VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2014
- Thèse n°
ÉLABORATION D’UNE MOLECULE DE CHIMIO-THERAPIE
POUR LE TRAITEMENT DES TUMEURS MAMMAIRES :
LES QUINOLEINES SUBSTITUEES
(STIMULANT DES JONCTIONS GAP)
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 18 décembre 2014
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
Delahaye Adélaïde
Né (e) le : 15 septembre 1988
à Evreux (27)
1
2
3
4
Remerciements
A monsieur le professeur Michel Rivoire de la faculté de médecine de Lyon, pour
avoir aimablement accepté la présidence de cette thèse,
Hommages respectueux,
Au professeur Thierry Marchal, pour m’avoir aidé dans la realisation de ce travail
alors meme que je me trouvais sur un autre continent,
Un immense merci,
Au professeur Philippe Berny, pour avoir accepté de faire partie de ce jury de
thèse et pour son soutien tout au long de ma scolarite a Vetagro Sup,
Remerciements,
5
A mes parents et ma famille sans qui je n’en serais pas la aujourdh’hui
A Dave qui m’apporte son soutien au quotidien
A Annelise, qui ma accepte dans son laboratoire et m’a tant aide dans mes
travaux de recherche
A mon groupe de Clinique, Benedicte, Chloe, Kelly, sans qui les rotations
n’auraient pas été les memes
A ma simili ancienne qui m’a été precieuse au cours de ces annees a Marcy
A mes bruns qui sont a l’origine de tant de bons souvenirs
A tous mes autres amis a Vetagro Sup, Philippe, Bernadette, Tatiana, Aurelie,
Maelys, Adeline, Justine, Celia, Helene, Thomas, Yorick, Anais
Aux amis d’avant qui restent malgre la distance
A tous ceux que j’oublie
Merci a tous
6
Sommaire
Liste des enseignants de VetAgro Sup ................................................................... 3
Remerciements ....................................................................................................... 5
Sommaire ................................................................................................................ 7
Table des illustrations ............................................................................................ 17
Table des tableaux ................................................................................................ 21
Introduction ......................................................................................................... 23
Première partie : Tissu mammaire et cancérisation ......................................... 25
I/ Formation du tissu mammaire ............................................................................ 27
A/ Embryogenèse mammaire ................................................................................ 27
i/ La glande mammaire .......................................................................................... 27
a/ L'épithélium mammaire .................................................................................. 27
b/ Le mésenchyme mammaire ........................................................................... 28
1/ Le mésenchyme dense ............................................................................... 29
2/ Le tissu précurseur du coussinet adipeux ................................................... 30
c/ Le développement des mamelons.................................................................. 31
ii/ Interactions épithélium-mésenchyme au cours de l'embryogenèse ................... 31
a/ Interactions entre épithélium mammaire et fibroblastes ................................. 31
b/ Interactions entre épithélium mammaire et tissu précurseur du coussinet adipeux ................................................................................................................... 32
iii/ Les protéines de matrice extracellulaire ............................................................ 33
B/ Développement post-natal de la glande mammaire chez la souris ................... 33
i/ Développement de la ramification ductale .......................................................... 34
a/ Le nouveau-né ............................................................................................... 34
b/ Le jeune : bourgeons terminaux et canaux .................................................... 35
ii/ Régulation de la croissance ............................................................................... 37
a/ Régulateurs de croissance systémiques ........................................................ 37
b/ Œstrogènes .................................................................................................... 37
c/ Hormones de croissance et prolactine ........................................................... 38
d/ Facteur de croissance épidermiques ............................................................. 38
iii/ Interactions épithélium-stroma .......................................................................... 39
7
a/ Croissance organotypique et stroma .............................................................. 39
b/ L'épithélium subadulte conserve un potentiel embryogénique ....................... 39
c/ Réorganisation du stroma .............................................................................. 40
d/ Synthèse d'ADN du stroma ............................................................................ 40
e/ Induction des récepteurs ................................................................................ 40
iv/ Vieillissement des cellules mammaires ............................................................ 41
II/ Carcinogenèse .................................................................................................. 43
A/ Principes de base ............................................................................................. 43
i/ Evolution clonale ................................................................................................ 43
ii/ Cycle cellulaire, senescence et apoptose .......................................................... 43
B/ Les gènes impliqués dans la carcinogenèse..................................................... 47
i/ Oncogènes ......................................................................................................... 47
a/ L'oncogène myc ............................................................................................. 48
b/ L'oncogène ras ............................................................................................... 49
c/ Le récepteur tyrosine kinase ErbB2 ............................................................... 51
d/ Les microARNs comme oncogènes ............................................................... 51
e/ Les oncogènes dans la recherche contre le cancer ....................................... 52
ii/ Gènes tumeur-suppresseurs (TSGs) ................................................................. 52
a/ Génétique des TSGs dans le cancer ............................................................. 53
1/ Hypothèse de Knudson sur l'inactivation des TSGs ................................... 53
2/ Analyse de la perte d'hétérozygotie ............................................................ 54
3/ Haploinsuffisance ....................................................................................... 57
b/ Rôle et propriétés de certains TSGs .............................................................. 57
1/ Rb ............................................................................................................... 57
2/ p53.............................................................................................................. 58
3/ Famille CIP/KIP (p21Waf1/Cip1 et p27Kip1) ...................................................... 60
iii/ Instabilité génomique ........................................................................................ 61
a/ Présentation des mécanismes de préservation de l'intégrité du génome ....... 61
b/ Tumeurs présentant une instabilité des microsatellites .................................. 62
c/ Tumeurs caractérisées par une instabilité chromosomique (CIN) .................. 63
d/ Recombinaison mitotique et cancer : l'hélicase BLM ..................................... 63
e/ Réarrangements chromosomiques dus à un dysfonctionnement des télomères ................................................................................................................. 64
8
f/ Valeur clinique de l'instabilité génomique........................................................ 64
iv/ Epigénétique ..................................................................................................... 65
a/ Méthylation de l'ADN ...................................................................................... 65
b/ Régulation de la méthylation de l'ADN et de son maintien ............................. 66
c/ Cancer et méthylation aberrante .................................................................... 66
d/ Perte d'empreinte dans le cancer ................................................................... 67
e/ Remodelage du nucléosome.......................................................................... 68
f/ Variants des histones ...................................................................................... 68
g/ Interaction dynamique entre les différents mécanismes épigénétiques ......... 68
h/ Détection du cancer ....................................................................................... 69
i/ Résistance à la thérapie .................................................................................. 69
j/ Thérapie liée à la méthylation.......................................................................... 69
v/ Importance du stroma ........................................................................................ 70
a/ La morphologie du stroma tumorale est modifiée .......................................... 71
b/ Changement du profil d'expression des fibroblastes ...................................... 72
c/ Les fibroblastes associés aux tumeurs ne sont pas toujours génétiquement
normaux ............................................................................................................. 72
d/ « Modelage » du stroma tumoral.................................................................... 73
vi/ Télomérase ....................................................................................................... 73
a/ Les télomères, des structures spécialisés ...................................................... 74
b/ Structure et activité des télomérases ............................................................. 74
c/ Régulation de l'activité des télomérases ........................................................ 75
d/ Implication thérapeutique des télomérases .................................................... 75
e/ Mécanismes alternatifs pour la maintenance des télomères .......................... 76
vii/ Angiogenèse .................................................................................................... 76
a/ L'organisation des vaisseaux tumoraux est différente de celle des vaisseaux
normaux ............................................................................................................. 76
b/ Régulation de l'angiogenèse .......................................................................... 77
c/ Déclenchement de l'angiogenèse par hypoxie ............................................... 77
d/ Autres stimuli déclenchant l'angiogenèse ...................................................... 78
e/ Vascularisation des tumeurs .......................................................................... 79
f/ Cooptation ....................................................................................................... 80
g/ Mimétisme vasculaire ..................................................................................... 80
9
h/ Vaisseaux mosaïques .................................................................................... 80
i/ Thérapie anti-angiogénique ............................................................................. 80
viii/ Métastase........................................................................................................ 81
a/ Les étapes de la métastase ........................................................................... 82
b/ Bases moléculaires ........................................................................................ 83
1/ Interactions cellule-cellule ........................................................................... 83
2/ Protéolyse de la matrice extracellulaire ...................................................... 84
3/ Gènes suppresseurs de métastases .......................................................... 85
4/ Migration et motilité des cellules cancéreuses ............................................ 85
5/ Implantation ................................................................................................ 86
c/ Implications clinique ....................................................................................... 86
C/ Aspects spécifiques .......................................................................................... 87
i/ Contexte tissulaire comme déterminant de la fonction tumeur-suppressive ou
oncogène............................................................................................................... 87
a/ Les gènes RUNX ........................................................................................... 87
b/ Les gènes Notch ............................................................................................ 89
ii/ Cellules souches cancéreuses .......................................................................... 91
iii/ Pharmacogénomique – Détermination de l'efficacité thérapeutique ................. 94
a/ Lien entre chimiothérapie / radiothérapie et apoptose ................................... 95
b/ Le gène tumeur suppresseur p53, un régulateur majeur de l'efficacité de la
thérapeutique anticancéreuse ............................................................................ 95
c/ La résistance à la thérapie est intrinsèque aux tumeurs ................................ 96
d/ Pharmacogénétique ....................................................................................... 97
1/ Les mécanismes en amont ......................................................................... 97
2/ Interaction médicament-cible ...................................................................... 98
3/ Les mécanismes en aval ............................................................................ 99
4/ Vers la thérapie individuelle ........................................................................ 99
iv/ Carcinogenèse chimique .................................................................................. 99
a/ Carcinogènes génotoxiques ......................................................................... 100
b/ Les hydrocarbones aromatiques polycycliques (PAHs) ............................... 100
c/ Les aflatoxines ............................................................................................. 100
d/ Les carcinogènes non génotoxiques ............................................................ 101
v/ Hormones et cancer ........................................................................................ 101
10
a/ Androgènes et cancer de la prostate ........................................................... 102
b/ Stéroïdes sexuels et cancer du sein ............................................................ 104
c/ GNRH (Growth Hormone Releasing Hormone) et carcinogenèse ............... 106
vi/ Oncogenèse virale .......................................................................................... 108
a/ Papillomavirus humain (HPV) ...................................................................... 109
b/ Epstein-Barr Virus (EBV).............................................................................. 111
c/ Virus de l'hépatite B (HBV) ........................................................................... 112
d/ Virus BK (BKV)............................................................................................. 112
e/ Virus de leucémie à lymphocytes T humain (HTLV) .................................... 113
f/ Virus de tumeur mammaire murin (MMTV) ................................................... 114
Deuxième partie : Développement des quinoléines substituées et test
fonctionnel sur des xénogreffes ...................................................................... 117
I/ Synthèse et activité anti-cancer du sein des quinoléines substituées .............. 119
II/ Bioactivité et cibles moléculaires de nouvelles quinoléines substituées dans des
lignées de cellules tumorales murines et humaines in vitro ................................. 127
A/ Résumé........................................................................................................... 127
B/ Introduction ..................................................................................................... 128
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 130
i/ Traitements médicamenteux, culture cellulaire et essai de prolifération ........... 130
ii/ Immunofluorescence et microscopie confocale ............................................... 132
iii/ Synthèse de macromolécules et transport de nucléosides ............................. 132
iv/ Liaison à l'ADN et tests de fragmentation ....................................................... 133
v/ Index mitotique et anomalies ........................................................................... 135
vi/ Test fluorogénic de l'activité des caspases ..................................................... 136
vii/ Analyse par Western blot du clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase-1
(PARP-1) ............................................................................................................. 137
viii/ Immunodétection du niveau protéique et de l'autophosphorylation de HER1 et
HER2 ................................................................................................................... 138
D/ Résultats ......................................................................................................... 141
i/ Inhibition de la prolifération des cellules tumorales .......................................... 141
ii/ Inhibition de l'expression de la protéine Ki-67 .................................................. 143
iii/ Inhibition de la synthèse de macromolécules et transport de nucléosides ...... 145
iv/ Liaison et fragmentation de l'ADN................................................................... 147
11
v/ Index mitotique et anomalies ........................................................................... 149
vi/ Induction du clivage de PARP-1 et de l'activation des caspases effectrices et
initiatrices ............................................................................................................ 150
vii/ Niveaux protéiques et autophosphorylation de HER1 et HER2 ..................... 152
E/ Discussion....................................................................................................... 154
III/ Les quinoléines substituées de seconde génération comme médicament anticancéreux contre le cancer du sein ..................................................................... 165
A/ Résumé........................................................................................................... 165
B/ Introduction ..................................................................................................... 165
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 168
i/ Matériaux .......................................................................................................... 168
ii/ Lignée cellulaire et culture ............................................................................... 168
iii/ Analyse par Western blot ................................................................................ 168
iv/ Activité des jonctions GAP .............................................................................. 169
v/ Croissance des colonies sur gélose molle ....................................................... 169
vi/ Exclusion au bleu Trypan................................................................................ 169
vii/ Tumeurs de xénogreffes de cellules T47D chez les souris nu/nu .................. 170
viii/ Analyse statistique ........................................................................................ 170
D/ Résultats ......................................................................................................... 170
E/ Discussion et conclusion ................................................................................. 174
IV/ Les activateurs des jonctions GAP augmentent l'efficacité du cisplatine dans la
réduction des tumeurs mammaires ..................................................................... 177
A/ Résumé........................................................................................................... 177
B/ Introduction ..................................................................................................... 178
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 180
i/ Déclaration éthique ........................................................................................... 180
ii/ Composés........................................................................................................ 180
iii/ Lignées cellulaires et culture cellulaire ............................................................ 180
iv/ Xénogreffe de cellules tumorales T47D chez la souris nude .......................... 181
v/ Analyse Western blot ....................................................................................... 181
vi/ Immunohistochimie ......................................................................................... 182
vii/ Analyse statistique ......................................................................................... 182
D/ Résultats ......................................................................................................... 183
12
i/ Croissance de xénogreffes de cellules tumorales T47D chez la souris nude ... 183
ii/ Expression de protéines des xénogreffes ........................................................ 184
iii/ Etude histologique des organes métaboliques................................................ 188
E/ Discussion....................................................................................................... 191
V/ Traitement combinatoire avec l'activateur des jonctions GAP et le tamoxifène
dans des cellules de cancer du sein .................................................................... 197
A/ Résumé........................................................................................................... 197
B/ Introduction ..................................................................................................... 198
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 201
i/ Lignées cellulaires et culture ............................................................................ 201
ii/ Morphologie cellulaire ...................................................................................... 201
iii/ Croissance des colonies en utilisant de l'agar mou......................................... 201
iv/ Test MTT ........................................................................................................ 201
v/ Analyse Western blot ....................................................................................... 202
vi/ Immunofluorescence et microscopie confocale .............................................. 203
vii/ Dosage de l'apoptose par cytométrie de flux ................................................. 203
viii/ Analyse statistique ........................................................................................ 203
D/ Résultats et discussion ................................................................................... 170
i/ Effet des PQ1 et du tamoxifène sur des protéines apoptotiques ...................... 201
ii/ Mesure de l'apoptose par la morphologie nucléaire et cytométrie de flux ........ 201
iii/ Effet de l'inhibiteur des jonctions GAP, CBX, sur les protéines Cx43, BAX,
caspase 3 et cycline D1 ...................................................................................... 201
iv/ Effet du CBX sur le test MTT, l'expression de la protéine Ki-67 et le dosage de
l'apoptose par cytométrie de flux ......................................................................... 201
E/ Conclusion ...................................................................................................... 170
F/ Importance ...................................................................................................... 170
Troisième partie : tests thérapeutiques sur un modèle de tumeurs
spontanées chez la souris MMTV-PyVT .......................................................... 219
I/ La souris transgénique MMTV-PyVT comme modèle de carcinome mammaire à
plusieurs stades et efficacité du traitement antinéoplasique ............................... 221
A/ Résumé........................................................................................................... 221
B/ Introduction ..................................................................................................... 221
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 224
i/ Animaux............................................................................................................ 224
13
ii/ Composés........................................................................................................ 225
iii/ Anticorps ......................................................................................................... 225
iv/ Analyse Western blot ...................................................................................... 226
v/ Immunohistochimie (IHC) ................................................................................ 226
vi/ Analyse statistique .......................................................................................... 227
D/ Résultats ......................................................................................................... 227
E/ Discussion....................................................................................................... 234
II/ Effet anticancéreux de la molécule PQ1 sur le modèle de souris MMTV-PyVT241
A/ Résumé........................................................................................................... 241
B/ Introduction ..................................................................................................... 242
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 244
i/ Composés ........................................................................................................ 244
ii/ Animaux ........................................................................................................... 244
iii/ Anticorps ......................................................................................................... 245
iv/ Analyse Western blot ...................................................................................... 245
v/ Immunohistochimie (IHC) ................................................................................ 245
vi/ Analyse statistique .......................................................................................... 246
D/ Résultats ......................................................................................................... 246
E/ Discussion....................................................................................................... 253
III/ Biodisponibilité et efficacité d'un stimulant des jonctions GAP (PQ7) dans un
modèle de tumeur mammaire murin .................................................................... 261
A/ Résumé........................................................................................................... 261
B/ Introduction ..................................................................................................... 262
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 264
i/ Déclaration éthique ........................................................................................... 264
ii/ Composés........................................................................................................ 264
iii/ Animaux .......................................................................................................... 264
iv/ Études de distribution des PQ7 chez la souris (HPLC et spectrométrie de
masse) ................................................................................................................ 265
a/ Extraction des PQ7 des organes et du plasma ............................................ 265
b/ Quantification de PQ7 par HPLC ................................................................. 266
v/ Spectroscopie de masse ................................................................................. 267
vi/ Anticorps ......................................................................................................... 267
14
vii/ Analyse Western blot ..................................................................................... 267
viii/ Immunohistochimie (IHC) .............................................................................. 268
ix/ Analyse statistique .......................................................................................... 268
D/ Résultats ......................................................................................................... 269
i/ Distribution des PQ7 ......................................................................................... 269
ii/ Analyse des organes vitaux après exposition aux PQ7 ................................... 271
iii/ Effet des PQ7 sur la croissance tumorale dans un modèle de formation
spontanée de tumeurs mammaires ..................................................................... 272
iv/ Analyse pathologique des tumeurs PyVT après traitement aux PQ7 ............. 275
v/ Effet de PQ7 sur l'expression de la connexine dans le tissu néoplasique ....... 277
E/ Discussion....................................................................................................... 279
IV/ Effet de molécules antinéoplasique sur un modèle de tumeur spontanée chez
le mâle ................................................................................................................. 285
A/ Résumé........................................................................................................... 285
B/ Introduction ..................................................................................................... 285
C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 289
i/ Déclaration éthique ........................................................................................... 289
ii/ Modèle de souris ............................................................................................. 290
iii/ Anticorps ......................................................................................................... 290
iv/ Immunohistochimie ......................................................................................... 291
v/ Analyse Western blot ....................................................................................... 291
vi/ Analyse statistique .......................................................................................... 292
D/ Résultats ......................................................................................................... 292
i/ Caractérisation du modèle de souris PyVT et effets du traitement sur
l'expression des récepteurs hormonaux .............................................................. 292
ii/ Effet du cisplatine sur le développement précoce des souris PyVT ................. 293
iii/ Effet du paclitaxel sur le développement précoce de PyVT souris .................. 295
iv/ Effet du tamoxifène sur le développement précoce des souris PyVT ............. 296
v/ Expression protéique dans les tumeurs isolées de souris PyVT ..................... 297
vi/ Examen pathologique des tumeurs mammaires chez le mâle ........................ 299
E/ Discussion....................................................................................................... 300
Conclusion ......................................................................................................... 305
Références bibliographiques ........................................................................... 307
15
16
Table des illustrations
Fig. 1 : Ramifications et bourgeons terminaux chez une souris femelle de 5
semaines ............................................................................................................... 36
Fig. 2 : Marquage de la glande mammaire ............................................................ 37
Fig. 3 : Reponse a l’EGF chez la souris ovariectomisee ....................................... 38
Fig. 4 : Transplantations successives de tissu mammaire .................................... 42
Fig. 5 : Diminution du taux de croissance de 15% a chaque generation ............... 42
Fig. 6 : Cycle cellulaire .......................................................................................... 44
Fig. 7 Voie majeure d’induction de la senescence ................................................ 45
Fig. 8 : Deux voies principales d’induction de l’apoptose ...................................... 46
Fig. 9 : Formation de foci ....................................................................................... 47
Fig. 10 : L’oncogene Myc et la proteine Max ......................................................... 49
Fig. 11 : Régulation de la protéine p21 par GEF et GAP ....................................... 50
Fig. 12 : Hypothese de Knudson ........................................................................... 54
Fig. 13 : Perte d’heterozygotie............................................................................... 55
Fig. 14 : Analyse de la perte d’heterozygotie......................................................... 56
Fig. 15 : Region minimale de deletion ................................................................... 56
Fig. 16 : Régulation de la protéine Rb ................................................................... 58
Fig. 17 : Régulation des TSGs Rb et p53 par Ink4a/Arf ........................................ 59
Fig. 18 : Test de tumorigénicité ............................................................................. 92
Fig. 19 : Structure du récepteur aux androgènes ................................................ 103
Fig. 20 : Surexpression des récepteurs aux androgènes en réponse à la thérapie
............................................................................................................................ 104
Fig. 21 : Structure et formules des quinoléines substituées ................................ 120
Fig. 22 : Préparation du 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole
(compose 13) ...................................................................................................... 121
Fig. 23 : Préparation de la quinoléine 14 ............................................................. 122
Fig. 24 : Synthèse des quinoléines substituées 1 à 4 .......................................... 123
Fig. 25 : Synthèse des quinoléines substituées 5, 6 et 7..................................... 124
Fig. 26 : Structures des differentes quinoleines substituees ............................... 143
Fig. 27 : Inhibition de la croissance des cellules L1210 par differentes PQ à 2 et 4
jours .................................................................................................................... 143
17
Fig. 28 : Inhibition de la croissance des cellules tumorales Pan02, A-431, BT-474
et SK-BR-3 par PQ1 à 2 et 4 jours ...................................................................... 143
Fig. 29 : Inhibition de l’expression de la proteine Ki-67 par PQ1 ......................... 144
Fig. 30 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-thymidine par differentes
concentrations de PQ1 ........................................................................................ 146
Fig. 31 : Inhibition du transport cellulaire des bases puriques et pyrimidiques dans
des cellules L1210............................................................................................... 146
Fig. 32 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-uridine dans l’ARN et de [3H]-leucine
dans les proteines par differentes concentrations de PQ1 .................................. 146
Fig. 33 : Inhibition de la liaison du bromure d’ethidium a l’ADN........................... 147
Fig. 34 : Induction de la fragmentation de l’ADN ................................................. 148
Fig. 35 : Gel de fragmentation de l’ADN .............................................................. 149
Fig. 36 : Clivage de la protéine PARP-1 dans des cellules L1210....................... 151
Fig. 37 : Test fluorogenic de l’activation des caspases initiatrices et effectrices
dans des cellules L1210 ...................................................................................... 152
Fig. 38 : Immunodetection du niveau des recepteurs HER1 et HER2 ................. 153
Fig. 39 : Inhibition de la phosphorylation des récepteurs HER1 et HER2 dans des
cellules A-431 et SK-BR-3 ................................................................................... 154
Fig. 40 : Activité des jonctions GAP .................................................................... 171
Fig. 41 : Formation de colonies sur gélose molle ................................................ 172
Fig. 42 : Effet des PQ7 sur la viabilité cellulaire .................................................. 172
Fig. 43 : Effet des PQ7 sur l’expression de Cx43 dans des cellules T47D .......... 173
Fig. 44 : Effet des PQ7 sur les caspases 9 activées ........................................... 173
Fig. 45 : Croissance de xénogreffes de cellules T47D chez des souris nu/nu
préalablement traitées au 17β-œstradiol ............................................................. 174
Fig. 46 : Croissance de xénogreffes chez la souris nude .................................... 183
Fig. 47 : Immunohistochimie sur des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D . 184
Fig. 48 : Expression protéique dans des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D
............................................................................................................................ 186
Fig. 49 : Immunohistochimie des organes métaboliques..................................... 190
Fig. 50 : Expression de la Cx43 dans des organes prélevés sur des souris nude191
Fig. 51 : Effet des PQ1 sur la morphologie des cellules T47D ............................ 206
Fig. 52 : Réduction de croissance des colonies de cellules T47D ....................... 207
Fig. 53 : Évaluation de la prolifération des cellules T47D au moyen du test MTT207
18
Fig. 54 : Expression du marqueur de division cellulaire Ki-67 ............................. 208
Fig. 55 : Expression des protéines impliquées dans les voies de l'apoptose ...... 210
Fig. 56 : Expression des protéines survivine et BAX observée par
immunofluorescence ........................................................................................... 212
Fig. 57 : Analyse des cellules apoptotiques par marquage APO-BrdU et flow
cytométrie ............................................................................................................ 213
Fig. 58 : Etude de l'inhibition des jonctions GAP en utilisant le CBX ................... 215
Fig. 59 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT aux stades de prédéveloppement, développement précoce et développement tardif ..................... 229
Fig. 60 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT ................................... 229
Fig. 61 : Expression de marqueurs moléculaires aux trois stades de
développement .................................................................................................... 231
Fig. 62 : Evaluation histo-pathologique de tumeurs mammaires de souris PyVT
colorées à l’hemalun-éosine ................................................................................ 232
Fig. 63 : Métastases de tumeurs mammaires dans les poumons, colorées à
l’hemalun-éosine ................................................................................................. 232
Fig. 64 : Croissance tumorale chez les souris PyVT femelles ............................. 234
Fig. 65 : Croissance tumorale (en mm3) chez la femelle PyVT femelle .............. 248
Fig. 66 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle ............ 249
Fig. 67 : Expression des protéines x46, Cx43, PKC-α et survivine dans les
tumeurs PyVT aux trois stades de développement ............................................. 251
Fig. 68 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles .......... 253
Fig. 69 : Métastases de tumeurs mammaires dans l’épithélium pulmonaires ..... 254
Fig. 70 : Evaluation de tissus normaux issus de souris PyVT ............................. 256
Fig. 71 : Distribution du compose PQ7 ................................................................ 270
Fig. 72 : Effet du compose PQ7 sur l’expression des Cx43 dans les tissus
normaux .............................................................................................................. 271
Fig. 73 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT femelle ................ 273
Fig. 74 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle ............ 275
Fig. 75 : Analyse de tumeurs isolées de souris PyVT femelles 48h après la
dernière injection ................................................................................................. 276
Fig. 76 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles .......... 278
Fig. 77 : Phénotype des souris PyVT males au cours du stade précoce de
développement .................................................................................................... 294
19
Fig. 78 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT male traitée au
cisplatine ............................................................................................................. 295
Fig. 79 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT male traitée au
paclitaxel ............................................................................................................. 296
Fig. 80 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT male traitée au
tamoxifène ........................................................................................................... 297
Fig. 81 : Expression des marqueurs moléculaires Bcl-2, caspase 3, cycline D1 et
survivine .............................................................................................................. 299
20
Table des tableaux
Table 1 : Les quatre méthyltransférases majeures identifiées chez l'Homme et
leurs propriétés
Table 2 : Effets des quinoléines substituées sur l’index mitotique et la fréquence
de cellules binucléés ou avec des micronoyaux dans des cellules tumorales L1210
21
22
Introduction
Le cancer du sein est le cancer de plus grande incidence chez la femme.
