THµSE - Université Paul Sabatier

5)µ4&
&OWVFEFMPCUFOUJPOEV
%0$503"5%&-6/*7&34*5²%&506-064&
%ÏMJWSÏQBS
Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
1SÏTFOUÏFFUTPVUFOVFQBS
CAREL Clément
le vendredi 29 novembre 2013
5JUSF
Contrôle spatial et temporel de la biosynthèse des acides mycoliques au cours
du cycle cellulaire du pathogène résurgent Mycobacterium tuberculosis.
²DPMF EPDUPSBMF et discipline ou spécialité ED BSB : Microbiologie
6OJUÏEFSFDIFSDIF
Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale - CNRS UMR5089
%JSFDUFVST
EFʾÒTF
Dr. ZERBIB Didier
Jury :
Dr. BAULARD Alain, Directeur de recherche, Lille
Dr. BAYAN Nicolas, Professeur de l'Université de Paris Sud
Dr. BOUVERET Emmanuelle, Directeur de recherche, Marseille
Dr. MOLLE Virginie, Chargé de recherche, Montpellier
Dr. CLOTTES Eric, Professeur de l'Université de Toulouse III
Dr. ZERBIB Didier, Chargé de recherche, Toulouse
Rapporteur
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Je vais commencer une des parties les plus difficiles à écrire de mon manuscrit de thèse : les
remerciements. N’ayant pas été très loquace après de ma soutenance de thèse je me dois de
compenser ce manque ici.
Je tiens tout d’abord à remercier les membres de mon jury d’avoir accepté de juger mon travail
de thèse. Je suis particulièrement reconnaissant au Dr. Emmanuelle Bouveret, Dr. Alain Baulard
et Pr. Nicolas Bayan d’avoir accepté d’être rapporteur, mais également au Dr. Virginie Molle et
au Pr. Eric Clottes d’avoir été respectivement examinatrice et président du jury de thèse.
C’est également pour moi l’occasion de remercier chaleureusement Mamadou Daffé, qui a été
au cours de ma thèse un réel soutient. Mamadou s’est révélé un chef d’équipe disponible et
impliqué mais aussi un homme très humaniste avec une philosophie de vie profondément
ancrée, qu’il a su partager. Il m’aura ainsi permis de percevoir et de mieux comprendre la
différence entre regret et remord. Il a su également m’aiguiller et me guider sans m’influencer
par sa vision et ses problématiques. Pour tout cela et pour tous les efforts que vous avez
consentis pour moi, merci Mamadou.
Je me dois également de remercier la personne qui a su me transmettre le gout de la recherche,
mon directeur de thèse, Didier Zerbib. En effet, arrivé en stage de M1 pour acquérir les
rudiments du génie génétique, du clonage, de l’expression de protéines, je suis reparti avec le
virus de la recherche. Durant l’année de M2R tu m’as soutenu, encadré et encouragé, me
permettant ainsi d’obtenir une bourse de thèse. Pour cela et pour ta formation de très grande
qualité je te suis reconnaissant. Les années de thèse n’ont pas été un long fleuve tranquille que
ce soit sur le plan de la recherche ou de nos relations. Elles mon permis d’acquérir une large
connaissance scientifique, de réaliser une profonde introspection, mais aussi d’avoir une vision
élargie de la recherche. Je te remercie également pour ta disponibilité et ton investissement au
cours de la rédaction du manuscrit et de la préparation orale de thèse. Je me sens maintenant
près à voler de mes propres ailes grâce à l’autonomie et l’indépendance que tu m’as consenti.
Comment ne pas remercier mon collègue de bureau, Kaymeuang Cam avec qui j’ai partagé un
nombre de café incalculable et je dois l’avouer aussi de quelques bières. Mais je retiendrai de
ces trois années passées, votre intarissable optimisme ainsi que votre passion pour la recherche
et la science en général. Je tiens également à vous remercier pour votre soutien moral et
scientifique qui ont permis la progression technique de mon projet de thèse vers des bases
génétiques mais également théoriques grâce au partage de vos connaissances du cycle cellulaire
et bien plus.
Je remercie aussi l’ensemble des « jeunes » passé ou actuel de l’équipe avec qui j’ai eu la chance
d’interagir notamment : Sylvain, Karim, Ségolène, Sabine, Pauline, Cheikh, Mélanie, Emilie,
Coralie,…. Et tout particulièrement Nawel pour ton franc parlé, nos nombreuses discussions et
surtout tes précieux conseils, Lucie pour m’avoir supporté malgré mon humour et aussi pour ta
maladresse qui me fait encore beaucoup rire, Stevie avec qui j’ai partagé le labo (parfois au
grand damne de Kanjana). J’espère que ton flegme (pas britannique mais Breton) et ta
persévérance te permettront de réaliser une belle thèse puis une belle carrière, j’ai vraiment
beaucoup apprécié discuter et travailler avec toi. Et bien sur Kanjana, j’ai découvert une autre
culture avec toi et toi avec moi, nous avons beaucoup appris l’un de l’autre, je pense aussi qu’on
a formé un jolie tandem même si au départ, nos personnalités, façon de travailler étaient aussi
éloignés que nos pays respectifs. J’espère que tu réaliseras tes rêves professionnels et
personnels. J’espère aussi te rendre visite en Thaïlande car tu nous as beaucoup fait rêver avec
tes photos d’iles paradisiaques
Merci à toi Françoise, pour ton enthousiasme et ta bonne humeur et pour le temps que tu m’as
offert. J’ai beaucoup apprécié travailler avec toi, tu auras réussi à me transmettre le gout de la
biochimie des lipides et surtout permis d’avoir une vue complète de la biosynthèse des acides
mycoliques.
Merci aussi à : Patricia (Qui m’auras permis de découvrir le P3 sans y mettre les pieds), Fabienne
(Pour tes conseils et ton phrasé supersonique), Nathalie (qui comme moi, doit avoir des actions
chez Coca-Cola), Gilles (pour votre connaissance livresque et votre règne hégémonique sur la
réunion biblio), Maryelle (Pour ta gentillesse et pour m’avoir permis de me projeter rapidement
dans l’après thèse), Anne (pour ton humour et ton rire communicatif), Annaîk et enfin Hédia.
Merci à ma famille. A mes parents qui m’ont tout d’abord, poussé vers les études, et une fois
lancé mon permis de les réaliser dans les meilleures conditions possibles. A ma petite sœur
adorée avec qui j’ai partagé quelques connaissances en biologie moléculaire.
Merci à mes amis notamment Yoann et Jérémy avec qui j’ai partagé mes années de licence. Une
mention particulière à Jérémy avec qui j’ai passé de très nombreuses heures à réviser les partiels
et ensuite à les fêter.
A Clémence devenue entre-temps ma femme qui aura été bien plus qu’un support moral sans
faille. En effet, tu as été une des grandes artisanes de cette thèse, grâce à tes corrections et tes
nombreuses relectures. Mais aussi, merci de m’avoir supporté et poussé pour aller au bout de
cette aventure qu’est la thèse. Il y a une phrase que tu m’as rapportée récemment : l’Homme
aspire profondément à deux choses à un travail épanouissant et à trouver la personne qui
partagera le reste de sa vie. Pour la première, je suis sur la bonne voie et la seconde je l’ai.
RÉSUMÉ
La compréhension du mécanisme qui gouverne la coordination spatio-temporelle de la
croissance et de la division de Mycobacterium tuberculosis, est essentielle pour lutter contre
le bacille tuberculeux. La plupart des nombreuses enzymes de la synthèse du complexe acide
mycolique-arabinogalactane-peptidoglycane de l’enveloppe sont essentielles à la survie du
bacille. En utilisant une approche dynamique, nous avons localisé in vivo les enzymes du
complexe Fatty-Acid-Synthase-II (FAS-II), impliquées dans la biosynthèse des acides
mycoliques (AM), ainsi que leur transporteur Mmpl3. Les enzymes FAS-II co-localisent au
niveau des pôles et du septum avec Wag31 : la protéine responsable de la localisation
polaire de la biosynthèse du peptidoglycane mycobactérien. Mmpl3 se localise au niveau de
l’enveloppe et se concentre dynamiquement aux pôles et aux septa. Cette localisation est
dépendante du domaine cytoplasmique C-terminal de Mmpl3 susceptible de reconnaitre
directement ou indirectement une protéine polaire et notamment Wag31. La localisation
dynamique de FAS-II et du transporteur MmpL3 des AM avec Wag31, au niveau des pôles de
croissance et des septa, signifie que les composés lipidiques majeurs de la mycomembrane
pourraient être synthétisés en ces loci. Ce constat met en évidence une différence majeure
entre les mycobactéries et les autres bactéries en forme de bâtonnets étudiées à ce jour. Sur
la base des activités polaires de biosynthèse de l'enveloppe déjà connues chez les
mycobactéries, nous proposons l'existence d’une machinerie polaire complexe, consacrée à
la biogenèse de l'ensemble de l'enveloppe. En conséquence, les pôles mycobactériens
représenteraient le talon d'Achille du bacille à tous ses stades de croissance.
1
SOMMAIRE
RÉSUMÉ ___________________________________________________________________ 1
SOMMAIRE ________________________________________________________________ 2
INTRODUCTION_____________________________________________________________ 7
I.
La lutte contre la tuberculose _________________________________________________ 8
I/ 1
La prévention ___________________________________________________________________ 8
I/ 1.1
Le BCG ______________________________________________________________________ 8
I/ 1.2
Une nouvelle génération de vaccin ? ______________________________________________ 9
I/ 2
Traitements contre la tuberculose _________________________________________________ 10
I/ 2.1
Médicaments contre la tuberculose disponibles actuellement _________________________ 10
I/ 2.2
Médicaments disponibles dans le futur proche _____________________________________ 11
a. Composés réorientés pour la lutte contre la tuberculose ________________________________ 12
b. Composés spécifiques de la lutte contre la tuberculose _________________________________ 13
I/ 3
II.
Stratégies thérapeutiques ________________________________________________________ 14
I/ 3.1
DOTS _______________________________________________________________________ 15
I/ 3.2
Stop-TB _____________________________________________________________________ 16
I/ 3.3
Bilan épidémiologique en 2011__________________________________________________ 17
Les mycobactéries _________________________________________________________ 19
II/ 1
Lignage de Mtb et Co-évolution avec l’homme _______________________________________ 19
II/ 2
Physiopathologie de la tuberculose_________________________________________________ 20
II/ 2.1
Cycle infectieux de Mtb _____________________________________________________ 21
II/ 2.2
Relation de Mtb aux macrophages_____________________________________________ 21
a. La phagocytose _________________________________________________________________ 21
b. Vue classique des mécanismes de résistance de Mtb aux pouvoirs bactéricides des macrophages
________________________________________________________________________________ 22
c. Vue alternative des mécanismes de résistance de Mtb aux pouvoirs bactéricides des macrophages
________________________________________________________________________________ 23
d. L’autophagie participe au contrôle de l’infection par Mtb _______________________________ 24
II/ 2.3
Adaptation physiologique de Mtb au granulome _________________________________ 24
a. L’hypoxie et le rôle du système DosST/R _____________________________________________ 25
2
b. Adaptation métabolique. _________________________________________________________ 25
c. Maintien de la balance redox ______________________________________________________ 27
d. A qui profite le granulome ? _______________________________________________________ 28
III.
L’enveloppe mycobactérienne _______________________________________________ 30
III/ 1
Architecture ___________________________________________________________________ 30
III/ 2
Composition biochimique ________________________________________________________ 31
III/ 2.1
La membrane plasmique ____________________________________________________ 31
III/ 2.2
La paroi __________________________________________________________________ 31
a. Le peptidoglycane _______________________________________________________________ 31
b. Arabinogalactane _______________________________________________________________ 31
c. Mycomembrane ________________________________________________________________ 32
III/ 2.3
III/ 3
IV.
Capsule __________________________________________________________________ 34
Rôles et fonctions des composés de l’enveloppe ______________________________________ 34
Biosynthèse des acides mycoliques__________________________________________ 37
IV/ 1
Organisation générale ___________________________________________________________ 37
IV/ 2
Les antibiotiques ciblant la biosynthèse des AM ______________________________________ 37
IV/ 3
FAS-I _________________________________________________________________________ 39
IV/ 4
FAS-II _________________________________________________________________________ 40
IV/ 4.1
Initiation du cycle FAS-II _____________________________________________________ 41
IV/ 4.2
Les condensases KasA et KasB ________________________________________________ 42
IV/ 4.3
Les réductases MabA et InhA _________________________________________________ 44
IV/ 4.4
Les déshydratases HadA, B et C _______________________________________________ 45
IV/ 5
Modifications de la chaîne méromycolique __________________________________________ 46
IV/ 5.1
Introduction des groupements méthyl et fonction cyclopropane ____________________ 47
a. Fonction cyclopropane ___________________________________________________________ 47
b. Fonction méthyl ________________________________________________________________ 48
IV/ 5.2
IV/ 6
Introduction des fonctions oxygénées __________________________________________ 48
Condensation des acides mycoliques _______________________________________________ 49
IV/ 6.1
Activation de la chaîne méromycolique _________________________________________ 49
IV/ 6.2
Activation de la chaîne alpha des AM __________________________________________ 50
IV/ 6.3
Condensation des chaînes méromycoliques et alpha activées _______________________ 50
IV/ 7
Export des AM à travers la membrane plasmique _____________________________________ 51
IV/ 8
Régulation de la biosynthèse des AM _______________________________________________ 53
IV/ 8.1
Les STPK mycobactériennes __________________________________________________ 54
IV/ 8.2
Régulation des enzymes de FAS-II par les STPK ___________________________________ 55
IV/ 9
Interactome de la biosynthèse des AM ______________________________________________ 56
IV/ 9.1
Organisation générale du MABI _______________________________________________ 56
3
IV/ 9.2
V.
Essentialité des interfaces d’homomultimérisation _______________________________ 57
Biogénèse de l’enveloppe au cours de la croissance des mycobactéries ______________ 59
V/ 1
Croissance polaire ______________________________________________________________ 59
V/ 1.1
Biosynthèse du peptidoglycane aux pôles _______________________________________ 59
V/ 1.2
Wag31, la protéine clé de la croissance polaire __________________________________ 60
V/ 1.3
Régulation de la croissance des mycobactéries ___________________________________ 61
V/ 2
Division et croissance asymétrique _________________________________________________ 62
V/ 2.1
Croissance asymétrique des mycobactéries _____________________________________ 62
V/ 2.2
Division asymétrique des mycobactéries ________________________________________ 63
VI.
Hypothèse et projet de travail______________________________________________ 65
RÉSULTATS _______________________________________________________________ 67
I.
Localisation du système FAS-II aux sites de croissance et de division de la bactérie _____ 68
I/ 1
Introduction et système expérimental ______________________________________________ 68
I/ 2
Résultats ______________________________________________________________________ 69
I/ 2.1
Publication: « Polar localization of Mycobacterium tuberculosis Fatty Acid Synthase-II Proteins
in the course of bacterial Growth and Wag31 Dynamics _____________________________________ 69
I/ 2.2
Conclusion __________________________________________________________________ 71
I/ 2.3
Etude phénotypique du mutant ΔkasB de Msm ____________________________________ 71
a. Stratégie et mise en œuvre _______________________________________________________ 71
b. Effet de KasB sur la longueur des AM de Msm ________________________________________ 72
I/ 2.4
II.
Localisation de protéine par immunofluorescence chez Msm _________________________ 74
Rôle du domaine cytoplasmique de Mmpl3 dans sa localisation ____________________ 76
II/ 1
Localisation et topologie de Mmpl3 ________________________________________________ 76
II/ 2
Localisation du domaine membranaire ______________________________________________ 77
II/ 3
Localisation polaire du domaine cytoplasmique _______________________________________ 79
III.
Vers l’étude des bases moléculaires de la localisation de MmpL3 ___________________ 81
III/ 1
Mise en œuvre du système TetR/Pip OFF ____________________________________________ 81
III/ 2
Etude du phénotype de filamentation du mutant conditionnel ftsZ _______________________ 82
III/ 3
Localisation de MmpL3 en condition mutant pour FtsZ _________________________________ 83
III/ 4
Localisation de MmpL3 en condition mutante pour Wag31 _____________________________ 84
DISCUSSION_______________________________________________________________ 86
CONCLUSION ______________________________________________________________ 94
MATÉRIEL & MÉTHODES ____________________________________________________ 97
4
IV.
Matériel génétique ______________________________________________________ 98
IV/ 1
Souches microbiennes utilisées ____________________________________________________ 98
IV/ 2
Plasmides utilisés et construits ____________________________________________________ 98
V.
Conditions de culture ______________________________________________________ 101
V/ 1
Cultures d'Escherichia coli _______________________________________________________ 101
V/ 2
Culture de Mycobacterium smegmatis _____________________________________________ 101
VI.
Construction des vecteurs et manipulation d’ADN. ____________________________ 101
VI/ 1
Manipulation de l'ADN __________________________________________________________ 101
VI/ 2
Amplification par Réaction de Polymerisation en chaîne (PCR) __________________________ 102
VII.
Préparation de cellules compétentes (technique de Mandel & Higa) ______________ 102
VII/ 1
Escherichia coli ________________________________________________________________ 102
VII/ 2
Mycobacterium smegmatis ______________________________________________________ 102
VIII.
Transformation des cellules compétentes. ___________________________________ 103
VIII/ 1
Escherichia coli ______________________________________________________________ 103
VIII/ 2
Mycobacterium smegmatis ____________________________________________________ 103
IX.
Co-immunoprécipitation ___________________________________________________ 103
IX/ 1
Transcription/traduction in vitro __________________________________________________ 103
IX/ 2
Immunoprécipitation et lavage ___________________________________________________ 104
IX/ 3
Analyse des protéines sur gel SDS-PAGE ____________________________________________ 104
IX/ 4
Préparation des « billes magnétiques » pour Co-IP ___________________________________ 104
X.
Quantification relative en cinétique de l’expression des fusions GFP ________________ 105
X/ 1
Quantification relative fluorimétrique _____________________________________________ 105
X/ 2
Quantification relative en western blot ____________________________________________ 105
XI.
Observation microscopique _________________________________________________ 106
XII.
Construction et analyse du mutant de délétion kasB de Msm ___________________ 106
XII/ 1
Construction génétique du mutant kasB ____________________________________________ 106
XII/ 2
Extraction des acides mycoliques _________________________________________________ 107
XII/ 3
Analyse des acides mycoliques ___________________________________________________ 108
ANNEXES ________________________________________________________________ 109
RÉFÉRENCES _____________________________________________________________ 112
5
La tuberculose est une maladie ancienne qui peut prendre plusieurs formes : tuberculose
osseuse, méningée, ganglionnaire, cutanée (lèpre) et enfin pulmonaire. La première trace de cette
pathologie est retrouvée il y environ 500 000 ans (Kappelman et al, 2008) sous la forme de tuberculose
osseuse. Puis, d’autres cas sont décrits dans la littérature durant l’époque de l’Egypte ancienne. On
retrouve ensuite la description des symptômes dans les écrits d’Hippocrate au Vème siècle avant JC. Le
symptôme majeur dans les cas de tuberculose pulmonaire est la présence de structures anormales dans les
poumons. Ces structures nommées tubercules, du latin tuber signifiant tumeur, furent pour la première fois
associées à la maladie en 1679 par Franciscus de le Boë. Cette dénomination sera ensuite à l’origine du
nom de la maladie : la tuberculose. Suivront ensuite de nombreuses hypothèses quant aux causes et
transmission. C’est à la fin du 19ème siècle que la compréhension et l’analyse scientifique de la tuberculose,
nommée à cette époque phtisie, prennent réellement leur essor. Tout d’abord, avec les travaux du
chirurgien français Jean-Antoine Villemin, qui réalise en 1869 l’infection d’animaux en laboratoire à partir
de tissus humains infectés, et prouve ainsi le caractère infectieux et non tumoral de la pathologie. C’est en
1882, en utilisant une nouvelle méthode de coloration, que le physicien prussien Robert Koch isole pour la
première fois l’agent étiologique de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Très vite, des
recherches sont menées afin de développer un vaccin antituberculeux, notamment par Robert Koch luimême. Il pense avoir développé un vaccin à partir d’antigènes mycobactériens : la tuberculine. Mais en
1890 la preuve est faite que le « vaccin » est inefficace. Il faudra ensuite attendre trente et une années
avant de voir l’émergence du premier vaccin efficace. Cette réussite est à mettre au crédit d’Albert
Calmette et Camille Guérin. A partir de 1906, ils réalisent des passages en cultures successives de
Mycobacterium bovis (agent étiologique de la tuberculose bovine) sur des morceaux de pommes de terre
additionnés d’extrait biliaire. Après treize années et deux cent trente passages, ils lancent des tests sur de
nombreux animaux et c’est en 1921 que la première vaccination humaine a lieu. Ce germe aujourd’hui
nommé bacille de Calmette Guérin (BCG) fut la première forme de vaccin vivant administré chez l’homme.
Malgré ces avancées pour prévenir la maladie, les traitements au début du 20ème siècle ciblaient
principalement les symptômes et non leurs causes. Les sanatoriums ont été mis en place dans ce sens. Ils
devaient permettre la guérison par le repos, l’air pur des montagnes, l’exposition à la lumière et au soleil.
Ils permettaient aussi d’endiguer la contagion par l’isolement des tuberculeux. Grâce à la découverte
d’antibiotiques tels que la streptomycine et l'acide para amino-salicylique (PAS), le traitement en
sanatorium laisse progressivement place au traitement à domicile dans les années 1950 et 1960. La période
entre 1940 et 1980 représente « l’âge d’or » de la découverte d’antibiotiques. En 1945, il est montré que
l’isoniazide (INH) possède une activité antituberculeuse très importante. Ces découvertes ont été et restent
des éléments majeurs de la lutte contre la tuberculose.
6
INTRODUCTION
7
INTRODUCTION
I.
La lutte contre la tuberculose
I/ 1
La prévention
I/ 1.1 Le BCG
Depuis 1921, plus de 4 milliards de personnes ont été vaccinées avec le BCG. Cette vaccination,
rendue obligatoire en France en 1950, a permis de réduire de façon drastique la mortalité chez
les jeunes enfants, notamment pour les formes méningées et disséminées. La vaccination
s’effectue dans le premier mois après la naissance. Le caractère obligatoire et généralisé de la
vaccination par le BCG a fait l’objet de débats en France notamment en 2006, du fait des limites
d’efficacité de ce vaccin, des effets indésirables, et de la baisse d’incidence de la tuberculose. Il
n’est maintenant plus obligatoire. Dans un nombre de cas très limité (incidence de 4 pour
100 000, Enquête européenne - BCG chez l’enfant, 2005) la vaccination peut se traduire par une
pathologie appelée BCGite, qui peut être mortelle dans sa forme aigüe. Des travaux ont permis
de déterminer que ces complications sont dues à un déficit immunitaire d’origine virale (VIH :
virus de l’immunodéficience humaine), ou génétique (syndrome de susceptibilité mendélienne
aux infections mycobactériennes) avec des mutations au sein des gènes de l’hôte codant pour
les récepteurs à l’interféron gamma ou aux interleukines (Catherinot et al, 2005). Il est de ce fait
recommandé par l’OMS de ne pas effectuer de vaccination chez les enfants VIH positifs.
L’importance du BCG n’est pas contestée, car la balance bénéfice/risque est clairement en
faveur de la vaccination. Cependant, il est maintenant bien admis que la vaccination par le BCG
n’est pas suffisante d’un point de vue planétaire. En effet, il ne permet qu’une protection
mondiale de 50% contre la tuberculose chez l’adulte (Colditz et al, 1994). De plus, la protection
semble varier en fonction de la latitude sous laquelle est utilisé le vaccin ! Par exemple,
l’efficacité de protection est de 75% au Royaume Uni contre moins de 30% pour Porto Rico.
Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer ces variations géographiques : une variation
génétique des souches de BCG, des différences génétiques ou nutritionnelles des populations,
les influences environnementales comme le niveau d’ensoleillement ou encore l’exposition prévaccinale à des souches environnementales de mycobactérie. Cette préexposition immuniserait
contre le BCG mais pas contre Mtb. Il semble donc que la variabilité géographique soit due à un
ensemble de causes environnementales et socio-économiques. L’efficacité du vaccin la plus
faible est retrouvée dans les zones géographiques les plus touchées par la tuberculose. Il est
8
INTRODUCTION
donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales et/ou des souches vaccinales
ayant un pouvoir immunogène plus important proche de celui de Mtb.
I/ 1.2 Une nouvelle génération de vaccin ?
Actuellement deux grandes stratégies complémentaires sont principalement mises en œuvre
pour développer de nouveaux vaccins. La première est basée, comme le vaccin actuel, sur des
souches vivantes atténuées. Notamment des souches recombinantes de mycobactéries
exprimant des antigènes ayant un fort pouvoir immunogène. Par exemple la souche rBCG30, qui
surexprime l’antigène 85B de Mtb, augmentant ainsi son pouvoir antigénique par rapport à la
souche parentale de BCG (Horwitz et al, 2006). Cette souche, en tant que vaccin, devrait
prochainement entrer en phase 2. La vaccination tout comme avec le BCG aurait lieu avant
l’exposition à l’agent pathogène dans les premiers mois de naissance (3 et 9 mois). Cette
vaccination précoce (« Prime ») aurait pour but, comme auparavant, de prévenir la
préexposition aux souches environnementales qui rendent inopérant le BCG. Pour pallier ce
problème, des souches atténuées de Mtb sont actuellement en développement préclinique
comme les souches Mtb ΔRD1-ΔpanCD (Sambandamurthy et al, 2006) ou la souche ΔPhoP-Δfad
(Martin et al, 2006). Cette dernière est entrée en phase 1 de développement clinique très
récemment. Certaines souches recombinantes pourraient également être utilisées comme
vaccin thérapeutique. En effet, Sweeney et collaborateurs ont développé une souche
recombinante de M.smegmatis (Msm) surexprimant la région esx-3 de Mtb et permettant de
réaliser une stérilisation complète chez la souris infectée au préalable par Mtb (Sweeney et al,
2011). Dans le même sens, une souche tuée de Mtb et dont les composés immunogènes de
l’enveloppe sont structurés en liposome, est actuellement en phase 2. Ce type de « vaccinsérum » pourrait à terme permettre de raccourcir les traitements thérapeutiques en stimulant le
système immunitaire.
La seconde stratégie est basée sur des vaccins sous-unitaires permettant une activité « primeboost ». Elle aurait lieu en même temps que la vaccination pédiatrique par le BCG, ou par les
nouvelles souches recombinantes, puis à l’âge adulte pour restimuler le système immunitaire.
Ces vaccins sont constitués uniquement d’un petit nombre de motifs antigéniques injectés sous
forme de protéines recombinantes avec adjuvants ou exprimés par un vecteur viral. Comme par
exemple l’AdAg85A (phase 1) qui est basé sur un vecteur adenoviral ne pouvant pas se répliquer
et exprimant l’antigène 85A (Wang et al, 2004). Ces deux premières stratégies permettraient
9
Nom du vaccin
Description
Stratégie
Phase
clinique
Vaccin de type souches vivantes atténuées
VPM 1002
rBCG exprimant la lystériolysine et uréiase
déplétée
Prime
Phase 2
rBCG30
rBCG exprimant l’Ag85B de Mtb
Prime
Phase 1
terminée
MTBVAC
Mtb délétée du gène phoP et fadD26
Prime
Phase 1
Vaccin de type sous-unitaire
Oxford MVA85A/
AERAS-485
Souche virale viccinia atténuée exprimant
l’Ag85A
Prime-Boost
Phase 2
Crucell Ad35/ Aeras402
Adénovirus 35 non-réplicatif exprimant les
antigènes Ag85A, Ag85B et TB10.4
Prime-Boost
Phase 2
GSK M72
Protéines recombinantes Rv1196 et Rv0125
associées à l’adjuvant AS01 ou AS02
Prime-Boost
Phase 2
Ad5Ag85A
Adénovirus 5 non réplicatif exprimant l’Ag85A
Prime-Boost
Phase 1
HyVac4/Aeras-404
(SSI/SP H4-IC31)
Protéine de fusion de l’Ag85B et TB10.4 associée
à l’adjuvant IC31
Prime-Boost
Phase 1
Hybrid-1 + IC31
Protéine de fusion de l’Ag85B et ESAT-6 associée
à l’adjuvant IC31
Prime-Boost
Phase 1
Hybrid-1 + CAF01
Protéine de fusion de l’Ag85B et ESAT-6 associée
à l’adjuvant CAF01
Prime-Boost
Phase 1
Hybrid 56 + IC31
Protéine de fusion de l’Ag85B, ESAT-6 et
Rv2660c associée à l’adjuvant IC31
Prime-Boost
Phase 1
ID93 + GLA-SE
Protéine de fusion de Rv2608, Rv3619, Rv3620,
et Rv1813associée à l’adjuvant GLA-SE
Prime-Boost
Phase 1
Immunothérapie
Phase 2
Vaccin de type souche tuée
RUTI
Ensemble antigénique de Mtb associé en
liposome
Figure 1 : Les vaccins contre la tuberculose en phase clinique. Nom et description des
différents candidats vaccins en cours se trouvant en phase clinique 1, 2 ou 3. D’après
Ottenhoff & Kaufmann, 2012 et Tuberculosis vaccine candidates – 2013 (OMS-Stop TB
partnership),
INTRODUCTION
actuellement d’avoir une action protectrice de préexposition afin de prévenir l’infection. Elles
auraient également une action protectrice de post-exposition afin de prévenir la progression de
la maladie. L’ensemble des vaccins actuellement en phase clinique est représenté (figure 1).
En conclusion, ces nouvelles pistes vaccinales visent à obtenir une réaction immunitaire plus
importante permettant ainsi de pallier la variabilité d’efficacité du BCG actuellement observée
(confère paragraphe I/ 1.1 p.8). Malgré ces importantes avancées, il n’en demeure pas moins
que ces vaccins ne seront pas disponibles avant une, voire deux, décennies. De plus, il est
probable que l’action isolée d’un seul de ces vaccins ne puisse être la solution idéale : « …I
believe that it is unlikely that a single vaccine will arise as a ‘magic bullet’…» (Kaufmann, 2006).
Cette pensée d’un spécialiste reconnu de l’immunologie de la tuberculose suggère le
développement de vaccins constitués de plusieurs souches et faisant appel à des vaccins de type
« prime-boost ».
I/ 2
Traitements contre la tuberculose
I/ 2.1 Médicaments contre la tuberculose disponibles actuellement
Les antituberculeux actuels sont classés en deux « lignes ». Les antibiotiques de première ligne
sont les antibiotiques utilisés dans le cadre de tuberculose sensible, c’est à dire causée par une
bactérie ne possédant pas de résistances génétiques aux antituberculeux. Ils sont utilisés en
combinaison dans le cadre d’un traitement de plusieurs mois. Les antituberculeux de seconde
ligne sont des médicaments utilisés pour traiter les tuberculoses induites par une souche
résistante de Mtb notamment aux antibiotiques de première ligne. Ils sont utilisés en
combinaison avec les antibiotiques de première ligne auxquels est sensible la souche, durant un
traitement extrêmement long pouvant durer plusieurs années. L’ensemble de ces médicaments
est divisé en 5 groupes (Figure 2), classés de 1 à 5 en fonction : de leur efficacité, de leur mode
d’administration, de leur classification chimique et du retour d’expérience sur leur utilisation
(2010). Les 4 premiers groupes sont des antibiotiques bien étudiés, dont les modes d’action et
les cibles sont connus. Seul le groupe 4 présente des antibiotiques bactériostatiques
contrairement aux 3 autres qui sont composés de molécules ayant une activité bactéricide.
La première ligne est constituée du groupe 1 (le plus efficace) et de la streptomycine (groupe 2).
Le groupe 1 est composé de : l’INH, la rifampicine (Rif), la pyrazinamide (Pza), l’éthambutol
(Emb) et de la rifapentine (Rpt). Ils possèdent tous l’avantage d’être administrables par voie
10
Antibiotique (date de
découverte)
Cible
Effet
Groupe
Antibiotiques de première ligne
Isoniazide (1952)
InhA (2-trans-énoyl-ACP
réductase NADH dépendente)
Inhibition de la synthèse des
acides mycoliques
1
Rifampicine (1963)
Sous-unité β de l’ARN
polymérase
Inhibition de la transcription
1
Pyrazinamide (1954)
Sous-unité ribosomale 30S
Inhibition de la traduction et
acidification du cytoplasme
1
Ethambutol (1961)
Arabinosyle transferase
Inhibition de la biosynthèse
de l’arabinoglalactane
1
Antibiotiques de seconde ligne
Streptomycine (1944)
S12 et ARNr 16S de la sousunité ribosomale 30S
Inhibition de la synthèse
protéique
2
Capreomycine (1963)
Lien B2a entre la sous-unité 30s
et 50s du ribosome
Inhibition de la synthèse
protéique
2
Kanamycine (1957)
Sous-unité ribosomale 30S
Inhibition de la synthèse
protéique
2
Amikacine (1972)
Sous-unité ribosomale 30S
Inhibition de la synthèse
protéique
2
Ofloxacine (1980)
Topoisomérase et ADN gyrase
Super-hélicité de l’ADN
3
Ethionamide (1961)
InhA (2-trans-énoyl-ACP
réductase NADH dépendente)
Inhibition de la synthèse des
acides mycoliques
4
Cycloserine (1952)
D-alanine épimérase et ligase
Inhibition de la biosynthèse
du peptidoglycane
4
Acide para-amino
salicylique (1948)
Dihydropteroate synthase
Inhibition de la biosynthèse
du folate
4
Figure 2 : Nom et description des antibiotiques les plus utilisés dans le cadre de la lutte
contre la tuberculose, d’après (Zumla et al, 2013). Nom, date de découverte, cible et mode
d’action des principaux antituberculeux.
INTRODUCTION
orale ce qui permet une prise à domicile moins contraignante que, par exemple, la
streptomycine qui est injectable. Leurs modes d’action sont bien connus, ainsi que les
résistances qui leur sont associées. L’INH cible la biosynthèse des acides mycoliques : acides gras
mycobactériens à très longues chaînes, essentiels, spécifiques et lipides majeurs de l’enveloppe
(confère paragraphe III/ 2.2c p.29 ). La cible et le mode d’action de l’INH seront décrits plus en
détail par la suite (confère paragraphe IV/ 2 p.37). La seconde ligne est classée en quatre
groupes (groupe 2, 3 et 4).
Le groupe 2 est composé d’antibiotiques administrés par voie injectable : les aminoglycosides
(streptomycine, kanamycine et amikacine) et les polypeptides (capréomycine et viomycine). Les
aminoglycosides sont utilisés préférentiellement, mais en cas de résistance à la streptomycine et
à la kanamycine, les polypeptides sont utilisés.
Le groupe 3 est composé des fluoroquinolones (ofloxacine, siprofloxacine, levofloxacine,
moxifloxacine et gatifloxacine) qui sont utilisés dans le cadre d’autres pathologies mais qui sont
aussi actifs contre la tuberculose. Cette classe, notamment pour la gatifloxacine et la
moxifloxacine, sera discutée plus précisément par la suite (Médicaments disponibles dans le
futur p.11).
Le groupe 4 est constitué d’antibiotiques administrés sous forme orale (acide paraaminosalicylique : PAS, cycloserine, terizidone, ethionamide et protionamide). Ces antibiotiques
ne sont que rarement utilisés en combinaison du fait de leur toxicité. Par exemple, la prise
simultanée d’éthionamide et de PAS provoque des effets secondaires forts sur les voies gastrointestinales.
Les composés du groupe 5, pourraient représenter la « troisième ligne d’antituberculeux », car
ils sont généralement utilisés en dernier recours et ne sont pas recommandés par l’OMS. Leur
efficacité et mode d’action sont mal connus. Ces antibiotiques sont : clofazimine, linezolide,
amoxicilline/acide
clavulanique,
thiacétazone,
imipénème/cilastatine,
clarithromycine.
Cependant un antibiotique comme la thiacétazone a fait l’objet de recherche récente et sera
discuté plus précisément par la suite (confère paragraphe IV/ 4.4 p.45)
I/ 2.2 Médicaments disponibles dans le futur proche
Les antibiotiques actuellement utilisés en première ligne ont été développés il y a environ cinq
décennies. Leur efficacité n’est plus à démontrer. Cependant, il est nécessaire de développer de
11
PBTZ169
TBA-354
Phase 1
DelamanideN
GatifloxacineR
MoxifloxacinR
LinezolideR
AZD5847NR
SutezolideNR
RifapentineR
Phase 3
PA-824N
SQ-109N
Phase 2
Développement clinique
Figure 3 : Pipeline des nouveaux anti-tuberculeux en 2013. Les classes chimiques sont
indiquées par un code couleur : fluoroquinolone, rifamycin, oxazolidinone, nitroimidazole,,
benzothiazinone. N nouveaux composés, R composés existants réorientés pour la lutte
contre la tuberculose, NR nouvelles molécules issues de recherche autres que la tuberculose
et réorientées. 2013 (OMS-Stop TB partnership),
CPZEN-45
DC-159a
Q203
SQ609
SQ641
TBI-166
Développement
Développement préclinique
INTRODUCTION
nouveaux antituberculeux pour permettre de lutter contre les cas de tuberculose résistante. Ces
nouvelles molécules devraient posséder, dans l’idéal, les caractéristiques suivantes (Zumla et al,
2013) :
-
Avoir une activité plus efficace que les antibiotiques existants afin de réduire la durée de
traitement.
-
Inhiber via de nouveaux mécanismes, afin de permettre le traitement des souches
résistantes.
-
Etre compatibles avec les trithérapies antivirales.
-
Ne pas posséder d’activités antagonistes d’autres antituberculeux afin de permettre
l’utilisation d’au moins trois autres médicaments.
-
Etre capable d’éliminer Mtb dans ses différents états physiologiques.
-
Avoir passé toutes les phases de test clinique.
Les phases de test clinique sont précédées, dans le cas de molécules nouvellement synthétisées,
d’une phase préclinique permettant l’optimisation du composé ainsi que les tests sur l’animal.
En suivent les phases cliniques qui doivent répondre aux questions suivantes :
-
Phase 1 : Le composé est-il sûr ? (environ 1 an)
-
Phase 2 : Quels sont ses effets ? sa cinétique ? son effet dose ? (plus de 2 ans)
-
Phase 3 : Est-il plus efficace qu’un placébo et que le traitement de référence ? (de 1 à 4
ans)
Lorsqu’une molécule passe l’ensemble de ces phases, elle reçoit une autorisation de mise sur le
marché (AMM). Il faut généralement 1 an après les phases cliniques pour obtenir l’AMM. En
moyenne, il faut donc au moins 10 ans entre la découverte d’une molécule active et son AMM.
Au cours des cinq dernières années il a été possible de voir l’émergence d’un « TB drug
pipeline » prometteur, c’est-à-dire un ensemble de composés à la fois : découverts, en phase
préclinique, et en phase clinique 1, 2 ou 3 (Figure 3). La majorité des composés en phase clinique
est issue de recherche antimicrobienne autre que la tuberculose. Ce sont des composés
réorientés (fluoroquinolones, rifamycines, oxazolidinones et riminophenazines). Cependant,
d’autres molécules sont issues directement des recherches menées sur la tuberculose comme
les nitroimidazoles et le composé SQ109.
a. Composés réorientés pour la lutte contre la tuberculose
12
INTRODUCTION
Fluoroquinolones : Les fluoroquinolones, et notamment la moxifloxacine et la gatifloxacine
actuellement en phase 3, ciblent la DNA gyrase et la topoisomérase. Elles sont déjà autorisées et
utilisées dans le cadre de pathologies telles que les pathologies respiratoires aigües, infections
simples de la peau ou des tissus mous. Cela a permis d’utiliser rapidement ces antibiotiques.
Mais cela pose également un problème car des patients non diagnostiqués pour la tuberculose
sont traités avec ces molécules, ce qui a pour effet de favoriser la sélection de souches de Mtb
résistantes. Cependant leurs efficacités sur Mtb démontrent que l’ADN gyrase et la
topoisomérase sont des cibles de choix. Dans ce sens, des programmes de recherche ciblant ces
deux molécules ont été lancés. Ils ont pour but d’identifier les molécules inhibitrices de ces deux
cibles mais n’ayant pas de résistances croisées avec les fluoroquinolones existantes.
Rifamycines : Un dérivé de Rif, la rifapantine, est en phase 2. Cet antibiotique à large spectre, a
une demi-vie plus longue que la Rif. Son efficacité est testée en phase 2 dans le but de réduire la
durée du traitement antituberculeux. Il cible tout comme la Rif la sous-unité béta de l’ARN
polymérase.
Oxazolidinones : Actuellement en phase 2, le Sutezolide et l’AZD5847, analogues du linozolide,
sont utilisés en dernier recours contre les infections par des bactéries à Gram positive.
L’AZD5847 inhibe la synthèse protéique tout comme le linozolide en se fixant à l’ARNr 23S
bloquant ainsi la traduction. L’apparition de mutations dans cette cible est très peu fréquente
(Shaw & Barbachyn, 2011).
b. Composés spécifiques de la lutte contre la tuberculose
Nitroimidazole : PA-824 et OPC-67683 sont respectivement en phase clinique 2 et 3. Le PA-824
est un pro-médicament (Stover et al, 2000) qui est activé par une nitroréductase (Ddn) de Mtb
dépendante du cofacteur F420 . Cela entraine la production d’espèces réactives, dont les cibles
restent inconnues mais qui provoquent l’inhibition de la synthèse des acides mycoliques. Il est
actif contre les populations aérobies et anaérobies de Mtb. En condition anaérobie Mtb entre en
phase non-réplicative, correspondant sur le plan de la pathologie à une phase asymptomatique
(latente). Cette caractéristique devrait le rendre efficace contre la tuberculose latente. De plus, il
ne provoque pas d’effets secondaires et a des paramètres pharmacocinétiques intéressants. Des
résistances génétiques au PA-824 ont été identifiées. Ces souches ont perdu la capacité de
synthétiser le cofacteur F420 et donc d’activer le composé (Manjunatha et al, 2006). Cette
évolution permet aux souches d’acquérir également une résistance croisée à l’OPC-67683. Ce
13
INTRODUCTION
dernier aussi connu sous le nom de delamanide semble également inhiber la biosynthèse des
acides mycoliques (Matsumoto et al, 2006).
Ethylenediamine : SQ109. Cette molécule en phase 2, dérivée de l’éthambutol par synthèse
chimique combinatoire, bloque le transport des acides mycoliques à travers la membrane
plasmique en inhibant la protéine de transport MmpL3 (Tahlan et al, 2012). Elle a montré un
excellent pouvoir bactéricide : rapide, avec une bonne diffusion cellulaire et une longue ½ vie.
Elle semble également potentialiser l’action d’autres composés comme la bedaquiline (Reddy et
al, 2010). Une série d’inhibiteurs de MmpL3 est également en cours de développement préclinique.
Bedaquiline : TMC-207. Cette molécule inhibe la sous unité F0 de l’ATP synthase bactérienne et
prive ainsi la bactérie d’ATP (Koul et al, 2007). Elle est 20 000 fois plus active sur l’ATP synthase
mycobacterienne que sur celle de l’homme. Cela permet à cette molécule de ne pas être toxique
pour l’homme ce qui a permis la validation de la phase 1. Encore en phase 2 début 2012, elle fut
autorisée à la mise sur le marché en décembre 2012 et vient s’ajouter aux antibiotiques de
seconde ligne. Cette autorisation accélérée a été rendue possible pour permettre le traitement
de tuberculose résistante à une grande partie des antibiotiques de première et seconde ligne.
Elle doit cependant être utilisée en dernier recours du fait de l’existence d’effets secondaires
indésirables comme l’arythmie cardiaque. Cette molécule est la première molécule
spécifiquement développée dans le cadre de la tuberculose à être mise sur le marché depuis la
Rif il y a 40 ans.
I/ 3
Stratégies thérapeutiques
La découverte des premiers antituberculeux a permis le développement de stratégies
thérapeutiques dès 1952, avec l’administration d’une combinaison de 3 molécules (INH, PAS et
streptomycine) pour une durée de 24 mois. Cette stratégie a par la suite, été soutenue par un
programme de vaccination mondiale par le BCG à partir de 1974 puis remplacée en 1980 par un
traitement de plus courte durée (6-8 mois) combinant 4 antituberculeux (INH, Rif, ethambutol et
pyrazinamide). Ces stratégies ont permis d’accentuer la diminution de la mortalité notamment
dans les pays industrialisés (Pour revue (Raviglione & Pio, 2002)). Cette stratégie se révèle moins
efficace dans les pays pauvres, du fait d’un manque d’infrastructures sanitaires. Cette évolution
positive a été remise en cause dans les années 90 que ce soit dans les pays industrialisés ou non.
En effet, l’émergence du virus du VIH et du syndrome d’immunodéficience acquise associé, a
14
INTRODUCTION
causé une recrudescence de la tuberculose. Aux Etats-Unis, on notait une augmentation de 34%
des cas de tuberculose chez les enfants de moins de 5 ans entre 1987 et 1993. Cette tendance
également observée en Europe, ne s’explique cependant pas uniquement par l’apparition du VIH
mais également par des raisons socio-économiques (Bloom & Murray, 1992). En effet, cette
période voit l’effondrement de l’union soviétique provoquant ainsi des flux migratoires
importants notamment de personnes infectées par la tuberculose. En 1990, on estimait dans le
monde à 7.5 millions le nombre de cas de tuberculose et à 2.5 millions le nombre de décès. Ces
statistiques combinées à l’apparition de souches résistantes aux traitements ont poussé à la
mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques.
I/ 3.1 DOTS
Afin de contrer la résurgence de la tuberculose au niveau mondial, l’OMS a développé de
nouvelles stratégies inspirées de la méthode de Karel Styblo et de l’union internationale contre
la tuberculose et les maladies pulmonaires dans les années 1980 en Tanzanie et au Malawi.
Cette stratégie appelée DOTS (de l'anglais, Directly Observed Treatment, Short-course) avait
pour objectifs de dépister 70% des cas de tuberculose et de soigner 85% d’entre eux dans les
années 2000. Elle repose sur cinq éléments :
-
la volonté politique des gouvernements concernant son financement ainsi que son
organisation ;
-
le dépistage de Mtb par des examens bactériologiques de qualité ;
-
un traitement normalisé de la tuberculose avec surveillance et soutien des patients ;
-
une logistique pharmacologique efficace ;
-
une évaluation constante de la situation épidémiologique.
Sur le plan purement thérapeutique, le diagnostic est réalisé par examen microscopique
d’expectoration avec notamment la technique de coloration de Ziehl-Neelsen révélant
spécifiquement les mycobactéries par leur caractère acido-alcoolo-résistant à la coloration. En
suivent une mise en culture et des tests de sensibilité aux antibiotiques. Cela doit être réalisé
dans des laboratoires adaptés suivant des protocoles définis. Le traitement consiste, dans le cas
de souches sensibles, en la prise pendant 2 mois des antituberculeux de 1ère ligne, la Rif, l’INH,
l’éthambutol et la pyrazinamide suivie de 4 mois avec seulement la Rif et l’INH. Cette stratégie
vise à enrayer l’épidémie et à prévenir l’apparition de nouvelles souches résistantes aux
traitements connus. Adoptée par 155 pays, cette stratégie bien qu’en deçà des objectifs fixés est
15
INTRODUCTION
néanmoins un succès avec 84,7% des cas détectés soignés en 2005. Ce traitement est également
appliqué aux tuberculoses extra-pulmonaires. Il peut être cependant compliqué dans le cas de
souches résistantes ou dans le cas de co-ïnfection par le VIH.
Pour les tuberculoses résistantes on distingue deux types de souches :
-
les souches multi-résistantes, ou MDR (de l’anglais, multi drug-resistance) caractérisées
par la résistance à l’INH et la Rif.
-
les souches ultra-résistantes ou XDR (de l’anglais, extensively drug-resistance) dérivant
des MDR et résistant également aux fluoroquinolones et à au moins un des médicaments
injectables de seconde ligne.
Le traitement des souches MDR et XDR nécessite au préalable une analyse efficace afin
d’identifier les antibiotiques auxquels la souche pourrait être sensible. Le traitement se base sur
la combinaison d’au moins 4 antibiotiques comprenant un antituberculeux du groupe 2 durant 6
mois, et un traitement de 18 mois sans médicament injectable. Même si la base du traitement
des MDR et XDR est la même, les souches XDR peuvent s’avérer plus compliquées à traiter et
nécessiter l’utilisation plus fréquente d’antibiotiques du groupe 5.
I/ 3.2 Stop-TB
En 2006, la stratégie « Stop-TB » établie autour du DOTS lance le « Global Plan to stop-TB »
2006-2015 visant d’ici 2015 à maitriser l’incidence de la tuberculose et inverser sa tendance. Le
but est de réduire de moitié les taux de prévalence et de mortalité par rapport à l’année 1990.
Pour atteindre ces objectifs, de nouveaux éléments sont ajoutés:
-
La prise en compte des souches MDR et XDR dans le traitement ainsi que des patients coinfectés avec le VIH ;
-
La contribution au renforcement du système de santé ;
-
L’engagement de tous les acteurs de la santé ;
-
L’implication des patients et des communautés dans le contrôle de la tuberculose ;
-
La promotion de la recherche au niveau du diagnostic, de la vaccination et du traitement.
Des objectifs seront fixés par l’OMS d’ici 2015 comprenant des taux de dépistage et de
traitement à atteindre (traitement de 50 millions de tuberculeux, réduction de moitié de la
prévalence et du nombre de décès, thérapie antivirale à 3 millions de patients co-infectés avec le
16
Figure 4 : Taux d’incidence de la tuberculose dans le monde en 2011. (Rapport mondial
sur la lutte contre la tuberculose, OMS, 2012).
INTRODUCTION
VIH), ainsi que le développement d’outils de diagnostic. Ces objectifs comprennent également la
découverte de nouveaux antituberculeux permettant de diminuer la durée du traitement et d’un
nouveau vaccin, sûr et efficace. Ils ont pour but final de pouvoir éliminer la tuberculose des
problèmes majeurs de santé publique en 2050.
I/ 3.3 Bilan épidémiologique en 2011
En 2011, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a constaté 8.7 millions de nouveaux cas
répartis de façon non-homogène sur la planète (figure 4) et entre 0.84 et 1.1 million de décès
(Rapport mondial sur la lutte contre la tuberculose, OMS, 2012). La répartition des cas de TB
dans le monde repose principalement sur des facteurs sociaux. En effet, la surpopulation la
malnutrition et l’insalubrité sont des facteurs propices au développement de la maladie à travers
l’affaiblissement du système immunitaire. L’apparition du virus du VIH dans les années 1980 a eu
un impact important sur l’évolution de la tuberculose. Depuis les années 1995, date à laquelle
l’OMS met en place la stratégie DOTS, on peut observer une baisse des courbes : d’incidence, de
mortalité, de prévalence, ainsi que de l’incidence de la tuberculose chez les personnes VIH
positives (figure 5). En extrapolant cette tendance, les objectifs (déclarés pour le programme
« Stop-TB ») de diminuer de 50% le taux de prévalence et de mortalité devraient être atteints.
Ces tendances se traduisent par des chiffres très encourageants. En effet, entre 1995 et 2011, 51
millions de patients atteints de tuberculose ont été traités avec succès dans les programmes
DOTS et « Stop-TB », et on estime à 20 millions environ le nombre de vies sauvées. Globalement,
le taux de réussite du traitement a augmenté de 57% en 1995 à 85% en 2010, remplissant ainsi
l’objectif du programme DOTS.
Cependant, malgré ces chiffres très encourageants, l’ensemble de la communauté scientifique
pointe du doigt, l’évolution des cas de tuberculoses résistantes (Gandhi et al, 2010). L’OMS
dénombrait en 2011, 630 000 cas de tuberculose provoqués par une souche Mtb MDR. Même si
actuellement les données sont insuffisantes pour avoir une idée de l’incidence de la tuberculoseMDR, la tendance est suffisamment inquiétante pour qu’en 2009 un système de rapport
informatique des cas de tuberculose-MDR ait été mis au point (WHO, 2011). Le traitement des
tuberculoses-MDR est un objectif du programme STOP-TB. Nous disposons maintenant, en 2013,
des premiers résultats de l’action de ce programme. Entre 2009 et 2011, le pourcentage de
patients infectés par une souche MDR ayant accès à un traitement spécifique a largement
augmenté mais ne demeure que de 18% pour les 30 pays étudiés (Falzon et al, 2013). Ce
17
Taux / 100 000 population
Incidence
Taux / 100 000 population
Prévalence
Taux / 100 000 population
Prévalence
Figure 5 : Evolution de l’incidence, de la prévalence et de la mortalité entre 1991 et 2011
Tendance globale du taux d’incidence (vert), de prévalence (bleu) et de mortalité (orange).
Le taux d’incidence chez les personnes HIV positives est représenté par une courbe (rouge).
La ligne pointillée représente l’objectif du programme StopTB pour 2015.
INTRODUCTION
pourcentage insuffisant signifie que la majorité des cas de tuberculoses MDR n’a pas été prise en
charge par un traitement adapté. Cette situation est probablement responsable de l’apparition
de souches XDR dans un nombre croissant de pays. De plus, en 2009, une étude rapportée par
l’OMS sur une cohorte de 15 personnes en Iran a mis en évidence des souches résistantes à tous
les antibiotiques testés (Migliori et al, 2012). Ces souches ont été nommées par ces auteurs
XXDR pour «extremely drug resistant ». Une autre équipe a rapporté le cas de souches
résistantes à tous les antibiotiques existants : TDR « totaly drug resistant » (Velayati et al, 2009).
Même si ces cas restent marginaux, il n’en demeure pas moins que cette évolution est
inquiétante et doit faire l’objet d’un investissement majeur. En effet, il est nécessaire d’effectuer
une amélioration de la prise en charge des tuberculoses résistantes et de développer
rapidement de nouveaux antituberculeux sans quoi la tuberculose risque de demeurer un
problème de santé majeur même après 2050.
18
Pathogènes
Figure 6 : Arbre phylogénétique de 119 espèces mycobacteriennes. Pathogènes,
Opportunistes, Saprophytes, ___ Croissance lente, ___ croissance rapide (Gutierrez, Supply
et al. 2009)
INTRODUCTION
II.
Les mycobactéries
Les mycobactéries sont classées dans le genre Mycobacterium faisant lui-même partie de l’ordre
des actinomycetales caractérisé par une croissance sous forme de mycelium. Ce sont des bacilles
à coloration de Gram positive qui mesurent entre 2 et 5 µm de longueur et entre 0.2 à 0.5 µm de
diamètre. 49 génomes ont actuellement été séquencés notamment ceux des pathogènes Mtb
(Cole et al, 1998a), M.leprae (Cole et al, 2001), du pathogène atténué M.bovis BCG (Brosch et al,
2007), et du saprophyte Msm. Leurs génomes sont à haut taux en GC (61 à 71%) et de tailles
variables, le génome le plus petit étant celui de Mycobacterium leprae (3.27 Mb). Des études
taxonomiques ont rapidement défini une séparation entre les espèces de mycobactéries à
croissance lente et rapide. Les mycobactéries à croissance rapide nécessitent moins de 7 jours
pour obtenir des colonies sur milieu solide tandis que celles à croissance lente nécessitent plus
de 7 jours. De façon intéressante les bactéries à croissance lente regroupent l’ensemble des
espèces pathogènes tandis que les bactéries à croissance rapide regroupent une large majorité
d’espèces saprophytes (Gutierrez et al, 2009) (Figure 6). Il semble donc y avoir une forte
association, dans le cas d’infection d’hôtes immunocompétents, entre faible vitesse de
croissance et pouvoir pathogène.
II/ 1 Lignage de Mtb et Co-évolution avec l’homme
Toute les mycobactéries pathogènes sont phylogénétiquement proches (Figure 6), mais on
distingue parmi elles un sous-groupe appelé complexe Mtb. Ces bactéries sont génétiquement
très proches (99.9% de similarité). Plus précisément, on regroupe au sein de ce complexe les
espèces suivantes caractérisées en partie par leurs spécificités d’hôte: Mtb (Homme),
M.africanum (Homme), M.caprae (chèvre et mouton), M.microti (campagnol), M.bovis (bovin),
M.pinnipedii (lion de mer et phoque) et M.canetti. Ce dernier diffère des autres espèces par la
nature de ses colonies. En effet, M.canetti forme des colonies dites lisses contrairement aux
colonies rugueuses des autres espèces du complexe. De plus, il n’y aucune preuve de
transmission homme-homme de cette souche combinée au fait que les isolats cliniques sont
rares, il est possible d’avancer que cet organisme est probablement un pathogène opportuniste
(Gagneux, 2012). L’apparente absence de transfert de gènes et de recombinaison génétique
entre ces espèces indique que la structure de la population peut être guidée par une réduction
de la diversité. Cela peut s’expliquer par le développement clonal, la spécialisation de l’hôte, le
mode d’infection ou la formation de granulome au cours de l’infection par ces espèces. Cette
19
INTRODUCTION
notion implique que les délétions acquises dans un génome d’une espèce donnée ne peuvent se
réparer du fait de l’absence de séquences homologues nécessaires au système de réparation par
recombinaison homologue. Cela implique que dans ce complexe, les espèces ayant une délétion
donnée dans leur génome découlent d’une espèce possédant cette région. En suivant cette
logique Brosch et collaborateurs ont pu mettre en évidence un lignage entre les espèces de Mtb,
M.canetti, M.africanum, M.microti, et M.bovis (Brosch et al, 2002). En effet, il semble que
l’ensemble des souches du complexe Mtb découle d’une souche ancestrale de Mtb ou de
M.canetti. Une étude plus récente a confirmé cette organisation en marquant davantage les
différences entre lignage ancien et moderne (Hershberg et al, 2008). Il semblerait également que
M.canetti et les autres bacilles à colonies lisses puissent représenter le groupe comprenant
l’ancêtre commun du complexe Mtb (Gutierrez et al, 2005). La découverte d’un cas de
tuberculose osseuse il y a 500 000 ans, comme évoqué dans l’avant-propos de ce manuscrit, ne
semble donc pas illusoire. Pourtant l’origine préhistorique de l’ancêtre de Mtb semble mal
admise dans la communauté scientifique, peut-être, comme la majorité des études allant contre
les dogmes préétablis ? Il n’en demeure pas moins que la compréhension de l’origine de Mtb et
de son évolution sont des points fondamentaux dans la compréhension de la physiologie de Mtb
et donc dans la lutte contre la tuberculose.
