µXRF, ESEM-EDX, Tof-SIMS

Etude de la qualité des sols et
productions potagères dans le cadre des
évaluations quantitatives des risques
sanitaires liés aux sites et sols pollués.
PR Camille Dumat, INP-ENSAT Sols et Risques
[email protected]
Dr Eva Schreck, post-doc sur projet Dimension
[email protected]
DIMENSION
Eva Schreck
Post-doc
BIOTUBA
Thibaut Leveque
Thèse Ademe
Influence des vers de terre sur la
bioaccessibilité des métaux dans
les sols et végétaux
CLEANSITE
Yann Foucault
Thèse ANRT
Remédiation des sols pollués : tests
écotox en relation avec des
concentrations résiduelles admissibles?
 Les projets abordent les transferts des métaux présents dans des particules ultrafines ou
nano vers les écosystèmes terrestres (plantes potagères, vers de terre)
et l'homme (bioaccessibilité et toxicité).
 Les techniques de décontamination des sols
et études pour réduire les risques environnementaux et sanitaires sont également abordées.
Contexte général des projets en cours
PM process
riches en
métaux
Phytoremédiation
1) Impact PM / plantes et vers de terre ?
- Mécanismes de transferts et Ecotoxicité?
- Taille, métal, spéciation, voie de transfert
et influence des microorganismes.
4) Engrais verts / phyto-remédiation ?
- Impact sur le devenir des métaux ?
- et la qualité des sols ?
3) Impact sanitaire?
Inhalation et toxicité respiratoire?
PHYLOSPHERE
RHIZOSPHERE
DRILOSPHERE
3) Impact sanitaire ?
Bio-accessibilité humaine par ingestion
des plantes, PM, sols pollués (divers scénarios) ?
2) Influence bioturbation vers de terre ?
- Phyto-disponibilité ?
- Bioaccessibilité ?
2006-2009: Thèse Gaelle Uzu  Transfert foliaire couple Pb-Laitue
Objectifs du projet Dimension : Enviro-Santé-Société

Etudier le transfert atmosphère-plante de métaux issus de PM

Mieux comprendre le transfert sol-plante / PM
 influence des amendements, de la stabilisation par les constituants
du sol et de la spéciation chimique des métaux.

Déterminer le devenir des métaux dans la plante
 concentrations totales en métaux, localisation dans la plante,
mécanismes de transfert…

Etudier la bioaccessibilité gastro-intestinale des métaux pour
diverses matrices

Etudier la toxicité pulmonaire
 cytotoxicité et réponse pro-inflammatoire des PM et NP modèles
Présentation de quelques points
1 - Transfert atmosphère-plante / mécanismes

Foliar uptake of metals and metalloids by various plants in the context of sanitary risk
assessment under urban atmospheric pollution. STOTEN (under review)
2 - Transfert sol-plante : Impact du vieillissement des sols

Influence of soil ageing on bioavailability and ecotoxicity of lead carried by process
waste metallic ultrafine particles. Chemosphere, 2011.
3 - Modélisation de l’interception foliaire

DECA: a new model for assessing the foliar uptake of atmospheric lead by vegetation,
using Lactuca sativa as an example.
J. of Environmental management (under review)
4 - Impact sanitaire : toxicité vis-à-vis de l’Homme


Bioaccessibilité gastro-intestinale des métaux en lien avec la voie de transfert
Toxicité pulmonaire des PM
Aspect ENVIRONNEMENT
Mécanismes du transfert foliaire
Phytotoxicité des PM dans les sols
Pollution atmosphérique diffuse



Usine de recyclage de batteries au Pb : STCM, Toulouse
328 kg of particules en suspensions incluant 31 kg de plomb sont émises
chaque année (d’après les autorités)
Autres métaux (activités d’affinage): Cd, Cu, As, Sb, Sn…
 Emissions de PM ultra-fines (continuum avec nanoparticules)
Conséquences pour
l’environnement et la santé
humaine
Evaluation des risques et
des mécanismes de
transfert vers différentes
matrices
Transfert Atmosphère- Plante & Mécanismes
Schreck et al., STOTEN under review