L'American Cancer Society estime à plus de 230 000 le nombre de nouveaux cas
en 2014 pour les Etats-Unis seulement, soit environ 30 % de l'ensemble des
cancers chez la femme. Grâce aux progrès réalisés en terme de diagnostic, 60 %
des cancers du sein sont maintenant diagnostiqués à un stade précoce, ce qui,
conjointement avec les progrès en matière de traitement a permis d'atteindre un
taux de survie à cinq ans de 90 % dans la population caucasienne et 79 % dans la
population afro-américaine. Pour autant, le cancer du sein est la deuxième cause
de mortalité par cancer après le cancer des poumons. On estime à 40 000 le
nombre de décès par cancer du sein chez les femmes américaines en 2014, soit
15 % des décès suite à un cancer chez la femme. (1)
Les cellules cancéreuses se caractérisent par la présence d'anomalies
génétiques à l'origine d'une instabilité génomique qui permet l'accumulation de
nouvelles mutations. Parmi les anomalies observées dans les cellules de cancer
de sein, on rencontre la perte de communication intercellulaire au travers des
jonctions GAP (GJIC) en raison de la diminution d'expression ou l'absence de
jonctions GAP (2). Les jonctions GAP sont les seules jonctions des cellules
animales permettant le passage de petites molécules, jusqu'à 1,2 kDa (3). La
restauration de jonctions GAP fonctionnelles pourrait ainsi être une option
thérapeutique dans le traitement du cancer. L'association d'un activateur des
jonctions GAP avec d'autres molécules de chimiothérapies est également une
option intéressante dans la mesure où elle permettrait d'augmenter la propagation
de la molécule cytotoxique et ainsi potentiellement améliorer son efficacité.
Ce travail présente dans un premier temps la mise en place de la glande
mammaire au cours du développement et les connaissances acquises au cours
des dernières décennies sur les mécanismes de la carcinogenèse. Ensuite, nous
présenterons la partie expérimentale de cette thèse avec, dans un premier temps,
l'élaboration de l'inhibiteur des jonctions GAP et son utilisation dans un modèle de
23
xénogreffe et, dans un deuxième temps, son utilisation dans un modèle de tumeur
spontanée chez la souris PyVT-MMTV.
24
Première partie
Tissue mammaire et
cancérisation
25
26
I/ Formation du tissu mammaire
A/ Embryogenèse mammaire
La glande mammaire est un organe spécifique des mammifères. Comme
d'autres organes reproducteurs, la glande mammaire croit lentement au cours de
l'embryogenèse et de la vie du jeune mais n'est pas mature avant que le système
reproducteur devienne fonctionnel à la puberté. (4)
i/ La glande mammaire
a/ L'épithélium mammaire
La formation de la glande mammaire commence chez l'embryon de 10 à 11
jours avec l'élargissement d'une monocouche d'ectoderme du bourgeon du
membre antérieur au bourgeon du membre postérieur d'un côté puis des deux
côtés. C'est ce qu'on appelle la crête mammaire primitive. Elle a également été
décrite chez le rat et chez l'Homme. (5, 6, 7)
À 12 jours, l'embryon possède cinq pairs de bourgeons mammaires : trois
thoraciques et deux inguinales. Ils sont formés de plusieurs couches de cellules
épidermiques, légèrement élevées par rapport à la surface de l'épiderme. Il a été
proposé que le bourgeon se forme par division asymétrique des cellules à
intervalle régulier le long de la crête mammaire primitive avec disparition de la
crête entre ces foyers de proliférations. Cependant, l'index mitotique des cellules
du bourgeon est inférieur à celui des cellules épidermiques adjacentes, suggérant
que les bourgeons se forment par migration de cellules épidermiques, ce qui a été
montré par la suite. (4, 8, 9)
Chez les souris, la différenciation des gonades s'effectue à la fin du 13ème
jour de gestation, moment à partir duquel les testicules commencent à produire
des androgènes chez le mâle. Chez les femelles, la croissance de la glande
mammaire est très lente entre les 11ème et 16ème jours de gestation, sans
différenciation cellulaire, correspondant à une phase de repos. À la fin du 16ème
27
jour, le bourgeon mammaire s'allonge et pénètre le tissu précurseur du tissu
adipeux au 17ème jour. Durant les derniers jours de gestation l'épithélium croit et
se ramifie jusqu'à atteindre 15 à 20 canaux. Chez les mâles, le développement de
la glande mammaire est inhibé par les androgènes fœtaux. Au 14ème jour, le
volume de l'épithélium diminue. Au 15ème jour, la connexion entre les rudiments
mammaires et l'épiderme s'affine puis se rompt. Les rudiments mammaires sont
isolés au sein du coussinet adipeux et ne connaissent qu'une faible croissance
quand ils ne dégénèrent pas.
Lorsque les rudiments mammaires s'allongent chez la femelle à la fin du
16ème jour, ils prennent la forme d'un entonnoir dont l'embouchure est dirigée
vers l'épiderme et est en partie remplie de cellules cornées. Au même moment,
des vacuoles intercellulaires se forment en région proximale et fusionnent pour
former un canal qui se connecte ensuite au canal lactifère principal. À ce stade de
développement, la glande développe des ramifications secondaires et tertiaires. (4)
En raison de la difficulté à retirer complètement les différentes hormones de
l'embryon à un stade précoce, il n'a pas été possible d'étudier les besoins en une
hormone particulière au cours de la morphogenèse mammaire in vivo. Cependant,
des études in vitro ont montré que la glande mammaire de rat au 17ème jour
répondait aux hormones induisant la différenciation chez l'adulte parmi lesquelles
on trouve l'insuline, l'aldostérone, la prolactine, la progestérone et les œstrogènes.
En particulier, l'insuline entraine la croissance et la pénétration du mésenchyme
par l'épithélium mammaire ; la prolactine stimule la prolifération et la ramification
des canaux dans le coussinet adipeux et toutes les hormones en association
induit la production de caséine. Ainsi, l'épithélium est déjà déterminé comme
épithélium mammaire dès le 17ème jour de gestation. (10)
b/ Le mésenchyme mammaire
De nombreux organes sont composés d'une part de tissu épithélial et
d'autre part de tissu mésenchymateux. Ces deux tissus interagissent, ce qui
s'avère essentiel pour la croissance, la détermination, la morphogenèse ou encore
la différenciation. Dans le cadre du développement de la glande mammaire, on
distingue deux types de mésenchymes : un, dense, est composé de plusieurs
28
couches de fibroblastes en contact direct avec l'épithélium tandis que le second
est précurseur du coussinet adipeux. L'importance du mésenchyme dans
l'induction de la glande mammaire a été montrée par Propper. Celui-ci a retiré le
tissu mésodermique de régions mammaires et non mammaires chez des
embryons de rat de 12 jours et l'a mis en culture avec de l'épiderme de futures
régions mammaires et non mammaires. Il a constaté que l'épiderme de la future
région mammaire mis en culture avec du mésoderme non mammaire ne
développait pas de bourgeon mammaire alors qu'inversement, l'épiderme issu de
région non mammaire mis en culture avec du mésoderme mammaire développait
des bourgeons mammaires. (11-15)
1. Le mésenchyme dense
Avant 10 à 12 jours de gestation, il est difficile de le distinguer du
mésenchyme précurseur du coussinet adipeux sans utiliser de marqueurs
spécifiques. À 13 jours, ce mésenchyme est constitué de deux à trois couches de
fibroblastes autour de l'épithélium mammaire. La différenciation phénotypique
entre mâles et femelles s'opère entre le 13ème et le 15ème jour de gestation.
Chez le mâle, le mésenchyme se condense autour du bourgeon mammaire sous
l'influence des androgènes, ayant pour conséquence la régression du tissu. Chez
la femelle, le mésenchyme persiste autour de l'épithélium mais sans condensation.
Lors d'expériences avec de la testostérone radio marquée (3H-testostérone ou 3H5-dihydrotestostérone), il a été montré que le mésenchyme était la seule cible et
que de 12 à 14 jours de gestation on passait de quelques cellules à environ 3000
possédant des récepteurs. La réponse aux androgènes ne se manifeste pas avant
la fin du 13ème jour. (16-20)
Au cours du développement, ce mésenchyme présente deux fonctions
majeures : il permet l'interaction entre l'épithélium mammaire et le stroma adipeux
et il intervient dans le dimorphisme sexuel. (15, 21)
29
2. Le tissu précurseur du coussinet adipeux
Au 14ème jour de gestation, il apparaît comme un tissu dense sous les
rudiments mammaires. Si on l'isole et le transplante sous la capsule rénale, il se
différencie en tissu adipeux en environ deux semaines. Aux jours 15-16, il évolue
vers un tissu lâche qui, aux jours 16-17 contient des pré-adipocytes qui forment
des structures lobulaires, observables au rouge Soudan. Les îlots de préadipocytes augmentent en taille puis fusionnent entre eux au fur et à mesure de la
différenciation. Deux à trois jours après la naissance, l'ensemble du tissu
précurseur est converti en tissu adipeux blanc.
La différenciation du tissu adipeux mammaire s'opère avant les autres
tissus adipeux. En effet, elle s'observe avant la naissance alors que les autres
tissus adipeux, présents au niveau de l'épididyme, du mésentère ou du
mésomètre par exemple, ne se différencient que 1 à 3 jours après la naissance.
Selon la classification de Hausman et Thomas, il existe trois stades de
différenciation : le stade I au cours duquel le tissu est histologiquement distinct du
tissu conjonctif adjacent mais ne possède pas d'enzyme de la lipogenèse ; le
stade II au cours duquel les adipocytes ne sont pas morphologiquement
différenciés mais sont réactifs pour certaines enzymes et stade III au cours duquel
sont morphologiquement différenciés et réactifs pour de nombreuses enzymes. Le
tissu précurseur du coussinet adipeux est au stade I à 14 jours de gestation, au
stade II à 17 et au stade III deux à trois jours après la naissance. (22, 23)
Le tissu précurseur du coussinet adipeux est essentiel au bon
développement de la glande mammaire. En effet, si l'on sépare l'épithélium
mammaire du tissu environnant et qu'on le met en culture avec du mésenchyme
de différents organes, une glande mammaire avec canaux allongés et bourgeons
terminaux ne se développe qu'en présence du tissu précurseur du coussinet
adipeux. Le tissu mésenchymateux fibroblastique dense permet la prolifération
nodulaire de l'épithélium avec de nombreuses ramifications des canaux. (14)
30
c/ Le développement des mamelons
Les mamelons sont classés en trois grands types : le type prolifératif, le
type épithélial et le type éversif. Le type prolifératif est rencontré chez l'Homme et
de nombreux mammifères domestiques. Les cellules du mésenchyme prolifèrent
autour du cordon mammaire entrainant une élévation de l'épiderme suivie par la
formation des mamelons. Chez les rongeurs, on rencontre le type épithélial qui se
caractérise par une invagination circulaire de l'épiderme autour du cordon
mammaire au 18ème jour de gestation chez la souris et au 20ème chez le rat. Au
même moment, la croissance de l'anneau épidermique forme une zone circulaire
surélevée qui sera plus tard le mamelon. (4, 10)
ii/ Interactions épithélium-mésenchyme au cours de l'embryogenèse
Les interactions entre l'épithélium et le mésenchyme sont primordiales au
cours de l'organogenèse chez l'embryon mais aussi chez l'adulte. Le meilleur
exemple est représenté par le développement des dents : le mésenchyme affecte
l'épithélium qui à son tour affecte le mésenchyme et finalement, l'épithélium
synthétise l'énamel tandis que le mésenchyme synthétise la dentine. On observe
le même schéma au cours du développement mammaire avec le mésenchyme qui
entraine la détermination de l'épithélium et rend l'épithélium capable d'interagir
avec le stroma adipeux. Ensuite l'épithélium mammaire induit l'expression de
récepteurs aux androgènes par le mésenchyme mammaire permettant la réponse
de ce dernier aux androgènes. (12)
a/ Interactions entre épithélium mammaire et fibroblastes
L'importance
de
l'épithélium dans l'expression
de
récepteurs aux
androgènes a été montrée par co-culture de mésenchyme de jeune embryon
n'exprimant pas encore de récepteurs et d'épithélium mammaire ou non
mammaire tel que de l'épithélium pancréatique ou épidermique. Le halo de
testostérone
radio-marquée
(3H-testostérone)
couplé
aux
cellules
mésenchymateuses n'a été observé qu'avec de l'épithélium mammaire suggérant
31
que
les
récepteurs
aux
androgènes
étaient
induit
chez
les
cellules
mésenchymateuses par l'épithélium mammaire adjacent. (19)
En plus des études mentionnées précédemment, des études ont été
menées avec des souris mutées insensibles aux androgènes Xtfm. L'épithélium et
le mésenchyme mammaires ont été isolés d'animaux Tfm et sauvages puis les
différentes combinaisons de ces deux tissus ont été mises en culture en présence
d'androgène. Seules les cultures dont le mésenchyme provenait d'un animal
sauvage ont entrainé un phénotype mâle (régression du tissu mammaire),
suggérant que le mésenchyme est la cible des androgènes. (17, 24)
D'autres études similaires ont montré que la condensation des cellules
mésenchymateuses responsable de la destruction des rudiments mammaire
n'avaient lieu que lorsque le mésenchyme sauvage était attaché à la surface
épithéliale, et ce même si le mésenchyme était extrait de jeunes embryons deux
jours avant l'expression de récepteurs aux androgènes. Ceci indique que les
cellules requises pour la réponse aux androgènes sont déjà sur place et ne
migrent pas depuis une région éloignée. Par ailleurs, cette réponse est organe
spécifique mais non espèce spécifique. En effet, lorsque de l'épithélium mammaire
de souris est mis en culture avec du mésenchyme en présence de testostérone,
on n'observe une condensation du mésenchyme que lorsque ce dernier est
d'origine mammaire, et non lorsqu'il est d'origine pancréatique, pulmonaire ou
encore salivaire. En revanche, la condensation s'opère que le mésenchyme
provienne de souris, de rat ou de lapin. (18)
b/ Interactions entre épithélium mammaire et tissu précurseur du coussinet
adipeux
Au début du développement de la glande mammaire, l'épithélium est
entouré de mésenchyme mammaire dense. Ensuite, lorsque la différenciation des
cellules adipeuses commence (à 16-17 jours chez la souris et 19-20 jours chez le
rat), l'épithélium mammaire traverse la gaine de mésenchyme dense et pénètre le
tissu précurseur du coussinet adipeux. L'interaction de l'épithélium mammaire
avec ce dernier est indispensable pour la détermination des caractéristiques de
structure de la glande mammaire. En effet, si l'épithélium mammaire est
32
transplanté avec du mésenchyme dense sous la capsule rénale, il développe une
hyperplasie des canaux avec de nombreuses ramifications mais sans élongation.
En revanche, si l'épithélium est transplanté avec du tissu précurseur du coussinet
mammaire, il se développe normalement. (4, 14)
iii/ Les protéines de matrice extracellulaire
Les interactions entre deux tissus, comme épithélium et mésenchyme,
peuvent être médiées par des signaux diffusibles ou non, incluant des hormones,
des hormones de croissance ou encore des protéines de matrice extracellulaire
(MEC).
Les
principaux constituants
de
la
MEC
sont :
les
collagènes,
glycoprotéines et protéoglycanes. Parmi ceux-ci, l'épithélium synthétise de la
laminine, du sulfate de protéohéparane et du collagène de type IV tandis que le
mésenchyme produit de la fibronectine. (25-30)
La fibronectine est produite par le mésenchyme mammaire et les
fibroblastes dermiques tout au long de l'embryongenèse mammaire. La laminine et
le sulfate de protéohéparane, en revanche, n'est présente que dans la membrane
basale située entre l'épithélium et le mésenchyme au 14ème jour de gestation
chez la souris. À la fin du 16ème jour, les cellules précurseurs du coussinet
adipeux commencent à déposer de la matière grasse et synthétisent de la
laminine et du sulfate de protéohéparane, habituellement produits par l'épithélium,
tandis que l'épithélium croit et pénètre le tissu précurseur du coussinet adipeux. La
membrane basale est dégradée à la pointe des canaux en développement. (4, 30,
31)
B/ Développement post-natal de la glande mammaire chez la souris
À la différence de la plupart des organes, la glande mammaire subit une
grande partie de sa morphogenèse au cours de la puberté et chez l'adulte. À partir
de la puberté, les glandes mammaires se développent au sein des coussinets
adipeux. Cette caractéristique est importante dans la mesure où, contrairement
aux autres organes, l'étude du développement est rendue plus aisée, le sujet
33
n'étant plus dans l'utérus de la mère. Il est ainsi possible d'étudier le
développement des canaux, les régulations qui s'opèrent sur le tissu ou encore les
interactions entre épithélium et stroma. (4)
i/ Développement de la ramification ductale
a/ Le nouveau-né
Chez la souris nouveau-née femelle, le parenchyme mammaire consiste en
un unique canal primaire relié à la tétine auquel sont reliés des cordons de cellules
épithéliales. Les canaux sont formés d'au maximum deux ou trois couches de
cellules épithéliales et présentent de nombreuses lumières qui fusionnent
progressivement pour former de réels canaux. Les canaux se terminent en
bourgeons terminaux riches en cellules en division (32).
Au cours des trois premières semaines de vie, les canaux s'allongent et se
ramifient. Avec l'élimination des hormones maternelles par le nouveau-né, les
bourgeons terminaux présents à la naissance régressent. La croissance qui a lieu
à cette période est abolie par stérilisation, ce qui suggère que celle -ci est due aux
hormones ovariennes, bien que la maturité sexuelle ne soit pas atteinte avant
l'âge de quatre à six semaines chez les souris et les rats. (33, 34)
Il est intéressant de noter que les cellules épithéliales du fœtus à terme
semblent déjà engagées dans leur voie de différenciation. En effet, la culture de
ces cellules en présence d'hormones permet la différenciation qui se traduit par la
production de caséine. Chez le rat, cette production de caséine peut être obtenue
dès 16 jours en présence d'insuline, de glucocorticoïdes et de prolactine. (35)
Cependant ces cellules ne sont pas complètement déterminées. Greffées
au sein du mésenchyme salivaire, elles se ramifient à la manière de cellules
épithéliales salivaires et forment parfois des adénomères : l'unité sécrétrice des
glandes salivaires. Des expériences similaires ont été menées au sein de la
capsule rénale aboutissant aux mêmes résultats. Chez l'individu en lactation en
revanche, ces tissus ectopiques expriment des lactose synthétases et sécrètent
une substance similaire au lait. Ainsi, il semble que la fonction de l'épithélium
34
mammaire soit déterminée avant la naissance mais que celui-ci conserve une
certaine pluripotence. (36, 37)
La différenciation du stroma mammaire autour de la naissance est
extrêmement importante pour la différenciation de l'épithélium mammaire. La
région mammaire du fœtus présente un mésenchyme dense qui se différencie en
fin de gestation formant le coussinet adipeux. Ce coussinet adipeux est
indispensable à la morphogenèse mammaire et déterminera par la suite les limites
de l'élargissement de la glande. (38, 32)
b/ Le jeune : bourgeons terminaux et canaux
Dès l'âge de trois à quatre semaines chez la souris, un plus tard chez le rat,
les bourgeons terminaux se forment de nouveau à l’extrémité des canaux et le
taux de croissance ainsi que la ramification augmentent. Bien qu'ayant lieu avant
la puberté, ce processus est sous contrôle d'hormones ovariennes puisqu'une
ovariectomie entraine la régression des bourgeons terminaux et l'arrêt de la
croissance en quelques jours. (39, 40)
Le bourgeon terminal permet la croissance mais aussi détermine le profil de
ramification en réponse aux hormones systémiques pour la croissance et aux
signaux locaux pour la ramification. Lorsque les limites du coussinet adipeux sont
atteintes, le stroma envoie un signal entrainant la régression des bourgeons
terminaux. (41) (Fig. 1)
Les bourgeons terminaux ont un diamètre de 0,1 à 0,5 mm et consistent en
quatre à six couches d'épithélium cubique. La lumière est bordée de cellules en
continuité avec les canaux matures qui présentent des microvillosités sur leur face
luminale. (42)
En région basale du bourgeon terminal, les cellules de la couche
superficielle sont très différentes des cellules situées plus en profondeur. Ces
cellules de surface ne sont pas différentiées : elles ne présentent pas de polarité
cytoplasmique, ne possède pas un cytosquelette hautement organisé et ne
forment pas de jonctions avec les cellules voisines ou les cellules de la couche
inférieure. En effet, la destruction de la lame basale avec de la hyaluronidase a
pour conséquence le détachement de ces cellules de surface. (4, 42)
35
Ces cellules se différencient progressivement avec l'éloignement, en latéral,
de l'extrémité du bourgeon, en cellules myoépithéliales. En revanche, il semblerait
que certaines d'entre elles infiltrent les cellules sous-jacentes pour rejoindre les
cellules canalaires. Par ailleurs, des expériences de transplantation ont montré
que des transplants étaient capables de se régénérer dans un coussinet adipeux
dépourvu de glande mammaire. Il semblerait donc que les cellules de surface du
bourgeon soient des cellules souches pluripotentes. (42, 43, 44, 45)
Fig. 1 : Ramifications et bourgeons
terminaux chez une souris femelle de 5
semaines. Extrait de Williams et Daniel
(42)
Les canaux sont composés de deux types cellulaires : des cellules
canalaires en région centrale et des cellules myoépithéliales avec leur membrane
basale en périphérie. Il a été proposé que les cellules myoépithéliales fussent
capables de se dédifférencier et donner des cellules souches de surface au cours
de la formation de ramifications ou d'alvéoles. (32, 42)
La lame basale est synthétisée par les cellules de surface au niveau des
bourgeons terminaux et par les cellules myoépithéliales au niveau des canaux. (42,
27). Au niveau du bourgeon terminal, elle est riche en acide hyaluronique qui
pourrait servir à réduire l'adhésion afin que le bourgeon terminal puisse envahir le
coussinet adipeux. (27)
Un marquage à la 14C-thymidine montre que la réplication a lieu
essentiellement au niveau des bourgeons terminaux. (Fig. 2). Lorsque la glande
atteint les limites du coussinet adipeux, les bourgeons régressent et la glande
reste inactive jusqu'à la gestation.
36
Fig. 2 : Gauche : Marquage de la glande
mammaire à la 14C-thymidine chez une
souris de cinq semaines. Droite :
Coloration à l'hémalun. D'après Daniel et
al. (71)
ii/ Régulation de la croissance
a/ Régulateurs de croissance systémiques
Pour étudier le rôle des hormones dans la croissance de la glande
mammaire, des animaux ont été ovariectomisés, hypophysectomysés et
adrénalectomisés, conduisant à une complète régression du tissu glandulaire
mammaire. Par la suite, ils ont été traités avec des hormones stéroïdiennes et
peptidiques, seules ou en association sur une période de 30 jours.
