détection indirecte - Direction des services vétérinaires
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Le choix des tests pour la detection des pathogènes Xavier Linker, M.Sc. – Account Manager M: 514-953.0267 [email protected] Plan Objectif d’un programme de santé • Pourquoi avoir un programme de santé? • Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Approche traditionnelle • Les animaux sentinelles • Détection directe (non-spécifique et semi-spécifique) ‒ Observations, nécropsie et histopathologie ‒ Parasitologie: méthodes et limites ‒ Bactériologie: méthodes et limites • Détection indirecte (spécifique) ‒ Sérologie • Limitations liées à l’approche traditionnelle L’utilisation de la PCR • La PCR • La PCR comme outil de surveillance sanitaire 1 Plan Objectif d’un programme de santé • Pourquoi avoir un programme de santé? • Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Approche traditionnelle • Les animaux sentinelles • Détection directe (non-spécifique et semi-spécifique) ‒ Observations, nécropsie et histopathologie ‒ Parasitologie: méthodes et limites ‒ Bactériologie: méthodes et limites • Détection indirecte (spécifique) ‒ Sérologie • Limitations liées à l’approche traditionnelle L’utilisation de la PCR • La PCR • La PCR comme outil de surveillance sanitaire 2 Pourquoi avoir un programme de santé? Les infections silencieuses • Les animaux sont potentiellement exposés à diverses infections • Les infections entrainant des signes cliniques sont désormais rares dans les animaleries de recherche • La plupart des infections touchant les animaleries sont silencieuses = ne provoquent aucune lésion, aucun signal d’alerte Seules des analyses en laboratoire peuvent mettre en évidence ces infections silencieuses Pourquoi rechercher ces infections? • Pas de signe clinique pour les animaux mais interférences potentielles avec les résultats de recherche • Une infection peut entrainer la modification de nombreux paramètres de recherche - Reproduction des animaux, Comportement, Réponse immunitaire, Développement des tumeurs… Création de listes d’exclusions pour pathogènes + autres agents 3 Pourquoi avoir un programme de santé? Diagnostic ou programme de santé? • Diagnostic = utiliser tous les tests possibles pour trouver la cause à un problème (mortalité d’un animal par exemple) • Programme de santé (dépistage de routine et quarantaine) = examen d’animaux « normaux » afin de s’assurer qu’ils répondent bien aux spécifications (entres autres: respect de liste d’exclusion) Les efforts se concentrent surtout sur le dépistage plutôt que sur le diagnostic 4 Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Qu’est ce qu’une infection • Définition = il s’agit de l’invasion et de la multiplication de microorganismes, tels des bactéries, des virus ou des parasites qui ne sont normalement pas présents dans l’organisme (www.medicinenet.com) • Infection clinique ou silencieuse, localisée ou systémique • La présence de microorganismes qui vivent naturellement dans le corps n’est pas considéré comme une infection (exemple: flore bactérienne intestinale) anne.decoster.free.fr 5 Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Qu’est ce qu’un parasite? • Définition = le parasitisme est une relation biologique dont un des protagonistes (le parasite) tire profit (en se nourrissant, en s'abritant ou en se reproduisant) aux dépens d'un hôte. Les parasités sont, quant à eux, appelés hôtes. (www.wikipedia.org) - En médecine vétérinaire, on appelle parasite un métazoaire ou protozoaire (n'incluant donc ni virus, ni bactérie, ni champignon). Tailles variables • Ectoparasite = le parasite est présent à l'extérieur de son hôte (parties externes comme la peau ou cavités comme les cavités buccales ou branchiales). Exemple: mites • Endoparasite = le parasite est présent dans les tissus, dans le système sanguin, dans le tube digestif ou à l'intérieur d'une cellule. Exemples: oxyures, Giardia, Entamoeba 6 Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Qu’est ce qu’une bactérie? • Définition = le terme bactérie désigne certains organismes vivants microscopiques et procaryotes présents dans tous les milieux. Le plus souvent unicellulaires (www.wikipedia.org) • Taille = généralement 0.2 à 2µm • Nombreuses formes : sphériques (coques), allongées ou en bâtonnets (bacilles), des formes plus ou moins spiralées • La plupart de ces bactéries sont inoffensives ou bénéfiques pour l’organisme mais il existe cependant