
Tyr (1 tRNA)
>
Ser (2 tRNAs) Leu (1 tRNA) >
Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA)
UAG
Gln (2 tRNAs)
Tyr (1 tRNA)
>
Ser (1 tRNA) Leu (1 tRNA)
Trp ( 1 tRNA)
>
Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA)
UGA
Cys (1 tRNA)
Trp (1 tRNA)
>
Arg (2 tRNAs)
Ser (2 tRNAs) Gly (1 tRNA)
Leu (1 tRNA) 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
tRNAs suppresseurs naturels potentiels impliqués
dans la translecture
Il existe plusieurs tRNAs naturels proches cognats par codon stop. Plusieurs acides amines peuvent etre potentiellement
incorpores au sein d’un meme codon
Affinités des tRNAs suppresseurs potentiels
UAA
Gln (2 tRNAs)
Tyr (1 tRNA)
>
Ser (2 tRNAs) Leu (1 tRNA) >
Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA)
UAG
Gln (2 tRNAs)
Tyr (1 tRNA)
>
Ser (1 tRNA) Leu (1 tRNA)
Trp ( 1 tRNA)
>
Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA)
UGA
Cys (1 tRNA)
Trp (1 tRNA)
>
Arg (2 tRNAs)
Ser (2 tRNAs) Gly (1 tRNA)
Leu (1 tRNA)  Les acides aminés identifiés correspondent à ceux prédits par les règles
d’appariement codon/anticodon
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Correlation entre les taux d’incorporation
calculés et les données génétiques
Taux d’incorporation des tRNA suppresseurs naturels
dépend de:
Non canonique
•• complémentarité codon/anticodon
•• nombre de copies de gènes de tRNA
58%
40%
Appariement
Watson et Crick
Non apparié
Nombre de copies ( )
de genes de tRNA
2%
(7)
AΨG
GUU
GUC
UUS
(14)
UUC
UAA
UAA
UAA
UAA
UAA
Y tRNATyr
(8)
(9)
Q tRNAGln
89%
Y tRNATyr
(8)
Q tRNAGln (1)
K tRNALys
8%
Q tRNAGln
(9)
K tRNALys
3%
Q tRNAGln
(1)
K tRNALys
(7)
K tRNALys
AΨG
GUU
GUC
UUS
UUC
UAG
UAG
UAG
UAG
UAG
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
(14)
Correlation entre les taux d’incorporation
calculés et les données génétiques
77%
W tRNATrp
20%
(6)
C tRNACys
ACC
ACG
UGA
UGA
(4)
(1)
GCI
GCC
(11)
UCU
UGA
UGA
UGA
(6)
R tRNAArg
Non canonique
Non apparié
3%
R tRNAArg
Appariement
Watson et Crick
R tRNAArg
Nombre de copies ( )
de genes de tRNA
 Validation de la levure S. cerevisiae comme modèle de choix pour l’etude
qualitative et quantitative des acides aminés incorporés
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Influence du contexte nucléotidique sur la nature des
acides amines de translecture
Codon stop
●UAA
●UGA
Contexte
Taux de translecture Acide aminés
…KNE●QINN…
11%
…KNE●QSN…
39%
…QF●QSN…
11%
…KNE●QINN…
22%
…NR●QSV…
11%
Q, Y, K
C, W, R
 Pour les contextes testés, la nature du codon stop détermine le choix des acides
aminés majoritairement insérés
Prochaine étape sera la mesure du taux d’incorporation des acides aminés insérés
en fonction du contexte
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Perspectives
• Effet d’antibiotiques (paromomycine, gentamicine, G418…)
sur la nature et le taux d’incorporation des acides aminés
de translecture en fonction du codon stop et du contexte
nucléotidique.
• Adaptation de ce système d’étude de la translecture
aux cellules humaines en vue des applications
théraupetiques potentielles.
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Remerciements
Sandra Blanchet
Olivier Namy
Jean-Pierre Rousset
Alain Brunelle
Jean-Pierre LeCaer
29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans
Manuela Argentini
Laila Sago
Willy Bienvenut
Virginie Redeker