Des études s’intéressant plus particulièrement à la phylogénie des souches du complexe Mtb
« adaptées » à l’Homme ont permis d’établir un lien entre les souches et leur localisation
géographique et donc avec une population humaine donnée (Hershberg et al, 2008). Les auteurs
montrent également que M.africanum représenterait le lignage le plus basal du complexe Mtb.
Ce lignage n’est retrouvé qu’en Afrique. L’ensemble de ces informations a amené les auteurs à
proposer un scénario évolutionnaire des origines de la tuberculose. Ce scénario décrit la
dissémination de la tuberculose à partir de l’Afrique au cours de la migration humaine et la
différenciation des souches en fonction des populations géographiques décrites précédemment.
Même si ce scénario pose encore quelques questions non résolues, l’ensemble de ces données
semble établir néanmoins les bases d’une longue interaction entre l’homme et les
mycobactéries pathogènes. Ce qui pose la question d’une éventuelle coévolution. Même s’il est
extrêmement difficile de prouver cette théorie, certaines études semblent tout de même la
soutenir (Gagneux et al, 2006; Reed et al, 2009).
II/ 2 Physiopathologie de la tuberculose
20
Figure 7 : Cycle infectieux de Mtb (D’après Russell et al, 2007). Mtb infecte l’Homme par
les voies aériennes supérieures, puis il est reconnu et phagocyté par des cellules du système
immunitaire notamment les macrophages alvéolaires. Cela provoque une réponse immune
et inflammatoire localisée, permettant le recrutement d’autres cellules de l’immunité
aboutissant à la formation d’un granulome. Avec le temps et la multiplication de Mtb le
granulome se caséifie puis se rompt en libérant Mtb. (
INTRODUCTION
II/ 2.1 Cycle infectieux de Mtb
Mtb infecte l’Homme par les voies aériennes supérieures, puis il est reconnu et phagocyté par
des cellules du système immunitaire notamment les macrophages alvéolaires. Dans 70% des cas,
les bactéries sont lysées par les mécanismes bactéricides du macrophage. Cependant dans les
30% des cas restants Mtb est capable de survivre. Cela provoque une réponse immune et
inflammatoire localisée, permettant le recrutement d’autres cellules de l’immunité comme les
lymphocytes B et T. Dans 5 % des cas, la personne infectée déclare une tuberculose dite active,
c’est-à-dire qu’elle présente des symptômes de la maladie et peut infecter son entourage.
Cependant, dans l’immense majorité (95%), les cellules de l’immunité recrutées au site
d’infection participent à la formation d’une structure multicellulaire : le granulome. Celui-ci est
constitué en son centre de macrophages infectés, puis de “foamy macrophages“ et de
phagocytes mononucléaires. La périphérie est, quant à elle, constituée de lymphocytes en
association à des fibres de collagène et d’autres composants de la matrice extracellulaire. Ce
stade « contenu » est appelé phase de latence de la maladie, durant laquelle l’hôte ne présente
pas de signe clinique et n’est pas contagieux. La structure cellulaire du granulome permet de
contenir Mtb, vraisemblablement en état de dormance, par l’action combinée de plusieurs
stress : hypoxie, oxyde nitrique, ROS, et carence en nutriments. Le bacille peut ainsi perdurer en
état de dormance au sein du granulome durant plusieurs années. A cette période de latence,
peut succéder une phase de réactivation de la maladie vraisemblablement provoquée par un
changement d’état immunitaire de l’hôte (personnes âgées, malnutrition, co-infection avec le
VIH…). Cette réactivation provoque l’apparition des lésions caséeuses spécifiques de la
tuberculose, provoquant des cavernes et une destruction du tissu pulmonaire par nécrose totale
des cellules. Cette phase est la phase active de la maladie où l’hôte est contagieux pour son
entourage (pour revue (Ernst, 2012; Russell et al, 2010)(Figure 7).
II/ 2.2 Relation de Mtb aux macrophages
a. La phagocytose
Mtb est reconnu directement par les macrophages par différents récepteurs. Les « Toll like
receptors » (TLR) notamment le TLR2 et TLR9 qui reconnaissent un grand nombre de composés
dont des composés de l’enveloppe (lipoprotéines et le lipomananne) (Banaiee et al, 2006) ou
encore l’ADN des mycobactéries (Bafica et al, 2005). Mtb est également reconnu par les
récepteurs de type lectine C dont le récepteur au mannose, DC-SIGN, dectine 1 et mincle (pour
21
INTRODUCTION
revue, (Ernst, 2012)). Mtb est également reconnu par la voie opsonique c’est-à-dire par les
récepteurs des parties constantes (Fc) des immunoglobulines et par le récepteur du complément
de type 3 (CR3). Le type de récepteur par lequel Mtb pénètre dans le macrophage a des
conséquences importantes sur la survie du bacille. Par exemple, l’internalisation dans les
macrophages humains via le récepteur au mannose ne déclenche ni la production de réactifs
oxygénés, ni la maturation du phagosome (Astarie-Dequeker et al, 1999). C’est donc une voie
d’entrée présentant moins de stress pour le bacille tuberculeux. En ce qui concerne la
phagocytose opsonique, l’entrée par le récepteur Fc implique une réaction oxydative et une
réponse inflammatoire du macrophage. A contrario, l’internalisation via CR3 prévient l’activation
des macrophages (Caron & Hall, 1998). De plus, l’entrée CR3-dépendante nécessite la présence
de cholestérol sur la paroi de l’hôte (Gatfield & Pieters, 2000; Peyron et al, 2000). Dans le même
ordre d’idée, la présence de cholestérol dans le phagosome contenant Mtb est nécessaire pour
l’inhibition de la fusion du phagosome et du lysosome (Gatfield & Pieters, 2000). Une activation
du macrophage ne représente pas nécessairement un avantage pour l’hôte car l’activation
médiée par l’interleukine 4 et 13 provoque une inhibition de l’autophagie et une incapacité à
maitriser l’infection (Harris et al, 2007).
b. Vue classique des mécanismes de résistance de Mtb aux
pouvoirs bactéricides des macrophages
Mtb est confronté au sein des macrophages principalement et classiquement à deux grandes
activités bactéricides.
Tout d’abord la mise en place par le macrophage de la production d’ions superoxydes générés
par un complexe NADPH assemblé au niveau de la membrane du phagosome. La génération de
ce composé ainsi que des métabolites en découlant (peroxyde d’hydrogène, les ions
hypervalents) sont très toxiques pour la plupart des espèces bactériennes. Cependant, Mtb est
capable à travers l’expression de gènes codant pour des protéines de type superoxydedismutase de tolérer ces stress (Braunstein et al, 2003; Piddington et al, 2001; Shi et al, 2003).
De plus, plusieurs composants de l’enveloppe, les réductases ainsi que les gènes de production
des mycothiols semblent jouer un rôle important. Une étude plus récente indique également
que Mtb protège son ADN du stress oxydatif en formant une barrière physique grâce à la
protéine Lsr2 (Colangeli et al, 2009; Qu et al, 2013).
22
Figure 8 : Schématisation des voies possibles d’autophagie d’une bactérie (Levine et al,
2011). Voies possibles impliquant la machinerie d’autophagie par laquelle les bactéries (et
les membranes endommagées par les bactéries contenues dans des vacuoles) peuvent être
dirigées vers le lysosome. L’adaptateur (adaptator, en orange) se réfère aux protéines
encore inconnues pouvant être impliquées dans la reconnaissance des agents pathogènes,
et impliquées dans les mécanismes ubiquitine-dépendants ou indépendants.
INTRODUCTION
La seconde activité bactéricide majeure du macrophage est l’acidification du phagosome grâce à
sa fusion avec des lysosomes, ce qui provoque notamment l’accumulation sur sa membrane de
complexes de type V-ATPases (Hackam et al, 1997). Ce processus a pour conséquence de voir le
pH diminuer rapidement entre 4.5 et 5. De plus, la maturation du phagosome se traduit
également par le recrutement d’hydrolases lysosomales ayant des activités de type
protéolytique ou lipolytique. Ces molécules sont capables de dégrader la plupart des composés
biologiques. Mtb, pour résister à ce processus, semble moduler la maturation du phagosome en
inhibant la fusion phagosome lysosome. En effet, ce mécanisme d’arrêt de la maturation a été
très bien étudié montrant que Mtb est capable de manipuler un grand nombre de molécules de
l’hôte, notamment le phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P). En effet, Mtb semble à même de
bloquer la synthèse de cette molécule en inhibant la PI3 Kinase (Vergne et al, 2003; Vergne et al,
2005) mais également de dégrader cette molécule en sécrétant la phosphatase acide SapM (Puri
et al, 2013; Vergne et al, 2005). D’autres mécanismes sont également mis en jeu (pour revue
(Russell, 2011)) comme, de façon non exhaustive, l’inhibition des protéines de l’hôte par
phosphorylation grâce à la protéine pknG (Walburger et al, 2004), ou l’altération de la
signalisation calcique, toutes deux nécessaires à la fusion phagosome lysosome (Jayachandran et
al, 2007). L’ensemble de ces mécanismes a pour conséquence un maintien du pH à 6 au sein des
macrophages (pour revue (Rohde et al, 2007)) ainsi qu’une localisation et une réplication de Mtb
dans le phagosome (Rohde et al, 2012).
c. Vue alternative des mécanismes de résistance de Mtb aux
pouvoirs bactéricides des macrophages
L’étude menée par Rhode et collaborateurs montre également que 12-25% des bactéries ne sont
pas entourées par une membrane phagosomale intacte après 3 à 4 jours d’infection. Cette
observation va dans le sens que Mtb n’est pas restreint au sein du phagosome. En effet, depuis
2007 les travaux « fondateurs » de Van der Wel et collaborateurs (van der Wel et al, 2007) ont
amené une nouvelle notion : l’échappement de Mtb du phagosome. Cette étude a été sujette à
de nombreuses controverses. Cependant, ces résultats ont été récemment confirmés par deux
laboratoires (Houben et al, 2012; Simeone et al, 2012). Il semble qu’un consensus émane de ces
différentes études sur le rôle central du système de sécrétion ESX-1 dans ce mécanisme.
Le travail très élégant réalisé par Simeone et collaborateurs confirme l’échappement de Mtb
dans le cytosol, mais également que l’échappement provoque probablement la mort par nécrose
23
INTRODUCTION
du macrophage. Cette dernière observation est cependant en opposition avec plusieurs études
montrant que Mtb inhibe l’activité apoptotique des macrophages afin d’échapper aux défenses
immunitaires (Gan et al, 2008). Cette opposition et le mécanisme d’échappement vers le cytosol
suggèrent que les mécanismes de résistance de Mtb dans le macrophage (bien que très étudiés)
sont sans doute plus complexes qu’imaginés auparavant.
d. L’autophagie participe au contrôle de l’infection par Mtb
L’implication de l’autophagie comme mécanisme de défense de l’hôte a été mise en lumière lors
de l’infection par Mtb (Gutierrez et al, 2004). Ce mécanisme, en absence d’infection, maintient
l’homéostasie au sein du macrophage en permettant une dégradation et un recyclage
d’organites et de protéines (Xie & Klionsky, 2007) notamment en cas de carence en nutriments.
L’autophagie semble également avoir un rôle important en cas d’infection par Mtb que ce soit au
sein du phagosome ou lors de son échappement dans le cytosol. Ce mécanisme est induit
notamment par l’interféron γ, la présence de ROS et l’activation des TLRs (pour revue, (Songane
et al, 2012)). Cette induction provoque le recrutement d’une membrane plasmique, provenant
principalement du réticulum endoplasmique, son élongation, ainsi que son interaction avec les
cargos cellulaires pour former un autophagosome. L’autophagosome s’assemble autour du
microbe présentant les protéines clés de l’autophagie, telles que la protéine LC3 et l’ubiquitine
(Levine et al, 2011) (Figure 8). Il fusionne ensuite avec le lysosome provoquant, comme
précédemment, une acidification et la dégradation du microbe. Ce mécanisme ne semble pas
posséder de système de reconnaissance spécifique des microorganismes. Cependant, dans le cas
de Mtb, il semble que le bacille puisse inhiber la maturation de l’autophagosome, tout comme
dans le cas du phagosome. Cette inhibition est encore mal comprise mais fait actuellement
l’objet de nombreuses recherches. L’inhibition des facteurs de virulence impliqués dans
l’inactivation et la résistance à l’autophagie pourrait être une stratégie thérapeutique
intéressante.
II/ 2.3 Adaptation physiologique de Mtb au granulome
Une propriété majeure de Mtb au sein du granulome est sa capacité de tolérance aux
antibiotiques notamment à l’INH, bien que des études in vivo aient montré que l’INH avait la
capacité de pénétrer dans toutes les lésions provoquées par Mtb dans les poumons humains
(Barclay & Winberg, 1964). Cette observation suggère un changement physiologique du bacille
qui lui permet une tolérance aux antibiotiques. Une explication est donnée par le modèle de
24
Figure 9 : Schématisation du fonctionnement du système à deux composants dosTS/R en
présence des stress présents au sein du granulome. La partie senseur de DosS perçoit la
diminution de la concentration en dioxygène (O2) ainsi que la présence d’espèces réactives
tel que l’oxyde nitrique (NO). La réception d’un de ces signaux chimiques provoque la
dimérisation de DosS et DosR, son autophosphorylation ainsi que la phosphorylation du
régulateur DosR qui peut alors venir se fixer sur les séquencés promotrices des gènes de
son régulon.
INTRODUCTION
Wayne, qui définit l'état de Mtb comme un état de non réplication et de non division (Wayne,
1994). Ce modèle se base sur l’environnement présent au sein du granulome humain. En effet, le
granulome limite la croissance de Mtb en privant le bacille d’oxygène, de nutriments et l’expose
à des pH très faibles et à des effecteurs immunitaires comme l’oxyde nitrique, élément le plus
limitant de la croissance de Mtb semblant être l'oxygène. La capacité de Mtb à survivre dans le
granulome indique néanmoins que la bactérie a développé des stratégies d'adaptation. Cette
capacité semble reposer sur l'utilisation de plusieurs facteurs comme : les tyrosines kinases,
facteurs sigma et système à deux composants dont notamment le système DosST/R.
a. L’hypoxie et le rôle du système DosST/R
Le système DosST/R permet à la bactérie de détecter et d’adapter sa physiologie à l’hypoxie, par
l’intermédiaire de ses deux histidines kinases (DosST) et du régulateur transcriptionnel DosR
(Figure 9). Ce système a été découvert à l’origine en étudiant, par des travaux de
transcriptomique les gènes exprimés différemment, par une souche virulente et non virulente de
Mtb (Dasgupta et al, 2000). Dénommé Dos pour Dormancy Survival, ce système à deux
composants est capable de détecter le niveau d’oxydoréduction du milieu grâce au senseur
DosS, qui reconnait les ions ferriques, et le taux d’oxygène par la protéine DosT. DosS est aussi
impliqué dans la reconnaissance de l’oxyde nitrique (Voskuil et al, 2003). Ces deux histidines
kinases sont ensuite capables d’activer DosR par phosphorylation (Figure 9). La fixation sur l’ADN
se réalise au niveau d’un motif consensus, en amont des promoteurs de gènes en réponse aux
stress notamment à l’hypoxie. Le régulon DosR comprend environ 50 gènes dont la fonction de
certains restes inconnus. Les analyses bioinformatiques suggèrent que la majorité des gènes
jouent un rôle dans le métabolisme des carbohydrates et des acides gras, ainsi que dans le
transport des électrons (Murphy & Brown, 2007). Très récemment, une étude issue d’un
programme de recherche à grande échelle menée par le NIH a montré le rôle central du gène
rv0081 (Galagan et al, 2013), qui semble faire partie du régulon DosR. Au cours de l’analyse
transcriptionnelle de Mtb en condition d’hypoxie, il ressort que rv0081 est le point central de
l’adaptation à l’hypoxie. Ce régulateur transcriptionnel permet notamment de réguler plusieurs
gènes impliqués dans le métabolisme des lipides tel que la biosynthèse des acides mycoliques
(inhA, mabA, fas). De plus, cette étude montre clairement l’implication de Rv0081 et du système
DosST/R dans une moindre mesure dans l’adaptation à l’hypoxie initiale et à plus long terme.
b. Adaptation métabolique.
25
Figure 10 : Schéma du cycle de l’acide citrique, du glyoxylate, et du méthyl citrate (d'après
Munoz-Elias and McKinney, 2006). CIT, citrate synthase; ACN, aconitase; ICD, isocitrate
dehydrogenase; KGD, 2-ketoglutarate decarboxylase; SSD, succinic-semialdehyde
dehydrogenase; SDH, succinate dehydrogenase; FUM, fumarase; MDH, malate
dehydrogenase; MQO, malate:quinone oxidoreductase; ICL1, isocitrate lyase isoform 1;
ICL2, isocitrate lyase isoform 2; MLS, malate synthase; MCS, methylcitrate synthase; MCD,
methylcitrate dehydratase; MCL, 2-methylisocitrate lyase.
INTRODUCTION
Mtb est capable d’adapter sa physiologie au stress hypoxique et aux effecteurs immunitaires
mais aussi au manque de nutriments. Des études transcriptomiques dans le modèle de Wayne
mettent en avant une surexpression de gènes, codant pour des enzymes de biosynthèse d’acides
gras tel que le gène tgs1 (triglycéride synthase 1) (Sirakova et al, 2006). Des études ont montré
l’implication de DosR et rv0081 dans la régulation du gène codant cette protéine (Chauhan &
Tyagi, 2009; Galagan et al, 2013). L’ensemble de ces gènes de biosynthèse est aussi surexprimé
dans les bacilles issus de poumons humains (Rachman et al, 2006). Les travaux portant sur les
gènes de biosynthèse des acides gras, appuyés par des études génomiques suggèrent que Mtb
est capable de survivre dans un environnement nutritif riche en acide gras, et pauvre en
carbohydrates (Cole et al, 1998b) ; (McKinney, 2000). De plus, la délétion du gène tgs1 provoque
l’élimination complète des triglycérides chez Mtb en condition de stress multiple ainsi qu’une
augmentation de la sensibilité aux antibiotiques (Deb et al, 2009). De façon logique, on observe
une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans la β-oxydation. En effet, les acides
gras stockés sous forme de triglycérides sont convertis en acyl-CoA par 5 étapes de β-oxydation
nécessitant l’action de nombreuses enzymes. Mtb possède plus de 250 enzymes impliquées dans
le métabolisme des lipides (en comparaison E.coli en possède 50), ce qui suggère l’importance
des acides gras comme source de nutriments pour Mtb.
Lorsque les bactéries sont cultivées sur un milieu ayant comme principale source de carbone les
acides gras, l’alimentation du cycle de l'acide citrique se réalise via le cycle du glyoxylate, qui
convertit les molécules d’acétyl-CoA provenant de la β-oxydation des acides gras en
oxaloacétate, un intermédiaire du cycle de l'acide citrique. Bien que le cycle de l'acide citrique et
le cycle du glyoxylate aient de nombreuses enzymes en commun, deux enzymes sont spécifiques
à ce dernier : l’isocitrate lyase (ICL), qui catalyse le clivage de l'isocitrate en glyoxylate et
succinate, et la malate synthase (MLS) qui assure la condensation de glyoxylate et de l'acétylCoA en malate (Figure 10) (pour revue (Munoz-Elias & McKinney, 2006)). Mtb possède dans son
génome deux gènes (icl1 et icl2) codant pour des isocitrates lyases. Les bactéries dépourvues de
ces deux enzymes sont incapables de se développer sur milieu riche en acides gras ou dans les
macrophages, et sont rapidement éliminées des poumons de souris infectées (Munoz-Elias &
McKinney, 2005). De plus, il a été montré que le succinate joue un rôle prépondérant dans
l’adaptation à l’hypoxie. En effet, deux études montrent que le succinate est sécrété et permet
de maintenir une polarisation de la membrane nécessaire à la survie de Mtb également en phase
non-réplicative (Beste et al, 2011; Watanabe et al, 2011).
26
INTRODUCTION
De plus, Mtb a la capacité de métaboliser le cholestérol (Pandey & Sassetti, 2008). Les auteurs de
cet article ont montré que les gènes codant Mce4 (un transporteur du cholestérol) ou pour HsaC
(une enzyme clé de catabolisme du cholestérol) sont essentiels à la croissance sur un milieu où le
cholestérol est la seule source de carbone. Les souches mutantes (ΔMce4 ou ΔHsaC) inoculées à
des souris, présentent une incapacité à persister au cours du temps de façon identique à une
souche délétée pour Icl1. La métabolisation du cholestérol augmente le « pool »de propionate
de la bactérie. Or, Icl1 est impliqué dans l’utilisation du propionate (Munoz-Elias et al, 2006), ce
qui implique que les gènes icl1, mce4, et msaC sont essentiels à l’utilisation du cholestérol. Cela
souligne d’autant plus l’intérêt de cibler l’Icl1 au cours d’un traitement contre la tuberculose. Les
« foamy macrophages » (FMs) provenant de la différenciation de macrophages possèdent des
inclusions lipidiques riches en acides gras, esters de cholestérol et cholestérol qui semblent être
utilisés par la bactérie comme source de carbone (Russell et al, 2009). Les acides mycoliques qui
sont des acides gras à longue chaîne composant l’enveloppe (confère paragraphe III/ 2.2c p. 32)
prennent une part importante dans cette différenciation (Peyron et al, 2008). De plus, une fois
au contact des FMs la bactérie passe très rapidement d’un état réplicatif à un état non réplicatif.
Ceci suggère que Mtb prend une part active dans la formation des FMs et peut-être dans la
formation du granulome comme le suggèrent les travaux réalisés dans le poisson zèbre infecté
par M.marinum (Davis & Ramakrishnan, 2009).
c. Maintien de la balance redox
La β-oxydation des acides gras en acyl-CoA semble être, comme dit précédemment, une étape
importante de l’adaptation de Mtb à la phase de latence, qui est limitée par la disponibilité
d’accepteur terminal d’électron du fait du manque de dioxygène. Pour que les différentes étapes
du métabolisme aient lieu, il est nécessaire de maintenir un équilibre redox. Cet équilibre est
réalisé par le maintien du rapport NADH/NAD+ dans la cellule. Autrement dit, le nombre de
réactions générant du NADH doit être contrebalancé par des réactions générant son homologue
oxydé. L’absence d’oxygène déstabilise cet équilibre, mais Mtb a la capacité de le rétablir en
faisant appel à des transporteurs et accepteurs électroniques alternatifs (Boshoff & Barry, 2005)
et par le recyclage et la synthèse de novo des cofacteurs nicotinamides (Boshoff et al, 2008).
Mtb est capable, en état de dormance, de réguler les enzymes composant la chaîne respiratoire
comme le montrent des études transcriptomiques in vitro et in vivo (Shi et al, 2005). L’ensemble
des enzymes est réprimé, ce qui est en adéquation avec l’état non réplicatif de Mtb et donc avec
le ralentissement de son métabolisme. Cependant, la fonction de respiration est essentielle pour
27
Figure 11 : Modèle de la chaine respiratoire de Mycobacterium tuberculosis durant la
phase de latence (d’après Rao et al., 2008).
INTRODUCTION
la survie de Mtb en état non réplicatif (Rao et al, 2008). Pour maintenir cette fonction Mtb
réprime fortement les enzymes impliquées dans le métabolisme aérobie. En effet, les gènes
codant les enzymes comme la NADH déshydrogénase I et les oxydases terminales (aa3
cytochrome c oxydase et cytochrome bd oxydase) sont réprimés. Cette inhibition de certaines
enzymes de la chaîne respiratoire est contrebalancée par l’expression d’enzymes alternatives.
Cela se traduit par le maintien du niveau d’expression de la déshydrogénase II, la surexpression
de l’opéron narGHJI et du gène narK2X permettant d’utiliser comme accepteur électronique
terminal : le nitrate (Shi et al, 2005)(figure 11). Une étude suggère que le furamate peut
également faire office d’accepteur terminal alternatif (Boshoff & Barry, 2005), mais le
mécanisme à ce jour le plus étudié durant la dormance de Mtb reste la respiration du nitrate.
Cette adaptation de la chaîne respiratoire permet de maintenir l’activité de la FoF1 ATP synthase
qui est responsable de la synthèse d’ATP, cette activité est, elle aussi, essentielle à la survie de
Mtb en état de dormance (Rao et al, 2008)(figure 11). Cependant, tout comme pour la βoxydation cette respiration est largement dépendante de la capacité de la cellule à maintenir
l’équilibre NADH/NAD+. Pour maintenir l’équilibre d’oxydoréduction, la cellule est capable
comme dit précédemment de recycler ou de synthétiser de novo le NAD. La synthèse de novo à
partir du tryptophane fait appel à une voie métabolique aérobie, cette voie est de façon logique
inhibée durant la phase de dormance. A l’opposé, les enzymes de la voie de recyclage du NAD
sont surexprimées dans le modèle de Wayne. En effet, in vivo, Mtb réalise un changement de la
synthèse de novo du NAD vers la voie de recyclage contrôlée par le régulateur DosR. La flexibilité
du métabolisme permet ainsi de maintenir un équilibre redox adéquat pour le maintien de
l’activité respiratoire et de la β-oxydation.
d. A qui profite le granulome ?
Le granulome maintient Mtb dans un état de non réplication et de non division. De cette
situation, nait un équilibre qui perdure durant plusieurs années. Toutefois, il est envisageable
que cet équilibre ne soit pas parfait à tout moment. En effet, des études chez la souris suggèrent
que durant la phase de latence il y aurait de courtes phases de réactivation (S. Ehlers, 2009). Ces
phases de réactivation correspondraient au recrutement au sein du granulome de foamy
macrophages, qui lors de leur migration permettraient une diffusion de l'oxygène au sein du
granulome. Or, il est établi que Mtb prend une part active dans la différenciation des
macrophages en foamy macrophages. On peut donc imaginer que ces phases de réactivation
soient provoquées par Mtb elle-même, soit pour infecter de nouveaux macrophages, car ceux-ci
28
Figure 12 : Modèle de prolifération de Mycobacterium tuberculosis au sein de l'organisme
et rôle du granulome dans le développement de la tuberculose. (Bold and Ernst, 2009). Les
étapes de formation du granulome au cours de la tuberculose expliquent le stade initial de
la maladie, qui se caractérise par l'expansion de la population bactérienne en l'absence de
l'immunité adaptative. La multiplication bactérienne et sa propagation est facilitée par la
formation du granulome naissant. Les macrophages infectés apoptotiques permettent de
recruter de nouveaux macrophages au site d’infecté. Ces macrophages recrutés
phagocytent les débris cellulaires ainsi que les bactéries. Certains macrophages
nouvellement infectés migrent et forment des granulomes secondaires. Lorsque l'initiation
de l'immunité adaptative se produit finalement, les lymphocytes T CD4+ et CD8+ sont
recrutés au niveau des tissus infectés pour limiter la croissance bactérienne. Bien qu'elle
soit essentielle pour le contrôle de l'infection, l’immunité adaptative ne peut pas éradiquer
Mtb. Le granulome mature représente un équilibre entre les mycobactéries virulentes et la
réponse immunitaire de l'hôte.
INTRODUCTION
ont une durée de vie trop courte par rapport à la durée de la phase de latence, soit pour établir
un équilibre statique entre mort et réplication de la bactérie et ainsi perdurer dans le granulome.
Ceci amène à se poser la question : à qui profite le granulome ? Cette question a récemment été
étudiée par l'intermédiaire d'un modèle d'étude de Mtb : M.marinum. M.marinum est capable
d'infecter son hôte (le poisson) et de former des granulomes. Dans ce modèle, les granulomes
permettent dans un premier temps de faciliter le développement des bacilles (Davis and
Ramakrishnan, 2009). M.marinum tout comme Mtb possède un système de sécrétion ESX-1
permettant de sécréter des antigènes tels qu'ESAT-6. Ce système est impliqué dans la régulation
de l'expression de deux gènes (mmp9 et timp2b) présents dans le génome des cellules
épithéliales de l'hôte, et qui codent pour des protéines impliquées dans la migration des
macrophages (Volkman et al., 2010). Le recrutement des macrophages par M.marinum permet à
cette dernière de se multiplier et d'infecter de nouveaux macrophages (Figure 12). Dans un
second temps se forme l'équilibre statique que nous évoquions auparavant et qui un jour, par
des mécanismes encore mal connus, pourra tourner en faveur de Mtb et provoquer le passage
dans la phase active de la maladie.
29
Capsule
Mycomembrane
Périplasme
Membrane plasmique
Glycolipide Phospholipide
AM
Porine
Figure 13 : Modèle structurale de l’enveloppe mycobactérienne (d’aprés Sani et al, 2010).
L’épaisseur des différentes couches de ce modèle de l’ultrastructure de l’enveloppe des
mycobactéries a été définie par la technique de CEMOVIS (Hoffmann et al, 2008), La couche
L1 représente la couche de peptidoglycane et la couche L2 l’arabinogalactane. Les liens
covalents entre le peptidoglycane, l’arabinoglactane et le feuillet interne de la
mycomembrane ne sont pas représentés.
INTRODUCTION
III.
L’enveloppe mycobactérienne
Le rôle central de l’enveloppe mycobactérienne au cours de l’infection, son implication dans la
résistance aux défenses immunitaires, ainsi que lors du traitement ont fait l’objet de très
nombreuses études. Sa composition, sa structure ainsi que les voies de biosynthèse de ses
composants sont assez bien définies.
III/ 1 Architecture
L’enveloppe des mycobactéries, et de façon plus générale celle des Corynebacterineae, possède
une caractéristique singulière au sein des bactéries de type Gram+ qui est de posséder une
réelle membrane externe. En effet, la connaissance de la structure fine de l’enveloppe des
mycobactéries a été récemment grandement améliorée par des travaux de Hoffmann et
collaborateurs et de Zuber et collaborateurs (Hoffmann et al, 2008; Zuber et al, 2008). Leurs
approches par CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Section), qui conserve les
structures grâce à une congélation extrêmement rapide limitant la formation de cristaux de
glace, a permis la visualisation d’une membrane externe de l’enveloppe proche de son état natif.
Cette membrane externe est composée de lipides, probablement des acides mycoliques et est
structurée en bicouche d’une épaisseur de 8 nm chez M.bovis et Msm. Ces résultats, associés
aux travaux antérieurs, permettent de définir un nouveau modèle structural de l’enveloppe
mycobactérienne (Figure 13). Ce modèle est classiquement décrit du cytoplasme vers le milieu
extracellulaire, avec tout d’abord la membrane plasmique surmontée d’une couche granulaire
séparée de la paroi par la lumière de l’espace périplasmique. La paroi est surmontée par la
mycomembrane puis par la capsule. La paroi est composée principalement de trois molécules
liées de façon covalente : le peptidoglycane (PG), l’arabinogalactane (AG) et les acides
mycoliques (AM). L’épaisseur de cette structure étant d’environ 20 nm dont environ 7 nm
pourrait correspondre au complexe AG-PG (Hoffmann et al, 2008; Zuber et al, 2008). Ce modèle
structural correspond sur le plan architectural à celui de l’enveloppe des bactéries à Gram
négative. Classiquement, les bactéries à coloration de Gram positive possèdent seulement une
couche de peptidoglycane épaisse (20 à 80 nm) surmontant un espace étroit et la membrane
plasmique et sont caractérisées par l’absence de membrane externe. Les bactéries à Gram
négative possèdent une membrane plasmique et une membrane externe composées de
bicouches lipidiques entourant un espace périplasmique important contenant une faible couche
30
Chaine méromycolique
A
Chaine alpha
B
Type d’AM
Structure
Espèce de
mycobactérie
α cis / cis
Méthoxy cis
Méthoxt trans
tuberculosis
Céto cis
Hydroxy cis
C
α trans / trans
α cis / cis
α’ cis
Smegmatis
Epoxy trans
Figure 14 : Représentation schématique de la structure des acides mycoliques (d’après
Vaubourgeix et al, 2009). A, structure générale d’un AM, D représente la décoration distale
et P la décoration proximale. B, structure des AM majoritaires de Mtb. C, structure des AM
majoritaires de M.smegmatis.
INTRODUCTION
de peptidoglycane (1 à 8 nm). Cette caractéristique des mycobactéries ne remet pas en cause
leur classification mais met en avant l’originalité et la complexité de leur enveloppe.
III/ 2 Composition biochimique
III/ 2.1 La membrane plasmique
La membrane plasmique est composée principalement de phospholipides structurés en bicouche
dans laquelle se trouvent de nombreuses protéines. On y trouve du phosphatidylinositol et ses
dérivés : la phosphatidyléthanolamine et le phosphatidylglycérol ainsi que des cardiolipides. Ces
derniers sont présents, chez Mtb au niveau des sites de croissance et de division et pourraient
avoir un rôle important dans la réplication mycobactérienne à travers leur interaction avec la
protéine centrale de ce système : DnaA (Maloney et al, 2011).
III/ 2.2 La paroi
La paroi est composée par un complexe covalent mAGP (mycolyl ArabinoGalactanPeptidoglycan). En plus du complexe mAGP, on retrouve également des protéines et des lipides
dits extractibles ou libres. Ces lipides extractibles sont intercalés au sein de la paroi mais ne sont
pas liés covalemment aux autres molécules.
a. Le peptidoglycane
Le peptidoglycane des bactéries est le plus souvent structuré par un enchaînement alterné
d’unités de N-acétylglucosamine (GlcnAc) et d’acide muramique (Mur) modifié. Ces polymères
sont reliés entre eux par des tétrapeptides de type L-alanyl–D-isoglutaminyl–mesodiaminopimelyl–D-alanine (L-Ala–D-Glu–A2pm–D-Ala), fixés sur le groupement carboxyle des
acides muramiques. Le peptidoglycane des mycobactéries diffère en deux points de cette
structure classique. Tout d’abord tous les résidus d’acides muramiques sont N-acétylés avec un
acide glycolique. Ensuite, le tétrapeptide comporte aussi bien des liaisons A2pm–D-Ala que des
liaisons A2pm-A2pm (Lederer et al, 1975). Ce réseau complexe est en grande partie responsable
du maintien de la forme de la bactérie et de sa rigidité. Sa biosynthèse est la cible de certains
antibiotiques comme la Vancomycine.
b. Arabinogalactane
31
INTRODUCTION
L’arabinogalactane dont la première structure fine a été proposée par Daffé et collaborateurs
(Daffe et al, 1990) est un hétéropolysaccharide ramifié. Il est constitué d’un domaine galactane
et d’un domaine arabinane complexe. De façon simplifiée, chez Mtb, le domaine galactane est lié
par une liaison phosphodiester à certains acides muramiques via un phosphodisaccharide
(Lederer et al, 1975). Il se compose de 32 résidus de D-galactofuranosyle (D-Galf). Les domaines
arabinanes sont liés aux résidus D-Galf (Besra et al, 1995). Chaque domaine arabinane se
compose de 27 unités de D-arabinofuranosyle (D-Araf). En position terminale, les domaines
arabinanes possèdent des motifs hexaarabinofuranosyle, chacun estérifiés par quatre acides
mycoliques terminaux. La biosynthèse de l’arabinogalactane est la cible d’un antituberculeux de
première ligne (confère paragraphe I/ 2.1 p 10), l’éthambutol, qui inhibe l’enzyme de
biosynthèse du domaine arabinane EmbB.
c. Mycomembrane
La mycomembrane est, selon toute vraisemblance, constituée d’AM liés à l’AG (i) et de lipides
extractibles (ii). La notion de lipide extractible est en rapport avec la propriété de ces lipides de
se solubiliser dans les solvants utilisés pour la purification des lipides de la paroi. De façon
contraire, le complexe mAGP reste dans la fraction insoluble.
(i) Les AM du mAGP sont généralement décrits comme faisant partie du feuillet interne de la
bicouche lipidique de la mycomembrane. Ils sont également appelés AM liés en opposition aux
AM présents dans les lipides extractibles. Les AM sont les constituants majeurs de l’enveloppe,
40 à 60% de la masse sèche totale de l’enveloppe, dont 90 à 95% se retrouvent dans le complexe
mAGP. Essentiels à la survie des mycobactéries, ils représentent une barrière de perméabilité
très importante. Sur le plan structural, il s’agit d’acides gras à très longue chaîne α-ramifiés et βhydroxylés pouvant atteindre 90 atomes de carbones (Figure 14A). Ils sont le résultat de la
condensation d’une chaîne dite méromycolique (C40-C60), avec une chaîne plus courte dite chaîne
alpha (C22-C26) (Asselineau & Lederer, 1950). Leur structure varie en fonction des espèces et au
sein d’une même espèce, principalement au niveau de la longueur de chaîne carbonée, des
fonctions chimiques décorant la chaîne méromycolique, et du degré d’insaturation de la chaîne
méromycolique (Lanéelle et al, 2012). Les fonctions chimiques (ou décorations) situées en
position dite proximale (proche de la fonction carboxylique) et distale (la plus éloignée de la
fonction carboxylique) sont caractéristiques d’un type d’AM donné. Un grand nombre de
structures d’AM a été résolu dans différentes espèces pathogènes ou non pathogènes. Dans le
32
INTRODUCTION
cas de Mtb, il existe quatre espèces d’AM majoritaires : les alpha-AM (cis/cis), céto-AM,
méthoxy-AM (cis et trans), hydroxy-AM (cis) (Figure 14B). Les alpha-AM possèdent en position
proximale et distale une cyclopropanation de conformation cis. Ces AM sont pour la majorité
composés de 78 et 80 atomes de carbone et en moindre mesure de 76 ou 82 carbones (Laval et
al, 2001). En effet, au sein d’une même classe d’AM d’une espèce de mycobactérie donnée on
peut retrouver des longueurs de chaîne différentes. Chez Msm les AM sont principalement de
type alpha-AM (cis/cis ou trans/trans), alpha’-AM et époxy-AM. Les alpha-AM de Msm ne
présentent que peu de cyclopropanations, et elles sont majoritairement remplacées par des
insaturations.
(ii) Les lipides extractibles de Mtb peuvent être classés en trois groupes majoritairement
présents dans le feuillet externe de la mycomembrane avec tout d’abord les glycolipides à
tréhalose. Le composé majoritaire de ce groupe est le dimycolate de tréhalose (DMT). Il s’agit
d’un 6,6’-dimycoloyl-α-D-tréhalose. Une forme ne présentant pas d’AM en position 6’ du
tréhalose, le MMT, est également présente. Ces composés sont décrits chez toutes les espèces
de mycobactéries. Les AM du MMT et DMT sont identiques aux AM retrouvés dans le complexe
mAGP. Les glycolipides à tréhalose comportent également des composés spécifiques au seul Mtb
complexe : les di-acyltréhaloses (DAT), tri-acyltréhaloses (TAT) and poly-acyltréhaloses (PAT). De
façon encore plus spécifique, les sulfatides (SL) composés d’une molécule de tréhalose soufré,
acylé par 2 à 4 acides gras, ne sont retrouvés que chez Mtb et M.canetti. Les lipooligosaccharides
(LOS) ne sont quant à eux retrouvés au sein du complexe Mtb que chez M.canetti. Le second
groupe de lipide extractible est composé de lipoglycanes notamment de phosphatidyl-myoinositol mannosides (PIM) et des formes plus glycosylées : lipomannane (LM) et
lipoarabinomannane (LAM). La structure de ces composés est relativement conservée entre les
différentes espèces de mycobactéries, seule l’extrémité mannoside (la coiffe) varie en fonction
des espèces. Les composants du dernier groupe sont des mycocérosates à lipides dénommés :
phenolic glycolipids (PGL) et phthiocerol dimycocerosates (PDIM). Ils sont spécifiques d’un petit
nombre de mycobactérie, notamment des pathogènes humains Mtb, M.leprae et M.ulcerans. Ils
ont donc fait l’objet de nombreuses études afin de rechercher un lien potentiel entre leur
présence et la pathogénicité de ces souches.
33
INTRODUCTION
III/ 2.3 Capsule
La capsule, d’une épaisseur de 35 nm chez Mtb et Msm, est la structure la plus externe de
l’enveloppe. Sa présence a été confirmée par des travaux de microscopie électronique par cryoplonge (Sani et al, 2010). Les composants de cette couche externe ne sont pas liés covalemment
aux autres constituants de l’enveloppe. Cette propriété rend la capsule labile, en condition de
culture in vitro de laboratoire qui utilise un détergeant pour limiter l’agrégation des bactéries
entre elles (Wright, 1992). Cette structure est principalement composée de polysaccharides et
de protéines (environ 97% de la capsule) et d’une faible proportion de lipides (Lemassu & Daffé,
1994; Ortalo-Magné et al, 1995). Chez Mtb, on retrouve trois polysaccharides : l’α-D-glucane, le
D-arabino-D-mannane, et le D-mannane. Le D-arabino-D-mannane à la même structure que le la
partie non lipidique du LAM décrit précédemment. Les protéines, quant à elles, représentent 40
à 55 % des composés de la capsule. On y retrouve les mycoloyltransférases FbpA,B et C (ou
antigènes 85 A,B,C) ou encore des protéines sécrétées par le système ESX comme les antigènes
ESAT-6 et CFP-10 (Niederweis et al, 2010; Sani et al, 2010).
III/ 3 Rôles et fonctions des composés de l’enveloppe
L’enveloppe est une barrière de perméabilité importante. En effet, les composés hydrophiles ont
une très faible capacité de diffusion à travers les bicouches lipidiques. Ils sont principalement
incorporés à travers les porines. Dans le cas des mycobactéries, ces porines semblent moins
présentes sur le plan quantitatif que chez les bactéries à Gram négative (Engelhardt et al, 2002;
Trias et al, 1992). De plus, les porines mycobactériennes à quantité égale de celles d’ E.coli
confèrent une perméabilité plus faible (Trias et al, 1992). Classiquement une membrane
plasmique est très perméable aux composés lipophiles. Cependant, cette propriété est
dépendante de la fluidité de la membrane (McElhaney et al, 1973). Or, les composés
hydrophobes diffusent particulièrement lentement à travers l’enveloppe des mycobactéries
(Jarlier & Nikaido, 1994). Cette observation indique donc, une faible fluidité de l’enveloppe. Il
semble que les AM soient les acteurs principaux de l’imperméabilité de l’enveloppe (pour revue
(Brennan & Nikaido, 1995)). En effet, le feuillet interne de la mycomembrane étant composé
d’AM fixés covalemment à l’arabinogalactane ne permet qu’une très faible fluidité. La longueur
des chaînes carbonées ainsi que les groupements chimiques qui la composent influencent la
fluidité de la membrane. Ainsi, la présence de cyclopropanations, de doubles liaisons trans et
d’AM oxygénés modifierai la fluidité de l’enveloppe (Dubnau et al, 2000; George et al, 1995; Liu
et al, 1996). De même, la présence de DMT dans le feuillet externe de la mycomenbrane
34
INTRODUCTION
influence la perméabilité de l’enveloppe (Jackson et al, 1999). Cette très faible perméabilité aux
composés hydrophobes pose certaines questions. Comment les nutriments sont-ils importés ?
Quels avantages l’imperméabilité de l’enveloppe confère-t-elle aux mycobactéries ? La première
question semble trouver une réponse à travers le transport actif du cholestérol (confère chapitre
II/ 2.3b p.25), mais l’import des acides gras reste cependant à déterminer. De plus, il semble que
l’import des nutriments puisse limiter la vitesse de division des mycobactéries (Stephan et al,
2005). La seconde question a été très étudiée car cette propriété de l’enveloppe confère entre
autre, une résistance passive à certains antibiotiques, aux stress, ainsi qu’un rôle dans la
modulation de la réponse immune.
Les composés de l’enveloppe, outre leurs rôles dans la structuration de l’enveloppe, jouent
chacun des rôles spécifiques. Les lipides extractibles ont probablement peu d’impact sur
l’architecture de l’enveloppe mais ils possèdent des rôles centraux au cours de la phagocytose,
du trafic intra-macrophagique et du contrôle de l’inflammation (pour revue (Neyrolles & Guilhot,
2011)). Le complexe mAGP semble lui, très impliqué dans la structure de l’enveloppe et comme
dit précédemment dans le maintien de la forme ainsi que dans la division de la bactérie (confère
chapitre III p. 30).
La mycomembrane et les AM sont impliqués dans de nombreux processus de résistance et de
pathogénèse. Sa localisation à l’interface entre la bactérie et le macrophage l’implique
naturellement dans le dialogue hôte/pathogène, comme le montre la haute immunogénicité du
TDM. De plus, le caractère essentiel et spécifique des AM font de leur biosynthèse une cible de
choix dans le cadre de la lutte contre la tuberculose. Les AM ne sont pas retrouvés dans les
espèces commensales de l’homme, ce qui permet aux traitements visant spécifiquement la
biosynthèse des AM de ne pas altérer cette flore essentielle. Comme nous l’avons vu
précédemment, la biosynthèse des AM est déjà la cible d’antituberculeux. Cependant son étude
est encore un challenge primordial dans le cadre de la lutte contre la tuberculose, notamment
dans le cadre de tuberculose MDR ou XDR.
Mon projet de thèse s’inscrit dans cet axe, plus particulièrement dans l’étude du couplage de la
biosynthèse des AM avec la croissance et la division cellulaire. En effet, une voie encore non
explorée et alternative pour inhiber la biosynthèse pourrait être de la découpler de la croissance
et de la division. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer une étude précise de l’implication de la
biosynthèse des AM au cours de l’élongation et la division bactérienne. De même, il sera
35
INTRODUCTION
primordial de définir les bases moléculaires de ce couplage afin de pouvoir éventuellement les
cibler à des fins thérapeutiques.
36
Synthèse des
précurseurs
des AM
Elongation et
modification de
la chaine
méromycolique
Condensation
des AM
Figure 15 : Organisation schématique de la voie de biosynthèse des AM, (d’après
Marrakchi et al, 2008). Les mycobactéries possèdent deux systèmes FAS afin de réaliser la
biosynthèse des AM. Le système FAS-I réalise la synthèse de novo des acides gras banals, de
la chaîne alpha des AM et des précurseurs du système FAS-II. Le système FAS-II effectue
l’élongation des produits de FAS-I pour former la chaine méromycolique. La chaîne
méromycolique modifiée est ensuite condensée avec la chaine alpha puis réduite pour
former un AM mature. CoA : coenzyme A, ACP : Acyl Carrier Protein.
INTRODUCTION
IV.
Biosynthèse des acides mycoliques
La volonté de compréhension de la voie de biosynthèse des AM a été grandement motivée par le
fait que l’un des plus anciens antibiotiques antituberculeux, et le plus efficace, l’INH, cible cette
voie. Il aura fallu un peu plus de 20 ans entre la découverte de l’INH (1945) et les premiers
travaux évoquant l’inhibition de la biosynthèse des AM comme mode d’action (Takayama et al,
1972; Winder & Collins, 1970). De plus, le caractère spécifique et essentiel des AM évoqué
précédemment a motivé le développement de nombreuses recherches visant à améliorer la
connaissance de sa biosynthèse afin de définir d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques, et
de développer de nouveaux antituberculeux. Cette pensée est encore d’actualité.
IV/ 1 Organisation générale
Les AM sont issus de systèmes de type Fatty-Acid-Synthase (FAS). L’originalité des mycobactéries
est de posséder deux systèmes FAS. Le premier nommé FAS-I est une enzyme unique multidomaine retrouvée généralement chez les eucaryotes supérieurs et les champignons mais
absente chez les plantes. Elle assure la biosynthèse de novo des acides gras ainsi que la synthèse
de la chaîne alpha des AM. Le système FAS-II présent chez les bactéries et les organelles des
plantes et des eucaryotes supérieurs est quant à lui composé par plusieurs enzymes différentes.
Chez les mycobactéries le système FAS-II ne permet pas d’effectuer la synthèse de novo d’acides
gras. Il réalise l’élongation de la chaîne méromycolique à partir d’acides gras issus de FAS-I. Les
réactions biochimiques mises en œuvre pour l’élongation des chaînes hydrocarbonées sont les
mêmes dans les systèmes FAS-I et FAS-II. Globalement sur le plan biochimique, la différence
majeure entre ces deux systèmes est la nature du transporteur d’acide gras (CoA ou ACP)(Figure
15).
Le système FAS-I réalise la synthèse de novo bimodale d’acides gras (C16-C18 et C24-C26) qui vont
ensuite être en partie pris en charge par le système FAS-II. Ce système effectue une élongation
importante pour former la chaîne méromycolique dont la longueur varie en fonction des espèces
(C74-C90). Après, ou en cours d’élongation, la chaîne méromycolique est modifiée par
l’introduction de fonctions chimiques spécifiques permettant la classification des AM. La chaîne
méromycolique est ensuite condensée avec la chaîne alpha (C24-C26) issue de FAS-I, puis réduite,
pour former un AM mature (Marrakchi et al, 2008) (Figure 15).
IV/ 2 Les antibiotiques ciblant la biosynthèse des AM
37
Figure 16 : Mécanisme d’action de l’inhibition de FAS-II par l’isoniazide (Vilchèze & Jacobs,
2007). L’INH est activé par katG pour former l'adduit INH-NAD. Le produit d'addition inhibe
l’enzyme InhA (enoyl-ACP réductase) du système FAS-II qui réalise la synthèse de la chaine
méromycolique des acides mycoliques.. Le résultat de cette inhibition conduit à l’arrêt de la
biosynthèse des acides mycoliques et finalement à la mort cellulaire. Trois classes d'acides
mycoliques sont représentées
INTRODUCTION
La biosynthèse des AM est la cible de deux antituberculeux très efficaces qui sont l’INH et
l’éthionamide. Tous deux ciblent l’enzyme InhA. L’INH possède une concentration minimale
inhibitrice (CMI) de 0.05 µg/mL contre Mtb. En comparaison, la CMI de l’INH de Msm est 100 fois
supérieure. L’INH possède à long terme (> 24 h) une activité bactéricide. Cet antituberculeux est
un pro-médicament qui est activé par la catalase-péroxydase KatG (rv1908c). Cette enzyme
convertit l’INH en plusieurs espèces réactives comme le radical isonicotinoyl capable d’acyler
plusieurs composés in vitro. L’INH peut également être activé in vitro par l’ajout de Mn2+ (Roger
& John, 1997). Cela a permis de cristalliser l’InhA en interaction avec son cofacteur NADH et
l’INH activé (Rozwarski et al, 1999). De façon surprenante, cette étude a montré que l’INH activé
ne fixe pas directement InhA mais forme un adduit covalent avec son cofacteur, le NAD. Cet
adduit NAD-INH inhibe l’activité de InhA (Rawat et al, 2003). L’ensemble des résultats a permis à
Vichèze et Jacobs de proposer un mécanisme d’action de l’inhibition de InhA par l’INH (Figure
16) (Vilchèze & Jacobs, 2007). La résistance à l’INH est le plus souvent induite par l’acquisition de
mutations au sein du gène katG limitant ou abrogeant l’activité de la protéine KatG. Des
mutations ont également été rapportées au sein du gène inhA lui-même ou dans le promoteur
de l’opéron inhA. En effet, la mutation S94A de InhA confère une résistance à l’INH (Vilchèze et
al, 2006). La tolérance de Mtb au cours du traitement à l’INH a longtemps été attribuée
uniquement à la non-réplication d’une sous-population. En effet, l’INH n’est théoriquement actif
que sur les cellules en division. Récemment, une étude a montré que la tolérance à l’INH n’est
pas dépendante de l’état de réplication du bacille mais de l’état transcriptionnel du gène katG
(Wakamoto et al, 2013). Les bacilles tolérants (persisteurs) montrent en moyenne au cours du
temps une expression plus faible du gène. Ces persisteurs sont également trouvés en culture in
vitro et possèdent un profil d’expression génétique global particulier, différent des bactéries en
état de dormance (Keren et al, 2011). Leur nombre augmente en phase stationnaire ce qui
semble indiquer un mécanisme déterminé d’adaptation. L’état de persistance ou tolérance
semble donc dépendre à la fois de phénomènes stochastiques et déterminés mais pas de l’état
de réplication et de croissance du bacille. Ce phénomène pourrait expliquer le mode
d’acquisition de résistances génétiques au cours du traitement.
L’éthionamide (ETH) cible également la biosynthèse des AM par l’inhibition d’InhA. L’ETH et l’INH
sont des analogues structuraux. La résistance à l’INH provoquée par la substitution S94A dans
InhA confère une résistance croisée à l’ETH (Vilchèze et al, 2006). Ces données semblent
suggérer que les modes d’action de l’INH et de l’ETH sont très similaires. Cependant très peu de
38
INTRODUCTION
souches cliniques présentent des résistances croisées entre ces deux antibiotiques (Fattorini et
al, 1999). En effet, dans cette étude sur 46 souches MDR, 100% sont résistantes à l’INH et
seulement 4.3% sont résistantes à l’ETH. Ceci est vraisemblablement dû au mode d’activation de
l’ETH qui est différent de celui de l’isoniazide. En effet, l’éthionamide est activé par une enzyme
de type monooxygénase nommée EthA ((Baulard et al, 2000; DeBarber et al, 2000). Le gène
ethA,qui code pour l’enzyme du même nom, est négativement contrôlé par le régulateur
transcriptionnel EthR membre de la famille des répresseurs TetR (Engohang-Ndong et al, 2004).
La répression de l’expression d’ethA par EthR conduit à une faible activation de l’ETH par EthA.
Cela nécessite donc, lors du traitement avec l’ETH, d’utiliser des concentrations élevées ce qui
provoque l’apparition d’effets secondaires notamment au niveau gastro-intestinal. Pour tenter
de pallier ce problème, Willand et collaborateurs ont développé une série d’inhibiteurs
synthétiques de la fixation d’EthR à l’ADN (Willand et al, 2009). Le composé BDM31381
provoque une expression 35 fois supérieure d’EthA par rapport à une souche de Mtb non traitée.
Cela permet d’augmenter de façon substantielle la sensibilité de Mtb à une concentration
donnée d’ETH. L’optimisation structurale de cette série de molécules a notamment permis
d’obtenir un composé (BDM41906) permettant d’augmenter 10 fois l’activité de l’ETH sur Mtb
infectant des macrophages (Flipo et al, 2012).
L’enzyme EthA pourrait également être responsable de l’activation de la thiacétazone (TCA) et
de l’isoxyl (ISO) (Dover et al, 2007). Ces deux composés inhibent la biosynthèse des AM
(Phetsuksiri et al, 1999; Winder et al, 1971). Une étude semble également montrer une
inhibition de l’introduction des fonctions cyclopropanes des AM (Alahari et al, 2007). Les auteurs
de cette étude proposent que la TCA et l’ISO ciblent les méthyltransférases impliquées dans la
biosynthèse des AM. Cependant, deux études très récentes contredisent cette assignation
(Belardinelli & Morbidoni, 2012; Grzegorzewicz et al, 2012a). En effet, les auteurs de ces études
désignent de façon très convaincante, les déshydratases du système FAS-II comme cibles de la
TCA et de l’ISO. De plus, Belardinelli et collaborateurs ne confirment pas le rôle d’EthA ou de
MmaA4 dans l’activation de ces composés.
IV/ 3 FAS-I
Le système FAS-I comme évoqué précédemment est composé d’une enzyme unique, codée par
le gène fas (rv2524c). Ce type d’enzyme de synthèse d’acide gras est généralement retrouvé
chez les eucaryotes. Sur un plan phylogénétique, FAS-I de Mtb est proche de celui des
champignons (Jenke-Kodama et al, 2005). Le gène fas ne semble pas provenir d’un transfert
39
Système
FAS-I
B
KasA
KasB
Système
FAS-II
HadAB
HadBC
A
Figure 17 : Organisation schématique des enzymes de FAS-II (D’après Schaeffer et al,
2001). A, représente l’étape d’activation de l’AcpM par l’AcpS. B, représente les étapes
successives se répétant afin d’obtenir la chaine méromycolique,
INTRODUCTION
horizontal de gène issu d’une séquence d’eucaryote supérieur (Gamieldien et al, 2002). De plus,
les différences biochimiques et d’organisation des domaines catalytiques entre le FAS animal et
celui de champignon semblent indiquer des événements évolutifs indépendants menant à la
formation de ces deux systèmes (évolution convergente). Le FAS-I mycobactérien semble sur le
plan structural proche de celui des champignons mais de taille inférieure (Boehringer et al,
2013). Il serait donc intéressant d’étudier sur le plan évolutif le lien entre FAS-I mycobactérien et
celui des champignons.
L’enzyme FAS-I mycobacterienne est composée de 7 domaines catalytiques distincts :
acyltransférase, 2-trans-enoyl réductase, (3R)-hydroxyacyl déshydratase, malonyl/palmitoyl
transférase, ACP, β-cétoacyl réductase, β-cétoacyl transférase (Fernandes & Kolattukudy, 1996;
Odriozola et al, 1977). Elle permet la synthèse de novo d’acyl-CoA à longue chaîne à partir d’un
acétyl-CoA puis de malonyl-CoA comme unité d’élongation. Chaque cycle catalytique correspond
à une élongation de deux carbones de la chaîne aliphatique. Il possède la particularité d’être
bimodal (propriété des Corynobacterineae), c’est-à-dire de synthétiser des acyl-CoA de deux
gammes de longueurs différentes : C16-C18 et C24-C26. Les acides gras à courte chaîne (C16-C18)
servent de substrats pour l’élongation de la chaîne méromycolique par FAS-II (Qureshi et al,
1984). Les acides gras plus longs (C24-C26) forment la chaîne alpha des AM. Les acides gras plus
courts (C16-C18) synthétisés par FAS-I sont également incorporés (comme chez les autres
organismes) au sein des phospholipides de la membrane plasmique.