Chez la souris jusqu'à 12 semaines, la croissance ductale est maximale
avec une association d'oestrogènes et d'hormones de croissance. Les hormones
de croissance seules stimulent fortement la croissance avant 12 semaines mais
faiblement par la suite, ce qui pourrait s'expliquer par le fait que les bourgeons
terminaux ont alors atteints les limites du coussinet adipeux. Les oestrogènes
seuls ne stimulent pas la croissance, quelque soit l'âge de l'animal. (46, 47, 48)
b/ Oestrogènes
Des animaux ovariectomisés avec un implant de 17β-oestradiol dans la
glande mammaire présentent une stimulation de la prolifération locale des
bourgeons terminaux sans affecter la glande controlatérale ce qui semble indiquer
une action paracrine de l'hormone. Par ailleurs, cet effet de l'oestradiol n'est
observé que si les cellules épithéliales sont accompagnées de cellules du stroma
ce qui souligne l'importance du micro-environnement cellulaire dans le
37
développement. Nous verrons par la suite que ce micro-environnement joue
également un rôle majeur au cours de la carcinogenèse. (49, 50, 51, 52).
c/ Hormones de croissance et prolactine
De la même manière que pour les oestrogènes, des implants d'hormones
de croissance et de prolactine sont capables de stimuler la prolifération de
l'épithélium mammaire et ce, que les animaux soient ovariectomisés ou non. (46,
47, 49, 53, 54, 55)
d/ Facteur de croissance épidermiques
Il a été montré sur culture en gel de collagène dans un milieu supplémenté
en sérum que le facteur de croissance épidermique EGF ainsi que les facteurs
permettant la production d'AMPc stimulaient la prolifération de l'épithélium
mammaire. Le même type d'expérience dans un milieu non supplémenté en
sérum a montré que l'association d'insuline, EGF, transferrine, sérum albumine
bovin et choléra toxine pouvait accroitre la prolifération cellulaire d'un facteur 10
en l'espace de 10 jours. Inversement, en l'absence d'EGF et d'insuline, la
croissance est inhibée. Enfin, EGF agit en synergie avec la prolactine et la
progestérone pour stimuler la croissance. (56, 57, 58)
Des expériences d'implants d'EGF chez des souris ovariectomisées ont
montré que l'action du facteur de croissance était dose dépendante. (Fig. 3)
Fig. 3 : Réponse à l'EGF dose-dépendante
chez la souris ovariectomisée. Extrait de
Coleman et al. (49)
38
iii/ Interactions épithélium-stroma
a/ Croissance organotypique et stroma
Les cellules épithéliales mammaires sont incapables de former des canaux
et des bourgeons terminaux in vitro, même si elles sont mises en culture dans un
gel de collagène, ce qui suggère que la présence du stroma est indispensable au
développement de la glande mammaire. Les cellules sont cependant toujours
capables de subir la morphogenèse normale. En effet, des cellules épithéliales
mammaires issues de cultures cellulaires sont capables de former des
ramifications de nouveau lorsqu'elles sont placées dans un coussinet adipeux
dépourvu de parenchyme. (53, 54, 59)
Il est intéressant de constater que si l'on injecte dans le coussinet adipeux
de souris du collagène de type I que l'on laisse polymériser puis que l'on introduit
un fragment de canal mammaire, en trois à six jours, ce dernier prend un aspect
cranté en raison de la formation de cul-de-sacs épithéliaux semblables à ceux
formés in vitro en gel de collagène. Lorsque les cellules atteignent le coussinet
adipeux, des bourgeons terminaux normaux se forment, ce qui souligne
l'importance du tissu adipeux pour le développement de l'épithélium mammaire.
(60)
b/ L'épithélium subadulte conserve un potentiel embryonique
Chez le jeune, l'épithélium mammaire est encore sensible au mésenchyme
embryonnaire. Ainsi, des cellules épithéliales mammaires de l'animal subadulte
transplantées dans du mésenchyme salivaire développent une morphologie de
glande salivaire. En revanche, le même transplant dans du mésenchyme
pulmonaire, pancréatique ou méta-néphrogénique n'a pas d'effet, ce qui montre
que la plasticité est réduite. La gestation rend ces cellules unipotentes, avec
absence de réponse à une transplantation dans du mésenchyme salivaire. (61)
39
c/ Réorganisation du stroma
La région comprise entre le bourgeon terminal et le canal mammaire est
une zone de forte activité morphogénique où, en l'espace de 200 à 300 μm, le
diamètre du bourgeon terminal est réduit d'un facteur dix pour atteindre le
diamètre du canal. De façon concomitante, le stroma s'enrichit en fibrocytes qui
s'orientent le long des flancs du bourgeon terminal et du canal mammaire et
produisent du collagène. (42)
Au cours de la formation des fibrocytes, du glycosaminoglycane est
synthétisé, en particulier de la chondroïtine sulfate. (27, 62)
d/ Synthèse d'ADN du stroma
Des expériences de radio marquage chez la souris et le rat ont montré de
la synthèse d'ADN au sein du stroma jusqu'à 250 μm de distance du bourgeon
terminal, avec une réplication décroissante au fur et à mesure de l'éloignement du
bourgeon terminal. En revanche, les canaux en régression et l'épithélium
mammaire sénescents ne sont pas associés à de la synthèse d'ADN dans le
stroma, ce qui suggère que l'épithélium en prolifération induit la synthèse d'ADN
dans le stroma. (63, 64)
Cette réponse du stroma sert à produire des fibrocytes comme expliqué
précédemment. Par ailleurs, une partie des cellules en réplication sont des
cellules endothéliales en division en raison de l'angiogenèse qui se produit dans la
glande mammaire au cours du développement.
e/ Induction des récepteurs
Des expériences d'autoradiographie des récepteurs aux EGF révèlent que
le nombre de récepteur par cellule dans le stroma est augmenté d'un facteur 5
entre le stroma adjacent aux flancs du bourgeon terminal et le stroma éloigné du
bourgeon ; ce qui suggère que l'épithélium en croissance induit une activité des
récepteurs aux EGF de façon locale. Chez l'embryon mâle, l'épithélium mammaire
entraîne l'expression de récepteurs aux androgènes dans les cellules du
40
mésenchyme adjacentes. Plus tard, ces cellules participent à la destruction des
rudiments mammaires induite par les androgènes. (49, 65, 66)
iv/ Vieillissement des cellules mammaires
Les cellules, non immortalisées ou transformées, en culture présentent un
potentiel de croissance limité, proportionnel à l'espérance de vie de l'espèce du
donneur et qui ne peut pas être significativement accru par des modifications du
milieu de culture. (19, 68, 69)
Les milieux de culture n'étant pas un bon reflet du micro-environnement des
cellules in vivo, des expériences de transplantations séquentielles au cours
desquelles l'épithélium mammaire est transplanté de façon successive dans de
nouveaux coussinets mammaires dépourvus de glande mammaire chez des
animaux jeunes permet de reproduire des interactions normales épithélium-stroma
dans des conditions physiologiques. Ces expériences ont permis de mieux
comprendre le vieillissement des cellules mammaires :
1. Les cellules mammaires ont une espérance de vie limitée, même dans des
conditions jugées optimales (Fig. 4). La croissance décroit de 15 % en moyenne à
chaque génération (Fig. 5). Cette baisse de croissance reflète la sénescence
cellulaire.
2. La sénescence est liée au nombre de divisions cellulaire et non au temps
écoulé.
3. Les nodules alvéolaires hyperplasiés (lésions pré-cancéreuses) sont formés de
cellules immortalisées qui n'entrent pas en sénescence.
4. La sénescence des cellules mammaires résulte d'une perte progressive de
capacité à répondre aux facteurs mitogènes. Le tissu sénescent, qui a perdu sa
capacité de prolifération chez la souris vierge peut cependant être stimulé et
proliférer de nouveau en réponse à des signaux hormonaux différents comme lors
d'une gestation. Cependant, dans le cas d'une gestation, la prolifération va donner
naissance à des alvéoles et non à des bourgeons terminaux.
5. Les cellules mammaires sénescentes peuvent entrer en division en réponse à
la choléra-toxine, un stimulant de la production d'AMPc ; ce qui est en accord avec
l'hypothèse selon laquelle, suite à une exposition répétée à un facteur mitogène, la
41
cellule cesse de répondre et entre en sénescence. (43, 45, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78)
Fig. 4 : Transplantations successives de tissu
mammaire
(3
mois
entre
chaque
transplantation). A. Première génération : tout le
coussinet adipeux est occupé B. Quatrième
génération : tissu de 16 mois, seuls 25 % du
coussinet adipeux sont occupés. Issu de Daniel
et al. (71)
Fig. 5 : Diminution du taux de
croissance de 15 % à chaque
génération. Issu de Daniel et al. (71)
42
II/ Carcinogenèse
A/ Principes de base
i/ Evolution clonale
Le cancer est une maladie qui a une base génétique. Que la tumeur soit
due à un virus ou à un autre carcinogène, l'ADN des cellules tumorales est
toujours affecté. Il s'agit également d'une maladie présentant une progression
clonale. En effet, la tumeur a pour origine une seule cellule qui se divise et donne
naissance à un grand nombre de clones. Au fur et à mesure que les cellules
accumulent des mutations, les cellules présentant les caractéristiques les plus
agressifs, tels que croissance rapide ou résistance à certaines molécules de
chimiothérapies deviennent prédominantes. Certaines tumeurs sont dites
polyclonales car provenant de plusieurs cellules, porteuses de mutations
différentes, chacune progressant de façon clonale. Ces tumeurs sont encore plus
difficiles à traiter en raison de leur polymorphisme.
ii/ Cycle cellulaire, senescence et apoptose
L'une des caractéristiques majeures des tumeurs malignes est la
dérégulation de l'équilibre entre division et mort cellulaires. Dans des conditions
normales, l'équilibre peut être rompu, en faveur de la division cellulaire au cours
du développement par exemple ou en faveur de la mort cellulaire au cours de
l'involution du tissu mammaire post lactation par exemple. Ceci étant, ce
déséquilibre est toujours hautement contrôlé, ce qui n’est pas le cas dans les
cellules cancéreuses. En effet, ces dernières échappent aux signaux contrôlant la
division et la mort cellulaires et les détournent à leur avantage afin de se
développer aux dépends des cellules avoisinantes.
Le cycle cellulaire se divise en quatre phases majeures nommées G1, S, G2
et M (Fig. 6). La réplication de l'ADN a lieu au cours de la phase S, alors que la
mitose et la cytokinèse ont lieu au cours de la phase M. Les phases G1 et G2 sont
43
des phases de préparation aux phases S et M, respectivement. Ce sont les
phases sujettes aux plus importantes régulations. Les cyclines et kinases
dépendantes des cyclines (CdK) sont des protéines clefs de cette régulation. En
cas de signal de croissance, on observe une augmentation du nombre de cyclines
qui se lient et ainsi activent les CdK qui à leur tour phosphorylent des facteurs en
aval, principalement oncogènes ou tumeurs suppresseurs tels que les protéines
p53 et Rb, levant ainsi l'arrêt du cycle cellulaire. La protéine CDK1 est
responsable de la sortie de la phase G1 tandis que la protéine CDK2 est
responsable de la transition G2/M. (79)
Fig. 6 : Cycle cellulaire
La présence d'inhibiteurs de croissance ou l'absence de facteurs de
croissance induisent l'arrêt du cycle cellulaire. Dans certaines conditions, comme
par exemple en présence de dommages de l'ADN ou en cas de raccourcissement
des télomères, cet arrêt est irréversible. Les cellules sont alors dites sénescentes.
Dans le cadre du cancer, ces cellules sont importantes car elles ont la capacité de
sécréter des facteurs de croissance et ainsi former un micro-environnement prooncogène, comme c'est le cas pour les fibroblastes sénescents par exemple.
Plusieurs gènes sont impliqués dans l'induction et la maintenance de la
sénescence parmi les quels on peut citer le gène tumeur suppresseur p53 et sa
cible l'inhibiteur des CDK (CDKI) p21, activés de façon transitoire après le signal
44
induisant la sénescence. Une fois que l'activité de ces gènes est réduite, un autre
CDKI, p16, est régulé à la hausse (Fig. 7). Le fait que ces trois gènes soient des
tumeur-suppresseurs montre l'importance de la sénescence comme mécanisme
anti-carcinogène (80).
En réponse à des signaux intrinsèques ou
extrinsèques, la cellule meurt ensuite part « mort
cellulaire programmée » ou apoptose. La voie
extrinsèque a pour origine des récepteurs activés
par des ligands de la famille TNF (Tumor Necrosis
Factor) tels que TRAIL (TNF-Related ApoptosisInducing Ligand). La voie intrinsèque implique les
mitochondries qui, en réponse à certains signaux
libèrent des facteurs pro-apoptotiques tels que le
cytochrome c (cyt c) dans le cytoplasme. Dans les
deux cas, l'éxécution de la réponse apoptotique
requiert l'activation de protéases : les caspases (Fig.
8 (3)). Une fois dans le cytoplasme, le cyt c forme
un complexe avec Apaf-1 (APoptosis Activating
Factor-1), de l'ATP et la procaspase-9, que l'on
nomme l'apoptosome. La procaspase-9 est activée
en caspase-9 qui est une caspase initiatrice qui à
son tour active d'autres caspases dites exécutrices
telles que caspases-3, -6 et -7. La cascade
protéolytique
phénotype
est
alors
apoptotique :
activée
entraînant
condensation
de
le
la
chromatine, fragmentation de l'ADN, rétrécissement
du noyau etc. Enfin, les vésicules apoptotiques sont
phagocytées.
Parmi les gènes importants dans la régulation de
l'apoptose figurent les membres de la famille Bcl-2
parmi lesquels certains sont pro-apoptotiques : Bcl-2, Bcl-XL et Mcl-1 alors que
d'autres sont anti-apoptotiques : Bak et Bax. La balance entre ces gènes proapoptotiques et anti-apoptotiques joue un rôle important dans la régulation de
45
l’exécution de l'apoptose. La conversion vers la malignité et le phénotype
tumorigène requiert l'acquisition de la résistance à l'apoptose. En effet, la
prolifération seule est insuffisante pour la formation cancéreuse et induit
l'apoptose de façon directe ou indirecte. A la prolifération doivent être associés
des signaux de survie produis par les facteurs de croissance qui sont souvent
surexprimés dans les cellules cancéreuses. Une forme particulière d'apoptose,
nommée « Anoikis », liée à des contacts anormaux entre cellules et matrice
pourrait jouer un rôle important dans le processus de métastase. Enfin, l'apoptose
est également induite par raccourcissement des télomères et le gène tumeur
suppresseur p53 est d'importance majeure dans cette forme d'apoptose (81).
Fig. 8 : Deux voies principales d’induction de l’apoptose. D’après Hippokratis (82)
46
B/ Les gènes impliqués dans la carcinogenèse
i/ Oncogènes
Pour être qualifié d'oncogène, un gène doit pouvoir entraîner la
transformation de cellules non cancéreuses.
Pour pouvoir l'évaluer, on réalise
deux tests, le plus souvent sur fibroblastes après (sur)expression du gène dans
les cellules :
1/ Indépendance d'ancrage et absence d'inhibition de contact. En effet les cellules
non cancéreuses, même immortalisées requièrent un attachement à une
membrane basale et cessent de proliférer lorsqu'elles deviennent confluantes. Par
opposition, les cellules cancéreuses peuvent croitre au dessus les unes des
autres et former des foci (Fig. 9). Par ailleurs, ces cellules sont mises en culture
en gel mou (moins de 1% d'agar ou agarose), où seules les cellules cancéreuses
sont capables de croitre.
Fig. 9 : Formation de foci. D’après Hippokratis (82)
2/
Formation
de
tumeurs
in
vivo.
Pour
cela,
on
utilise
des
souris
immunocompétentes, le plus souvent nude, auxquels on injecte en sous cutanée
les cellules surexprimant le gène à tester. Si des tumeurs se développent au cours
des un ou deux mois suivant l'injection, le gène peut être considéré oncogène.
Ces tests sont relativement bons et prédictifs, il faut cependant garder en
mémoire certaines limites associées. En effet, le contexte cellulaire et tissulaire
est très important pour la croissance tumorale. Ainsi, les cellules de carcinomes
mammaires MCF7 par exemple ne peuvent se développer que chez des souris
nude
supplémentées
en
hormones
co-injectées
avec
des
fibroblastes.
Inversement, la surexpression du gène à tester est extrêmement élevée par
rapport à l'expression endogène, parfois de plusieurs ordres de magnitude. De
plus, les cellules testées sont immortalisées, ce qui implique qu'elles sont déjà
porteuses d'un certain nombre de mutations. Enfin, il est à noter que les cellules
47
murines sont plus prônes à la cancérisation que les cellules humaines, en
particulier dans les conditions de ces tests.
Les oncogènes peuvent coder des protéines nucléaires (facteurs de
transcription), cytoplasmiques (enzymes solubles), membranaires (récepteurs) ou
sécrétées (facteurs de croissance). Ils sont sujets à de nombreuses mutations
donnant lieu à des allèles hyperactifs, ce qui peut se traduire par des mutations
ponctuelles générant des protéines constitutivement actives. C'est le cas des
mutations ponctuelles dans les codons 12, 13 et 16 des membres de la famille ras.
Une autre forme d'activation consiste à surexprimer le gène, sans que celui-ci ne
soit porteur de mutation. Il s'agit alors d'un changement quantitatif et non qualitatif.
Ceci peut être le résultat d'une activation de la transcription ou d'une amplification
(82)
Il est intéressant de noter que de nombreux oncogènes ont d'abord été
identifiés par l'étude de virus capables d'engendrer des cancers. On distingue
alors la version virale de l'oncogène v-onc et la version endogène, ou cellulaire, de
l'oncogène c-onc. On peut prendre src comme exemple d'un tel oncogène,
découvert par l'étude du RSV (Rous Sarcoma Virus).
a/ L'oncogène myc
L'oncogène myc est l'un des oncogènes humains les plus puissants pour
l'induction de la tumorigenèse in vitro et in vivo. Initialement identifié comme cible
de translocation dans les lymphomes primaires de Burkitt conduisant à sa
surexpression, il a ensuite été montré que sa surexpression était commune dans
les tumeurs humaines. Les protéines codées par le gène myc sont des facteurs de
transcription présentant des motifs hélice-boucle-hélice et leucine zipper. La
protéine Max peut former un hétérodimère avec la protéine Myc formant ainsi un
facteur de transcription actif. A l'inverse, lorsque la protéine Max se lie aux
protéines Mad ou Mnt, la transcription des gènes sous le contrôle de Myc est
inhibée (Fig. 10). La séquence reconnue par Myc est courte : CAYGTG, ce qui
explique que ce facteur de transcription se lie à environ 15 % des gènes humains.
L'oncogène myc est également responsable de la régulation à la hausse directe
48
du gène hTERT, codant la sous-unité catalytique des télomérases, ce qui souligne
son importance dans l'immortalisation des cellules.
Fig. 10 : L’oncogène Myc et la protéine Max. D’après Hippokratis (82)
De facon paradoxale, myc est également capable de causer l'apoptose. Par
exemple, il a été montré que myc pouvait inhiber l'activation de p21Waf1, un
inhibiteur des CDK, induite par la protéine p53. Ceci favorise la réponse
alternative engendrée par p53 qui est proapoptotique. Ceci suggère que, pour
pouvoir causer le cancer, la voie pro-apoptotique induite par myc doit être
réprimée. (83, 84, 85)
b/ L'oncogène ras
Les oncogènes ras contrôlent de nombreux processus cellulaires tels que
la prolifération, la transformation maligne et l'angiogenèse et joue aussi un rôle
d'intermédiaires dans de nombreuses voies de signalisation. Leur activation
engendre de nombreuses cascades de signalisation résultant dans la régulation
de la croissance, du développement et de l'oncogenèse.
On distingue trois membres dans la famille ras : H-ras, K-ras et N-ras. Les
gènes de la famille ras codent de petites GTPases de 21kDa p21 ras localisées à la
49
surface de la membrane plasmique. La forme active de cette protéine est liée à
une molécule de GTP alors que la forme inactive est liée à une molécule de GDP.
À la réception du signal d'activation, des facteurs spécifiques d'échange du
nucléotide guanine (GEFs) induit la formation de Ras-GTP, tandis que des
protéines d'activation des GTPases (GAPs) stimulent l'activité GTPasique de ras,
induisant la transition de ras-GTP à ras-GDP, inactivant ainsi le complexe (Fig. 11).
Fig. 11 : Régulation de la protéine p21 par GEF et GAP
Des mutants de la famille ras sont fréquemment trouvés dans les tumeurs
primaires humaines. Les mutations sont le plus souvent des substitutions d'une
seule base dans les codons 12, 13 et 61. La forme altérée de la protéine p21 ras
est insensible à la régulation par les GAP, ce qui la rend constitutivement active,
entrainant un signal mitogène indépendemment de toute stimulation par un ligand.
Parmi les nombreux effecteurs de ras, deux sont d'importance majeure :
Raf et PI3K (Phosphatidylinositide 3 Kinase). Raf est une protéine kinase activée
par des agents mitogènes MAPKKK (Mitogen-activated protein kinase kinase
kinase) qui active les sérine/thréonine protéine kinases MEK1/2 (MAPKK) qui à
leur tour activent les MAPKs. Enfin, les MAPKs sont transloquées dans le noyau
et activent par phosphorylation divers facteurs de transcription. La PI3K quant à
elle convertit le phosphatidylinositol-4,5-phosphate (PIP2) en phosphatidylinositol3, 4,5-phosphate (PIP3). La formation de PIP3 résulte dans l'activation de la
protéine kinase B / Akt qui présente une activité sérine / thréonine kinase qui
entraîne une cascade de phosphorylation. Cette cascade inhibe l'inhibition de
protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-XL par Bad, inhibe des protéases
associées à l'apoptose telles que la caspase-9 et active NF-KB en supprimant
50
l'activité de son inhibiteur IKB. Au final on observe des effets prolifératifs et antiapoptotiques. (86, 87)
c/ Le récepteur tyrosine kinase ErbB2
Les récepteurs tyrosines kinases sont des récepteurs transmembranaires
dont l'extrémité N-terminale est extra-cellulaire et présente un site de liaision pour
le ligand, tandis que l'extrémité C-terminale est intra-cellulaire et présente l'activité
kinase. En réponse à la liaison du ligand, les récepteurs peuvent s'homo ou
s'hétérodimériser, activant leur activité kinase et par suite une cascade de
phosphorylation. Parmi les différents récepteurs tyrosine kinase, la famille ErbB
est particulièrement importante dans la carcinogenèse. La famille se compose de
quatre membres : ErbB1-4. ErbB2 présente un rôle majeur dans la carcinogenèse
mais est à ce jour un récepteur orphelin, c'est à dire que l'on ne connaît pas son
ligand. Le récepteur RebB3 quant à lui ne présente pas d'activité catalytique,
uniquement une activité régulatrice. Il est intéressant de noter cependant que le
dimère ErbB2-ErbB3 présente l'activité la plus importante, plus qu’ErbB2-ErbB2
par exemple. Les ligands de ces récepteurs contiennent pour la plupart le motif
spécifique des facteurs de croissance épidermiques (EGF). Ce ne sont pour
autant pas les seuls ligands ; on peut noter en particulier la liaison du facteur de
croissance TGF-beta (transforming growth factor) avec le récepteur ErbB1. Parmi
les effecteurs des récepteurs ErbB, plusieurs ont une activité oncogène reconue,
tels que Src, c-Yes, c-Abl, PI3K ou encore Ras. (88)
d/ Les microARNs comme oncogènes
Les microARNs sont de courtes molécules d'ARN, faisant en moyenne 21
nucléotides (variant le plus souvent de 18 à 24 nucléotides) résultant de molécules
plus larges, polycistroniques maturées par des ARNases spécifiques. Il a été
montré une expression aberrante de ces microARNs dans des tumeurs primaires.
De façon intéressante, l'expression de ces microARNs semble prédire l'agressivité
de la tumeur. Une étude avec le micro-ARN mir-17-92, localisé dans une région
souvent amplifiée dans les lymphomes et autres cancers s'est avéré accélérer la
51
tumorigenèse dans un modèle de lymphome murin. Si le mécanisme d'action de
ces microARNs est à ce jour encore inconnu, ils semblent présenter un grand
intérêt pour de plus amples recherches. (89, 90)
e/ Les oncogènes dans la recherche contre le cancer
La découverte des oncogènes a permis de faire d'important progrès, en
particulier dans le diagnostic. Il est en effet possible de détecter des mutations
dans ces oncogènes avant même que le patient ne présente de signe clinique. Ils
représentent également une cible thérapeutique majeure. Ainsi le récepteur Her2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor 2), autre nom du récepteur
ErbB2, fréquemment surexprimé dans les cancers du sein hormone indépendants
avec un mauvais pronostique, peut être la cible d'un anticorps qui bloque son
activité. Un tel anticorps a été développé : trastuzumab (Herceptin). Un autre
exemple de médicaments ciblant l'activité des oncogène est trouvé avec
l'oncogène ras. Une modification post-traductionnelle de p21ras est nécessaire
pour que la protéine acquiert sa complète activité : la farnésylation, réalisée par
une enzyme appelée la farnésyl transférase. Des inhibiteurs de cette enzyme sont
actuellemet à l'étude clinique.
En plus des problèmes associés à tout médicament tels que leur possible
toxicité, les tumeurs acquièrent fréquemment de nouvelles mutations les rendant
indépendante de la mutation oncogénique d'origine. (91)
ii/ Gènes tumeur-suppresseurs (TSGs)
Ces gènes codent en général des protéines nucléaires impliquées d'une
façon relativement directe dans l'inhibition de la progression du cycle cellulaire,
l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. Il existe des exceptions comme PTEN
(Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome 10) qui est une
phosphatase à la fois pour les protéines et pour les lipides qui notamment inactive
certaines enzymes en les déphosphorylant. Une autre exception est le récepteur
IGF (Insulin-like Growth Factor) de type II qui est un récepteur membranaire.
52
En raison de leur rôle de régulation négative de la prolifération cellulaire,
leur activité normale doit être diminuée ou perdue au cours de la carcinogenèse.