Mise à exposition dans enceinte de l’usine
Salades, Ray-grass, Persils déjà exposés en 2010
+ nouvelles plantes: choux, radis, carottes, vignes
Sol non contaminé
Voile géotextile pour s’affranchir du transfert sol-plante
Temps d’exposition variable selon temps de culture
Détermination des concentrations en métaux

Les parties aériennes des végétaux sont récoltées, séchées et
lavées selon les scénarios de consommation des humains ou
animaux
lavage global pour les laitues, carottes, choux et radis
 simple rinçage pour le persil
 absence de lavage pour ray-grass ou vignes





Séchage
Minéralisation acide
Digestion au DigiPREP HNO3/H2O2
Analyse par ICP-OES ou ICP-MS
[Pb] dans feuilles (mg kg-1 de matière sèche)
Concentrations en Pb : quelques résultats
800
Laitue
700
Persil
600
500
Vigne
Ray-grass
400
300
200
100
0
Témoins
2 semaines d'exposition
4 semaines d'exposition

Absorption du Pb par voie foliaire et accumulation dans tissus

[Pb] dépendent des techniques de désorption et de l’espèce végétale
(morphologie)  Cf. observations

Mêmes résultats avec autres métaux (ICP-MS)

Effet racines: translocation

Effet lavage : -25%
Metal concentrations in roots (mg kg-1 DW)
Translocation feuilles-racines des métaux
25
roots of exposed lettuces
roots of controls
20
15
10
Pool de 5 racines
5
(45 jours d’exposition)
0
Cu
Zn
Se
Pb
Metal concentrations in roots (mg kg-1 DW)
Mobiles
ISOTOPIE
0,7
roots of exposed lettuces
0,6
roots of controls
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Cd
Sn
Sb
As
Observations microscopiques
Macroscopic scale
Whole plant
Lead-enriched PM deposition
Centimetric zones of leaves
• Distribution élémentaire  µXRF
µXRF and ESEM-EDX
• Morphologie et composition élémentaire des
PM  SEM-EDX
Molecular surface & depth
ToF-SIMS : depth profiling
Microscopic scale
• Images de la surface et pénétration des
particules dans la feuille  ToF-SIMS
Observations comparatives en µFX
500 µm
RAY-GRASS
LAITUE
PbSiL
Cartes de µXRF
500 µm
Particules accumulées
Distribution du Pb plus diffuse
K
Pb L
au niveau de la veine centrale
SEM-EDX
1
Pb
métallique
1600
1400
Laitues:
Mêmes
observations en
SEM
Fe et Pb
2
S
1200
Alumino silicate
1000
1
1
800
Cts
600
2
3
400
200
0
Al
Na
Observations du ray-grass en µFX
Si
S
Al
K
Ca
Fe
500 µm
Pb L
1600
Si
1400
Pb
Fe
1200
Particle 1
1000
Particle 2
800
Cts
1
2
3
Particle 3
Al
600
Na
400
200
P
K Ca
2
4
Fe
Pb
Pb
0
0
1
2
6
E (kV)
8
3
 Présence de particules riches en Pb
10
12
14
Observations en SEM
Sur feuilles de persil:
Pb métallique:
10 µm de diamètre
Particle enrichie en Ca et K,
+ petite quantité de Pb.
Certaines particules sont présentes au niveau des stomates
 potentiel mécanisme de pénétration?
Observations en SEM
Sur feuilles de persil:
Présence de composés en aiguilles:
formations secondaires
Pénétration via la surface cuticulaire?
 Etude en ToF-SIMS
Internalisation via la surface
foliaire?
Décapage de la surface et analyses ToF-SIMS
Profil de profondeur réalisé sur une zone
nécrotique enrichie en Pb par ToF-SIMS
Abrasion des composés organiques et apparition de composés riches en Pb
 Formations secondaires juste sous la membrane organique puis formes