IV/ 4 FAS-II
Le système FAS-II est un système multi-enzymatique. Chez les bactéries productrices d’AM où il
est présent et contrairement aux autres systèmes FAS-II bactériens, il n’est pas capable de
réaliser la synthèse de novo des acides gras et dépend donc du système FAS-I (Odriozola et al,
1977). Chacune des enzymes possède une seule activité catalytique permettant de participer à
l’élongation de l’acyl-CoA provenant de FAS-I jusqu’à l’obtention d’une chaîne complète
d’environ 60 carbones (chaîne méromycolique). L’activité de ce système dépend in vitro et
probablement in vivo d’une Acyl Carrier Protein (ACP). Cette spécificité est soutenue par le
« clustering » du gène acpM avec des gènes codant des protéines centrales de FAS-II (FabD,
KasA, KasB) (Cole et al, 1998a), mais également par l’identification in vivo d’acides gras à très
longues chaînes sous forme acyl-AcpM (Besra et al, 1995). L’AcpM permet le « transport » des
acides gras en cours de synthèse d’une enzyme de FAS-II à l’autre. La chaîne carbonée est liée
covalemment à l’AcpM par l’intermédiaire d’un groupement 4’-phosphopantéthéine (p-Pant)
40
Figure 18: Représentation schématique de la conservation de la synténie des principaux
gènes de FAS-II de 20 espèces de mycobactéries. Cette représentation schématique a été
générée grâce au logiciel string 9.02.
fabD acpM kasA kasB accD6
hadA B C
mabA inhA
INTRODUCTION
transféré du coenzyme A par l’AcpS (Chalut et al, 2006) (Figure 17A). L’élongation par le malonyl
de l’acyl-AcpM se fait au niveau de la fonction thiol du groupement 4’-phosphopantéthéine.
Schématiquement, le cycle FAS-II commence par la formation du malonyl-AcpM à partir du
malonyl-CoA par une enzyme de type malonyl-CoA:ACP transacylase (MCAT ; FabD). La molécule
ainsi formée correspond à l’unité d’élongation. Le lien entre FAS-I et FAS-II est réalisé par
l’enzyme FabH de type β-cétoacyl-ACP synthase III. En effet, elle réalise la condensation de type
Claisen de l’acyl-CoA provenant de FAS-I avec une molécule de malonyl-ACP. La chaîne ainsi
formée, entre ensuite dans le cycle FAS-II proprement dit. Ce cycle FAS-II est composé de 4
étapes successives de condensation, réduction déshydratation et réduction se répétant jusqu’à
obtenir la chaîne méromycolique (Figure 17B). Le produit de la condensation par FabH est pris
en charge au niveau de la première étape de réduction du cycle (MabA). Les étapes de
condensation suivantes sont réalisées par l’une des deux β-cétoacyl-ACP-synthases (KasA/KasB).
Le produit de condensation par KasA ou KasB est un β-cétoacyl-ACP qui est ensuite réduit par
une β-cétoacyl-ACP réductase NADPH dépendante (MabA) formant un β-hydroxyacyl-ACP luimême déshydraté par un des deux hétérodimères de type β-hydroxyacyl-ACP déshydratase
(HadA-B/HadB-C). Le 2-trans-énoyl-ACP formé est alors réduit par l’énoyl-ACP réductase NADHdépendante (InhA) formant un acyl-ACP qui sera pris en charge par une condensase.
Sur le plan génétique le système FAS-II s’organise principalement autour de 3 opérons. Le
premier (parfois appelé opéron FAS-II) est composé dans l’ordre des gènes mtfabD-acpM-KasAKasB-accD6. Le second est l’opéron mabA-inhA et le dernier, l’opéron déshydratase, composé au
moins des gènes hadA-hadB-hadC. Cette synténie est très bien conservée au sein du genre
mycobacterium notamment entre Mtb et son modèle d’étude non-pathogène Msm (Figure 18).
On remarque également que l’ensemble des gènes est présent au sein du génome de M.leprae.
Cet organisme possède le plus petit génome du genre, ce qui suggère une pression de sélection
évolutive pour le maintien du système FAS-II et aussi de son caractère essentiel.
IV/ 4.1 Initiation du cycle FAS-II
L’initiation comprend le changement du « carrier » du malonyl, grâce aux protéines FabD et
AcpM. C’est aussi la première étape de condensation par FabH du malonyl-CoA et de l’acyl-CoA
issu de FAS-I.
L’essentialité des gènes acpM et fabD n’a pas été déterminée, mais des travaux de prédiction
par transposition annotent fabD comme étant non essentielle à la croissance (Zhang et al, 2012).
41
INTRODUCTION
Le gène acpM, quant à lui n’est pas annoté du fait probablement de sa trop faible taille. La nonessentialité de FabH, si elle est confirmée par délétion du gène, peut peut-être s’expliquer par la
présence d’une activité redondante. En effet, on trouve un autre gène (fabD2) ayant une activité
malonyl-CoA:Acp transacylase (MCAT) (Yi-Shu et al, 2006). Cependant malgré l’amélioration de
la méthode de prédiction par Zhang et collaborateurs, cette méthode à elle seule ne permet pas
d’affirmer sans erreur l’essentialité ou non d’un gène. La nature de l’activité MCAT de FabD a été
déterminée in vitro (Kremer et al, 2001). De plus, le gène fabD de Mtb est capable de
complémenter un mutant thermosensible de FabD d’E.coli en condition non permissive (Kremer
et al, 2001).
FabH possède un site actif composé d’une triade catalytique (Cys112, His244, Asn274) conservée au
sein des enzymes de type β-cétoacyl-ACP synthase III (KAS-III). La cystéine 112 fixe le substrat de
type acyl-CoA en formant une liaison thioester permettant ainsi la dissociation du coenzyme A
(Scarsdale et al, 2001). La résolution de la structure de FabH a permis de déterminer son état
homodimérique. L’activité de FabH ne semble pas pouvoir être réalisée par la condensase KasA
in vitro (Borgaro et al, 2011). Cela montre donc le rôle central de FabH en tant que pivot entre le
système FAS-I et FAS-II. Ce rôle central a motivé de nombreuses recherches afin de développer
des molécules inhibitrices de son activité (Al-Balas et al, 2009; Lu et al, 2010; Lu et al, 2011).
Cependant, le gène fabH est prédit comme étant non-essentiel à la croissance (Zhang et al,
2012). Contrairement à fabD, il ne semble pas y avoir d’activité redondante et aucun orthologue
ne semble présent chez M.leprae. Il serait donc nécessaire d’étudier l’importance du gène fabH
in vivo.
IV/ 4.2 Les condensases KasA et KasB
Les gènes kasA (rv2245) et kasB (rv2246) codent pour des enzymes de type β-cétoacyl-ACP
synthase qui assurent la condensation entre l’acyl-ACP et le malonyl-ACP (Kremer et al, 2002;
Schaeffer et al, 2001). Ces deux enzymes possèdent 66% d’identité de séquence. Sur le plan
biochimique, il est difficile de distinguer ces deux enzymes. En effet, toutes les deux possèdent in
vitro une haute affinité pour les acyl-ACP ainsi qu’une capacité à effectuer l’élongation de
longues chaînes d’acides gras (Kremer et al, 2002; Schaeffer et al, 2001).
Slayden et Barry ont cependant pu avancer la possibilité de l’existence d’une différence
fonctionnelle entre ces deux enzymes. En effet, ils ont réalisé la surexpression des deux gènes
ensemble ou séparément au sein de Msm, puis réalisé un extrait cellulaire et suivi la synthèse de
42
INTRODUCTION
la chaîne méromycolique par marquage radioactif au [14C]-malonyl-CoA. Ils ont pu ainsi
déterminer que KasA semble impliquée dans l’élongation initiale de la chaîne jusqu’à 40
carbones et que kasB interviendrait pour réaliser l’élongation terminale jusqu’à 54 carbones
(Slayden & Barry, 2002). Ces résultats ont été confirmés par des études génétiques chez Mtb et
M.marinum. En effet, l’interruption du gène kasB de M.marinum par un transposon (Gao et al,
2003a), induit entre autre un raccourcissement des AM de 2 à 6 carbones (Gao et al, 2003b). Ce
défaut de synthèse a été localisé au niveau proximal de la chaîne méromycolique (Gao et al,
2003b). Cela correspond donc à un défaut de synthèse terminal de la chaîne méromycolique
induit par l’interruption de kasB. Une étude similaire menée chez Mtb révèle également un
raccourcissement des AM de 2 à 6 carbones lors de la délétion (par échange allélique) de kasB
(Bhatt et al, 2007a). La mutation de kasB se traduit également par un défaut de synthèse de
céto-AM chez M.marinum et de céto et méthoxy-AM trans-cyclopropanés chez Mtb. Ce
phénotype traduit donc un rôle de KasB, probablement indirect, dans l’insertion des décorations
de la chaîne méromycolique Ces défauts de biosynthèse des AM semblent déstabiliser la
structure de l’enveloppe. De plus, la surexpression de KasA dans la souche kasB mutante de
M.marinum ne permet pas de recouvrer un phénotype sauvage. Cela semble indiquer l’absence
de redondance d’activité entre les enzymes KasA et KasB. Bhatt et collaborateurs confirment
cette hypothèse en démontrant que kasA est essentiel à la survie de Msm (Bhatt et al, 2005).
Cela signifie donc que KasB n’est pas capable d’assurer l’activité de KasA. La souche mutante
complémentée par kasA en condition non permissive présente des défauts de structure de
l’enveloppe sous forme de « bulles » en microscopie électronique. Cela confirme l’essentialité
des AM dans la structure de l’enveloppe.
En conclusion, KasA est responsable de l’élongation principale de la chaîne méromycolique et
KasB de son l’élongation terminale. Le gène kasA est essentiel contrairement au gène kasB (Mtb
Marinum). Cependant, il semble peu probable qu’in vivo KasB n’intervienne que pour effectuer
une élongation terminale de 6 carbones.
Une partie de mes travaux de thèse montre également l’implication de KasB dans l’élongation
terminale de la chaîne méromycolique chez Msm (confère paragraphe I/ 2.3b p.72).
Les structures cristallographiques de KasA (Luckner et al, 2009) et de KasB (Sudharsan et al,
2007) ont été déterminées. Ces deux protéines ont été cristallisées sous forme d’homodimère
pouvant indiquer une activité sous cette forme. Enfin, les structures 3 dimensions (3D) de ces
43
INTRODUCTION
enzymes montrent que leur domaine N-terminal n’est pas enfoui au sein de la structure
secondaire et est peu structuré.
IV/ 4.3 Les réductases MabA et InhA
MabA réalise la réduction du β-cétoacyl-ACP en β-hydroxyacyl-ACP au cours des cycles FAS-II.
Cette réductase possède une spécificité pour les longues chaînes d’acyl-CoA NADPH
dépendantes (Cohen-Gonsaud et al, 2002; Marrakchi et al, 2002b). Il y a 5 gènes annotés FabG
dans le génome de Mtb, FabG1 (MabA) a été démontré comme étant celui impliqué dans FAS-II
(Marrakchi et al, 2002b). Le gène mabA a été montré comme essentiel à la survie (Parish et al,
2007). En effet, les auteurs n’ont pu réaliser la délétion du gène mabA qu’en présence d’une
copie supplémentaire du gène chez Mtb. De plus, ils ont également montré que le gène mabA de
Msm peut complémenter la délétion du gène de Mtb. Cela confirme que le système FAS-II est
très bien conservé sur le plan génétique (confère paragraphe IV/ 1 p. 37) et fonctionnel au sein
du genre Mycobacterium.
InhA est une 2-trans-énoyl-ACP réductase NADH-dépendante qui réalise la dernière étape du
cycle FAS-II (Marrakchi et al, 2000). Cette réductase possède une affinité 100 fois plus
importante pour l’énoyl-ACP que pour l’énoyl-CoA et a une préférence pour les longues chaînes
(Quémard et al, 1995). Elle catalyse la réduction du 2-trans-énoyl-ACP en acyl-CoA. Le gène
codant InhA (inhA ou rv1484) est situé en aval du gène mabA. Il semble également essentiel à la
survie car pour effectuer sa délétion, il est nécessaire de fournir une copie sauvage
supplémentaire (Bhatt et al, 2005). Un allèle thermosensible du gène inhA a également été
caractérisé chez Msm, permettant une inactivation de InhA à 42°C (Vilcheze et al, 2000). En
condition mutante (42°C), les auteurs observent une accumulation de C24:0 et une diminution de
C16:0. Ces molécules correspondent aux produits de FAS-I de Msm. Cela semble confirmer que
FAS-II utilise le C24:0 issu de FAS-I. Les même résultats sont observés lors du traitement des
bactéries à l’INH (Vilcheze et al, 2000). De plus, comme expliqué précédemment le transfert d’un
allèle d’inhA portant une mutation ponctuelle (S94A) permet la résistance à l’INH (Vilchèze et al,
2006). Cela confirme les travaux antérieurs désignant InhA comme la cible principale de l’INH
(Banerjee et al, 1994).
MabA et InhA possèdent une structure tertiaire très proche et semblent tétramériques en
solution ainsi que dans les formes cristallines obtenues (Cohen-Gonsaud et al, 2002; Rozwarski
et al, 1999). Toutes deux possèdent une extrémité N-terminale non enfouie dans la structure.
44
Figure 19 : Modèle proposé du rôle respectif des hétérodimères HadAB et HadBC (D’après
Sacco et al., 2007).
INTRODUCTION
IV/ 4.4 Les déshydratases HadA, B et C
L’étape de déshydratation de l’hydroxyacyl-ACP en 2-trans-énoyl-ACP est réalisée après l’étape
de réduction par MabA et avant l’étape de réduction par InhA. Chez E.coli le système FAS-II
possède deux déshydratases FabA et FabZ. Or, aucun orthologue évident de fabA et fabZ n’est
présent dans le génome de Mtb (Sacco et al, 2007b). Néanmoins, Sacco et collaborateurs ont pu
définir 11 gènes candidats pouvant coder une enzyme de type déshydratase (Sacco et al, 2007a).
Seul un candidat (rv0636) remplissait l’ensemble des critères de sélection défini dans cette
étude. De plus, ce candidat avait déjà été décrit comme pouvant faire partie du système FAS-II
(Castell et al, 2005). Ce gène est structuré au sein d’un opéron impliquant deux autres gènes
(rv0635 et rv0637). Cet opéron semble essentiel à la survie de Mtb. L’activité in vitro des
protéines nommées HadA, HadB et HadC (codées par cet opéron) confirme leur rôle de
déshydratases. Ces protéines montrent également une préférence pour les substrats dérivés
ACP à longues chaînes. L’ensemble de ces arguments ont permis aux auteurs de définir ces
protéines comme étant responsables de l’activité déshydratase du système FAS-II.
Les protéines HadABC forment deux hétérodimères HadAB et HadBC, où seule la sous-unité B
possède l’activité catalytique (Sacco et al, 2007a). De façon étonnante, ces deux hétérodimères
appartiennent à la famille « hydratase 2 » contrairement aux déshydratases généralement
impliquées dans les systèmes FAS-II bactériens (White et al, 2005). Les protéines Had semblent
former individuellement un repliement de type « simple hotdog ». Les hétérodimères formant
probablement une structure de type « double hotdog » asymétrique. Les modélisations
structurales des hétérodimères HadAB et HadBC réalisées par Cantaloube et collaborateurs
semblent confirmer cette hypothèse (Cantaloube, 2010). La structure fine des déshydratases
reste cependant à déterminer par cristallographie.
Le rôle spécifique de chaque hétérodimère reste également à définir. Cependant, Sacco et
collaborateurs ont émis l‘hypothèse que HadAB est impliquée dans l’élongation initiale et HadBC
dans l’élongation terminale des chaînes méromycoliques. D’autre part, comme le gène kasB, le
gène hadC est absent des génomes de Rhodococcus et Nocardia qui possèdent des AM plus
courts (C34-C60) que ceux retrouvés chez les mycobactéries (C74-C90), alors que les gènes hadA et
hadB sont bien conservés (figure 19). De plus, HadBC semble posséder une préférence pour les
longues chaînes d’acides gras. Des études d’interaction protéines-protéines ont été réalisées
entre les différentes protéines de FAS-II (confère paragraphe IV/ 6 p. 49). Celles-ci définissent
une interaction préférentielle de HadAB avec KasA et de HadBC avec KasB (Cantaloube et al,
45
INTRODUCTION
2011). Tout comme KasB, hadC pourrait être non essentielle à la croissance contrairement à
hadA (Zhang et al, 2012). L’ensemble de ces résultats confirme la possibilité d’une spécialisation
de HadAB et HadBC en fonction de la longueur de chaîne grâce à leurs interactions avec KasA ou
KasB.
Chez E.coli, l’étape de déshydratation du cycle FAS-II est réalisée principalement par l’enzyme
FabZ. FabA intervient également durant cette étape mais contrairement à FabZ, elle possède en
plus de l’activité déshydratase, une activité isomérase (Rock & Cronan, 1996). Au cours de
l’élongation de l’acyl-ACP, FabA introduit au niveau du carbone 10 une insaturation pour former
le trans-2-decenoyl-ACP. Cette double liaison est ensuite isomérisée par l’activité isomérase de
FabA pour former le cis-2-decenoyl-ACP. FabA n’intervient que lors de la formation de cette
insaturation. Cette molécule ne peut être réduite par FabI (orthologue de InhA) et est prise en
charge par FabB pour subir l’étape de condensation. Cela aboutit donc au maintien de
l’insaturation en position cis sur la chaîne d’acide gras. Chez Streptococcus pneumoniae, l’étape
d’isomérisation est réalisée par FabM qui ne possède que l’activité isomérase (Marrakchi et al,
2002a). Comme chez E.coli, le cycle FAS-II de Mtb génère des composés de type trans-2-énoylAcp avant l’étape de déshydratation. L’introduction des insaturations cis de la chaîne pourrait
donc être réalisée par l’isomérisation des trans-2-énoyl-ACP en cis-2-énoyl-ACP. L’enzyme qui
pourrait réaliser cette réaction n’a pas encore été décrite chez Mtb. Par homologie à E.coli les
déshydratases HadAB et/ou HadBC pourraient posséder cette activité. On peut également
imaginer que cette activité soit réalisée par une enzyme spécialisée comme chez Streptococcus
pneumoniae.
IV/ 5 Modifications de la chaîne méromycolique
Les mycobactéries possèdent plusieurs types d’AM. Ils varient au niveau de la longueur de la
chaîne méromycolique mais aussi au niveau des fonctions présentes aux positions distale et
proximale de cette chaîne (confère paragraphe III/ 2.2c p.32). On retrouve des fonctions de type
oxygéné, cyclopropane, groupement méthyl et double liaison (confère paragraphe IV/ 4.4 p. 45).
L’introduction
des
fonctions
chimiques
sur
la
chaîne
méromycolique
dépend
de
méthyltransférases, S-adénosyl-méthionine (SAM)-dépendantes. Ces enzymes catalysent de
façon générale, le transfert du groupement méthyl de la SAM, vers le précurseur adéquat ayant
une fonction cis éthylénique. On retrouve chez Mtb 8 méthyltransférases (Mtf) semblant
spécifiques de la biosynthèse des AM : CmaA1, CmaA2, MmaA1, MmaA2, MmaA3, MmaA4
(Hma), PcaA et UmaA1 (Dubnau et al, 1997; George et al, 1995; Quémard et al, 1997; Yuan &
46
INTRODUCTION
Barry, 1996; Yuan et al, 1998). Quatre d’entre elles (MmaA1, MmaA2, MmaA3 et MmaA4) sont
regroupées au sein d’un même cluster de gènes (Yuan & Barry, 1996).
Chez E.coli l’exposition à des stress comme l’exposition à de faibles pH, de hautes températures,
l’hypoxie provoque une augmentation de la quantité des lipides cyclopropanés (Grogan &
Cronan, 1997). Il semble donc que les Mtf puissent jouer un rôle important dans l’adaptation au
stress (figure 20). De plus, la perte des fonctions introduites par les Mtf affecte profondément la
virulence et la pathogénicité de Mtb (Michael et al, 2000; Yuan et al, 1998).
IV/ 5.1 Introduction des groupements méthyl et fonction cyclopropane
a. Fonction cyclopropane
Par homologie au cyclopropane fatty acid synthase d’E.coli (CFAS), 4 Mtf (CmaA1, CmaA2, PcaA
et MmaA2) ont été identifiées comme pouvant être responsables de l’introduction des
cyclopropanes sur la chaîne méromycolique des AM de Mtb. La surexpression du gène cmaA1
(rv3392c) chez Msm induisait la transformation de la double liaison cis des alpha-AM en
cyclopropane cis en position distale (Yuan et al, 1995). De la même façon, CmaA2 avait été
impliquée dans la modification par cis-cyclopropanation des alpha-AM et époxy-AM de Msm
(George et al, 1995).
Cependant, la délétion des gènes cmaA1 et cmaA2 chez Mtb ne confirme pas les résultats
obtenus par leur surexpression chez Msm. En effet, la délétion de cmaA2 chez Mtb n’affecte pas
la structure des alpha-AM (Glickman et al, 2001). Elle provoque par contre la disparition des
cyclopropanations trans des espèces oxygénées d’AM. CmaA2 semble donc être la Mtf
responsable de l’introduction des cyclopropanes trans des AM oxygénés. La délétion du gène
cmaA1 ne provoque également aucun changement de structure des alpha-AM de Mtb
(Glickman, 2003). Elle ne provoque de façon générale aucun phénotype clair sur la structure des
AM. Le rôle de CmaA1 reste encore à déterminer. Les conclusions des études originales sur
CmaA1 (Yuan et al, 1995) et CmaA2 (George et al, 1995) semblent donc erronées.
La Mtf responsable de la cyclopropanation cis des alpha-AM en position proximale a été décrite
par Glickman et collaborateurs. En effet, la délétion de la Mtf du gène codant PcaA
(anciennement UmaA2) de Mtb provoque la disparition des fonctions cyclopropaniques cis en
position proximale des alpha-AM sans affecter la structure des AM oxygénés (Glickman et al,
2000)(figure 20).
47
Enzyme
(Gène)
Modification introduite
Fonction biologique
Formation de cordes
Persistance
Activité pro-inflammatoire au
stade précoce de l’infection
Références
PcaA ou
UmaA2
(Rv0470c)
Cyclopropane cis (alpha-mycolates, P)
CmaA1
(Rv3392c)
Cyclopropane cis (alpha-mycolates, D) --- Rôle
attribué à MmaA2 en 2003
CmaA2
(Rv0503c)
Cyclopropane
oxygénés, P)
MmaA1
(Rv0645c)
Groupement méthyle (position vicinale des
doubles liaisons ou cyclopropane)
Yuan et al., 1997
MmaA2
(Rv0644c)
Cyclopropane cis (a-mycolates, D)
Cyclopropane cis (acides mycoliques oxygénés,
PP)
Glickman et al., 2003
MmaA3
(Rv0643c)
Méthoxylation (des acides hydroxymycoliques)
Yuan and Barry, 1996
Dubnau et al., 1998
MmaA4 ou
Hma
(Rv0642c)
Groupement méthyle +
secondaire en position
hydroxymycolique)
UmaA1
(Rv0469c)
trans
(acides
mycoliques
fonction
vicinale
alcool
(acide
Groupement méthyle des acides mycoliques a
et époxy- de M. smegmatis (position vicinale
des doubles liaisons trans ou cyclopropane
trans)
Glickman et al., 2000
Huang et al., 2002
Rao et al., 2005
Yuan et al., 1995
Huang et al., 2002
Rôle immunomodulateur
(DcmaA2 : hypervirulent chez
la souris)
(George et al., 1995)
Glickman et al., 2001
Rao et al., 2006
Virulence de M. tuberculosis
(DmmaA4 : atténué chez la
souris)
Persistance
Activateur de la thiacétazone
Boissier et al., 2006
Dao et al., 2008
Alahari et al., 2009
DumaA1 : hypervirulence chez
la souris
Laval et al., 2008
Figure 20 : Activité, fonction(s) biologique(s) et structure(s) tridimensionnelle(s) des 8 Mtf
de Mtb (Vaubourgeix, thèse UPS 2009). P : Position proximale, D : Position distale.
INTRODUCTION
Le gène mmaA2 possède également une homologie importante avec les CFAS de E.coli. Ce gène
est essentiel à la synthèse des cyclopropanations cis des alpha-AM en position distale. MmaA2
serait également responsable de l’introduction du cyclopropane cis en position distale des AM
oxygénés (Glickman, 2003). Cette activité semble donc redondante avec celle de CmaA2. Cela a
été confirmé par la construction d’un double mutant mmaA2 / cmaA2 suivi par l’analyse de la
structure des AM en comparaison avec les simples mutants (Barkan et al, 2010). Cette étude
montre également que MmaA2 est la Mtf la plus importante pour l’introduction du
cyclopropane cis en position distale des alpha-AM (figure 20).
b. Fonction méthyl
Les groupements méthyl sont retrouvés du coté oméga des cyclopropanations trans en position
proximale des AM oxygénés (Minnikin & Polgar, 1967). La Mtf MmaA1 a été proposée comme
pouvant catalyser l’introduction du groupement méthyl à cette position des AM oxygénés (Yuan
et al, 1997). Plus récemment, une étude montre que l’action de MmaA1 est essentielle pour
l’introduction des cyclopropanes trans en position proximale des AM oxygénés (Barkan et al,
2010). Les auteurs suggèrent que MmaA1 réalise l’introduction du groupement méthyl
précurseur de la double liaison qui permettra à CmaA2 de réaliser la cyclopropanation en
position proximale.
Les travaux sur l’enzyme UmaA1 n’ont pas permis de déterminer son rôle chez Mtb,
contrairement à Msm. En effet, la délétion du gène umaA1 de Msm provoque la disparition de la
ramification méthylée en position proximale des doubles liaisons ou cyclopropanations des AM
(Laval et al, 2008).
IV/ 5.2 Introduction des fonctions oxygénées
L’introduction des fonctions oxygénées (céto et méthoxy) semble être réalisée par l’action de
deux Mtf : MmaA3 et MmaA4. MmaA4 (aussi nommée Hma) catalyse la formation d’un
précurseur de type hydroxy-AM à partir d’un AM cis di-insaturé (figure 20). Cette enzyme
permet la méthylation du carbone côté oméga de la double liaison cis en position distale. Cette
méthylation permet ensuite en présence d’une molécule d’eau, l’introduction d’une fonction
hydroxyl adjacente au groupement méthyl (Dinadayala et al, 2003; Dubnau et al, 2000). La
molécule ainsi formée est le précurseur cis des AM oxygénés. Le précurseur des AM oxygénés
trans semble quant à lui, être formé par l’enzyme MmaA1. En effet, MmaA1 semble à l’origine
48
INTRODUCTION
de l’introduction du groupement méthyl trans au niveau de la double liaison cis en position
proximale (Yuan et al, 1998).
Les groupements hydroxyl introduits en position distale peuvent être modifiés en fonction
méthoxy par l’action de MmaA3 pour former les méthoxy-AM (Dinadayala et al, 2003; Dubnau et
al, 1997; Yuan & Barry, 1996; Yuan et al, 1998)(figure 20). La formation des céto-AM est due à la
réduction par une réaction redox de la fonction hydroxyl en fonction cétone.
IV/ 6 Condensation des acides mycoliques
IV/ 6.1 Activation de la chaîne méromycolique
L’activation de la chaîne méromycolique est catalysée par l’enzyme FadD32 (Trivedi et al, 2004).
Cette enzyme fait partie de la famille «long chain fatty acyl-AMP ligase » (FAAL) de Mtb. FadD32
permet in vitro la formation d’un acyladénylate à partir d’un acide gras libre et d’ATP (Gavalda et
al, 2009; Léger et al, 2009; Trivedi et al, 2004). De plus, FadD32 possède une seconde activité lui
permettant d’effectuer le transfert d’un acide gras libre sur le domaine ACP de Pks13 (Gavalda et
al, 2009). Cette activité est appelée fatty acid ACP synthetase (FAAS). Le gène codant pour
FadD32 est inclus dans un cluster de gènes composé de Pks13 et AccD4 conservé chez M.leprae.
Cela confirme le lien entre FadD32 et Pks13 sur le plan génétique. L’activité de FadD32 est
essentielle à la survie de Mtb (Stanley et al, 2013). En effet, cette étude a permis de caractériser
un inhibiteur spécifique de l’activité FAAS de FadD32. Cet inhibiteur permet une diminution de la
charge bactérienne chez le poisson zèbre infecté par M.marinum et de la DO d’une culture in
vitro de Mtb. Cette étude confirme l’essentialité de FadD32 dans la biosynthèse des AM, mise en
avant par la réalisation d’un mutant de délétion de l’orthologue de fadD32 de Corynebacterium
glutamicum (Portevin et al, 2005). Le gène fadD32 est également essentiel chez Mtb (Boldrin et
al, 2010). FadD32 est donc essentielle à la biosynthèse des AM à travers ses activités FAAL et
FAAS. De plus, son activité est une cible validée pour le développement de nouveaux
antituberculeux (Galandrin et al, 2013; Stanley et al, 2013).
Malgré les avancées récentes sur le rôle de FadD32, une partie de ses mécanismes enzymatiques
reste inconnue. La spécificité de substrat notamment reste à déterminer in vivo, car il est peu
probable que la chaîne méromycolique libre soit disponible au sein de la cellule du fait de son
insolubilité. L’hypothèse la plus probable est la présence d’une thioestérase agissant en amont
de FadD32. L’analyse du génome de Mtb a révélé la présence d’un gène (Rv3802c) possédant
49
Figure 21 : Schéma de fonctionnement biochimique de FadD32-Pks13 et de son
organisation en domaines (Gavalda et al, 2009). Pour simplifier, les chaînes aliphatiques
ont été dessinées en C16. FadD32 synthétise le meromycoloyl-AMP à partir d’un produit de
FAS-II libre et de l'ATP (1). Le produit de cette réaction est alors spécifiquement chargé par
FadD32 sur le bras P-pant du domaine N-ACP de Pks13 (2). Il s'agit d'un transacylation acylAMP/ACP. La chaîne méromycolique est ensuite transférée sur le domaine KS (3). L'unité
d'extension carboxyacyl-CoA est spécifiquement chargée sur le domaine AT, qui catalyse la
liaison covalente de la chaîne carboxyacyl à son site actif (1') et son transfert ultérieur
spécifiquement sur ​le domaine C-ACP (2'). Le domaine KS catalyse la condensation de type
Claisen entre le meromycoloyl et une chaîne alpha pour produire un α-alkyl-β-cétothioester
lié au domaine C-ACP (3'). Ensuite, il est probable que le domaine de thioestérase (TE)
catalyse la libération de la chaîne α-alkyl β-cétoacyle et son transfert sur un accepteur
encore inconnu (X1, probablement le tréhalose) (4’).
INTRODUCTION
une activité potentielle thioestérase appartenant au cluster de gène fadD32 et pks13. Il serait
également intéressant d’étudier la possibilité que FadD32 effectue un transfert in vivo des acyls
de FAS-I sur l’AcpM. Cette hypothèse permettrait d’expliquer la non essentialité proposée pour
FabH (Zhang et al, 2012).
IV/ 6.2 Activation de la chaîne alpha des AM
La chaîne alpha des AM provient, comme détaillé précédemment, du système FAS-I. En effet,
FAS-I fournit un acyl-CoA (C24-C26) qui va être activé par carboxylation. Cette réaction semble
catalysée par un complexe acyl-CoA carboxylase composé d’AccA3-AccD4-AccD5 (Portevin et al,
2005). La chaîne ainsi activée se retrouve sous la forme d’un carboxylacyl-CoA. Elle peut alors
être prise en charge par l‘enzyme Pks13 pour effectuer sa condensation avec la chaîne
méromycolique.
L’appartenance de AccD5 au complexe de carboxylation de la chaîne alpha est remise en cause
par une étude (de cristallographie) qui prédit une spécificité de cette enzyme pour le propionylCoA et non pour les longues chaînes d’acides gras (Lin et al, 2006). Cependant, des études
d’interaction au sein du laboratoire semblent confirmer son implication dans le complexe de
carboxylation de la chaîne alpha (Cantaloube, 2010).
L’orthologue d’accD4 de Mtb est essentiel à la biosynthèse des AM chez C.glutamicum (Portevin
et al, 2005). L’enzyme AccD4 représente la sous-unité catalytique beta du complexe. Il est
nécessaire pour l’activité catalytique, que le complexe possède au moins une sous-unité
catalytique alpha (AccA1-3). AccA3 semble dans ce cas responsable de l’activité catalytique
alpha. Les autres ACCases sont impliquées en partie dans la biosynthèse des précurseurs des AM
tels que le malonyl-CoA. Cette famille de protéines a fait l’objet de revues bibliographiques très
précises (Gago et al, 2011; Marrakchi et al, 2008).
IV/ 6.3 Condensation des chaînes méromycoliques et alpha activées
La réaction de condensation de type Claisen est réalisée par la polykétide synthase 13 (Pks13) de
Mtb. Pks13 est une protéine de grande taille (186 KDa) comprenant de 1733 résidus d’acides
aminés. Elle est composée de cinq domaines distincts possédant chacun une activité catalytique
nécessaire à la condensation (Gavalda et al, 2009) : le domaine ACP N-terminal, KS (Ketoacyl
Synthase), AT (Acyl Transferase), ACP C-terminal, TE (Thio-Estérase). Les domaines ACP, pour
être actifs, sont modifiés post-traductionnellement par l’enzyme PptT (4’PhosphoPanTétheinyl
50
Figure 22 : Schéma général de l'étape de condensation des acides mycoliques (Gavalda et
al, 2009). Les carbones asymétriques du motif mycolique ont une configuration R, R. Chez
les mycobactéries, R1-CO = C40-C60 et R2 = C20-C24; X1 = accepteur encore inconnu de l’
α-alkyl β-cétoacyl (probablement le tréhalose); X2 , accepteur encore inconnu des AM
(probablement le tréhalose).
INTRODUCTION
Transférase) (Chalut et al, 2006). Les chaînes méromycoliques et alpha activées peuvent alors
être fixées respectivement sur le domaine ACP N-terminal et C-terminal. La fixation de la chaîne
alpha est réalisée par le domaine AT de Pks13. Le transfert de la chaîne méromycolique sur le
domaine ACP N-terminal nécessite in vitro la présence de FadD32. Le domaine AT ne semble pas
capable d’effectuer un transfert sur le domaine ACP N-terminal. De même, FadD32 n’est pas
capable d’effectuer le transfert d’acyl-AMP sur le domaine C-terminal. La chaîne méromycolique
est transférée de façon autonome sur le domaine KS de Pks13. Le domaine KS réalise la
condensation de type Claisen qui permet la formation d’un α-alkyl-β-cétoacyl lié au domaine
ACP C-terminal. La libération du produit de condensation est probablement réalisée par le
domaine TE de Pks13 sur un accepteur restant à définir (Figure 21). La formation de l’AM mature
nécessite la réduction de la fonction céto en fonction hydroxyl. Cette réduction semble réalisée
par l’enzyme CmrA (Lea-Smith et al, 2007).
L’ensemble des résultats obtenus par les études de l’activation et de la condensation des chaînes
alpha et méromycoliques a permis à Gavalda et collaborateurs de proposer un modèle général
de la voie de condensation des AM (Figure 22)(Gavalda et al, 2009).
Le gène codant pour Pks13 semble essentiel à la biosynthèse des AM chez Msm et chez
C.glutamicum (Portevin et al, 2004). Plus récemment, Wilson et collaborateurs ont caractérisé
une série de composés inhibant spécifiquement l’activité de Pks13 (Wilson et al, 2013). Ces
composés pourraient inhiber le transfert de la chaîne méromycolique sur le domaine ACP Nterminal de Pks13. A l’heure actuelle, seule la structure du domaine AT de Pks13 a été
caractérisée (Bergeret et al, 2012). Des études en cryo-électromicroscopie devraient permettre
dans le futur d’étudier les mouvements des domaines les uns par rapport aux autres. Une étude
de ce type a déjà été menée sur l’enzyme FAS-I de métazoaire (Brignole et al, 2009).
IV/ 7 Export des AM à travers la membrane plasmique
Le transport des AM à travers la membrane plasmique a longtemps été une question sans
réponse. Depuis 2012, et les travaux fondateurs de Grzegorzewicz et collaborateurs, la protéine
responsable de ce transport a été identifiée comme étant Mmpl3 (Grzegorzewicz et al, 2012b;
Varela et al, 2012).
Cette protéine appartient à la famille des RND protéine (de l’anglais, Resistance, Nodulation, and
cell Division proteins)(Domenech et al, 2005). Cette famille de protéines est ubiquitaire des trois
règnes de la vie, cependant au sein des eubactéries, elle est principalement restreinte aux
51
A
B
C
Figure 23 : Représentation schématique de la topologie des protéines de la famille des
RND et notamment celle de Mmpl3 de Mtb. (A) Représentation de la topologie des
protéines de la famille RND (Guan et al, 1999 ; Paulsen et al, 1996). La topologie de la
protéine Mmpl3 est inconnue mais sa modélisation ((Toppred, (Von Heijne, 1992)) permet
de définir deux modèles, l’un à 12 TMS et deux larges boucles extra-cytoplasmique (B) et
l’autre à 11 TMS et une large boucle extra-cytoplasmique (C). EC : extra-cytoplasmique ; PM
: membrane plasmique ; C : cytoplasme.
INTRODUCTION
bactéries à coloration de Gram négative. Ces protéines, chez les bactéries, sont impliquées dans
un grand nombre de processus (pour revue, (Putman et al, 2000)). De façon générale, leurs
actions permettent le passage d’un composé à travers la membrane par l’utilisation de la force
proton motrice. Sur le plan topologique, ce sont des protéines de grande taille, composées de 12
segments transmembranaires (TMS) et de deux boucles extracytoplasmiques positionnées entre
le TMS 1 et 2 et le TMS 7 et 8 (Guan et al, 1999; Paulsen et al, 1996) (Figure 23A). Elles sont
souvent associées avec des protéines accessoires. Chez E.coli, AcrB a été très bien étudiée
notamment du fait de son implication dans la résistante aux médicaments de même pour MxeB
de Pseudomonas aeruginosa (pour revue, (Paulsen et al, 1996)).
Chez Mtb, il existe 14 gènes codant pour des protéines de type RND (Tekaia et al, 1999). Parmi
eux, on retrouve le gène mmpl3 (rv0206c) codant pour Mmpl3. Les prédictions informatiques de
la topologie de Mmpl3 semblent indiquer la présence de 11 ou 12 domaines transmembranaires
selon les modèles (Owens et al, 2013; Tullius et al, 2011; Varela et al, 2012) (Figure 23B et C). Le
modèle topologique présentant 12 TMS prédit également deux larges boucles cytoplasmiques
entre les TMS 1 et 2 et 7 et 8. Ce modèle se rapproche donc plus de la topologie théorique des
protéines de la famille RND. De plus, on remarque que dans ce modèle les extrémités Nterminale et C-terminale de la protéine sont prédites dans le cytoplasme. L’étude de la topologie
de MxeR définit également ses extrémités N-terminale et C-terminale dans le cytoplasme de
Pseudomonas aeruginosa (Guan et al, 1999). Le modèle à 11 TMS prédit une localisation
extracytoplasmique de l’extrémité C-terminale. Actuellement, la topologie de Mmpl3 n’a pas
encore été étudiée expérimentalement. Une partie de mes travaux de thèse permettent
cependant de déduire certaines informations, quant à la topologie globale de Mmpl3,
notamment en ce qui concerne la position de l’extrémité C-terminale.
Les activités biochimiques et enzymologiques de Mmpl3 sont encore très mal définies, en
comparaison des autres enzymes de la biosynthèse des AM. Grzegorzewicz et collaborateurs
montrent que l’inhibition de Mmpl3 provoque une diminution de la quantité de TDM libéré dans
le milieu de culture. En parallèle, ils observent une accumulation de TMM au niveau des cellules
de Mtb. Cette évolution de la quantité de TDM et TMM est dose dépendante, semblant signifier
que ce phénomène est spécifique de l’inhibition de Mmpl3 (Grzegorzewicz et al, 2012b). Un
mutant conditionnel du gène mmpl3 de Msm n’est pas viable en condition non permissive
(Grzegorzewicz et al, 2012b; Varela et al, 2012). Cela semble signifier que le gène mmpl3 est
essentiel. L’analyse des AM néo-synthétisés fixés à l’arabinogalactane montre une diminution
52
INTRODUCTION
progressive de toutes les espèces au cours du temps, lorsque la souche est placée en condition
non permissive (Grzegorzewicz et al, 2012b; Varela et al, 2012). L’ensemble de ces résultats
semble donc indiquer que Mmpl3 est responsable du transport à travers la membrane
plasmique de toutes les espèces d’AM, sous la forme de TMM (Figure 24). Ce résultat semble
indiquer que l’accepteur terminal des AM après la condensation par Pks13 pourrait être le
tréhalose. Ces deux études monternt également que le gène codant pour Mmpl3 de Mtb peut
complémenter la délétion du gène codant Mmpl3 de Msm. Il serait maintenant intéressant
d’étudier l’interaction entre les enzymes de la biosynthèse des AM et Mmpl3, tant sur le plan
biochimique que physique.
Mmpl3 semble une cible thérapeutique prometteuse pour le développement de nouveaux
antibiotiques (confère paragraphe I/ 2.2b p.13).
IV/ 8 Régulation de la biosynthèse des AM
La biosynthèse des AM implique un nombre important d’enzymes, de précurseurs, de cofacteurs
et de coenzymes et elle représente un coût énergétique important pour la bactérie. Il est donc
probable que la biosynthèse des acides mycoliques soit régulée génétiquement, par exemple,
lors des phases non-réplicatives, lors de carences en nutriments mais également pour maintenir
la balance entre les systèmes FAS-I et FAS-II.
L’étude de la régulation génétique de la biosynthèse des AM n’a débuté que très récemment.
Elle représente la suite logique de l’étude des AM, qui avait commencée par : l’identification, la
structure, la biochimie, l’enzymologie, la génétique pour arriver maintenant à la régulation
génique. Le premier régulateur à avoir été décrit : MabR (Salzman et al, 2010), régule
négativement l’expression de fas (FAS-I) et de certains gènes de protéines de FAS-II. Ce
régulateur transcriptionnel est essentiel chez Msm et est très bien conservé chez les différentes
espèces de mycobactéries, soulignant le rôle central de cette régulation. Les signaux de
régulation restent cependant à découvrir. Classiquement, les signaux de régulation de la
biosynthèse d’acides gras sont les acides gras eux-mêmes. En effet, dans le cas de FasR d’E.coli,
la fixation du régulateur sur sa séquence est inhibée par la présence d’acyl-CoA (DiRusso et al,
1992) permettant ainsi une levée de l’activation. En parallèle, ce régulateur (activateur) est
également un inhibiteur de la bêta-oxydation, ce qui semble indiquer un rôle de ce régulateur
dans la balance synthèse/dégradation des acides gras.
53
Figure 24 : Représentation schématique du rôle de Mmpl3 dans le transport des AM à
travers la membrane plasmique; (Grzegorzewicz et al, 2012). Les AM sont représentés en
noir. DAT, diacyltrehaloses; PAT, polyacyltrehaloses; PDIM, phthiocerol dimycocerosates. Le
tréhalose libéré lors du transfert sur l’arabinogalactane de la partie AM du TMM ou lors de
la formation de TDM à partir du TMM est recyclé et réimporté à l'intérieur des cellules par
le transporteur ABC SugABC et la LpqY des lipoprotéines associées (Kalscheuer et al, 2010);
AccD4 et AccA3 forment un complexe carboxylase qui active probablement la chaine alpha
(C24 ou C26 acyl-CoA) pour être condensée avec la chaîne méromycolique. FbpABC ou
Ag85ABC sont les mycoloyltransferases qui réalisent à la fois le transfert des AM sur l’AG et
la modification du TMM en TDM. Arabinogalactane (AG) , Peptidoglycane (PG).
INTRODUCTION
Récemment le régulateur FadR a été mis en évidence chez Mtb (Biswas et al, 2013). Ce
régulateur semble inhiber des gènes de FAS-II. Sa fixation semble peu modifiée par la présence
d’acyl-CoA. Le régulateur FasR a quant à lui été décrit pour activer l’expression du gène fas (FASI) (Mondino et al, 2013). Sa fixation pourrait être inhibée par les longues chaînes d’acyl-CoA.
L’ensemble de ces données est encore insuffisante pour modéliser l’action combinée de ces
régulateurs dans le cadre de stress, ou bien dans la balance entre FAS-I et FAS-II.
La régulation de la biosynthèse des AM semble être réalisée à la fois au niveau transcriptionnel
et post-traductionnel. En effet, depuis une décennie, les régulations post-traductionnelles,
notamment par phosphorylation de protéines, ont fait l’objet de nombreuses recherches (Bhatt
et al, 2007b; Molle & Kremer, 2010). Ces deux mécanismes sont probablement complémentaires
du fait de leur mode d’action différent et de leur vitesse de mise en place. En effet, chez E.coli, la
régulation transcriptionnelle est un phénomène dit lent, de l’ordre de la minute voire de la
génération, contrairement à la régulation post-traductionnelle, qui permet une réponse rapide
de l’ordre de la milliseconde (Alon, 2007). De ce fait, et au vu du temps de génération
extrêmement long de Mtb (24h), on peut aisément imaginer que les régulations post
traductionnelles jouent un rôle central chez ce bacille. Les mycobactéries possèdent en plus des
systèmes
à
deux
composants,
une
voie
de
signalisation
faisant
appel
aux
Sérine/Thréonine/tyrosine Protéines Kinases (STPK) (Cole et al, 1998a). L’action des STPK est
couplée à un rétrocontrôle induit par une phosphatase. Ce mode de signalisation a longtemps
été attribué spécifiquement aux organismes eucaryotes. Cependant, depuis les programmes de
séquençage du génome à large échelle, plusieurs signatures correspondant à des STPK ont été
retrouvées chez plusieurs eubactéries (pour revue, (Bakal & Davies, 2000)) dont les
mycobactéries (Cole et al, 1998a). Ces signatures correspondent au motif conservé des STPK
eucaryotes notamment celui du site catalytique (DXKPXN) ainsi que des 11 sous-domaines
conservés (Hanks & Quinn, 1991).
IV/ 8.1 Les STPK mycobactériennes
L’annotation du génome de Mtb a permis d’établir la présence de 11 STPK. Les critères
d’annotation se sont basés sur les spécificités des kinases de type Hanks décrites précédemment
(pour revue, (Av-Gay & Everett, 2000)). Leur nombre varie en fonction des espèces, par exemple
4 STPK sont annotées chez M.Leprae et 24 chez M.marinum (Narayan et al, 2007). Les analyses
phylogénétiques des STPKs de Mtb par alignement de séquences ont permis de les classer en 5
54
INTRODUCTION
sous-embranchements, nommés clade (Av-Gay and Everett, 2000; Narayan et al., 2007).
L’environnement génétique ainsi que la conservation au sein des espèces de mycobactéries a
permis aux auteurs d’orienter le rôle de chaque clade chez Mtb. Le clade I, constitué des STPK
transmembranaires, est présent chez différentes espèces mycobactériennes dont Mtb, où il est
représenté par 3 STPKs, PknA, PknB et PknL. Ce clade semble être impliqué dans la régulation de
la division et de la croissance cellulaire, la formation du septum et l’élongation du
peptidoglycane. Les gènes pknA et pknB sont en opéron avec pstP codant l’unique sérine
thréonine phosphatase de Mtb. Le clade II, constitué des kinases de la membrane interne et des
kinases cytoplasmiques chez les mycobactéries, est représenté chez Mtb par les kinases
membranaires, PknH, PknE et PknD. Ce clade semble avoir un rôle dans la régulation du
transport transmembranaire. Le clade III contient PknF, PknI et PknJ. Ce clade semble être
impliqué dans la division cellulaire et la régulation des transports membranaires. Le clade IV est
représenté chez Mtb par la protéine kinase soluble PknK. Ce clade semblerait être impliqué dans
la virulence et la synthèse des composés de la paroi. Le clade V contient la dernière kinase de
Mtb, PknG. L’organisation génétique de cette kinase soluble suggère un rôle dans le
métabolisme des sucres (cycle de Krebs). Des études expérimentales sont néanmoins
nécessaires pour confirmer les différents rôles des STPK de Mtb.
IV/ 8.2 Régulation des enzymes de FAS-II par les STPK
Plusieurs études ont montré que les enzymes de FAS-II, FabH, HadAB, HadBC, MabA, InhA, KasA
sont régulées négativement par la phosphorylation induite par les STPK (Khan et al, 2010; Molle
et al, 2006; Molle et al, 2010; Slama et al, 2011; Veyron-Churlet et al, 2009; Veyron-Churlet et al,
2010). Seule la protéine KasB semblait activée par la phosphorylation in vitro (Molle et al, 2006).
Cependant, selon L. Kremer co-auteur de cette étude, l’activité de KasB pourrait in vivo être
réprimée par la phosphorylation. Récemment, une étude montre que l’enzyme PcaA
responsable de la cyclopropanation en position proximale des AM est inhibée par la
phosphorylation (Corrales et al, 2012). In vitro, PcaA est phosphorylée par plusieurs STPK sur les
thréonines T168 et T183. Par génie génétique, il est possible de substituer ces deux thréonines
en alanine pour obtenir une protéine non phosphorylable. A l’inverse, la substitution de la
thréonine par un acide aspartique permet de mimer une phosphorylation constitutive et non
labile (protéine phosphomimétique). L’expression d’un mutant de pcaA codant pour une PcaA
phosphomimétique chez M.bovis, ΔpcaA, montre l’absence d’alpha-AM. Cela confirme donc les
données in vitro quant à l’inhibition de l’activité de PcaA par la phosphorylation.
55
Figure 25 : Résumé des interactions protéine-protéine des enzymes de la biosynthèse des
AM (Cantaloube et al, 2011). Les enzymes de condensation (en orange) interagissent les
unes avec les autres et avec le cœur de l’interactome composé de MabA (en jaune), InhA
(en vert foncé) et FabD (en rouge). Pour plus de clarté, le cœur est représenté dans chaque
type de complexe. KasA et KasB interagissent préférentiellement avec HadAB (en vert clair)
et HadBC respectivement. Les interactions entre les Mtf (en violet) et KasA, HadAB, FabD et
InhA ou KasB, HadBC InhA et FabD sont représentées par des flèches courbes noires. Pks13
(en bleu) interagit avec KasB et avec les Mtf MmaA3 et MmaA4. Chaque type de complexe
est représenté par un rectangle gris, I-FAS-II est le complexe d'initiation, E1-FAS-II et E2FAS-II, les complexes d‘élongation de type 1 et 2 respectivement et T-FAS-II est le complexe
de terminaison.
INTRODUCTION
Si l’action des phosphorylations sur les protéines de biosynthèse des AM est bien décrite et
semble robuste, le signal et la STPK par lesquels elle est induite demeurent à définir.
IV/ 9 Interactome de la biosynthèse des AM
La biosynthèse des AM fait appel à de nombreuses protéines. Contrairement au système FAS-I,
cette biosynthèse est réalisée par des enzymes uniques monofonctionnelles. D’autres voies de
biosynthèse complexes telles que le cycle de Krebs font appel à un grand nombre d’enzymes
uniques. L’étude de ces mécanismes complexes a permis de mettre en avant le rôle central des
interactions protéines-protéines évoquant ainsi la notion de « metabolic channeling ». Cette
notion décrit le passage du précurseur d’une enzyme à l’autre grâce à la présence d’interactions
protéiques permettant une compartimentalisation de la biosynthèse au cœur du complexe (Veer
Reddy & Pardee, 1980; Welch, 1978). C’est dans cette optique qu’au laboratoire, une étude
poussée d’interactions protéiques a été menée sur les enzymes de biosynthèse des AM
(Cantaloube et al, 2011; Veyron-Churlet et al, 2005; Veyron-Churlet et al, 2004). Ces études ont
permis de déterminer l’existence d’un complexe d’interactions appelé M.A.B.I. (de l’anglais,
Mycolic Acid Biosynthesis Interactome).
IV/ 9.1 Organisation générale du MABI
Le modèle propose l’existence de trois à quatre sous-complexes enzymatiques, chacun centré
sur une condensase (FabH ou Kas) associée à FabD et spécialisé dans l’initiation, l’élongation, et
la terminaison de la chaîne méromycolique. Un « core » est formé par les réductases MabA, InhA
et les deux hétérodimères de déshydratases HadAB ou HadBC. Ces complexes pourraient soit
coexister, soit s’associer de façon séquentielle. La spécificité de chaque sous-complexe est
apportée par l’interaction avec l’une des condensases du système FAS-II. Ainsi, le complexe IFAS-II porte la condensase mtFabH, le complexe E-FAS-II (E1-FAS-II et E2-FAS-II) contient KasA ou
KasB respectivement alors que le complexe T-FAS-II contient Pks13 et est associé à E2-FAS-II via
KasB. De plus, les complexes E-FAS-II sont caractérisés par des interactions préférentielles entre
KasA et HadAB (E1-FAS-II) ou KasB et HadBC (E2-FAS-II). Comme évoqué précédemment, ces
interactions semblent confirmer l’hypothèse de l’implication de HadAB dans l’élongation initiale
et de HadBC dans l’élongation terminale des AM.
Les Mtf interagissent de façon préférentielle avec les condensases KasA et KasB mais pas avec la
condensase FabH du complexe d’initiation I-FAS-II (Figure 25). Les interactions entre les Mtf et le
complexe E1-FAS-II et E2-FAS-II pourraient indiquer que les décorations de la chaîne
56
Synthèse
du malonyl-CoA
Activation de la chaîne α
Activation
de la chaîne
méromycolique
α3
α3 α3
α3
α3
α?
+
α3
α?
β4 β5 β4
β5
β5
β4
α?
α?
?
ε5
FadD32
α? α?
-
β6 β6 β6
β6
β6
β6
FAS-II
Figure 26 : Modélisation des interactions des différentes ACCases et de FadD32 entre elles
et avec le système FAS-II (Cantaloube, thèse 2010). Les flèches rouges représentent les
interactions protéine-protéine déduites d’expériences de double hybride chez la levure et
de Co-IP. Les flèches vertes représentent, en plus des interactions protéine-protéine, l’effet
activateur ou inhibiteur d’AccE5 sur les deux complexes d’ACCases. Les sous-unités α,
correspondent à AccA3 (α 3) ou une autre sous-unité α potentielle (α?). Les sous-unités β
représentent AccD4 (β4), AccD5 (β5) et AccD6 (β6). La sous-unité ε5 correspond à AccE5.
INTRODUCTION
méromycolique ont lieu au cours de l’élongation de cette chaîne. De même, l’interaction entre
MmaA4 et les déshydratases est en accord avec le fait que des mutations du gène mmaA4
puissent être associées à la résistance aux antibiotiques (isoxyle et thiacétazone) ciblant
HadABC. En effet, la modification de l’interaction entre les deux protéines pourrait modifier leur
conformation et ainsi limiter l’action des antibiotiques. Cependant, le rôle de MmaA4 dans
l’activation et la résistance à ces antibiotiques est remis en cause (Belardinelli & Morbidoni,
2012; Grzegorzewicz et al, 2012a).
Pour finir, S. Cantaloube au cours de ses travaux de thèse, a pu mettre en évidence un complexe
d’interaction entre les ACCases elles-mêmes ainsi qu’entre les ACCases et la protéine FadD32
appartemant au complexe de terminaison T-FAS-II (Cantaloube, 2010). Le modèle d’interaction
proposé correspond à la présence d’une sous-unité alpha composée d’un homo-hexamère
d’AccA3 interagissant avec une sous-unité béta composée de 3 monomères d’AccD4 et 3
monomères d’AccD5. AccE5, unité epsilon du complexe, interagit avec AccA3 et AccD5 (figure
26). AccD4 possède une forte interaction avec FadD32, ce qui pourrait permettre d’établir le lien
entre le complexe ACCase et le complexe de terminaison.
IV/ 9.2 Essentialité des interfaces d’homomultimérisation
L’étude de l’homomultimérisation des protéines MabA et InhA a permis de mettre en avant le
caractère essentiel de ces interactions. En effet, la mutation G162L de MabA provoque un
phénotype dominant négatif lors de l’expression du gène codant cette protéine chez Msm,
M.bovis et Mtb (Veyron-Churlet et al, 2004). Cette mutation semble déstabiliser l’interface
d’interaction α4α5 (D.Zerbib et L.Mourey, non-publié), décrite structuralement par CohenGonsaud et collaborateurs (Cohen-Gonsaud et al, 2002). La mutation D228R de l’interface α6β7
de MabA ne provoque pas de phénotype in vivo. Cela semble indiquer que l’interface α4α5 est
essentielle contrairement à l’interface α6β7. La mutation S170K d’InhA (équivalent positionnel
de G162L dans l’interface α4α5) provoque aussi l’apparition d’un phénotype dominant négatif
(Cantaloube, 2010). Cette mutation impacte également l’interface α4α5. Contrairement à MabA,
les travaux en chromatographie d’exclusion semblent indiquer que le mutant S170K d’InhA est
dimérique. Les travaux en cristallographie ont confirmé l’état tétramérique de MabA G162L. S.
Cantaloube propose que le dimère d’InhA est la forme active in vivo et que la forme
tétramérique est la forme de stockage.
57
INTRODUCTION
Les interactions protéiques homotypiques et hétérotypiques semblent jouer un rôle important
dans la biosynthèse des AM. Il semble clair que la biosynthèse des AM est réalisée par un ou
plusieurs complexes multi-protéiques. La biochimie et l’enzymologie des enzymes de ce
complexe sont très bien décrites dans la littérature. Cependant, son implication dans la
croissance et la division cellulaire n’est pour l’instant que très peu documentée. Seule la
biosynthèse du peptidoglycane a été décrite sur le plan de sa localisation et de sa régulation au
cours de l’élongation et de la division bactérienne.
58
Biosynthèse du PG dépendante de
MreB chez E.coli
Croissance polaire chez les
mycobactéries et corynébactéries
Croissance polaire chez streptomyces
Figure 27 : Représentation de différents modes de croissance bactériens (d’après, Flärdh,
2010) Différents modes d‘élongation de la paroi cellulaire des bactéries. Les sites actifs de
biosynthèse de la paroi cellulaire apparaissent en rouge. La plupart des cellules en bâtonnet
(partie supérieure) utilisent une hélice MreB (bleu) comme échafaudage pour la synthèse
du peptidoglycane. Les actinobacteries croissent de façon indépendante de MreB et
réalisent leur croissance aux pôles de la cellule. Les mycobacteries et les corynebactéries,
en forme de bâtonneté, réalisent leur croissance aux deux pôles de la cellule (panneau du
milieu). Chez streptomyces, les zones d'assemblage de la paroi cellulaire sont à la pointe
des hyphes, y compris aux pointes des nouvelles branches des hyphes (panneau du bas).
INTRODUCTION
V.
