Techniques de purification à usage thérapeutique

Techniques de
purification d’une
population cellulaire à
usage thérapeutique
(Isolation, Séparation, Sélection)
Le 25 Novembre 2015
Phénotype: notion de CD
- Classes de différenciation (cluster of differentiation):
L’ensemble des antigènes membranaires de cellules.
- Fonction:
- Molécules d’adhérence (CD49, 54, 56, 58, 61, 62)
- L’antenne; capteur de message provenant de l’environnement
(récepteur)
(CD25/CD122 ⇒ IL-2;
CD126 ⇒ IL-6)
- Le transducteur qui délivre des message à la cellule
(CD132 ⇒ IL-2;
CD130 ⇒ IL-6)
Révélation de CDs exprimées sur les cellules
Marquage
Analyse
(Lavage)
FL
(PE)
SSC
FSC
SSC
cytométrie
SSC
Image d’un marquage sur les cellules
sanguines en cytométrie en flux
FSC
SSC
CD exprimées sur les cellules sanguines
Type de cellules
Cellules souches
Cellules myéloïde
Neutrophiles
Monocyte
Mégacaryocyte (Plaquette)
Erythrocyte
Lymphocyte
T
B
Cellules NK
CD
CD34; CD117; CD133
CD10; CD15; CD32
CD13; CD14; CD64
CD41; CD61
Glycoporine A
CD2; CD3; CD4; CD8
CD19; CD20; CD138
CD16; CD56; CD161
Sélection
(Isolation, Séparation, Purification)
Classification
•
1. Par objectif:
- Sélection positive
- Sélection négative
•
2. Par méthode:
- Physique (centrifugation)
- Immunologique (billes magnétiques;
Tri par cytométrie en flux)
- Biologique (adhésion; clonage; pharmaceutique)
Paramètres d’évaluation
- Pureté
- Rendement
- Viabilité
L’objectif de sélection:
Sélection
négative
Sélection
positive
Cellule tumorale
Cellules intéressantes
Autres cellules
Cellules intéressantes
Méthode de sélection
Méthode physique:
- Centrifugation
- Buffy-coat (Cobe Spectra)
- Ficoll
- Elutriation
Taille et densité des cellules sanguines
Taille (µ
µm)
Globules rouges
7 (6.5-7.5)
Densité
(la masse volumique)
1.098 (1.089-1.105)
Eosinophiles
12 (12-15)
1.091 (1.087-1.096)
Neutrophiles
12 (12-15)
1.088 (1.082-1.097)
Basophiles
9.5 (9-10)
1.078 (1.074-1.082)
Monocytes
15 (15-20)
1.071 (1.065-1.075)
9 (8-10)
1.063 (1.057-1.067)
2-3
1.040
Lymphocytes
Plaquettes
Vitesse de
sédimentation
Centrifugation
- Le comportement d’une particule dans un champ centrifuge peut être
exprimé par l’équation suivant:
Fa = volp * ρi * g
Poussée d’Archimède
Force Centrifuge
Fc = volp * ρp * n * g
Fnette = n . g . volp . (ρ
ρp - ρi )
Vitesse de sédimentation ∝ Fnette
Vol: volume (taille) d’une particule
ρp: densité de particule
ρi: densité de milieu
g: pesanteur
n * g: accélération centrifuge
[ n = 11,18 * r * (tpm / 100) ² ]
ρp > ρi :
V>0
ρp = ρi :
V=0
ρp < ρi :
V<0
Taille et densité des cellules sanguines
Taille (µ
µm)
Globules rouges
7 (6.5-7.5)
Densité
(la masse volumique)
1.098 (1.089-1.105)
Eosinophiles
12 (12-15)
1.091 (1.087-1.096)
Neutrophiles
12 (12-15)
1.088 (1.082-1.097)
Basophiles
9.5 (9-10)
1.078 (1.074-1.082)
Monocytes
15 (15-20)
1.071 (1.065-1.075)
9 (8-10)
1.063 (1.057-1.067)
2-3
1.040
Lymphocytes
Plaquettes
Vitesse de
sédimentation
Buffy-Coat
Buffy-coat
Neutr; Mono; Lymph
Centrifugation
Centrifugation
Globules
rouges
MINIATURISATION:
Congélation d’une unité de Sang Placentaires
Buffy Coat
Globules rouges
COBE Spectra
Sortie hématies
Sortie plasma
Entrée du sang
Sortie CMN
Spectra Optia® Apheresis System
Terumo-BCT
Ficoll
Centrifugation
Milieu (PBS, ρi = 1.0)
Fnette = n . g . volp ( ρp - ρi )
ρp
>
ρi;
V>0
( pour toutes les cellules)
ρp
Milieu de séparation (ρi = 1.077)
<
ρi;
V=0
( pour les cellules mononucléées)
ρp
>
ρi;
V>0
( pour les neutrophiles et GR)
Ficoll
Sang
Plasma
Cellules
mononucléées
Milieu de séparation
ρ = 1,077
GR
Elutriation
Centre de
rotation
Force de Flux
Force Centrifuge
La vitesse de pompe pour faire
sortir une population cellulaire
> C * d² *(
tour / min
1000 )
2
Plaquette
GR
d: diamètre de cellule
C: coefficient constant (en fonction
de type de la chambre de séparation)
Lym
Neutro
Mono
Méthode Immunologique
- Billes magnétiques (Dynal; Miltenyi)
- Tri par cytométrie en flux
Enzyme
ou
Peptide
Aimant
Aimant
Aimant
Billes Dynal (4,5 µm)
Billes Miltenyi (50 nm)
Bille
Internalisation
(Pinocytose)
Sélection d’une cellule productrice de cytokine
Méthode Immunologique:
- Billes magnétiques (Dynal; Miltenyi)
- Tri par cytométrie en flux
Cytomètre trieur
Beckman-Coulter: MoFlo Astrios
Vitèsse tri: 70,000 cellules / seconde
7 lasers, 6 voies
Méthode Biologique:
- Adhésion
- Clonage (dilution limite)
- Pharmaceutique
Adhésion sur boite plastique
Incubation 1h, à 37 °C
Déchets
(cellules non adhérentes)
Cellules adhérentes
Méthode Biologique:
- Adhésion
- Clonage (dilution limite)
- Pharmaceutique
Caractériser les clones
Amplification du clone
Méthode Biologique:
- Adhésion
- Clonage (dilution limite)
- Sélection pharmaceutique
Sélection des cellules transtectées
Promoteur
Cellule non transfectée
Gène inséré
Cellule transfectée
Gène de résistance
à la Gentamycine
Milieu de sélection (G418)
Médicaments de Thérapie Innovante (MTI) et PTC