de nombreuses espèces pathogènes. - Pathogènes: Salmonella spp., Streptobacillus moniliformis, Mycoplasma pulmonis… Opportunistes: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa… 7 Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Qu’est ce qu’un virus? • Définition = un virus est une entité biologique nécessitant un hôte, souvent une cellule, dont il utilise le métabolisme et ses constituants pour se répliquer. • Selon de nombreuses définitions du vivant (entité matérielle réalisant les fonctions de relation, nutrition, reproduction), les virus ne seraient pas des êtres vivants (www.wikipedia.org) • Petite taille : généralement inférieure à 0.25µm • Information génétique = ADN ou ARN - Exemples: parvovirus (MPV, MVM), coronavirus (MHV), norovirus (MNV)… hortidact.eklablog.com 8 Plan Objectif d’un programme de santé • Pourquoi avoir un programme de santé? • Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Approche traditionnelle • Les animaux sentinelles • Détection directe (non-spécifique et semi-spécifique) ‒ Observations, nécropsie et histopathologie ‒ Parasitologie: méthodes et limites ‒ Bactériologie: méthodes et limites • Détection indirecte (spécifique) ‒ Sérologie • Limitations liées à l’approche traditionnelle L’utilisation de la PCR • La PCR • La PCR comme outil de surveillance sanitaire 9 Les animaux sentinelles Voies d’excrétion des pathogènes (module formation CALAS) • Poumons (toux, éternuements…) • Tube digestif (fèces) • Fluides corporels (urine, salive…) Transmission des infections • Par contact direct entre des animaux (ou entre un animal et une personne) • Par contact indirect (par l’intermédiaire du milieu environnant) • Par des vecteurs passifs (pas de contacts) Contact direct difficile/impossible = utilisation d’animaux sentinelles (litières sales – contact indirect) pour mettre en évidence une infection 10 Détection directe: observations, nécropsie, histo Méthodes non-spécifiques • « Grand filet » • Détecte une grande variété d’agents et de lésions • Essentiellement utilisées dans une situation de diagnostic (étudier et résoudre un problème) • Les observations non-spécifiques sont nécessaires pour détecter des causes non infectieuses, telles qu’environnementales ou génétiques 11 Détection directe: observations, nécropsie, histo Observations de routine des animaux vivants • Études des déviations par rapport à la normale - Apparence - Comportement - Fèces, urines, autres excrétions http://www.research.psu.edu 12 Détection directe: observations, nécropsie, histo Nécropsie • La nécropsie peut mettre en évidence des anomalies, indépendamment de la cause 13 Détection directe: observations, nécropsie, histo Histopathologie • Il ne s’agit pas d’un outil essentiel pour la surveillance – elle est surtout utilisée pour le diagnostic des lésions. - Définition = diagnostic par l’étude microscopique des tissus Les lames sont préparées par un pathologiste Certaines colorations peuvent aider à identifier des microorganismes L’histopathologie est souvent nécessaire pour déterminer la cause 14 Détection directe: parasitologie Méthode semi-spécifique • Identification de certains groupes d’agents infectieux. On a besoin de savoir ce que l’on cherche Évaluation de la fourrure et de la peau • Observation directe et stéréoscopique • Examen microscopique - Ruban adhésif pour les mites et les œufs d’oxyures Raclage du pelage pour les mites et les dermatophytes 15 Détection directe: parasitologie Évaluation du contenu gastro-intestinal et des fèces • Observation stéréoscopique (iléon, caecum, colon) pour les helminthes, oxyures… • Observation microscopique - Préparation humide et contraste de phase pour certains protozoaires Fecal centrifugation concentration pour kystes et les œufs (protozoaires et vers) Limites de la parasitologie • Habilité et entrainement du technicien (observation) • Méthode peu spécifique • Méthode peu sensible: difficulté de l’observation, mauvaise ou non transmission de certains parasites sans contact direct entre animaux (exemple des mites) 16 Détection directe: bactériologie Méthode semi-spécifique • But = détection de certaines bactéries opportunistes et pathogènes au sein d’un microbiome large, variable et non défini. • Comment = utilisation de milieux de culture et de conditions sélectifs permettant la culture de la bactérie sélectionnée Collection des échantillons • Les échantillons doivent être collectés aux endroits les plus souvent colonisés par