Evolutions technologiques, coût, accessibilité et POCs “Point of Care” Pr Christine ROUZIOUX Université Paris Descartes ADN VIH : présent Provirus intégré dans le chromosome des lymphocytes CD4 infectés Charge virale cellulaire: Diagnostic chez l’enfant par PCR en temps HIV-1 (HIV-2) ARN HIV: présent dans les particules virales libres dans le plasma sanguin Test de Charge Virale CV ou VL Technique de PCR en temps réel VL: Plasma or serum, sang total, DBS Objectif du traitement : réduire la charge virale pour bloquer la destruction des CD4 et induire une restauration immunitaire Mesurer la CV peut participer au renforcement du SUCCES virologique de l’observance Préserver un capital thérapeutique: faire durer le plus longtemps possible le succès pour éviter de devoir passer aux traitements de 2 ème ligne (chers et peu accessibles) Enjeu individuel: de bonne restauratrion immunitaire +…. Enjeu collectif: économique, réduction de risque de transmission Algorithmes à définir : ex alternance avec CD4… • La technique de biologie moléculaire la plus utilisée est la PCR en temps réel : 2 étapes: • Extraction/purification de l’acide nucléïque : ARN VIH • Amplification du gène + Détection du produit amplifié in real time • Comparaison à une gamme standard: résultat quantitatif en nombre de copies d’ARN VIH/ml Worldwide prevalence of HIV-1subtypes, CRFs and URFs HIV-1 group M : > 30 Millions infected subjects 9 non recombinants subtypes (20-30% divergence) A-BD-C-F-G-H-J-K 50 CRFs et >100s of Unique Recombinant Forms Comparisons of HIV-1 RNA assays Results with the WHO reference panel NISBC 01/466 A Strain Origin B C D AE F 92UG037 92TH014 98TZ017 94UG114 92TH001 93BR020 Uganda Thailand Tanzania AG-GH H N O RU570 V1525 YBF30 MVP5180 Uganda Thailand Brazil Russia Gabon Cameroon Cameroon Monitor 3,38 3,15 3,43 3,5 3,63 3,67 3,76 4,11 3,61 - - Nuclisens 3,55 3,53 3,59 3,81 3,53 2,33 - 2,18 - - - bDNA 3,06 3,2 3,07 3,49 3,33 3,47 3,25 3,58 2,62 - - LCx 3,57 3,4 3,44 3,71 3,64 3,53 3,34 3,62 2,48 2,18 - Real-time PCR G2 3.54 3,44 3,45 4,08 3,72 3,72 3,4 4,46 4,01 - - • Increase in HIV-1 diversity: new recombinants viruses > 50 CRF • Importance of epidemiological molecular surveys in all countries Combinations of Equipment and reagents provided by different suppliers, organized within Open Sub-networks : Equipements for NA extraction Reagents + Consumables Equipements for Amplification and Detection 16, 32, 96 samples Quiagen (Artus), Bieocentric 24, 48, 96 samples Training Maintenance Hot-line Quality control Training Maintenance Hot-line Nombreuses innovations en développement: • Automates d’extraction: différents types : extraction seule, ou extraction et distribution des réactifs • Réactifs: nouvelles chimies • Machines de PCR en temps réel : nouvelles machines plus rapides, plus solides, logiciels plus faciles From PROMEGA Automated extraction: equipment open: • Polyvalent for different types of samples : whole blood, blood plasma, urines, BAL, DBS….. • Nucleic acid extraction: DNA and RNA Quantitatives Real time PCR : • HIV1- RNA, HIV1-DNA : early infants diagnosis • HIV2-RNA, HIV 2-DNA : early infant diagnosis • TB, HBV, HCV, PCR mutations for resistant strains • HSV, VZV, CMV, EBV…Chlamydiae, • Respiratory infections: Adenoviruses, RSV, Metapneumovirus, para-influenzae… Influenzae A and B: H1N1 Est un exemple de « preuve de concept » de la faisabilité des systèmes ouverts dans les pays du Sud PCR en temps réel, ARN-HIV-1, ARN-HIV-2, HIV1+2 ADN; adapté à la diversité génétique Utilisable sur différents types de machines. Prix de réactifs 8.8 Euros (Biocentric), <5 E ADN VIH 350 000 tests produits depuis 2005 Elle a été validée par de nombreuses publications: • Pour l’ARN-VIH-1: Dabis, Rouet, Danel, Leroy, Ekouevi, Camelia NEJM) • Pour l’ADN-VIH-1: Viard, Goujard, Hoen, Dalmasso (Plos One) Avettand-Fenoel (2009) Initialement: tests au lit du malade, tests faisables par le médecin, très simples, qualitatifs et très rapides CV VIH: recherches faites pour un test moléculaire très simplifié et de faible technicité (zones rurales) Plusieurs tests sont en cours de développement et Aucun n’est encore disponible, ni validé par un marquage CEE ou FDA. Pas de publications ni d’études à grande échelle Présentations congrès: prototypes Disponibilité annoncée pour 2014, 2015…voire plus Coût???? Cible 15 dollars Category Technology General Principle In early clinical validation LIAT (IQUUM) Multiplex real-time PCR SAMBA (DRW) Isothermal amplification, Dipstick readout, plan for automation and visual read-out HDA (Biohelix) Helicase dependent amplification NAT technology that could GeneXpert Cepheid be adapted BD Max (Handylab) Multiple targets, real-time TB, MRSA Real-time microfluidic PCR Influenza Enigma (Enigma diagnostics) Twist Dx Early development Recombinase polymerase amplification (RPA) EO-NAT HIV (wave 80) Semi-Bio North-western University Eiken chemical Inverness, Abbott etc Department of Molecular Medicine and Haematology p24 Liat Tube 1. Collect sample 2. Scan barcode Time to result: 1hour 3. Insert the tube Get results 200ul plasma Assay chemistry: silica magnetic bead extraction & multiplex real-time PCR detection Liat Analyzer Internal control strategy: RNA process control to minimize likelihood of a false negative readout © IQuum, Inc. 2010 7 92% correlation with Abbott m2000 with 75 clinical specimens (clades A, B, C, and D) Training took 5 minutes Easy to use Assay takes 60 minutes y = 0.9817x + 0.1187 R2 = 0.9157 6 L iat A ssay VL (lo g 10) 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 Reference Assay VL(log10) 5 6 7 Fiscus, unpublished data 2010 (IAS, Vienna) Simple amplification-based assay (SAMBA) Cartridge prototype machine Lee H H et al. J Infect Dis. 2010;201:S65-S71 GeneXpert TB, Enterovirus, Papillomavirus HIV CONCLUSIONS Nous sommes en pleine phase d’évolution technologique Divers fabricants de machines ou de réactifs sont dans les “starting blocks” pour développer des test de CV Les systèmes ouverts sont intéressants à plusieurs titres: • Ouverts aux innovations • Ouverts à de multiples diagnostiques L’arrivée de nouveaux fabricants est essentielle pour induire de la concurrence et faire baisser les prix qui représentent le plus gros obstacle à la charge virale. La baisse des coûts est un des moyens qui va permettre d’ouvrir l’accès à la charge virale pour les patients du SUD.