primaires  étude spéciation au SYNCHROTRON (en cours)
Mécanismes envisagés
Lead enriched PM-deposition
Voies de transfert ?
1 Ostioles des stomates
Diffusion via les pores de la
2 cuticule
µXRF, ESEM-EDX, Tof-SIMS
3 Pénétration par pores puis
entrée dans la cellule
(endocytose)?
2
1
Cuticle
3
Epidermis
Mesophyll
Guard cells
and ostiole
Uptaken metal
Mesures des échanges gazeux: Licor 6400
Variation de CO2 (µmol.m-².s-1)
14
12
Témoins
10
Exposés
8
6
4
2
0
15
30
45
Temps d'exposition (jours)
Pas de variations des échanges gazeux (ΔCO2) enregistrés sur des choux exposés
aux retombées atmosphériques en comparaison à des choux témoins
 pas d’obstruction des stomates
Effet du vieillissement des sols pollués
(pollution historique et dopage)
Schreck et al., Chemosphere 2011
Process PM emissions
AIR
Pollution
SOIL
Atmospheric
fallouts
ENVIRONMENT POLLUTION
Uzu et al., EP 2009 and EST 2010
Surface Water
Contamination
Lead-recycling facility
Lactuca sativa
Vibrio fisheri
Normalized tests
STANDARDISED TESTS
(AFNOR, REACH…)
- sols dopés
Microtox test
- sols dopés vieillis 3 mois
- sols pollution historique
Germination tests and growth assays
 Germination Index, root and
shoot elongation, fresh an dried
biomass
Bioluminescence inhibition (%)
Doshi et al., 2008 ; Barrena et al., 2009
C1
C2
120
120
Relative root elongation (%)
A
α
100
80
a
C
C3
α
100
C1
80
β
a
C2
ab
B
C3
60
C
β
20
b
0
40
b
γ
Influence de la concentration en PM
et des propriétés des sols sur la
croissance racinaire
40
ab
B
60
Relative root elongation (%)
Résultats de phytotoxicité
A
γ
Soil-1
Soil-2
Soil-3
20
0
Soil-1
Soil-2
Soil-3
20
a
18
C ontrol
Concentrations en PM dans les sols:
C1 (825 Pb mg kg-1) < C2 (1650) < C3 (2475)
R oot leng th (c m )
20
a
18
R oot leng th (c m )
16
14
16
α
A
14
α
A ged C 2
12
b
10 C ontrol
B
b
8 C2
A ged C 2
6
B
Pollution
historique
γ
c
4
β
B
β
B
12
10
C2
A
2
8
6
c
γ
0
S oil-1
4
Effet
du vieillissement sur l’élongation racinaire
2
comme biomarqueur de phytotoxicité
0
S oil-2
S oil-3
S oil-4
Lien ENVIRO – SANTE
Modélisation de l’interception foliaire et évaluation
des risques sanitaires
Implications sur la bioaccessibilité des métaux
Toxicité respiratoire
Modélisation du transfert foliaire
Schreck et al., J. Environ. Mangement, under review


Modèle HHRAP (US EPA): Interception foliaire (prédiction des risques) pour
grandes cultures
Modèle DECA: Paramètres mesurés individuellement toutes les semaines
PARAMETRES D’ENTREE
Retombées atmosphériques
Facteur de lavage
Surface d’occupation
Rayon salade
Poids salade
Coefficient d’atténuation
Modèle INERIS DECA
(Dynamic Estimation of Contaminant
concentration using Attenuation factors)
- Évaluation de paramètres de
perte
- Influence du lavage
SORTIE
CPb : Concentrations totales en
plomb dans les feuilles de laitues,
prédites par le modèle
Résultats du modèle DECA (Ineris)
Ratio moyen : valeur modélisée / valeur mesurée
DECA
1.1 ± 0.3
HHRAP
1.7 ± 0.4
mgPb.kg-1 MS
Feuilles laitue
- Modèle H2RAP
paramètres globaux
- Mesures
- Modèle SAG
paramètres individuels

Bonne corrélation avec les valeurs mesurées: amélioration des prédictions dans
le cas de cultures en jardins ou biotests près de sources de Pb