la bactérie - - Peau et muqueuses de surface: Corynebacterium (peau) ou Pasteurella pneumotropica (muqueuse vaginale) Voies aériennes supérieures: Streptococcus pneumoniae, Bordetella bronchiseptica Tractus gastro-intestinal: citrobacter rodentium 17 Détection directe: bactériologie Isolement des colonies bactériennes • Les écouvillons sont étalés sur un milieu de culture sélectif - Un tel milieu limite la croissance des autres bactéries et favorise la croissance de la bactérie recherchée Des centaines de milieux différents Certaines bactéries ont besoin de conditions particulières (anaérobie, températures…) Caractérisation des colonies bactériennes isolées • • • • • • Morphologie de la colonie/cellule: forme, taille, couleur… Biochimie: bandes API, système Vitek (automatisé) Identification par PCR Séquençage de gènes Analyses d’acides gras … 18 Détection directe: bactériologie Avantages de la bactériologie • Cela permet d’identifier des bactéries non communes ou des bactéries qui n’avaient pas été isolées auparavant • Discipline bien maitrisée et possibilité d’automatisation Limites de la bactériologie • Grande charge de travail • Certaines bactéries comme Proteus poussent plus facilement et peuvent masquer d’autres colonies plus petites • Les résultats négatifs doivent être considérés avec précaution - La plupart des bactéries ne sont pas cultivables Les bactéries ont pu mourir avant la mise en culture • Certaines bactéries ne se transmettent pas (ou mal) par contact indirect 19 Détection indirecte: sérologie Méthode spécifique • Détection spécifique de l’agent recherché Principe de la sérologie (détection indirecte) • La plupart des virus (mais aussi certaines bactéries ou parasites invasifs) vont entrainer une réponse immunitaire (anticorps) de l’animal • La réponse est spécifique car les anticorps vont reconnaître des antigènes « étrangers » (molécule, souvent des protéines) spécifiques à un pathogène donné (carte d’identité). • Les anticorps circulent dans le sang (et la lymphe). • La présence d’anticorps circulants peut indiquer une infection en cours ou une infection passée La sérologie est une méthode de détection indirecte = détection des anticorps (et non pas détection du pathogène directement) 20 Détection indirecte: sérologie http://jeanvilarsciences.free.fr 21 Détection indirecte: sérologie Détection des anticorps • Interactions anticorps-antigène • La plupart des tests de sérologie sont des tests en phase solide: • Un antigène est fixé sur une surface (puits) • Le sérum à tester est ajouté dans le puits, mis à incuber puis lavé • Ensuite, des anticorps anti-anticorps associés à une enzyme sont ajoutés, mis à incuber puis lavés • Enfin, on ajoute un chromogène: cette molécule réagit et change de couleur en présence de l’enzyme. L’intensité de la couleur peut-être quantitative http://acces.ens-lyon.fr 22 Détection indirecte: sérologie Méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) • Méthode en phase solide la plus répandue pour la détection de anticorps • Utilisation de plaques 96 puits permettant des analyses à moyen/haut débit • Le changement de couleur indique la présence de l’anticorps recherché (souvent utilisation d’un spectrophotomètre) http://virology-online.com/ MFIA (Multiplexed Fluorometric Immunoassay) • Utilise la technology Luminex (basée sur des billes) • Chaque antigène est lié à une bille de couleur différente – potentiellement jusqu’à 100 billes • Lecture des billes par fluorométrie 23 Détection indirecte: sérologie Dried Blood Spots • Nouvelle méthode de collection du sang pour la sérologie : 1 goutte de sang suffit - Plus besoin d’euthanasier les animaux (3R). Et donc possibilité de tester des animaux en protocole Plus besoin d’envoyer du sérum = gain de temps (plus de centrifugation) Stabilité du sang séché = possibilité de conserver 1 semaine tablette Simplicité pour l’envoi des échantillons = enveloppe 24 Détection indirecte: sérologie Les limites de la sérologie • L’animal doit être immunocompétent • Le temps de séroconversion de permet pas de mettre en évidence une infection en cours • Certains virus ne se transmettent pas ou mal par contact indirect • Pendant longtemps pas d’alternatives à la sérologie car les virus sont difficiles à cultiver et/ou isoler 25 Les limitations liées à l’approche traditionnelle Les limites liées aux techniques utilisées • Manque de spécificité • Manque de sensibilité - Les agents doivent le plus souvent être viables (culture par exemple) Bactériologie – certaines bactéries ne se cultivent pas Sérologie – temps de séroconversion • Formation du personnel (parasitologie) Les limites liées à l’utilisation des animaux sentinelles • Plusieurs virus, bactéries ou parasites se ne transmettent pas ou mal par contact indirect (litières sales). L’utilisation des racks ventilés empêche désormais la propagation des agents par l’air. • Certaines souches sont résistantes (la C57BL/6 est résistante au MPV) • Difficulté de l’échantillonnage et de la représentativité des colonies ou animaux en protocole • Problème de dilution de l’infection 26 Les limitations liées à l’approche traditionnelle Les limites liées à l’utilisation des animaux sentinelles 27 Plan Objectif d’un programme de santé • Pourquoi avoir un programme de santé? • Que recherche t’on au cours d’un bilan de santé? Approche traditionnelle • Les animaux sentinelles • Détection directe (non-spécifique et semi-spécifique) ‒ Observations, nécropsie et histopathologie ‒ Parasitologie: méthodes et limites ‒ Bactériologie: méthodes et limites • Détection indirecte (spécifique) ‒ Sérologie • Limitations liées à l’approche traditionnelle L’utilisation de la PCR • La PCR • La PCR comme outil de surveillance sanitaire 28 La PCR Méthode de détection directe • Amplification enzymatique in-vitro du matériel génétique (ADN ou ARN) • Amplification de séquences spécifiques d’acides nucléiques (ADN ou ARN) des pathogènes recherchés (virus, bactéries ou parasites) • Des cycles répétés permettent une amplification en quelques heures http://fr.wikipedia.org/ 29 La PCR Détection par gel • Le matériel génétique amplifié est ensuite séparé en utilisant un gel d’agarose (séparation en fonction de la taille) • Le matériel génétique est révélé grâce à un marqueur qui se lit aux acides nucléiques • La détection par gel pose des problèmes de lecture (faux positifs par exemple) et est laborieuse 30 La PCR La PCR fluorogénique • Utilisation d’une sonde interne afin de détecter et suivre l’amplification = plus spécifique • Utilisation de la détection fluorescente = plus sensible • Détection en temps réel = meilleure interprétation des résultats • Les puits de PCR ne sont pas ouverts = moins de contaminations croisées • Haut débit 31 La PCR comme outil de surveillance sanitaire Limites liées à l’approche traditionnelle et apport de la PCR • Manque de spécificité La PCR est plus spécifique Possibilité de détecter tous les agents de la liste d’exclusion SPF • Manque de sensibilité La PCR peut détecter des agents non cultivables/isolables La PCR peut détecter de très petites quantités d’acides nucléiques La PCR peut détecter une infection en cours: intérêt pour la quarantaine 32 La PCR comme outil de surveillance sanitaire Limites liées à l’approche traditionnelle et apport de la PCR • Problème du contact indirect (animaux sentinelles) Méthode non invasive = Fèces, swabs de la cavité orale, du pelage et de la région péri-anale Méthode non létale pour tester les animaux en protocole ou quarantaine La PCR résout le problème des agents pathogènes qui se ne transmettent pas ou mal. La grande sensibilité de la PCR permet de pooler (1:10) 33 La PCR comme outil de surveillance sanitaire Limites liées à l’approche traditionnelle et apport de la PCR • Problème de l’échantillonnage Les tests PCR environnementaux comme solution au problème de l’échantillonnage et du problème de transmission des agents pathogènes = encore besoin d’animaux sentinelles? 34 La PCR comme outil de surveillance sanitaire Les limites de la PCR • Détection d’acides nucléiques possible en l’absence d’infection Le nombre de copies peut déterminer si l’infection est en cours • Coût Pooler permet de limiter le coût • Possibilité de manquer une contamination si l’agent a été combattu par l’animal ou excrété temporairement La PCR environnementale est une solution • La PCR environnementale n’est pas compatible avec tous les systèmes de racks ventilés 35 Conclusion Comprendre ce que l’on recherche aide à construire un programme de santé efficace Le programme de santé parfait n’existe pas nécessairement • Souvent un compromis coût/efficacité • Souvent un mix de plusieurs techniques (sérologie + PCR par exemple) 36 Resources • • • • • • • • • Handbooks (x4) Workshops, webinars, seminars, lecture series Posters (criver.com) The Source JOVE Eureka AskCRL 1.888.CRIVER.1 Account Manager Customer Service 1.800.LAB.RATS Every Step of the Way.