Biogénèse de l’enveloppe au cours de la croissance des
mycobactéries
V/ 1 Croissance polaire
Les mycobactéries font partie de l’ordre des actinomycetales caractérisées par leur croissance
sous forme de mycelium. Contrairement aux streptomycètes, les mycobactéries ne forment pas
de vrai mycélium, mais possèdent cependant une croissance apicale. La croissance apicale ou
polaire, est une caractéristique commune entre les mycobactéries et les streptomycètes. Ce
mode de croissance s’oppose à la croissance latérale utilisée par les bactéries modèles en
bâtonnet comme E.coli ou B.subtilis (Daniel & Errington, 2003) (Figure 27). Ces deux types de
croissance sont en partie déterminées par la localisation de la biosynthèse du peptidoglycane
latéral (Daniel & Errington, 2003).
V/ 1.1 Biosynthèse du peptidoglycane aux pôles
La localisation de la biosynthèse du peptidoglycane (PG) chez les mycobactéries a été
déterminée grâce à l’utilisation d’un antibiotique ciblant cette synthèse couplée avec un
fluorophore (vancomycine-fluorescéine ; VanFL). Ce marquage, montre une localisation de la
biosynthèse du PG au niveau des pôles chez les corynébactéries (Daniel & Errington, 2003). Cette
localisation a été confirmée par la suite chez les mycobactéries (Thanky et al, 2007). Cela signifie
que le peptidoglycane latéral est « inerte » chez les Corynebacterineae. Chez E.coli, la
biosynthèse du PG est orientée notamment par la protéine MreB qui forme une hélice
intracytoplasmique le long de la membrane bactérienne (Figure 27). Cette protéine joue
également un rôle de structure dans le maintien de la forme de la bactérie. Chez les
Corynebacterineae, cette protéine est absente, ce qui pose deux questions : comment la
biosynthèse du PG est-elle localisée ? Et, comment la forme de la bactérie est-elle maintenue ?
Dans ces bactéries, la biosynthèse du PG aux pôles semble dépendante de la protéine Wag31
(orthologue de la protéine DivIVA de B.subtilis). En fonction des espèces, le gène codant cette
protéine est annoté DivIVA ou Wag31. Un mutant conditionnel du gène wag31 de Msm a été
réalisé, montrant en condition non permissive, une diminution importante voire totale de la
biosynthèse du PG aux pôles jusqu’à la lyse de la bactérie (Kang et al, 2008). Cette étude a
également montré que la diminution de la concentration en Wag31 est accompagnée d’un
changement morphologique important, aboutissant à la perte de la forme en bâtonnet et un
59
INTRODUCTION
arrondissement total de la cellule. Ces observations ont été confirmées par une étude similaire
chez C.glutamicum montrant l’implication de DivIVA (Wag31) dans la localisation de la
biosynthèse du PG et la forme de la bactérie (Letek et al, 2008). Cette étude montre également
que les orthologues wag31 de Mtb et divIVA de S. coelicolor peuvent complémenter la délétion
du gène codant pour DivIVA de C.glutamicum. En effet, la forme et la localisation du PG naissant
sont restaurées. Cela signifie donc que « l’activité » de Wag31 semble être conservée chez les
actinomycètes. Chez les corynebactéries, la protéine RsmP semble également impliquée dans
l’élongation polaire (Fiuza et al, 2010). Cette protéine n’est cependant pas présente chez les
mycobactéries.
La destructuration de la biosynthèse du PG à travers la perte de Wag31 montre l’importance du
PG dans le maintien de la forme du bacille. De plus, une surexpression de Wag31 provoque
également une modification de la forme des bactéries. Il semble donc que le maintien de la
forme soit dépendant de l’orientation du peptidoglycane inerte induite directement ou
indirectement par la protéine Wag31.
La biosynthèse du peptidoglycane a été largement décrite sur le plan biochimique et
enzymologique notamment chez E.coli (pour revue (Bouhss et al, 2008)). Cette voie de
biosynthèse est complexe et fait appel à de nombreuses protéines notamment les « penicilline
binding proteins » (PBP), RodA et les Mur ligases. Chez C.glutamicum, les PBP ont été localisées
principalement au niveau des pôles (Valbuena et al, 2007). De plus, PBP1b interagit
physiquement avec DivIVA. Ces observations sont donc en adéquation avec la localisation
polaire de la biosynthèse du PG. Cela semble établir un lien direct entre la localisation d’une voie
de biosynthèse et la localisation des protéines impliquées dans cette voie. Des interactions
physiques entre Wag31 et des PBP ont également été mises en évidence chez les mycobactéries
(Mukherjee et al, 2009a).
V/ 1.2 Wag31, la protéine clé de la croissance polaire
Cette protéine de type Coiled-coil se localise au niveau des pôles chez B.subtilis (Oliva et al,
2010). Cette localisation est plus importante en termes d’intensité au niveau d’un des deux pôles
de la bactérie. Cette observation a été expliquée par l’âge du pôle. En effet, après la division il y
formation, sur le site de division d’un nouveau pôle dans chaque cellule fille. Dans une cellule
jeune, la re-localisation de Wag31 au niveau de ce nouveau pôle est plus récente et donc moins
intense lors de son observation. Cette observation est également bien décrite chez S.coelicolor
60
Figure 28 : Rôle des STPK dans la biosynthèse, l’élongation et la division mycobactérienne
(d’après, Molle & Kremer, 2010). Les STPK sont autophosphorylées en réponse à des stimuli
externes, puis phosphorylent leurs protéines cibles.
INTRODUCTION
où la protéine DivIVA est retrouvée de façon plus importante au niveau de l’hyphe principal en
comparaison des pôles des branches (Flärdh, 2003; Hempel et al, 2008).
Wag31 a la capacité de se localiser de façon autonome au niveau des pôles des mycobactéries
(Ramamurthi & Losick, 2009). En effet, le domaine N-terminal de la protéine possède un
domaine d’interaction aux membranes (Flärdh, 2010). Il a été montré que DivIVA de B.subtilis est
capable de localiser une protéine partenaire au niveau de la membrane d’un liposome, ce qui
indique que la protéine DivIVA seule peut se localiser et localiser une protéine au niveau de la
membrane plasmique (Lenarcic et al, 2009). De plus, il a été montré que DivIVA possède une
affinité supérieure pour les pôles (Lenarcic et al, 2009). Cette affinité est expliquée par la forme
du pôle qui crée une courbure négative importante semblant stabiliser les multimètres de
DivIVA. Cette géométrie est également retrouvée lors de la formation du septum (Ramamurthi &
Losick, 2009).
Cette protéine est donc un point d’ancrage de protéine au niveau de la membrane du pôle. Cette
fonction est impliquée dans la localisation du PG au niveau des pôles des mycobactéries.
D’autres « grands » mécanismes comme la réplication chromosomique sont également
dépendants de cette protéine (pour revue, (Hett & Rubin, 2008)
V/ 1.3 Régulation de la croissance des mycobactéries
La biosynthèse du peptidoglycane joue un rôle central dans le maintien de la forme des
mycobactéries. Comme nous l’avons vu précédemment, la modification de l’expression de la
protéine Wag31 induit des modifications morphologiques de la bactérie. Il semble donc que la
biosynthèse du PG nécessite une régulation fine de son activité afin de maintenir la forme de la
bactérie. Les principaux gènes codant pour les enzymes de l’élongation et de la division forment
des opérons notamment l’opéron Dcw (de l’anglais, Division Cell Wall) dans lequel est retrouvée
la STPK PknL et son régulateur transcriptionnel associé (Rv2175c). De même, les gènes essentiels
de la biosynthèse du PG, pbpA et rodA sont retrouvés en opéron avec les STPK PknA et PknB.
Cette association génétique a permis d’établir les premiers liens entre l’élongation et la division
bactérienne avec leurs régulations par la phosphorylation. Une revue très détaillée des résultats
des études de la régulation de la division des mycobactéries et corynébactéries par la
phosphorylation a été réalisée par Molle et Kremer (2010). Cette revue reprend l’ensemble des
protéines phosphorylées ainsi que la STPK potentiellement responsable de cette
phosphorylation (Figure 28)(Molle & Kremer, 2010).
61
Figure 29 : Schéma et conséquences du mode de croissance asymétrique des
mycobactéries (D’après Aldridge et al, 2012). (A) Schéma de marquage en pulse et chasse
de l’enveloppe permettant de suivre l’enveloppe néo-synthétisée et donc le taux de
croissance de chaque pôle. (B) Conséquence sur la population bactérienne de la croissance
asymétrique. Alt : alternateur ; Acc : accélérateur. (C) Taux de croissance mesuré en
vidéomicroscopie après marquage en pulse et chasse de l’enveloppe.
INTRODUCTION
De façon intéressante, la STPK PknB, possède un domaine de fixation extra-cytoplasmique PASTA
(de l’anglais, (PBP And Serine/Threonine kinase Associated domain). Un travail remarquable a
montré que ce domaine permettait la localisation de PknB au niveau des pôles et du septum de
la bactérie (Mir et al, 2011). Cette localisation est dépendante de l’interaction du domaine
PASTA avec le peptidoglycane naissant présent aux pôles des mycobactéries (Mir et al, 2011).
PknB est donc localisée au même endroit que certaines de ses cibles telles que PbpA ou Wag31.
Dans le cas de Wag31, l’augmentation du niveau de phosphorylation par PknA et B potentialise
sa localisation aux pôles et provoque une augmentation de la biosynthèse du PG (Hamasha et al,
2010). Cependant, PknB est également impliquée dans le rétrocontrôle de la biosynthèse du PG.
En effet, PknB est retrouvée en complexe avec les protéines MviN et FhaA. La phosphorylation
de MviN par PknB permet à son tour la phosphorylation de FhaA, ce qui induit l’inhibition de la
biosynthèse du PG (Gee et al, 2012). Cette étude extrêmement détaillée montre également une
localisation polaire de la protéine FhaA aux pôles et septum de Msm.
L’ensemble de ces études confirme la localisation polaire de la biosynthèse du PG, mais
également le rôle central de la régulation par les STPK dans la division chez les mycobactéries.
De façon intéressante, la biosynthèse des AM est également régulée à différentes étapes par des
STPK (confère paragraphe IV/ 8.2 p.55).
V/ 2 Division et croissance asymétrique
V/ 2.1 Croissance asymétrique des mycobactéries
Comme indiqué précédemment, le mode de division septal des bactéries définit des âges de
pôles différents. D’après la localisation plus importante de Wag31 à l’ancien pôle, celui-ci a
rapidement été défini comme le pôle de croissance. Cependant, la preuve expérimentale n’a été
apportée que très récemment par Aldridge et collaborateurs (2012) (Figure 29). Cette étude de
référence a permis de mesurer la vitesse d’élongation des pôles grâce à un marquage
fluorescent en pulse-chasse de l’enveloppe (Aldridge et al, 2012). L’enveloppe neosynthétisée
n’étant pas marquée, les auteurs ont pu mesurer l’allongement de Msm au cours du temps. Ces
mesures indiquent que dans 71% des cas, la cellule sœur ayant hérité de l’ancien pôle
(accélérateur) croît plus rapidement par rapport à l’autre cellule sœur ayant hérité du nouveau
pôle parental (alternateur) (figure 29). De plus, les accélérateurs réalisent leur propre division
avec une taille plus importante que les alternateurs. Cela implique donc, que la division
mycobactérienne est sans doute déterminée par le temps (l’âge de la bactérie) et non par la
62
Figure 30 : Modèle des mécanismes de contrôle du site de division chez B. subtilis
(Bramkamp & van Baarle, 2009). MinJ interagit avec divIVA et MinD, alors que MinC
interagit seulement avec MindD et divIVA n’interagit qu’avec MinJ. Dans les cellules filles,
divIVA (sphères violettes) recrute le complexe MinCDJ (sphères oranges) vers les pôles. Seul
M inJ se lie directement à divIVA. Lors de la polymérisation de FtsZ (sphères vertes) en un
« anneau » (vert) à mi-cellule, MinCDJ est recruté à l'écart des pôles de la cellule au niveau
du site de division. Le recrutement du complexe MinCDJ a probablement pour rôle
d’empêcher l’initiation d’un nouveau cycle de division. Après l'achèvement du
cloisonnement, MinCDJ est répartie équitablement entre les deux pôles. Les ellipses
oranges représentent les nucléoïdes.
INTRODUCTION
taille de la cellule comme chez les bactéries de référence E.coli ou B.subtilis. Les auteurs ont
ensuite déterminé que les accélérateurs possédaient une sensibilité aux antibiotiques plus
importante que les alternateurs. Ce résultat est convaincant pour les antibiotiques ciblant la
biosynthèse de l’enveloppe.
L’ensemble de ces résultats a récemment été contesté par Wakamoto et collaborateurs
(Wakamoto et al, 2013). En effet, les auteurs n’observent qu’une très faible différence du taux
de croissance en fonction de l’âge des pôles et ils n’observent pas de différence de susceptibilité
à l’INH en fonction de l’âge des pôles. Cependant, cet antibiotique était décrit par Aldridge et
collaborateurs comme présentant une forte variabilité permettant difficilement de conclure. De
façon surprenante, Wakamoto et collaborateurs ne discutent absolument pas leurs résultats en
s’opposant à l’étude d’Aldridge et al. La méthode employée pour calculer le taux d’élongation de
ces deux études est différente. Les descriptions succinctes de ces méthodes dans ces deux
articles ne permettent pas d’avancer d’hypothèse quant à ces différences de résultats.
Cependant d’autres études confirment maintenant les travaux initiaux d’Aldridge et al. Les
auteurs évoquent un taux de croissance deux fois supérieur pour l’ancien pôle, voire une
croissance unipolaire (Joyce et al, 2012; Singh et al, 2013).
V/ 2.2 Division asymétrique des mycobactéries
La mise en place du site de division chez les bactéries modèles en bâtonnet est sous un contrôle
spatio-temporel strict afin que la septation se réalise au milieu de la cellule et entre les
nucléoïdes. (Goehring & Beckwith, 2005; Harry et al, 2006). Le premier événement observable
dans la division cellulaire est la polymérisation de la « tubuline like » FtsZ en un anneau dans la
région mi-cellulaire. Cet anneau de FtsZ agit alors comme site de nucléation pour les composants
de la machinerie de division, également connu sous le nom de divisome (Bi et al, 1991; Harry,
2001). Que ce soit chez les bactéries à Gram négatif et Gram positif, comme E.coli et B.subtilis
respectivement, le choix du milieu de la cellule comme site de division est déterminé par une
combinaison de mécanismes de contrôle négatif tels que le système Min et le système
d’occlusion du nucléoïde Noc. Le sytème MinCD dont le point d’ancrage aux pôles est DivIVA
empêche la formation et l'assemblage ultérieur du divisome près des pôles chez B.subtilis. De
plus ce système permet d’inhiber la formation d’un second anneau de FtsZ à proximité du
premier. L’occlusion du nucléoïde, notamment les facteurs SLMA, prévient l'assemblage de FtsZ
au niveau des nucléoïdes. Cela permet la formation d’un anneau de FtsZ fonctionnel uniquement
63
INTRODUCTION
au milieu de la cellule et dans l’espace inter-chromosomique (pour revue, (Bramkamp & van
Baarle, 2009)) (Figure 30).
Chez les mycobactéries, les systèmes MinCDE et d’occlusion du nucléoïde sont absents (Hett &
Rubin, 2008). Comme dit précédemment, la division chez les mycobactéries pourrait dépendre
uniquement de l’âge et non de la taille de la bactérie (Aldridge et al, 2012). La septation dépend
essentiellement de l’emplacement de l’anneau de FtsZ dans la cellule. Or, chez les
mycobactéries, l’anneau de FtsZ ne se localise pas toujours au milieu de la cellule (Singh et al,
2013). Cela semble confirmer l’absence des mécanismes évoqués précédemment de régulation
de la septation chez les mycobactéries. Cependant, malgré l’absence de système d’occlusion par
le nucléoïde, très peu de « guillotinage » de l’ADN chromosomique est observé. Il semble que la
protéine FtsK soit capable d’effectuer le « transfert » rapide du nucléoïde vers les cellules filles
malgré la mise en place du divisome (Singh et al, 2013).
La division en deux cellules filles nécessite également une biogénèse de l’enveloppe au niveau
du site de division. En effet, une biosynthèse du PG est rapidement observée au niveau des
nouveaux pôles chez toutes les bactéries en bâtonnets (Daniel & Errington, 2003). Cette
biosynthèse ne dépend pas dans les premiers temps de la protéine Wag31. La localisation de la
biosynthèse du PG semble dictée par des interactions protéine-protéine. Ces interactions
mettent en jeu notamment les protéines FtsZ, FtsW et Pbp3. En cas de délétion de la protéine
FtsW, la biosynthèse du peptidoglycane au septum est abolie (Datta et al, 2006). Les auteurs
observent également un défaut de formation du septum indiquant probablement que la
protéine FtsW permet de stabiliser l’anneau de FtsZ. Une autre étude a montré que chez E.coli,
FtsW possède un rôle direct dans la biosynthèse du PG en réalisant le passage à travers la
membrane du lipide II nécessaire à la synthèse du PG (Mohammadi et al, 2011). Chez Msm, le
défaut de biosynthèse du PG au septum dans le mutant conditionnel FtsW pourrait être dû à
l’absence de l’activité « flippase » de FtsW. La protéine Wag31 se relocalise au niveau du
nouveau pôle dès que la courbure négative est suffisamment importante et permet alors le
recrutement de l’ensemble des protéines de biosynthèse du PG. Les protéines actuellement
impliquées dans la division cellulaire chez les mycobactéries ont été décrites dans une revue de
Hett et Rubin (2008). Ces auteurs posent également la question de la biosynthèse des autres
composants de l’enveloppe au cours de la croissance et la division. En effet, contrairement à la
biosynthèse du PG, l’implication de la biosynthèse de l’arabinogalactane et des AM dans la
croissance et la division des mycobactéries reste à définir.
64
INTRODUCTION
VI.
Hypothèse et projet de travail
Les mycobactéries possèdent une enveloppe complexe avec une ultrastructure caractéristique.
Les composants de cette enveloppe sont, pour certains, spécifiques du genre des
Corynebacterineae, ou bien, pour d’autres, spécifiques des espèces pathogènes de
mycobactéries. L’enveloppe représente l’interface entre la bactérie et son hôte et de ce fait, elle
joue un rôle prépondérant dans la résistance, notamment aux macrophages alvéolaires.
L’inhibition de la biosynthèse des AM de l’enveloppe, du fait de leur essentialité et de leur
spécificité, représente une voie thérapeutique idéale. L’antibiotique le plus efficace actuellement
contre la tuberculose est l’INH, qui cible l’enzyme InhA, une protéine clé du cycle FAS-II dans la
biosynthèse des AM. D’autres antibiotiques actuels ou en voie de développement ont également
pour cible cette voie de biosynthèse.
Au sein du laboratoire, des études précédentes ont permis de définir le système FAS-II comme
formé de complexes multi-protéiques spécialisés interconnectés les uns avec les autres. Ces
interactions sont spécifiques et certaines sont essentielles à la survie. Ce complexe comprend les
enzymes clés de FAS-II (MabA, InhA, KasA, KasB et HadABC), les enzymes effectuant le lien avec
FAS-I (FabH et FabD) ainsi que les enzymes réalisant la condensation et les modifications des
chaînes méromycoliques. Ces interactions pourraient définir in vivo des complexes spécialisés
dans l’initiation I-FAS-II qui porterait la condensase mtFabH, le complexe E-FAS-II (E1-FAS-II et
E2-FAS-II) qui contiendrait KasA/HadAB ou KasB/HadBC respectivement. Le complexe T-FAS-II
contiendrait lui Pks13 et serait associé à E2-FAS-II via KasB.
Dans le but de localiser ces complexes in vivo, des fusions traductionnelles de protéines de FAS-II
de Mtb (KasA KasB InhA MabA) avec des protéines fluorescentes (eGFP) avaient été réalisées au
laboratoire. L’observation initiale en microscopie de fluorescence d’un modèle non pathogène
(Msm) exprimant ces fusions avait été réalisée par S. Cantaloube (Cantaloube, 2010).
De façon marquante, ces expériences indiquaient que plusieurs protéines de FAS-II avaient une
localisation polaire et/ou septale. Cette localisation particulière pouvait être corrélée avec des
résultats plus anciens qui avaient montré que l’INH induisait une lyse des bactéries par les pôles
probablement en affectant un lieu de synthèse active des AM (Bardou et al, 1996). Comme nous
l’avons vu plus haut (confère paragraphe V/ 1.1 p.59), les pôles de Mtb sont des sites actifs de
croissance de la paroi. La synthèse du peptidoglycane latérale de Mtb est réalisée au niveau des
pôles, ce qui se traduit par un allongement de la bactérie à partir de ses extrémités. Ce
65
INTRODUCTION
mécanisme est dépendant de la protéine clé de l’élongation polaire Wag31. Ceci peut conduire à
penser que la synthèse des AM et celle de la paroi sont deux phénomènes corrélés dans l’espace
et peut-être aussi dans le temps.
Si la biochimie de la synthèse des AM est relativement bien connue, la régulation et le lieu de
cette synthèse ne le sont pas. Tous les éléments ci-dessus suggèrent l’existence d’un couplage
spatial et temporel entre la division cellulaire et la synthèse des constituants de l'enveloppe. Ces
observations ont motivé mes travaux de thèse. Mon travail a consisté en l’étude de la
dynamique de la localisation de protéines impliquées dans la biosynthèse des AM au cours de la
croissance bactérienne, dans le but d’approcher un projet plus général consistant en la
recherche d’une relation fonctionnelle entre le cycle bactérien et la biogenèse de l’enveloppe.
66
RÉSULTATS
67
Soft Agar + 7H9
Séries de Z
z1
z2
z3
z4
(x,y)
Bactéries
DMIRB
pLAM12::GFP
Figure 31 : Schéma du système de vidéomicroscopie en agar pad permettant l’observation
de mycobactéries en croissance.
RÉSULTATS
I.
Localisation du système FAS-II aux sites de croissance et de
division de la bactérie
I/ 1
Introduction et système expérimental
Les mycobactéries possèdent une enveloppe très complexe. La biosynthèse des différents
composés de l’enveloppe représente une dépense énergétique importante pour la bactérie. De
plus, cette biosynthèse se doit, comme par exemple pour le PG, d’être couplée de façon intime
avec la croissance et la division cellulaire. En effet, l’absence de protéine de structure comme
MreB semble indiquer que la forme en bâtonnet des mycobactéries est probablement due
uniquement à des composants de l’enveloppe et notamment au PG. La croissance de la paroi
latérale est réalisée à partir des pôles. Dans la littérature, seule la biosynthèse du PG est décrite
comme localisée aux pôles. Cette localisation semble dépendante de la protéine clé de la
croissance polaire : Wag31.
Les résultats présentés ci-dessous, démontrent que des enzymes clés du système FAS-II de la
biosynthèse des AM sont également localisées au niveau des pôles et du site de septation. Ces
résultats représentent la première localisation in vivo d’un système complexe de biosynthèse
d’acides gras de la membrane externe.
Comme nous l’avons vu précédemment, la biosynthèse du PG est de nos jours « facilement »
localisable grâce à l’utilisation d’un dérivé fluorescent de la vancomycine (Van-Fl, Van-Alexa
etc.). En effet, ces molécules se fixent directement sur les motifs D-Ala D-Ala des précurseurs du
PG empêchant leur polymérisation. Contrairement à cela, la biosynthèse des AM ne possède
actuellement pas de marqueur pouvant permettre sa localisation. Pour approcher la localisation
de la biosynthèse des AM, nous avons donc entrepris de réaliser la localisation des protéines clés
de FAS-II (MabA, InhA, KasA, KasB) grâce à leur fusion avec la GFP. Cette stratégie a largement
été utilisée dans la littérature du fait de nombreux avantages, mais elle présente également des
limites qui seront discutées plus bas. De nombreuses mises au point ont été nécessaires pour
permettre une expression optimale des gènes de FAS-II de Mtb fusionnés avec le gène de la GFP
chez Msm. Les travaux préliminaires ont été réalisés dans un système d’expression constitutif
basé sur le promoteur fort phsp60. Du fait de la toxicité et de l’instabilité observées avec ces
constructions (S. Cantaloube, thèse 2010), les fusions traductionnelles ont été ensuite réalisées
dans différents systèmes d’expression inductibles. Trois systèmes d’expression inductibles ont
été testés pour ce projet : un système Tet-ON (S. Cantaloube), un système inductible à l’IPTG (C.
68
RÉSULTATS
Carel ; M1) et enfin à l’acétamide (K. Nukdee ; M2R). Après comparaison de différents systèmes
d’expression, nous avons choisi d’utiliser le système d’expression inductible à l’acétamide
(Triccas et al, 1998). Nous avons fusionné la GFP à l’extrémité N-terminale (N-ter) des gènes de
FAS-II car cela a permis d’éviter la toxicité observée des fusions à l’extrémité C-terminale (C-ter).
De plus, les données structurales des enzymes MabA, InhA, KasA et KasB présentées
précédemment (confère paragraphe IV/ 4 p.40) indiquent que les extrémités N-ter ne sont pas
enfouies dans la structure de ces protéines et sont peu structurées. Il semblait donc logique de
s’orienter vers des fusions en N-ter.
L’étude microscopique des souches de Msm exprimant les constructions génétiques précédentes
a nécessité une mise au point technique très importante. A titre d’exemple, le simple montage
des lames de microscopie, du fait de l’agrégation importante de Msm et malgré l’utilisation de
détergent (Tween) durant la culture (confère paragraphe V/ 2 p.101) fut en soi un problème
technique à surmonter. L’acquisition des images statiques a été réalisée grâce à un microscope à
champ large permettant également la réalisation de vidéomicroscopie. Les conditions et les
techniques employées pour la réalisation de la vidéo-microcopie ont été mises au point par K.
Nukdee (Doctorante) et D.Zerbib sur la base des travaux de Joyce et collaborateurs (Joyce et al,
2011) (Figure 31). Ces derniers utilisent un système ouvert dans lequel les bactéries poussent sur
une lamelle surmontée d’agar mou fournissant les nutriments nécessaires à la croissance
bactérienne.
I/ 2
Résultats
I/ 2.1 Publication: « Polar localization of Mycobacterium tuberculosis
Fatty Acid Synthase-II Proteins in the course of bacterial Growth and
Wag31 Dynamics
L’article suivant reprend une grande partie des résultats obtenus durant ma thèse. Une partie
des expériences de vidéomicroscopie provient du travail de thèse de K. Nukdee justifiant ainsi la
signature en co-premier auteur de cette étude.
Ces travaux avaient pour but d’étudier l’implication de la biosynthèse des AM au cours de
l’élongation et la division chez Msm, modèle d’étude non pathogène de Mtb. Ce modèle d’étude
est couramment utilisé et admis, notamment dans le cadre d’études s’intéressant au cycle
cellulaire des mycobactéries ((Aldridge et al, 2012; Watanabe et al, 2011). Comme indiqué
69
RÉSULTATS
précédemment, nous avions opté pour une stratégie visant à localiser des enzymes de
biosynthèse des AM de Mtb en les fusionnant à la GFP. Ces constructions ont été fournies de
façon ectopique et inductible chez Msm afin de faciliter leur observation en vidéomicroscopie
sur bactérie unique en croissance. Nous avons donc localisé les protéines clés des complexes
FAS-II et du transport des AM, analysé leur colocalisation avec la protéine polaire Wag31
responsable de la localisation de la biosynthèse du PG et porté aussi notre effort, au cours de
cette étude, sur le test de l’activité de nos fusions par des analyses phénotypiques et
biochimiques.
70
Mycobacterium tuberculosis Proteins Involved in Mycolic
Acid Synthesis and Transport Localize Dynamically to the
Old Growing Pole and Septum
Clément Carel1,2., Kanjana Nukdee1,2., Sylvain Cantaloube1,2, Mélanie Bonne1,2, Cheikh T. Diagne1,2,
Françoise Laval1,2, Mamadou Daffé1,2, Didier Zerbib1,2*
1 Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France, 2 Université de Toulouse, Université Paul Sabatier,
Toulouse, France
Abstract
Understanding the mechanism that controls space-time coordination of elongation and division of Mycobacterium
tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), is critical for fighting the tubercle bacillus. Most of the numerous
enzymes involved in the synthesis of Mycolic acid - Arabinogalactan-Peptidoglycan complex (MAPc) in the cell wall are
essential in vivo. Using a dynamic approach, we localized Mtb enzymes belonging to the fatty acid synthase-II (FAS-II)
complexes and involved in mycolic acid (MA) biosynthesis in a mycobacterial model of Mtb: M. smegmatis. Results also
showed that the MA transporter MmpL3 was present in the mycobacterial envelope and was specifically and dynamically
accumulated at the poles and septa during bacterial growth. This localization was due to its C-terminal domain. Moreover,
the FAS-II enzymes were co-localized at the poles and septum with Wag31, the protein responsible for the polar localization
of mycobacterial peptidoglycan biosynthesis. The dynamic localization of FAS-II and of the MA transporter with Wag31, at
the old-growing poles and at the septum suggests that the main components of the mycomembrane may potentially be
synthesized at these precise foci. This finding highlights a major difference between mycobacteria and other rod-shaped
bacteria studied to date. Based on the already known polar activities of envelope biosynthesis in mycobacteria, we propose
the existence of complex polar machinery devoted to the biogenesis of the entire envelope. As a result, the mycobacterial
pole would represent the Achilles’ heel of the bacillus at all its growing stages.
Citation: Carel C, Nukdee K, Cantaloube S, Bonne M, Diagne CT, et al. (2014) Mycobacterium tuberculosis Proteins Involved in Mycolic Acid Synthesis and
Transport Localize Dynamically to the Old Growing Pole and Septum. PLoS ONE 9(5): e97148. doi:10.1371/journal.pone.0097148
Editor: Laurent Kremer, Université de Montpellier 2, France
Received December 16, 2013; Accepted April 15, 2014; Published May 9, 2014
Copyright: ß 2014 Carel et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). CC was supported by the French ministry of research; KN was
supported by a fellowship from the Thailand government. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or
preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
. These authors contributed equally to this work.
In Mtb, two Fatty-Acid-Synthase systems (FAS), FAS-I [6] and
FAS-II [7], are devoted to the synthesis of common fatty acids and
of specific, long-chain, a-acylated, b-hydroxylated fatty acids,
namely mycolic acids (MA) [8,9]. Mycolic acids constitute the
major lipid component of the envelope and form the external
mycomembrane [10,11]. They are either inserted in the
mycomembrane as trehalose dimycolates and monomycolates
(TDM and TMM) or linked covalently to the underlying
arabinogalactan (AG), itself bound to peptidoglycan (PG) to form
the MAPc [12,13]. Mycolic acids stem from the condensation of a
medium chain-length fatty acid (C24-C26) produced by FAS-I with
a long meromycolic chain (up to C60) produced by FAS-II (Figure
S1) [14,15]. FAS-II is comprised of specialized and interconnected
protein complexes [16,17,18] (Figure S2). The MA biosynthetic
pathway is assumed to be cytoplasmic, a notion recently reinforced
by the discovery of a MA transporter in mycobacteria: the
potential trans-membrane protein MmpL3 [19,20,21]. We
hypothesized that at least part of the FAS-II multi-protein
complexes may exist as stable entities and could be involved in
the biogenesis of MAPc during bacterial growth.
Introduction
The mycobacterial cell envelope is of an exceptional complexity. One of the major challenges for Mycobacterium tuberculosis (Mtb)
is probably achieving the synthesis of this thick multilayer barrier
[1,2]. The Mtb envelope is partly responsible for its innate
resistance to antibiotics and plays a major role in both its virulence
and persistence. Tuberculosis (TB) reappeared in the 1990s and
remains one of the main causes of lethality worldwide. The
principal challenge is to fight the increasing number of multi-drug
resistant (MDR) Mtb clinical isolates. The alternate periods of
growth and dormancy of Mtb during infection [3] render the
discovery of new effective antibiotics difficult. Mtb division, as well
as the regulation of its cell cycle and the maintenance of cell wall
homeostasis, are nonetheless weak points of the bacillus. Understanding the mechanisms that guarantee spatial and temporal
coordination of Mtb envelope biogenesis during the cell cycle is a
crucial step toward deciphering the role of this major player of Mtb
pathogenesis [4,5].
PLOS ONE | www.plosone.org
1
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
The cell wall elongation process of actinobacteria [4] is different
from that of other rod-shaped models such as Escherichia coli or
Bacillus subtilis [22]. In the latters, nascent PG is made all along the
side of the bacterium during elongation and at the septum during
the division process [23] whereas in the former, the lateral PG
derives from polar biosynthesis during elongation [24]. Among
mycobacteria, the polar localization of PG synthesis is mainly due
to the phospholipid-interacting protein Wag31, the ortholog of the
B. subtilis DivIVA protein [25,26,27]. Wag31, by targeting
negatively-curved membranes [28], is responsible for the polar
localization and the septal re-localization of several PG biosynthesis proteins [29,30]. Wag31 is mainly located at the ‘‘old pole’’
(Figure 1), which is the active locus among mycobacteria and other
actinobacteria where new molecular material of the lateral cell wall is
added [31,32]. The ‘‘septal pole’’ (Figure 1), which represents the
future pole and the developing septum, does not participate in
lateral PG biosynthesis [33].
We demonstrate herein that reductases from the FAS-II core as
well as the MA transporter MmpL3 are located at the active
mycobacterial old poles and at the position of the septum prior to
division. The condensing enzymes form polar foci but are also able
to diffuse in the cytoplasm. FAS-II localization is correlated with
the dynamics of cell division, with the localization of Wag31 and
with the dynamics of the MA transporter MmpL3. These results
describe the first observation of the localization of sophisticated
machinery for fatty acid biosynthesis. In addition, they reveal the
existence of a possible link between two central and essential
processes: bacterial division and whole envelope biogenesis.
Mycolic acids may be synthesized at the active poles and septa
in order to be transported, probably by MmpL3, to the external
mycomembrane.
Results
FAS-II complex components are located at one bacterial
pole
Mtb genes encoding the FAS-II reductases MabA and InhA,
and the condensing enzymes KasA and KasB, were merged to the
C-terminal end of gfp and expressed under the control of the PamiE
inducible promoter in the non-pathogenic bacterium model M.
smegmatis mc2155 (Msm). In a first series of experiments, large field
fluorescence microscopy images, hereafter called static images,
were acquired six hours after induction. GFP alone emitted a
bright and diffuse fluorescence throughout the cytoplasm
(Figure 2A). Conversely, the reductase fusions yielded intense foci
located mainly at one bacterial pole (Figure 2A). In the strains
expressing either GFP-KasB or GFP-KasA, polar foci were also
detectable although together with a diffuse fluorescence in the
cytoplasm (Figure 2A). To quantify foci formation, a polar index
(PI) was calculated and defined as the ratio of the number of
bacteria containing at least one polar focus reported to the total
number of fluorescent bacteria (N). Over one thousand bacteria
expressing each fusion were analyzed on several replicates. Two
groups were found (Figure 2B). The first group, e.g. MabA
(89.47%61.20, N = 1100) and InhA (63.86%61.56, N = 2000),
had a high PI while the second group, e.g. KasA (13.34%61.40,
N = 900) and KasB (21.02%62.40, N = 1700), had a lower PI.
Due to the inaccuracy of quantifying and comparing static images
from different snapshots, the total amount of fluorescence in live
bacterial culture was assessed by fluorometry as a function of
induction time. This enabled to verify whether PI was correlated
or not with fusion expression levels. Eight hours after induction
(Figure 2C), the strain containing GFP alone (PI = 0%) emitted the
maximum fluorescence (280 RFU). MabA (PI = 89%) and KasB
(PI = 21%) yielded intermediate fluorescence levels (45 RFU and
35 RFU, respectively) whereas KasA (PI = 13%) and InhA
(PI = 63%) yielded very low levels (below 10 RFU). The absence
of correlation between fluorescence levels and PI values (as
compared between Figure 2B and Figure 2C) was further
confirmed by Western blotting experiments performed on the
same cultures (Figure 2D). Western blotting results were perfectly
correlated with fluorometry results (see comparison between
Figure 2D and Figure 2C) and thus were not correlated with PI
values, indicating that foci formation was not due to protein
overexpression but rather due to preferential localization of FAS-II
at the pole.
Dynamics of polar localization of FAS-II proteins
In order to analyze foci formation and localization and avoid
potential problems due to protein accumulation, a dynamic
analysis was implemented. The goal was to observe and follow the
very early stages of foci formation during bacterial division,
starting just after the beginning of the induction of GFP-fusion
expression with a low amount of inducer (0.02% acetamide).
Time-lapse microscopy experiments were designed using a recent
and efficient agar pad microscopy technique [34]. In the GFPproducing strain (Movie S1), the signal was bright and diffuse in
which no foci were observed. In the GFP-MabA producing strain
(Movie S2), at the beginning of induction, the first foci (Figure 3,
foci a, 3 h; and b, 5 h), were observed at the septal poles of the
mother bacterium. These foci appeared at mid-cell at the position
of the next division septum. These types of foci were often
apparently split in two after the end of the division process
(Figure 3, foci a1-2, 5 h; b1-2, 9 h). Thereafter, they became
established at the new poles of the first pair of daughter bacteria
(Figure 3, foci a, b, c, 9 h to 13 h). At the end of induction the
Figure 1. Schematic representation of mycobacterial polar
growth and establishment of bacterial poles. Two division cycles
(D1 and D2) are presented. The active biosynthesis of lateral
peptidoglycan at the poles and biosynthesis of septal peptidoglycan
at the future pole (septal poles) are symbolized with curved arrows. The
old pole (in red) and the new pole (in blue); are both represented and
refer to the first division event (D1).
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g001
PLOS ONE | www.plosone.org
2
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
Figure 2. Polar localization of FAS-II proteins. (A) Enlarged images of wide-field microscopy experiments on GFP-fusion expressing bacteria.
Bright field images (BF; leftmost column) together with GFP fluorescence images (GFP, middle column) of Msm expressing GFP fusions with MabA,
InhA, KasA or KasB, or GFP alone (Ø) were acquired after 6 hours of induction. The merged images (right columns) allowed visualizing the polar
localization of the fusions. Total optical magnification: 630 X. Scale bar: 5 mm. (B) Scatter dot plot representation of polar indexes of Msm strains
expressing each GFP fusion after 6 hours of induction. Data were collected from wide-field microscopy images and subsequently expressed and
evaluated as described in Materials and Methods. Statistical t-tests were performed to assess the differences between the polar indices of GFP-MabA
(black circles) and GFP-InhA (black triangles) and between GFP-KasA (black squares) and GFP-KasB (open diamonds). Each data point corresponds to
an individual experiment. Each series of data points for a given fusion represents 500 to1500 bacteria analyzed. The p values of indicated unpaired ttests are symbolized by asterisks (***, p,0.0001), (*, p = 0.0264). (C) Total fluorescence of Msm cultures expressing GFP fusions. Experimental values
are represented as means 6 SEM. Fluorescence intensities, expressed in RFU (as defined in the text and in the Materials and Methods) of liquid
cultures of Msm expressing either GFP alone (Ø), GFP-MabA (black circles), GFP-KasB (open diamonds), GFP-KasA (black squares) or GFP-InhA (black
triangles) were plotted against the length of induction in hours (h). The curve fit was obtained by using a second order polynomial nonlinear
regression (quadratic) calculated with GraphPad Prism 5.0 software. (D) Western Blot analysis of GFP-fusions. Total protein content of Msm culture
samples expressing either GFP alone or the GFP-fusions with the indicated proteins was analyzed by Western blotting using anti-GFP antibodies. The
blots were performed 2 hours (left lanes), 4 hours (middle lanes) or 6 hours (right lanes) after acetamide induction of the same cultures depicted in
panel C. The molecular weights of the relevant marker bands are indicated in kDa.
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g002
pole structure in order to ensure elongation of the lateral
mycomembrane.
images resembled the static images from the first experiments
(Figure 2A) where this protein was present at only one pole,
leading to conclude that these foci correspond to dynamic protein
complexes. The same results were obtained with the InhA fusions
(Movie S3), displaying foci which were first visible at the septal
poles and thereafter establishing at one preferential pole. Because
of the lower level of expression of the KasA fusion (Movie S4), it
was more difficult to follow foci dynamics at the beginning of
induction although in the micro-colonies, GFP-KasA foci were
also first visible at the septal poles and then appeared very rapidly
at the poles. Finally, the KasB fusion (Movie S5) was diffuse in the
cytoplasm at the early stage of induction and the foci were only
visible at one pole at the end of the experiment. There was no
typical envelope labeling by FAS-II fusions observed at any time,
indicating that the FAS-II protein tested are probably cytoplasmic.
We thus hypothesized that these proteins ultimately participate in
PLOS ONE | www.plosone.org
FAS-II proteins are localized with the old pole marker
protein Wag31
Since FAS-II localization appeared to follow the reported
localization of the polar protein Wag31 [29,35], a recognized ‘‘old
pole marker’’, Wag31-FAS-II colocalization was therefore studied.
For purposes of clarity, the word colocalization is used in this study
to describe the localization of two proteins at the same focus but
without implying the existence of any molecular interaction. A
strain was constructed bearing a single but ectopic chromosomal
copy of a mCherry-Wag31 fusion under the control of the
constitutive promoter pHSP60 of the integrative vector pMV361.
This type of construct, using the pHSP60 promoter, has been
successfully used previously to study Wag31 localization [36].
When this strain was observed in fluorescence microscopy (Figure
3
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
bacteria expressing each fusion (N) stemming from several
individual slides (n.6). The polar indices of MabA (93.9360.59
N = 800), KasA (23.8764.56 N = 500) and KasB (13.4961.43
N = 500) were not statistically different from the previously
observed indices (see comparison between Figure 2B and 4B)
whereas the PI of GFP-InhA (35.9962.14 N = 700) was slightly
reduced. While there was no dramatic effect of the presence of the
mCherry-Wag31 fusion on the percentage of localization of the
FAS-II proteins, there was the presence of colocalization of both
Wag31 and FAS-II fusions foci. To quantify this phenomenon on
a large number of bacteria a colocalization index was defined as
being the percentage of bacteria exhibiting Wag31-GFP colocalization relative to the number of GFP-mCherry-positive bacteria.
Colocalization indices (Figure 4C) were very high for all FAS-II
proteins: MabA (83.31%63.27, N = 800), InhA (93.93%62.60,
N = 700), KasA (89.71%63.37, N = 500) and KasB
(89.52%63.60, N = 500). In order to evaluate the distribution of
foci within individual bacteria, a more in-depth analysis was
performed on a subset of bacteria by scanning more than 100
organisms of each type. On each scan (Figure 4D), the maximum
fluorescence was plotted against the normalized length of the
bacteria. A dot represented on a graph can refer to a focus (at the
pole) or simply to the maximum of diffuse fluorescence along the
cell. Localization of the reductases and colocalization with Wag31
at the old poles were clearly confirmed (Figure 4D). Furthermore,
the maximum florescence emitted by KasA and KasB, which
displayed the lowest polar indices, were clearly preferentially
observed in proximity of the old poles along with Wag31, thus
suggesting an actual preference for this localization (Figure 4D).
The distribution of the polar foci clouds represented only about
20% of total cell size, i.e. less than 1 mm, probably due to light
diffusion. This distribution was similar for FAS-II proteins and for
Wag31, already known to be localized close to the polar
membranes. In contrast, the maximum accumulation of GFP
alone was never found at the old pole suggesting a polar exclusion
of GFP alone. These analyses clearly demonstrate that the FAS-II
proteins were preferentially located at the old pole with Wag31.
Since Wag31 is acknowledged to be an old pole marker, we can
conclude that the polar FAS-II proteins were located at the active
growing ‘‘old pole’’ of the bacteria.
Figure 3. Dynamics of GFP-MabA localization. Images were
extracted from the movie presented as movie S2. The time interval after
the starting point of the movie is indicated in hour (h). Merge bright
field and GFP channel images (BF-GFP, left column) and GFP channel
images (GFP, right column) were extracted in order to follow the
dynamics of representative GFP-MabA foci. Two bacteria and their
daughter cells were schematized (far right). Representative foci (in
green) are labeled (a to f) and followed, when possible, in the daughter
cells. Superscript numbering represents potential foci splitting. White
arrows indicate the localization of the main foci on GFP images.
Magnification and scale are identical to those indicated in Figure 2A.
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g003
FAS-II localization dynamics follow Wag31 dynamics with
no molecular interaction
In order to compare FAS-II and Wag31 dynamics, time-lapse
experiments were performed on bacteria expressing both types of
fusions. The expression of mCherry-Wag31 being constitutive,
polar Wag31 foci were visible in the mother cells at the beginning
of the experiments. As observed on static images (Figure 4A), GFP
alone was diffuse in the cytoplasm (Movie S6). In this movie, the
presence of Wag31 at the old pole and its re-localization to the
septum were clearly visible (Movie S6). In the GFP-FAS-II
producing strains (Movies S7-S10), bacterial division was observed
together with Wag31 and FAS-II dynamics. The dynamics of GFP
foci were analyzed in detail for the GFP-MabA fusion (Movie S7
and Figure 5). Prior to the detection of GFP fluorescence,
mCherry-Wag31 mainly observed at the old poles then, as the
elongation progressed (1 h, bacteria 1 and 2), Wag31 was
relocated to the septa as previously observed [29,30]. The GFP
fusions were first detected at these new poles and slightly at the old
poles (2 h, bacteria 11 and 12). Progressively thereafter, establishment was observed at the old poles (see after 5 h, bacteria 11.1). At
the end of the experiments, GFP fluorescence was primarily
observed at the old poles together with the brighter Wag31
fluorescence. Bacterium no. 2 presented here (Figure 5) displayed
S3), the mCherry fusion was more visible at one pole as also
commonly observed by others [36,37]. This pole has been shown
to represent the old pole (Figure 1) [29]. The fusions were
introduced into the mCherry-Wag31 producing strain after which
the fluorescence of both GFP and mCherry was analyzed as
performed above on static images. As observed in the absence of
mCherry-Wag31 (Figure 2A), GFP remained diffuse whereas
GFP-MabA and GFP-InhA yielded intense polar foci, mainly at
one pole (Figure 4A). GFP-KasA and GFP-KasB still appeared
diffuse with a lower extend of polar spotting (Figure 4A). The
overall localization pattern of the FAS-II fusions was comparable
to that of the previous fusions (Figure 2A). The statistical relevance
of the localization (Figure 4B) was analyzed as above on individual
PLOS ONE | www.plosone.org
4
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
Figure 4. Polar colocalization of FAS-II proteins with Wag31. (A) Enlarged images of wide-field microscopy experiments on GFP-fusion and
PLOS ONE | www.plosone.org
5
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
mCherry-Wag31 fusion-expressing bacteria. GFP fluorescence images (GFP; leftmost column) together with mCherry fluorescence images (Che,
middle column) of Msm::mCherry-wag31 expressing GFP fusions with MabA, InhA, KasA, KasB, or GFP alone (Ø) were acquired after 6 hours of
induction. The merged images (right columns) allowed visualizing the polar colocalization of the fusions. Magnification and scale bars are identical to
those indicated in Figureô 2A. (B) Bar graph representation of GFP polar indices of Msm::mCherry-wag31 strains expressing each GFP fusion after
6 hours of induction. Experimental values are represented as mean 6 SD. Data were processes as described in Figureô 2B. Statistical t-tests were
performed to determine the differences between the polar indices of GFP-InhA (dark grey bar) and GFP-KasA (light grey bar) and of GFP-KasA and
GFP-KasB (white bar). The p values of indicated unpaired t-tests are symbolized by asterisks (*, p = 0.0271 for InhA-KasA), (*, p = 0.0186 for KasA-KasB).
(C) Bar graph representation of GFP-mCherry colocalization indices of Msm::mCherry-wag31 strains expressing each GFP fusion after 6 hours of
induction. Experimental values are represented as means 6 SD. Data were processed as in panel B; no significant differences were found between
colocalization indices. (D) Analysis of maximal mCherry-Wag31 (Che-Wag31, left column) and GFP-FAS-II fusion (GFP fusion, right column)
fluorescence position within individual Msm::mCherry-wag31 bacteria expressing each GFP fusion after 6 hours of induction. Each type of bacterium
was scanned on both channels. Each dot represents the position of maximum fluorescence of the scans expressed in % of the highest values. Each
dot was plotted against its position in the bacterium with the length of bacteria reported to 1. The names of the FAS-II proteins fused with GFP are
indicated. Ø refers to the Msm::mCherry-wag31 strain containing GFP alone.
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g004
exactly the same dynamics with a delayed appearance at the
beginning of the induction. Because of the lower expression of the
InhA fusion, the dynamics of this fusion was more difficult to
follow although the majority of GFP foci were established with the
brighter Wag31 foci (Movie S8). Finally, the KasA fusion (Movie
S9) and the KasB fusion (Movie S10) were mainly diffuse in the
cytoplasm as already observed on static images and foci were
observed only at the end of the experiments. When GFP fusion
expression was induced, new proteins entered the system via the
pole in construction (septal pole) and then established progressively
to the old pole with Wag31.
To ascertain whether dynamic FAS-II-Wag31 colocalization
was due, or not, to molecular interactions, in vitro Co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments were performed with Wag31
against FAS-II proteins. In vitro 35S-labeled HA-tagged FAS-II
proteins (h-proteins) bound to magnetic beads coated with antiHA antibodies were used to trap labeled c-Myc-tagged Wag31
protein (c-Wag31). No Co-IP bands were observed, except with
Wag31 itself (Figure S4A). When the Co-IP experiments were
performed in the reverse direction (Figure S4B), with h-Wag31
against c-FAS-II proteins, only non-specific binding was observed
with FAS-II proteins (Figure S4B, IPØ). This non-specific binding
was not observed when known negative controls were used (Figure
S4C) including human c-Lamin (c-Lam) or mycobacterial Nat
protein (Arylamine N acetyltransferase, [38]). This indicates that
FAS-II proteins localize to the old pole and follow Wag31
dynamics without any direct molecular interaction with Wag31.
In vivo activity of GFP-fusions
FAS-II proteins are organized in specialized complexes (Figure
S2) interconnected with one another [16,17,18]. We showed
above that representative members of theses complexes were
located at the old poles during elongation and at the septa prior to
division. It was thus tempting to postulate that the biosynthesis of
mycolic acids may occur at these precise foci. To date, there is no
known biochemical clue for locating MA biosynthesis in vivo. Thus,
to address this question, we chose to analyze GFP-fusion activity in
vivo. The kasB gene is the only FAS-II gene that is not essential in
both M. marinum [39] and Mtb [40]. In the absence of KasB, which
is part of the E2-FAS-II complex [17] and is responsible for the
final step of meromycolate elongation, the MA are shortened by
two to four carbons [40]. For the present purposes, we constructed
a kasB-KO mutant of Msm (Figure S5) that was viable, indicating
that kasB is also ‘‘non-essential’’ in Msm. In this mutant, the alphaand epoxy-MA were shortened by four carbons (Figure 6A, 6B)
whereas the alpha’-MA, which appeared as KasB independent,
were not affected (Figure S6). The mutant phenotype was reverted
by complementation with the wild type kasB gene and, more
importantly, by the GFP-KasB fusion (Figure 6A). The localization
Figure 5. Dynamic of GFP-MabA/Wag31 colocalization. Images
were extracted from the movie presented as movie S7. The time interval
after the starting point of the movie is indicated in hours (h). Images
were extracted from three channels (bright field, BF, left column; GFP,
middle column; mCherry, Che, right column) in order to follow the
dynamics of representative GFP-MabA and mCherry-Wag31 foci. Two
bacteria, numbered 1 and 2, and their daughter cells, identified by
superscript numbering are schematized on the right. Magnification: 630
X. Scale bar: 5 mm.
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g005
PLOS ONE | www.plosone.org
6
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
Figure 6. Analysis of GFP-KasB and GFP-InhA in vivo activities. (A) MALDI-TOF mass spectra of a-mycolic acid methyl esters extracted from
wild type (Msm mc2155, WT), mutant (Msm mc2155 DkasB, DB) and complemented (Msm mc2155 DkasB/kasB, DB/B; Msm mc2155 DkasB/gfp-kasB, DB/
gB) strains. The accurate masses (m/z), together with the length of the odd carbon-numbered mycolates are indicated. (B) TLC analysis of mycolic acid
methyl esters extracted from the strains analyzed and described in Figureô 6A. The migration position of the a-mycolates (alpha), the a’-mycolates
(alpha’) and of the epoxy-mycolates (epoxy) are indicated. (C) Growth analysis of colonies of Msm mc2155 derivatives spotted onto agar plates
containing increasing amounts of isoniazid (INH). Bacterial colonies were photographed either under white light (first three rows) or under blue light
illumination allowing to reveal GFP fluorescence (last row). Bacteria containing the vector alone (Ø) or expressing the Mtb inhA gene, or the GFP
fusion with InhA are represented. (D) Two colonies of the thermosensitive strain Msm inhAts containing either the pLAM12 vector (L12), the
pLAM12::GFP-InhA plasmid (L12 GFP-InhA) or the pLAM12::InhA plasmid (L12 InhA) were grown at 30uC (left) or 42uC (right) on agar plates containing
acetamide (0.2%).
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g006
in our system, to test the GFP-fusion complementation of
interrupted genes. MabA and kasA genes exist within operons
whereas inhA lies at the end of an operon. Nevertheless, we had
some inkling with regard to InhA. InhA is the primary INH
(isoniazid, also known as isonicotinylhydrazine) target and its
pattern of GFP-KasB in the complemented mutant was identical
to that observed with the wild type (data not shown). The GFPKasB fusion was active in vivo.
Given that the other FAS-II genes (mabA, inhA, kasA) are
essential [41,42] and part of operons, it was not easily achievable,
PLOS ONE | www.plosone.org
7
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
overproduction induces an increase in the level of INH resistance
by trapping the INH-NAD adducts in its catalytic pocket, thus
reducing INH concentration within the bacteria [43]. We first
verified that the overproduction of the wild type inhA gene in our
strain indeed increased INH resistance (18.75 fold; 75 mg/ml,
Figure 6C) whereas the production of GFP alone did not affect this
level (4 mg/ml). A clear increase in resistance threshold, (12.5 fold;
50 mg/ml), was also observed when GFP-InhA was produced. The
GFP-InhA fusion was likely able to bind the INH-NAD adducts in
vivo thereby inducing an increase in cell resistance to INH. Finally,
to demonstrate that the GFP-InhA fusion was active, the
complementation of an inhA thermosensitive mutant Msm strain
(mc22359; inhAts; [44]) was tested (Figure 6D). At 42uC, in the
presence of acetamide, the inhAts strain containing the void vector
pLAM12 was unable to grow. In contrast, when either the wild
type InhA protein or, more interestingly, the GFP-InhA fusion was
expressed, the complemented strains were thermo-resistant
indicating that the fusion was also able to complement the InhA
deficiency. These results demonstrate that the GFP-InhA as well as
the GFP-KasB fusion may be active in vivo while forming foci.
Localization of the Mycolic acid export machinery
Recently, the potential membrane protein MmpL3 has been
identified in Mtb as an MA transporter [19,45]. It is involved in the
transport of TMM to the external mycomembrane. Because of the
localization of major components of FAS-II observed herein, we
hypothesized that MA may be synthesized at these loci to be
subsequently transported at the actively growing envelope regions.
GFP was therefore merged to the MmpL3 C-terminal given that
this domain was predicted to be intra-cytoplasmic (Toppred2,
[46], http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html).
MmpL3, a RND family protein [47], was predicted to be
organized in twelve transmembrane helices. The localization of
this fusion was analyzed as above. Upon performing time-lapse
experiments with MmpL3-GFP alone (Movie S11), or in the
presence of mCherry-Wag31 (Figure 7, extracted from Movie
S12), a very clear envelope staining was observed together with
preferential labeling of one pole and a very bright and flashing
labeling of the septum, likely due to the presence of the double
membrane at this position. The first conclusion was that MmpL3
might indeed be in the membrane or at least, in the envelope. Its
C-terminal domain, fused with the GFP, could be intracytoplasmic because GFP is not fluorescent when it is located in
another compartment [48]. As a localization control, a GFP fusion
of the first ten transmembrane helices of MmpL3 (MmpL3-N10)
was constructed and its localization analyzed in vivo as described
above. Upon performing time-lapse experiments with MmpL3N10-GFP in the presence of mCherry-Wag31 (Figure 8, extracted
from Movie S13), the preferential MmpL3 polar localization was
not observed. MmpL3-N10, which remained in the membrane, or
at least in the envelope, was no more accumulated at the pole. The
polar accumulation (P) of MmpL3 was quantified as described in
Materials and Methods and compared to that of MmpL3-N10
(Figure 8B). MmpL3-N10 localization was not polar (P = 1.16 6
0.15 N = 113) whereas MmpL3 was enriched by more than 5 fold
at the pole (P = 5.3560.38 N = 192).
The aspect of the images of the polar localization of MmpL3
differed significantly from that observed with the FAS-II
components. The former was ‘‘crescent-shaped’’, suggesting a
membrane localization of MmpL3. MmpL3 was located in the
envelope, probably in the cytoplasmic membrane, and was
preferentially located at the growing bacterial tips containing the
larger amounts of Wag31. In addition, MmpL3 was visible very
early in the septa, likely before the appearance of Wag31 and
PLOS ONE | www.plosone.org
Figure 7. Dynamic localization of MmpL3. Images were extracted
from the movie presented as movie S12. The time interval after the
starting point of the movie is indicated in hours (h). Images were
extracted from three channels (bright field, BF, left column; GFP, middle
column; GFP and mCherry, GFP-Che, right column). The dynamics of the
localization of the GFP fusions was followed in Msm::mCherry-wag31
bacteria expressing the MmpL3-GFP fusions. The presence of MmpL3 in
septa is indicated by white arrows in the right column. The ‘‘croissant’’shaped accumulation of MmpL3 at the poles is indicated by white
arrows in the middle column. The position of mCherry-Wag31 at the
poles and septa is clearly visible. Magnification: 630 X. Scale bar: 5 mm).
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g007
membrane curvature. This polar localization of the MA
transporter appeared to be due to a MmpL3 domain located
between the end of helix 10 and the C-terminal end of the protein.