HHRAP : plus grande surestimation des quantités de Pb accumulées

Importance du lavage des végétaux avant consommation et des facteurs
d’atténuation à prendre en compte dans l’évaluation des risques
Bioaccessibilité gastrique
- Travaux sur PM process (Uzu et al. EST 2011)
- 2 matrices: sols pollués et végétaux
exposés (différentes voies)
● Bioaccessibilité gastrique et intestinale
in vitro : simuler la digestion
→ Biodisponibilité calculée (Denys- etTest
al., 2007)
humaine  fraction capable de passer
dans la circulation sanguine
● Test chimique DTT :
Estimation du potentiel pro-oxydant des PM

Lausanne
Protocole « BARGE »
Bioaccessibility Research Group Europe
Digestions successives par fluides (salivaire, stomacal, duodénal,
biliaire), contrôles pH, 37°C (partie consommée)

Dosage des métaux en ICP-OES ou ICP-MS

Bioaccessibilité (%) = ([métal] mesurée après extraction par fluides
digestifs / [métal] totale mesurée dans la matrice) X 100
Bioaccessibilité du Pb dans les végétaux (%)
Bioaccessibilité gastrique du Pb dans les plantes
Persils
60
Laitues
50
40
Teneur en Pb dans les feuilles :
- laitues : 62 ppm en moyenne
- persils : 89 ppm en moyenne
30
20
10
Environ 30 ppm bioaccessible
0
4 semaines d'exposition

Différences de bioaccessibilité du Pb selon les végétaux

Quantités bioaccessibles proches selon les végétaux : 30 mg.kg-1 MS

A confirmer en étudiant ces fractions sur autres végétaux du projet
Bioaccessibilité dans feuilles de laitue (%)
Bioaccessibilité d’autres métaux dans la laitue
40%
4S
6S
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Cu
Zn
As
Cd
Pb

Globalement: fraction bioaccessible au niveau gastrique = autour
de 20-25 % de la teneur totale

Difficile de déterminer une tendance d’évolution dans le temps de la
bioaccessibilité
Influence du lombric sur la phytodisponibilité et la
bioaccessibilité des métaux

Premiers tests : 2 espèces de vers, 2 types de sols pollués, [métaux]
croissantes
 Mesures de la biomasse: perte de poids (arrêt nutrition et locomotion)
 Production de turricules : diminution activité du ver
 Forte absorption et bioaccumulation de métaux
Objectifs:
[Pb] in earthworms (mg kg-1
DW)
Lead bioaccumulation in Lumbricus terrestris
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Controls
100 ppm
825 ppm
1650 ppm
Lead concentration in contaminated soil
28
Bioturbation
4000 ppm

Étudier l’influence du lombric sur
la bioaccess et la
phytodisponibilité des métaux
(activités de creusage, rôle MO…)

Lien entre bioaccessibilité
humaine et toxicité chez le
lombric???
Toxicité pulmonaire
In vitro: cultures de cellules
épithéliales humaines
Voies aériennes
supérieures
(extra-thoraciques)
Pharynx
Larynx
Trachée
Lignée bronchique:
16 HBE
NCI-292
Lignée alvéolaire
A549
Cultures primaires
bronche
bronchiole
bronchiole
Voies aériennes
inférieures
(intra-thoraciques)
Bronchiole
Bronchiole
respiratoire
respiratoire
Alvéoles
Alvéole
Alvéole
Effet biologique des particules
Effets court terme
Inflammation
Macrophages
(GM-CSF, IL8…)
Inflammation
Effets
cardiovasculaires
EGFR
airway
epithelium
effet
autocrine
Amphiréguline
fibroblasts
smooth muscle
cells
(EGFR ligands)
Effet
paracrine
Endothelium
Remodelage
cancer
Effets long terme
Toxicité pulmonaire

Culture cellulaire et études réalisées sur :
 PM process (différentes tailles, émission diffuse enceinte et sortie four)PM1 et PM0.1 (impaction)
 effet vieillissement mis en évidence

Particules du commerce sous forme ultra-fine: CuO, ZnO, CdO,
Sb2O3

Test de cytotoxicité : test colorimétrique WSR  induction de la mort
cellulaire à des concentrations élevées