Les gènes de maintien de l'intégrité de l'ADN sont aussi à classer parmi les TSGs
puisque, en effet, leur perte entraîne l'acquisition accrue de mutations. On appelle
ces derniers gènes gardiens ou « caretaker » par opposition aux gènes tumeurs
suppresseurs « classiques » contrôlant en particulier la prolifération cellulaire que
l'on appelle « gatekeeper ». Dans cette partie, on s'intéressera aux gènes
gatekeeper tandis que les caretaker seront vus plus en détail dans la partie
suivante sur l'instabilité génomique. Certains mécanismes de leur activation sont
cependant communs, bien que ces gènes soient traités dans deux sous-parties
distinctes. (82)
a/ Génétique des TSGs dans le cancer
1/ Hypothèse de Knudson sur l'inactivation des TSGs
Ce modèle a été proposé à l'origine pour le rétinoblastoma, en comparant
les formes héréditaires et non héréditaires de la maladie. Par la suite le modèle en
deux étapes de Knudson s'est avéré applicable à presque tous les TSGs. D'après
ce modèle, les deux allèles normaux doivent être inactivés pour permettre la
progression cancéreuse, requiérant donc deux atteintes génétiques pour la perte
de leur fonction. Dans les formes héréditaires, un allèle a déjà été inactivé par
délétion, mutation ou tout autre mécanisme affectant les cellules de la lignée
germinale. Les formes héréditaires progressent plus vite puisque la premèire étae
a déjà eu lieu et qu'une seule atteinte supplémentaire est requise pour la perte
d'activité du TSG (Fig. 12).
53
Fig. 12 : Hypothese de Knudson. Adaptee d’Hippokratis (82)
Ainsi, d'après ce modèle, la première étape peut être une mutation fauxsens ou une petite délétion entrainant l'inactivation d'un des deux allèles ; alors
que la deuxième étape résulte dans l'inactivation fonctionnelle de l'allèle restant
qui peut se produire par divers mécanismes. La perte d'un chromosome entier ou
la fragmentation chromosomale pourraient constituer cette seconde atteinte en
réduisant l'haplotype des TSGs à l'hémizygotie. Cependant ce ne sont pas les
seuls mécanismes d'inactivation, on peut en particulier considérer des
mécanismes épigénétiques tels que l'hyperméthylation du promoteur ou une
recombinaison mitotique qui éliminerait l'allèle sauvage et le remplace par une
copie de l'allèle muté (Fig. 13). Toutes les altérations résultant dans la perte
d'hétérozygotie des TSGs et la génération de cellules porteuses uniquement de
l'allèle muté soit homozygotes soit hémizygotes, en fonction du mécanisme les
générant, sont regroupées sous le terme général « perte d'hétérozygotie » ou LOH
(Loss Of Hétérozygotie).
2/ Analyse de la perte d'hétérozygotie
Pour réaliser une telle analyse, des marqueurs répartis dans l'ensemble du
génome sont utilisés, soit des RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
qui correspondent à la substitution d'une base unique, soit des polymorphismes de
54
microsatellites qui correspondent à un nombre de répétition différent de la
séquence microsatellite de base (Fig. 14). Dans les deux, le polymorphisme
permet de distinguer les deux allèles et par suite l'identification de la perte de l'un
de ces deux allèles dans le cas de LOH. En général, les études analyses de
banques d'échantillons pour localiser le nouveau TSG. Si un TSG est impliqué
dans la maladie, des fragments de chromosome se recoupant devraient avoir
perdu ce TSG. On appelle région minimale de délétion la portion du chromosome
qui présente la LOH avec une plus forte incidence dans plusieurs échantillons de
tumeurs ; cette région est la plus probable de contenir le TSG. Pour réduire au
maximum la taille de cette région, on utilise des marqueurs à haute densité, c'est à
dire proches les uns des autres (Fig. 15).
Fig. 13 : Perte d’heterozygotie. D’apres Hippokratis (82)
Cette analyse présente cependant des
limites qui expliquent pourquoi de nombreuses
études ne parviennent pas à identifier de TSG. La
limite majeure consiste dans le fait que la détection
de LOH suppose que la population de cellules est
homogène et a perdu l'allèle d'intérêt de façon
uniforme.
Ceci
est
incorrect
puisque
les
échantillons ne contiennent pas que des cellules
tumorales. Ils contiennent également des cellules
de
stroma
qui
sont
génétiquement
presque
normales. Par ailleurs, les cellules tumorales
présentent une hétérogénéité significative en raison du développement clonal des
cellules tumorales. En effet, seules les mutations apparues tôt au cours de la
carcinogenèse seront présentes dans l'ensemble des cellules ; toute mutation
acquise de façon plus tardive ne sera présente que dans une sous-population de
cellules tumorales. Une autre limitaion résulte dans le fait que le modèle de
Knudson, bien qu'applicable dans de nombreux cas, est trop simpliste. En effet, de
nombreuses cellules cancéreuses sont polyploïdes ou aneuploïdes.
55
Fig. 14 : Analyse de la perte d’heterozygotie. Adaptee d’Hippokratis (82)
Les avacées technologiques, en particulier les chips ADN ainsi que les
techniques de microdissection permettant d'isoler de façon précise différentes
populations cellulaires au sein de la tumeur devraient résoudre ces problèmes. (92,
93)
Fig. 15 : Region
minimale de
deletion. Adaptee
d’Hippokratis (82)
56
3/ Haploinsuffisance
D'après l'hypothèse de Knudson qui est applicable à la vaste majorité des
TSGs, ces gènes sont récessifs pour la carcinogenèse du fait qu'une mutation à
l'état hétérozygote est insuffisante pour produire les changements phénotypique et
en particulier le cancer. L'allèle restant doit également être inactivé. Cependant, il
existe des exceptions pour lesquelles le TSGs à l'état hémizygote est insuffisant
pour exercer son action tumeur suppressive. Ces gènes agissent de façon dosedépendante. C'est notamment le cas des régulateurs du cycle cellulaire de la
famille CIP/KIP, p21 et p27, respectivement.
Pour montrer qu'un TSG se comporte de façon haploinsuffisante dans la
carcinogenèse, il doit répondre à deux critères :
1/ Une délétion allélique se produit qui est associée avec la carcinogenèse
2/ L'allèle restant est exprimé dans les cellules tumorales, dans sa forme sauvage,
non affecté par aucune mutation, à plus faible niveau en raison de l'hémizygotie.
(94)
b/ Rôle et propriétés de certains TSGs
1/ Rb
Les protéines Rb et p53 sont des protéines nucléaires et sont considérées être
parmi les plus importants régulateurs du cycle cellulaire. Lorsque le gène Rb est
muté chez l'Homme, il est responsable du développement de tumeurs de la rétine :
rétinoblastoma. Il est le TSG à l'origine de l'hypothèse de Knudson. Par la suite, le
gène muté a été trouvé dans d'autres types de cancer tels que les carcinomes
pulmonaires à petites cellules ou encore les ostéosarcomes.
Rb est responsable pour l'arrêt du cycle cellulaire en G1 en se liant aux
facteurs de transcription E2F et DP1 et prévenant la transcription des gènes
nécessaires à la phase S tels que les cyclines, CDK, DNA polymérase alpha et
autres enzymes impliquées dans la réplication de l'ADN. En revanche, le fait que
cette protéine intéragisse physiquement avec plu de 100 protéines laisse à penser
que son rôle est probablement plus complexe que pensé à l'origine.
57
L'inactivation de Rb par phosphorylation est médiée par des CDKs, en
particulier CDK4 et CDK6, elles-mêmes inhibées par le TSG p16 (Fig. 16) (95, 96)
Fig. 16 : Régulation de la protéine Rb
2/ p53
La protéine p53 est mutée dans près de 50% des tumeurs primaires
humaines. Ce gène code un facteur de transcription de 53 kDa qui est considéré
comme étant le médiateur majeur de réponse de la cellule au stress par des
agents causent des dommages de l'ADN, hypoxie, oncogènes activés et autres
facteurs génotoxiques inducteurs de stress. Son activation résulte dans l'arrêt du
cycle cellulaire ou l'apoptose par liaison aux séquences régulatrices du promoteur
des gènes cibles entrainant leur activation ou leur inhibition. La protéine p53 est
sujette à de nombreuses modifications post-traductionnelles, en particulier
phosphorylation, entrainant son activation ou inactivation par changement
conformationnel affectant sa capacité de liaison spécifique à l'ADN. L'une des
voies de régulation de l'activité de p53 est sous le contrôle de Arf1 qui inhibe la
protéine Mdm2, qui est, elle même un inhibiteur de p53 activée par feedback
négatif par la forme activée de p53 (Fig. 17). (96)
58
Fig. 17 : Régulation des TSGs Rb et p53 par Ink4a/Arf.
Mdm2 peut inhiber p53 en se liant à la région N-terminale, ce qui empêche
l’interaction avec d'autres protéines critiques pour son activité de facteur de
transcription. Par ailleurs, Mdm2 présente également une activité E3 ubiquitine
ligase qui entraine la dégradation de p53 par le protéasome. Mdm2 est
fréquemment amplifié dans les tumeurs primaires, ce qui souligne son importance
dans la tumorigenèse.
L'activation de p53 peut entrainer l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose et
le contexte tissulaire semble jouer un rôle importance dans l'orientation de la
réponse. En effet, les fibroblastes répondent à l'activation de p53 suite à des
dommages de l'ADN par arrêt du cycle cellulaire tandis que les cellules
épithéliales répondent par
l'induction de l'apoptose. Trois hypothèses ont été
proposées pour expliquer cette décision.
1/ D'importants dommages de l'ADN vont entrainer une activation prolongée de
p53 aboutissent à l'apoptose tandis que des dommages moins importants
n'entrainent qu'un arrêt transitoire du cycle cellulaire.
2/ La décision est pré-déterminée en fonction du type cellulaire.
3/ La décision dépend de la disponibilité en co-facteurs exprimés dans ces
conditions. (97, 98)
La fonction de p53 est associée à sa capacité de reconnaître des
séquences
spécifiques du promoteur des gènes cibles. Cependant, de plus
59
récentes études montrent que p53 peut se lier avec une haute affinité à des
structures de l'ADN, indépendamment de leur séquence. Ces structures
comprennent de l'ADN mal assorti (mismatch) ou formant des protubérances
(bulging DNA), ce qui montre l'implication directe de p53 dans la réparation de
l'ADN. (99)
3/ Famille CIP/KIP (p21Waf1/Cip1 et p27Kip1)
L'inibiteur des CDK p21 (p21Waf1/Cip1) a d'abord été identifié comme le
premier gène dont la transcription est activée par p53. Des études récentes ont
montré que son rôle était plus complexe que la simple inhibition des CDKs et
pourrait avoir une action indépendante de l'activation par p53.
La régulation du cycle cellulaire par p21 est exercée par sa capacité à se
lier aux CDKs et inhiber leur activité. Des études récentes ont montré que des
complexes de p21, cyclines et CDKs pouvaient être trouvés dans une forme active.
Par ailleurs, dans certaines conditions, p21 peut être nécessaire pour la
progression de la phase G1 à la phase S. Il semblerait que la localisation de p21
dans la cellule joue un rôle important dans son action. Si sa localisation nucléaire
entraine l'arrêt du cycle cellulaire, sa localisation cytoplasmique pourrait entrainer
la progression du cycle cellulaire et prévenir l'apoptose. Le niveau précis de p21
pourrait également jouer un rôle clef. Le niveau basal de p21 pourrait aider à la
formation de complexes cycline/CDK et donc entrainer la progression du cycle
cellulaire tandis que des niveaux plus élevés bloqueraient l'activité des CDK.
La régulation de p21 est également réalisée par sa dégradation par le
protéasome, régulée par l'antigène de prolifération nucléaire (PCNA – Proliferating
nuclear antigen)
L'autre membre de la famille CIP/KIP est la protéine p27Kip1 qui agit de
façon similaire à p21 par sa liaison aux CDKs. Il s'agit du premier exemple de TSG
haploinsuffisant dans la carcinogenèse. (100, 101)
60
iii/ Instabilité génomique
Le haut niveau de lésions génétiques dans les cellules tumorales n'étant
pas compatible avec le taux de mutation dans les cellules normales (10 -7 mutation
/ nucléotide / division cellulaire), il a été proposé que les cellules tumorales avaient
acquis un phénotype « mutateur ». Cette hypothèse a été confirmé par la
découverte de formes familiales de cancer dans lesquels les mécanismes de
maintien de l'intégrité du génome étaient altérés parmi lesquels on peut citer
Xeroderma pigmentosum (XP) ou encore le cancer colorectal héréditaire sans
polypose (HNPCC – Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ainsi que
l'existence d'animaux prédisposés au développement de tumeurs en raison de
défauts de réparation de l'ADN ou de ségrégation des chromosomes. Par ailleurs,
des formes sporadiques de cancer portant des mutations dans les gènes de
réparation de l'ADN ont également été trouvés, ce qui suggère qu'une réduction
de la fidélité de réplication est une caractéristique intrinsèque des toutes les
tumeurs. Les mécanismes de maintien de l'ADN peuvent être divisés en deux
grandes sous parties :
1/ Les mécanismes de protection contre l'instabilité chromosomique qui incluent
tous les points de contrôle du fuseau mitotique
2/ Les mécanismes de maintien de la stabilité subchromosomique. En cas de
dommage d'un ou d'un petit nombre de nucléotides, deux mécanismes peuvent
intervenir : réparation par excision resynthèse de nucléotide (NER) ou de base
(BER). Si deux bases ne sont pas correctement appariées,
le système de
réparation de mésappariements (MMR – mismatch repair) est activé. Enfin, si la
double hélice est rompue, elle peut être réparée par recombinaison homologue
(HR) ou non homologue (NHEJ – Non Homologous End Joining).
a/ Présentation des mécanismes de préservation de l'intégrité du génome
Pour la NER, les bases endommagées sont reconnues par un large
complexe protéique et un fragment de 25-30 nucléotides de long est excisé.
Ensuite, le brin d'ADN non endommagé sert de modèle pour la resynthèse. Un
61
défaut dans ce mécanisme de maintien de l'intégrité de l'ADN est impliqué dans la
grande majorité des cas de Xeroderma pigmentosum. (102)
Pour la BER, les enzymes glycosylases jouent un rôle majeur puisqu'elles
peuvent reconnaître certaines bases altérées comme par exemple la présence
d'une base uracile. Dans ce cas, la base est hydrolysée, laissant un espace sans
base qui pourra être reconnu par d'autres enzymes de réparation de l'ADN.
Lorque deux bases sont misappariées, l'ADN forme une boucle qui est
reconnue par des complexes protéiques appartenant aux familles MSH, MLH et
PMS. Des défauts de MMR sont responsables entre autres de certaines formes
familiales et sporadiques de cancer du côlon.
Lorsque la double hélice est rompue, la chromatide sœur peut être utilisée
pour guider la réparation donnant lieu à une HR qui relativement fidèle. En
revanche, si les extrêmités sont assemblées en fonction de l'homologie de courtes
répétitions, comme dans la NHEJ, de petites délétions ou translocations peuvent
avoir lieu. (103)
Au cours de la mitose, l'intégrité de l'ADN est contrôlée à trois moments
clefs : à la transition G1/S, au cours de la phase S et à la transition G2/M. La cycle
cellulaire est arrêté et ne pourra poursuivre sa progression que si l'ADN passe le
contrôle. Si l'étendu des dommages est trop importante pour une bonne réparation,
la cellule est alors redirigée vers la voie de l'apoptose. Comme nous l'avons vu
précédemment le gène tumeur suppresseur p53 joue un rôle majeur dans
l'orientation vers l'arrêt prolongé du cycle cellulaire ou l'apoptose. (104, 105, 106)
b/ Tumeurs présentant une instabilité des microsatellites
Le HNPCC a été largement étudié pour pour mieux comprendre
l'association entre réparation de l'ADN et réparations de l'ADN. Cette maladie est
autosomale dominante et commence par des lésions adénomateuses bénignes
qui par la suite se développent en cancer par accumulation de nouvelles
mutations. L'analyse moléculaire a montré une liaison génétique avec des gènes
homologues de gènes de réparation de l'ADN chez la levure ainsi qu'une
instabilité des microsatellites dans le tissu tumoral. Lors de l'analyse LOH, les
chercheurs ont détecté dans les cellules malignes de HNPCC d'allèles
62
microsatellites absents dans le tissu normal du même patient. Bien que les
microsatellites soient des régions non codantes et donc sans impact sur le
phénotype, cette observation couplée avec la liaison génétique avec des loci
contenant a priori des gènes de réparation de l'ADN, laisse à penser que cette
maladie est due à des mutations dans des gènes codant des enzymes de
réparation de l'ADN. Des résultats similaires ont été trouvés dans d'autres formes
de cancers.
c/ Tumeurs caractérisées par une instabilité chromosomique (CIN)
L'instabilité chromosomique de ces tumeurs entraine une polyploïdie ou
aneuploïdie. Ces cancers ne présentent pas de MSI. Plusieurs mécanismes ont
été proposés pour expliquer l'association de l'aneuploïdie avec la tumorigenèse :
accélération de la LOH et réduction à l'hémizygotie des TSGs ou accroissement
du signal oncogène par amplification.
Les gènes de contrôle du fuseau mitotique tels que hBUBR1 ou hMAD2 ont
été mis en cause dans cette instabilité chromosomique.
En raison de l'importance de cette instabilité dans la carcinogenèse, il a été
proposé qu'il s'agissait de l'étape d'initiation de la carcinogenèse, capable d'activer
les oncogènes par amplification et de déstabiliser les TSGs par délétion allélique.
(107)
d/ Recombinaison mitotique et cancer : l'hélicase BLM
Les hélicase de la famille RecQ sont des enzymes capables d'éliminer des
structures secondaires atypiques. L'une de ces enzymes est l'hélicase BLM qui,
lorsqu'elle est mutéé est responsable du syndrome de Bloom qui parmi ces
nombreux signes cliniques présentent une incidence de cancer très élevée.
63
e/ Réarrangements chromosomiques dus à un dysfonctionnement des
télomères
Les télomères protègent les chromatides sœurs contre la fusion. Dans les
cellules normales les télomères sont perdus progressivement, aboutissant à la
sénescence de la cellule. Au cours de la réplication d'un chromosome ayant perdu
ses télomères, les chromatides sœurs fusionnent à leur extrêmité. Un pont est
alors formé qui se rompt au cours de l'anaphase et le cycle se répète à la division
suivante. L'instabilité est due au point de rupture qui n'est jamais exactement où la
fusion a eu lieu. Ainsi, des altérations telles que des duplications ou des délétions
peuvent se produire. Par ailleurs, il est possible que les deux chromatides
fusionnées se détachent de l'un des pôles engendrant un un chromosome
dicentrique dan l'une des cellules filles et la perte d'un chromosome dans l'autre.
Dans la plupart des tumeurs, les télomérases sont actives et empêchent
l'érosion des télomères de sorte que l'étendue de ce mécanisme est inconnu mais
il a été montré dans certaines tumeurs humaines et murines. (108, 109)
f/ Valeur clinique de l'instabilité génomique
La détection de MSI est relativement aisée puiqsu'elle ne nécessite que
l'isolation d'ADN de bonne qualité. La classification de Bethesda implique l'analyse
de cinq marqueurs. Si deux ou plus sont positifs, la tumeur est considérée avoir un
haut grade de MSI ; si un seul marqueur est positif il s'agit d'un bas grade de MSI
et si aucun marqueur n'est positif, la tumeur est stable. L'avantage de cette
technique est qu'elle est très sensible et l'instabilité peut être détectée même si
l'échantillon contient des cellules normales au milieu des cellules tumorales
(cellules du stroma, cellules de l'endothélium vasculaire etc.). Par ailleurs, presque
toutes les tumeurs présentent une instabilité des microsatellites, raison pour
laquelle l'analyse des MSI peut être utilisée comme méthode diagnostique. Pour
cela des fluides biologiques pouvant contenir des cellules tumorales tels que
l'urine sont comparés à de l'ADN normal extrait de sang périphérique.
64
La détection d'altérations chromosomiques plus importantes constituant
l'instabilité chromosomique a également été proposée mais la limite majeure
consiste dans le matériel nécessaire pour la réalisation de telles analyses. (110)
iv/ Épigénétique
L'expression de plusieurs loci peut être modifiée de façon réversible par
modification de la méthylation, perte d'empreinte ou encore remodelage du
nucléosome. Ces modifications sont dites épigénétiques car elles ne changent pas
la séquence primaire de l'ADN. Ainsi, tout phénotype, y compris le cancer
s'explique par une composante génétique et une composante épigénétique et il
est important de prendre ces deux composantes en compte pour mieux
comprendre la maladie. (111, 112)
a/ Méthylation de l'ADN
On sait désormais que des modifications de la méthylation de l'ADN
constituent l'altération la plus commune dans les cellules cancéreuses, plus
encore que les substitutions et les altérations chromosomiques. La méthylation
globale des cytosines est réduite de 20 à 60 % dans les cellules cancéreuses et la
déméthylation a tendance à augmenter avec la progression de la maladie ;
cependant, certaines régions sont hyperméthylées, en particulier le promoteur de
certains TSGs. Alors qu'au début de l'analyse de la méthylation de l'ADN, on ne
disposait que d'enzymes de restriction spécifiques pour la forme méthylée ou
déméthylée, on dispose aujourd'hui d'autres techniques telles que la MS-PCR
(Méthylation Spécifique PCR) qui utilise la propriété du traitement au bisulfite,
capable de remplacer les cytosines non méthylées en thymine, engendrant une
séquence primaire distincte qui peut être sélectionnée par l'utilisation d'amorces
spécifiques. Enfin, la détection des cytosines méthylées par immunohhistochimie
a également été améliorée permettant la détection de la méthylation in situ.
65
b/ Régulation de la méthylation de l'ADN et de son maintien
La méthylation a lieu au niveau du carbone 5 des cytosines au sein des
îlots CpG et est réalisée par des méthyltransférases (DNMTs – DNA
methyltransferases). Une grande proportion des îlots CpG se situent au sein des
promoteurs et on estime qu'environ 60 % des promoteurs humains possèdent de
tels îlots.
Le profil de méthylation est établi tôt au cours de l'embryogenèse et
maintenu par la suite grâce à l'action de trois DNMTs : DNMT1, DNMT3A et
DNMT3B (Tableau 1). DNMT1 peut reconnaître les met-C sur un brin de la
fourche de réplication de l'ADN et ajouter un groupe méthyle sur la cytosine
correspondante de l'autre brin. La DNMT2 a été identifiée informatiquement par
homologie avec d'autres méthyltransférases. Elle ne présente qu'une activité
résiduelle in vitro et par conséquent son rôle reste à déterminer.
Tableau 1 : Les quatre méthyltransférases majeures identifiées chez l'Homme et leurs propriétés.
Méthyltransférase
Propriétés
DNMT1
Hémiméthylase – maintient le profil de méthylation au cours
de la réplication de l'ADN
DNMT2
Activité méthyltransférase faible – Rôle inconnu
DNMT3A
Méthylation de novo
DNMT3B
Méthylation de novo
c/ Cancer et méthylation aberrante
En général, la méthylation inhibibe l'expression du gène mais dans le cas
du cancer, les gènes peuvent être déméthylés (oncogènes) ou hyperméthylés
(TSGs). Si les gènes de réparation de l'ADN sont hyperméthylés il s'en suit une
instabilité de l'ADN ou une instabilité chromosomique. Inversement, il a été montré
dans les tumeurs de Wilms qu'une déméthylation des séquences satellites en
66
région péricentrique entraînait des réarrangements qui n'étaient pas dus à une
instabilité de l'ADN globale.
D'une façon générale, la déméthylation progresse avec l'âge de façon tissu
spécifique, ce qui est en accord avec la plus forte incidence de cancers chez les
personnes âgées. Le groupe méthyle nécessaire à la méthylation dérive de la
méthionine et une étude a montré qu'un haut niveau de méthionine réduisait
l'incidence de cancer. (113).
La base moléculaire de l'hypométhylation des cellules cancéreuses est
encore à l'étude cependant l'altération de certains gènes a été mise en cause
dans l'hypométhylation tels que : DNMT3B ou Lsh (un membre de la famille SNF2
qui code une hélicase ATP-dépendante jouant un rôle dans le remodelage et la
maintenance du profil de méthylation normal de l'ADN).
Parmi les gènes subissant fréquemment une hypométhylation, on rencontre
des gènes jouant un rôle positif dans la carcinogenèse tels que H-ras, cycline D2
ou encore bcl-2. Inversement, les TSGs sont souvent hyperméthylés. On pourra
entre autres noter les gènes Rb, INK4a et MLH1 rencontrés précédemment. De
façon intéressante, l'hyperméthylation est une alternative à la délétion allélique.
Le mécanisme permettant de cibler l'hyperméthylation à certains loci n'est
pas très clair.
La raison pour laquelle la méthylation empêche l'expression a donné lieu à
plusieurs hypothèses, toutes trois étant supportées par des études expérimentales.
Selon la première hypothèse, la méthylation entraîne un changement de
conformation de l'ADN qui empêche sa reconnaissance par les protéines se liant à
l'ADN. La seconde hypothèse met en jeu des protéines capables de reconnaître la
forme méthylée de l'ADN et qui répriment la transcription. En particulier, la
protéine MeCP2 recrute des histones désacéthylases qui inhibent la transcription.