Discussion
The main objective of the present study was to determine
whether the biogenesis of mycolic acids is coordinated or not with
bacterial envelope elongation. Through the use of a mycobacterial
model of Mtb, M. smegmatis, we were able to localize MA
biosynthesis FAS-II proteins in vivo and compare their localization
dynamics to that of the polar protein Wag31. Wag31 is a main
component of mycobacterial elongation and division [29,37] and
has been found to be associated with the curved membranes of old
poles as well as of the division septum [49]. Herein; proteins of the
8
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
microscopy images (as in Figureô 7 and Figureô 8A) by scanning
individual bacteria at the level of the membrane, the cytoplasm, and
the poles as described in the Materials and Methods. The y-axis
represents the polar accumulation (P) of either the complete (Wt) or the
N-terminal portion (N10) of the MmpL3 transporter. A statistical t-test
was performed to determine the difference between the polar
accumulation of MmpL3-GFP (black bar, P = 5.35360.3810 N = 192)
and the absence of polar accumulation of MmpL3-N10-GFP (white bar,
P = 1.16060.1572 N = 113), with N indicating the number of bacteria
analyzed. The unpaired t-test p value is symbolized by asterisks (***, p,
0.0001).
doi:10.1371/journal.pone.0097148.g008
FAS-II complex core [16,17,18] were observed to form foci
associated with both the old poles and septal poles. While the FASII condensing enzymes were mainly diffuse, they were also able to
form foci at the same locations. In dynamic studies, newlysynthesized ectopic FAS-II proteins were first located at the septal
region suggesting that they may participate very early in pole
construction. Thereafter, they were established rapidly at the old
poles together with polar Wag31 foci [29]. Such polar localization
of FAS-II proteins as well as their dynamic localization to the old
poles along with Wag31 suggest the existence of a spatiotemporal
coordination between MA biosynthesis and Wag31-controlled
polar PG synthesis.
A key question was to determine whether foci, which were
observed herein in bacteria expressing ectopic GFP fusions,
correspond to actual complexes or to protein aggregates or
inclusion bodies (IB). In rod-shaped bacterium E.coli, which does
not display the same polar cell-wall elongation process as
mycobacteria, the poles are not the active sites for PG synthesis
[22]. In E.coli, the poles and the regions between the chromosomes
are the areas where protein aggregates accumulate [50]. Furthermore, these foci do not separate after division and are
preferentially accumulated in the mother cell during cellular aging
[51]. In contrast, in mycobacteria, poles are very active loci where
lateral PG synthesis [22] and most likely free MA synthesis [52],
occur during bacterial elongation. In addition, poles are also
involved in protein export [53], DNA transfer [32], chromosomal
partitioning and DNA replication [54,55] as well as phosphorylation by Ser/Thr protein kinases [56]. Mycobacterial poles are
thus certainly not suitable for detrimental protein accumulation. A
second argument against polar IB formation is the fact that
asymmetric FAS-II polar localization was observed in the present
model. Actinobacteria exhibit apical (polar) growth [24] and the
distribution of polar proteins involved in PG biosynthesis is
asymmetric with a preference for old poles [29]. Even though old
pole-containing mycobacteria do not grow faster [57], polar
growth itself appears to be asymmetric with the old pole being
more active than the new pole [31]. Indeed, we observed herein a
localization preference of FAS-II proteins to the old pole
containing Wag31 whereas GFP alone seemed excluded from
these poles. The foci clouds of FAS-II and Wag31 were located at
the same position in the bacteria, at the very end of the organism.
As commonly observed in E.coli, inclusion bodies are otherwise
more likely to be found further inside the bacterial tips. Finally,
three additional observations in the present study advocate against
IB formation. First, there was no quantitative correlation between
foci formation and GFP-fusion expression levels. Secondly, two of
the four fusion proteins tested (KasB and InhA) were active in vivo
while forming foci. Thirdly, during the division process, we
observed foci splitting which can be compared to the active
polarisome splitting in Streptomyces [58]. These finding strongly
suggest that the FAS-II foci revealed the presence of FAS-II
complexes mainly at the old poles and septal poles.
Figure 8. Dynamic localization of MmpL3-N10. (A) Images were
extracted from the movie presented as movie S13. The time interval
after the starting point of the movie is indicated in hours (h). Images
were extracted from three channels (bright field, BF, left column; GFP
and mCherry, GFP-Che, middle column; GFP, right column). The
dynamics of the localization of the GFP fusions was followed in
Msm::mCherry-wag31 bacteria expressing the MmpL3-N10-GFP fusions.
The presence of MmpL3-N10 in septa is indicated by white arrows in
the right column. The position of mCherry-Wag31 at the poles and
septa is clearly visible. Magnification: 630 X. Scale bar: 5 mm. (B) Bar
graph representation of the localization of MmpL3 and MmpL3-N10 in
Msm strains expressing each GFP fusion after 6 hours of induction. Data
are represented as mean 6 SEM. Data were collected from wide-field
PLOS ONE | www.plosone.org
9
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
In conclusion, the polar localization of external membrane lipid
biosynthesis enzymes observed in the present study constitutes a
novel observation in bacteria and a fortiori in mycobacteria.
Moreover, the observation of the dynamic localization of the MA
transporter MmpL3 strongly reinforces the possibility of a
positioning of MA biosynthesis in these regions. In keeping with
the existing literature, the present data further suggest the
existence of the polar localization of complete MAPc synthesis
and its coordination with bacterial cell elongation. Peptidoglycan
is already known to be synthesized at these positions [70] as is
likely arabinan [52]. Moreover, mycolic acids are linked to
arabinogalactan at these positions [68,69]. Present findings also
show that FAS-II proteins, MmpL3 and Wag31 are present in the
same region, at the same time in the bacteria; furthermore, it has
recently been demonstrated that INH can affect the coupling of
division and elongation [57]. Altogether, all the above data further
place the pieces of the puzzle together and support the proposed
model of localized envelope biogenesis machinery coordinated
with the process of cell elongation and division. This coordinated
process may ultimately represent the Achilles’ heel of the
pathogenic bacterium Mycobacterium tuberculosis.
Mycolic acids are believed to be synthesized in the cytoplasm
and transported to the periplasm as TMM by the trans-membrane
RND-family transporter MmpL3 [19]. As expected, in view of its
secondary structure and function, MmpL3 was observed at the
level of the mycobacterial envelope. It is likely inserted in the
plasma membrane similarly to that proposed in the original
MmpL3 study [19]. Moreover, RND family proteins such as gram
negative efflux pumps for example are inserted in the inner
membrane and driven by the proton motive force [59] solely
present at this level of the envelope. In addition, the MmpL3 Cterminal GFP fusion used herein was fluorescent, indicating that
the C-terminus domain of MmpL3 is probably located in the
cytoplasm. GFP functions as an efficient reporter for analysis of
protein topology since it is fluorescent when located in the
cytoplasm and non-fluorescent when transported outside the
plasma membrane [48]. MmpL3-GFP was clearly more abundant
in the membrane of Wag31-containing old poles while displaying a
crescent-shaped fluorescence. This typical shape is similar to that
observed for DivIVA, an ortholog of Wag31 in B.subtilis [28].
Moreover, this shape was very different from the shape of the
GFP-FAS-II foci, suggesting that FAS-II was not inserted in the
membrane as in the case for MmpL3 or occupying the inside of
the membrane as in the case of Wag31. Finally, the most
impressive images were obtained when the bacteria formed a
septum: MmpL3 yielded a very intense labeling at the position of
the septum probably due to its insertion into the double membrane
of the septum. This MmpL3 localization pattern strongly
resembled that reported for membrane Ser/Thr protein kinase
PknB [56]. Indeed, Wag31 has been shown to be regulated by
PknA and PknB [29]. PknA and B have been involved in the
inhibition of many MA biosynthesis proteins such as KasA [60],
mtFabH [61], MabA [62], InhA [63,64] and the methyltransferase
PcaA [65]. This suggests the existence of a common regulatory
network between FAS-II, Wag31 and the cell wall elongation
process. From the present data and in view of the literature, we
can propose that mycolic acids are probably primarily exported at
the poles and septa in proximity to Wag31 and FAS-II foci and at
the locus of PG biosynthesis. The disappearance of the polar
accumulation of MmpL3 upon deletion of its C-terminal end
suggests that this region is probably involved in its localization. It
also suggests that MmpL3 may be localized through a diffusioncapture mechanism using its C-terminal end as signal [66].
A puzzling question was to ascertain whether the polar
localizations of FAS-II and MmpL3 reflect MA biosynthesis and
export localization. Some reports can indeed be interpreted in this
manner when compared with our results. Mtb polar lysis has been
observed in very early EM images of isoniazid-treated wild-type
bacilli [67]. Isoniazid targets InhA and if we assume that synthesis
and export of mycolic acids are primarily polar, InhA inhibition
will leave ‘‘holes’’ in the polar mycomembrane and ultimatly
induce specific unipolar lysis as previously reported [67]. More
recently, polar lysis was also observed when arabinan synthesis was
inhibited with benzothiazinone [31,52]. Finally, a link with MA
synthesis was also attributed following MmpL3 localization.
Because MmpL3 is accumulated at the pole, MA export (and
probably MA synthesis) can be polar. By using unnatural trehalose
analogs, two separate reports have shown that Ag85 activity, the
mycoloyl-transferase that links mycolic acids to arabinogalactan, is
concentrated in the envelope and at the poles of mycobacteria
with a pattern strongly resembling that of MmpL3 herein [68,69].
The linking of mycolic acids to the cell wall may occur mainly at
these positions. As suggested by the present results, the C-terminal
domain of MmpL3 may be involved in this localization.
PLOS ONE | www.plosone.org
Materials and Methods
Strains and culture conditions
Plasmid constructions were performed in the Escherichia coli K12
derivative Top10-F’ (Invitrogen) using classical cloning procedures
according to enzyme and product manufacturers’ recommendations (NEBiolabs; Fermentas; Promega,). Culture media (LuriaBertani (LB) broth, or LB-Agar) were supplemented when needed
with either kanamycin (50 mg/mL), hygromycin-B (200 mg/mL),
or chloramphenicol (12.5 mg/mL). Mycobacterium smegmatis mc2155
(ATCC 700084) was cultured in Middlebrook based media
(Difco). Liquid cultures were grown in Middlebrook 7H9 (0.05%
Tween 80, 10% ADC (BBL)) whereas bacteria were plated on
Middlebrook 7H10 agar (10% OADC (BBL)). Msm inhAts (mc2
2359; [44]) is a derivative of Msm mc2155 bearing a punctual
mutation in the inhA gene rendering both the protein and the
strain thermosensitive. When needed, media were supplemented
with either kanamycin (50 mg/mL), hygromycin-B (150 mg/mL)
or zeocin (10 mg/ml).
Plasmid constructions
The four Mtb FAS-II genes (inhA, rv1484; mabA, rv1483; kasA,
rv2245; kasB, rv2246) were isolated from the previously described
pGAD-T7::fas-II and pGBK-T7::fas-II derivatives [17] as either
Nde1-BamH1 (kasA and mabA), Nde1-EcoR1 (inhA), or Nde1-Msc1
fragments (kasB). They were cloned under the control of the
acetamidase promoter (PamiE) at the corresponding sites of the
inducible vector pLAM12 [71] to produce the pLAM12::fas-II
derivatives (Table S1). For the construction of the fluorescence
control vectors, the egfp and the mCherry genes were amplified
respectively from pEGFPN1 (Clontech) and from pmCherry-N1
(Clontech) using specific pairs of primers creating a Nde1 site at the
ATG position of each gene and a second site (egfp, HindIII; mcherry,
BamH1) at the end of each gene (Table S2). These genes were then
cloned at the same sites in pLAM12 to yield pLAM12::gfp and
pLAM12::mCherry (Table S1). For construction of N-terminal GFP
fusions with the FAS-II proteins, the egfp gene was amplified from
the pEGFPN1 vector using a second set of primers creating inphase Nde1 sites both at the ATG and STOP positions (Table S2).
The egfp gene was inserted at the Nde1 sites of each of the four
FAS-II genes in the pLAM12 derivatives. For construction of the
Wag31 fusion, the wag31 gene (rv2145c) was amplified by PCR
10
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
from Mtb H37Rv genomic DNA using specific primers (Table S2)
creating a Nde1 site at the ATG position and cloned as an Nde1BamH1 fragment under the control of the pHSP60 promoter of
the replicative vector pMV261-Nde [17], a derivative of pMV261
[72]. Using the same strategy as above, the mCherry gene was
cloned, as an intermediate, at the Nde1 site of pMV261::wag31 to
yield a N-terminal fusion with Wag31. The fusion was further
transported at an equivalent position of the integrative vector
pMV361 [72]. The same wag31 Nde1-BamH1 DNA fragment was
also cloned at the equivalent positions of the Matchmaker III yeast
two-hybrid cloning vectors pGAD-T7 and pGBK-T7 (Clontech)
to produce pGAD-T7::wag31 and pGBK-T7::wag31. In the same
manner, the Mtb nat gene (rv3566) was cloned in the Matchmaker
III vectors as Nde1-BamH1 fragments. Finally, the mmpL3 gene
(rv0206c) and its N-terminal end containing only the first ten transmembrane helices (Mp3-N10) were cloned at the Nde1 site of
pLAM12::gfp to construct the C-terminal MmpL3-GFP and
MmpL3-N10-GFP fusion plasmids pLAM12::mmpL3::gfp and
pLAM12::mp3-N10::gfp. All constructs were verified by restriction
analysis and sequencing (Millegen).
Construction of the Mycobacterium smegmatis kasB
knockout strain
The Msm kasB gene (MSMEG_4328) was disrupted by using the
‘‘recombineering method’’ developed by van Kessel and Hatfull
[71]. The linear allelic exchange substrate (AES; Figure S5) was
constructed using a three fragments fusion-PCR [73] with the
indicated primers (Table S2). The AES was constituted, from 59 to
39, by the fusion of the 800 bps of DNA upstream from the
initiator codon of kasB, followed by the Zeocin (InvivoGen)
resistance gene (Sh ble,) from the pZeo vector [74] and ended by
the 800 bps of DNA downstream from the stop codon of kasB. The
substrate was subsequently introduced by electro-transformation
into a recipient Msm strain already containing a hygromycinresistant derivative of the recombineering plasmid pJV53 encoding
for phage recombinases [71]. The construction and the selection of
the mutant were essentially performed as previously described
[71]. The chromosomal structure of the mutant (Figure S5) was
verified by PCR with suitable primers (Table S2 and Figure. S5).
After curing of the recombineering plasmid, the mutant strain was
transformed by appropriate plasmid to produce the control strain
(Msm-DkasB/pLAM12) and the complemented strains (MsmDkasB/pLAM12::kasB and Msm DkasB/pLAM12::gfp-kasB)).
Analysis of GFP-fusion expression in vivo
Msm liquid cultures were induced with 0.2% acetamide in early
log phase (OD590nm = 0.5) and samples were collected every two
hours. Fluorescence at 525 nm (excitation at 485 nm) and
OD590nm were measured in micro-titration plates (Optiplate-96
well) with a FLx800 fluorescence reader (Biotek Instruments).
Acquisition of fluorescence in the sample (F(s)) was performed in
triplicate on serial dilutions of each culture. The data, expressed in
relative fluorescence units (RLU), were corrected for the variation
in fluorescence of the medium (F(m)) and the background
fluorescence of the Msm/pLAM12 control strain (F(c)). Fluorescence (F) was also reported to the OD of the sample (OD(s)) and of
the control strain (OD(c)) using the following formula: F = [(F(s) –
F(m))/OD(s))]/[(F(c) – F(m))/(OD(c)]. The means 6 SD (standard
deviation) of the data were plotted against the time of induction
using Graphpad Prism 5 software (GraphPad Software Inc.). The
same culture samples were analyzed by Western blotting during
the course of induction. Aliquots of known and equivalent OD
were lysed, fractionated on 10% SDS-PAGE and appropriate
amounts of total protein were blotted using mouse monoclonal
anti-GFP (Roche Applied science ref: 11814460001) as primary
antibodies. The blots were revealed by bioluminescence (ECL
detection Kit, Millipore) and visualized by fluoroimaging.
Mycolic acid analysis
MA was performed essentially as described [75]. Bacterial
residues obtained after lipid extraction with organic solvents were
saponified at 110uC for 3 h in a mixture of KOH (40%) and
methoxyethanol (C3H8O2) (1:7, v/v). After acidification, fatty
acids were extracted with diethyl ether and methylated with an
ethereal solution of diazomethane. The mycolate patterns of the
strains were determined by analytical high performance thin-layer
chromatography (HPTLC) on Silica gel 60 (Merck) using
dichloromethane 100% as eluent and revealed with rhodamine
B (Sigma). The different classes of mycolates were separated by
preparative TLC (Macherey-Nagel Silica Gel 60), using the same
eluent. The lengths of the various types of purified mycolates were
determined by MALDI-TOF mass spectrometry as previously
described. MALDI mass spectra were acquired in reflectron mode
using an Applied Biosystems 4700 Analyzer equipped with a
Nd:YAG laser (355 nm wavelength, ,500-ps pulse and 200Hz
repetition rate). The shots (2500 total) were accumulated in
positive ion mode and MS data were acquired using the
instrument default calibration. Mycolate samples were dissolved
in chloroform at a concentration of 1 mM, and were directly
spotted onto the target plate as 0.5 ml droplets, followed by the
addition of 0.5 ml matrix solution. Samples were allowed to
crystallize at room temperature. The matrix used was 2,5dihydroxybenzoic acid (10 mg ml21) in CHCl3/CH3OH (1 : 1).
In vitro Co-immunoprecipitation (Co-IP)
In vitro transcription/translation of the genes of interest with the
TnT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) was performed as described previously [18] using supercoiled DNA from pGAD-T7 or pGBK-T7 derivatives expressing
either the FAS-II genes [16,17] or the wag31 and nat genes as
substrates (Table S1). This system allowed generating L-[35S]methionine-labeled proteins tagged with either the HA (hemagglutinin) epitope (pGAD-T7 derivatives) or the c-Myc epitope
(pGBK-T7). The products were named h-proteins (HA-tagged) or
c-proteins (c-Myc-tagged). For Co-IP experiments, the h-proteins
and the c-proteins were mixed together with goat anti-mouse IgG
magnetic beads (Dynabeads M-450) coated with monoclonal antiHA antibodies (Sigma). Proteins ratios were adjusted to 1:1 as
described by assessing their specific activities (phosphorimaging)
and correcting for their differences in the number of methionine
residues. The co-IP reactions were performed as previously
described [18] and analyses performed by separation on SDSPAGE (4-20%) and phosphorimaging.
PLOS ONE | www.plosone.org
Microscopy and video-microscopy
Msm liquid cultures expressing either the GFP protein fusions
alone, or the GFP fusions together with the mCherry-Wag31
fusion were induced in log phase (OD590nm 0.5) with 0.2%
acetamide during 6 hours. Bacteria were pelleted, concentrated
(20X) in PBS, and spread (10 mL) on poly-L-lysine coated glass
slides (PolyScience). Slides were mounted with Dako mounting
medium and observed with a large field Leica DMIRB fluorescence microscope at 63X magnification (Leica HCX Plan Apo
x63/1.40-Oil). GFP (488 nm/509 nm) was revealed with a GFPET filter cube (excitation: BP 470/40; dichroic mirror, 495;
emission: LP 525/50) whereas mCherry fluorescence (587 nm/
610 nm) was visualized with a N2.1 Leica filter cube (excitation:
BP 515–560; dichroic mirror, 580; emission LP 590). Images were
11
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
captured with a CoolSnap HQ2 CCD camera (1 pixel = 6.45 mM),
acquired with MetaMorph 7.1.7 software and processed with
ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). All
different images were acquired with the same exposure time
(200 ms). Image processing consisted in equivalent adjustments of
brightness and contrast on complete images. Gamma and LUT
(Look Up Table) values were not modified and were left as linear
on each channel. For statistical analysis and quantification of the
polar indices, multiple slides (n) of independent experiments were
used. An average of 1500 bacteria (N; see text) were counted from
a minimum of three different slides and a maximum of 16 slides
(3,n,16). Student t-tests were performed on raw data using the
GraphPad Prism 5.0 software. Polar indices were expressed as
percentages of polar foci in the fluorescent population and
presented as mean with standard deviation (SD). For precise
analysis of colocalization, each channel (GFP and mCherry) on
microscopy images from individual bacteria producing both types
of fusion (greater than 100) were scanned using the ROI manager
of ImageJ software (NIH-USA). Thereafter, the GFP and the
mCherry fluorescence profiles of each bacterium were obtained
with the Plot Profile plugin. The maximum fluorescence levels of
each scan of a given strain were normalized to the highest
fluorescence value in this strain and plotted against their position
along the long axis of the bacterium. The total length of each
bacterium was reported to 1.
In order to quantify the polar localization of MmpL3, images
from wide field fluorescence microscopy of Msm expressing either
MmpL3-GFP or MmpL3-N10-GFP were analyzed with ImageJ
software (NIH-USA) using the Plot Profile function. On each
individual bacterium, three plots along 0.7 mm width lines were
obtained: the first inside the cytoplasm (Background Fluorescence,
FBG), the second along the long axis of the bacterium and passing
through one pole (Polar Fluorescence, FPO), and the third along
the short axis of the bacterium and crossing the membranes
(Membrane fluorescence, FMB). On each bacterium, the maximum fluorescence (FMax) of each plot was collected. The analysis
was performed on more than 100 individual bacteria. The polar
localization fold ratio was calculated with the formula, [|FPOMaxFBGMax|]/[|FMBMax-FBGMax|], yielding a value of 1 when
there was no polar localization and a value superior to 1 when the
fluorescent protein was accumulated at the membrane pole.
Polarization was expressed as mean 6 SEM (Standard Error to
the Mean), with N represent here the number of bacteria
analyzed.
Time-lapse video microscopy was performed using an agar pad
method essentially as previously described [34]. The bacteria were
grown to mid-log phase, and aliquots (400 mL) were applied onto
the coverslip of 35 mm glass bottom dishes (MatTek). After
5 minutes, the liquid was removed by aspiration and the bacteria
were covered by 7H9 medium (10% ADC) at 37uC containing
0.6% Noble agar (Sigma), along with the appropriate antibiotics
and the inducer (acetamide, 0.02%). After 1 hour solidification,
the plates were pre-incubated for three hours at 37uC. The
fluorescence was detectable in control GFP-producing bacteria.
This time was chosen as the starting point (t = 0) for all time lapse
experiments. Thereafter, the plates were observed as above using
the Leica DMIRB florescence microscope equipped with a 37uC
humid chamber. GFP and mCherry fluorescence was visualized
with a GFP/mCherry-ET filter cube (Chroma Technology;
excitation, no selection; dichroic filter, SP490-BP570/40; emission
BP522/44-BP633/54). Individual frames (100 ms exposure) were
acquired at regular time intervals (from 10 min to 2 hours) with
MetaMorph 7.1.7 software during 14 to 20 hours. The representative movies were generated using ImageJ software. The required
PLOS ONE | www.plosone.org
channels were extracted from the time-lapse image stacks and
combined as described in the supplemental movie legends, after
which they were converted to AVI (Audio Video Interleave)
format at 0.5 to 1.5 frames per second using JPEG compression.
Minimal image processing was performed as described above for
static images.
Supporting Information
Figure S1 The mycolic acid biosynthesis pathway. The
substrates and products of the Fatty Acid Synthase of type I (FASI) and II (FAS-II) are indicated together with the biochemical
reactions (black arrows) necessary to achieve the biosynthesis of
mature mycolic acid (see [8] and [9] for review). The enzymes
responsible for each reaction are identified in colored circles. The
cofactors necessary for reduction reactions to occur (NADPH,
NADH) were omitted for reasons of clarity. The proximal and
distal positions of the meromycolic chain modifications by MAMtfs are indicated as P and D respectively. Intermediate reactions
not detailed (acyl-chains activation) are symbolized by interrupted
arrows. The synthesis of the meromycolic chain is initiated by the
condensation by the mtFabH protein of the acyl-CoA products of
FAS-I with malonyl-ACP by MtFabD to give a keto-acyl-ACP.
After reduction by the keto-acyl-ACP reductase MabA, followed
by dehydration by the hydroxyl-acyl-dehydratases HadAB or
HadBC and reduction by the enoyl-ACP reductase InhA, the acylchain enters into a new cycle of elongation through condensation
by the keto synthase KasA or KasB with a new malonyl-ACP unit.
After its synthesis, the meromycolic chain is adenylated and ligated
by FadD32 onto Pks13, which is the terminal condensing enzyme
that links the meromycolic chain to a carboxylated alpha chain
produced by FAS-I. The remaining keto function of the generated
mycolic motif is then reduced by CmrA to yield the mycolic acid.
(TIF)
The Mycolic Acid Biosynthesis Interactome.
The Mycolic Acid Biosynthesis Interactome (M.A.B.I.) is composed of three types of complexes: (i) the ‘initiation FAS-II’ (I-FASII) contains mtFabH interacting with a core (MabA, InhA and
mtFabD) and represents the link between FAS-I and FAS-II; (ii)
two ‘elongation FAS-II’ (E-FAS-II) complexes comprise the core
interacting preferentially with either KasA and HadAB (E1-FASII) or KasB and HadBC (E2-FAS-II); these two complexes are
thought to be capable of elongating acyl-AcpM to produce fulllength meromycoloyl-AcpM, (iii) the ‘termination FAS-II’ (T-FASII) involves Pks13 interacting with KasB and is thought to
condense the a-branch with the meromycolic branch. Our
working hypothesis is that the formation of each complex type
may be successive and that the acyl-ACP substrates may be
channeled from one type of complex to another as a function of its
elongation status. The FAS-II initiation complex (I-FAS-II), the
elongation complexes 1 and 2 (E1-FAS-II and E2-FAS-II) and the
termination complex (T-FAS-II) are represented in grey. The
condensing enzymes KasA, KasB and MtFabH (FabH) are in
orange. The interactions between the HadAB (AB) and HadBC
(BC) dehydrase heterodimers (in green) with the MA-Mtf (in violet)
are symbolized by curved arrows. The core (in yellow) symbolizes
the reductases MabA and InhA together with the malonylCoA
ACP transacylase MtFabD. The terminal condensing enzyme
Pks13 is depicted in blue. The direction of trafficking of the
elongating substrate is symbolized by arrows emanating from acylCoA (from FAS-I) toward the mature mycolic acid. Interrupted
arrows symbolize omitted steps of substrate modifications.
(TIF)
Figure S2
12
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
Table S1 Description of plasmids.
Figure
S3 Localization
of
mCherry-Wag31
in
Msm::mcherry-wag31. Enlarged images of wide-field microscopy experiments on mCherry-Wag31 fusion-expressing bacteria
as presented in Figure 2 and Figure 4. Brightfield images (BF;
leftmost column) together with mCherry fluorescence images
(Che, middle column) of Msm mc2 155::pMV361::mCherry (Ø) and
Msm mc2155::pMV361::mCherry-wag31 (Wag31) were acquired
6 hours after dilution of the main culture and in the presence of
anhydro-tetracyclin (50 ng/mL) for the latter. The merged images
(right columns) allowed visualizing the localization of Che-Wag31
mainly at one pole of the bacteria (the old pole). Total optical
magnification: 630 X. Scale bar: 5 mm.
(TIF)
(DOCX)
Table S2 Oligonucleotide sequences of PCR primers.
(DOCX)
Movie S1 Localization of GFP. Growth of Msm derivatives
expressing GFP alone under the control of the pamiE promoter was
followed by fluorescence time lapse video-microscopy. The movie
(left panel) obtained by merging the bright field channel (in red)
with the GFP channel (in green) is presented with the movie (right
panel) displaying only the GFP channel. AVI file (0.8 frames per
second) was obtained as described in Materials and Methods at 0.8
frames per second with one frame per hour. Time intervals are
indicated in hours (h). Scale bar: 5 mm.
(AVI)
Analysis of FAS-II/Wag31 interactions by coimmunoprecipitation. L-[35S]-methionine-labeled h-proteins
(HA tagged; h-protein) and c-proteins (c-Myc tagged; c-protein)
from in vitro transcription translation reactions as well as the Co-IP
reaction products were fractionated by SDS-PAGE (4–20%)
followed by phosphorimaging analysis. The gels containing the
h-Wag31 protein alone or the c-Wag31 alone are represented in
the leftmost lanes. The names of the c-proteins or h-proteins used
in the Co-IP experiments are indicated above each panel. These
proteins were run alone (-), or after Co-IP (IP). (A) c-Wag31 was
tested against h-FAS-II. (B) h-Wag31 was tested against c-FAS-II
proteins; IPØ refers to a Co-IP performed between a given cprotein and a void extract (obtained with the pGAD-T7 empty
vector). (C) h-Wag31 was tested against human laminC (c-Lam)
with Mtb Arylamine N-acetyltransferase (c-Nat) used as negative
control. The black arrowheads represent a Co-IP band while the
open arrowheads indicate the position of a missing Co-IP band
corresponding to a negative interaction. When the sizes of both
proteins were too close to each other, non-labeled h-proteins were
used for Co-IP experiments as indicated with an asterisk.
(TIF)
Figure S4
Movie S2 Localization of GFP-MabA. Growth of Msm
derivatives expressing the GFP-MabA fusion under the control of
the pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S1
(AVI)
Movie S3 Localization of GFP-InhA. Growth of Msm
derivatives expressing the GFP-InhA fusion under the control of
the pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S1
(AVI)
Movie S4 Localization of GFP-KasA. Growth of Msm
derivatives expressing the GFP-KasA fusion under the control of
the pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S1
except that the AVI file was obtained at 1.5 frames per second
with one frame obtained every 15 min.
(AVI)
Movie S5 Localization of GFP-KasB. Growth of Msm
derivatives expressing GFP-KasB alone under the control of the
pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S1
(AVI)
and characterization of
M.smegmatis DkasB. (A) The wild type region (WT) of the
Msm chromosome comprising kasA (open arrow), kasB (grey arrow)
and accD6 (open arrow) is depicted as a solid line together with the
positions for hybridization of PCR primers (Wt-Fwd and Wt-Rev).
The AES product synthesized by fusion-PCR is also presented
with the primers used for its synthesis. The Zeocin resistance gene
(Sh ble; ble) is represented as a black arrow. The structure of the
chromosomal region after the allelic exchange is illustrated
together with the positions of PCR primers used for its
characterization. The lengths of each PCR product are indicated
in base pairs (bps) and represented by dashed lines. (B) Ethydium
bromide staining of an agarose gel of PCR products of wild-type
(Wt) and DkasB (D) Msm genomic DNA. The primer pairs used for
amplification are indicated above the gel. The migration positions
of control linear DNA are indicated along with their respective
sizes (in kbp).
(TIF)
Figure
S5 Construction
Movie S6 Localization of mCherry-Wag31 and GFP.
Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives expressing
GFP alone under the control of the pamiE promoter was followed
by fluorescence time lapse video-microscopy. The movie (left
panel) obtained by merging together the bright field channel (in
blue), the GFP channel (in green) and the mCherry channel (in
red) is presented with the movie displaying only the merged GFP
and the mCherry channels (right panel). The AVI file was
obtained as described in Materials and Methods at 0.5 frames per
second. With one frame obtained every hour. The time intervals
are indicated in hours (h). Scale bar: 5 mm.
(AVI)
Movie S7 Localization of mCherry-Wag31 and GFP-
MabA. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives
expressing the GFP-MabA fusion under the control of the pamiE
promoter was followed by fluorescence time lapse video-microscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S6 except that
the AVI file was obtained at 1.5 frames per second with one frame
obtained every 10 min.
(AVI)
Figure S6 MALDI-TOF analysis of a’- and epoxy-
mycolic acid methyl esters. Mass spectra of a’-mycolic acid
(left column) and epoxy-mycolic acid methyl esters (right column)
extracted from wild type (Msm mc2155, WT), mutant (Msm
mc2155 DkasB, DB) and complemented (Msm mc2155 DkasB/kasB,
DB/B; Msm mc2155 DkasB/gfp-kasB, DB/gB) strains. The accurate
masses (m/z), together with the length of the even carbonnumbered epoxy-mycolates and the odd carbon-numbered a’mycolates are indicated.
(TIF)
PLOS ONE | www.plosone.org
Movie S8 Localization of mCherry-Wag31 and GFP-
InhA. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives
expressing the GFP-InhA fusion under the control of the pamiE
promoter was followed by fluorescence time lapse video-micros13
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
copy. Movie treatment is identical to that of Movie S6 except that
the AVI file was obtained at 1.5 frames per second with one frame
obtained every 15 min.
(AVI)
pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S6.
(AVI)
Movie S13 Localization of mCherry-Wag31 and
MmpL3-N10-GFP. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31
derivatives expressing the GFP fusion of the membrane domain of
MmpL3 (Mp3-N10-GFP) under the control of the pamiE promoter
was followed by fluorescence time lapse video-microscopy. Movie
treatment is identical to that of Movie S6.
(AVI)
Localization of mCherry-Wag31 and GFPKasA. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives
expressing the GFP-KasA fusion under the control of the pamiE
promoter was followed by fluorescence time lapse video-microscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S6 except that
the AVI file was obtained at 1.5 frames per second with one frame
obtained every 15 min.
(AVI)
Movie S9
Acknowledgments
Localization of mCherry-Wag31 and GFPKasB. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives
expressing the GFP-KasB fusion under the control of the pamiE
promoter was followed by fluorescence time lapse video-microscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S6.
(AVI)
Movie S10
We thank John McKinney and Neeraj Dhar (EPFL; Lausanne,
Switzerland), Jean-Yves Bouet and Jerôme Rech (LMGM-CNRS;
Toulouse, France), and Serges Mazères (TRI platform; IPBS-CNRSUPS; Toulouse, France) for very initial help on time lapse microscopy
experiments setup. We are particularly grateful to Lucie Spina for technical
assistance on HPTLC mycolic acid analysis. We thank JC van Kessel and
G Hatfull for providing the pLAM12 plasmid from the recombineering
system [71] and W. Jacobs for providing the Msm inhAts mutant strain [44].
Thank to Mr. Pierre Pothier for the editing of the manuscript.
Localization of MmpL3-GFP. Growth of Msm
derivative expressing the MmpL3-GFP fusion under the control of
the pamiE promoter was followed by fluorescence time lapse videomicroscopy. Movie treatment is identical to that of Movie S1
(AVI)
Movie S11
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: DZ CC. Performed the
experiments: CC KN SC MB CD FL DZ. Analyzed the data: DZ CC
MD. Wrote the paper: DZ.
Localization of mCherry-Wag31 and
MmpL3-GFP. Growth of Msm::pMV361 mCherry-Wag31 derivatives expressing the MmpL3-GFP fusion under the control of the
Movie
S12
References
1. Daffe M, Draper P (1998) The envelope layers of mycobacteria with reference to
their pathogenicity. Adv Microb Physiol 39: 131–203.
2. Minnikin DE, Kremer L, Dover LG, Besra GS (2002) The methyl-branched
fortifications of Mycobacterium tuberculosis. Chem Biol 9: 545–553.
3. Ernst JD (2012) The immunological life cycle of tuberculosis. Nat Rev Immunol
12: 581–591.
4. Hett EC, Rubin EJ (2008) Bacterial growth and cell division: a mycobacterial
perspective. Microbiol Mol Biol Rev 72: 126–156.
5. Letek M, Fiuza M, Villadangos A, Mateos L, Gil J (2012) Cytoskeletal proteins
of actinobacteria. International journal of cell biology 2012: 905832.
6. Boehringer D, Ban N, Leibundgut M (2013) 7.5 Å Cryo-EM Structure of the
Mycobacterial Fatty Acid Synthase. Journal of molecular biology 825: 841–849.
7. Gago G, Diacovich L, Arabolaza A, Tsai SC, Gramajo H (2011) Fatty acid
biosynthesis in actinomycetes. FEMS Microbiol Rev 35: 475–497.
8. Takayama K, Wang C, Besra GS (2005) Pathway to synthesis and processing of
mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev 18: 81–101.
9. Marrakchi H, Lanéelle M-A, Daffé M (2014) Mycolic acids: structures,
biosynthesis, and beyond. Chemistry & biology 21: 67–85.
10. Zuber B, Chami M, Houssin C, Dubochet J, Griffiths G, et al. (2008) Direct
visualization of the outer membrane of mycobacteria and corynebacteria in their
native state. J Bacteriol 190: 5672–5680.
11. Hoffmann C, Leis A, Niederweis M, Plitzko JM, Engelhardt H (2008) Disclosure
of the mycobacterial outer membrane: cryo-electron tomography and vitreous
sections reveal the lipid bilayer structure. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 3963–
3967.
12. Crick DC, Mahapatra S, Brennan PJ (2001) Biosynthesis of the arabinogalactanpeptidoglycan complex of Mycobacterium tuberculosis. Glycobiology 11: 107R–
118R.
13. Cole S, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, et al. (1998) Deciphering
the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence.
Nature 393: 537–544.
14. Kremer L, Baulard A, Besra GS (2000) Genetics of Mycolic Acid Biosynthesis.
In: Hatfull G, Jacobs WR, editors. Molecular Genetics of Mycobacteria.
Washington, D.C.: ASM Press.pp. 173–190.
15. Asselineau C, Asselineau J, Laneelle G, Laneelle MA (2002) The biosynthesis of
mycolic acids by Mycobacteria: current and alternative hypotheses. Prog Lipid
Res 41: 501–523.
16. Veyron-Churlet R, Bigot S, Guerrini O, Verdoux S, Malaga W, et al. (2005)
The biosynthesis of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis relies on
multiple specialized elongation complexes interconnected by specific proteinprotein interactions. J Mol Biol 353: 847–858.
17. Veyron-Churlet R, Guerrini O, Mourey L, Daffe M, Zerbib D (2004) Proteinprotein interactions within the Fatty Acid Synthase-II system of Mycobacterium
PLOS ONE | www.plosone.org
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
14
tuberculosis are essential for mycobacterial viability. Mol Microbiol 54: 1161–
1172.
Cantaloube S, Veyron-Churlet R, Haddache N, Daffe M, Zerbib D (2011) The
Mycobacterium Tuberculosis FAS-II Dehydratases and Methyltransferases
Define the Specificity of the Mycolic Acid Elongation Complexes. PLoS One
6: e29564.
Grzegorzewicz AE, Pham H, Gundi VA, Scherman MS, North EJ, et al. (2012)
Inhibition of mycolic acid transport across the Mycobacterium tuberculosis
plasma membrane. Nat Chem Biol 8: 334–341.
Zumla A, Hafner R, Lienhardt C, Hoelscher M, Nunn A (2012) Advancing the
development of tuberculosis therapy. Nat Rev Drug Discov 11: 171–172.
Varela C, Rittmann D, Singh A, Krumbach K, Bhatt K, et al. (2012) MmpL
genes are associated with mycolic acid metabolism in mycobacteria and
corynebacteria. Chemistry & biology 19: 498–506.
Daniel RA, Errington J (2003) Control of cell morphogenesis in bacteria: two
distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell 113: 767–776.
den Blaauwen T, de Pedro M, Nguyen-Distèche M, Ayala J (2008)
Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS microbiology reviews 32: 321–344.
Letek M, Fiuza M, Ordóñez E, Villadangos A, Ramos A, et al. (2008) Cell
growth and cell division in the rod-shaped actinomycete Corynebacterium
glutamicum. Antonie Van Leeuwenhoek 94: 99–109.
Edwards D, Thomaides H, Errington J (2000) Promiscuous targeting of Bacillus
subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and
fission yeast. The EMBO journal 19: 2719–2727.
Cha JH, Stewart GC (1997) The divIVA minicell locus of Bacillus subtilis.
J Bacteriol 179: 1671–1683.
Flärdh K (2003) Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in
Streptomyces coelicolor A3(2). Molecular microbiology 49: 1523–1536.
Lenarcic R, Halbedel S, Visser L, Shaw M, Wu L, et al. (2009) Localisation of
DivIVA by targeting to negatively curved membranes. The EMBO journal 28:
2272–2282.
Kang CM, Nyayapathy S, Lee JY, Suh JW, Husson RN (2008) Wag31, a
homologue of the cell division protein DivIVA, regulates growth, morphology
and polar cell wall synthesis in mycobacteria. Microbiology 154: 725–735.
Jani C, Eoh H, Lee JJ, Hamasha K, Sahana MB, et al. (2010) Regulation of
polar peptidoglycan biosynthesis by Wag31 phosphorylation in mycobacteria.
BMC Microbiol 10: 327.
Aldridge BB, Fernandez-Suarez M, Heller D, Ambravaneswaran V, Irimia D, et
al. (2012) Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth
and antibiotic susceptibility. Science 335: 100–104.
Wirth SE, Krywy JA, Aldridge BB, Fortune SM, Fernandez-Suarez M, et al.
(2012) Polar assembly and scaffolding proteins of the virulence-associated ESX-1
secretory apparatus in mycobacteria. Mol Microbiol 83: 654–664.
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
In Vivo Localization of Mycobacterial FAS-II Complexes
54. Maloney E, Madiraju M, Rajagopalan M (2009) Overproduction and
localization of Mycobacterium tuberculosis ParA and ParB proteins. Tuberculosis (Edinb) 89 Suppl 1: S65–69.
55. Maloney E, Madiraju SC, Rajagopalan M, Madiraju M (2011) Localization of
acidic phospholipid cardiolipin and DnaA in mycobacteria. Tuberculosis (Edinb)
91 Suppl 1: S150–155.
56. Mir M, Asong J, Li X, Cardot J, Boons GJ, et al. (2011) The extracytoplasmic
domain of the Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr kinase PknB binds specific
muropeptides and is required for PknB localization. PLoS Pathog 7: e1002182.
57. Wakamoto Y, Dhar N, Chait R, Schneider K, Signorino-Gelo F, et al. (2013)
Dynamic persistence of antibiotic-stressed mycobacteria. Science 339: 91–95.
58. Richards DM, Hempel AM, Flardh K, Buttner MJ, Howard M (2012)
Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput
Biol 8: e1002423.
59. Blair JM, Piddock LJ (2009) Structure, function and inhibition of RND efflux
pumps in Gram-negative bacteria: an update. Current opinion in microbiology
12: 512–519.
60. Molle V, Brown AK, Besra GS, Cozzone AJ, Kremer L (2006) The Condensing
Activities of the Mycobacterium tuberculosis Type II Fatty Acid Synthase Are
Differentially Regulated by Phosphorylation. J Biol Chem 281: 30094–30103.
61. Veyron-Churlet R, Molle V, Taylor RC, Brown AK, Besra GS, et al. (2009) The
Mycobacterium tuberculosis {beta}-Ketoacyl-Acyl Carrier Protein Synthase III
Activity Is Inhibited by Phosphorylation on a Single Threonine Residue. J Biol
Chem 284: 6414–6424.
62. Veyron-Churlet R, Zanella-Cleon I, Cohen-Gonsaud M, Molle V, Kremer L
(2010) Phosphorylation of the Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl
carrier protein reductase MabA regulates mycolic acid biosynthesis. J Biol Chem
285: 12714–12725.
63. Molle V, Gulten G, Vilcheze C, Veyron-Churlet R, Zanella-Cleon I, et al.
(2010) Phosphorylation of InhA inhibits mycolic acid biosynthesis and growth of
Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 78: 1591–1605.
64. Khan S, Nagarajan SN, Parikh A, Samantaray S, Singh A, et al. (2010)
Phosphorylation of enoyl-acyl carrier protein reductase InhA impacts mycobacterial growth and survival. J Biol Chem 285: 37860–37871.
65. Corrales R, Molle V, Leiba J, Mourey L, de Chastellier C, et al. (2012)
Phosphorylation of Mycobacterial PcaA Inhibits Mycolic Acid Cyclopropanation: CONSEQUENCES FOR INTRACELLULAR SURVIVAL AND FOR
PHAGOSOME MATURATION BLOCK. The Journal of biological chemistry
287: 26187–26199.
66. Rudner D, Pan Q, Losick R (2002) Evidence that subcellular localization of a
bacterial membrane protein is achieved by diffusion and capture. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 8701–
8706.
67. Bardou F, Quémard A, Dupont MA, Horn C, Marchal G, et al. (1996) Effects of
isoniazid on ultrastructure of Mycobacterium aurum and Mycobacterium
tuberculosis and on production of secreted proteins. Antimicrobial Agents And
Chemotherapy 40: 2459–2467.
68. Backus KM, Boshoff HI, Barry CS, Boutureira O, Patel MK, et al. (2011)
Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium
tuberculosis. Nat Chem Biol 7: 228–235.
69. Swarts BM, Holsclaw CM, Jewett JC, Alber M, Fox DM, et al. (2012) Probing
the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J Am Chem Soc
134: 16123–16126.
70. Thanky NR, Young DB, Robertson BD (2007) Unusual features of the cell cycle
in mycobacteria: Polar-restricted growth and the snapping-model of cell division.
Tuberculosis (Edinb) 87: 231–236.
71. van Kessel JC, Hatfull GF (2007) Recombineering in Mycobacterium
tuberculosis. Nat Methods 4: 147–152.
72. Stover CK, de la Cruz VF, Fuerst TR, Burlein JE, Benson LA, et al. (1991) New
use of BCG for recombinant vaccines. Nature 351: 456–460.
73. Heckman K, Pease L (2007) Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven
overlap extension. Nature protocols 2: 924–932.
74. Drocourt D, Calmels T, Reynes J, Baron M, Tiraby G (1990) Cassettes of the
Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher
eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic acids research 18: 4009.
75. Laval F, Laneelle MA, Deon C, Monsarrat B, Daffe M (2001) Accurate
molecular mass determination of mycolic acids by MALDI-TOF mass
spectrometry. Anal Chem 73: 4537–4544.
33. Flardh K (2010) Cell polarity and the control of apical growth in Streptomyces.
Curr Opin Microbiol 13: 758–765.
34. Joyce G, Robertson BD, Williams KJ (2011) A modified agar pad method for
mycobacterial live-cell imaging. BMC Res Notes 4: 73.
35. Kang CM, Abbott DW, Park ST, Dascher CC, Cantley LC, et al. (2005) The
Mycobacterium tuberculosis serine/threonine kinases PknA and PknB: substrate
identification and regulation of cell shape. Genes Dev 19: 1692–1704.
36. Santi I, Dhar N, Bousbaine D, Wakamoto Y, McKinney JD (2013) Single-cell
dynamics of the chromosome replication and cell division cycles in mycobacteria. Nat Commun 4: 2470.
37. Nguyen L, Scherr N, Gatfield J, Walburger A, Pieters J, et al. (2007) Antigen 84,
an effector of pleiomorphism in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 189:
7896–7910.
38. Munshi T, Gupta A, Evangelopoulos D, Guzman JD, Gibbons S, et al. (2013)
Characterisation of ATP-dependent Mur ligases involved in the biogenesis of cell
wall peptidoglycan in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One 8: e60143.
39. Gao LY, Laval F, Lawson EH, Groger RK, Woodruff A, et al. (2003)
Requirement for kasB in Mycobacterium mycolic acid biosynthesis, cell wall
impermeability and intracellular survival: implications for therapy. Mol
Microbiol 49: 1547–1563.
40. Bhatt A, Fujiwara N, Bhatt K, Gurcha SS, Kremer L, et al. (2007) Deletion of
kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical
latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A 104:
5157–5162.
41. Bhatt A, Kremer L, Dai AZ, Sacchettini JC, Jacobs WR, Jr. (2005) Conditional
depletion of KasA, a key enzyme of mycolic acid biosynthesis, leads to
mycobacterial cell lysis. J Bacteriol 187: 7596–7606.
42. Parish T, Roberts G, Laval F, Schaeffer M, Daffe M, et al. (2007) Functional
complementation of the essential gene fabG1 of Mycobacterium tuberculosis by
Mycobacterium smegmatis fabG, but not Escherichia coli fabG. J Bacteriol 189:
3721–3728.
43. Banerjee A, Dubnau E, Quemard A, Balasubramanian V, Um KS, et al. (1994)
inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium
tuberculosis. Science 263: 227–230.
44. Vilcheze C, Morbidoni HR, Weisbrod TR, Iwamoto H, Kuo M, et al. (2000)
Inactivation of the inhA-encoded fatty acid synthase II (FASII) enoyl-acyl carrier
protein reductase induces accumulation of the FASI end products and cell lysis
of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 182: 4059–4067.
45. Tahlan K, Wilson R, Kastrinsky DB, Arora K, Nair V, et al. (2012) SQ109
Targets MmpL3, a Membrane Transporter of Trehalose Monomycolate
Involved in Mycolic Acid Donation to the Cell Wall Core of Mycobacterium
tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 56: 1797–1809.
46. von Heijne G (1992) Membrane protein structure prediction. Hydrophobicity
analysis and the positive-inside rule. Journal of molecular biology 225: 487–494.
47. Domenech P, Reed MB, Barry CE, 3rd (2005) Contribution of the
Mycobacterium tuberculosis MmpL Protein Family to Virulence and Drug
Resistance. Infect Immun 73: 3492–3501.
48. Feilmeier BJ, Iseminger G, Schroeder D, Webber H, Phillips GJ (2000) Green
fluorescent protein functions as a reporter for protein localization in Escherichia
coli. Journal of bacteriology 182: 4068–4076.
49. He Z, De Buck J (2010) Localization of proteins in the cell wall of
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K10 by proteomic analysis.
Proteome Sci 8: 21.
50. Winkler J, Seybert A, König L, Pruggnaller S, Haselmann U, et al. (2010)
Quantitative and spatio-temporal features of protein aggregation in Escherichia
coli and consequences on protein quality control and cellular ageing. The
EMBO journal 29: 910–923.
51. Lindner A, Madden R, Demarez A, Stewart E, Taddei F (2008) Asymmetric
segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and
rejuvenation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 105: 3076–3081.
52. Makarov V, Manina G, Mikusova K, Mollmann U, Ryabova O, et al. (2009)
Benzothiazinones Kill Mycobacterium tuberculosis by Blocking Arabinan
Synthesis. Science 324: 801–804.
53. Carlsson F, Joshi SA, Rangell L, Brown EJ (2009) Polar localization of virulencerelated Esx-1 secretion in mycobacteria. PLoS Pathog 5: e1000285.
PLOS ONE | www.plosone.org
15
May 2014 | Volume 9 | Issue 5 | e97148
Supporting Information
Mycobacterium tuberculosis proteins involves in mycolic acid
synthesis and transport localize to the old growing pole and septum
Clément Carel1,2,†, Kanjana Nukdee1,2,†, Sylvain Cantaloube1,2, Mélanie Bonne1,2,
Cheikh T. Diagne1,2, Françoise Laval1,2, Mamadou Daffé1,2 and Didier Zerbib1,2,§
1
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS); Institut de Pharmacologie et de
Biologie Structurale (IPBS); BP64182, 205 route de Narbonne, F-31077 Toulouse, France
2
Université de Toulouse; Université Paul Sabatier; IPBS; F-31077 Toulouse, France
†
Both authors contributed equally to this work
§ For correspondence. E-mail: [email protected] Tel +33 (0)561 175 963; Fax: +33
(0)561 175 994;
Supporting Tables
Supporting Table 1. Description of plasmids
Plasmid name
Gene cloned
Vector
Origin
pGAD-T7::kasA
kasA
pGAD-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGAD-T7::kasB
kasB
pGAD-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGAD-T7::mabA
mabA
pGAD-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGAD-T7::inhA
inhA
pGAD-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGAD-T7::fabH
mtfabH
pGAD-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGAD-T7::wag31
wag31
pGAD-T7
This study
pGAD-T7::nat
nat
pGAD-T7
This study
pGAD-T7::parA
parA
pGAD-T7
This study
pGAD-T7::murC
murC
pGAD-T7
This study
pGBK-T7::kasA
kasA
pGBK-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGBK-T7::kasB
kasB
pGBK-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGBK-T7::mabA
mabA
pGBK-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGBK-T7::inhA
inhA
pGBK-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGBK-T7:fabH
fabH
pGBK-T7
(Veyron-Churlet et al., 2004)
pGBK-T7::lam
lamin
pGBK-T7
Clontech
pGBK-T7::wag31
wag31
pGBK-T7
This study
pGBK-T7::nat
nat
pGBK-T7
This study
pGBK-T7::parA
parA
pGBK-T7
This study
pGBK-T7::murC
murC
pGBK-T7
This study
pLAM12::mabA
mabA
pLAM12
This study
pLAM12::inhA
inhA
pLAM12
This study
pLAM12::kasA
kasA
pLAM12
This study
pLAM12::kasB
kasB
pLAM12
This study
pLAM12::gfp
egfp
pLAM12
This study
pLAM12::gfp-mabA
egfp
pLAM12::mabA
This study
pLAM12::gfp-inhA
egfp
pLAM12::inhA
This study
pLAM12::gfp-kasA
egfp
pLAM12::kasA
This study
pLAM12::gfp-kasB
egfp
pLAM12::kasB
This study
pLAM12::mmpl3-gfp
mmpl3
pLAM12::gfp
This study
pLAM12::mp3-N10-gfp
mmpl3-N10
pLAM12::gfp
This study
pMV261::wag31
wag31
pMV261-Nde
This study
pMV361::che-wag31
wag31
pMV261::che-wag31
This study
pMV361::che
mcherry
pMV361
This study
pMC1s::che-wag31
wag31
pMC1s
This study
Supporting Table 2. Oligonucleotide sequences of PCR
Namea
Sequence (5’ to 3’)b
Site
Target
mCherry (F1)
GCAGCCATATGGTGAGCAAGGGC
NdeI
mcherry
mCherry (R1)
GGTGTAAGCGGCATATGCTTGTACAGC
NdeI
mcherry
mCherry (R2)
CGTTGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGC
BamHI
mcherry
GFP (F1)
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGTGAGCAAG
NdeI
egfp
GFP (R1)
GCCATGGCCATATGCTTGTACAGCTCGTCC
NdeI
egfp
GFP (R2)
AGAGTCGCGGAAGCTTTACTTGTA
HindIII
egfp
Wag31 (F)
CTCGAGGGGACAACATATGCCGCTTACACC
NdeI
wag31
Wag31 (R)
CAACCTACCAGGATCCGGCTGCCGACCTCG
BamHI
wag31
Nat (F)
TCAGAATGGCCATATGGCACTGGATCTGACCG
NdeI
nat
Nat (R)
GGTTCGTTTGTTCGGATCCCGTTTGCCGGGC
BamHI
nat
ParA (F)
GGAGGGACCATATGAGTGCTCCGTGGGGC
NdeI
parA
ParA (R)
CAGTCGGGATCCGCGCAGCCAGGCCACG
BamHI
parA
MurC (F)
GGACAACCATATGAGCACCGAGCAGTTGC
NdeI
murC
MurC (R)
CTCGATCTGTGGATCCTCGTTGTGTTCCG
BamHI
murC
MmpL3 (F)
CAGTAAGGAGCTCATATGTTCGCCTGGTGG
NdeI
mmpL3
MmpL3 (R)
CACCTCACCATATGTTAAAGGCGTCCTTCG
NdeI
mmpL3
Mp3-N10 (F)
CAGTAAGGAGCTCATATGTTCGCCTGGTGG
NdeI
mp3-N10
Mp3-N10 (R)
CGCGAGAGCGCCATATGTCGACCCAGGAGG
NdeI
mp3-N10
Wt-Fwd
CCTGAGGTCGATCCGGACCG
-
kasA
Wt-Rev
CCACTTGGCCTGGAACTCCTCG
-
accd6
AES-Fwd
CGCGCCGGTGTCATC
-
kasA
AES-Rev
CACATCGTAGGCGCGAC
-
accD6
PZ1
CAGTCGATCCACGTGGAGATTTACGCGATTCT
TTCCTTTACC
-
kasA
PZ2
CCACTGAGCGTCAGACCCACGTGCTCTACTCAA
CCGAGTTGAATGTTTC
-
accD6
PZ3
CTCCACGTGGATCGACTGCCAGGC
PmlI
sh ble
PZ4
GAGCACGTGGGTCTGACGCTCAGTGG
PmlI
sh ble
a
The primer orientation, with respect to the orientation of the gene transcription, is indicated under brackets as F
(forward) or R (reverse).
b
Restriction sites created are underlined. FAS-I
O
CH3
S C oA
n
acyl-C oA
O
mtFabH
O
-O
S A cpM
malonyl-A C P
CH3
O
n
O
CH3
3 -ketoacyl-A C P
O
S C oA
FAS-II
S A cpM
n
acyl-C oA
S A cpM
n
Kas (AB)
CH3
O
MabA
C H3
OH O
n
S A cpM
3R -hydrox yacyl-A C P
acy l-A C P
O
C H3
InhA
n
Had(ABC)
S A cpM
trans-2-enoyl-A C P
Pks13
MA-Mtf
C H3
D
n1
P
OH
n3
n2
CH3
n4
COOH
Mycolic Acid
Figure S1 The mycolic acid biosynthesis pathway. The substrates and products of the Fatty Acid
Synthase of type I (FAS-I) and II (FAS-II) are indicated together with the biochemical reactions
(black arrows) necessary to achieve the biosynthesis of mature mycolic. The enzymes responsible
for each reaction are named in colored circles. The cofactors necessary for reduction reactions to
occur (NADPH, NADH) were omitted for clarity. The proximal and distal position of the meromycolic
chain modifications by the MA-Mtfs are indicated as P and D respectively. When intermediate reactions were not detailed (acyl-chains activation), it was symbolized by interrupted arrows. The
synthesis of the meromycolic chain is initiated by the condensation by the mtFabH protein of the
acyl-CoA products of FAS-I with malonyl-ACP by MtFabD (Choi et al., 2000) to give a keto-acylACP. After reduction by the keto-acyl-ACP reductase MabA (Banerjee et al., 1998, Cohen-Gonsaud
et al., 2002, Ducasse-Cabanot et al., 2004), dehydration by the hydroxyl-acyl-dehydratases HadAB
or HadBC (Sacco et al., 2007a, Sacco et al., 2007b, Brown et al., 2007) and reduction by the
enoyl-ACP reductase InhA (Banerjee et al., 1994), the acyl-chain enter into a new cycle of elongation through the condensation by the keto synthases KasA or KasB with a new malonyl-ACP unit
(Schaeffer et al., 2001, Kremer et al., 2002, Slayden & Barry, 2002). After its synthesis the meromycolic chain is adenylated and ligated by FadD32 onto Pks13 (Trivedi et al., 2004, Portevin et al.,
2004, Portevin et al., 2005, Gavalda et al., 2009, Leger et al., 2009), which is the terminal condensing enzyme that links the meromycolic chain to a carboxylated alpha chain produced by FAS-I.
The remaining keto function of the future mycolic motif is then reduced, by CmrA (Lea-Smith et al.,
2007) (Bhatt et al., 2008) to give the MA.