Evaluation des sécrétions de cytokines et de facteurs de croissance
par la méthode ELISA à des concentrations non cytotoxiques
Cytotoxicité des particules
Test WST
450
400
Viabilité (%)
350
300
250
200
150
100
50
25
5
50
Sb
2O
3
5
Sb
2O
3
25
Sb
2O
3
50
Cd
O
Cd
O
Cd
O
50
Zn
O
H2
O
2
PM
1
5
PM
1
25
PM
1
50
PM
to
t5
PM
to
t2
5
PM
to
t5
0
Cu
O
5
Cu
O
25
Cu
O
50
Zn
O
5
Zn
O
25
T
0
Traitement

Cytotoxicité des particules du commerce: CdO et CuO (nano), ZnO
(dissolution rapide, effet dose)

Pour les PM et Sb2O3: problème d’interférence PM-réactif
 la cytotoxicité est masquée
Tests ELISA: IL-8 et AR

Induction de l’inflammation et des facteurs de croissance: sécrétion de IL-

8 et AR
Pas d’effet dose
Augmentation des sécrétions avec la finesse des particules


Problème: pour les PM, est-on vraiment en dessous de la dose de
cytotoxicité?

Poursuivre des tests pour diminuer ces phénomènes
d’interférence

Lien avec tests DTT
Axe ENVIRO – SANTE – SOCIETE de l’OMP
 Améliorer la compréhension des mécanismes de phyto-disponibilité
des éléments inorganiques pour différents scénarios (mécanismes biogéochimiques aux interfaces).
PM
PM
PM
Faire progresser les outils d’évaluation des risques
environnementaux et sanitaires :
Colloque Environnement Santé Paris Nov 2011
 Proposer des préconisations pour réduire les risques :
Environnement Risques et Santé, V1, 2012 pour les populations et les travailleurs
 Aspects sociétaux: travail participatif, consignes pour réduire les risques, acceptabilité des risques
 Développer les techniques de restauration
des propriétés multifonctionnelles des sols (ingénierie écologique).
34
Compétences mobilisées sur les projets
Aérologie
Microbiologie
Sciences du Sol
Biologie
Risque (Eco)toxicologique = f (PM - Transfert - Cible)
Biogéochimie
Ecotoxicologie Toxicologie
SHS
International
Lausanne
University of Castilla
La Mancha Spain.
Bioaccessibility Research Group Europe
National
INRA-PSH
ISTerre
Ecseco
Biogeochim
Dynabio
AGIR
Région
INP
Plateforme d’outils « Environnement-Santé » OMP
● Bioaccessibilité gastrique et intestinale
→ Biodisponibilité calculée (Denys et al., 2007)
pH~1.9
● Test chimique DTT :
Estimation du potentiel pro-oxydant des PM
pH~7
Lausanne
Bioaccessibility Research Group Europe
EQRS : Identification des Dangers + Détermination des Doses d’Exposition
+ Etude des Effets
Collaborations :
Pôle de recherche ToxAlim
SHS, Epidémiologistes…
● Ingestion et Inhalation - Différents contaminants (pesticides, mycotoxines..)
36
Quelques publications et communications :
● E.Schreck,
Y.Foucault, F.Geret, P.Pradere, C.Dumat. Influence of soil ageing on bioavailability and
ecotoxicity of lead carried by process waste metallic ultrafine particles. Chemosphere, 2011.
● G. Uzu, J.J. Sauvain... and Camille Dumat. In vitro assessment of the pulmonary toxicity and gastric
availability of lead-rich particles from a recycling plant. Environmental Science & Technology, 2011.
● Y. Foucault, K. Tack, E. Schreck, T. Levêque, P. Pradere & C. Dumat. Environmental and sanitary
risks assessment for lead-battery recycling activities, SUITMA 2011.
● T. Leveque, Y. Capowiez, E. Schreck, Y. Foucault, C. Grand & C. Dumat. Earthworm influence on
metals bioavaibility in relation with metal speciation and ecotoxicity, SETAC 2012.
Merci de votre attention!!!