Inversement, la troisième hypothèse suggère que la méthylation diminue l'affinité
des facteurs de transcription pour l'ADN. (114)
d/ Perte d'empreinte dans le cancer
L'empreinte fait référence au phénomène de méthylation permettant
l'expression d'un seul des deux allèles : maternel ou paternel. Les gènes sujets à
67
ce phénomène comprennent l'IGF-II (Insulin-like growth factor), H19 (ARN non
codant jouant un rôle dans la régulation à la baisse de la masse corporelle et de la
prolifération cellulaire), BWS (Beckwith-Wiedemann Syndrome). La
perte
d'empreinte, entrainant l'expression des deux allèles, est présente dans certains
cancers tels que la tumeur de Wilms.
e/ Remodelage du nucléosome
Le nucléosome consiste en huit histones (deux de chaque : H2A, H2B, H3
et H4) autour desquels l'ADN est enroulé. L'histone H1 se positionne à l'extérieur
du complexe est ferme le deuxième tour de l'ADN autour des huit autres histones.
Ce complexe est dynamique et peut être modifié par acétylation, méthylation ou
phosphorylation des histones. Le silençage égnique est souvent associé à la
déacétylation et à la méthylation des lysines.
Le gène ALL1 code une protéine qui fait partie d'un large complexe de
remodelage de la chromatine, acétylation/déacétylation et méthylation des
histones et qui est souvent altéré dans les leucémies, montrant l'importance du
nucléosome dans la carcinogenèse.
f/ Variants des histones
Il existe des variants des histones possédant des fonctions particulières. De
nombreuses études doivent être réalisées pour élucider le rôle de tous ces
variants et leur rôle dans la carcinogenèse mais quelques uns ont déjà été étudiés.
Par exemple, H2AX, variant de l'histone H2A semble indiquer une rupture de la
double hélice. La suppression de l'histone H2AX entraine le développement de
lymphomes, ce qui suggère que H2AX serait un TSG. CENP-A (Centromere
Protein A) se substitue à l'histone H3 au niveau des centromères et il a été montré
une surexpression de ce variant dans les tumeurs colorectales. (115)
g/ Intéraction dynamique entre les différents mécanismes épigénétiques
Les différents mécanismes épigénétiques présentent une forte synergie
pour réguler l'expression des gènes and agir de façon coopérative. Par exemple, il
68
a été montré que la méthylation de l'ADN pouvait entraîner des modifications de
histones et inversement (116). On peut imaginer que dans les conditions
physiologiques, cette synergie est responsable du maintien de la stabilité
génomique alors que dans le cas où une erreur se produit dans un mécanisme,
cela ait une répercussion sur les autres mécanismes.
h/ Détection du cancer
Il semble possible de détecter la maladie avec trois ou quatre marqueurs de
méthylation spécifiques (114). Avec les nouvelles méthodes telles que la MS-PCR,
il est possible de tester des matériaux biologiques (lavage broncho-alvéolaire,
nœuds lymphatiques, urine, salive etc.) et détecter la maladie à un stade précoce.
i/ Résistance à la thérapie
Comme certains gènes sont importants pour l'efficacité du traitement,
connaître le statut de méthylation de ces gènes pourrait être une bonne manière
de prédire l'efficacité du traitement. Ceci a été montré avec l'enzyme de réparation
de
l'ADN
MGMT
(O6-methylguanine
DNA
methyltransferase)
dont
l'hyperméthylation est associée avec une bonne réponse des patients atteints de
gliome à des traitements à base de BCN (carmustine) temozolomide.
j/ Thérapie liée à la méthylation
En raison de l'observation d'une hyperméthylation à certains loci, il est
tentant de vouloir déméthyler la chromatine. Cependant, un tel traitement ne
ciblerait pas uniquement les TSGs mais aussi les oncogènes et facteurs de
croissance. La perte d'empreinte d’IGF-II est un bon exemple des effets
indésirables d'un tel traitement. Par ailleurs, l'hypométhylation de l'ADN entraine
une élévation de l'instabilité génomique. Ce qui décidera de l'utilisation ou non de
tels traitements sera la balance bénéfice/risque. De tels traitements sont
actuellement à l'étude et nous devrions connaître les résultats dans un futur
proche.
69
v/ Importance du stroma
Dans les tumeurs primaires, les cellules cancéreuses ne croissent jamais
seules, n'établissant des contacts qu'avec des cellules de même types mais, au
contraire, elles établissent un réseau complexe avec des cellules de différentes
origines. Le microenvironnement des cellules cancéreuses est constitué de
cellules endothéliales formant les vaisseaux, de cellules inflammatoires du
système immunitaire en réponse au développement tumoral et de fibroblastes.
Ces cellules constituent le stroma. Dans certains adénocarcinomes pancréatiques,
mammaires ou colo-rectaux, le stroma et en particulier les fibroblastes peuvent
constituer jusqu'à 90 % de la masse tumorale. Lorsque l'on se réfère au stroma on
pense
souvent
aux
fibroblastes
et
au
matériel
extracellulaire,
excrété
majoritairement par les fibroblastes. Ces fibroblastes répondent aux signaux
envoyés par les cellules tumorales mais aussi, peuvent affecter la morphologie et
le comportement des cellules néoplasiques, établissant ainsi une relation
bilatérale avec les cellules cancéreuses.
L'importance du stroma dans la croissance tumorale peut être mise en
évidence par la différence de taux de croissance entre des lignées cellulaires in
vitro, sur boite de Petri et dans des souris immunodéficientes. In vitro, le taux de
croissance reflète en grande partie la capacité de division des cellules alors qu'in
vivo, greffées dans un animal, la croissance dépend également de la disponibilité
en nutriments, du support mécanique et de la sensibilité aux contacts. Par ailleurs,
l'hôte qui fournit le stroma peut influencer drastiquement le comportement des
cellules cancéreuses. Par conséquent, si l'étude de cultures cellulaires et
l'identification de leurs altérations et de leur rôle est informative et utile, il faut
garder en mémoire qu'elles présentent des limites et sont par conséquent
incomplètes.
Un exemple de l'importance des fibroblastes dans la carcinogenèse est
présenté par le fait que des fibroblastes associés à des carcinomes sont capables
de stimuler la progression tumorale de cellules épithéliales non tumorales,
suggérant que les fibroblastes suffisent à engendrer des signaux oncogéniques
puissants (117).
70
Si les fibroblastes associés aux cellules cancéreuses jouent un rôle
activateur dans la carcinogenèse, les fibroblastes en soit ne facilite pas toujours la
progression tumorale. En effet, des kératinocytes injectées avec ras forment des
tumeurs chez la souris uniquement s'ils sont injectés seuls ou en association avec
des fibroblastes 3T3 immortalisés alors que s'ils sont injectés avec des
fibroblastes normaux, la tumorigénicité est supprimée.
a/ La morphologie du stroma tumorale est modifiée
Les pathologistes ont remarqué que le stroma associé aux cellules
cancéreuses était morphologiquement distinct du stroma associé au tissu normal.
Ces altérations sont regroupées sous le terme « réaction desmoplastique » et
comprennent entre autres un index mitotique élevé, des atypies de la matrice
extracellulaire comme une auglentation de la production de certaines formes de
collagène, de fibronectine, de glycosaminoglycanes et de protéoglycanes.
Les myofibroblastes sont prédominants dans les tumeurs et peuvent être
identifiés par immunohistochimie par l'expression de marqueurs spécifiques tels
que la vimentine, l'actine des fibres lisses alpha, la chaîne lourde de myosine des
fibres lisses, la desmine la calponine et l'alpha-intégrine. De façon intéressante,
cette différenciation partielle est également rencontrée en réponse à une blessure
ou à une inflammation au cours desquelles les myofibroblastes orchestrent la
cicatrisation. Ceci est d'autant plus important qu'il existe un lien entre inflammation
chronique et cancer qui pourrait impliquer les fibroblastes. Par ailleurs,
l'inflammation induit la formation d'un stroma réactif morphologiquement identique
à celui engendré par les tumeurs malignes.
Les cellules cancéreuses sécrètent des protéases spécifiques : les
métalloprotéinases de matrice (MMPs) qui jouent un rôle clef dans la transition du
stroma vers sa forme associée aux cellules cancéreuses. L'une de ces MMPs, la
stromelysin-1 (str-1) exprimée de façon ectopique dans les cellules épithéliales
mammaires désorganise le stroma de telle sorte qu'elle est suffisante à entrainer
le développement de cancer du sein.
71
b/ Changement du profil d'expression des fibroblastes dans les tumeurs
Mis à part les marqueurs morphologiques mentionnés précédemment, les
fibroblastes associés aux cellules cancéreuses présentent une expression
différente de plusieurs autres gènes. Nombre d'entre eux sont des facteurs de
croissance qui peuvent agir à la fois sur les cellules du stroma et sur les cellules
tumorales. Un exemple est donné par le facteur de croissance HGF qui est
exprimé majoritairement par les fibroblastes tandis que son récepteur, c-Met est
exprimé par les cellules cancéreuses. D'autres facteurs de croissance sont mis en
jeu, en particulier TGF-béta mais l'intéraction entre cellules cancéreuses et stroma
est plus complexe. En effet, TGF-béta et son récepteur sont exprimés à la fois par
les fibroblastes et les cellules cancéreuses et l'activation du récepteur peut
engendrer des signaux de stimulation ou d'inhibition tumorale en fonction du tissu
et du système expérimental étudiés. (118, 119)
c/ Les fibroblastes associés aux tumeurs ne sont pas toujours
génétiquement normaux.
Pendant longtemps, les fibroblastes ont été supposés génétiquement
normaux et les changements dans leur profil d'expression attribués aux cellules
cancéreuses adjacentes. Ceci étant, il semblerait que ce ne soit pas toujours vrai ;
les fibroblastes peuvent accumuler des mutations similaires aux cellules
néoplasiques. Parmi les mutations décrites, on rencontre l'inactivation de TSGs
tels que p53 ou PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome
10). (120) Une étude portant sur l'importance de p53 dans les fibroblastes dans
laquelle des tumeurs chimères formées de cellule de cancer mammaire humain de
de fibroblastes mutés ou non pour p53, a montré que les mutations de p53 dans
les fibroblastes conféraient un taux de croissance plus élevé et des tumeurs plus
agressives à l'histopathologie que les fibroblastes normaux. (121, 122).
Il semblerait que le stroma associé aux cellules cancéreuses joue un rôle
double dans la carcinogenèse. D'une part, les fibroblastes sécrètent des facteurs
de croissance tels que SDF-1 (Stromal-cell Derived Factor 1) qui agit sur les
cellules cancéreuses par l'intermédiaire du récepteur CXCR4, et d'autre part par le
72
recrutement de cellules souches endothéliales, contribuant à l'angiogenèse (123,
124).
d/ « Modelage » du stroma tumoral
En résumé, au cours des premières divisions d'une cellule transformée qui
donnera par division clonale une tumeur, le stroma joue un rôle négatif dans la
carcinogenèse, protégeant l'organisme contre le cancer en encapsulant la tumeur
et inhibant son développement. Par la suite, cependant, certains produits des
cellules cancéreuses tels que des facteurs de croissance ou des MMPs modifient
le stroma qui devient un stoma associé aux cellules cancéreuses. À partir de ce
moment, le stroma favorise la croissance tumorale. Des modifications génétiques
et épigénétiques ciblant les fibroblastes pourraient également participer à cette
transition. Au cours de la phase initiale, si des mutations existent dans certaines
cellules du stroma, elles seront sélectionnées positivement, ajoutant à
l'hétérogénéité du stroma. À cette étape du développement, la tumeur est
hautement dépendante du stroma, ce qui fait du stroma une cible prometteuse
pour le traitement contre le cancer à un stade précoce.
vi/ Télomérase
Au cours de chaque réplication, les chromosomes se raccourcissent à leurs
extrémités : les télomères. Ce raccourcissement entraine une réponse de
dommage de l'ADN qui est irréversible et indépendante des facteurs de
croissance dans le micro-environnement de la cellule. Il s'agit de la sénescence
réplicative, contrôlée par les TSGs p53 et Rb. Ce raccourcissement est un
problème pour les cellules qui doivent pouvoir se diviser un nombre indéfini de fois
telles que les cellules de la lignée germinale, les cellules embryonnaires, les
cellules souches, les lymphocytes activés ou encore les cellules cancéreuses.
Pour résoudre se problème, une enzyme, la télomérase, est capable de réaliser
l'élongation des télomères sans avoir besoin d'un brin d'ADN comme modèle.
73
a/ Les télomères, des structures spécialisées
Les extrémités des chromosomes eucaryotes sont formés de complexes
d'ADN et de protéines appelés télomères qui protègent protègent les cellules
contre l'instabilité de l'ADN par fusion des chromosomes. Les télomères consistent
en de courtes séquences d'ADN répétées (microsatellites) riches en en bases G.
Chez l'Homme et la souris, les télomères présentent une répétition de (TTAGGG)n
générée par les télomérases. Les télomérases sont des polymérases qui ne
dépendant pas d'un modèle ADN mais d'un modèle ARN qu'elles possèdent de
façon interne, et elles se comportent comme une transcriptase inverse. Chez
l'Homme les télomères font en moyenne 15-20 kpb à la naissance et, en l'absence
de
télomérase
ou
autre
mécanisme
de
maintenance
des
télomères,
raccourcissent à chaque réplication. Cette réduction de la taille des télomères
reflète l'âge de la cellule en termes de prolifération. Cette diminution de taille des
télomères peut être vue comme une protection contre la transformation maligne
puisque la sénescence qui associée ne permet pas l'accumulation de mutations.
On verra par la suite que les télomérases jouent à la fois un rôle négatif (de
protection) et positif (permissif) en fonction du stade de transformation ou encore
du contexte génétique. (125, 126)
b/ Structure et activité des télomérases
Les télomérases sont des complexes ribonucléoprotéiques formés de
plusieurs sous-unités dont deux majeures : une unité catalytique (TERT) qui
synthétise la répétition de (TTAGGG)n à l'extrémité 3' des chromosomes et une
composante ARN (TERC) qui fournit le modèle ARN pour la sous-unité TERT.
La grande majorité des tumeurs primaires possèdent une télomérase
réactivée leur assurant la capacité de se diviser un nombre de fois indéfini. Ainsi,
même si les télomérases ne sont pas en soit des oncogènes, elles exercent une
action positive sur la carcinogenèse en permettant aux cellules de contourner la
sénescence due au raccourcissement des télomères. Même si la réactivation des
télomérases devrait être un événement précoce dans la carcinogenèse, l'étude de
lésions néoplasiques précoces semble indiquer le contraire. L'activité des
74
télomérases est en corrélation avec la progression de la maladie, avec des lésions
avancées exhibant de plus haut niveaux d'activité des télomérases que les mêmes
tumeurs à un stade plus précoce. (127)
c/ Régulation de l'activité des télomérases
De nombreux facteurs exercent une régulation dur les télomérases, parmi
lesquels l'oncogène myc qui induit l'activité des télomérases au cours de la
transformation maligne. Cette capacité à stimuler l'activité des télomérases et
donc l'immortalisation cellulaire pourrait expliquer en partie l'importance de
l'oncogène myc dans de nombreux tissus. Les hormones hypothalamiques ont
également été proposées avoir un rôle dans la régulation de l'activité des
télomérases mais cela n'a pas été démontré.
La
localisation
intracellulaire
des
télomérases
constitue
un
autre
mécanisme de régulation. Ainsi, la protéine PinX1 inhibe l'activité des télomérases
en formant un complexe stable avec la sous-unité TERT et en la séquestrant dans
le nucléole alors qu'en l'absence de PinX1 elle se localise principalement dans le
nucléoplasme.
d/ Implications thérapeutiques des télomérases
Dans la mesure où une grande majorité de tumeurs présentent une
réactivation des télomérases, l'inhibition de ces dernières pourrait constituer une
cible thérapeutique intéressante. Cependant, les conséquences d'un tel traitement,
en particulier sur les cellules souches et les lymphocytes activés doivent être
étudiées. Par ailleurs, entre le moment où les télomérases sont inactivées et le
moment où le raccourcissement des télomères est suffisant pour entrainer la
sénescence, il existe un temps de latence au cours duquel la maladie peut
continuer sa progression. De plus, le raccourcissement des télomères est à
l'origine d'une instabilité génomique qui pourrait permettre à la tumeur de devenir
encore plus agressive. Enfin, des mécanismes alternatifs de maintien des
télomères existent qui pourraient être activés en réponse au traitement. (128)
75
e/ Mécanismes alternatifs pour la maintenance des télomères
Si la plupart des tumeurs présentent une réactivation des télomérases, ce
n'est pas le cas de toutes les tumeurs, ce qui implique qu'elles présentent des
mécanismes alternatifs de maintien de la taille des télomères. Ces mécanismes
sont dénommés ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) et impliquent des
recombinaisons homologues entre télomères.
vii/ Angiogenèse
Les cellules cancéreuses sont caractérisées par une autonomie croissante
par rapport aux cellules normales, ceci étant, elles dépendent toujours de leur
environnement. En particulier, elles doivent satisfaire leurs besoins métaboliques.
Lorsque
les
tumeurs
atteignent
1-2
mm3,
elles
deviennent
hautement
vascularisées, ce qui est nécessaire pour qu'elles puissent poursuivre leur
croissance. Cette transition constitue « l'angiogenic switch » et est hautement
régulée. Parmi les signaux déclenchant l'angiogenèse, l'hypoxie est la mieux
caractérisée.
La régulation de l'angiogenèse est un processus complexe qui a deux
composantes : prolifération et morphogénie. Ces processus sont très similaires à
la néovascularisation physiologique mais présentent certaines différences comme
nous le verront par la suite.
Après avoir pensé pendant longtemps que les vaisseaux des tumeurs
provenaient exclusivement de vaisseaux pré-existants dans l'environnement, on
sait désormais qu'il existe des mécanismes complexes permettant la formation de
vaisseaux de novo à partir d'angioblastes ou un mimétisme vasculaire.
a/ L'organisation des vaisseaux tumoraux est différente de celle des
vaisseaux normaux
Dans les tissus normaux, les vaisseaux présentent une organisation
hiérarchique de sorte que toutes les cellules sont assez proches des vaisseaux
76
pour que les nutriments puissent diffuser et être complètement consommés. Dans
les tumeurs, en revanche, l'organisation des vaisseaux est anormale de sorte que
certaines régions tumorales sont souvent en condition d'hypoxie. De plus, le
diamètre des vaisseaux est irrégulier et certaines régions présentent une
accumulation de plusieurs couches de cellules épithéliales. Par ailleurs, au sein
d'une même tumeur, le flot sanguin et la perméabilité vasculaire sont hétérogènes.
Cette hétérogénéité serait due à un déséquilibre entre les facteurs angiogéniques
et anti-angiogéniques ; ainsi des facteurs tels que VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor) accroissent la perméabilité vasculaire, tandis que des facteurs tels
que Ang1 et Tsp1 la réduisent.
À l’échelle moléculaire, le profil d'expression peut aussi différer des cellules
normales avec par exemple l'absence d'expression du marqueur CD31. Les
molécules d'adhésion sont également différentiellement exprimées, une fois
encore en raison de l'action de facteurs de croissance ; VEGF-A stimule
l'expression de molécules d'adhésion, tandis que TGF-béta (Transforming Growth
Factor beta), bFGF (basic Fibroblast Growth factor) et Ang1 l'inhibent.
Rétablir un réseau vasculaire normal dans les tumeurs pourrait aider à
délivrer de façon plus efficace les molécules de chimiothérapie traditionnelles.
(129)
b/ Régulation de l'angiogenèse
Avec l'augmentation de sa taille, la tumeur requiert de plus en plus de
nutriments et d'oxygène. Rapidement, le micro-environnement ne permet plus
l'approvisionnement en quantité suffisante de ces éléments. Les cellules
cancéreuses le perçoivent comme un signal et sécrète des facteurs de stimulation
de l'angiogenèse dont les membres de la famille VEGF, FGF (Fibroblast Growth
Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor) et angiopoïétine. (130)
c/ Déclenchement de l'angiogenèse par hypoxie
L'hypoxie est le principal signal d'induction de l'angiogenèse. La famille HIF
(Hypoxia-Inducible Factors), qui code des facteurs de transcription, joue un rôle
77
majeur dans ce processus. En condition de normoxie, HIF-1alpha est lié au
produit du TSG VHL (Von Hippel-Lindau), ce qui entraîne sa dégradation par le
protéasome.
En condition d'hypoxie, l'hydroxylase PHD (oxygen-dependent prolyl
hydroxylase) est inactivée ce qui entraine la dissociation de HIF-1alpha et VHL ; à
la suite de quoi, HIF-1alpha forme un hétérodimère avec HIF-1béta ou p53.
L'hétérodimère HIF-1alpha/HIF-1béta est un facteur de transcription qui se lie aux
séquences HRE (Hypoxia-Regulatory Elements) activant ainsi les acteurs de
l'angiogenèse dont VEGF, érythropoïétine, etc. Le facteur HIF-3alpha est quant à
lui un inhibiteur de l'angiogenèse.
Par ailleurs, la phosphorylation de HIF-1alpha est proportionnelle au niveau
d'hypoxie et le niveau de phosphorylation de HIF-1alpha détermine quant à lui si
HIF-1alpha va former un hétérodimère avec HIF-1béta ou p53. Pour des
conditions d'hypoxie moyennes, HIF-1alpha se lie à HIF-1béta, tandis que dans
des conditions d'hypoxie sévères, il se lie à p53, dirigeant ainsi la cellule vers
l'apoptose. D'autres facteurs participent à la régulation de HIF-1alpha que nous ne
détaillerons pas, parmi lesquels les PI3Ks (Phosphatidylinositol-3-kinases) et les
MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) (131)
d/ Autres stimuli déclenchant l'angiogenèse
Bien que jouant un rôle clef, la déprivation en oxygène n'est pas le seul
stimulus d'induction de l'angiogenèse. La déprivation en nutriments peut
également jouer ce rôle en entraînant une diminution de la concentration en ATP
intracellulaire, ce qui entraîne un stress similaire à l'hypoxie.
De même, le stress oxydant peut activer l'angiogenèse par la stimulation de
production de VEGF et autres facteurs angiogèniques.
Enfin, plusieurs oncogènes, dont les membres de la famille ras ou bcl-2
peuvent activer l'expression de VEGF ou inhiber l'expression de TSP-1
(Thrombospondine 1), une glycoprotéine de la matrice extracellulaire inhibitrice de
l'angiogenèse. (132)
78
e/ Vascularisation des tumeurs
On dénombre trois mécanismes principaux d'acquisition de vascularisation
par les tumeurs :
1. Bourgeonnement
Il s'agit du mécanisme prédominant. Il met en jeu la prolifération et la
migration de cellules endothéliales à partir de vaisseaux existants. Le facteur
VEGF-A induit la prolifération des cellules endothéliales mais aussi active les
metalloprotéases et les activateurs du plasminogène, responsables de la
dégradation de la matrice extracellulaire, permettant la migration des cellules
endothéliales. Dans les conditions physiologiques, les cellules endothéliales à la
pointe du bourgeon expriment le récepteur aux VEGF 2 et suivent un gradient de
VEGF. Il n'est pas clair si un tel mécanisme existe dans les tumeurs en raison de
l'irrégularité de la vascularisation. D'autres facteurs, tels que FGFs et TGF-béta
régulent également ce processus.
2. Intussusception
Il s'agit d'une variante du mécanisme de bourgeonnement au cours duquel
les cellules endothéliales situées face à face se rapprochent jusqu'à former deux
vaisseaux distincts (133)
3. Recrutement des angioblastes
Les précurseurs endothéliaux circulants (CEPs = Circulating Endothelial
Precursors) peuvent être recrutés par la tumeur pour former la vascularisation
tumorale. De nombreux facteurs entrent en jeu dans ce mécanisme parmi lesquels
les membres de la famille VEGF et leurs récepteurs, le récepteur à EGF 2 et SFD1 (Stromal cell-Derived Factor 1). (134)
L'importance de ce mécanisme est fortement tumeur dépendant. En effet,
les CEPs sont responsables de 90 % de la vascularisation de certains lymphomes
contre seulement 5 % des neuroblastomes. Le stade tumoral est également
important puisque la plupart des vaisseaux des lymphomes à J2 dérivent de CEPs
alors qu'à J14, seulement 50 % le sont.
79
f/ Cooptation
Il s'agit d'un mécanisme observé dans certains tissus très vascularisés tels
que le cerveau ou les poumons, dans lesquels les cellules tumorales se
développent autour des vaisseaux pré-existants. Le facteur Ang2 participe à
l'augmentation du diamètre des vaisseaux et au rétrécissement de leur taille. Par
la suite, en raison du manque de vaisseaux, les conditions deviennent hypoxiques,
stimulant l'angiogenèse par VEGF-A et donc la vascularisation en périphérie. (134)
g/ Mimétisme vasculaire
Dans certaines tumeurs, comme les mélanomes uvéaux, les vaisseaux
sont situés uniquement en périphérie. Cependant, ces tumeurs ne sont pas
nécrotiques, impliquant un flux sanguin dans ces tumeurs. Des analyses plus
détaillées montrent la présence de canaux en intéraction avec les vaisseaux
sanguins. Ces canaux ne sont pas formés de cellules endothéliales mais
partagent certains marqueurs avec ces dernières dont le facteur de Von
Willebrand, CD34 et lectine d'Ulex. (134)
h/ Vaisseaux mosaïques
Les cellules endothéliales des vaisseaux tumoraux subissent fréquemment
l'apoptose, exposant ainsi des cellules cancéreuses au lumen, entrainant la
formation de vaisseaux mosaïques constitués de cellules endothéliales et
cancéreuses en proportion variable. (134)
i/ Thérapie anti-angiogénique
Si l'expression de l'oncogène ras ou des télomérases suffit à induire la
transformation de cellules épithéliales in vitro, ce n'est pas le cas in vivo où il faut
de hauts niveaux d'expression de ras ou VEGF, ce qui implique que l'angiogenèse
est nécessaire pour la progression tumorale. Ceci est confirmé par l'inhibition de
croissance tumorale associée à des inhibiteurs endogènes de l'angiogenèse tels
80
que l'endostatine ou l'angiostatine qui réduisent la formation de métastases dans
le modèle de cancer des poumons de Lewis.