E1-FAS-II
AB
I-FAS-II
FAS-I
Mtf
Kas A
FabH
Core
Mtf
acyl-CoA
E2-FAS-II
Kas B
Pks13
BC
Mtf
T-FAS-II
Mycolic Acid
Figure S2 The Mycolic Acid Biosynthesis Interactome. The M.A.B.I. is composed of
three types of complexes : (i) the ‘initiation FAS-II’ (I-FAS-II) contains mtFabH interacting
with a core (MabA, InhA and mtFabD) and represents the link between FAS-I and FAS-II;
(ii) two ‘elongation FAS-II’ (E-FAS-II) complexes comprise the core interacting preferentially either with KasA and HadAB (E1-FAS-II) or with KasB and HadBC (E2-FAS-II), these
two complexes are thought to be able of elongating acyl-AcpM to produce full-length
meromycoloyl-AcpM, (iii) the ‘termination FAS-II’ (T-FAS-II) involves Pks13 interacting
with KasB and might condenses the α-branch with the meromycolic branch. Our working
hypothesis is that the formation of each type of complex might be successive and that
the acyl-ACP substrates could be channeled from one type of complex to another as a
function of its elongation status. The FAS-II initiation complex (I-FAS-II), the elongation
complexes 1 and 2 (E1-FAS-II and E2-FAS-II) and the termination complex (T-FAS-II)
are represented as. The condensing enzymes KasA, KasB and MtFabH (FabH) are in
orange. The interactions between the dehydrase heterodimers (in green) HadAB (AB)
and HadBC (BC) with the MA-Mtf (in violet) are symbolized by curved arrows. The core
(in yellow) symbolizes the reductases MabA and InhA together with the malonylCoA ACP
transacylase MtFabD. The terminal condensing enzyme Pks13 is depicted in blue. The
sense of trafficking of the elongating substrate is symbolized by arrows from the acylCoA from FAS-I toward the mature MA. Interrupted arrows symbolize omitted steps of
substrate modifications.
5 µm
Ø
5 µm
Wag31 (pMV)
5 µm
Wag31 (pMC)
BF
Che
Merge
Figure S3 Localization of mCherry-Wag31 in Msm::mcherry-wag31. Enlarged images of
wide-field microscopy experiments on mCherry-Wag31 fusion expressing bacteria are
presented as in Figure 2 and Figure 4. Brightfield images (BF; leftmost column) together
with
mCherry
fluorescence
images
(Che,
middle
column)
of
Msm
mc²
155::pMV361::mCherry (Ø) Msm mc²155::pMV361::mCherry-wag31 (Wag31(pMV)),
and Msm mc²155::pMC1s::mCherry-wag31 (Wag31(pMC)) were taken 6 hours after the
main culture dilution and in the presence of anhydro-tetracyclin (50 ng/mL) for the later.
The merged images (right columns) allowed visualizing the localization of Che-Wag31
mainly at one pole of the bacteria (the old pole). The total optical magnification was 630
X. The scale bar (5µm) is depicted
A
3097bps
Wt-Fwd
WT
kasA
Wt-Rev
kasB
AES-Fwd PZ1
AES
PZ3
accD6
PZ4
PZ2
AES-Rev
ble
∆kasB
kasA
ble
Wt-Fwd
accD6
PZ3
PZ4
Wt-Rev
1664bps
1547bps
2527 bps
Wt-Fwd
Wt-Rev
B
Wt
∆
Wt-Fwd
PZ4
Wt
PZ3
Wt-Rev
∆
Wt
∆
20
10
7
5
4
3
2
1.5
1
Figure S5 Construction and characterization of M.smegmatis ΔkasB. (A) The wild type
region (WT) of the Msm chromosome comprising kasA (open arrow), kasB (grey arrow)
and accD6 (open arrow) is depicted as a solid line together with the positions for hybridization of PCR primers (Wt-Fwd and Wt-Rev). The AES product synthesized by fusionPCR is also presented with the primers used for its synthesis. The Zeocin resistance
gene (Sh ble, ble) is represented as a black arrow. The structure of the chromosomal
region after the allelic exchange is given together with the positions of PCR primers used
for its characterization. The lengths of each PCR products are indicated in base pairs
(bps) and represented with dashed lines. (B) Ethydium bromide staining of an agarose
gel of PCR products of wild-type (Wt) and ΔkasB (Δ) Msm genomic DNA. The primers
pairs used for amplification are indicated on top of the gel. The positions of migration of
control linear DNA are indicated with their sizes (in kbp).
α’-mycolates
951.9
intensity (%)
C79
C64
C62
100
epoxy-mycolates
1204.3
979.9
WT
C77
1176.2
50
C81
1232.3
C60
923.9
C75
C66
C83
1148.2
1008.0
1260.3
0
C62
100
∆B
intensity (%)
C64
C77
50
C75
C60
C73
C66
1120.37
0
C79
C64
100
∆B/B
intensity (%)
C62
C81
50
C77
C75
C66
C60
C83
0
intensity (%)
C81
C64
100
C79
∆B/gB
C62
50
C77
C66
C60
0
914.0
938.2
962.4
986.6
1010.8
mass (m/z)
C83
C75
1106.0
1143.8
1181.6
1219.4
1257.2
mass (m/z)
Figure S6 MALDI-TOF analysis of α’- and epoxy- mycolic acid methyl esters.
Mass spectra of α’-mycolic acid (left column) and epoxy- mycolic acid methyl
esters (right column) extracted from the wild type (Msm mc²155, WT), the mutant
(Msm mc²155 ΔkasB, ΔB) and the complemented (Msm mc²155 ΔkasB/kasB, Δ
B/B; Msm mc²155 ΔkasB/gfp-kasB, ΔB/gB) strains. The accurate masses (m/z),
together with the length, in number of carbons, of the even epoxy-mycolates and
the odd α’-mycolates, are indicated.
Figure S4 Analysis of FAS-II/Wag31 interactions by co-immunoprecipitation. L-[35S]methionine-labeled h-proteins (HA tagged; h-protein) and c-proteins (c-Myc
tagged; c-protein) from in vitrotranscription translation reactions as well as the CoIP reaction products were fractionated by SDS-PAGE (4–20%) followed by
phosphorimaging analysis. The gels containing the h-Wag31 protein alone or the cWag31 alone are represented in the leftmost lanes. The names of the c-proteins or
h-proteins used in the Co-IP experiments are indicated above each panel. These
proteins were run alone (-), or after Co-IP (IP). (A) c-Wag31 was tested against hFAS-II. (B) h-Wag31 was tested against c-FAS-II proteins; IPØ refers to a Co-IP
performed between a given c-protein and a void extract (obtained with the pGADT7 empty vector). (C) h-Wag31 was tested against human laminC (c-Lam)
with Mtb Arylamine N-acetyltransferase (c-Nat) used as negative control. The black
arrowheads represent a Co-IP band while the open arrowheads indicate the
position of a missing Co-IP band corresponding to a negative interaction. When the
sizes of both proteins were too close to each other, non-labeled h-proteins were
used for Co-IP experiments as indicated with an asterisk.
RÉSULTATS
I/ 2.2 Conclusion
Nous avons pu démontrer au cours de l’étude « statique » que les réductases MabA et InhA du
complexe de biosynthèse des AM se localisent préférentiellement aux pôles bactériens. Les
condensases KasA et KasB, lorsqu’elles forment des foci, le font aussi aux pôles, mais ces
protéines sont essentiellement diffuses dans le cytoplasme. Nous avons montré que les
protéines du système FAS-II se localisent de façon dynamique avec Wag31 à l’ancien pôle duquel
Wag31 est un véritable marqueur ainsi qu’au niveau du futur site de division (pole septal). Cela
signifie que la localisation des protéines de FAS-II s’établit au niveau du pôle de croissance de
Msm. De plus, nous avons aussi montré que le transporteur des AM à travers la membrane
plasmique (Mmpl3), dont la structure est celle d’une protéine membranaire à 12 segments
transmembranaires, se localise à la membrane et préférentiellement aux pôles de Msm. La
localisation polaire est dépendante du domaine C-terminal intra-cytoplasmique de Mmpl3.
Le niveau de localisation des protéines n’est pas dépendant du niveau d’expression des
protéines. De plus, les fusions GFP de KasB et InhA semblent actives in vivo. En effet, la fusion
GFP de KasB est capable de complémenter la délétion du gène chromosomique de KasB. De
même, la fusion GFP d’InhA est capable d’induire une tolérance accrue à l’INH signifiant que sa
structure in vivo est compatible à la fixation de son inhibiteur.
L’ensemble de ces résultats semble donc attester d’une localisation préférentielle des protéines
de FAS-II ainsi que du transporteur Mmpl3 aux anciens pôles et au septum avant la division. Cela
peut rendre compte de la possibilité d’une localisation polaire et septale de la biosynthèse des
AM au même titre que celle du PG.
I/ 2.3 Etude phénotypique du mutant ΔkasB de Msm
a. Stratégie et mise en œuvre
Le mutant d’insertion-délétion du gène kasB de Msm (kasB ::zeo) décrit dans le manuscrit
présenté au paragraphe précédent a été réalisé grâce au système de « recombineering »
développé dans l’équipe du Dr. Hatfull (van Kessel & Hatfull, 2007). Ce système correspond à
l’application aux mycobactéries du système lambda-Red développé chez E.coli (Datsenko &
Wanner, 2000). Afin de permettre facilement la complémentation de la souche mutante avec les
vecteurs disponibles au laboratoire portant la résistance à la Kanamycine nous avons choisi
d’utiliser un dérivé du vecteur du recombineering résistant à l’Hygromycine (pJVH53-Hygro,
71
KasA
KasB
AccD6
mc²155 wt
Echange allélique
ZeoR
Vecteur de recombineering
HygroR
KasA
ZeoR
AccD6
mc²155 ΔkasB
Vecteur de recombineering
HygroR
Transformation
KasA
ZeoR
AccD6
mc²155 ΔkasB
Vecteur de complémentation
KanR
Figure 32 : Schéma de construction du mutant ΔkasB de Msm par recombinaison
homologue induite par un système phagique (recombineering).
RÉSULTATS
W.Malaga). Pour sélectionner l’échange allélique entre l’AES et la région chromosomique nous
avons utilisé la cassette de résistance à la zéocine (Figure S5 ; article) (Figure 32). Comme cette
cassette n’avait pas été utilisée au laboratoire avant ces travaux nous avons dû déterminer la
concentration adéquate en zéocine pour effectuer les sélections. De plus, au vu du faible
nombre de mutants obtenus lors de cette expérience (8 colonies) nous avons aussi construit un
mutant de délétion-insertion du gène kasB avec la cassette de résistance à la kanamycine
(kasB ::Kan) classiquement utilisée pour réaliser des mutants chromosomiques. Dans les mêmes
conditions expérimentales nous avons obtenu un nombre de mutants équivalents (10 colonies)
avec la cassette de résistance à la kanamycine. Ce résultat indique que le faible nombre de
mutant obtenu n’était pas lié à la nature de la cassette. De plus, cela indique que la cassette de
résistance à la zéocine peut être utilisée en routine pour la construction de mutant d’insertiondélétion.
Cette stratégie permet grâce à l’association de trois cassettes de résistances différentes
(Hygromycine, Kanamycine, Zéocine) de réaliser la délétion d’un gène essentiel en une seule
étape. En effet, la cassette de résistance à la zéocine permet la sélection de l’échange allélique.
La cassette de résistance à l’hygomycine permet la sélection du plasmide du recombineering et
la cassette de résistance à la kanamycine permet la sélection du plasmide portant le gène de
complémentation. Cette stratégie a été utilisée depuis, avec succès, dans le cadre d’autres
projets au sein de l’équipe chez Msm et Mtb (K. Cam et S. Jamet)
Comme décrit plus haut, la souche mutante pour le gène kasB a été utilisée pour vérifier
que la fusion GFP-KasB pouvait complémenter cette déficience. Nous avons en outre observé un
effet spécifique de la complémentation par le gène kasB de Mtb sur la longueur des AM de Msm
et avons décidé d’étudier cet effet plus avant.
b. Effet de KasB sur la longueur des AM de Msm
L’analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des AM du mutant de Msm kasB::zeo avait
montré une diminution de la longueur des alpha-AM et époxy-AM dans cette souche en
comparaison de la souche sauvage (figure 7 ; article). Ce phénotype était bien complémenté par
l’expression du gène kasB de Mtb seul ou en fusion avec la GFP mais cette complémentation
permettait de synthétiser des alpha-AM plus long de 2 carbones (C82) que ceux de la souche
sauvage de Msm (C80). De plus, l’enveloppe globale du complémenté était modifiée par rapport à
72
Figure 33 : Spectre de masse MALDI-TOF d’AM de Msm. Les spectres MALDI-TOF ont été
obtenus en mode positif. Les spectres correspondent à un zoom dans la zone de masse des
alpha, époxy et alpha-AM de la souche sauvage de Msm (A), de la souche mutante ΔkasB
complémentée par le plasmide pLAM12::kasB de Msm mc²155 (B) ou de la souche mutante
ΔkasB complémentée par le plasmide pLAM12::kasB de de Mtb H37Rv (C). Toutes les
cultures étaient induites à l’acétamide (0,2%).
RÉSULTATS
la souche sauvage. Le profil de masse était décalé de façon générale vers des masses supérieures
(figure 7 ; article).
Une hypothèse était que cette modification de la structure des AM dans la souche mutante de
Msm complémentée par le gène kasB de H37Rv était due à la provenance (Mtb) du gène
complémentant et ceci bien que les protéines de Mtb et de Msm soient très similaires (80 %
d’identité). En effet, cette nouvelle structure était plus proche du profil de masse des AM de Mtb
que de ceux de Msm.
Afin de tester cette observation nous avons réalisé le clonage du gène kasB de Msm dans le
même système d’expression inductible à l’acétamide (pLam12). Puis nous avons complémenté le
mutant kasB::zeo avec cette construction et enfin, nous avons analysé les AM de cette souche
selon la technique décrite plus haut.
L’analyse des AM de la souche complémentée avec le gène de Msm (Figure 33B) montre la
même tendance de profil que celle complémentée avec le gène de Mtb (Figure 33C). En effet,
comme précédemment le phénotype mutant est complémenté au niveau des époxy-AM et
alpha-AM. Pour les alpha-AM on observe même une augmentation de la longueur plus
importante qu’avec le gène de Mtb (C82 pour le gène Mtb et C84 pour le gène de Msm). Les
alpha-AM de cette souche sont donc plus longs de 3 carbones par rapport à la souche sauvage
(Figure 33A). De plus, l’espèce majoritaire des alpha-AM est déplacée de C79 pour la souche
sauvage à C80 pour la souche complémentée avec le gène de kasB de Msm (C82 pour le sauvage
et C86 pour le gène de Msm). Pour les époxy-AM on observe une augmentation de taille de 4
carbones par rapport à la souche sauvage dans la souche complémenté avec le gène kasB de
Msm. La complémentation par le gène de Mtb modifie également le profil de masse mais
n’effectue qu’une élongation supplémentaire de 1 carbone. De plus, dans le cas de la
complémentation par le gène kasB de Msm, on observe également la présence de masse en -2
m/z par rapport au pic correspondant aux époxy-AM de longue taille (Figure 33B). Cela peut
indiquer la présence d’une insaturation supplémentaire sur la chaîne méromycolique.
Cependant pour conclure quant à la présence de modification supplémentaire ou différente, il
serait nécessaire d’effectuer une analyse en RMN.
Ces résultats sont intéressants car ils suggèrent que la modification de la taille des AM n’est pas
fonction de l’espèce de provenance du gène kasB mais plutôt de son niveau d’expression. Ceci
suggère que le niveau de kasB était un facteur limitant de l’élongation terminale des chaînes
73
RÉSULTATS
méromycoliques. De plus, la complémentation par le gène de l’espèce (Msm) est plus efficace
que par celui d’une autre espèce (Mtb) suggérant que si les activités des protéines de Msm et de
Mtb sont équivalentes, ce sont peut-être des interactions avec les autres protéines de FAS-II qui
sont limitantes lors des complémentations croisées. Ces résultats semblent indiquer que la taille
des AM de Msm sauvage n’est pas limitée uniquement par des contraintes structurales de KasB,
mais par la quantité de KasB présente dans la cellule et peut-être par son affinité pour les
complexes FAS-II d’élongation.
De plus, nous avons pu également mettre en avant un autre résultat. Nous avons observé que
contrairement aux alpha et époxy les alpha’-AM ne sont pas affectés par la délétion ou la
surexpression du gène kasB (Figure S6 ; article et non montré). Il semble donc que cette espèce
n’implique pas, pour sa biosynthèse, la protéine KasB. Cela pourrait donc signifier que les alpha’AM sont issus de complexes de biosynthèse FAS-II n’impliquant pas KasB.
I/ 2.4 Localisation de protéine par immunofluorescence chez Msm
Conscients du risque de l’approche de localisation par production ectopique de fusions GFP,
nous avions souhaité, en parallèle, développer une technique complémentaire permettant de
localiser les protéines exprimées physiologiquement pour palier la formation éventuelle de corps
d’inclusion. L’immunofluorescence (IF) in situ est très utilisée dans les cellules eucaryotes dans le
cadre de localisation protéique. Cette technique a l’avantage de mieux maintenir l’intégrité de la
cellule contrairement à l’immunolocalisation directe en microscopie électronique qui nécessite
une fixation drastique et la réalisation de coupes. L’IF est beaucoup moins courante chez les
procaryotes et, chez les mycobactéries, cette stratégie n’a été utilisée, pour des protéines
cytoplasmiques, que dans deux études de localisation (Cimino et al, 2006; Sureka et al, 2010).
Ces deux études reposent respectivement sur des stratégies de perméabilisation par le toluène
et des solvants ou par l’action enzymatique du lysozyme et en présence de triton X100 comme
détergent.
Nous avons mis en œuvre ces deux protocoles. Tout d’abord nous avons testé, sur une souche
de Msm sauvage, le protocole de Sureka et collaborateurs basé sur l’utilisation de toluène et de
solvants. L’IF était réalisée à l’aide d’anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine
MabA et d’un anticorps secondaire monoclonal fluorescent (Alexa 488). Malgré de très
nombreuses mises au point concernant les concentrations de toluène, les temps d’incubation,
les concentrations en anticorps primaire et secondaire nous n’avons pu obtenir aucune
74
GFP
IF
A
B
C
D
BF
MERGE
Figure 34 : Localisation par immunofluorescence de la GFP chez Msm. La technique
d’immunofluorescence a été réalisée d’après Datta et collaborateurs (Datta et al, 2006). La
souche de Msm exprime la GFP par l’intermédiaire du plasmide pMV361-HYGRO::GFP. A/
Localisation par microscopie de fluorescence de la fluorescence émise par la GFP ellemême. B/ Immunolocalisation avec des anticorps anti-GFP (1/500 dans 1% PBS-BSA) et
anticorps secondaires anti-Souris Alexa 555 (Rouge). C/ Visualisation en contraste de phase.
D/ Superposition des images A et B montrant une différence de localisation entre les deux
méthodes de visualisation.
RÉSULTATS
localisation spécifique. En effet, la localisation de la fluorescence se trouvait de façon majoritaire
au niveau de la lamelle et non au niveau des bactéries ! Les modifications concernant le blocage
de la lamelle n’ont pas permis de résoudre le problème. Nous avons attribué ce résultat à la
qualité du seul anticorps en notre possession, seulement validé pour le Western blot et qui
n’avait jamais été utilisé dans des études visant à détecter des protéines natives.
Afin de s’affranchir du problème potentiel de l’anticorps, nous avons donc testé le protocole
avec des anticorps primaires anti-GFP (développés spécialement pour l’immunofluorescence) en
réalisant les expériences d’IF sur une souche de Msm surexprimant la GFP seule. La révélation
des expériences d’IF avec un anticorps secondaire fluorescent (Alexa 555, rouge) indiquait de
façon étonnante une localisation membranaire de la GFP (Figure 34B) alors que le signal propre
à la GFP indiquait une localisation cytoplasmique (Figure 34A). L’anticorps primaire semble donc,
soit reconnaitre un élément de l’enveloppe, ce qui est peu probable, ou bien rester piégé dans
l’enveloppe lors de l’expérience. Après de nombreux échecs et au vu du manque de détails du
protocole publié, nous avons conclu que ce protocole n’était pas adapté à la réalisation d’IF et
pouvait conduire à de fausses interprétations. Nous avons essayé d’obtenir le protocole détaillé
auprès des auteurs de ce travail. Notre requête restant sans réponse, nous avons abandonné
cette approche.
Dans un deuxième temps nous avons testé le protocole de Cimino et collaborateurs. La
perméabilisation des cellules est réalisée par l’intermédiaire du lysozyme (2mg/mL) puis du
triton X100 (0,1%). Nous avons réalisé le protocole comme décrit dans l’étude. Dans un premier
temps, nous avons observé, par deux fois, une localisation polaire et le long de la membrane de
la protéine MabA (Figure 35A et B). Mais, nous avons obtenu aussi, par deux fois, des images
similaires lorsque le serum pré-immun était utilisé comme anticorps primaire (Figure 35C et D).
Nous n’avons donc pas pu conclure quant à la localisation de MabA par cette technique d’IF.
Nous avons également tenté de mettre au point des conditions de perméabilisation et
d’hybridation sans succès.
L’immunolocalisation chez les mycobactéries semble très complexe à mettre en œuvre
probablement à cause de la structure et de l’imperméabilité de l’enveloppe. Le nombre d’études
utilisant cette technique pour localiser une protéine cytoplasmique est très restreint. La
localisation de protéines membranaires ou présentes dans l’enveloppe semble être moins
difficile à mettre en œuvre et l’utilisation de souches mutantes ayant une structure de
75
BF
IF
AntiMabA
Serum
Pré-immun
Figure 35 : Localisation par immunofluorescence de MabA chez Msm sauvage. La
technique d’immunofluorescence a été réalisée d’après Cimino et collaborateurs (Cimino et
al, 2006) sur une souche de Msm sauvage (A et C). La localisation par microscopie de
fluorescence est réalisée par immuofluorescence avec l’anticorps anti-MabA (1/500 dans
1% PBS-BSA) et l’anticorps secondaire anti-Lapin alexa 488 (B). Le témoin négatif (D) est
réalisé avec le sérum pré-immun ainsi que l’anticorps secondaire anti-Lapin alexa 488 .
Panneaux A et B (lumière blanche), panneaux B et D (canal GFP).
RÉSULTATS
l’enveloppe déstabilisée pourrait permettre de faciliter l’étape de perméabilisation de
l’enveloppe (Carlsson et al, 2009). Ce travail permet de noter que même si l’approche par
production ectopique de protéines de fusion représente un risque, ce risque existe aussi pour
des techniques réputées plus physiologiques comme l’immunofluorescence in situ.
II.
Rôle du domaine cytoplasmique de Mmpl3 dans sa localisation
II/ 1 Localisation et topologie de Mmpl3
Comme décrit précédemment, nous avons montré que le transporteur des AM (MmpL3) était
localisé au niveau de la membrane plasmique et de façon préférentielle au niveau des pôles et
du septum de division (confère paragraphe I/ 2.1 p.69). Pour ce faire, nous avons réalisé une
fusion traductionnelle avec le gène de la GFP en C-ter du gène de mmpL3. Cette fusion a été
réalisée dans le même vecteur d’expression inductible à l’acétamide que pour les gènes de FASII. Nous avons choisi de réaliser la fusion en C-ter afin de ne pas perturber les éventuels signaux
d’adressage à la membrane présents classiquement en N-ter des protéines membranaires. De
plus, d’après les informations topologiques concernant MmpL3 (Varela et al, 2012) il semblait
hautement probable que son domaine C-ter soit cytoplasmique et non membranaire ou
périplasmique (confère paragraphe IV/ 7 p.51).
Dans un premier temps nous avons réalisé l’observation de la souche portant la fusion GFP de
MmpL3 dans les mêmes conditions statiques que les fusions des gènes de FAS-II. Brièvement
nous avons réalisé l’induction à l’acétamide (0.2%) d’une culture liquide en milieu de phase
exponentielle. Après 6h d’induction, nous avons réalisé l’observation des cellules en microscopie
de fluorescence statique. Le résultat de ces observations montrait une localisation anarchique,
non membranaire, et sous forme de foci dispersés dans le cytoplasme (résultats non montrés).
Cette observation n’était permise que dans un faible nombre de bactéries du fait de l’absence
totale de fluorescence dans la majorité des cellules. Ce résultat semblait indiquer une toxicité
forte de la fusion amenant à une sélection des bactéries ne l’exprimant pas ou peu.
Nous avons alors réalisé l’observation de la souche de Msm en vidéomicroscopie permettant
une induction progressive et moins importante (0.02% acétamide) de la production de MmpL3GFP (Film S11). Le résultat de cette observation dynamique montrait une localisation
membranaire de MmpL3 dans les cellules fluorescentes qui, maintenant, étaient majoritaires.
Cette localisation membranaire montrait également une concentration plus importante de la
76
Figure 36 : Représentation linéaire des dérivés de la protéine MmpL3 de Mtb. La topologie
prédite de MmpL3 sauvage est représentée (en haut). Sont également représentées les
différents constructions générées lors de cette étude avec les positions des régions choisies
pour définir des domaines. La GFP fusionnée en C-terminal est aussi représentée. La
nomenclature est celle utilisée dans le texte.
RÉSULTATS
fluorescence au niveau des pôles de Msm. Cependant l’expression de la fusion, après plusieurs
heures d’induction, provoquait également une forte toxicité amenant à la lyse des cellules.
L’observation de la fusion MmpL3-GFP dans une souche surexprimant également la fusion
mCherry-Wag31 induisait une diminution importante de sa toxicité et l’observation de cette
souche a permis de confirmer la localisation polaire de la fusion GFP de MmpL3 de Mtb chez
Msm (Figure 8 ; article et Film S12). Ce premier résultat suggérait que le transport des AM
pourrait être réalisé de façon principale au niveau des pôles et du septum des mycobactéries.
Par la suite nous avons donc effectué l’observation de toutes les constructions concernant
MmpL3 en vidéomicroscopie dans une souche produisant mCherry-Wag31 pour limiter la
toxicité de la construction initiale.
Le second résultat de ce travail est donné par le simple fait que la fusion MmpL3-GFP provoque
une intense fluorescence membranaire. Cela semble signifier que la GFP, et donc l’extrémité Cterminale de MmpL3, sont localisées dans le cytoplasme et ceci confirme les prédictions de la
topologie de MmpL3. En effet, chez E.coli la GFP n’est fluorescente que lorsqu’elle est
cytoplasmique. D’ailleurs, son utilisation conjointe avec la protéine PhoA, qui a le comportement
inverse, a permis de définir la topologie de nombreuse protéines membranaires (Drew et al,
2002; Feilmeier et al, 2000). Pour confirmer ce résultat Il faudrait effectuer une fusion Cterminale avec la protéine PhoA, active seulement dans le périplasme (Baulard et al, 2003;
Kremer et al, 1995) et montrer que l’activité PhoA de la fusion est nulle.
Par la suite, notre réflexion a donc été basée sur le modèle topologique composé de 12 TMS (de
l’anglais, transmembrane sequence) (Trans avec le domaine C-ter du coté cytoplasmique de la
membrane plasmique (Figure 36). Nous avons défini deux régions distinctes de MmpL3 : la
région membranaire composée des 12 TMS (notée MmpL3-N) et la région cytoplasmique
comprenant uniquement le domaine C-ter de la protéine (notée MmpL3-C).
Nous avons ensuite entrepris d’étudier la localisation des régions cytoplasmiques et
membranaires de façon indépendante, notre but étant d’essayer de définir la région responsable
de la localisation de MmpL3 aux pôles.
II/ 2 Localisation du domaine membranaire
N’ayant pas la topologie exacte de la protéine MmpL3 nous avons défini deux bornes différentes
pour délimiter les régions membranaires et cytoplasmiques en nous basant sur la structure
77
A
MERGE
GFP
MmpL3
WT
MmpL3
N-10
B
Figure 37 : Localisation et analyse du profil de fluorescence de Msm produisant MmpL3GFP et le domaine MmpL3-N10. (A) Localisation des fusions MmpL3-GFP et Mmpl3-N10GFP. Le panneau de gauche correspond à la superposition des canaux GFP et mCherry
(MERGE), le panneau de droite correspond à l’observation de la fluorescence de la GFP
(GFP). L’échelle est donnée par la barre de 5 µm. (B) Quantification de la fluorescence
polaire vs latérale de MmpL3 sauvage (voir Matériel et Méthode du manuscrit), MmpL3N10. *** correspond à un p value < 0.0001. Les tests statistiques (test t de student) et les
graphiques ont été réalisés à l’aide du logiciel Prism 5.0.
RÉSULTATS
secondaire prédite (Toppred, (Von Heijne, 1992)). Nous avons défini la leucine 718 et la glycine
727 comme bornes de la région membranaire de MmpL3 (Figure 36). La leucine 718 est située
après le dernier acide aminé (AA) prédit comme étant impliqué dans la dernière TMS (TMS 12).
La glycine 727 est située 10 AA en aval. Nous avons réalisé le clonage de ces deux fragments (1718 ; MmpL3-N12-1 et 1-727 ; MmpL3-N12-2) de MmpL3 en fusion traductionnelle avec la GFP
en position C-terminale (Figure 36). Ces deux constructions, analysées par vidéomicroscopie
dans Msm ne provoquaient pas de fluorescence membranaire et même souvent pas de
fluorescence du tout (résultats non montrés). Les conditions d’expression et de construction
étant maitrisées et vérifiées, nous avons supposé que ces protéines tronquées n’étaient pas
aptes à adopter une conformation correcte. Il était possible que la GFP de MmpL3-N12-1-GFP et
de MmpL3-N12-2-GFP soit adressée au périplasme en absence de signal de « retour » vers le
cytoplasme, provoquant ainsi une inhibition de la fluorescence. Ceci serait possible si ses signaux
de « retour » sont présents dans la séquence du domaine cytoplasmique inexistant dans nos
constructions. De la même façon une fusion de MmpL3-N12-1 et N12-2 avec la protéine PhoA
permettrait de valider ou non cette hypothèse.
Nous avons alors choisi de « déplacer » la borne du domaine membranaire entre la TMS 10 et 11
à la position 655. La boucle cytoplasmique entre les TMS 10 et 11 est plus longue que celle entre
la TMS 11 et 12. Ceci permettait de supposer que la GFP fusionnée pouvait être cytoplasmique.
Nous avons réalisé la construction de ce domaine (1-655 ; MmpL3-N10 ; Figure 36) comme
précédemment. L’observation en vidéomicroscopie de cette construction a révélé une
localisation membranaire de la fluorescence mais cette fois, sans accumulation préférentielle
aux pôles. La localisation de MmpL3-N10 était différente de celle de la protéine MmpL3 entière
(Figure 37) (Figure 9 ; article et Film S13). Nous avons alors réalisé une quantification relative de
la fluorescence présente aux pôles en comparaison de la fluorescence présence sur la longueur
de la bactérie (Figure 9 ; article). Cette quantification avait révélé que la fluorescence émise par
la fusion GFP de MmpL3 sauvage est 5.353 ± 0.3810 (N=192) fois plus importante au pôle de
Msm alors que celle de MmpL3-N10 montrait un rapport de 1.160 ± 0.1572 (N=113) (Figure 37).
Ce rapport traduit le fait que le domaine membranaire 1-655 présente une localisation
homogène le long de la membrane. Nous avons réalisé la construction du domaine
complémentaire du domaine MmpL3-N10 (1-655) le domaine MmpL3-C10. Ce domaine
correspond aux 2 TMS (11 et 12) ainsi que le domaine cytoplasmique. L’observation de la souche
de Msm transformée par cette construction ne montre pas de localisation membranaire de
78
BF
MERGE
GFP
C12-1
C12-2
C12-3
C12-6
Ø
Figure 38 : Localisation des domaines cytoplasmiques de MmpL3 fusionnés à la GPP chez
Msm. Le panneau le plus à gauche correspond à l’observation des cellules en lumière
transmise (BF), le panneau du milieu correspond à la superposition des observations en
lumière transmise, fluorescence mCherry et GFP (MERGE), le panneau le plus à droite
correspond uniquement à l’observation de la fluorescence émise par la GFP (GFP). Les
noms des dérivés de MmpL3 sont indiqués selon la nomenclature de la Figure 36. La barre
en bas à droite du panneau BF représente une distance de 5 µm.
RÉSULTATS
MmpL3-C10, mais la formation de foci multiples dans le cytoplasme (résultats non montrés).
Cette observation semblait donc indiquer que la protéine de fusion MmpL3-C10 n’est pas
adressée à la membrane mais n’est pas soluble dans le cytoplasme. Cela peut s’expliquer comme
précédemment par l’absence des signaux d’adressage à la membrane, ce qui entraine un
maintien de la protéine dans le cytoplasme et probablement une conformation aberrante et une
agrégation dues à la présence des deux TMS.
Ces résultats importants semblent bien confirmer le modèle topologique de MmpL3. Les 10
premiers TMS de MmpL3 sont membranaires et la boucle TMS10-TMS11 semble être
cytoplasmique. Mais l’observation la plus intéressante est donnée par le fait que cette protéine
tronquée MmpL3-N10 ne soit plus capable de se localiser, comme MmpL3 sauvage, de façon
préférentielle aux pôles de la bactérie. Comme le domaine membranaire MmpL3-N10 composé
des 10 TMS n’est pas impliqué dans la localisation polaire du transporteur des AM il semble donc
que le domaine responsable de la localisation soit présent dans les régions en aval.
II/ 3 Localisation polaire du domaine cytoplasmique
Le problème d’adressage à la membrane du domaine MmpL3-C10 nous a amené à nous
concentrer sur la région prédite comme cytoplasmique, en aval du domaine TMS12. Nous avons
alors cloné les domaines complémentaires au domaine membranaire MmpL3-N12-1 (1-718) et
N12-2 (1-727) décrits plus haut. Ces domaines cytoplasmiques ont été nommés MmpL3-C12-1
(719-944) et MmpL3-C12-2 (728-944). Pour l’étude des domaines C-terminaux de MmpL3, la GFP
a été placée en position C-terminale ce qui permettait d’être cohérent avec les observations
réalisées précédemment sur les domaines N-terminaux de MmpL3. Le résultat montre une
localisation cytoplasmique et clairement polaire des fusions MmpL3-C12-1-GFP et MmpL3-C122-GFP exprimées chez Msm (Figure 38). De plus, en vidéomicroscopie nous avons pu observer
également que la fluorescence la plus intense des domaines MmpL3-C12-1 et MmpL3-C12-2-GFP
était localisée au même pôle que l’intensité maximale de la fusion mCherry-Wag31 (Films S14 et
S15). Cela signifie que ces fusions se localisent préférentiellement au niveau de l’ancien pôle
tout comme les protéines de FAS-II étudiées dans cette thèse. On observe également, au
moment de la division ou juste après la division, une localisation ou relocalisation de ces fusions
au pôle septal de façon moins intense qu’à l’ancien pôle tout comme la fusion mCherry-Wag31.
79
C12-1
C12-2
C12-3
C12-6
Ø
Figure 39 : Analyse des profils de fluorescence des souches de Msm produisant différents
domaines cytoplasmiques de Mmpl3 fusionnés à la GFP. Les images générées en
microscopie de fluorescence ont été analysées avec le logiciel ImageJ. Les graphes
représentent l’intensité de fluorescence de la GFP en fonction de la taille des bactéries
(µm). Quatre bactéries représentatives ont été analysées et sont représentées de couleur
différente. Les noms des dérivés de MmpL3 sont indiqués selon la nomenclature de la
Figure 36.
RÉSULTATS
Ces résultats indiquent que le domaine cytoplasmique est capable de se localiser aux pôles en
absence d’ancrage membranaire. Ceci pouvait indiquer que la localisation de la protéine MmpL3
complète soit dirigée par son domaine cytoplasmique.
Afin de savoir si une séquence spécifique était responsable de la localisation du domaine
cytoplasmique, nous avons alors construit une série de délétions N-terminales du domaine
cytoplasmique C-terminal MmpL3-C12. Ces domaines cytoplasmiques nommés C12-3, C12-4,
C12-5 et C12-6 correspondent respectivement aux AA : 783-944, 813-944, 855-944 et 920-944
de MmpL3 sauvage (Figure 36). Comme auparavant ces domaines ont été clonés en fusion avec
la GFP placée en C-ter (K. Hachi, stagiaire M1). Les résultats de vidéo microscopie du domaine
MmpL3-C12-3 en fusion avec la GFP montrent une localisation intense au niveau du cytoplasme.
La localisation est clairement diffuse si l’on compare avec celle des domaines MmpL3-C12-1 et
C12-2. Les tracés de fluorescence de la fusion GFP avec le domaine C12-3 montrent un niveau de
fluorescence dans la région centrale des bactéries beaucoup plus important que celle des
domaines C12-1 et C12-2. Ceci confirme également la différence de localisation entre les fusions
des domaines C12-1 et C12-2 d’une part et C12-3 d’autre part.
Il est également possible d’observer la formation de foci discrets au niveau des pôles dans le cas
de la fusion C12-3. La comparaison des tracés de fluorescence confirme cette observation avec
un épaulement de la courbe de la fluorescence de la GPP au niveau des pôles en comparaison
avec les tracés de la GFP seule (Figure 39). Il semblait donc que la séquence de 65 AA située
entre le domaine MmpL3-C12-2 et C12-3 ait un rôle important dans la localisation du domaine
cytoplasmique de MmpL3. Il était aussi possible que cette région joue un rôle dans la localisation
de la protéine entière sauvage.
Le domaine MmpL3 C12-6, fusionné avec la GFP, est cytoplasmique. Sa localisation est diffuse
mais avec un épaulement sur les tracés de la fluorescence au niveau d’un pôle. Ce domaine
MmpL3- C12-6 est composé uniquement de 24 AA. Il est possible que sa faible taille ne soit pas
compatible avec un repliement correct. Dans ce cas, les épaulements observés sur les tracés de
fluorescence concernant ce domaine pourraient ne pas être dus à une localisation polaire
préférentielle. Les domaines MmpL3-C12-4, et -5 n’ont pas été testés.
Enfin, nous avons voulu savoir si la séquence de 65 AA comprise entre le domaine MmpL3-C12-2
et C12-3 était suffisante pour induire la localisation polaire du domaine membranaire. Pour cela
nous avons réalisé le clonage du domaine membranaire avec ces 65 AA en fusion avec la GFP.
80
A
B
Figure 40 : Localisation et analyse du profil de fluorescence de Msm produisant le
domaine Mmpl3-N12-3. (A) Localisation de la fusion MmpL3-N12-3-GFP. Le panneau de
gauche correspond à l’observation en lumière transmise, le panneau de droite correspond à
l’observation de la fluorescence de la GFP. L’échelle est donnée par la barre de 5 µm. (B)
Quantification de la fluorescence polaire vs latérale de MmpL3 sauvage (voir Matériel et
Méthode du manuscrit), Mmpl3-N10 et Mmpl3-N12-3. *** correspond à un P value <
0.0001. La différence entre le rapport de fluorescence de MmpL3-N10 et N12-3 est non
significatif (ns) P value = 0,6617. Les tests statistiques (test de student) et les graphiques
ont été réalisés à l’aide du logiciel Prism 5.0.
RÉSULTATS
Cette construction correspond au domaine complémentaire de MmpL3-C12-3 et est nommée
MmpL3-N12-3 (Figure 36). L’observation en vidéomicroscopie de cette construction introduite
chez Msm montre une localisation clairement membranaire (Figure 40A ; Film S16). Il ne semble
pas y avoir de localisation préférentielle au niveau des pôles de Msm. En effet, une
quantification de la fluorescence de MmpL3-N12-3 comparant la fluorescence polaire vs la
fluorescence latérale montre un rapport de 1.053 ± 0.1619 (N=63) (Figure 40B). Ce rapport de
fluorescence est statistiquement différent de celui de la localisation de MmpL3 sauvage (P value
< 0.0001) et possède une différence non significative avec le rapport obtenu avec le domaine
MmpL3-N10 (P value = 0,6617). Ces résultats semblent indiquer que les 65 AA déterminés sont
nécessaires mais ne sont pas suffisants pour induire la localisation de la protéine MmpL3 au
niveau des pôles. De plus, cela confirme que le déterminant de localisation polaire semble être
présent dans la région cytoplasmique. En effet, comme pour le domaine MmpL3-N10, cette
protéine tronquée de MmpL3 n’est pas capable de se localiser préférentiellement au niveau des
pôles. Cela indique également que les TMS 11 et 12 ne sont pas impliquées dans la localisation.
L’ensemble de ces résultats semble donc indiquer que MmpL3 sauvage est localisé aux pôles de
Msm grâce à des déterminants présents dans sa région cytoplasmique C-terminale.
III.
Vers l’étude des bases moléculaires de la localisation de MmpL3
La recherche des bases moléculaires de la localisation de FAS-II faisait partie intégrante du projet
de thèse de K. Nukdee (doctorante 1ère année). Il était, notamment question de connaitre, par
des approches génétiques l’implication de protéines du cycle bactérien (Wag31, FtsZ, Pbps) dans
la localisation de FAS-II. Plusieurs tentatives de construction de mutant conditionnel du gène
wag31 avaient été entreprises et avaient échouées. Ces échecs ont été attribués à des
problèmes de complémentation inefficace par Wag31 lors de la construction de ces mutants. Le
niveau d’expression de Wag31 au moment de la disruption du gène sauvage semble primordial.
III/ 1 Mise en œuvre du système TetR/Pip OFF
Au cours de mon travail de thèse, nous avons obtenu un système d’expression contrôlé
développé par Boldrin et collaborateurs qui permet, en présence de tétracycline (Tc) ou
d’anhydrotétracycline (AH-Tc), de réprimer l’expression d’un gène placé en aval du promoteur
Pptr lui-même contrôlé par le répresseur Pip (Figure 41A). Les auteurs de cette étude ont
également réalisé, grâce au vecteur suicide pFRA53, un système permettant la mutagenèse in
81
A
B
Figure 41 : Schéma du mode de régulation du système TET/PIP ainsi que son application
pour la réalisation de mutants chromosomiques (d’après Boldrin et al, 2010). (A) Modèle
de fonctionnement du système TetR / Pip OFF. En l'absence de tétracycline (Tc), le
répresseur TetR se lie à ses opérateurs pour éteindre la transcription du gène du répresseur
Pip, permettant ainsi l'expression de lacZ. En présence de Tc, la transcription de pip est
autorisée. En conséquence, Pip réprime l'expression de lacZ. (B) Le plasmide pFRA53
possède les 500 premières paires de bases du gène ftsZ de Msm placées en aval du
promoteur Pptr. Ce plasmide ne possède pas d’origine de réplication pour les
mycobactéries. Lors de la transformation de Msm puis de la sélection par l’Hygromycine
(Hyg) l’établissement du plasmide permettant la résistance est réalisée par recombinaison
homologue entre la séquence ftsZ du plasmide et celle du chromosome. L’insertion du
plasmide induit la délétion d’une partie (3’) du gène chromosomique qui est sous le
contrôle de son promoteur sauvage et la formation d’une copie intacte du gène placée alors
sous le contrôle du promoteur Pptr. La présence du plasmide pFRA42 intégré au site att de
Msm permet le fonctionnement du système TetR/Pip OFF, Cette construction permet donc
d’inhiber l’expression de ftsZ en présence de Tc ou d’anhydro-tetracycline (AH-Tc),
RÉSULTATS
situ d’un gène chromosomique et la mise sous contrôle de Pip du gène sauvage complémentant
(Figure 41B). Pour tester leur système les auteurs avaient réalisé la mise sous contrôle du gène
ftsZ de Msm (Boldrin et al, 2010).
Nous avons tout d’abord testé les conditions d’utilisation de ce système grâce au gène
rapporteur de la -galactosidase. Nous avons effectué le sous-clonage de la souche de Msm
portant le plasmide pFRA42B sur différentes boites de Pétri contenant chacune une
concentration différente de AH-Tc (25, 50, 100 et 150 ng/mL). Le milieu contenant du X-gal en
concentration adaptée nous a permis d’observer la présence (coloration bleue) ou non (aucune
coloration) de la beta galactosidase (résultats non montrés). Les colonies sous-clonées sur milieu
contenant 25 et 50 ng/mL de AH-Tc montrent une coloration bleue plus intense pour les colonies
de la boite contenant 25 ng/mL de AH-Tc. Contrairement à cela les colonies des boites possédant
100 et 150 ng/mL d’AH-Tc ne montrent aucune coloration. Le système semble donc totalement
réprimé à 100 et 150 ng/mL d’AH-Tc. Par la suite nous avons réalisé l’ensemble des expériences
avec ce système avec une concentration de 100ng/mL d’AH-Tc.
III/ 2 Etude du phénotype de filamentation du mutant conditionnel
ftsZ
Nous avons utilisé les constructions plasmidiques fournies par les auteurs pour construire une
souche de Msm permettant en présence d’AH-Tc d’inhiber l’expression du gène ftsZ. L’obtention
de ce mutant avait été réalisée par transformation et sélection (Hygromycine) du plasmide
pFRA53 dans une souche portant le plasmide pFRA42B. Ceci permettant d’effectuer la mise sous
contrôle du système TetR/Pip OFF du gène ftsZ sauvage complémentant la délétion produite par
le système (Figure 41B). Nous avons ensuite effectué le sous-clonage de 4 colonies sur milieu de
culture solide contenant ou non 100 ng/mL d’AH-Tc ainsi que d’une souche de Msm témoin. Les
4 colonies issues de la transformation du plasmide pFRA53 montrent une croissance normale sur
milieu sans AH-Tc en comparaison avec la souche témoin. Contrairement à cela sur milieu
contenant l’AH-Tc les mutants ne sont pas capables de former des colonies contrairement à la
souche témoin. Cette observation est en adéquation avec le fait que le gène ftsZ soit essentiel.
L’observation en vidéomicroscopie du mutant conditionnel ftsZ en condition non permissive
montre une augmentation importante de la taille des bactéries provoquée par l’incapacité de la
cellule à former un septum de division (Film S17). La taille des cellules en fin de film est
supérieure à 15 µm (Figure 42E,F,G,H,I et J), en comparaison Msm est décrit comme ayant une
82
+ AH-Tc
- AH-TC
Figure 42 : Observation au cours du temps de la croissance de Msm en condition ne
permettant plus l’expression du gène ftsZ. En présence d’AH-Tc (100ng/µL), l’expression
du gène ftsZ est réprimée provoquant l’apparition au cours du temps d’un phénotype de
filamentation (panneau de gauche). En absence d’AH-Tc (panneau de droite) la souche
exprime le gène ftsZ et la croissance est normale. Les images ont été extraites
d’expériences de videomicroscopie et ont été obtenues en lumière transmise. L’échelle est
indiquée en µm.
RÉSULTATS
taille moyenne de 3 à 5 µm (Hett & Rubin, 2008). De façon intéressante, nous avons pu observer
la formation de branchements perpendiculaires à l’axe principal de la bactérie (Figure 42F,H,I et
J) qui ne sont jamais observés sur la souche sauvage. Ce bourgeonnement est capable
d’effectuer une croissance importante pour atteindre dans cet exemple représentatif, 6.8 µm de
longueur, soit une taille supérieure à la taille moyenne de Msm. Cette souche semble donc bien
posséder un phénotype mutant pour FtsZ, c’est-à-dire l’établissement au cours du temps d’un
phénotype de filamentation (Dziadek et al, 2003). En comparaison, la même souche en absence
d’AH-Tc, c’est-à-dire en présence de la protéine FtsZ sauvage, montre en vidéomicroscopie une
élongation, une division, et une taille normales (Film S18). De plus, aucune cellule possédant une
longueur supérieure ou égale à 10 µm n’a été observée. Le phénotype de filamentation semble
donc bien dépendre ici uniquement de l’inhibition de l’expression du gène de ftsZ.
Afin de confirmer l’absence de septum dans les filaments nous avons utilisé le domaine MmpL3N10 fusionné à la GFP comme marqueur du septum. Comme montré figure 43A, aucune
fluorescence transversale à l’axe des filaments n’est observable dans la souche ftsZ en condition
non-permissive (Film S19). Cela semble donc confirmer l’absence de figure de septation et
l’absence de formation de l’anneau ftsZ permettant le recrutement de la membrane plasmique
et donc de la fusion MmpL3-N10. Les cellules sont donc bien incapables d’initier la formation du
divisome (Hett & Rubin, 2008) après quelques heures d’exposition à l’AH-Tc.
III/ 3 Localisation de MmpL3 en condition mutant pour FtsZ
La localisation de la fusion MmpL3-N10-GFP observée en condition ftsZ mutant était comparable
à celle observée en condition sauvage, c’est-à-dire membranaire (Figure 9 ; article). La
localisation du domaine MmpL3-N10 n’est donc pas affectée par la diminution de la
concentration (déplétion) ou l’absence de FtsZ dans la bactérie. Nous avons voulu réaliser
l’observation de la localisation de la fusion de MmpL3 complète avec la GFP en contexte mutant
pour FtsZ. Ceci ne pouvait pas être effectué, comme les autres expériences étudiant MmpL3,
dans la souche produisant la fusion mCherry-Wag31 à cause des incompatibilités de plasmides et
de gènes de résistances. MmpL3-GFP, en condition ftsZ mutante possède une localisation
membranaire. De plus, la concentration au niveau des membranes polaires est encore visible et,
de façon plus intéressante, on remarque une fluorescence plus intense au niveau des pôles des
branches (Figure 43B). De plus, on observe également une déformation importante de la forme
de la cellule typique de l’expression de la fusion MmpL3 dans une souche ne surexprimant pas
Wag31 (Film S20).
83
Figure 43 : Observation au cours du temps de la localisation de la fusion GFP de MmpL3
chez Msm en condition ne permettant plus l’expression du gène ftsZ. (A) Localisation de
MmpL3-N10-GFP au sein de Msm induite par 0,2% acétamide et en condition mutante ftsZ
(100ng/µL AH-Tc). (B) Localisation de MmpL3-GFP complète dans les mêmes conditions. Les
images obtenues en lumière transmise (colonne gauche) ou sur le canal GFP (colonne
droite) sont présentées.
RÉSULTATS
Ces résultats de localisation du domaine MmpL3-N10 et MmpL3 sauvage en condition FtsZ
mutante ne permettaient pas d’effectuer une quantification de la fluorescence polaire et
latérale du fait du nombre trop réduit de bactéries observées à ce jour et de la toxicité générée
par MmpL3-GFP complète. Cependant, il semble bien qu’en absence de FtsZ, des pôles soient
créés pour la formation des branches et que MmpL3 s’accumule aussi bien à ces pôles qu’aux
pôles « normaux » de la bactérie. Ce résultat indique un phénomène de localisation actif à un
nouveau site de croissance et non dans l’axe principal de la bactérie. Cela confirme que la
localisation de MmpL3 aux pôles de la bactérie est un phénomène physiologique et non un
phénomène d’accumulation non spécifique.
III/ 4 Localisation de MmpL3 en condition mutante pour Wag31
Afin d’étudier le rôle potentiel de Wag31 dans la localisation de FAS-II et de MmpL3 K. Nukdee et
moi-même avons effectué la construction d’une souche de Msm mutant conditionnel de wag31
dans laquelle le gène sauvage wag31 est sous contrôle du système TetR/Pip OFF. Ce système a
permis d’obtenir facilement cette souche contrairement aux multiples essais effectués
auparavant avec les systèmes « classiques » d’échange allélique mis en place par exemple dans
le cas de la délétion du gène kasB. Pour permettre une visualisation plus facile du phénotype,
nous avons également réalisé l’observation en vidéomicroscopie de l’apparition du phénotype
dans une souche de Msm exprimant la GFP afin de marquer le cytoplasme des bactéries. Dans
cette souche, l’inhibition de l’expression du gène wag31 provoque rapidement une déformation
progressive des bactéries, généralement au niveau d’un pôle pour donner des bactéries en
forme d’ampoule. Puis, la déformation de la cellule s’étend à l’autre pôle jusqu’à former une
cellule totalement ronde qui lyse rapidement (Film S21). Ces résultats sont totalement en accord
avec les résultats de Kang et collaborateurs obtenus avec un mutant conditionnel wag31 (Kang
et al, 2008). Comme précédemment le phénotype observé est uniquement dépendant de
l’inhibition de l’expression du gène wag31 comme le montre la division normale de la même
souche en absence d’AH-Tc. La forme des cellules non induites est également de type sauvage et
ne présentent pas de lyse apparente. A ce jour, l’observation en absence d’AH-Tc a été réalisée
uniquement dans une souche n’expriment pas la GFP (Film S22).
Nous avons réalisé l’expression de MmpL3 sauvage en fusion avec la GFP dans le mutant
conditionnel wag31. L’observation en vidéomicroscopie nous a permis, en condition non
permissive, de mettre en avant l’arrondissement des cellules typiques d’un mutant Wag31 ainsi
qu’une localisation altérée de la fusion complète MmpL3-GFP (Film S23). Cependant la toxicité à
84
Figure 44 : Observation au cours du temps de la localisation de fusion GFP de Mmpl3 chez
Msm en condition ne permettant plus l’expression du gène Wag31. Les images extraites
de films obtenus en videomicroscopie sont représentées ( canal GFP).
RÉSULTATS
la fois de la déplétion en Wag31 et de la présence de la fusion MmpL3 provoquait une lyse très
rapide des bactéries. Cela rendait très complexe l’étude statistique de la localisation de MmpL3
dans cette souche. La construction d’un système génétique pouvant pallier ce problème a été
entreprise (P. Thevenot ; stagiaire BTS).
Ces résultats bien que très préliminaires semblent indiquer que la localisation polaire de MmpL3
soit affectée dans le mutant conditionnel wag31. En effet, lorsque les cellules sont arrondies
(signe d’une diminution très importante de la quantité de Wag31) il semble que la fusion MmpL3
soit localisée de façon uniforme au niveau de la membrane plasmique (Figure 44). Cette
observation est le premier indice de l’existence d’une interaction fonctionnelle entre Wag31 et
un acteur de la biosynthèse des AM. Il ouvre la voie vers l’étude de la relation entre le cycle
bactérien et la biosynthèse des lipides majeurs de l’enveloppe que sont les AM.
85
DISCUSSION
86
DISCUSSION
Le but de cette étude à long terme était de savoir si la biosynthèse des acides mycoliques
de l’enveloppe mycobactérienne était coordonnée ou non avec les processus d’élongation et de
division bactérienne. Une première approche de réponse à cette question a été d’essayer de
définir le lieu de biosynthèse des AM par la localisation des enzymes effectuant cette
biosynthèse. Pour cela, nous avons réalisé une analyse détaillée, en microscopie de
fluorescence, de la localisation de quatre protéines clés de la biosynthèse des AM. Cette analyse
a été réalisée également par vidéomicroscopie afin d’étudier la dynamique du système. Les
réductases de FAS-II (MabA et InhA) ont été localisées principalement à un pôle de la
mycobactérie. La localisation des condensases de FAS-II (KasA et KasB) était quant à elle
principalement diffuse dans le cytoplasme et la faible proportion de foci visibles était polaire. En
outre, un lien entre la localisation de FAS-II et le cycle bactérien a été mis à jour lorsque la
dynamique de FAS-II a pu être rapprochée de celle de la protéine Wag31 impliquée dans la
biosynthèse apicale du PG mycobactérien.
Avant de discuter de l’apport proprement dit de ce travail dans la connaissance de la
biosynthèse des AM, il est intéressant de noter que le résultat global, qui montre des réductases
localisées et des condensasses diffuses, peut être rapproché du modèle de fonctionnement de
FAS-II proposé par des études précédentes du laboratoire (Cantaloube et al, 2011; VeyronChurlet et al, 2005; Veyron-Churlet et al, 2004), et d’observations plus anciennes non-expliquées
à l’époque (Bardou et al, 1996; Bhatt et al, 2005).
Les travaux réalisés au sein du laboratoire visant à étudier l’interactome de la
biosynthèse des AM avaient montré l’existence de complexes spécialisés de biosynthèse des AM
centrés sur les réductases MabA et InhA et la protéine FabD et dont la spécificité serait apportée
par les condensases FabH, KasA, ou KasB (Cantaloube et al, 2011; Veyron-Churlet et al, 2005;
Veyron-Churlet et al, 2004). Dans ce modèle, les condensases KasA et KasB sont susceptibles, de
« diffuser » de complexes en complexes pour participer à la synthèse initiale, puis terminale, des
AM. Cette différence sur le plan des interactions protéines-protéines a été retrouvée au niveau
de leur localisation dans cette étude. Les réductases du système seraient donc localisées
généralement à l’ancien pôle alors que les condensases de FAS-II pourraient se localiser de façon
transitoire tout en étant essentiellement diffuses dans le cytoplasme. Des résultats plus anciens
avaient présenté les effets induits par la délétion de la réductase InhA ou de la condensase KasA.
87
DISCUSSION
Des souches mutantes conditionnelles d’inhA ou de kasA placées en condition non-permissives,
montraient, en microscopie électronique à balayage, une déformation des cellules différentes
dans ces deux cas (Bhatt et al, 2005). La souche mutante d’inhA présente une perte localisée de
matériel au niveau de l’enveloppe (« blebs formation ») et une déformation globale assez forte
de la bactérie. Contrairement à cela, la mutation conditionnelle de kasA provoque uniquement
une déformation localisée des cellules, moins importante que dans le cas d’inhA et sans
formation de « bulles » suggérant la perte de matériel. Les auteurs de cette étude discutent de la
différence profonde de phénotype mais ne peuvent l’expliquer. Même s’il est difficile de
modéliser la relation entre la localisation et les effets phénotypiques que nous avons observé. Il
est intéressant de noter que les mutations de kasA et de inhA devraient avoir le même effet sur
l’enveloppe, or cet effet est différent. De la même façon, leur localisation est différente dans la
bactérie. Enfin, une autre étude ancienne a montré que l’INH provoquait la lyse des bactéries par
les pôles (Bardou et al, 1996). L’INH pourrait avoir un effet bloquant pouvant « tuer »
brutalement FAS-II alors que la déplétion en enzyme de FAS-II pourrait simplement diminuer
progressivement la biosynthèse et provoquer un défaut de couverture en AM de la bactérie. En
conclusion, ces résultats traduisent un comportement phénotypique différent des réductases et
des condensases de FAS-II cohérent avec nos résultats.
La biosynthèse de la mycomembrane est-elle polaire ?
