Développement et application d`une méthode de marquage de l
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EMERGENT Développement et application d’une méthode de marquage de l’ADN par des nanoparticules magnétiques pour définir le rôle des transferts horizontaux de gènes entre bactéries dans les processus de bio-atténuation des polluants du sol Pascal Simonet : Pascal.simonet@ec-­‐lyon.fr -­‐ Marie Frénéa-­‐Robin: marie.robin@univ-­‐lyon1.fr Établissement coordinateur: AMPÈRE, ECL, UCB Lyon 1, CNRS, F-­‐69130, ECULLY Établissements partenaires: Institut NÉEL, CNRS, F-­‐38042 Grenoble; G2ELab, CNRS, F-­‐38402 Grenoble; IPCMS, CNRS, F-­‐67034 Strasbourg POINTS FORTS CONTEXTE ET ENJEUX Vers une nouvelle approche technologique d’étude de la diversité bactérienne environnementale et des transferts horizontaux de gènes in situ. Le séquençage de très nombreux génomes bactériens a permis de révéler le rôle fondamental du transfert horizontal de gènes entre cellules de même génération pour l’adaptation bactérienne et l’évolution des génomes. Le transfert de gènes pose problème quand il induit la dissémination de gènes de résistance à des antibiotiques mais trouve son utilité quand il favorise la dégradation de molécules toxiques comme peuvent l’être certains pesticides xénobiotiques. L’étude in situ du transfert de l’information génétique entre bactéries, aussi bien pour en comprendre fondamentalement les implications évolutives et adaptatives que pour tenter de les contrôler (accélérer la dégradation des polluants, éviter la dissémination des gènes de résistance à des antibiotiques) nécessite le recours aux toutes dernières technologies d’investigation. Afin de permettre le suivi des transferts de gènes entre bactéries du sol et l’identification des bactéries réceptrices impliquées dans ces transferts (y compris celles appartenant à l’immense réservoir des non cultivables), le projet EMERGENT visait à mettre au point une nouvelle technologie consistant à conférer des propriétés magnétiques aux bactéries en vue de leur isolement sélectif à l’aide de microaimants intégrés dans des dispositifs microfluidiques. Bactérie non transformée Bactérie transformée par un ADN marqué Attraction spécifique des bactéries marquées magnétiquement B C PRODUCTIONS SCIENTIFIQUES ET BREVETS [1] Pivetal J. et al., 2014, Sensors and Actuators B: Chemical, pp.581-­‐589. [2] Pivetal J. et al., 2014, Journal of Microbiological Methods, pp.84-­‐91. [3] Pivetal J. et al., 2015, Environmental Science and Pollution Research, pp.20322-­‐20327. Au total, 10 articles en lien avec les différents champs disciplinaires (microbiologie, magnétisme, chimie de surface, microsystèmes pour la biologie). Ces travaux ont également fait l’objet de 14 communications dans des conférences internationales. Micro-­aimant A Des bactéries ayant internalisé de l’ADN marqué avec des nanoparticules magnétiques ont pu être attirées sur des films aimantés structurés. Les motifs aimantés présentent des dimensions en rapport avec la taille des bactéries manipulées (motifs carrés de dimensions pouvant atteindre 7x7 µm). Par ailleurs, les aimants présentent une structure plane ayant permis de réaliser aisément leur intégration dans des canaux microfluidiques. Toutefois, les taux de transfert restent très faibles, ce qui limite l’applicabilité de la méthode à l’étude des THG. Nous avons montré que l’approche proposée était également applicable à l’isolement spécifique de bactéries présentes dans un mélange en exploitant le principe de l’hybridation in situ magnétique (ciblage de séquences d’acides nucléiques spécifiques dans des bactéries fixées à l’aide d’une sonde marquée magnétiquement). Le dispositif de tri microfluidique a permis d’isoler des cellules cibles (Escherichia coli DH10β) présentes en faible abondance (0,04%) dans une suspension contenant 99,96% de bactéries Acinetobacter sp. ADP1 non cibles), pour produire une suspension fortement enrichie en E.coli (pureté de 99,96%). D A.Image AFM d’un brin d’ADN marqué avec des particules superparamagnétiques de taille 50 nm. B. Isolement de bactéries E.coli marquées sur un microaimant. C et D. Puce microfluidique développée. OBJECTIFS et METHODES Développement de l’outil : 1. Greffage de nanoparticules magnétiques sur des molécules d’ADN 2. Internalisation des fragments d’ADN marqués dans des bactéries 3. Isolement des cellules bactériennes marquées magnétiquement et élution des bactéries non cibles à l’aide d’une puce microfluidique intégrant un réseau de microaimants. IPCMS : Synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de nanoparticules G2Elab : Conception des microaimants, calcul de forces (simulations numériques) Institut NÉEL : Fabrication et caractérisation des microaimants AMPÈRE : Greffage des nanoparticules sur l’ADN, manipulation des bactéries et intégration microfluidique. PERSPECTIVES – Messages pour H2020 INSPIRATION Les travaux concernant le marquage des bactéries par hybridation magnétique in situ se poursuivent au laboratoire Ampère, avec l’objectif d’isoler des bactéries à partir d’une communauté extraite d’un environnement complexe comme le sol, afin de séquencer totalement leur génome. Les premières applications vont consister à cibler des bactéries majoritairement non cultivées telles que les acidobactéries, importantes tant quantitativement (avec de très nombreuses espèces différentes) que pour les fonctions réalisées in situ. Dans un second temps, la technique sera appliquée à des taxa susceptibles de contenir des représentants dont le génome possède des gènes codant des activités enzymatiques d’intérêt industriel (y compris pour la remédiation d’environnements pollués) ou de production de métabolites secondaires. Ce type de projet permet de former les futurs acteurs de la recherche (doctorants, étudiants de master) au travail à l’interface entre plusieurs champs disciplinaires (microsystèmes, physique appliquée, chimie, microbiologie). Les étudiants ainsi formés auront un profil compétitif qui leur permettra de répondre aux besoins croissants de l’industrie dans les domaines des nano-­‐ et biotechnologies et seront en mesure de proposer des. solutions innovantes appliquées au domaine de la bioingénierie environnementale.