Pour réduire l'angiogenèse tumorale, des anticorps monoclonaux ont été
développés avec, en particulier, des anticorps contre VEGF : bevacizumab
(Avastin) ou l'intégrine αvβ3 : Vitaxin.
L'avantage d'une telle thérapie réside dans le fait que les cellules
endothéliales sont des cellules normales et ne présentent pas l'instabilité des
cellules cancéreuses. Par conséquent, les cellules ne devraient pas développer de
résistance au traitement et devrait être applicable à tout type de tumeur.
Cependant, des études ont montré que ce n'était pas le cas et que les tumeurs
présentaient une sensibilité très variable au traitement. Deux mécanismes majeurs
ont été avancés pour essayer d'expliquer ce phénomène : les cellules
cancéreuses exprimant un moindre besoin en oxygène
pourraient être
sélectionnées ou des mécanismes alternatifs de vascularisation pourraient être
utilisés n'utilisant pas la cible du traitement. Des études vont dans le sens de
l'existence de ces deux mécanismes. Par exemple, il existe des mutations de la
protéine p53 conférant une résistance à l'hypoxie (135).
En général, une combinaison de ces traitements anti-angiogéniques avec
d'autres traitements anti-cancéreux est utilisée.
La thérapie anti-angiogénique étant peu toxique et non favorable au
développement de résistances, elle constitue un bon candidat pour une thérapie
prophylactique des patients à haut risque de développer un cancer.
viii/ Métastase
La métastase désigne la capacité des cellules cancéreuses à se propager
depuis le site primaire où elles se sont formées vers d'autres organes à travers les
vaisseaux sanguins ou lymphatiques. Les métastases sont la première cause de
mortalité chez les patients atteints de cancer. Malgré des progrès dans la
compréhension de la maladie et dans les traitements, le prognostique des patients
présentant des métastases ne s'est que peu amélioré.
Ce processus fait appelle à des facteurs de croissance, des chimiokines,
des molécules d'adhésion et des protéases de matrice. Dans de nombreux cas,
81
les cellules sont dans un premier temps latentes. Des modèles mathématiques
prévoient que durant cette période, les cellules prolifèrent lentement par
alternance de cycles de quiescence et prolifération.
Le stroma, du tissu d'origine comme du tissu receveur, joue un rôle
important dans la régulation de la métastase.
a/ Les étapes de la métastase
La métastase, comme la carcinogenèse, se déroule en plusieurs étapes et
est multifactorielle. C'est pourquoi l'acquisition d'un phénotype malin n'est pas
toujours synonyme de capacité à métastaser. Pour métastaser, les cellules
doivent accumuler des mutations leur permettant d'échapper à leur site de
développement primaire, survivre au transport dans les vaisseaux lymphatiques
ou sanguins et enfin, s'implanter dans un tissu différent qui, le plus souvent,
constitue un micro-environnement différent de celui d'origine. La métastase est un
processus qui, en général, présente une efficacité faible. Alors que l'échappement
au site primaire présente une efficacité élevée, la croissance dans des tissus
différents jusqu'à être bien vascularisées et cliniquement détectable se produit
avec une efficacité faible. Pour que cette dernière soit fructueuse, les cellules
métastasiques doivent être en mesure d'induire l'angiogenèse afin que les
micrométastases puissent se développer et elles doivent pouvoir s'adapter à leur
nouvel environnement et répondre aux signaux paracrines de croissance et de
survie.
L'injection expérimentale sous-cutanée de cellules tumorales à des souris
nude, SCID ou autres souris immunoincompétentes reflète cette dernière étape de
la maladie au cours de laquelle les cellules cancéreuses doivent croitre dans un
micro-environnement différent de celui d'origine. C'est la raison pour laquelle
certaines lignées cellulaires ne peuvent se développer que dans leur tissu
d'origine et ne présentent qu'une faible croissance ou ne croissent pas du tout en
région sous-cutanée.
Il semblerait que la capacité à métastaser soit le fruit de l'accumulation de
mutations dans les cellules cancéreuses ensuite sélectionnée parce qu'elle
82
constitue un avantage pour les cellules. Cependant, il semblerait que l'hypoxie
induise également la métastase.
Lorsque les cellules échappent à leur tissu d'origine, elles peuvent entrer
dans la circulation sanguine et être distribuées dans la circulation systémique.
C'est ainsi que les tumeurs mammaires donnent naissance à des métastases
dans les poumons par exemple. Alternativement, elles peuvent pénétrer les
vaisseaux lymphatiques et être transporter jusqu'aux nœuds lymphatiques. Depuis
les nœuds lymphatiques, les cellules cancéreuses peuvent gagner la circulation
sanguine et créer des métastases dans des organes différents. Les chercheurs
pensent que cette deuxième voie de dissémination est prédominante.
La lymphangiogenèse, comme l'angiogenèse, est régulée, au moins en
partie, par les facteurs de croissance VEGFs et leurs récepteurs. Elle s'associe à
un plus fort potentiel métastasique. (136)
b/ Bases moléculaires
1/ Interactions cellule-cellule
Les intégrines sont des protéines membranaires qui peuvent se dimériser
pour former des complexes qui interagissent avec la matrice extra-cellulaire
(MEC). Les cadhérines sont une famille de protéines régulant l'adhésion cellulecellule. L'E-cadherine est une protéine transmembranaire dont la portion
extracellulaire forme des jonctions adhérentes avec les cellules voisines tandis
que la portion intracellulaire intéragit avec les caténines, elles-mêmes liées à des
filaments d'actine. Il existe une relation de corrélation inverse entre l'expression
des E-cadhérines et l'agressivité de nombreuses tumeurs. Les N-cadhérines,
quant à elles, jouent un rôle différent puisqu'elles favorisent la motilité cellulaire. Il
est donc possible qu'on ait, au cours de la progression tumorale, un changement
depuis les E-cadhérines, qui favorisent l'ancrage, vers les N-cadhérines, qui
favorisent la migration. Les ephrines et récepteurs eph jouent également un rôle
important puisqu'ils sont impliqués dans la régulation de la communication, de
l'attachement, de la forme et de la motilité cellulaires. Il est intéressant de
remarquer que les signaux sont bidirectionnels. À la suite de l'intéraction entre le
83
ligand et son récepteur, un signal est envoyer vers l'intérieur de la cellule et un
signal est transduit au travers du ligand. (137, 138)
2/ Protéolyse de la matrice extracellulaire
Le remodelage de la MEC est une étape importante puisqu'elle est
nécessaire pour l'invasion locale par les cellules tumorales. De nombreuses
protéines / enzymes sont importantes pour la protéolyse de la MEC : les
métalloproteinases de matrice (MMPs), les sérine-protéases, les ADAMs
(adamalysin-related membrane proteases), les BMP-1 (bone morphogenetic
protein 1), les héparinases et les cathepsines.
Les MMPs sont, pour la plupart, sécrétées par les cellules du stroma suite à
la réception d'un signal des cellules cancéreuses. Au travers su clivage
protéolytiques, elles peuvent parfois activer des facteurs de croissance et leurs
récepteurs qui étaient jusqu'alors latents. Par exemple, le récepteur PAR-1
(Protease activated receptor 1) est activé par clivage protéolytique par MMP-1.
Les récepteurs PARs sont couplés à des protéines G et comportent leur propre
ligand en région N-terminale. Suite à son activation, il initie la migration des
cellules cancéreuses. (139)
Les ADAMs sont des protéines transmembranaires impliquées dans
l'adhésion cellulaire et la lyse de la MEC au travers de ces domaines désintégrine
et metalloprotéinase. Une autre classe d'ADAMs clive les cytokines ancrées dans
la membrane cellulaire, les protéines d'adhésion, les facteurs de croissance etc.
qui se détachent alors de la membrane plasmique.
Les sérine-protéases inclus l'uPA (urokinase plasminogen activator), la
thrombine et la plasmine. La fixation de l'uPA sur son récepteur l'active entrainant
la conversion de plasminogène en plasmine qui, à son tour, présente une activité
protéolytique dirigée contre les protéines de la MEC et contre certains facteurs de
croissance activés par clivage. La surexpression d'uPA dans certains cancers est
associée à un mauvais prognostique. Inversement, son inhibition dans des
modèles expérimentaux prévient la métastase en supprimant la capacité invasive
des tumeurs.
84
Le protéoglycane heparan sulfate joue un rôle important dans l'organisation
de la MEC et la séquestration de molécules bioactives. L'héparanase clive les
chaines d'heparan sulfate ce qui déstabilise la MEC et affecte la fonctionnalité
tissulaire. L'activité de cette enzyme est augmentée dans diiférentes tumeurs
primaires et lignée cellulaires métastatiques. De plus, son activation dans des
cellules présentant une faible capacité métastatique l'augmente.
Enfin les cystéine-cathepsines sont une famille de protéases qui jouent
également un rôle important dans la dégradation de la MEC, l'invasion locale et
l'initiation de la métastase. Elles affectent notamment la laminine, la fibronectine et
le collagène. (137, 140)
3/ Gènes suppresseurs de métastases
De la même manière que les TSGs inhibent la carcinogenèse, les « gènes
suppresseurs de métastase » préviennent la migration des cellules cancéreuses.
Leur identification se base sur l'hypothèse que ces gènes devraient être régulés à
la baisse dans les cellules de tumeurs métastatiques par rapport aux cellules
tumorales non métastatiques. Ces gènes comportent notamment MKK4 qui code
une MAPK, KiSS1 qui code un ligand d'un récepteur associée à une protéine G.
Ces gènes inhibent la capacité métastatique des cellules sans affecter leur
capacité tumotigène.
Il est à noter que certains gènes impliquées dans la transformation
malignes tels que les oncogènes ont aussi un impact sur la capacité à métastaser
des cellules cancéreuses, comme par exemple ras. Il se pourrait que ce ne soit dû
qu'à leur action stimulatrice de la prolifération. De plus amples études devraient
éclaircir ce point. (137, 141)
4/ Migration et motilité des cellules cancéreuses
En plus de la modification de la MEC et du micro-environnement, les
cellules cancéreuses doivent acquérir la capacité de se déplacer. Le mouvement
collectif des cellules tumorales est relativement courant et fait intervenir les
intégrines β1. Le mouvement de cellules seules détachées de la tumeur primaire
85
est indépendant des intégrines β1. Les cellules cancéreuses peuvent excréter des
enzymes protéolytiques qui activent des protéines de la MEC telles que les
fibronectines, laminines ou encore thrombospondines qui, à leur tour, induisent la
migration des cellules tumorales. La chimiotaxie et l'aptotaxie (mouvement dirigé
vers un substrat fixe) sont les principales sources de mouvement des cellules
cancéreuses au cours de l'invasion locale. Des facteurs dérivés du stroma tels que
IGF-I et -II (Insulin-like growth factor) ou HGF (Hepatocyte growth factor) sont des
signaux paracrines qui stimulent la motilité ainsi que la prolifération des cellules
cancéreuses. (137, 142)
5/ Implantation
Trois mécanismes ont été proposés avoir un rôle dans la sélection du site
de métastase. Le premier mécanisme consiste en la présence de facteurs de
prolifération favorisant la croissance des cellules cancéreuses au site de
métastase. Le deuxième propose l'adhésion à l'endothélium adjacent au tissu où
la métastase se produit. Enfin, le troisième implique l'attraction des cellules
cancéreuses par des facteurs produit par le tissu d'implantation. Des études
supportent chancun de ces trois mécanismes. (137)
c/ Implications cliniques
Les avancées dans notre connaissance des mécanismes moléculaires de
la métastase ont deux impacts majeurs : elles permettent d'une part d'identifier
des marqueurs qui aident au diagnostique et au pronostique et elles orientent la
recherche de nouvelles thérapies.
Comme mentionné précédemment, la néoangiogenèse est une cible
prometteuse. Des inhibiteurs plus spécifiques de la métastases ont été
développés tels que des antagonistes des MMPs mais les résultats des essais
cliniques ne sont pas très prometteurs. (143)
86
C/ Aspects spécifiques
i/ Contexte tissulaire comme déterminant de la fonction tumeur-suppressive ou
oncogène de certains gènes
Bien que les gènes impliqués dans la carcinogenèse soient pléiotropiques,
leur implication dans le développement de la maladie est souvent vue en terme
de : positif ou négatif. Par exemple, les gènes ras activés codent des
oncoprotéines qui entrainent la transformation maligne mais aussi induisent
l'angiogenèse. Ces deux processus ont un effet positif sur le développement de la
maladie. De la même manière, le TSG p53 peut entrainer l'arrêt du cycle cellulaire
ou l'apoptose, les deux inhibant la carcinogenèse. Cette simplification a été mise
en question dans la mesure où le même type d'altération dans le même gène
pouvait avoir un effet positif ou négatif, jouant donc le rôle d'un oncogène ou d'un
TSG, en fonction du type cellulaire étudié. Peu de gènes répondent à cette
description mais il est important de les mentionner puisqu'ils illustrent le fait que
les cellules cancéreuses présentent une différenciation anormale. Cette
anormalité peut être une dé-différenciation ou une trans-différenciation. Ainsi, des
gènes impliqués dans la régulation de la différenciation cellulaire pourraient
induire ou prévenir la carcinogenèse. Deux familles de gènes répondent à ces
caractéristiques : les gènes RUNX codant des facteurs de transcription et les
récepteurs Notch.
a/ Les gènes RUNX
Les gènes RUNX codent des protéines qui dans des complexes avec les
CBF-β (core binding factor β) forment des facteurs de transcription pour des gènes
de différenciation, de croissance et de survie. La famille de facteurs de
transcription RUNX est formée de trois protéines : CBF-α, PEBP-2α (polyoma
enhancer-binding protein) et AML (acute myeloid leukemia). Les trois possèdent
un domaine Runt qui est le site de liaison à la protéine CBF-β.
87
L'implication de ces protéines dans le cancer a été découverte par
l'observation de translocations dans les leucémies engendrant des protéines
chimériques possédant la région N-terminale d’AML1 contenant le domaine Runt.
Bien que le mécanisme d'action soit inconnu, l'hypothèse a été avancée que cette
protéine chimère joue le rôle d'un antagoniste de la forme normale de la protéine
RUNX1. En plus des translocations, des mutations ponctuelles de RUNX1 ont
également été observées dans certaines leucémies. Ces mutations touchent plus
particulièrement le domaine Runt affectant la liaison à l'ADN ou entrainant des
formes tronquées des protéines.
Puisque la perte de fonction de ces protéines peut engendrer des
leucémies, ces protéines semblent être des TSGs. Cette idée est supportée par la
découverte de mutations des gènes RUNX1 dans la lignée germinale de patients
souffrant de formes familiales de troubles des plaquettes, une condition qui
prédispose à la leucémie myéloïde aiguë (AML). L'activité tumeur suppressive de
RUNX1 peut être étendue aux gènes RUNX3 qui sont souvent régulés à la baisse
par hyperméthylation dans les tumeurs primaires d'origine épithéliale.
Cependant le phénotype causée par la simple de perte de RUNX1 est
différent de celui engendré par la fusion de RUNX1 avec la protéine ETO qui agit
de manière dominante, comme un oncogène. Le potentiel oncogénique des gènes
RUNX est également supporté par l'observation que les trois membres sont des
cibles de l'activation insertionnelle par des rétrovirus dans des modèles murins de
lymphomes. De plus, l'amplification de RUNX1 a été reportée dans certaines
formes agressives de leucémies lymphoblastiques aiguës (ALL) à cellules B.
RUNX2 et RUNX3 n'ont pas été autant étudiés que RUNX1 mais il semblerait
qu'ils possèdent le même potentiel oncogénique.
Ainsi, les gènes RUNX constituent un bon exemple de gènes qui peuvent
agir comme oncogènes ou TSGs dans différentes conditions. Par conséquent
l'activité oncogénique ou tumeur suppressive d'un gène n'est pas le fruit d'une
altération spécifique dans un gène donné mais plutôt la combinaison de l'altération
et du contexte développemental et histologique. Ceci est extrêmement important
puisque le même traitement pourrait entrainer des effets opposés lorsque le
contexte cellulaire change. (144)
88
b/ Les gènes Notch
Ces gènes tiennent leur nom d'une mutation chez Drosophila melanogaster
qui produit entailles dans leurs ailes : notches en anglais. L'analyse moléculaire a
révélé que ce phénotype était dû à la perte de fonction par haploinsuffisance d'un
gène codant un récepteur transmembranaire : Notch. Il existe quatre homologues
de ce gène chez l'Homme. Ces gènes sont impliqués principalement dans la
différenciation cellulaire.
Ces récepteurs possèdent au moins cinq ligands : DLL1 (delta like ligand),
DLL2, DLL3, JAG1 et JAG2. Suite à la liaison de son ligand, le récepteur subit
plusieurs clivages protéolytiques entrainant la libération de la partie intracellulaire
du récepteur qui se localise alors dans le noyau. Ce processus est hautement
régulé au travers de l'interaction avec des protéines homologues de Deltex et
Mastermind chez Drosophila. Il est intéressant de noter que Deltex, qui est un
régulateur positif de Notch chez Drosophila, est un régulateur négatif chez les
mammifères. Le récepteur Notch activé participe à un complexe contenant
l'homologue du gène de la mouche SuH (suppressor of hairless) CBF-1 qui est un
facteur de transcription. Suite à la liaison de Notch, CBF-1, qui était jusqu'alors un
répresseur de transcription, devient un activateur de transcription. Les gènes
transcrits sont hautement pléiotropiques et contexte spécifique, à tel point qu'il est
impossible de prédire les conséquences de l'activation de Notch dans différents
tissus parce que la fonction de Notch ne semble pas être l'induction mais plutôt de
permettre certains changements. On classe l'action de Notch dans différentes
catégories : maintien de l'état indifférencié, maintien des cellules souches ou
différenciation binaire. Pour ce dernier cas, pour deux cellules de même type, celle
exprimant le ligand et celle exprimant le récepteur ne s'engageront pas dans la
même voie de différenciation. (145)
Parmi les gènes cibles de Notch on a : les facteurs de transcription Hes
(Hairy-enhancer of split) qui ont un effet sur la différenciation cellulaire et p21 Waf1,
qui est un inhibiteur des CDK et donc bloque la progression du cycle cellulaire.
Le locus Notch engendre des phénotypes différents en fonction du nombre
de copies du gène présent. Ainsi, la délétion ou la duplication d'un allèle
produiront des phénotypes différents de celui d'une cellule possédant deux allèles.
89
L'implication de Notch dans le cancer a commencé suite à l'observation de
translocations dans des ALL à cellules T générant des protéines chimères
contenant une version tronquée de la protéine Notch1 correspondant à la partie
intracellulaire du récepteur ce qui mime la version activée du récepteur. De façon
similaire, l'intégration du virus MuLV (Moloney murine leukemia virus) se produit
souvent au niveau du gène Notch1 générant une version tronquée de la protéine
correspondant au récepteur activé (la portion cytoplasmique). L'intégration du
virus MMTV (mouse mammary tumor virus) dans le gène Notch4 générait un gain
de fonction au travers d'une version tronquée de la protéine, de la même manière
que pour Notch1 dans les ALL à cellules T. Des études ultérieures sur souris
transgéniques exprimants la portion cytoplasmique de Notch 4 et Notch 1 a
prouvé l'association entre ces mutants et la carcinogenèse mammaire. L'activation
constitutive de Notch entraine l'arrêt de la différenciation de sorte que les animaux
présentent des cellules mammaires incapables de se différencier de façon
terminale suite à la stimulation hormonale. Il est intéressant de constater que le
modèle murin porteur d'une mutation de Notch1 présente une association entre
lésions bénignes et lactation, ce qui montre l'action contexte-dépendant de Notch.
Par ailleurs, les cancers du sein ainsi que d'autres cancers épithéliaux présentent
ne surexpression de signaux de la voie Notch, dont le récepteur et son ligand.
Ces données montrent que le récepteur activé, au moins dans certains
tissus tels que l'épithélium mammaire ou le tissu lymphatique, possède un
potentiel oncogénique. Des études in vitro sur lignées cellulaires montrent que le
récepteur seul présente un faible potentiel oncogénique mais qu'il agit en synergie
avec d'autres oncoprotéines. Les cibles du récepteurs Notch sont dans l'ensemble
inconnues mais il semblerait que la cycline D1 en soit une. Il existe également un
couplage entre Notch et la voie de signalisation de ras dans un contexte
néoplasique alors que la suppression de la voie Notch inhibe l'oncogenèse induite
par l'oncogène ras activé. (146)
De récentes études montrent cependant que l'activation de Notch dans des
kératinocytes entraine leur différenciation alors que la délétion du gène résulte
dans le développement de néoplasies et une sensibilité accrue à la carcinogenèse
chimique. Ces effets étaient associés avec l'induction de p21Waf1 par l'activation de
la voie de signalisation Notch. Ceci suggère une activité tumeur suppressive dans
90
l'épiderme qui s'oppose à l'activité oncogénique dans les cellules de l'épithélium
mammaire. Le mécanisme expliquant cette dualité est encore inconnu. (147)
ii/ Cellules souches cancéreuses
Des études ont montré qu'il y avait un nombre minimum de cellules à
injecter pour qu'un xénogreffe sur souris prenne. Or, si la population cellulaire
tumorale était homogène alors une seule cellule devrait suffire au développement
tumoral chez la souris et le nombre de cellules injectées n'influencerait que le
temps de latence pour l'obtention d'une tumeur palpable. Cependant, il s'avère
qu'un minimum d'au moins quelques centaines de cellules est nécessaire au
développement tumoral chez la souris. Des observations similaires ont été faites
in vitro avec des expériences clonogéniques dans lesquelles la survie de cellules
individuelles a été testée, par opposition à la survie de la culture entière. Ainsi, les
cellules cancéreuses ne sont pas homogènes et seulement une fraction des
cellules d'une tumeur peut croitre in vivo et générer une tumeur solide. Ces
cellules qui possèdent la capacité de se régénérer sont les cellules souches
cancéreuses et sont responsables d'une part pour le renouvellement des cellules
souches
et
d’autre
part
pour
la
génération
de
cellules
cancéreuses
« différenciées ». Ces dernières contribuent de façon importante à la masse
tumorale mais n'ont pas de propriétés tumorigéniques. Une telle hétérogénéité est
apparente dans les tératocarcinomes dans lesquels une faible proportion de
cellules expriment des marqueurs spécifiques tels que β-hCG (β-human chorionic
gonadotropin), tandis que les autres cellules peuvent produire dents ou poils. Bien
que les cellules souches cancéreuses comme les cellules « différentiés » aient la
capacité de proliférer, elle est limitée dans le cas de ces dernières tandis que les
cellules souches peuvent se diviser indéfiniment. (148)
Pour prouver cette hypothèse, il faut pouvoir séparer les cellules d'une
tumeur donnée en plusieurs sous-populations et tester leur tumorigénicité (Fig. 18).
De telles études ont été menées sur des tumeurs mammaires dans lesquelles les
cellules ont été séparées en fonction de leur profil d'expression de certains
marqueurs de surfaces et ont confirmé l'hypothèse. Seulement certaines souspopulations des cellules du cancer du sein étaient tumorigènes, correspondant
91
aux cellules souches de la tumeur mammaire primaire testée. L'injection d'une
centaine de cellules souches a permis le développement de tumeurs tandis que
l'injection de plusieurs dizaines de milliers des autres cellules n'a pas permis la
formation de tumeurs. (149)
Fig. 18 : Test de tumorigénicité. D’après Hippokratis (82)
Il reste cependant à prouver que ces cellules ont toutes les caractéristiques
de cellules souches tumorales et peuvent donc générer l'ensemble des sous-types
cellulaires de la tumeur.
Par ailleurs, l'injection de cellules de carcinome embryonnaire en souscutané chez des souris entraine le développement de tératocarcinomes tandis que
l'injection des mêmes cellules dans des blastocystes donne naissance à des
souris chimères. Ainsi, le devenir des cellules souches cancéreuses est
également hautement dépendant de leur micro-envrionnement. (150)
Implication des cellules souches cancéreuses sur le pronostique et le
traitement
L'accumulation de mutations n'a un réel impact que dans les cellules
souches cancéreuses. En effet, même si une cellule « différenciée » acquiert des
mutations, elles seront perdues puisque cette cellule a une durée de vie limitée.
92
Inversement, les mutations dans les cellules souches sont transmises aux cellules
filles, participant ainsi aux caractéristiques de la tumeur, de façon plus ou moins
importante en fonction de l'avantage prolifératif que ces mutations confèrent.
Il existe une hétérogénéité au sein même des cellules souches.Lorsque les
cellules de cancer du sein ont été testées, les tumeurs les plus agressives
comportaient plus de cellules tumorigènes, qui représentent donc cellules souches,
mais aussi celle-ci pouvaient être subdivisées en plusieurs sous-populations
caractérisées par différentes mutations. On peut également imaginer qu'une
mutation dans une cellule « différenciée » résulte dans l'acquisition de l'immortalité.