IL est complètement admis que l’ancien pôle correspond à la zone de croissance
pariétale principale des mycobactéries (Aldridge et al, 2012; Joyce et al, 2012; Singh et al, 2013).
En revanche, même si ces résultats sont actuellement débattus (Santi et al, 2013; Wakamoto et
al, 2013) l’ensemble des auteurs s’accorde à dire que la concentration maximale de Wag31 est
un marqueur de l’ancien pôle : le pôle de croissance. Or, la biosynthèse du PG au pôle est
d’autant plus importante que Wag31 s’y localise (Kang et al, 2008). Il semble donc possible, d’un
point de vue théorique, que l’élongation des mycobactéries soit asymétrique. Les différences de
résultats observés entre ces auteurs peuvent être dues à l’utilisation de systèmes expérimentaux
différents comme le propose Santi et collaborateurs. La localisation des protéines de FAS-II au
même pôle que la protéine Wag31 indique donc que la localisation de FAS-II s’établit aussi à
l’ancien pôle. Cette localisation aux pôles de croissance confirme que nos observations reflètent
la localisation naturelle des complexes FAS-II. De plus, la dynamique des protéines de FAS-II
(notamment MabA) montre une localisation (ou relocalisation) de la fluorescence au niveau des
pôles spetaux (nouveaux pôles) similaires à celle de Wag31, juste avant la division des bactéries.
88
DISCUSSION
Comme pour la biosynthèse du PG, la division entre les deux cellules filles nécessite une
biosynthèse d’AM intense pour maintenir l’intégrité de l’enveloppe. Des images étonnantes
obtenues en microscopie électronique semblent indiquer que l’enveloppe néo-synthétisée au
septum est structurellement indépendante de l’enveloppe latérale au moment de la formation
du septum de division (Vijay et al, 2012). Concrètement les constituants de l’enveloppe, et
notamment la couche d’AM au niveau du septum, ne semblent pas liés physiquement aux
constituants de l’enveloppe latérale. Cela implique donc le recrutement d’un complexe de
biosynthèse des constituants de l’enveloppe à ce niveau et probablement aussi le recrutement
des transporteurs de ces constituants. Ceci est en accord avec nos résultats qui montrent à la
fois la localisation des enzymes de FAS-II et du transporteur MmpL3 au niveau des pôles septaux
avant la division. Ceci est aussi en accord avec les travaux de Backus et collaborateurs qui
localisent également l’activité des mycoloyl transférases (FbpA,B et C) aux pôles et au septum
(Backus et al, 2011). En résumé, les protéines impliquées à la fois dans l’élongation, le transport
et la fixation des AM sur l’arabinogalactane sont localisées aux pôles. Il semble donc hautement
probable que la biosynthèse des AM soit réalisée aux pôles (notamment l’ancien) puis qu’elle se
re-localise dynamiquement au futur site de division. Les travaux de Makarov et collaborateurs
indiquent que l’inhibition de la biosynthèse du précurseur de l’arabinoglactane (l’arabinane)
induit une lyse polaire des bactéries (Makarov et al, 2009). Ces résultats (semblables à ceux
obtenus avec l’INH précédemment (Bardou et al, 1996)) pourraient indiquer que le pôle des
mycobactéries soit un point de fragilité de l’enveloppe que l’on pourrait comparer à la
« fragilité » de la région septale de E.coli lors de la division. Cette fragilité pourrait s’expliquer
par le fait que l’ensemble du complexe PG-AG-AM pourrait être synthétisé au pôle. En effet, de
façon logique le lieu de synthèse sera le premier affecté par l’inhibition de cette biosynthèse
contrairement aux structures synthétisées au préalable et déjà structurées.
Interaction fonctionnelle avec Wag31 ou simple couplage spatio-temporel ?
Le couplage de la localisation des enzymes de biosynthèse des AM et du PG ne semble
pas dirigé directement par la protéine Wag31. En effet, nos travaux suggèrent qu’il n’y a pas
d’interaction directe entre les protéines de FAS-II et la protéine Wag31. Cependant, Wag31
demeure une piste intéressante susceptible de pouvoir intervenir dans la localisation du
complexe FAS-II aux pôles de manière indirecte. Les résultats obtenus lors de la localisation de
MmpL3 en contexte mutant pour Wag31, discutés par la suite, semblent soutenir cette pensée. Il
serait en outre intéressant d’effectuer une recherche plus poussée des partenaires d’interaction
89
DISCUSSION
de Wag31 (Mukherjee et al, 2009b), afin de tester l’hypothèse d’une interaction directe ou
indirecte avec les protéines de FAS-II. Des travaux initiés par K. Nukdee avaient pour but de
poursuivre la localisation des protéines de FAS-II dans un contexte Wag31 mutant. En effet, si la
localisation de FAS-II est dépendante de Wag31, il devrait être possible d’observer une
délocalisation de nos fusions. Cela permettrait alors de vérifier si un lien existe vraiment entre la
protéine Wag31 et la localisation de FAS-II.
Localisation physiologique ou agrégation artefactuelle ?
L’ensemble de nos travaux démontre l’existence d’une localisation polaire et septale
d’enzymes de la biosynthèse des AM. Cependant, des travaux effectués grâce à l’observation de
fusions traductionnelles de la GFP exprimées de façon ectopique sont risqués et peuvent être la
cible de critique. Ces critiques auraient pu être fondées mais nous avons, dans ce travail, de très
nombreux arguments démontrant la nature « physiologique » de ces localisations. Chez E.coli, ce
type de construction pouvait conduire à la formation de corps d’inclusion dû à la mauvaise
conformation des protéines et à la surexpression des fusions (Mitraki & King, 1989). Ces corps
d’inclusion ont tendance à former des foci situés, chez E.coli, majoritairement aux deux pôles
(~60 % des cellules) et de façon beaucoup moins fréquente à un seul pôle (~20 % des cellules)
(Winkler et al, 2010). Les auteurs localisent également les corps d’inclusion entre les
chromosomes avec une localisation simultanée à 1 ou 2 pôles. Cette localisation nonphysiologique est induite par la présence des nucléoïdes qui physiquement excluent les corps
d’inclusion aux extrémités de la cellule et dans l’espace inter-nucleoïdique (Winkler et al, 2010).
La présence de ces corps d’inclusion induit un ralentissement du taux de croissance des
bactéries. Il existe différents paramètres favorisant la formation de corps d’inclusion notamment
une expression très forte à température élevée. La nature de la protéine est également
impliquée et est peut-être le paramètre principal qui régit la formation de ces structures. Les
pôles des mycobactéries sont des lieux actifs regroupant des processus essentiels à la survie de
Mtb mais également à sa pathogénicité. L‘accumulation de corps d’inclusion aux pôles ne doit
pas conférer aux mycobactéries un avantage sélectif alors que ceci peut être le cas pour E.coli
(Lindner et al, 2008). Nous n’avons pas observé de ralentissement du taux de croissance en
présence de nos fusions qui sont produites par un système inductible régulable. De même, leur
localisation au niveau du pôle de croissance (90 % des bactéries pour InhA et MabA) indique que
la localisation n’est pas aléatoire. Il est fort peu probable que les mycobactéries possèdent un
système d’adressage spécifique des corps d’inclusion au pôle de croissance. De plus, comme discuté
90
DISCUSSION
dans l’article nous avons observé la séparation, lors de la division, des foci au niveau des septum
comparable à la séparation du polarisome chez Streptomyces (Richards et al, 2012). Cette
observation est en opposition avec le comportement des corps d’inclusion au cours de la division
chez E.coli. Ils sont majoritairement exclus des cellules filles et non « clivés » (Lindner et al,
2008). Les films présentés montrent clairement que ceci n’est pas le cas ici. La fonctionnalité des
constructions KasB et InhA atteste également de la faible probabilité que les localisations
observées soient dues à la formation de corps d’inclusion. Cependant nous ne pouvons pas
exclure cette possibilité car nous ne possédons pas de preuve formelle de l’absence de corps
d’inclusion. Mais il est à noter que les foci observés pour Wag31, produit par un promoteur fort
constitutif (pHSP60) sont comparables à ceux observés pour les protéines de FAS-II et ne sont
plus du tout contestés dans la littérature (Kang et al, 2008; Santi et al, 2013). L’approche
complémentaire par l’immunofluorescence aurait pu nous permettre de confirmer les
observations réalisées avec la GFP. Il s’est avéré que cette technique, pourtant mieux acceptée,
conduisait à des résultats beaucoup plus artefactuels.
Nous avons donc accumulé des preuves indirectes énumérées ci-dessus qui confirment la
nature « physiologique » de la localisation in vivo de FAS-II. Actuellement des projets de
localisation en cours d’en d’autres laboratoires (non encore publiés) sont réalisés par
l’intermédiaire de la fusion d’une protéine fluorescente directement au niveau du gène sauvage
permettant ainsi d’exprimer la fusion en condition plus naturelle. Cette technique nécessite
l’intégration d’un plasmide suicide au niveau du gène d’intérêt avant son excision pour former la
fusion. Cela n’a jamais à notre connaissance été réalisé sur un gène impliqué dans un opéron. En
effet, l’insertion complète d’un plasmide au sein d’un opéron a de fortes probabilités de créer un
effet polaire sur les gènes en aval. Ce genre d’approche lorsqu’elle a été utilisée pour étudier
l’essentialité des gènes de Mtb avait, en première instance, conduit à de nombreux résultats
erronés présents dans la littérature (Sassetti et al, 2003; Zhang et al, 2012). Nos gènes sont tous
impliqués dans des opérons composés de gènes essentiels. Il semble donc que même
actuellement cette technique ne puisse être facilement appliquée pour l’étude de la localisation
du système FAS-II.
L’enzyme KasB est-elle Impliquée dans le contrôle de la longueur des AM de Msm ?
L’étude de la longueur des AM de la souche délétée du gène kasB nous a permis de montrer que
KasB était responsable de la synthèse terminale des AM chez Msm. Ces résultats étaient en
91
DISCUSSION
adéquation avec les travaux précédents chez Mtb et M.marinum (Bhatt et al, 2007a; Gao et al,
2003b). La complémentation d’un mutant kasB par la fusion traductionnelle du gène de kasB
avec celui de la GFP nous a permis de prouver la fonctionnalité de la fusion in vivo. De plus, les
études de complémentation avec le gène seul de kasB de Mtb ou de Msm indiquent que la
longueur des AM est déterminée en partie par la quantité de KasB. Cela pourrait être dû à la
déstabilisation de la stœchiométrie des complexes spécialisés de biosynthèse des AM. En effet,
l’augmentation de la quantité de KasB pourrait induire une formation accrue de complexes
d’élongation E2-FAS-II permettant une élongation plus importante des chaînes méromycoliques.
Cela semble également signifier que structurellement KasB est capable d’effectuer une
élongation plus importante et que, chez la souche sauvage, la longueur des AM soit déterminée
par le niveau d’expression du gène kasB. Il serait donc intéressant de savoir s’il existe une
régulation transcriptionnelle de ce gène permettant de modifier la longueur de chaîne des AM
en fonction des conditions environnementales. Cette étude a également montré que KasB n’est
pas impliquée dans la synthèse des Alpha’-AM. On peut supposer qu’in vivo la chaîne
méromycolique de ces AM soit synthétisée uniquement par le complexe E1-FAS-II.
Un rôle de MmpL3 dans la localisation de la biosynthèse des AM ?
La protéine MmpL3 a été décrite comme effectuant le transport des AM sous forme de TMM à
travers la membrane plasmique chez les mycobactéries (Grzegorzewicz et al, 2012b; Varela et al,
2012). Nos résultats d’observation de cette protéine en vidéomicroscopie ont montré une
localisation membranaire de la fluorescence concentrée surtout au niveau des pôles. Ce résultat
est en accord avec la fonction de MmpL3 et indique également que le domaine C-terminal, le
point de fusion avec la GFP, est cytoplasmique. De plus, nous avons montré que le domaine
responsable de la localisation polaire de MmpL3 était le domaine C-terminal. En effet, ce
domaine est capable de se localiser de façon automne aux pôles contrairement au domaine
membranaire MmpL3-N10. L’absence de localisation de ce domaine membranaire tronqué
atteste que la localisation de MmpL3 ne semble pas être due à un adressage spécifique aux pôles
par le système d’export des protéines. Il est possible que MmpL3 soit adressée à la membrane
sans localisation précise et que le domaine cytoplasmique, une fois correctement positionné,
définisse sa localisation préférentielle. Ce modèle de localisation est appelé diffusion-capture
(Rudner et al, 2002). Il a été définit par Rudner et collaborateurs concernant la localisation de
SpoIVFB (protéine de sporulation de B.subtilis). Cette protéine est adressée à la membrane puis
diffuse en 2 dimensions le long de la membrane plasmique et est capturée par des partenaires
92
DISCUSSION
uniquement présents à la membrane de la spore. Ce mécanisme nécessite une protéine capable
d’ancrer ses partenaires. Dans le cas de localisation polaire, la protéine centrale des mécanismes
de localisation est la protéine Wag31. On peut donc supposer que MmpL3 soit adressée, diffuse
le long de la membrane plasmique, puis soit capturée directement ou indirectement par Wag31
grâce à son domaine cytoplasmique. Nos résultats, sur les bases moléculaires de la localisation
de MmpL3, semblent soutenir ce modèle. Des études complémentaires d’interactions (B2H), du
domaine cytoplasmique de MmpL3 contre une banque génomique ont été envisagées et
pourraient permettre de définir les partenaires de MmpL3 permettant sa localisation. Ce projet
pourra également permettre de définir les interactions probables entre MmpL3 et les enzymes
de FAS-II, notamment celle du complexe de terminaison T-FAS-II. L’existence de ces interactions
pourrait fournir une base structurale à l’existence d’interactions fonctionnelles entre l’export des
AM et leur biosynthèse. Avec nos résultats mis en perspective, ceci conduirait à la mise à jour
d’un lien entre la biosynthèse de la mycomembrane et celle de l’enveloppe dans sa totalité avec
le cycle cellulaire mycobactérien.
93
CONCLUSION
94
CONCLUSION
L’objectif de mon projet de thèse était de définir la localisation de la biosynthèse des AM
à travers la localisation de quatre protéines (MabA, InhA, KasA, KasB) impliquées dans cette voie
de biosynthèse ainsi que du transporteur des AM : MmpL3. Ce travail avait été initié par S.
Cantaloube à la fin de sa thèse. L’amélioration des conditions d’expression et d’observation
notamment à travers la vidéomicroscopie nous a permis d’établir l’existence d’une localisation
polaire dynamique de ces quatre protéines au cours de la croissance de Msm. De plus, notre
étude de fonctionnalité des fusions semble indiquer que cette localisation est de nature
physiologique.
Les enzymes étudiées sont impliquées dans le cycle d’élongation FAS-II de la chaîne
méromycolique des AM. L’ensemble des protéines du système FAS-II avait été montré au cours
d’études précédentes menées dans le laboratoire comme formant un interactome défini par des
interactions protéines-protéines spécifiques et essentielles. La localisation des protéines isolées
pourrait donc indiquer l’existence d’une localisation polaire de l’ensemble des protéines de FASII signifiant que les complexes de biosynthèse des AM pourraient être stables in vivo. De plus, la
présence du système FAS-II au niveau du pôle pourrait traduire le fait que la biosynthèse des AM
est réalisée principalement aux pôles de croissance des mycobactéries. Cette hypothèse est
soutenue par nos études réalisées cette fois-ci sur la localisation du transporteur des AM à
travers la membrane plasmique qui est membranaire et aussi majoritairement polaire.
Nos résultats suggèrent une localisation polaire de la biosynthèse des AM comme les études
s’intéressant à la localisation de la biosynthèse du PG. Il est possible d’imaginer, d’après des
travaux publiés que la biosynthèse de l’arabinogalactane pourrait être réalisée également aux
pôles (Makarov et al, 2009). En rappelant que ces trois molécules sont liées covalemment, il
semble plausible que l’ensemble de la biosynthèse du squelette de l’enveloppe s’effectue au
niveau des pôles mycobactériens.
Plusieurs protéines impliquées dans la biogénèse de l’enveloppe sont la cible d’antibiotiques
utilisés dans le cadre de la lutte contre la tuberculose. Ceci indique que ces cibles sont efficaces
pour permettre d’éradiquer la bactérie au sein de l’organisme. Cependant, devant
l’augmentation du nombre de cas de tuberculose MDR ou XDR il est urgent de développer de
nouveaux antibiotiques et de définir de nouvelles stratégies de traitement. Les bases
moléculaires de la localisation des enzymes de biosynthèse à la fois du PG et des AM pourraient
dépendre de la protéine du pôle Wag31. En effet, nos résultats semblent attester d’un couplage
95
CONCLUSION
spatio-temporel de la localisation des protéines de FAS-II et de la protéine Wag31. De plus,
certains résultats, préliminaires, des bases moléculaires de la localisation de MmpL3 semblent
désigner Wag31 comme une ancre polaire potentielle de ce transporteur. L’étude des
interactions physiques entre Wag31 est les enzymes de biosynthèse du PG et des AM, dans le
but de les cibler, pourrait définir un nouveau mode d’inhibition de ces deux processus essentiels
à la survie de Mtb. L’inhibition d’interaction à but thérapeutique a déjà été proposée pour lutter
contre la tuberculose (Lin et al, 2012).
Même si mon projet de thèse était de type « fondamental », les résultats qui en découlent
semblent à même de définir un nouvel angle d’attaque de Mtb et donc de nouvelles cibles
thérapeutiques. Cela pourrait à terme donner lieu au développement de nouveaux projets de
recherche visant à développer de nouveaux antibiotiques efficaces.
96
MATÉRIEL &
MÉTHODES
97
MATÉRIEL & MÉTHODES
IV.
Matériel génétique
IV/ 1 Souches microbiennes utilisées
Espèce
Souche
Description
DZ137
malP ::lacIq, srlC ::Tn10, recA1, araD Δ(araleu), galE, galK, ΔlacX74, fsdR (rk-mk-), rpsL Laboratoire
(StrR)
Escherichia coli
DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96
deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA- Hoffman-Berling
argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–
Escherichia coli
MG1655
F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1
K. Cam
Mycobacterium mc2155
smegmatis
ATCC 70084
ept-1
(Snapper et al.,
1990)
Mycobacterium
kasB ::Zeo
smegmatis
ept-1, ΔkasB, ZeoR
C. Carel
Mycobacterium
kasB ::Kan
smegmatis
ept-1, ΔkasB, KanR
C. Carel
Escherichia coli
Source
Tableau 1 : Liste de souches utilisées et leurs caractéristiques génotypiques.
IV/ 2 Plasmides utilisés et construits
Nom
Description
Source
KanR, vecteur navette E. coli/mycobactéries, les gènes
clonés sont sous la dépendance du promoteur pHSP60
KanR, vecteur E. coli, promoteur pHSP60, intégratif chez
les mycobactéries (AttP-L5, int)
(Stover
al.,1991)
(Stover
al.,1991)
pGAD-T7
GAL4(769-881)AD, LEU2, AmpR, HA epitope tag
Clontech®
pGBK-T7
GAL4(1-147)AD, TRP1, KanR, C-myc epitope tag
Clontech®
pMV261
pMV361
pLAM12
pJVH 53
KanR, vecteur navette E. coli/mycobactéries, les gènes
clonés sont sous la dépendance du promoteur de
l’acétamidase inductible à l’acétamide
HygroR, vecteur navette E. coli/mycobactérie, les gènes
codant les protéines du recombineering sont clonés sous la
dépendance du promoteur pamiE, inductible à l’acétamide
98
et
et
(van Kessel &
Hatfull, 2007)
(van Kessel &
Hatfull, 2007)
MATÉRIEL & MÉTHODES
pFRA42B
pFRA53
StreptoR, vecteur navette E. coli/mycobactéries, intégratif
mycobactérie. Gènes clonés sous la dépendance du système
TetR/Pip OFF
AmpR HygroR, vecteur E.coli, vecteur suicide mycobactérie.
Contient 500 pbs de ftsZ de Msm en aval promoteur Pptr
(Boldrin et al,
2010)
(Boldrin et al,
2010)
Veyron et al.,
2004
Veyron et al.,
2004
Veyron et al.,
2004
Veyron et al.,
2004
Veyron et al.,
2004
pGAD::kasA
Gène kasA cloné dans pGAD
pGAD::kasB
Gène kasB cloné dans pGAD
pGAD::mabA
Gène mabA cloné dans pGAD
pGAD::inhA
Gène inhA cloné dans pGAD
pGAD::mtFabH
Gène fabH cloné dans pGAD
pGAD::nat
Gène nat cloné dans pGAD
C. Carel
pGAD::parA
Gène parA cloné dans pGAD
C. Carel
pGAD::murC
Gène murC cloné dans pGAD
C. Carel
pGAD::wag31
Gène wag31 cloné dans pGAD
C. Diagne
Veyron
2004
Veyron
2004
Veyron
2004
Veyron
2004
Veyron
2004
et al.,
pGBK::kasA
Gène kasA cloné dans pGBK
pGBK::kasB
Gène kasB cloné dans pGBK
pGBK::mabA
Gène mabA cloné dans pGBK
pGBK::inhA
Gène inhA cloné dans pGBK
pGBK::mtfabH
Gène fabH cloné dans pGBK
pGBK::wag31
Gène wag31 cloné dans pGBK
C. Diagne
pGBK::lam
Gène lam cloné dans pGBK
Clontech®
pGBK::nat
Gène nat cloné dans pGBK
C. Carel
pGBK::parA
Gène parA cloné dans pGBK
C. Carel
pGBK::murC
Gène murC cloné dans pGBK
C. Carel
pLAM12::gfp
Gène gfp cloné dans pLAM12
K. Nukdee
pLAM12::gfp-mabA
Gène gfp cloné dans pLAM12 ::mabA
K. Nukdee
pLAM12::gfp- inhA
Gène gfp cloné dans pLAM12 ::inhA
K. Nukdee
pLAM12::gfp- kasA
Gène gfp cloné dans pLAM12 ::kasA
K. Nukdee
pLAM12::gfp- kasB
Gène gfp cloné dans pLAM12 ::kasB
K. Nukdee
99
et al.,
et al.,
et al.,
et al.,
MATÉRIEL & MÉTHODES
pLAM12::kasB
Gène kasB cloné dans pLAM12
pLAM12::kasB
(Msm)
Gène kasB Msm cloné dans pLAM12
C. Carel
Gène mmpl3 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-N12-1 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-12-2 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-N10 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-1 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-2 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-3 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-4 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-5 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C12-6 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
Gène mmpl3-C10 cloné dans pLAM12 ::gfp
C. Carel
pLAM12::mmpl3-gfp
pLAM12::mmpl3N12-1- gfp
pLAM12::mmpl3N12-2- gfp
pLAM12::mmpl3N10- gfp
pLAM12::mmpl3C12-1- gfp
pLAM12::mmpl3C12-2- gfp
pLAM12::mmpl3C12-3- gfp
pLAM12::mmpl3C12-4- gfp
pLAM12::mmpl3C12-5- gfp
pLAM12::mmpl3C12-6- gfp
pLAM12::mmpl3C10- gfp
pFRA-wag31
500 pbs de wag31 (Msm) dans pFRA53
K.Nukdee
K. Nukdee
pMV361::mcherry
Gène mcherry cloné dans pMV361
C. Carel
pMV361::mcherrywag31
Gène mcherry cloné dans pMV361::wag31
C. Carel
100
MATÉRIEL & MÉTHODES
V.
Conditions de culture
V/ 1 Cultures d'Escherichia coli
E.coli est cultivée à 37°C en milieu Luria-Broth (Miller's LB Broth Base®), additionnée
d’agar (LBA) pour les cultures en milieu solide. Les antibiotiques utilisés, si nécessaires, sont
l'ampicilline (150µg/mL), kanamycine (50µg/mL), hygromycine (150µg/mL), chloramphénicol
(25µg/mL) et la streptomycine (20µg/mL)
V/ 2 Culture de Mycobacterium smegmatis
La souche Msm mc²155 est cultivée à 37ºC en milieu 7H9 (Difco) additionné de : 0,05%
de Tween 80, 10% (v/v) ADC, 0.5% (v/v) glycérol pour les cultures liquides, et en 7H10 ou 7H11
(Difco) additionné de 10% (v/v) d’OADC pour les cultures sur milieu solide. Selon le milieu
sélectif, les antibiotiques utilisés seuls ou en combinaison étaient: la kanamycine (50µg/ml),
l’hygromycine B (150µg/ml), la zéocine (10µg/mL) ou la streptomycine (20µg/mL).
VI.
Construction des vecteurs et manipulation d’ADN.
VI/ 1 Manipulation de l'ADN
Les préparations, et purification d’ADN plasmidique ainsi que les extractions d’ADN
linéaires depuis les gels d’agarose sont réalisées à l’aide des kits proposés par Qiagen®, en
suivant les protocoles fournis. Les hydrolyses enzymatiques d’ADN par les différentes enzymes
de restriction (Biolabs, Promega, Fermentas) sont réalisées en suivant les recommandations des
fournisseurs. Pour les constructions de plasmides recombinants, les ligations de fragments
d’ADN se font en respectant un rapport molaire 1:5 entre le vecteur (~1µg) et l’insert, en
présence de 1µl de T4 DNA ligase (Biolabs®) dans le tampon d’incubation de la ligase (1X), dans
un volume final de 30µl. La réaction a lieu sur une nuit à 16ºC.
La séparation des molécules d’ADN est faite par électrophorèse sur gel d’agarose
(Qbiogene) à 0.8% dans un tampon de migration TAE 1X (10mM Tris, 40mM acide acétique,
1mM EDTA pH8.0). Avant le dépôt, l’ADN est dilué dans du tampon de charge 6X (Fermentas) à
une concentration finale de 1X. Après migration, l’ADN est révélé par illumination sous les UV à
254nm grâce à un dispositif Alpha-imager après incubation dans une solution de bromure
d’éthidium (~1µg/ml - 10min)
101
MATÉRIEL & MÉTHODES
Toutes les constructions réalisées dans ce travail ont été vérifiées par cartographie de
restriction puis séquençage d’ADN(Millegen).
VI/ 2 Amplification par Réaction de Polymerisation en chaîne (PCR)
Les gènes mycobactériens sont amplifiés par PCR à partir de Bacmides issus d’une banque BAC
génomique de la souche Mtb H37Rv (Institut Pasteur-Paris) ou d’ADN génomique dans le cas de
Msm. Les réactions de PCR [5 min, à 98°C, 27X(30s, à 98°C ; 30s, à Tm +3°C ; 15s - 5 min selon la
taille du gène, à 72°C) ; 5min, à 72°C ] ont lieu dans un volume final de 50µL contenant 1µL de
polymérase phusion (Fermentas), son tampon de réaction (1X final), un mélange de dNTPs (200
µM), la matrice ADN (~10ng de BAC, plasmide ou ADN génomique) et les deux oligonucléotides
(1 µM) correspondant à la matrice.
VII.
Préparation de cellules compétentes (technique de Mandel &
Higa)
VII/ 1 Escherichia coli
A partir d’une préculture saturée d’E.coli, une dilution au 100ième est réalisée en milieu LB. La
culture (30ml) est incubée à 37°C jusqu'à atteindre une DO (600nm) de 0,35 puis est centrifugée
(5000rpm, rotor JA25-5 beckmann) pendant 10 minutes à 4°C. Le culot est resuspendu dans 5 mL
de CaCl2 (0.1M) froid et stérile. Les cellules sont ensuite incubées 30 minutes sur glace puis
centrifugées (5000rpm, rotor JA25-5 beckmann) pendant 10 minutes à 4°C. Le culot est repris
dans 300µL de CaCl2 additionné de glycérol stérile (15% final) puis stocké à -80°C dans des tubes
stériles (Nunc®).
VII/ 2 Mycobacterium smegmatis
Une préculture de Msm mc²155 est réalisée en 7H9 (5mL) additionnée de tween80 (0,05% final)
et d’antibiotiques si nécessaire. Elle est incubée 2 à 3 jours à 37°C, (180rpm). Cette culture est
diluée (500X dans un milieu identique) dans un volume de 100mL puis laissée en culture jusqu’à
une DO (600nm) de 0,5. La culture est alors incubée sur glace (1 heure) puis centrifugée (10
minutes, 3000G, 4°C) et le culot est repris dans 40mL d’H2O + tween80 (0,05% final) stérile et
froid. On procède à 3 lavages successifs puis le culot est repris en final dans 1mL d’ H2O +
glycérol 10% froid et stérile. Les cellules sont distribuées en aliquots de 200µL dans des tubes
stériles puis stockées à -80°C. Dans le cas des cellules compétentes utilisées pour le
102
MATÉRIEL & MÉTHODES
recombineering le protocole détaillé utilisé est celui décrit dans la publication (van Kessel &
Hatfull, 2007).
VIII. Transformation des cellules compétentes.
VIII/ 1
Escherichia coli
Les produits de réaction de ligation (15µL) sont ajoutés respectivement à 100µL des cellules
compétentes. Un contrôle négatif (sans ADN) et un contrôle positif (avec ~200µg du vecteur
parental) sont réalisés dans les mêmes conditions afin de s’assurer de l’efficacité de la
transformation. Après incubation sur la glace (20 min) les cellules sont soumises à un choc
thermique à 42°C (2 minutes) ce qui entraine la pénétration de l’ADN dans les cellules. Après
ajout de LB (1 mL) les cellules sont incubées à 37°C (1 heure) pour permettre l’expression
phénotypique. La solution de transformation est ensuite étalée (200µL) sur milieu sélectif solide
et incubée à 37°C. Les colonies sont ensuite sous-clonées, sur boites sélectives (patchs) pour
éliminer d’éventuelles colonies satellites et pouvoir procéder aux minipréparations d’ADN
plasmidique.
VIII/ 2
Mycobacterium smegmatis
Les cellules compétentes (100µL) sont incubées quelques minutes sur glace en présence de
d’ADN dialysé (1µg) et de glycérol 10% froid et stérile (100µL). Un témoin négatif (sans ADN) et
un témoin positif (vecteur parental) sont aussi réalisés suivant les mêmes conditions. L’électrotransformation se fait à l’aide du Biorad® Gene-Pulser™ (2,5kV, 25µF et 1000Ω) dans des
cuvettes de 2 mm. Après le choc électrique, les cellules sont reprises extemporanément dans du
7H9 (1mL) et incubées 3 heures à 37° pour permettre l’expression phénotypique. On étale
ensuite 200µL de chaque transformation sur boites sélectives, lesquelles sont incubées à 37°C (3
à 4 jours).
IX.
Co-immunoprécipitation
IX/ 1 Transcription/traduction in vitro
La transcription/traduction des gènes clonés dans les vecteurs pGADT7 ou pGBKT7, a été réalisée
in vitro en présence de 1µg d’ADN à l’aide du kit TnT Quick Coupled Transcription/Translation
System (Promega®). Les réactions sont faites en présence de 0,4µCi/µL de L-[35S] Methionine
103
MATÉRIEL & MÉTHODES
(1175 Ci/mmol) ou de L-Methionine froide (40µM final). La réaction se déroule à 30°C durant 90
minutes.
IX/ 2 Immunoprécipitation et lavage
Pour chaque réaction de Co-IP, les billes magnétiques « coatées » (10µL) sont lavées avec 100µL
de PBS-BSA puis resuspendues dans 300µL de tampon d’incubation (50mM NaCl ; 50mM Tris HCl
pH 7.4 ; 0.025% tween 20). Après ajout du volume approprié de la h-protéine (protéine avec
l’étiquette HA) et du volume correspondant de la c-protéine (protéine avec l’étiquette c-myc),
les billes sont incubées 2 heures sur une roue agitante à 4°C, elles sont ensuite lavées 3 fois avec
300µL de tampon de lavage (100mM NaCl ; 100mM Tris HCl pH 7.4 ; 0.025% tween 20), puis
resuspendues dans 20µl de tampon de migration pour protéines 1X. Les protéines restées fixées
sur les billes sont dénaturées pendant 2 min à 80°C puis analysées directement par
électrophorèse sur gel SDS-PAGE.
IX/ 3 Analyse des protéines sur gel SDS-PAGE
Après immunoprécipitation, les protéines dénaturées sont analysées par électrophorèse sur gel
de polyacrylamide (Novex® Tris-Glycine 4-20%). La migration se fait pendant 1 heures et 20
minutes à 150V constant (30-40 mA) dans un tampon de migration (Tris Glycine 1X; SDS 10%). Le
standard de taille utilisé est le Prestained Protein Marker (Biolabs). Après migration le gel est fixé
(30% méthanol : 10% acide acétique) pendant 30 minutes, il est ensuite déshydraté dans un bain
de méthanol à 70% pendant 5 min puis séché à chaud sous vide sur papier pendant 30 minutes.
Le gel sec sert ensuite à impressionner un écran révélé par un dispositif PhosphorImager après
une nuit d’exposition.
IX/ 4 Préparation des « billes magnétiques » pour Co-IP
Les billes Dynabeads M450 Goat anti-Mouse IgG (200µL) sont lavées 3 fois avec 300µl de PBS
stérile (composition PBS). Les lavages s’effectuent en fixant les billes quelques secondes sur un
portoir magnétique et en éliminant le surnageant. Les billes sont ensuite incubées avec 1ml de
PBS-BSA à 0.01% et 4µL d’anticorps monoclonaux de souris (Sigma®) pendant une nuit sur une
roue agitante à 4°C. Après incubation, les billes sont lavées 3 fois avec 1ml de PBS-BSA 0.01%,
enfin elles sont reprises dans 100µl de PBS-BSA 0.01%.
104
MATÉRIEL & MÉTHODES
X.
Quantification relative en cinétique de l’expression des fusions
GFP
X/ 1 Quantification relative fluorimétrique
Les cultures de Msm portant les plasmides d’intérêt ont été induites avec 0.2% d’acétamide en
phase logarithmique précoce (DO=). Les cultures sont ensuite suivies par densité optique à 690
nm et la fluorescence est mesurée toute les 2 heures. Nous avons utilisé le lecteur de
fluorescence Flx800 (Biotek instruments, INC) avec une sensibilité de 30 et une longueur d’onde
d’excitation et d’émission de 485/525 nm. Les acquisitions ont été réalisées en triplicate dans
des plaques 96 puits (optiplate, marque ??) avec des dilutions sériées de chaque culture. Les
données ont été traitées de façon à obtenir des valeurs indépendantes de la densité optique
grâce à la formule suivante :
Fluorescence spécifique = ((Féchantillon - Fmilieu) / DOéchantillon) x (DOcontrole / (Fcontrole - Fmilieu))
Les mesures de chaque échantillon obtenu avec cette formule ont été rentrées dans un tableur
(Prism) afin de réaliser les graphiques.
X/ 2 Quantification relative en western blot
En parallèle un suivi de l’expression au cours du temps a été réalisé en western blot. Avant
induction et toutes les deux heures après induction, 2mL de chaque culture, ont été prélevés en
parallèle de la prise de DO. Chaque échantillon a été centrifugé et repris dans du tampon de
charge SDS-PAGE de façon à déposer sur gel la même quantité de cellules, puis chauffé à 95 °C
pendant 15 minutes et fractionné sur gel polyacrylamide 10%. Le western blotting a été réalisé
grâce à un système semi-sec de transfert (Trans-blot SD blot bio-Rad) en accord avec les
recommandations du manufacturier (). Les membranes de nitrocellulose (Biorad, Trans-Blot®
0.45 µm) ont été incubées sur la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire anti-GFP (Roche Applied
science ref: 11814460001) dilué au 1:2000 (v/v) en TBS lait 5 % puis après lavage avec un
anticorps secondaire anti partie constante d’anticorps de souris (Bio-rad ref: 1706516) dilué au
1:10 000 (v/v) 1 heure à température ambiante. La révélation a été réalisée en utilisant un kit de
détection ECL (millipore).
105
MATÉRIEL & MÉTHODES
XI.
Observation microscopique
Les observations microscopiques sont réalisées grâce à un microscope à champ large
inversé (DMIRB Leica®) équipé d’un objectif à immersion (X63 HCX Plan Apo x63/1.40-Oil
Leica®). L’excitation de la eGFP est permise par une lampe à Xénon et un filtre d’excitation
comprenant la longueur d’onde de la GFP (480nm) et un filtre d’émission permettant d’observer
préférentiellement les longueurs d’onde proche de 509nm. En ce qui concerne la mCHERRY nous
possédons un filtre, non chevauchant la longueur d’onde d’excitation de la eGFP, permettant
d'exciter la mCHERRY de façon spécifique (587nm) et son émission (610nm).
L’acquisition des images est effectuée par une caméra (coolSnap HQ 1 pixel = 6.45 µm)
paramétrable par le logiciel Métamorph™, le traitement des images est réalisé grâce au logiciel
imageJ.
Le montage des lames était effectué avec des lames poly-L-lysine (PolyScience®). Nous
déposions 10µL de suspension bactérienne préalablement resuspendue dans du PBS 1X. Après
séchage des lames, nous déposions une goutte de liquide de montage développé pour la
microscopie de fluorescence (Daco© REF : S302380) permettant la fixation de la lamelle de
verre. Les cellules ainsi montées entre lame et lamelle étaient placées à 30°C pendant 10
minutes.
La vidéomicroscopie était réalisée en boite de Pétri à fond de verre selon la méthode décrit par
Joyce et collaborateurs. Les bactéries étaient cultivées en milieu liquide jusqu’en milieu de phase
exponentielle. 1 mL de culture était utilisé pour « équilibrer » le verre puis éliminé. 400 µL de
culture était déposés sur la lamelle de verre de la boite de Pétri d’observation. Après 10 minutes
le milieu de culture et les bactéries non déposées sur la lamelle étaient éliminées. Après séchage
à température ambiante, les bactéries déposées sur la lamelle de verre étaient recouvertes par
3mL du milieu 7H9 (10% ADC) à 37°C contenant 0.6% agar noble (Sigma), et le ou les
antibiotique(s) nécessaire(s) ainsi que l’inducteur (0.02% acétamide). La température était
ramenée à 37°C après ébullition, par incubation au bain marie à 37°C pendant 30 min. Après 45
minutes à température ambiante la boite fermée était placé à 37°C pendant 1 heure avant
observations.
XII.
Construction et analyse du mutant de délétion kasB de Msm
XII/ 1 Construction génétique du mutant kasB
106
MATÉRIEL & MÉTHODES
Nous avons réalisé la délétion du gène kasB (MSMEG_4328), grâce à l’utilisation du système de
recombinaison homologue : recombineering (van Kessel & Hatfull, 2007). La résistance du
plasmide portant les protéines de recombinaison phagique (pJV53) avait été changée afin de
porter la résistance à l’hygromycine (Wladimir Malaga, équipe Guilhot, IPBS, Toulouse, France).
Ensuite l’AES (Allelic Exchange Subtrate) a été réalisée en utilisant la technique de PCR de fusion
comme décrite par Karin L Heckman & Larry R Pease (Heckman & Pease, 2007) en effectuant
quelques modifications mineures. Tout d’abord, l’amplification des 3 parties de l’AES (800 pbs en
amont de l’ATG de kasB, la cassette de résistance à la zéocin, et 800 pbs en aval du codon stop
de kasB) ont été réalisées séparément avec comme matrice l’ADN génomique de mc²155 WT
pour les régions d’homologies et le plasmide pJET::zeo pour la cassette de résistance. Les
oligonucléaotides permettant l’amplification de la cassette zéocine possèdent également des
séquences d’homologies de la séquence 3’ de la région en amont de l’ATG et de la séquence 5’
de la région en aval du codon stop de kasB. Les 3 produits de PCR une fois purifiés sur gel
(QIAquick Gel Extraction Kit, Quiagen Germany) sont utilisés comme matrice pour la PCR de
fusion avec oligonucléotides externes. Une fois purifiée sur gel l’AES est dosée puis transformée
dans la souche de mc²155 compétente pour le « recombineering ». Après étalement sur milieu
solide additionné de 10µg/mL zéocine, les colonies obtenues sont discriminées de la souche
sauvage par PCR.
XII/ 2 Extraction des acides mycoliques
Afin de réaliser l’extraction des acides mycoliques, nous avons réalisé la mise en culture de la
souche mutante ainsi que des souches contrôles en 7H9 additionnée de glycérol, d’ADC et de
tween 0.05%. Afin d’éliminer progressivement le tween des cellules nous avons réalisé deux
dilutions (100 X) successives des cultures en milieu 7H9 glycérol additionné de kanamycine
50µg/mL. Suite à cela, 100 mL de culture sont centrifugés dans des flacons de 50 mL. Ces culots
sont ensuite repris dans un mélange CHCl3/CH3OH 1/2, 1/1 et 2/1 (v:v) afin le récupérer les
lipides extractibles. Cette étape est répétée 3 fois. Chacune des extractions est réalisée sur la
nuit à température ambiante. La phase organique est récupérée par filtration (filtre
préalablement taré) dans un ballon rodé. Les extraits organiques rassemblés sont ensuite séchés
dans un tube préalablement taré et les échantillons correspondant au acides mycoliques dits «
extractibles » sont conservés. Les bactéries délipidées, ou résidus bactériens récupérés sur le
filtre sont séchés à température ambiante puis pesés. Cette fraction est appelée « lipides liés »
car elle contient les acides mycoliques liés de façon covalente à l’arabinogalactane. Ces derniers
107
MATÉRIEL & MÉTHODES
sont obtenus par saponification des bactéries délipidées séchées : par un mélange de KOH 7M/2methoxyethanol en rapport 1/7 (v:v) pendant trois heures à 110°C. Le mélange réactionnel est
acidifié par ajout de quelques gouttes d’acide sulfurique 20%. Les acides mycoliques sont ensuite
extraits trois fois par de l’éther diéthylique. La phase éthérée est ensuite lavée à l’eau distillée
jusqu’à obtention d’un pH neutre. Si nécessaire, du sulfate de sodium (Na2SO4) en poudre est
rajouté pour éliminer les traces d’eau. La phase éthérée est par la suite concentrée, récupérée
dans un tube en verre préalablement taré, puis séchée et pesée. La saponification libère les
acides mycoliques qui sont par la suite méthylés grâce au diazométhane. Après méthylation, le
solvant est évaporé et les échantillons sont analysés en spectrométrie de masse et par
chromatographie sur couche mince.
XII/ 3 Analyse des acides mycoliques
L’analyse en spectrométrie de masse est réalisée sur un spectromètre de masse MALDI-TOF-TOF
4700 (Applied Biosystems) équipé d’un analyseur Time Of Flight TOF-4700. Nous reprenons les
échantillons en chloroforme de telle sorte à être à 1 mM. Puis 1 µL des échantillons est ensuite
déposé sur la plaque, mélangé avec 1 µL de matrice DHB (l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque) à 5
mg/mL dans du CHCl3/CH3OH (1:1 ; v/v) et cristallisé à température ambiante. Les analyses
MALDI-TOF ont été effectuées en mode réflectron positif. La source d’ionisation Matrix Assisted
Laser Desorption est constituée d’un laser Nd:YAG d’une longueur d’onde de 355 nm et d’une
fréquence de 200 Hz. Les ions formés sont accélérés vers l’analyseur à une tension de 20 kV.
2500 coups sont accumulés en mode ion positif et les données de spectrométrie de masse sont
acquises en utilisant la calibration par défaut de l’appareil.
108
ANNEXES
109
ANNEXES
Légende des Films supplémentaires
Film S14 : Localisation de Mmpl3-C12-1-GFP. La croissance de Msm exprimant une fusion GFP de
Mmpl3-C12-1 sous le contrôle du promoteur pamiE a été suivie par vidéomicroscopie de
fluorescence. Le format AVI a été obtenu grâce à ImageJ à 0.8 image par seconde. Le
chronomètre en haut à gauche des films indique le temps en heure. L’échelle est donnée par la
barre en bas à droite de 5 µm.
Film S15 : Localisation de Mmpl3-C12-2-GFP. La croissance de Msm exprimant une fusion GFP de
Mmpl3-C12-2 sous le contrôle du promoteur pamiE a été suivie par vidéomicroscopie de
fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S16 : Localisation de Mmpl3-N12-3-GFP. La croissance de Msm exprimant une fusion GFP de
Mmpl3-N12-3 sous le contrôle du promoteur pamiE a été suivie par vidéomicroscopie de
fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S17 : Observation du phénotype de croissance d’une souche exprimant de façon
conditionnelle le gène ftsZ. La croissance de Msm en présence de 100 ng/mL d’AHtc permettant
l’inhibition du promoteur Pptr en amont de ftsZ a été suivie par vidéomicroscopie. Le montage
du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S18 : Observation du phénotype de croissance d’une souche exprimant de façon
conditionnelle le gène ftsZ. La croissance de Msm en absence d’AHtc ne permettant pas
l’inhibition du promoteur Pptr en amont de ftsZ a été suivie par vidéomicroscopie. Le montage
du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S19 : Localisation de Mmpl3-N10-GFP dans une souche exprimant de façon conditionnelle le
gène ftsZ. La croissance de Msm exprimant la fusion Mmpl3-N10-GFP en présence de 100 ng/mL
d’AHtc permettant l’inhibition du promoteur Pptr en amont de ftsZ a été suivie par
vidéomicroscopie de fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S20 : Localisation de Mmpl3-GFP dans une souche exprimant de façon conditionnelle le
gène ftsZ. La croissance de Msm exprimant la fusion Mmpl3-GFP en présence de 100 ng/mL
d’AHtc permettant l’inhibition du promoteur Pptr en amont de ftsZ a été suivie par
vidéomicroscopie de fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
110
ANNEXES
Film S21 : Localisation de la GFP seule dans une souche exprimant de façon conditionnelle le
gène wag31. La croissance de Msm exprimant la GFP en présence de 100 ng/mL d’AHtc
permettant l’inhibition du promoteur Pptr en amont de wag31 a été suivie par vidéomicroscopie
de fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S22 : Observation du phénotype de croissance d’une souche exprimant de façon
conditionnelle le gène wag31. La croissance de Msm en absence d’AHtc ne permettant pas
l’inhibition du promoteur Pptr en amont de wag31 a été suivie par vidéomicroscopie. Le
montage du film a été réalisé comme pour le Film S14.
Film S23 : Localisation de la fusion Mmpl3-GFP dans une souche exprimant de façon
conditionnelle le gène wag31. La croissance de Msm exprimant la fusion Mmpl3-GFP en
présence de 100 ng/mL d’AHtc permettant l’inhibition du promoteur Pptr en amont de wag31 a
été suivie par vidéomicroscopie de fluorescence. Le montage du film a été réalisé comme pour le
Film S14.
111
RÉFÉRENCES
RÉFÉRENCES
112
RÉFÉRENCES
Al-Balas Q, Anthony N, Al-Jaidi B, Alnimr A, Abbott G, Brown A, Taylor R, Besra G, McHugh T, Gillespie
S, Johnston B, Mackay S, Coxon G (2009) Identification of 2-aminothiazole-4-carboxylate derivatives
active against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the beta-ketoacyl-ACP synthase mtFabH. PloS
one 4
Alahari A, Trivelli X, Guérardel Y, Dover L, Besra G, Sacchettini J, Reynolds R, Coxon G, Kremer L
(2007) Thiacetazone, an antitubercular drug that inhibits cyclopropanation of cell wall mycolic acids
in mycobacteria. PloS one 2
Aldridge BB, Fernandez-Suarez M, Heller D, Ambravaneswaran V, Irimia D, Toner M, Fortune SM
(2012) Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic
susceptibility. Science 335: 100-104
Alon U (2007) Introduction to Systems Biology: And the Design Principles of Biological Networks, Vol.
10: CRC press.
Asselineau J, Lederer E (1950) Structure of the mycolic acids of Mycobacteria. Nature 166: 782-783
Astarie-Dequeker C, N'Diaye E, Le Cabec V, Rittig M, Prandi J, Maridonneau-Parini I (1999) The
mannose receptor mediates uptake of pathogenic and nonpathogenic mycobacteria and bypasses
bactericidal responses in human macrophages. Infection and immunity 67: 469-477
Av-Gay Y, Everett M (2000) The eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases of Mycobacterium
tuberculosis. Trends in microbiology 8: 238-244
Backus K, Boshoff H, Barry C, Boutureira O, Patel M, D'Hooge F, Lee S, Via L, Tahlan K, Barry C, Davis B
(2011) Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nature
chemical biology 7: 228-235
Bafica A, Scanga C, Feng C, Leifer C, Cheever A, Sher A (2005) TLR9 regulates Th1 responses and
cooperates with TLR2 in mediating optimal resistance to Mycobacterium tuberculosis. The Journal of
experimental medicine 202: 1715-1724
Bakal C, Davies J (2000) No longer an exclusive club: eukaryotic signalling domains in bacteria. Trends
in cell biology 10: 32-38
Banaiee N, Kincaid E, Buchwald U, Jacobs W, Ernst J (2006) Potent inhibition of macrophage
responses to IFN-gamma by live virulent Mycobacterium tuberculosis is independent of mature
mycobacterial lipoproteins but dependent on TLR2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950)
176: 3019-3027
113
RÉFÉRENCES
Banerjee A, Dubnau E, Quemard A, Balasubramanian V, Um K, Wilson T, Collins D, de Lisle G, Jacobs
W (1994) inhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in Mycobacterium
tuberculosis. Science (New York, NY) 263: 227-230
Barclay WR, Winberg E (1964) Bactericidal Effect of Isoniazid as a Function of Time. Am Rev Respir Dis
90: 749-753
Bardou F, Quémard A, Dupont M, Horn C, Marchal G, Daffé M (1996) Effects of isoniazid on
ultrastructure of Mycobacterium aurum and Mycobacterium tuberculosis and on production of
secreted proteins. Antimicrobial agents and chemotherapy 40: 2459-2467
Barkan D, Rao V, Sukenick GD, Glickman MS (2010) Redundant function of cmaA2 and mmaA2 in
Mycobacterium tuberculosis cis cyclopropanation of oxygenated mycolates. Journal of bacteriology
192: 3661-3668
Baulard A, Betts J, Engohang-Ndong J, Quan S, McAdam R, Brennan P, Locht C, Besra G (2000)
Activation of the pro-drug ethionamide is regulated in mycobacteria. The Journal of biological
chemistry 275: 28326-28331
Baulard A, Gurcha S, Engohang-Ndong J, Gouffi K, Locht C, Besra G (2003) In vivo interaction between
the polyprenol phosphate mannose synthase Ppm1 and the integral membrane protein Ppm2 from
Mycobacterium smegmatis revealed by a bacterial two-hybrid system. The Journal of biological
chemistry 278: 2242-2248
Belardinelli J, Morbidoni H (2012) Mutations in the essential FAS II β-hydroxyacyl ACP dehydratase
complex confer resistance to thiacetazone in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium
kansasii. Molecular microbiology 86: 568-579
Bergeret F, Gavalda S, Chalut C, Malaga W, Quémard A, Pedelacq J-D, Daffé M, Guilhot C, Mourey L,
Bon C (2012) Biochemical and structural study of the atypical acyltransferase domain from the
mycobacterial polyketide synthase Pks13. The Journal of biological chemistry 287: 33675-33690
Besra G, Khoo K, McNeil M, Dell A, Morris H, Brennan P (1995) A new interpretation of the structure
of the mycolyl-arabinogalactan complex of Mycobacterium tuberculosis as revealed through
characterization of oligoglycosylalditol fragments by fast-atom bombardment mass spectrometry and
1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry 34: 4257-4266
Beste D, Bonde B, Hawkins N, Ward J, Beale M, Noack S, Nöh K, Kruger N, Ratcliffe R, McFadden J
(2011) ¹³C metabolic flux analysis identifies an unusual route for pyruvate dissimilation in
mycobacteria which requires isocitrate lyase and carbon dioxide fixation. PLoS pathogens 7
Bhatt A, Fujiwara N, Bhatt K, Gurcha S, Kremer L, Chen B, Chan J, Porcelli S, Kobayashi K, Besra G,
Jacobs W (2007a) Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and
114
RÉFÉRENCES
subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 104: 5157-5162
Bhatt A, Kremer L, Dai A, Sacchettini J, Jacobs W (2005) Conditional depletion of KasA, a key enzyme
of mycolic acid biosynthesis, leads to mycobacterial cell lysis. Journal of bacteriology 187: 7596-7606
Bhatt A, Molle V, Besra GS, Jacobs WR, Jr., Kremer L (2007b) The Mycobacterium tuberculosis FAS-II
condensing enzymes: their role in mycolic acid biosynthesis, acid-fastness, pathogenesis and in future
drug development. Molecular microbiology 64: 1442-1454
Bi E, Dai K, Subbarao S, Beall B, Lutkenhaus J (1991) FtsZ and cell division. Research in microbiology
142: 249-252
Biswas R, Dutta D, Tripathi A, Feng Y, Banerjee M, Singh B (2013) Identification and characterization
of Rv0494: a fatty acid-responsive protein of the GntR/FadR family from Mycobacterium
tuberculosis. Microbiology (Reading, England) 159: 913-923
Bloom B, Murray C (1992) Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science (New York, NY)
257: 1055-1064
Boehringer D, Ban N, Leibundgut M (2013) 7.5-A cryo-em structure of the mycobacterial fatty acid
synthase. Journal of molecular biology 425: 841-849
Boldrin F, Casonato S, Dainese E, Sala C, Dhar N, Palù G, Riccardi G, Cole S, Manganelli R (2010)
Development of a repressible mycobacterial promoter system based on two transcriptional
repressors. Nucleic acids research 38
Borgaro J, Chang A, Machutta C, Zhang X, Tonge P (2011) Substrate recognition by β-ketoacyl-ACP
synthases. Biochemistry 50: 10678-10686
Boshoff HI, Barry CE, 3rd (2005) Tuberculosis - metabolism and respiration in the absence of growth.
Nat Rev Microbiol 3: 70-80
Boshoff HI, Xu X, Tahlan K, Dowd CS, Pethe K, Camacho LR, Park TH, Yun CS, Schnappinger D, Ehrt S,
Williams KJ, Barry CE, 3rd (2008) Biosynthesis and recycling of nicotinamide cofactors in
mycobacterium tuberculosis. An essential role for NAD in nonreplicating bacilli. J Biol Chem 283:
19329-19341
Bouhss A, Trunkfield A, Bugg T, Mengin-Lecreulx D (2008) The biosynthesis of peptidoglycan lipidlinked intermediates. FEMS microbiology reviews 32: 208-233
115
RÉFÉRENCES
Bramkamp M, van Baarle S (2009) Division site selection in rod-shaped bacteria. Current opinion in
microbiology 12: 683-688
Braunstein M, Espinosa B, Chan J, Belisle J, Jacobs W (2003) SecA2 functions in the secretion of
superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Molecular microbiology
48: 453-464
Brennan P, Nikaido H (1995) The envelope of mycobacteria. Annual review of biochemistry 64: 29-63
Brignole E, Smith S, Asturias F (2009) Conformational flexibility of metazoan fatty acid synthase
enables catalysis. Nature structural & molecular biology 16: 190-197
Brosch R, Gordon S, Garnier T, Eiglmeier K, Frigui W, Valenti P, Dos Santos S, Duthoy S, Lacroix C,
Garcia-Pelayo C, Inwald J, Golby P, Garcia J, Hewinson R, Behr M, Quail M, Churcher C, Barrell B,
Parkhill J, Cole S (2007) Genome plasticity of BCG and impact on vaccine efficacy. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 104: 5596-5601
Brosch R, Gordon S, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C,
Hewinson G, Kremer K, Parsons L, Pym A, Samper S, van Soolingen D, Cole S (2002) A new
evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 99: 3684-3689
Cantaloube S (2010) Architecture et essentialité des complexes de biosynthèse des acides mycoliques
de la bactérie pathogène Mycobacterium tuberculosis. Université de Toulouse, Université Toulouse
III-Paul Sabatier,
Cantaloube S, Veyron-Churlet R, Haddache N, Daffé M, Zerbib D (2011) The Mycobacterium
tuberculosis FAS-II dehydratases and methyltransferases define the specificity of the mycolic acid
elongation complexes. PloS one 6
Carlsson F, Joshi S, Rangell L, Brown E (2009) Polar localization of virulence-related Esx-1 secretion in
mycobacteria. PLoS pathogens 5
Caron E, Hall A (1998) Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by
different Rho GTPases. Science (New York, NY) 282: 1717-1721
Castell A, Johansson P, Unge T, Jones T, Bäckbro K (2005) Rv0216, a conserved hypothetical protein
from Mycobacterium tuberculosis that is essential for bacterial survival during infection, has a double
hotdog fold. Protein science : a publication of the Protein Society 14: 1850-1862
Catherinot E, Fieschi C, Feinberg J, Casanova JL, Couderc LJ (2005) [Genetic susceptibility to
mycobacterial disease: Mendelian disorders of the interleukin-12 -interferon-gamma axis]. Revue des
maladies respiratoires 22: 767-776
116
RÉFÉRENCES
Chalut C, Botella L, de Sousa-D'Auria C, Houssin C, Guilhot C (2006) The nonredundant roles of two 4'phosphopantetheinyl transferases in vital processes of Mycobacteria. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 103: 8511-8516
Chauhan S, Tyagi JS (2009) Powerful induction of divergent tgs1-Rv3131 genes in Mycobacterium
tuberculosis is mediated by DevR interaction with a high-affinity site and an adjacent cryptic lowaffinity site. J Bacteriol 191: 6075-6081
Cimino M, Alamo L, Salazar L (2006) Permeabilization of the mycobacterial envelope for protein
cytolocalization studies by immunofluorescence microscopy. BMC microbiology 6: 35
Cohen-Gonsaud M, Ducasse S, Hoh F, Zerbib D, Labesse G, Quemard A (2002) Crystal structure of
MabA from Mycobacterium tuberculosis, a reductase involved in long-chain fatty acid biosynthesis.
Journal of molecular biology 320: 249-261
Colangeli R, Haq A, Arcus V, Summers E, Magliozzo R, McBride A, Mitra A, Radjainia M, Khajo A,
Jacobs W, Salgame P, Alland D (2009) The multifunctional histone-like protein Lsr2 protects
mycobacteria against reactive oxygen intermediates. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 106: 4414-4418
Colditz G, Brewer T, Berkey C, Wilson M, Burdick E, Fineberg H, Mosteller F (1994) Efficacy of BCG
vaccine in the prevention of tuberculosis. Meta-analysis of the published literature. JAMA : the
journal of the American Medical Association 271: 698-702
Cole S, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D, Gordon S, Eiglmeier K, Gas S, Barry C,
Tekaia F, Badcock K, Basham D, Brown D, Chillingworth T, Connor R, Davies R, Devlin K, Feltwell T,
Gentles S, Hamlin N, Holroyd S, Hornsby T, Jagels K, Krogh A, McLean J, Moule S, Murphy L, Oliver K,
Osborne J, Quail M, Rajandream M, Rogers J, Rutter S, Seeger K, Skelton J, Squares R, Squares S,
Sulston J, Taylor K, Whitehead S, Barrell B (1998a) Deciphering the biology of Mycobacterium
tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544
Cole S, Eiglmeier K, Parkhill J, James K, Thomson N, Wheeler P, Honoré N, Garnier T, Churcher C,
Harris D, Mungall K, Basham D, Brown D, Chillingworth T, Connor R, Davies R, Devlin K, Duthoy S,
Feltwell T, Fraser A, Hamlin N, Holroyd S, Hornsby T, Jagels K, Lacroix C, Maclean J, Moule S, Murphy
L, Oliver K, Quail M, Rajandream M, Rutherford K, Rutter S, Seeger K, Simon S, Simmonds M, Skelton
J, Squares R, Squares S, Stevens K, Taylor K, Whitehead S, Woodward J, Barrell B (2001) Massive gene
decay in the leprosy bacillus. Nature 409: 1007-1011
Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D, Gordon SV, Eiglmeier K, Gas S, Barry CE,
3rd, Tekaia F, Badcock K, Basham D, Brown D, Chillingworth T, Connor R, Davies R, Devlin K, Feltwell
T, Gentles S, Hamlin N, Holroyd S, Hornsby T, Jagels K, Krogh A, McLean J, Moule S, Murphy L, Oliver
K, Osborne J, Quail MA, Rajandream MA, Rogers J, Rutter S, Seeger K, Skelton J, Squares R, Squares S,
Sulston JE, Taylor K, Whitehead S, Barrell BG (1998b) Deciphering the biology of Mycobacterium
tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544
117
RÉFÉRENCES
Corrales R, Molle V, Leiba J, Mourey L, de Chastellier C, Kremer L (2012) Phosphorylation of
mycobacterial PcaA inhibits mycolic acid cyclopropanation: consequences for intracellular survival
and for phagosome maturation block. The Journal of biological chemistry 287: 26187-26199
Daffe M, Brennan P, McNeil M (1990) Predominant structural features of the cell wall
arabinogalactan of Mycobacterium tuberculosis as revealed through characterization of oligoglycosyl
alditol fragments by gas chromatography/mass spectrometry and by 1H and 13C NMR analyses. The
Journal of biological chemistry 265: 6734-6743
Daniel RA, Errington J (2003) Control of Cell Morphogenesis in Bacteria. Cell 113: 767-776
Dasgupta N, Kapur V, Singh KK, Das TK, Sachdeva S, Jyothisri K, Tyagi JS (2000) Characterization of a
two-component system, devR-devS, of Mycobacterium tuberculosis. Tuber Lung Dis 80: 141-159
Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences 97: 6640-6645
Datta P, Dasgupta A, Singh A, Mukherjee P, Kundu M, Basu J (2006) Interaction between FtsW and
penicillin-binding protein 3 (PBP3) directs PBP3 to mid-cell, controls cell septation and mediates the
formation of a trimeric complex involving FtsZ, FtsW and PBP3 in mycobacteria. Molecular
microbiology 62: 1655-1673
Davis JM, Ramakrishnan L (2009) The role of the granuloma in expansion and dissemination of early
tuberculous infection. Cell 136: 37-49
Deb C, Lee CM, Dubey VS, Daniel J, Abomoelak B, Sirakova TD, Pawar S, Rogers L, Kolattukudy PE
(2009) A novel in vitro multiple-stress dormancy model for Mycobacterium tuberculosis generates a
lipid-loaded, drug-tolerant, dormant pathogen. PLoS One 4: e6077
DeBarber A, Mdluli K, Bosman M, Bekker L, Barry C (2000) Ethionamide activation and sensitivity in
multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 97: 9677-9682
Dinadayala P, Laval F, Raynaud C, Lemassu A, Laneelle M-A, Laneelle G, Daffe M (2003) Tracking the
putative biosynthetic precursors of oxygenated mycolates of Mycobacterium tuberculosis. Structural
analysis of fatty acids of a mutant strain deviod of methoxy- and ketomycolates. The Journal of
biological chemistry 278: 7310-7319
DiRusso C, Heimert T, Metzger A (1992) … FadR, a global transcriptional regulator of fatty acid
metabolism in Escherichia coli. Interaction with the fadB promoter is prevented by long chain fatty
acyl coenzyme A …. Journal of Biological Chemistry
118
RÉFÉRENCES
Domenech P, Reed MB, Barry CE, 3rd (2005) Contribution of the Mycobacterium tuberculosis MmpL
protein family to virulence and drug resistance. Infection and immunity 73: 3492-3501
Dover L, Alahari A, Gratraud P, Gomes J, Bhowruth V, Reynolds R, Besra G, Kremer L (2007) EthA, a
common activator of thiocarbamide-containing drugs acting on different mycobacterial targets.
Antimicrobial agents and chemotherapy 51: 1055-1063
Drew D, Sjöstrand D, Nilsson J, Urbig T, Chin C-n, de Gier J-W, von Heijne G (2002) Rapid topology
mapping of Escherichia coli inner-membrane proteins by prediction and PhoA/GFP fusion analysis.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99: 2690-2695
Dubnau E, Chan J, Raynaud C, Mohan V, Lanéelle M, Yu K, Quémard A, Smith I, Daffé M (2000)
Oxygenated mycolic acids are necessary for virulence of Mycobacterium tuberculosis in mice.
Molecular microbiology 36: 630-637
Dubnau E, Lanéelle M, Soares S, Bénichou A, Vaz T, Promé D, Promé J, Daffé M, Quémard A (1997)
Mycobacterium bovis BCG genes involved in the biosynthesis of cyclopropyl keto- and hydroxymycolic acids. Molecular microbiology 23: 313-322
Dziadek J, Rutherford S, Madiraju M, Atkinson M, Rajagopalan M (2003) Conditional expression of
Mycobacterium smegmatis ftsZ, an essential cell division gene. Microbiology (Reading, England) 149:
1593-1603
Ehrt S, Guo XV, Hickey CM, Ryou M, Monteleone M, Riley LW, Schnappinger D (2005) Controlling
gene expression in mycobacteria with anhydrotetracycline and Tet repressor. Nucleic acids research
33: e21-e21
Engelhardt H, Heinz C, Niederweis M (2002) A tetrameric porin limits the cell wall permeability of
Mycobacterium smegmatis. The Journal of biological chemistry 277: 37567-37572
Engohang-Ndong J, Baillat D, Aumercier M, Bellefontaine F, Besra G, Locht C, Baulard A (2004) EthR, a
repressor of the TetR/CamR family implicated in ethionamide resistance in mycobacteria,
octamerizes cooperatively on its operator. Molecular microbiology 51: 175-188
Ernst J (2012) The immunological life cycle of tuberculosis. Nature reviews Immunology 12: 581-591
Falzon D, Jaramillo E, Wares F, Zignol M, Floyd K, Raviglione M (2013) Universal access to care for
multidrug-resistant tuberculosis: an analysis of surveillance data. The Lancet infectious diseases
Fattorini L, Iona E, Ricci M, Thoresen O, Orrù G, Oggioni M, Tortoli E, Piersimoni C, Chiaradonna P,
Tronci M, Pozzi G, Orefici G (1999) Activity of 16 antimicrobial agents against drug-resistant strains of
Mycobacterium tuberculosis. Microbial drug resistance (Larchmont, NY) 5: 265-270
119
RÉFÉRENCES
Feilmeier B, Iseminger G, Schroeder D, Webber H, Phillips G (2000) Green fluorescent protein
functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli. Journal of bacteriology 182: 40684076
Fernandes ND, Kolattukudy PE (1996) Cloning, sequencing and characterization of a fatty acid
synthase-encoding gene from< i> Mycobacterium tuberculosis</i> var.< i> bovis</i> BCG. Gene 170:
95-99
Fiuza M, Letek M, Leiba J, Villadangos A, Vaquera J, Zanella-Cléon I, Mateos L, Molle V, Gil J (2010)
Phosphorylation of a novel cytoskeletal protein (RsmP) regulates rod-shaped morphology in
Corynebacterium glutamicum. The Journal of biological chemistry 285: 29387-29397
Flärdh K (2003) Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces
coelicolor A3 (2). Molecular microbiology 49: 1523-1536
Flärdh K (2010) Cell polarity and the control of apical growth in Streptomyces. Current opinion in
microbiology 13: 758-765
Flipo M, Desroses M, Lecat-Guillet N, Villemagne B, Blondiaux N, Leroux F, Piveteau C, Mathys V,
Flament M-P, Siepmann J, Villeret V, Wohlkönig A, Wintjens R, Soror S, Christophe T, Jeon H, Locht C,
Brodin P, Déprez B, Baulard A, Willand N (2012) Ethionamide boosters. 2. Combining bioisosteric
replacement and structure-based drug design to solve pharmacokinetic issues in a series of potent
1,2,4-oxadiazole EthR inhibitors. Journal of medicinal chemistry 55: 68-83
Gagneux S (2012) Host-pathogen coevolution in human tuberculosis. Philosophical transactions of
the Royal Society of London Series B, Biological sciences 367: 850-859
Gagneux S, DeRiemer K, Van T, Kato-Maeda M, de Jong B, Narayanan S, Nicol M, Niemann S, Kremer
K, Gutierrez M, Hilty M, Hopewell P, Small P (2006) Variable host-pathogen compatibility in
Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 103: 2869-2873
Gago G, Diacovich L, Arabolaza A, Tsai S-C, Gramajo H (2011) Fatty acid biosynthesis in
actinomycetes. FEMS microbiology reviews 35: 475-497
Galagan J, Minch K, Peterson M, Lyubetskaya A, Azizi E, Sweet L, Gomes A, Rustad T, Dolganov G,
Glotova I, Abeel T, Mahwinney C, Kennedy A, Allard R, Brabant W, Krueger A, Jaini S, Honda B, Yu WH, Hickey M, Zucker J, Garay C, Weiner B, Sisk P, Stolte C, Winkler J, Van de Peer Y, Iazzetti P,
Camacho D, Dreyfuss J, Liu Y, Dorhoi A, Mollenkopf H-J, Drogaris P, Lamontagne J, Zhou Y, Piquenot J,
Park S, Raman S, Kaufmann S, Mohney R, Chelsky D, Moody D, Sherman D, Schoolnik G (2013) The
Mycobacterium tuberculosis regulatory network and hypoxia. Nature 499: 178-183
120
RÉFÉRENCES
Galandrin S, Guillet V, Rane R, Léger M, N R, Eynard N, Das K, Balganesh T, Mourey L, Daffé M,
Marrakchi H (2013) Assay development for identifying inhibitors of the mycobacterial FadD32
activity. Journal of biomolecular screening 18: 576-587
Gamieldien J, Ptitsyn A, Hide W (2002) Eukaryotic genes in Mycobacterium tuberculosis could have a
role in pathogenesis and immunomodulation. Trends in genetics : TIG 18: 5-8
Gan H, Lee J, Ren F, Chen M, Kornfeld H, Remold H (2008) Mycobacterium tuberculosis blocks
crosslinking of annexin-1 and apoptotic envelope formation on infected macrophages to maintain
virulence. Nature immunology 9: 1189-1197
Gandhi N, Nunn P, Dheda K, Schaaf H, Zignol M, van Soolingen D, Jensen P, Bayona J (2010)
Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of
tuberculosis. Lancet 375: 1830-1843
Gao L-Y, Groger R, Cox J, Beverley S, Lawson E, Brown E (2003a) Transposon mutagenesis of
Mycobacterium marinum identifies a locus linking pigmentation and intracellular survival. Infection
and immunity 71: 922-929
Gao L-Y, Laval F, Lawson E, Groger R, Woodruff A, Morisaki J, Cox J, Daffe M, Brown E (2003b)
Requirement for kasB in Mycobacterium mycolic acid biosynthesis, cell wall impermeability and
intracellular survival: implications for therapy. Molecular microbiology 49: 1547-1563
Gatfield J, Pieters J (2000) Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages.
Science (New York, NY) 288: 1647-1650
Gavalda S, Léger M, van der Rest B, Stella A, Bardou F, Montrozier H, Chalut C, Burlet-Schiltz O,
Marrakchi H, Daffé M, Quémard A (2009) The Pks13/FadD32 crosstalk for the biosynthesis of mycolic
acids in Mycobacterium tuberculosis. The Journal of biological chemistry 284: 19255-19264
Gee C, Papavinasasundaram K, Blair S, Baer C, Falick A, King D, Griffin J, Venghatakrishnan H,
Zukauskas A, Wei J-R, Dhiman R, Crick D, Rubin E, Sassetti C, Alber T (2012) A phosphorylated
pseudokinase complex controls cell wall synthesis in mycobacteria. Science signaling 5
George K, Yuan Y, Sherman D, Barry C (1995) The biosynthesis of cyclopropanated mycolic acids in
Mycobacterium tuberculosis. Identification and functional analysis of CMAS-2. The Journal of
biological chemistry 270: 27292-27298
Glickman MS (2003) The mmaA2 gene of Mycobacterium tuberculosis encodes the distal
cyclopropane synthase of the α-mycolic acid. Journal of Biological Chemistry 278: 7844-7849
Glickman MS, Cahill SM, Jacobs WR (2001) The Mycobacterium tuberculosis cmaA2 gene encodes a
mycolic acid trans-cyclopropane synthetase. Journal of Biological Chemistry 276: 2228-2233
121
RÉFÉRENCES
Glickman MS, Cox JS, Jacobs WR (2000) A Novel Mycolic Acid Cyclopropane Synthetase Is Required
for Cording, Persistence, and Virulence of< i> Mycobacterium tuberculosis</i>. Molecular cell 5: 717727
Goehring NW, Beckwith J (2005) Diverse paths to midcell: assembly of the bacterial cell division
machinery. Current Biology 15: R514-R526
Grogan D, Cronan J (1997) Cyclopropane ring formation in membrane lipids of bacteria. Microbiology
and molecular biology reviews : MMBR 61: 429-441
Grzegorzewicz A, Korduláková J, Jones V, Born S, Belardinelli J, Vaquié A, Gundi V, Madacki J, Slama
N, Laval F, Vaubourgeix J, Crew R, Gicquel B, Daffé M, Morbidoni H, Brennan P, Quémard A, McNeil
M, Jackson M (2012a) A common mechanism of inhibition of the Mycobacterium tuberculosis
mycolic acid biosynthetic pathway by isoxyl and thiacetazone. The Journal of biological chemistry
287: 38434-38441
Grzegorzewicz AE, Pham H, Gundi VA, Scherman MS, North EJ, Hess T, Jones V, Gruppo V, Born SE,
Kordulakova J, Chavadi SS, Morisseau C, Lenaerts AJ, Lee RE, McNeil MR, Jackson M (2012b)
Inhibition of mycolic acid transport across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane.
Nature chemical biology 8: 334-341
Guan L, Ehrmann M, Yoneyama H, Nakae T (1999) Membrane topology of the xenobiotic-exporting
subunit, MexB, of the MexA,B-OprM extrusion pump in Pseudomonas aeruginosa. The Journal of
biological chemistry 274: 10517-10522
Gutierrez M, Brisse S, Brosch R, Fabre M, Omaïs B, Marmiesse M, Supply P, Vincent V (2005) Ancient
origin and gene mosaicism of the progenitor of Mycobacterium tuberculosis. PLoS pathogens 1
Gutierrez M, Master S, Singh S, Taylor G, Colombo M, Deretic V (2004) Autophagy is a defense
mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages. Cell
119: 753-766
Gutierrez MC, Supply P, Brosch R (2009) Pathogenomics of mycobacteria. Genome dynamics 6: 198210
Hackam D, Rotstein O, Zhang W, Demaurex N, Woodside M, Tsai O, Grinstein S (1997) Regulation of
phagosomal acidification. Differential targeting of Na+/H+ exchangers, Na+/K+-ATPases, and
vacuolar-type H+-atpases. The Journal of biological chemistry 272: 29810-29820
Hamasha K, Sahana M, Jani C, Nyayapathy S, Kang C-M, Rehse S (2010) The effect of Wag31
phosphorylation on the cells and the cell envelope fraction of wild-type and conditional mutants of
Mycobacterium smegmatis studied by visible-wavelength Raman spectroscopy. Biochemical and
biophysical research communications 391: 664-668
122
RÉFÉRENCES
Hanks SK, Quinn AM (1991) Protein kinase catalytic domain sequence database: identification of
conserved features of primary structure and classification of family members. Methods in
enzymology 200: 38
Harris J, De Haro S, Master S, Keane J, Roberts E, Delgado M, Deretic V (2007) T helper 2 cytokines
inhibit autophagic control of intracellular Mycobacterium tuberculosis. Immunity 27: 505-517
Harry E (2001) Bacterial cell division: Regulating Z‐ring formation. Molecular microbiology 40: 795803
Harry E, Monahan L, Thompson L (2006) Bacterial cell division: the mechanism and its precison.
International review of cytology 253: 27-94
Hempel AM, Wang S-b, Letek M, Gil JA, Flärdh K (2008) Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal
branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. Journal of
bacteriology 190: 7579-7583
Hershberg R, Lipatov M, Small P, Sheffer H, Niemann S, Homolka S, Roach J, Kremer K, Petrov D,
Feldman M, Gagneux S (2008) High functional diversity in Mycobacterium tuberculosis driven by
genetic drift and human demography. PLoS biology 6
Hett E, Rubin E (2008) Bacterial growth and cell division: a mycobacterial perspective. Microbiology
and molecular biology reviews : MMBR 72: 126
Hoffmann C, Leis A, Niederweis M, Plitzko J, Engelhardt H (2008) Disclosure of the mycobacterial
outer membrane: cryo-electron tomography and vitreous sections reveal the lipid bilayer structure.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 3963-3967
Horwitz M, Harth G, Dillon B, Maslesa-Galić S (2006) A novel live recombinant mycobacterial vaccine
against bovine tuberculosis more potent than BCG. Vaccine 24: 1593-1600
Houben D, Demangel C, van Ingen J, Perez J, Baldeón L, Abdallah A, Caleechurn L, Bottai D, van Zon
M, de Punder K, van der Laan T, Kant A, Bossers-de Vries R, Willemsen P, Bitter W, van Soolingen D,
Brosch R, van der Wel N, Peters P (2012) ESX-1-mediated translocation to the cytosol controls
virulence of mycobacteria. Cellular microbiology 14: 1287-1298
Jackson M, Raynaud C, Lanéelle M, Guilhot C, Laurent-Winter C, Ensergueix D, Gicquel B, Daffé M
(1999) Inactivation of the antigen 85C gene profoundly affects the mycolate content and alters the
permeability of the Mycobacterium tuberculosis cell envelope. Molecular microbiology 31: 15731587
123
RÉFÉRENCES
Jarlier V, Nikaido H (1994) Mycobacterial cell wall: structure and role in natural resistance to
antibiotics. FEMS microbiology letters 123: 11-18
Jayachandran R, Sundaramurthy V, Combaluzier B, Mueller P, Korf H, Huygen K, Miyazaki T, Albrecht
I, Massner J, Pieters J (2007) Survival of mycobacteria in macrophages is mediated by coronin 1dependent activation of calcineurin. Cell 130: 37-50
Jenke-Kodama H, Sandmann A, Müller R, Dittmann E (2005) Evolutionary implications of bacterial
polyketide synthases. Molecular biology and evolution 22: 2027-2039
Joyce G, Robertson BD, Williams KJ (2011) A modified agar pad method for mycobacterial live-cell
imaging. BMC research notes 4: 73
Joyce G, Williams K, Robb M, Noens E, Tizzano B, Shahrezaei V, Robertson B (2012) Cell division site
placement and asymmetric growth in mycobacteria. PloS one 7
Kang C-M, Nyayapathy S, Lee J-Y, Suh J-W, Husson R (2008) Wag31, a homologue of the cell division
protein DivIVA, regulates growth, morphology and polar cell wall synthesis in mycobacteria.
Microbiology (Reading, England) 154: 725-735
Kappelman J, Alçiçek M, Kazanci N, Schultz M, Ozkul M, Sen S (2008) First Homo erectus from Turkey
and implications for migrations into temperate Eurasia. American journal of physical anthropology
135: 110-116
Kaufmann S (2006) Envisioning future strategies for vaccination against tuberculosis. Nature reviews
Immunology 6: 699-704
Keren I, Minami S, Rubin E, Lewis K (2011) Characterization and transcriptome analysis of
Mycobacterium tuberculosis persisters. mBio 2: 11
Khan S, Nagarajan S, Parikh A, Samantaray S, Singh A, Kumar D, Roy R, Bhatt A, Nandicoori V (2010)
Phosphorylation of enoyl-acyl carrier protein reductase InhA impacts mycobacterial growth and
survival. The Journal of biological chemistry 285: 37860-37871
Koul A, Dendouga N, Vergauwen K, Molenberghs B, Vranckx L, Willebrords R, Ristic Z, Lill H, Dorange
I, Guillemont J, Bald D, Andries K (2007) Diarylquinolines target subunit c of mycobacterial ATP
synthase. Nature chemical biology 3: 323-324
Kremer L, Baulard A, Estaquier J, Content J, Capron A, Locht C (1995) Analysis of the Mycobacterium
tuberculosis 85A antigen promoter region. Journal of bacteriology 177: 642-653
124
RÉFÉRENCES
Kremer L, Dover L, Carrère S, Nampoothiri K, Lesjean S, Brown A, Brennan P, Minnikin D, Locht C,
Besra G (2002) Mycolic acid biosynthesis and enzymic characterization of the beta-ketoacyl-ACP
synthase A-condensing enzyme from Mycobacterium tuberculosis. The Biochemical journal 364: 423430
Kremer L, Nampoothiri K, Lesjean S, Dover L, Graham S, Betts J, Brennan P, Minnikin D, Locht C, Besra
G (2001) Biochemical characterization of acyl carrier protein (AcpM) and malonyl-CoA:AcpM
transacylase (mtFabD), two major components of Mycobacterium tuberculosis fatty acid synthase II.
The Journal of biological chemistry 276: 27967-27974
Lanéelle M-A, Launay A, Spina L, Marrakchi H, Laval F, Eynard N, Lemassu A, Tropis M, Daffé M,
Etienne G (2012) A novel mycolic acid species defines two novel genera of the Actinobacteria,
Hoyosella and Amycolicicoccus. Microbiology (Reading, England) 158: 843-855
Laval F, Haites R, Movahedzadeh F, Lemassu A, Wong C, Stoker N, Billman-Jacobe H, Daffé M (2008)
Investigating the function of the putative mycolic acid methyltransferase UmaA: divergence between
the Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis proteins. The Journal of biological
chemistry 283: 1419-1427
Laval F, Lanéelle M, Déon C, Monsarrat B, Daffé M (2001) Accurate molecular mass determination of
mycolic acids by MALDI-TOF mass spectrometry. Analytical chemistry 73: 4537-4544
Lea-Smith D, Pyke J, Tull D, McConville M, Coppel R, Crellin P (2007) The reductase that catalyzes
mycolic motif synthesis is required for efficient attachment of mycolic acids to arabinogalactan. The
Journal of biological chemistry 282: 11000-11008
Lederer E, Adam A, Ciorbaru R, Petit J, Wietzerbin J (1975) Cell walls of Mycobacteria and related
organisms; chemistry and immunostimulant properties. Molecular and cellular biochemistry 7: 87104
Léger M, Gavalda S, Guillet V, van der Rest B, Slama N, Montrozier H, Mourey L, Quémard A, Daffé M,
Marrakchi H (2009) The dual function of the Mycobacterium tuberculosis FadD32 required for
mycolic acid biosynthesis. Chemistry & biology 16: 510-519
Lemassu A, Daffé M (1994) Structural features of the exocellular polysaccharides of Mycobacterium
tuberculosis. The Biochemical journal 297 ( Pt 2): 351-357
Lenarcic R, Halbedel S, Visser L, Shaw M, Wu L, Errington J, Marenduzzo D, Hamoen L (2009)
Localisation of DivIVA by targeting to negatively curved membranes. The EMBO journal 28: 22722282
Letek M, Ordóñez E, Vaquera J, Margolin W, Flärdh K, Mateos L, Gil J (2008) DivIVA is required for
polar growth in the MreB-lacking rod-shaped actinomycete Corynebacterium glutamicum. Journal of
bacteriology 190: 3283-3292
125
RÉFÉRENCES
Levine B, Mizushima N, Virgin H (2011) Autophagy in immunity and inflammation. Nature 469: 323335
Lin T-W, Melgar M, Kurth D, Swamidass S, Purdon J, Tseng T, Gago G, Baldi P, Gramajo H, Tsai S-C
(2006) Structure-based inhibitor design of AccD5, an essential acyl-CoA carboxylase
carboxyltransferase domain of Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 103: 3072-3077
Lin Y, Li Y, Zhu Y, Zhang J, Li Y, Liu X, Jiang W, Yu S, You X-F, Xiao C, Hong B, Wang Y, Jiang J-D, Si S
(2012) Identification of antituberculosis agents that target ribosomal protein interactions using a
yeast two-hybrid system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 109: 17412-17417
Lindner AB, Madden R, Demarez A, Stewart EJ, Taddei F (2008) Asymmetric segregation of protein
aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation. Proceedings of the National Academy
of Sciences 105: 3076-3081
Liu J, Barry C, Besra G, Nikaido H (1996) Mycolic acid structure determines the fluidity of the
mycobacterial cell wall. The Journal of biological chemistry 271: 29545-29551
Lu X, Chen Y, You Q (2010) 3D-QSAR, molecular docking studies, and binding mode prediction of
thiolactomycin analogs as mtFabH inhibitors. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry
25: 240-249
Lu X, Wan B, Franzblau S, You Q (2011) Design, synthesis and anti-tubercular evaluation of new 2acylated and 2-alkylated amino-5-(4-(benzyloxy)phenyl)thiophene-3-carboxylic acid derivatives. Part
1. European journal of medicinal chemistry 46: 3551-3563
Luckner S, Machutta C, Tonge P, Kisker C (2009) Crystal structures of Mycobacterium tuberculosis
KasA show mode of action within cell wall biosynthesis and its inhibition by thiolactomycin. Structure
(London, England : 1993) 17: 1004-1013
Makarov V, Manina G, Mikusova K, Möllmann U, Ryabova O, Saint-Joanis B, Dhar N, Pasca M, Buroni
S, Lucarelli A, Milano A, De Rossi E, Belanova M, Bobovska A, Dianiskova P, Kordulakova J, Sala C,
Fullam E, Schneider P, McKinney J, Brodin P, Christophe T, Waddell S, Butcher P, Albrethsen J,
Rosenkrands I, Brosch R, Nandi V, Bharath S, Gaonkar S, Shandil R, Balasubramanian V, Balganesh T,
Tyagi S, Grosset J, Riccardi G, Cole S (2009) Benzothiazinones kill Mycobacterium tuberculosis by
blocking arabinan synthesis. Science (New York, NY) 324: 801-804
Maloney E, Madiraju S, Rajagopalan M, Madiraju M (2011) Localization of acidic phospholipid
cardiolipin and DnaA in mycobacteria. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 91 Suppl 1: 5
126
RÉFÉRENCES
Manjunatha U, Boshoff H, Dowd C, Zhang L, Albert T, Norton J, Daniels L, Dick T, Pang S, Barry C
(2006) Identification of a nitroimidazo-oxazine-specific protein involved in PA-824 resistance in
Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 103: 431-436
Marrakchi H, Bardou F, Lanéelle M, Daffé M (2008) A comprehensive overview of mycolic acid
structure and biosynthesis. The mycobacterial cell envelope: 41-62
Marrakchi H, Choi K-H, Rock C (2002a) A new mechanism for anaerobic unsaturated fatty acid
formation in Streptococcus pneumoniae. The Journal of biological chemistry 277: 44809-44816
Marrakchi H, Ducasse S, Labesse G, Montrozier H, Margeat E, Emorine L, Charpentier X, Daffé M,
Quémard A (2002b) MabA (FabG1), a Mycobacterium tuberculosis protein involved in the long-chain
fatty acid elongation system FAS-II. Microbiology (Reading, England) 148: 951-960
Marrakchi H, Lanéelle G, Quémard A (2000) InhA, a target of the antituberculous drug isoniazid, is
involved in a mycobacterial fatty acid elongation system, FAS-II. Microbiology (Reading, England) 146
( Pt 2): 289-296
Martin C, Williams A, Hernandez-Pando R, Cardona P, Gormley E, Bordat Y, Soto C, Clark S, Hatch G,
Aguilar D, Ausina V, Gicquel B (2006) The live Mycobacterium tuberculosis phoP mutant strain is
more attenuated than BCG and confers protective immunity against tuberculosis in mice and guinea
pigs. Vaccine 24: 3408-3419
Matsumoto M, Hashizume H, Tomishige T, Kawasaki M, Tsubouchi H, Sasaki H, Shimokawa Y,
Komatsu M (2006) OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action
against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS medicine 3
McElhaney R, de Gier J, van der Neut-Kok E (1973) The effect of alterations in fatty acid composition
and cholesterol content on the nonelectrolyte permeability of Acholeplasma laidlawii B cells and
derived liposomes. Biochimica et biophysica acta 298: 500-512
McKinney JD (2000) In vivo veritas: the search for TB drug targets goes live. Nat Med 6: 1330-1333
Michael SG, Jeffery SC, William RJ (2000) A Novel Mycolic Acid Cyclopropane Synthetase Is Required
for Cording, Persistence, and Virulence of Mycobacterium tuberculosis. Molecular Cell 5
Migliori GB, Centis R, D’Ambrosio L, Spanevello A, Borroni E, Cirillo DM, Sotgiu G (2012) Totally drugresistant and extremely drug-resistant tuberculosis: the same disease? Clinical infectious diseases 54:
1379-1380
Minnikin D, Polgar N (1967) Structural studies on the mycolic acids. Chemical Communications
(London): 312-314
127
RÉFÉRENCES
Mir M, Asong J, Li X, Cardot J, Boons G-J, Husson R (2011) The extracytoplasmic domain of the
Mycobacterium tuberculosis Ser/Thr kinase PknB binds specific muropeptides and is required for
PknB localization. PLoS pathogens 7
Mitraki A, King J (1989) Protein Folding Intermediates and Inclusion Body Formation. Nature
Biotechnology 7: 690-697
Mohammadi T, van Dam V, Sijbrandi R, Vernet T, Zapun A, Bouhss A, Diepeveen-de Bruin M, NguyenDistèche M, de Kruijff B, Breukink E (2011) Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell
wall precursors across the membrane. The EMBO journal 30: 1425-1432
Molle V, Brown A, Besra G, Cozzone A, Kremer L (2006) The condensing activities of the
Mycobacterium tuberculosis type II fatty acid synthase are differentially regulated by
phosphorylation. The Journal of biological chemistry 281: 30094-30103
Molle V, Gulten G, Vilcheze C, Veyron-Churlet R, Zanella-Cleon I, Sacchettini JC, Jacobs WR, Jr.,
Kremer L (2010) Phosphorylation of InhA inhibits mycolic acid biosynthesis and growth of
Mycobacterium tuberculosis. Molecular microbiology 78: 1591-1605
Molle V, Kremer L (2010) Division and cell envelope regulation by Ser/Thr phosphorylation:
Mycobacterium shows the way. Molecular microbiology 75: 1064-1077
Mondino S, Gago G, Gramajo H (2013) Transcriptional regulation of fatty acid biosynthesis in
mycobacteria. Molecular microbiology 89: 372-387
Mukherjee P, Sureka K, Datta P, Hossain T, Barik S, Das K, Kundu M, Basu J (2009a) Novel role of
Wag31 in protection of mycobacteria under oxidative stress. Molecular microbiology 73: 103-119
Mukherjee P, Sureka K, Datta P, Hossain T, Barik S, Das KP, Kundu M, Basu J (2009b) Novel role of
Wag31 in protection of mycobacteria under oxidative stress. Molecular microbiology 73: 103-119
Munoz-Elias EJ, McKinney JD (2005) Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly
required for in vivo growth and virulence. Nat Med 11: 638-644
Munoz-Elias EJ, McKinney JD (2006) Carbon metabolism of intracellular bacteria. Cell Microbiol 8: 1022
Munoz-Elias EJ, Upton AM, Cherian J, McKinney JD (2006) Role of the methylcitrate cycle in
Mycobacterium tuberculosis metabolism, intracellular growth, and virulence. Mol Microbiol 60:
1109-1122
128
RÉFÉRENCES
Murphy DJ, Brown JR (2007) Identification of gene targets against dormant phase Mycobacterium
tuberculosis infections. BMC Infect Dis 7: 84
Narayan A, Sachdeva P, Sharma K, Saini A, Tyagi A, Singh Y (2007) Serine threonine protein kinases of
mycobacterial genus: phylogeny to function. Physiological genomics 29: 66-75
Neyrolles O, Guilhot C (2011) Recent advances in deciphering the contribution of Mycobacterium
tuberculosis lipids to pathogenesis. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 91: 187-195
Niederweis M, Danilchanka O, Huff J, Hoffmann C, Engelhardt H (2010) Mycobacterial outer
membranes: in search of proteins. Trends in microbiology 18: 109-116
Odriozola J, Ramos J, Bloch K (1977) Fatty acid synthetase activity in Mycobacterium smegmatis.
Characterization of the acyl carrier protein-dependent elongating system. Biochimica et biophysica
acta 488: 207-217
Oliva M, Halbedel S, Freund S, Dutow P, Leonard T, Veprintsev D, Hamoen L, Löwe J (2010) Features
critical for membrane binding revealed by DivIVA crystal structure. The EMBO journal 29: 1988-2001
Ortalo-Magné A, Dupont M, Lemassu A, Andersen A, Gounon P, Daffé M (1995) Molecular
composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology (Reading,
England) 141 ( Pt 7): 1609-1620
Owens C, Chim N, Graves A, Harmston C, Iniguez A, Contreras H, Liptak M, Goulding C (2013) The
Mycobacterium tuberculosis Secreted Protein Rv0203 Transfers Heme to Membrane Proteins
MmpL3 and MmpL11. The Journal of biological chemistry 288: 21714-21728
Pandey AK, Sassetti CM (2008) Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol.
Proc Natl Acad Sci U S A 105: 4376-4380
Parish T, Roberts G, Laval F, Schaeffer M, Daffé M, Duncan K (2007) Functional complementation of
the essential gene fabG1 of Mycobacterium tuberculosis by Mycobacterium smegmatis fabG but not
Escherichia coli fabG. Journal of bacteriology 189: 3721-3728
Paulsen I, Brown M, Skurray R (1996) Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiological
reviews 60: 575-608
Peyron P, Bordier C, N'Diaye E, Maridonneau-Parini I (2000) Nonopsonic phagocytosis of
Mycobacterium kansasii by human neutrophils depends on cholesterol and is mediated by CR3
associated with glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Journal of immunology (Baltimore,
Md : 1950) 165: 5186-5191
129
RÉFÉRENCES
Peyron P, Vaubourgeix J, Poquet Y, Levillain F, Botanch C, Bardou F, Daffe M, Emile JF, Marchou B,
Cardona PJ, de Chastellier C, Altare F (2008) Foamy macrophages from tuberculous patients'
granulomas constitute a nutrient-rich reservoir for M. tuberculosis persistence. PLoS Pathog 4:
e1000204
Phetsuksiri B, Baulard A, Cooper A, Minnikin D, Douglas J, Besra G, Brennan P (1999)
Antimycobacterial activities of isoxyl and new derivatives through the inhibition of mycolic acid
synthesis. Antimicrobial agents and chemotherapy 43: 1042-1051
Piddington D, Fang F, Laessig T, Cooper A, Orme I, Buchmeier N (2001) Cu,Zn superoxide dismutase of
Mycobacterium tuberculosis contributes to survival in activated macrophages that are generating an
oxidative burst. Infection and immunity 69: 4980-4987
Portevin D, De Sousa-D'Auria C, Houssin C, Grimaldi C, Chami M, Daffé M, Guilhot C (2004) A
polyketide synthase catalyzes the last condensation step of mycolic acid biosynthesis in mycobacteria
and related organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101: 314-319
Portevin D, de Sousa-D'Auria C, Montrozier H, Houssin C, Stella A, Lanéelle M-A, Bardou F, Guilhot C,
Daffé M (2005) The acyl-AMP ligase FadD32 and AccD4-containing acyl-CoA carboxylase are required
for the synthesis of mycolic acids and essential for mycobacterial growth: identification of the
carboxylation product and determination of the acyl-CoA carboxylase components. The Journal of
biological chemistry 280: 8862-8874
Puri R, Reddy P, Tyagi A (2013) Secreted Acid Phosphatase (SapM) of Mycobacterium tuberculosis Is
Indispensable for Arresting Phagosomal Maturation and Growth of the Pathogen in Guinea Pig
Tissues. PloS one 8
Putman M, van Veen H, Konings W (2000) Molecular properties of bacterial multidrug transporters.
Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 64: 672-693
Qu Y, Lim C, Whang Y, Liu J, Yan J (2013) Mechanism of DNA organization by Mycobacterium
tuberculosis protein Lsr2. Nucleic acids research 41: 5263-5272
Quémard A, Lanéelle M, Marrakchi H, Promé D, Dubnau E, Daffé M (1997) Structure of a
hydroxymycolic acid potentially involved in the synthesis of oxygenated mycolic acids of the
Mycobacterium tuberculosis complex. European journal of biochemistry / FEBS 250: 758-763
Quémard A, Sacchettini J, Dessen A, Vilcheze C, Bittman R, Jacobs W, Blanchard J (1995) Enzymatic
characterization of the target for isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. Biochemistry 34: 82358241
Qureshi N, Sathyamoorthy N, Takayama K (1984) Biosynthesis of C30 to C56 fatty acids by an extract
of Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Journal of bacteriology 157: 46-52
130
RÉFÉRENCES
Rachman H, Strong M, Ulrichs T, Grode L, Schuchhardt J, Mollenkopf H, Kosmiadi GA, Eisenberg D,
Kaufmann SH (2006) Unique transcriptome signature of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary
tuberculosis. Infect Immun 74: 1233-1242
Ramamurthi K, Losick R (2009) Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a
bacterial protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
106: 13541-13545
Rao SP, Alonso S, Rand L, Dick T, Pethe K (2008) The protonmotive force is required for maintaining
ATP homeostasis and viability of hypoxic, nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad
Sci U S A 105: 11945-11950
Raviglione M, Pio A (2002) Evolution of WHO policies for tuberculosis control, 1948-2001. Lancet 359:
775-780
Rawat R, Whitty A, Tonge P (2003) The isoniazid-NAD adduct is a slow, tight-binding inhibitor of InhA,
the Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase: adduct affinity and drug resistance. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 13881-13886
Reddy V, Einck L, Andries K, Nacy C (2010) In vitro interactions between new antitubercular drug
candidates SQ109 and TMC207. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 2840-2846
Reed M, Pichler V, McIntosh F, Mattia A, Fallow A, Masala S, Domenech P, Zwerling A, Thibert L,
Menzies D, Schwartzman K, Behr M (2009) Major Mycobacterium tuberculosis lineages associate
with patient country of origin. Journal of clinical microbiology 47: 1119-1128
Richards DM, Hempel AM, Flärdh K, Buttner MJ, Howard M (2012) Mechanistic basis of branch-site
selection in filamentous bacteria. PLoS computational biology 8: e1002423
Rock C, Cronan J (1996) Escherichia coli as a model for the regulation of dissociable (type II) fatty acid
biosynthesis. Biochimica et biophysica acta 1302: 1-16
Roger FZ, John SB (1997) The Requirement for Manganese and Oxygen in the Isoniazid-Dependent
Inactivation of Mycobacterium tuberculosis Enoyl Reductase. Journal of the American Chemical
Society 119
Rohde K, Veiga D, Caldwell S, Balázsi G, Russell D (2012) Linking the transcriptional profiles and the
physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS
pathogens 8
Rohde K, Yates R, Purdy G, Russell D (2007) Mycobacterium tuberculosis and the environment within
the phagosome. Immunological reviews 219: 37-54
131
RÉFÉRENCES
Rozwarski D, Vilchèze C, Sugantino M, Bittman R, Sacchettini J (1999) Crystal structure of the
Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase, InhA, in complex with NAD+ and a C16 fatty acyl
substrate. The Journal of biological chemistry 274: 15582-15589
Rudner D, Pan Q, Losick R (2002) Evidence that subcellular localization of a bacterial membrane
protein is achieved by diffusion and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 99: 8701-8706
Russell D (2011) Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection.
Immunological reviews 240: 252-268
Russell D, Barry C, Flynn J (2010) Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science
(New York, NY) 328: 852-856
Russell DG, Cardona PJ, Kim MJ, Allain S, Altare F (2009) Foamy macrophages and the progression of
the human tuberculosis granuloma. Nat Immunol 10: 943-948
Sacco E, Covarrubias AS, O'Hare HM, Carroll P, Eynard N, Jones TA, Parish T, Daffe M, Backbro K,
Quemard A (2007a) The missing piece of the type II fatty acid synthase system from Mycobacterium
tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104:
14628-14633
Sacco E, Legendre V, Laval F, Zerbib D, Montrozier H, Eynard N, Guilhot C, Daffé M, Quémard A
(2007b) Rv3389C from Mycobacterium tuberculosis, a member of the (R)-specific
hydratase/dehydratase family. Biochimica et biophysica acta 1774: 303-311
Salzman V, Mondino S, Sala C, Cole S, Gago G, Gramajo H (2010) Transcriptional regulation of lipid
homeostasis in mycobacteria. Molecular microbiology 78: 64-77
Sambandamurthy V, Derrick S, Hsu T, Chen B, Larsen M, Jalapathy K, Chen M, Kim J, Porcelli S, Chan J,
Morris S, Jacobs W (2006) Mycobacterium tuberculosis DeltaRD1 DeltapanCD: a safe and limited
replicating mutant strain that protects immunocompetent and immunocompromised mice against
experimental tuberculosis. Vaccine 24: 6309-6320
Sani M, Houben E, Geurtsen J, Pierson J, de Punder K, van Zon M, Wever B, Piersma S, Jiménez C,
Daffé M, Appelmelk B, Bitter W, van der Wel N, Peters P (2010) Direct visualization by cryo-EM of the
mycobacterial capsular layer: a labile structure containing ESX-1-secreted proteins. PLoS pathogens 6
Santi I, Dhar N, Bousbaine D, Wakamoto Y, McKinney J (2013) Single-cell dynamics of the
chromosome replication and cell division cycles in mycobacteria. Nature communications 4: 2470
132
RÉFÉRENCES
Sassetti C, Boyd D, Rubin E (2003) Genes required for mycobacterial growth defined by high density
mutagenesis. Molecular microbiology 48: 77-84
Scarsdale J, Kazanina G, He X, Reynolds K, Wright H (2001) Crystal structure of the Mycobacterium
tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III. The Journal of biological chemistry 276:
20516-20522
Schaeffer M, Agnihotri G, Volker C, Kallender H, Brennan P, Lonsdale J (2001) Purification and
biochemical characterization of the Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier protein
synthases KasA and KasB. The Journal of biological chemistry 276: 47029-47037
Shaw K, Barbachyn M (2011) The oxazolidinones: past, present, and future. Annals of the New York
Academy of Sciences 1241: 48-70
Shi L, Jung Y-J, Tyagi S, Gennaro M, North R (2003) Expression of Th1-mediated immunity in mouse
lungs induces a Mycobacterium tuberculosis transcription pattern characteristic of nonreplicating
persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:
241-246
Shi L, Sohaskey CD, Kana BD, Dawes S, North RJ, Mizrahi V, Gennaro ML (2005) Changes in energy
metabolism of Mycobacterium tuberculosis in mouse lung and under in vitro conditions affecting
aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 15629-15634
Simeone R, Bobard A, Lippmann J, Bitter W, Majlessi L, Brosch R, Enninga J (2012) Phagosomal
rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS pathogens 8
Singh B, Nitharwal R, Ramesh M, Pettersson B, Kirsebom L, Dasgupta S (2013) Asymmetric growth
and division in Mycobacterium spp.: compensatory mechanisms for non-medial septa. Molecular
microbiology 88: 64-76
Sirakova TD, Dubey VS, Deb C, Daniel J, Korotkova TA, Abomoelak B, Kolattukudy PE (2006)
Identification of a diacylglycerol acyltransferase gene involved in accumulation of triacylglycerol in
Mycobacterium tuberculosis under stress. Microbiology 152: 2717-2725
Slama N, Leiba J, Eynard N, Daffé M, Kremer L, Quémard A, Molle V (2011) Negative regulation by
Ser/Thr phosphorylation of HadAB and HadBC dehydratases from Mycobacterium tuberculosis type II
fatty acid synthase system. Biochemical and biophysical research communications 412: 401-406
Slayden R, Barry C (2002) The role of KasA and KasB in the biosynthesis of meromycolic acids and
isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 82: 149-160
Songane M, Kleinnijenhuis J, Netea M, van Crevel R (2012) The role of autophagy in host defence
against Mycobacterium tuberculosis infection. Tuberculosis (Edinburgh, Scotland) 92: 388-396
133
RÉFÉRENCES
Stanley S, Kawate T, Iwase N, Shimizu M, Clatworthy A, Kazyanskaya E, Sacchettini J, Ioerger T, Siddiqi
N, Minami S, Aquadro J, Schmidt Grant S, Rubin E, Hung D (2013) Diarylcoumarins inhibit mycolic acid
biosynthesis and kill Mycobacterium tuberculosis by targeting FadD32. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 110: 11565-11570
Stephan J, Bender J, Wolschendorf F, Hoffmann C, Roth E, Mailänder C, Engelhardt H, Niederweis M
(2005) The growth rate of Mycobacterium smegmatis depends on sufficient porin-mediated influx of
nutrients. Molecular microbiology 58: 714-730
Stover C, Warrener P, VanDevanter D, Sherman D, Arain T, Langhorne M, Anderson S, Towell J, Yuan
Y, McMurray D, Kreiswirth B, Barry C, Baker W (2000) A small-molecule nitroimidazopyran drug
candidate for the treatment of tuberculosis. Nature 405: 962-966
Sudharsan S, Lei W, Alistair KB, Lynn GD, Laurent K, Gurdyal SB, James CS (2007) X-Ray Crystal
Structure of Mycobacterium tuberculosis β-Ketoacyl Acyl Carrier Protein Synthase II (mtKasB).
Journal of molecular biology 366
Sureka K, Hossain T, Mukherjee P, Chatterjee P, Datta P, Kundu M, Basu J (2010) Novel role of
phosphorylation-dependent interaction between FtsZ and FipA in mycobacterial cell division. PloS
one 5
Sweeney K, Dao D, Goldberg M, Hsu T, Venkataswamy M, Henao-Tamayo M, Ordway D, Sellers R,
Jain P, Chen B, Chen M, Kim J, Lukose R, Chan J, Orme I, Porcelli S, Jacobs W (2011) A recombinant
Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium
tuberculosis. Nature medicine 17: 1261-1268
Tahlan K, Wilson R, Kastrinsky D, Arora K, Nair V, Fischer E, Barnes S, Walker J, Alland D, Barry C,
Boshoff H (2012) SQ109 targets MmpL3, a membrane transporter of trehalose monomycolate
involved in mycolic acid donation to the cell wall core of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial
agents and chemotherapy 56: 1797-1809
Takayama K, Wang L, David H (1972) Effect of isoniazid on the in vivo mycolic acid synthesis, cell
growth, and viability of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial agents and chemotherapy 2: 2935
Tekaia F, Gordon S, Garnier T, Brosch R, Barrell B, Cole S (1999) Analysis of the proteome of
Mycobacterium tuberculosis in silico. Tubercle and lung disease : the official journal of the
International Union against Tuberculosis and Lung Disease 79: 329-342
Thanky NR, Young DB, Robertson BD (2007) Unusual features of the cell cycle in mycobacteria: polarrestricted growth and the snapping-model of cell division. Tuberculosis 87: 231-236
134
RÉFÉRENCES
Trias J, Jarlier V, Benz R (1992) Porins in the cell wall of mycobacteria. Science (New York, NY) 258:
1479-1481
Triccas JA, Parish T, Britton WJ, Gicquel B (1998) An inducible expression system permitting the
efficient purification of a recombinant antigen from Mycobacterium smegmatis. FEMS microbiology
letters 167: 151-156
Trivedi O, Arora P, Sridharan V, Tickoo R, Mohanty D, Gokhale R (2004) Enzymic activation and
transfer of fatty acids as acyl-adenylates in mycobacteria. Nature 428: 441-445
Tullius M, Harmston C, Owens C, Chim N, Morse R, McMath L, Iniguez A, Kimmey J, Sawaya M,
Whitelegge J, Horwitz M, Goulding C (2011) Discovery and characterization of a unique mycobacterial
heme acquisition system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 108: 5051-5056
Valbuena N, Letek M, Ordóñez E, Ayala J, Daniel R, Gil J, Mateos L (2007) Characterization of HMWPBPs from the rod-shaped actinomycete Corynebacterium glutamicum: peptidoglycan synthesis in
cells lacking actin-like cytoskeletal structures. Molecular microbiology 66: 643-657
van der Wel N, Hava D, Houben D, Fluitsma D, van Zon M, Pierson J, Brenner M, Peters P (2007) M.
tuberculosis and M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell
129: 1287-1298
van Kessel JC, Hatfull GF (2007) Recombineering in Mycobacterium tuberculosis. Nature methods 4:
147-152
Varela C, Rittmann D, Singh A, Krumbach K, Bhatt K, Eggeling L, Besra G, Bhatt A (2012) MmpL genes
are associated with mycolic acid metabolism in mycobacteria and corynebacteria. Chemistry &
biology 19: 498-506
Veer Reddy GP, Pardee AB (1980) Multienzyme complex for metabolic channeling in mammalian
DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences 77: 3312-3316
Velayati A, Masjedi M, Farnia… P (2009) Emergence of New Forms of Totally Drug-Resistant
Tuberculosis BacilliSuper Extensively Drug-Resistant Tuberculosis or Totally Drug-Resistant Strains in
Iran. CHEST …
Vergne I, Chua J, Deretic V (2003) Tuberculosis toxin blocking phagosome maturation inhibits a novel
Ca2+/calmodulin-PI3K hVPS34 cascade. The Journal of experimental medicine 198: 653-659
Vergne I, Chua J, Lee H-H, Lucas M, Belisle J, Deretic V (2005) Mechanism of phagolysosome
biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 102: 4033-4038
135
RÉFÉRENCES
Veyron-Churlet R, Bigot S, Guerrini O, Verdoux S, Malaga W, Daffé M, Zerbib D (2005) The
Biosynthesis of Mycolic Acids in< i> Mycobacterium tuberculosis</i> Relies on Multiple Specialized
Elongation Complexes Interconnected by Specific Protein–Protein Interactions. Journal of molecular
biology 353: 847-858
Veyron-Churlet R, Guerrini O, Mourey L, Daffe M, Zerbib D (2004) Protein-protein interactions within
the Fatty Acid Synthase-II system of Mycobacterium tuberculosis are essential for mycobacterial
viability. Molecular microbiology 54: 1161-1172
Veyron-Churlet R, Molle V, Taylor R, Brown A, Besra G, Zanella-Cléon I, Fütterer K, Kremer L (2009)
The Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III activity is inhibited by
phosphorylation on a single threonine residue. The Journal of biological chemistry 284: 6414-6424
Veyron-Churlet R, Zanella-Cléon I, Cohen-Gonsaud M, Molle V, Kremer L (2010) Phosphorylation of
the Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier protein reductase MabA regulates mycolic
acid biosynthesis. The Journal of biological chemistry 285: 12714-12725
Vijay S, Anand D, Ajitkumar P (2012) Unveiling unusual features of formation of septal partition and
constriction in mycobacteria--an ultrastructural study. Journal of bacteriology 194: 702-707
Vilchèze C, Jacobs W (2007) The mechanism of isoniazid killing: clarity through the scope of genetics.
Annual review of microbiology 61: 35-50
Vilcheze C, Morbidoni HR, Weisbrod TR, Iwamoto H, Kuo M, Sacchettini JC, Jacobs WR (2000)
Inactivation of the inhA-Encoded Fatty Acid Synthase II (FASII) Enoyl-Acyl Carrier Protein Reductase
Induces Accumulation of the FASI End Products and Cell Lysis of Mycobacterium smegmatis. Journal
of bacteriology 182
Vilchèze C, Wang F, Arai M, Hazbón M, Colangeli R, Kremer L, Weisbrod T, Alland D, Sacchettini J,
Jacobs W (2006) Transfer of a point mutation in Mycobacterium tuberculosis inhA resolves the target
of isoniazid. Nature medicine 12: 1027-1029
Von Heijne G (1992) Membrane protein structure prediction: hydrophobicity analysis and the
positive-inside rule. Journal of molecular biology 225: 487-494
Voskuil MI, Schnappinger D, Visconti KC, Harrell MI, Dolganov GM, Sherman DR, Schoolnik GK (2003)
Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J
Exp Med 198: 705-713
Wakamoto Y, Dhar N, Chait R, Schneider K, Signorino-Gelo F, Leibler S, McKinney JD (2013) Dynamic
persistence of antibiotic-stressed mycobacteria. Science 339: 91-95
136
RÉFÉRENCES
Walburger A, Koul A, Ferrari G, Nguyen L, Prescianotto-Baschong C, Huygen K, Klebl B, Thompson C,
Bacher G, Pieters J (2004) Protein kinase G from pathogenic mycobacteria promotes survival within
macrophages. Science (New York, NY) 304: 1800-1804
Wang J, Thorson L, Stokes R, Santosuosso M, Huygen K, Zganiacz A, Hitt M, Xing Z (2004) Single
mucosal, but not parenteral, immunization with recombinant adenoviral-based vaccine provides
potent protection from pulmonary tuberculosis. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950) 173:
6357-6365
Watanabe S, Zimmermann M, Goodwin M, Sauer U, Barry C, Boshoff H (2011) Fumarate reductase
activity maintains an energized membrane in anaerobic Mycobacterium tuberculosis. PLoS
pathogens 7
Wayne LG (1994) Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 13: 908-914
Welch GR (1978) On the role of organized multienzyme systems in cellular metabolism: a general
synthesis. Progress in biophysics and molecular biology 32: 103-191
White S, Zheng J, Zhang Y-M, Rock (2005) The structural biology of type II fatty acid biosynthesis.
Annual review of biochemistry 74: 791-831
WHO (2011) Guidelines for the Programmatic Management of Drug-Resistant Tuberculosis: 2011
Update. World Health Organization
WHO Totg (2010) Treatment of tuberculosis: guidelines. World Health Organization
Willand N, Dirié B, Carette X, Bifani P, Singhal A, Desroses M, Leroux F, Willery E, Mathys V, DéprezPoulain R, Delcroix G, Frénois F, Aumercier M, Locht C, Villeret V, Déprez B, Baulard A (2009)
Synthetic EthR inhibitors boost antituberculous activity of ethionamide. Nature medicine 15: 537-544
Wilson R, Kumar P, Parashar V, Vilcheze C, Veyron-Churlet R, Freundlich JS, Barnes SW, Walker JR,
Szymonifka MJ, Marchiano E, Shenai S, Colangeli R, Jacobs WR, Jr., Neiditch MB, Kremer L, Alland D
(2013) Antituberculosis thiophenes define a requirement for Pks13 in mycolic acid biosynthesis.
Nature chemical biology
Winder F, Collins P (1970) Inhibition by isoniazid of synthesis of mycolic acids in Mycobacterium
tuberculosis. Journal of general microbiology 63: 41-48
Winder F, Collins P, Whelan D (1971) Effects of ethionamide and isoxyl on mycolic acid synthesis in
Mycobacterium tuberculosis BCG. Journal of general microbiology 66: 379-380
137
RÉFÉRENCES
Winkler J, Seybert A, König L, Pruggnaller S, Haselmann U, Sourjik V, Weiss M, Frangakis A, Mogk A,
Bukau B (2010) Quantitative and spatio-temporal features of protein aggregation in Escherichia coli
and consequences on protein quality control and cellular ageing. The EMBO journal 29: 910-923
Wright E (1992) Mycobacterium avium rough-to-smooth colony conversion resulting from growth in
Tween 80 without presence of type-specific glycopeptidolipid antigens. FEMS Microbiology Letters 98
Xie Z, Klionsky D (2007) Autophagosome formation: core machinery and adaptations. Nature cell
biology 9: 1102-1109
Yi-Shu H, Jing G, Hong-Mei Z, Jian-Qiang L, Xue-Lian Z, Hong-Hai W (2006) Purification and
characterization of the Mycobacterium tuberculosis FabD2, a novel malonyl-CoA:AcpM transacylase
of fatty acid synthase. Protein Expression and Purification 45
Yuan Y, Barry C (1996) A common mechanism for the biosynthesis of methoxy and cyclopropyl
mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 93: 12828-12833
Yuan Y, Crane D, Musser J, Sreevatsan S, Barry C (1997) MMAS-1, the branch point between cis- and
trans-cyclopropane-containing oxygenated mycolates in Mycobacterium tuberculosis. The Journal of
biological chemistry 272: 10041-10049
Yuan Y, Lee R, Besra G, Belisle J, Barry C (1995) Identification of a gene involved in the biosynthesis of
cyclopropanated mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 92: 6630-6634
Yuan Y, Mead D, Schroeder B, Zhu Y, Barry C (1998) The biosynthesis of mycolic acids in
Mycobacterium tuberculosis. Enzymatic methyl(ene) transfer to acyl carrier protein bound
meromycolic acid in vitro. The Journal of biological chemistry 273: 21282-21290
Zhang Y, Ioerger T, Huttenhower C, Long J, Sassetti C, Sacchettini J, Rubin E (2012) Global assessment
of genomic regions required for growth in Mycobacterium tuberculosis. PLoS pathogens 8
Zuber B, Chami M, Houssin C, Dubochet J, Griffiths G, Daffé M (2008) Direct visualization of the outer
membrane of mycobacteria and corynebacteria in their native state. Journal of bacteriology 190:
5672-5680
Zumla A, Nahid P, Cole S (2013) Advances in the development of new tuberculosis drugs and
treatment regimens. Nature reviews Drug discovery 12: 388-404
138