Le taux de croissance tumoral reflète donc, non seulement le taux de
prolifération cellulaire et l'interaction entre les cellules cancéreuses et le stroma
mais aussi la proportion de cellules souches au sein de la tumeur.
Les cellules souches ont également une implication importante pour la
thérapie. En effet, les traitements cherchent à inhiber la croissance des cellules
cancéreuses sans affecter les cellules normales. Cette sélection passe par le biais
de marqueurs spécifiques dans ou sur les cellules cancéreuses qui constituent
soit la cible de la thérapie soit une manière de distinguer les cellules néoplasiques
auxquelles le médicament doit être délivré. Cependant, cette sélection s'exerce en
général sur les cellules cancéreuses majoritaires, à savoir les cellules
« différenciées » alors que les cellules souches devraient constituer la réelle cible.
Le fait que les cellules souches représentent une faible proportion de la tumeur
rend l'identification de leur profil d'expression plus difficile dans la mesure où il est
souvent masqué par celui des cellules « différenciées ». Par ailleurs, les cellules
souches cancéreuses sont souvent quiescentes, possèdent des capacités de
réparation de l'ADN supérieures et ainsi présentent une plus haute résistance aux
traitements que les cellules « différenciées ». Enfin, les cellules souches
cancéreuses, comme les cellules souches normales, expriment des transporteurs
comme ABC (ATP binding cassette) qui jouent un rôle important dans la
résistance aux médicaments.
Ainsi, il est possible d'envisager que le manque d'efficacité des thérapies
anti-cancéreuses classiques soit dû au fait qu'elles inhibent la croissance d'une
sous-population cellulaire, les cellules « différenciées » mais n'affectent pas les
cellules souches. Le succès de traitements répétés pourrait alors être dû à la
93
diminution périodique de la population de cellules « différentiées ». Le
développement d'un traitement hautement efficace devrait donc prendre en
compte la population de cellules souches qui est celle qui doit être éliminée. (151,
152)
iii/ Pharmacogénomique – Détermination de l'efficacité thérapeutique
Dès le début de la thérapie anti-cancéreuse, les oncologistes ont remarqué
une grande hétérogénéité de réponses au traitement. Bien que des tumeurs
répondent bien au traitement, ce n'est pas le cas d'autres, souvent hautement
similaires par ailleurs. De plus, de nombreuses tumeurs, répondant initialement au
traitement, développent des résistances après un certain temps. Par conséquent,
la thérapie anti-cancéreuse ne soigne pas mais retarde la progression de la
maladie.
De nombreux médicaments ciblant différentes voies de signalisation
existent ; ainsi, différents mécanismes peuvent expliquer leur plus ou moins
grande efficacité et dans la plupart des cas, la résistance à un médicament n'est
pas synonyme de résistance à un autre. Pour les traitements ciblant des voies de
signalisation plus générales comme par exemple l'apoptose, un défaut au niveau
de la machinerie de l'apoptose entraine la résistance à l'ensemble des thérapies
se basant sur l'induction de la mort cellulaire programmée, parmi lesquelles on
peut citer le cisplatine, l'adriamycine ou encore la radiothérapie. Ceci est
également applicable aux tumeurs de l'appareil reproducteur utilisant des
thérapies hormonales et pour lesquelles la résistance est causée par l'absence de
récepteurs (et est donc prévisible). Cependant, même si les récepteurs sont
présents, la privation en hormones, qui sont des agents mitogènes, vise à induire
l'apoptose. La réponse apoptotique est donc encore une fois recquise. Un autre
mécanisme pouvant expliquer la sensibilité réduite des cellules cancéreuses aux
traitements est la présence de pompes comme la glycoprotéine P qui excrètent le
médicament hors de la cellule. Les cellules cancéreuses surexpriment souvent
ces « détoxifiants » cellulaires.
94
a/ Lien entre chimiothérapie/radiothérapie et apoptose
L'apoptose est caractérisée par certains changements morphologiques
pour lesquels les caspases jouent un rôle important. Il s'agit d'un processus actif,
hautement contrôlé, aboutissant à la mort cellulaire « dans la dignité ». Elle peut
être déclenchée par des signaux exogènes (stress génotoxique par exemple) ou
endogènes (en particulier au cours du développement). De nombreuses
molécules de chimiothérapie ont été identifiées de façon empirique, sur la base de
leur capacité à inhiber la prolifération cellulaire et donc leur mécanisme d'action
n'est pas toujours connu. Cependant, il apparaît souvent qu'ils agissent par un
mécanisme impliquant l'initiation de l'apoptose.
La voie extrinsèque de l'apoptose fait appel aux récepteurs de mort
cellulaire : CD95, récepteur au TNF (tumor necrosis factor) et récepteur au TRAIL
(TNF-related apoptosis-inducing ligand) qui, suite à leur activation entrainent une
cascade d'événements aboutissant à l'activation des caspases, en particulier les
caspases 3 et 7. Pour la voie intrinsèque, des protéines mitochondriales telles que
Smac/DIABLO (Second mitochondrial-derived activator of caspase / direct inhibitor
of apoptosis-binding protein with low pI), HtrA2 (high-temperature requirement
protein A2) ou encore cyt c sont relarguées dans le cytosol. Le cyt c forme un
complexe avec Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor 1) pour activer la
caspase 9 et induire l'apoptose tandis que Smac/DIABLO et HtrA2 se lient aux
protéines anti-apoptotiques et inhibent ainsi leur action. (153)
b/ Le gène tumeur suppresseur p53, un régulateur majeur de l'efficacité de
la thérapeutique anticancéreuse
Le TSG p53 joue un rôle important dans la régulation de l'apoptose. En
effet, il peut rompre l'équilibre entre les gènes pro-apoptotiques comme Bax, Bac
et puma et anti-apoptotiques comme Bcl-2 en faveur des gènes pro-apoptotiques
ou encore induire d'autres gènes impliqués dans l'apoptose tels que PTEN ou
Apaf-1 et stimuler la voie extrinsèque au travers des récepteurs CD95 et TRAIL.
En raison du rôle central qu'occupe p53, il n'est pas surprenant que ce
gène soit le plus souvent muté dans les cancers.
95
Il a été montré que la ré-expression de gènes impliqués dans l'apoptose
tels que p53 pouvait entrainer une réponse au traitement et qu'inversement,
l'inactivation de ces gènes rendait la tumeur résistante à la chimiothérapie et à la
radiothérapie. Ainsi, la voie de l'apoptose doit être intacte pour la réponse à la
plupart des traitements.
Dans le cas de la radiothérapie, suite aux radiations ionisantes, la plupart
des cellules cancéreuses connaissent ce que l'on appelle une « catastrophe
mitotique » qui résulte soit dans la mort cellulaire soit dans l'arrêt irréversible de la
croissance.
Des études présentent cependant des résultats contradictoires. En effet, il a
été démontré que la présence de p21Waf1, un TSG agissant en aval de p53 pour
induire l'arrêt du cycle cellulaire, rendait les tumeurs résistantes au traitement. Il a
été proposé que l'arrêt du cycle cellulaire permettait à la cellule de procéder à la
réparation des dommages de l'ADN engendrés par la thérapie alors que les
cellules déficientes en p21Waf1 continuaient de proliférer, accumulant ainsi des
mutations ce qui aboutit à leur mort.
Par ailleurs, p53 confère une résistance à certains agents intercalants
tandis qu'il confère une sensibilité à d'autres, comme le 5-fluorouracile, par un
mécanisme différent. Ceci reflète probablement de multiples rôles de p53 dans la
régulation de l'apoptose, de la stabilité génomique et de l'arrêt de la croissance
(réversible ou non). L'origine des cellules cancéreuses en association avec les
voies de signalisation affectées par les mutations dont elles sont porteuses
pourrait favoriser l'une ou l'autre réponse. Ainsi, les cellules prônes à entrer dans
l'arrêt du cycle cellulaire avec une réponse p53/p21 intacte seront résistantes à la
thérapie tandis que les cellules prônes à suivre la voie de l'apoptose seront
sensibles. Ceci souligne l'importance du contexte cellulaire, en plus du statut
génétique dans la prédiction de l'efficacité d'un traitement. (154, 155, 156)
c/ La résistance à la thérapie est intrinsèque aux tumeurs
Il apparaît donc que la capacité des cellules à échapper à l'apoptose est
aussi responsable de la résistance au traitement. Ainsi, la résistance à la thérapie
est intrinsèque aux tumeurs, ce qui n'empêche pas que les traitements entrainent
96
la sélection de certains génotypes présentant une plus grande résistance que les
autres. Les métastases, qui sont sujettes à une forte sélection sur la base de leur
survie dans des conditions non favorables, sont en général plus résistantes à la
thérapie que les tumeurs primaires. Ceci est en accord avec l'enrichissement des
cellules métastatiques en mutations de p53 et surexpression de Bcl-2 par rapport
aux tumeurs primaires d'origine.
Le succès plus important des thérapies combinatoires associant des agents
avec des cibles différentes s'explique par la probabilité réduite pour les cellules
cancéreuses d'avoir une résistance intrinsèque à l'ensemble de ces cibles.
d/ Pharmacogénétique
Jusqu'alors nous nous sommes intéressés aux mutations acquises et
accumulées par les cellules cancéreuses. Le polymorphisme hérité par les
patients pourrait également jouer un rôle important dans l'efficacité des thérapies
anti-cancéreuses.
Le terme pharmacogénétique réfère à la discipline étudiant les gènes
candidats susceptibles d'expliquer les variations dans la réponse d'un individu à
un médicament. Originellement destinée à l'étude de la réponse aux médicaments
contre des agents infectieux, cette discipline s'est par la suite ouverte à l'étude de
la réponse aux agents anti-cancéreux. Les mécanismes pouvant expliquer
l'efficacité d'un médicament peuvent être séparés en trois sous-catégories en
fonction de s'ils agissent en amont (transporteurs, enzyme métabolisant le
médicament etc.), au niveau (métabolisme de l'ADN, fuseau mitotique etc.) ou en
aval de la cible critique (régulation de l'apoptose).
1/ Les mécanismes en amont
Les transporteurs ABC, parmi lesquels le gène de multi-drogue résistance
MDR1 codant la glycoprotéine P, sont supposés jouer un rôle important dans
l'efficacité au traitement puisqu'ils régulent la quantité de médicaments dans les
cellules cancéreuses. Cette famille, qui en plus de MDR1 inclut également MRP1
97
et MRP2, est souvent amplifiée par mutations somatiques dans les cellules
cancéreuses mais aussi par polymorphisme hérité.
Les cytochromes P450 sont des enzymes qui peuvent soit détoxifier les
médicaments tels que le paclitaxel ou le tamoxifène soir activer des médicaments
inactifs tels que le cyclophosphamide. Le paclitaxel est métabolisé par CYP2C8
qui présente différents allèles avec une efficacité variable pour métaboliser ce
médicament. CYP17 est un membre de la famille des cyt P450 impliqué dans la
biosynthèse d'oestrogènes. Un polymorphisme dans la région non traduite du
gène entraine sa régulation à la hausse. Il a été montré que le risque de
développement d'un cancer de l'utérus suite à un traitement hormonal de
remplacement (après la ménopause) dépendait de l'allèle de CYP17 dont le
patient est porteur.
L'UGT (UDP-glucuronsyltransferase) catalyse la glucuronidation (ajout
d'acide glucuronique) de différentes molécules, les rendant solubles dans l'eau et
ainsi facilitant leur élimination. L'irinotecan est activé dans le foie en un inhibiteur
de l'ADN topoisomerase I utilisé chez les patients atteints de cancer du colon. Un
polymorphisme dans le promoteur de l'UGT conduit à une transcription réduite et
donc une moindre glucuronidation de ses cibles qui incluent l'irinotecan, ce qui
entraine dans certains cas une toxicité avec forte diarrhée. (157)
2/ Interaction médicament – cible
Le
5-fluorouracile
(5-FU)
est
converti
en
5-fluoro-2-deoxyuridine
monophosphate, un inhibiteur de la thymidylate synthase (TS) qui empêche la
division cellulaire. Dans le foie, une large proportion de 5-FU est inactivée par la
DPD (dihydropyrimidine dehydrogenase), une enzyme qui présente une forte
variabilité (d'un facteur 8 à 21) de son activité entre individus. Cette variabilité est
attibuée à un polymorphisme dans la séquence du gène. Les patients avec une
activité réduite de la DPD présentent en général une forte toxicité du 5-FU. Il
existe également un polymorphisme dans la région de régulation de la TS
affectant son niveau d'expression. Une faible activité de la TS est associée à une
mailleure réponse au traitement par le 5-FU.
98
Les enzymes de réparation de l'ADN qui corrigent les dommages causés
par certains agents anti-cancéreux jouent également un rôle dans l'efficacité des
médicaments. Par exemple, un polymorphisme de l'enzyme hMSH2 module la
susceptibilité à la chimiothérapie entrainant l'alkylation des guanines.
Les anti-folates comme le methotrexate sont utilisés dans la thérapie contre
les leucémies, les lymphomes et les cancers du sein. L'enzyme 5,10methylenetetrahydrofolate reductase, qui joue un rôle important dans le maintien
de niveaux faibles de folates, présente un polymorphisme qui affecte son activité
et donc le niveau de folates endogènes. (157)
3/ Les mécanismes en aval
Certains polymorphismes existent, comme par exemple dans le gène
tumeur suppresseur p53. En particulier, dans l'exon 4, un polymorphisme qui code
alternativement pour arginine ou proline à la position 72 affecte l'efficacité du cisplatine dans les cancers de la tête et du cou.
Des polymorphismes de l'ADN mitochondrial sont également susceptibles
de moduler la réponse aux traitements anti-cancéreux. (157)
4/ Vers la thérapie individuelle
Le but de la pharmacogénétique est de prédire la réponse au traitement
d'un patient en se basant sur son génotype. Des études en cours visent à évaluer
le polymorphisme non seulement dans les régions codantes mais aussi non
codantes, qui peuvent être des séquences régulatrices, dans la réponse aux
traitements anti-cancéreux. Ainsi, dans un futur proche, le traitement administré à
chaque patient se basera sur leur génotype. (158)
iv/ Carcinogenèse chimique
Cela fait très longtemps que l'on sait qu'il existe un lien entre certains
produits chimiques et certains cancers. Par exemple, il a été décrit il y a près de
300 ans que les ramoneurs développaient des cancers du scrotum.
99
Dans la carcinogenèse chimique, le composé responsable pour l'induction
de la néoplasie entraine des dommages de l'ADN : ruptures de l'ADN,
substitutions de bases, insertions, délétions, réticulation etc. Ces mutations
échappent aux systèmes de détection de dommages et de réparation de l'ADN et
deviennent fixes dans le génome. D'autres carcinogènes ne sont pas capavles de
se lier à l'ADN et exercent leur action de façon indirecte (épigénétique, dérivés
réactifs de l'oxygène, inflammation etc.).
a/ Carcinogènes génotoxiques
La liaison directe à l'ADN de certains carcinogènes et les dommages qu'ils
entrainent représentent un mécanisme direct de carcinogenèse. Ces composés,
parmi lesquels on trouve l’oxide d'éthylène, le bis (chloro-méthyl) éther et des
dérivés de l'aziridine et de la moutarde azotée, sont électrophiles, ce qui leur
permet d'intéragir physiquement avec l'ADN.
De vastes majorité des composés en revanche nécessitent d'être activés,
en particulier par les cyt P450 : ce sont des pro-carcinogènes. (159, 160)
b/ Les hydrocarbones aromatiques polycycliques (PAHs)
Les PAHs sont des carcinogènes produits lors de la combustion de matière
organique. Par exemple, le benzo(a)pyrène pentacyclique (BP) est présent dans
le goudron. Il peut être éliminé ou activé en 7,8-dihydrodiol BP qui se lie
directement à l'ADN. (160)
c/ Les aflatoxines
Ce sont des mycotoxines qui contaminent la nourriture au cours de la
croissance de certaines moisissures. Les aflatoxines, en partculier l'aflatoxine B1
(AFB1), sont responsables du développement de carcinomes hépatocellulaires.
L'AFB1 requiert l'activation par le cyt P450. La stéréochimie du métabolite est
importante. En effet, l'activation par CYP3A4 ne produit que des exo-isomères qui
sont 1000 fois plus génotoxiques que les endo-isomères. (160)
100
d/ Les carcinogènes non génotoxiques
Certains composés n'ont pas la capacité de se lier à l'ADN mais sont
pourtant
de
puissants
carcinogènes.
C'est
le
cas
de
la
2,
3,
7,8-
tetrachlorodidenzo-p-dioxine (TCDD). Les TCDD sont produites lors de la
production de phénols polychlorés. Le mécanisme d'action supposé des TCDD
consiste à stimuler les récepteurs aux arylhydrocarbures (AhR), ce qui, au travers
d'une cascade d'événements, aboutit à la modulation de l'activité de protéines de
régulation de la différenciation, de la prolifération et de la mort cellulaires.
L'ablation du gèna Ah chez des souris les rend résistantes à la carcinogenèse
induite par les TCDD. Inversement, la surexpression d'une forme active de l'AhR
induit des cancers chez la souris. (161, 162)
v/ Hormones et cancer
Le lien entre cancer et hormones a été reconnu il y a plus d'un siècle. Ce
lien reflète le fait que les hormones sont impliquées, de façon directe ou indirecte,
dans différents aspects de la biologie tumorale. Par exemple, les hormones sont
des régulateurs de la croissance tumorale ; elles ont un effet positif ou négatif sur
la prolifération cellulaire. De plus, le statut hormonal d'une tumeur a d'importantes
implications prognostiques et thérapeutiques. Par exemple, les tumeurs
prostatiques acquièrent une indépendance à l'androgène au cours de la
métastase.
Les hormones peuvent agir au travers des voies systémiques, paracrine ou
autocrine. L'action autocrine est tout particulièrement importante dans le cadre de
la carcinogenèse puisque les cellules cancéreuses peuvent générer des boucles
autocrines qui maintiennent le signal et qui constituent une cible des traitements
d'inhibition de croissance tumorale.
Les hormones peuvent agir par le biais de récepteurs membranaires qui
déclenchent une cascade de signalisation : ce sont les hormones protéiques ; ou,
et c'est le cas majoritaire, leurs récepteurs peuvent être dans le noyau et elles
agissent alors comme facteur de transcription : ce sont les hormones stéroïdes.
101
Il est courant de voir des actions différentes de la même hormone dans
différents tissus ; ceci s'explique par la présence de co-facteurs tissu-spécifiques
qui régulent l'activité hormonale.
a/ Androgènes et cancer de la prostate
Le cancer de la prostate est le cancer avec la plus forte incidence chez
l'homme et le second en termes de mortalité, après le cancer des poumons. Trois
sources de données laissent à penser que les androgènes jouent un rôle
important dans ce cancer. En premier lieu, la castration de jeunes mâles offre une
protection contre le développement du cancer de la prostate. Ensuite, des études
épidémiologiques
montrent
une
corrélation
entre
les
concentrations
en
androgènes dans le sérum et le risque de développer des tumeurs de la prostate.
Enfin, des études in vitro et in vivo montrent que l'équilibre entre mort cellulaire et
prolifération peut être rompu par le retrait ou la supplémentation en androgènes.
L'androgène majeur dans le sérum est la testostérone produite par les
cellules de Leydig dans les testicules. Dans la prostate, l'androgène prédominant
est la DHT (5α-dihydrotestostérone) qui est produite à partir de testostérone par la
5α-reductase. Ces deux androgènes agissent sur le même récepteur : le récepteur
aux androgènes (AR) qui est un acteur clef dans le cancer de la prostate. L'AR est
un récepteur nucléaire qui, suite à la liaison de son ligand, fonctionne comme un
facteur de transcription. La liaison des androgènes sur leur récepteur entraine la
dissociation d'une protéine chaperonne qui inhibait jusqu'alors le récepteur, sa
dimérisation et enfin sa liaison à sa séquence cible sur l'ADN. Les gènes cibles
initient une cascade de signaux aboutissant à la prolifération cellulaire et à
l'inhibition de l'apoptose. L'activation des AR entraine également la lipogenèse et
permet la synthèse de composants clefs de la membrane, tels que les
phospholipides ou le cholestérol. Cette lipogenèse persiste à tous les stades de
développement de la tumeur, même lorsque la tumeur est devenue indépendante
des androgènes, ce qui suggère que cette voie est fondamentale à la
carcinogenèse prostatique. Il est possible d'activer le récepteur en l'absence de
ligand, au travers de couplages avec d'autres voies impliquant des facteurs de
102
croissance telles que les voies de l'EGF, de l'IGF ou encore du KGF/FGF-7
(keratinocyte growth factor). (163)
Une autre action du récepteur a été proposée qui ne met pas en jeu son
rôle de facteur de transcription, à savoir, l'activation de la voie des MAPK au
travers d'un mécanisme dépendant du c-Src.
Des études in vitro et in vivo ont montré une grande hétérogénéité de
réponses suite à l'activation de l’AR. Ceci est dû à la présence de facteurs cellulespécifiques capable de moduler la réponse consécutive à l'activation du récepteur ;
ils sont co-activateurs ou co-répresseurs. Les co-activateurs de classe I tels que
p300/CBP lient les récepteurs nucléaires à la machinerie de transcription alors
que les co-activateurs de classe II tels que p160 sont impliqués dans le
remodelage de la chromatine. En fonction de la disponibilité en co-activateurs, ces
derniers sont recrutés seuls ou en association et suivis du recrutement de l'ARN
polymérase II (Fig. 19). Ce mécanisme est également applicable aux récepteurs
aux oestrogènes (ER). Plusieurs altérations de ces co-activateurs sont impliquées
dans le cancer de la prostate. Notamment, l'expression de SRC-1 est augmentée
dans les carcinomes prostatiques indépendants des androgènes par rapport à
ceux androgènes dépendants ou aux lésions bénignes tandis que l'expression de
RAC-3 est corrélée avec des tumeurs de hauts grades. P300 quant à lui a été
impliqué dans l'activation de l’AR par l'interleukine-6, de façon indépendante des
androgènes. (164)
Fig. 19 : Structure du récepteur aux androgènes
De nombreuses mutations du récepteur lui-même ont été reportées,
incluant des mutations accroissant l'activité du récepteur ou modifiant sa
spécificité pour son ligand. Il existe un polymorphisme poly-Glu (codon CAG) en
région N-terminale dont le nombre de répétitions varie de 14 à 35. Le degré de
répétition a été associé au risque de cancer de la prostate, avec un petit nombre
de répétitions associé à un risque plus important de développement d'un
103
carcinome de la prostate et un âge au diagnostique plus jeune. Les mutations du
AR sont, en général, rares dans les carcinomes prostatiques, du moins avant
thérapie. Les amplifications du AR qui si situe sur le bras long du chromosome 11
en position q13 sont également peu communes avant thérapie mais leur incidence
augmente, pouvant aller jusqu'à 30 %, dans les tumeurs réfractaires aux
hormones et leurs métastases. (165)
Un aspect important de la biologie du cancer de la prostate est l'acquisition
de l'indépendance aux androgènes. Après un certain point du développement, les
cellules des carcinomes prostatiques perdent leur sensibilité aux androgènes. Par
conséquent,
la
suppression
androgénique,
qui
constitue
une
approche
thérapeutique usuelle, ne retarde plus la croissance tumorale. Cette acquisition
constitue la transition du cancer de la prostate vers un stade incurable. Cette
transition n'est cependant pas toujours associée avec la perte ou l'altération de la
structure ou de l'expression des AR. Même, une amplification peut être observée
correspondant à une hypersensibilisation des AR (Fig. 20). (166)
Fig. 20 : Surexpression des récepteurs aux androgènes en réponse à la thérapie. D’après
Hippokratis (82)
b/ Stéroïdes sexuels et cancer du sein
Le cancer du sein est une autre maladie présentant une association
marquée avec les hormones stéroïdes, en particulier le 17β-oestradiol. Les rôles
104
des oestrogènes dans le cancer du sein est compliqué par l'action d'une autre
hormone : la progestérone, présente dans la glande mammaire à très hauts
niveaux à certaines phases du cycle menstruel.
De la même manière que les AR dans le cancer de la prostate, les
récepteurs aux oestrogènes (ER) joue un rôle central dans le cancer du sein. On
distingue deux récepteurs : ERα et ERβ, codés par des gènes situés sur le bras
long des chromosomes 6 et 14, respectivement. Ces récepteurs possèdent des
domaines analogues à ceux des AR, à savoir : domaine de liaison de l'ADN,
domaine de transactivation, domaine de liaison du ligand, etc. La dimérisation, qui
peut être homo- ou hétéro- entre ERα et ERβ, est essentielle à la fonction de
facteur de transcription et donc pour l'activation des gènes cibles. De la même
manière que pour les AR, des co-activateurs et co-répresseurs interviennent mais
la complexité de ce système est plus importante dans la mesure où la liaison de
leurs ligands entraine des réponses différentes en fonction du type d’ER activé.
Ainsi, leur action combinée peut entrainer des réponses différentes, et ce même
au sein du même système cellulaire.
L'activité normale des ER est requise pour le développement et la
maturation de la glande mammaire. Dans le tissu mammaire sein, seuls 10 % des
cellules épithéliales expriment ERα contre 85 % pour ERβ. Il a été montré que le
17β-oestradiol induisait la transition G1/S conduisant à une plus grande fraction de
cellules en phase S. Ceci s'explique par l'action exercée par le 17β-oestradiol sur
l'expression des gènes de progression du cycle cellulaire tels que la cycline D1,
myc etc. (167)
La régulation de l'expression des ER semble jouer un rôle important dans le
cancer du sein, cependant, le mécanisme d'action n'est pas bien connu en raison
des résultats contradictoires obtenus par différentes études. D'une façon générale,
la proportion de cellules exprimant les récepteurs ERα augmente dans les cancers
invasifs par rapport aux cellules de l'épithélium mammaire normal. Inversement,
l'expression des récepteurs ERβ est diminuée dans les lésions malignes, ce qui
suggère que ce type d’ER a une action tumeur suppressive. Cependant, l'opinion
actuelle est que, ce n'est pas le niveau d'expression en lui même qui est important
mais plutôt le rapport entre ERα et ERβ. Il semblerait qu'un rapport élevé
ERα/ERβ soit associé à une dépendance des tumeurs aux oestrogènes alors que
105
la diminution de ce rapport est associé aux tumeurs indépendantes des
oestrogènes. Ce modèle est compliqué par l'existence de variants plus courts de
ces ER possédant des propriétés de signalisation altérées. De plus, les ER
subissent souvent des altérations structurales telles que des mutations, délétions
ou amplifications dans les cancers du sein. (168)
À la fin du XIXe siècle, l'importance des oestrogènes dans la maladie
étaient déjà connue et c'est la raison pour laquelle G. Beatson a eu recours à
l'ovariectomie sur les patientes atteintes de cancer du sein. Par la suite, plusieurs
tentatives ont été faites d'antagoniser les oestrogènes, sans grand succès, jusque
dans les années 70 quand le tamoxifène a été développé. Il s'agit d'un antioestrogènes non stéroïdien pouvant être utilisé à la fois pour la prévention et le
traitement du cancer du sein. Des études ont montré que, si cette molécule avait
une action anti-œstrogénique dans l'épithélium mammaire, elle agissait comme
agoniste des oestrogènes dans d'autres tissus, en particulier l'endomètre. Ceci a
créé des inquiétudes quant au possible développement d'autres cancers liés aux
oestrogènes, en particulier des carcinomes de l'endomètre ; ceci étant, les
bénéfices d'un tel traitement sont supérieurs aux risques dans le traitement du
cancer du sein. Cette dualité serait due à des différences dans les co-activateurs
et co-répresseurs.
Depuis, différents analogues du tamoxifène ont été développés que l'on
appelle SERMs (selective ER modulators). L'un de ces SERM est prometteur : le
raloxifène, dans la mesure où il conserve l'activité anti-œstrogénique dans le tissu
mammaire du tamoxifène (ainsi que son activité agoniste dans les os) mais a
perdu son activité agoniste dans l'endomètre. (169)
c/ GHRH (Growth hormone releasing hormone) et carcinogenèse
Différentes hormones protéiques ont été associées avec la carcinogenèse.
L'une d'entre elles, la somatostatine, régule à la baisse la synthèse et l'excrétion
des hormones de croissance (GH) et est utilisée sous forme d'analogues dans le
traitement de différentes tumeurs solides. L'IGF-1 (insulin-like growth factor 1), qui
est également une hormone protéique, joue un rôle mitogène dans de
nombreuses tumeurs et constitue donc une cible dans le développement de
106
nouvelles chimiothérapies. Une autre hormone, la GHRH a récemment été
impliquée dans la carcinogenèse et constitue une cible prometteuse pour le
développement de nouvelles thérapies.
La GHRH est un neuropeptide sécrété par l'hypothalamus qui stimule la
synthèse et l'excrétion de GH dans l'hypophyse. Il semblerait cependant que la
GHRH soit également présente dans plusieurs autres tissus où elle serait
impliquait dans divers processus cellulaires. Elle régule la prolifération et la
différenciation de divers types cellulaires non hypophysaires. Le mécanisme
d'action dans les tissus périphériques est mal connu mais fait sans doute appel à
des voies de signalisation autocrines et paracrines (en plus de l'action
neuroendocrine). Le rôle de la GHRH dans la carcinogenèse met en jeu, au moins
en partie, des variants du récepteur à la GHRH plus courts que le récepteur
normal.
Il a été montré que des analogues antagonistes de la GHRH réduisaient les
concentrations en GH et IGF-1 dans des modèles animaux et au final inhibaient la
croissance de différentes tumeurs dépendantes de l'IGF-1, telles que des
ostéosarcomes, carcinomes de la prostate, du rein ou des poumons chez la souris
nude. Le rôle indirect de la GHRH dans la carcinogenèse a également été montré
en utilisant des « petites » souris porteuses d'une mutation faux-sens dans le gène
du récepteur à la GHRH le rendant inactif. En effet, l'ablation de l'action de la
GHRH résulte en une sensibilité réduite à la carcinogenèse chimique dans le foie.
De plus, les mêmes animaux fournissent un environnement non permissive aux à
la croissance de cellules de cancer du sein ; la croissance de xénogreffes chez
ces animaux étant fortement compromise par rapport aux animaux de phénotype
sauvage.
Ceci étant, des études ultérieures sur le mécanisme d'action des
antagonistes de la GHRH ont révélé que l'inhibition de l'IGF-1 n'était pas leur seul
mode d'action. Ces études ont montré que la GHRH était exprimée par plusieurs
tumeurs et lignées cellulaires et que la GHRH et son antagoniste agissaient de
façon opposée dans la régulation de la prolifération cellulaire par un mécanisme
ne faisant pas intervenir l'axe GH/IGF-1. Ceci suggère que la GHRH est un facteur
de croissance agissant de façon paracrine et autocrine.
107
Les tissus non hypophysaires normaux exprimant la GHRH inclus le
placenta, les ovaires, les testicules, et les lymphocytes. Les cancers produisant de
la GHRH inclus les cancers du sein, de l'endomètre, des ovaires, de l'estomac,
des os, de la prostate et les carcinomes pulmonaires à petites cellules.
L'obstacle majeur à l'étude du rôle extra-hypophysaire de ce neuropeptide
dans la carcinogenèse a été le fait que le récepteur à la GHRH dans les cancers
est a priori différent de celui dans l'hypophyse. En effet, le récepteur pituitaire
présente un profil d'expression restreint dans les tissus tels que le rein ou le
placenta. Cependant, des études récentes ont montré qu'il existait des variants de
ce récepteur exprimés dans de nombreux tissus normaux mais surtout malins,
médiant l'effet mitogène de la GHRH. L'un de ces variants : SV1 (splice variant 1)
qui diffère du récepteur normal au niveau d'une petite portion de la région Nterminale (domaine extra-cellulaire) est d'importance majeure dans la mesure où il
présente une activité indépendante de la fixation de son ligand. Ainsi, il peut
stimuler la prolifération cellulaire en l'absence de ligand mais la présence de
GHRH accroit son activité. (170)
Les antagonistes de la GHRH sont des anti-cancéreux prometteurs dans la
mesure où l'ablation de GHRH n'a que peu de conséquences chez l'adulte et
comme ce sont de courts peptides ils peuvent être synthétisés facilement.
vi/ Oncogenèse virale
L'oncogenèse virale est estimée responsable de 15 à 20 % des cancers
dans le monde. Cependant leur importance dans la biologie cancéreuse est plus
importante que leur incidence. En effet, leur étude a permis de mieux comprendre
la biologis des tumeurs, en particulier au début de la recherche sur le cancer.
Pour qu'un virus soit considéré oncogène, il doit répondre à quatre critères :
1. Le virus ou son acide nucléique doit être présent dans les cellules tumorales.
2. La transfection d'une certaine partie du génome viral dans une cellule doit
entrainer son immortalisation ou sa transformation.
3. Montrer qu'il existe une association causale entre l'acquisition du phénotype
malin et le génome viral (ou une portion de celui-ci).
108
4. Pertinence clinique : il doit exister une corrélation entre l'infection virale et
l'augmentation de l'incidence de tumeurs.
Plusieurs virus répondent aux critères ci-dessus, complètement ou en
partie. Certains sont des rétrovirus avec un génome à ARN simple brin tandis que
d'autres ont un génome à ADN double brin. Leurs mécanismes d'actions sont
variés. Dans certains cas ils codent une protéine présentant un potentiel
oncogène, capable d'interférer les voies de signalisation et d'initier la conversion
maligne. C'est le cas des papillomavirus, capable de se lier à des tumeursuppresseurs tels que p53 ou Rb et les inactiver. Dans d'autres cas, ils activent
des oncogènes endogènes tels que wnt ou Notch par mutagenèse insertionnelle.
L'étude de ces virus a permis l'identification de nouveaux gènes importants pour la
carcinogenèse.
Les tumeurs engendrées par des virus oncogènes présentent toutes les
caractéristiques des tumeurs développées de façon indépendante de toute
infection
comme
l'instabilité
génomique,
la
résistance
à
l'apoptose
et
l'augmentation de la prolifération.
a/ Papillomavirus humain (HPV)
L'infection par le virus HPV a été associée à de nombreuses néoplasies,
avec le plus grave étant le cancer du col de l'utérus. Le développement tumoral
présente une période de latence important, ce qui suggère qu'il doit y avoir
accumulation de mutations dans les gènes de l'hôte en plus de l'expression
d'oncoprotéines par le virus pour que la conversion vers la malignité s'opère. De
plus, seuls certains porteurs développent la maladie, ce qui implique une
susceptibilité différente des hôtes ainsi probablement que l'intervention de facteurs
environnementaux ou d'autres facteurs.
Plus de 200 souches ont été identifiées, que l'on peut classer dans deux
grandes catégories : les HPVs cutanés et des muqueuses. On distingue
également les souches à risque élevé et faible. Parmi les virus à risque élevé on
trouve HPV-16, -18 et -31 dont la présence est associée avec la plus forte
incidence de développement de différents types de cancers.
109
Le virus infecte dans un premier temps les cellules épithéliales basales en
division et est présent en petit nombre de copies au cours de la différenciation des
cellules infectées. Cependant, lorsque ces dernières atteignent le stade de
différenciation terminale, le virus se réplique en grand nombre de copies et des
virions sont produits.
Les HPVs sont des virus non enveloppés et leur génome consiste en une
molécule d'ADN double brin d'environ 8 kb. Le génome contient trois régions : la
région E (early) d'environ 4 kb qui code les protéines non structurales, la région L
(late) d'environ 3 kb qui code deux protéines de capside et la région LCR (long
control region) ou URR (upstream regulatory region) qui contient divers éléments
de régulation. Au total, le génome du virus contient 8 ORFs (open reading frames).
Parmi les protéines codées par le génome, E1 et E2 sont impliquées dans
la réplication du génome viral et se lie à l'ADN au niveau de l'origine de réplication.
E2 est aussi impliquée dans la régulation du nombre de copies.
Les propriétés oncogéniques du virus sont principalement attribuées aux
protéines codées par les gènes E6 et E7. L'expression de ces protéines dans des
cultures cellulaires entraine l'immortalisation des kératinocytes, augmente le taux
de mutation en entrainant une instabilité génomique et présente une synergie
avec d'autres oncogènes tels que ras ou myc pour causer la transformation
maligne des cellules. Au niveau moléculaire, l'action d’E6 et E7 est médiée par
leur abilité à se lier et à inactiver des TSGs endogènes p53 e Rb, qui sont
d'importants régulateurs du cycle cellulaire. Par ailleurs, E6 peut induire la
transcription de hTERT qui code la sous-unité transcriptase inverse des
télomérases. Il a été montré que l'affinité d’E7 pour Rb était supérieure dans les
virus à haut risque que dans les virus à risque faible. La liaison de E7 à Rb (ou
p107 et p130, les deux autres membres de la famille Rb) empêche la liaison de ce
dernier à E2F, ce qui stimule la progression du cycle cellulaire. E6 est responsable
de la dégradation de p53 par le protéasome suite à son ubiquitination. Elle a
également un rôle dans la régulation des contacts cellule-cellule au travers
d'intéractions avec des protéines contenant un domaine PDZ. (171)
La protéine E5 a également un rôle dans la carcinogenèse mais son
mécanisme d'action est inconnu. (172, 173)
110
b/ Epstein-Barr Virus (EBV)
L'EBV a été associé à de nombreuses maladies dont le lymphome de
Burkitt, la maladie de Hodgkin, certains lymphomes à cellules T, des carcinomes
naso-pharyngés indifférenciés ou encore des carcinomes gastriques.
Son génome est constitué d'une molécule d'ADN double brin linéaire
d'environ 172 kb. L'EBV présente un tropisme pour les lymphocytes B. L'infection
des lymphocytes est médiée par l'interaction entre le récepteur cellulaire CD21 et
la glycoprotéine gp350 ainsi qu'entre le HLA (human leukocyte antigen) de type II
et la protéine virale gp42. Le virus mais également infecter les cellules épithéliales
mais le mécanisme de l'infection n'est pas complétement compris.
Une grande partie de nos connaissances sur le virus dérive de l'étude de
lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs) qui correspondent à des lignées
cellulaires transformées établies à partir de la culture in vitro de lymphocytes
isolés de patients porteurs du virus. Les propriétés carcinogènes du virus sont
dues de façon prédominante à deux protéines virales : EBNA-2 (antigène
nucléaire) et LMP-1 (protéine membranaire) et de façon moindre aux protéines
EBNA-LP, EBNA-3A et EBNA-3C.
L’implication de ces gènes a été mise en évidence en utilisant des virus
recombinants dont certains gènes ont été supprimés. En réintroduisant le gène
d'intérêt, EBNA-2 par exemple, la capacité du virus à transformer les lymphocytes
B a été restaurée. EBNA-2 agit, au moins en partie, en induisant la transcription
de gènes cibles en se liant aux promoteurs contenant la séquence consensus
GTGGGAA. Cette liaison requiert le régulateur de transcription RBP-Jκ/CBF-1, qui
est aussi activé par le récepteur Notch. EBNA-2 active également l'oncogène cmyc.
LMP-1 est la protéine la plus importante dans le processus de
transformation. Elle présente des similarités avec CD40 (un membre de la famille
des TNFs). La surexpression de LMP-1 produits de nombreux effets différents qui
impliquent souvent l'action d'autres oncogènes cellulaires, comme par exemple,
l'induction de protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2, la production de
cytokins telles que les interleukines IL-6 ou -8 ou l'activation de la
phosphatidylinositol-3-kinase. (174, 175)
111
c/ Virus de l'hépatite B (HBV)
L'HBV est également un virus à ADN double brin. Il est associé à un grand
nombre de carcinomes hépatocellulaires. La protéine HBx joue un rôle clef dans la
transformation. Des expériences in vitro ont montré que la surexpression de HBx
dans des cellules de rongeurs entrainait leur immortalisation tandis que des
expériences avec des souris transgéniques ont montré que HBx agissait en
synergie avec d'autres stimuli oncogènes. Son rôle exact n'est pas clair mais il
semblerait qu'il agisse par le biais de la coopération avec d'autres oncogènes.
(173)
d/ Virus BK (BKV)
Le rôle du virus BK dans la carcinogenèse est contesté de par sa présence
dans une large part de la population et dans des tissus sains, sans présenter
aucune pathogénicité. Cependant des études ont montré qu'il possédait un
potentiel oncogène.
Le BKV est un polyomavirus avec un fort tropisme pour les cellules du rein,
même s'il peut également être rencontré à d'autres sites tels que l'estomac, les
poumons ou les nœuds lymphatiques. Son pouvoir oncogène est principalement
dû à deux protéines : l'antigène grand T (Tag) et l'antigène petit t (tag). Tag peut
se lier et inactiver les protéines p53 et Rb, de la même manière que les protéines
E6 et E7 du virus HPV. Tag est également responsable d'instabilité génomique se
traduisant par de nombreuses altérations chromosomiques (gains, délétions,
cassures, etc.). Le rôle de tag serait d'agir en synergie avec Tag.
Tag est capable de transformer des cellules de rongeurs in vitro, et coopère
pour cela avec l'oncogène ras. Cet effet n'était pas aussi marqué dans les cellules
humaines, ce qui n'est pas surprenant puisque la transformation des cellules
humaines est moins efficace que celle des rongeurs. Enfin, des souris
transgéniques exprimant Tag développent des carcinomes hépatocellulaires, des
tumeurs du rein et des maladies lymphoprolifératives.
Ceci étant, l'étude de tumeurs humaines montre une prévalence très
variable du BKV, même entre tumeurs de même type. De plus, la charge virale est
112
très faible, estimée à moins d'un virus par cellule, avec une forte hétérogénéité à
l'échelle cellulaire au sein d'une tumeur positive au BKV, certaines cellules n'étant
pas porteuses du virus. L'hypothèse proposée est que le virus initie l'instabilité
génomique et les changements dans l'expression des oncogènes qui s'en suivent
mais qu'ensuite le virus n'est plus requis. De plus, une activité paracrine a été
proposée permettant à une cellule infectée d'entrainer des changements dans les
cellules voisines. (176)
e/ Virus de leucémie à lymphocytes T humain (HTLV)
Contrairement aux virus présentés jusqu'à lors, le virus HTLV-1est un
rétrovirus, c'est à dire que c'est un virus à ARN qui, au cours de l'infection, subit
une transcription inverse puis une insertion dans le génome de l'hôte.
Il a la strusture classique des autres rétrovirus à savoir qu'il contient les
gènes gag, pol et env, bordés par les séquences LTRs (long terminal repeats). De
plus, il contient le gène Tax qui joue un rôle important dans la régulation dans la
régulation de la transcription, la réplication et la prolifération du virus dans les
cellules infectées. Tax agit au travers de l'interaction avec les protéines CREB
(cAMP responsive element binding-protein), SRF, NF-κB et AP-1 qui induit des
cytokines et des gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-xL et survivine. Tax interfère
également avec l'action de p53 et p16, inhibant ainsi l'apoptose et induisant une
instabilité génomique. Le mécanisme d'action n'est pas très clair mais pourrait
faire intervenir dans certains cas p300/CBP ou NF-κB. La protéine Tax possède
également des motifs de liaison aux domaines PDZ (cf. E6 et HPV). L'importance
de ces motifs est soulignée par l'absence de propriétés oncogènes de Tax chez le
virus HTLV-II, qui ne diffère de Tax chez HTLV-I que par l'absence de ces
domaines.
Le mécanisme de l'infection par HTLV-I est mal connu mais il semblerait
que les virions soient transmis par contacts cellule-cellule. Suite à l'entrée dans la
cellule hôte, le génome viral s'intègre de façon aléatoire dans le génome de l'hôte
et la protéine Tax induit la prolifération des cellules infectées. Ensuite, l'expression
de Tax doit être régulée à la baisse car il semblerait que les cellules exprimant
Tax constituent des cibles pour les lymphocytes T cytotoxiques. Plusieurs
113
mécanismes ont été proposés pour expliquer la suppression de l'expression de
Tax dont l'hyperméthylation de la région 5'-LTR ou l'inactivation par mutation. De
plus, les protéines virales p30, Rex et HBZ suppriment également l'expression de
Tax.
La période de latence entre l'infection et le développement de cancers est
souvent de quelques décennies, ce qui suggère que l'accumulation de mutations
est nécessaire à ce processus. (173, 177)
f/ Virus de tumeur mammaire murin (MMTV)
Ce virus infecte et cause des cancers chez les souris. Il est particulièrement
important pour nous dans la mesure ùo il nous a permis de développer notre
modèle d'étude : la souris PyVT-MMTV (cf. partie III).
L'isolation et l'identification du virus MMTV ainsi que la preuve de son
implication dans le développement de tumeurs mammaires sont consécutives au
développement de souris prédisposées aux tumeurs mammaires telles que les
souches C3H ou BR6. Des études ont montré que l'héritabilité n'était pas
Mendélienne mais due à un
« facteur extra-chromosomal » associé au
développement de tumeurs mammaires chez la mère. Par la suite, il a été montré
que le « facteur extra-chromosomal » était en fait un agent infectieux transmis lors
de la lactation.
Le virus induit la carcinogenèse au travers de son intégration qui conduit à
l'activation de gènes cellulaires sous la régulation des LTRs du MMTV qui
agissent comme des promoteurs/activateurs. Il semblerait que le virus présente
une certaine spécificité d'intégration conduisant à l'activation d'un nombre limité de
gènes. Parmi ces gènes activés par le MMTV on trouve les membres de la famille
wnt, les gènes du récepteur Notch ou encore les gènes de la famille FGF. Dans le
cas du récepteur Notch, une version tronquée du récepteur est produite le rendant
constitutivement actif. Il a été montré que toutes les souris exprimant ces
oncogènes sous la régulation des LTRs du virus développaient des tumeurs
mammaires. (178)
Pendant longtemps, ce virus était considéré n'infecter que les souris ;
cependant, des études récentes ont montré que certains cancers du sein humains
114
étaient porteurs de séquences homologues à celle du gène env du MMTV. Par la
suite des séquences correspondant à l'ensemble du génome du MMTV ont été
trouvées dans les cellules de cancer du sein alors qu'elles étaient absentes des
cellules saines des individus infectés. (179)
115
116
Deuxième partie
Développement et
activité des quinoléines
substituées
117
118
I/ Synthèse et activité anti-cancer du sein des quinoléines
substituées
Traduit de l'anglais : Shi et al. (180)
Résumé
Des agents anti-cancer du sein prometteurs dérivés de quinoléines
substituées ont été découverts. Les quinoléines ont été facilement synthétisées à
grande échelle à partir d'une séquence de réactions à partir de 4acétamidoanisole. Le produit d'addition de Michael a été isolé sous la forme du
produit intermédiaire de réaction dans la réaction de fermeture de cycle du 4amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole avec la méthylvinylcétone
menant à la 6-méthoxy-4-méthyl-8-nitro-5-(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoléine
(14)
la
fonction
amine
de
la
8-amino-6-méthoxy-4-méthyl-5-(3-
trifluoromethylphenyloxy) quinoléine, préparée à partir de 14, a été reliée à
différentes chaînes latérales par alkylation avec de la N-(3-iodopropyl) phtalimide,
Michael addition avec de l'acrylonitrile et une amination réductrice avec divers
carboxaldéhydes hétérocycliques, tels que l'imidazole-4-carboxaldéhyde, le
thiophène-2-carboxaldéhyde et le 2-furaldéhyde. Les effets des quinoléines
substituées sur la viabilité cellulaire de cellules de cancer du sein T47D en utilisant
un dosage d'exclusion au bleu trypan ont été examinés. Les résultats ont montré
que la valeur de la CI50 de la 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle) amino]-4-méthyl-5(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoléine est de 16 ± 3 nM, CI50 la plus faible parmi
toutes les quinoléines testées. Les valeurs de CI50 de trois autres quinoléines
sont dans la gamme nanomolaire, une plage souhaitable pour les tests
pharmacologiques.
Les quinoléines sont connues pour leur actvité anti malaria (181 – 183),
leishmanicide (184), antibactérienne (185), et anticancéreuse (186 – 189).
Récemment, les quinoléines ont été examinées dans l'inhibition des cassettes de
transport de médicaments se liant à l'ATP (186), le ciblage de l'hypoxie tumorale
(187), la modulation de la polyrésistance aux médicaments (8) et l'inhibition de la
119
tyrosine kinase (189). Sur la base des résultats de ces études, nous avons étudié
les quinoléines substituées à la recherche de nouveaux composés anti-cancer du
sein. Après notre criblage initial anticancéreux, nous nous sommes concentrés sur
les quinoléines substituées avec une structure présentant un squelette dérivé de
la 8-amino-5-(aryloxy)-6-méthoxy-4-methylquinoléine (181) par une dérivatisation
de sa chaîne latérale amino en C8. Nous rapportons ici la synthèse de nouvelles
quinoléines possédant des fonctions amines, nitriles, imidates, amidines et
hétérocycliques sur la chaîne latérale amino en C8, ainsi qu'une activité anticancer du sein puissante contre des cellules de cancer du sein T47D. Les
quinoléines substituées de synthèse sont résumés en figure 21.
Fig. 21 : Structure et formules
des quinoléines substituées.
Nous avons utilisé
une
méthode
synthèse
de
similaire
menant à 5-(aryloxy)-4methylprimaquine
(181,
190) en commençant par
le 4-acétamidoanisole (8)
par l'intermédiaire d'une
fonctionnalisation séquentielle C2 et C5 suivie par une réaction de fermeture de
cycle. Par conséquent, le 2-bromo-4-acétamido-5-nitroanisole (10) (190) a été
préparé à partir de la bromation du composé 8 en C2, suivie par une nitration en
C5. Le déplacement du bromure 6 avec du potassium 3-trifluoromethylphenoxide
(11) dans du N, N-diméthylformamide (DMF) à 120 ° C a donné le composé 4acétamido-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (12). L'élimination du
groupe protecteur acétyle du composé 12 avec de l'acide chlorhydrique dans de
l'éthanol a donné le 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (13)
(Fig. 22).
120
Fig. 22 : Préparation du 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (compose 13).
Différentes conditions de réaction ont été étudiées afin de maximiser le
rendement de la construction de l'anneau de la quinoléine à partir du composé 13
avec de la méthyl-vinyl-cétone (182). Le traitement du composé 13 avec la méthylvinyl-cétone, de l’arsenic et de l'acide phosphorique a 85 % à 100°C après 20 min
(188) permet d'obtenir un mélange de la quinoléine désirée 14, du produit
d'addition 1,4 15 et du composé de départ 13 dans un rapport 1:2:1. Lorsque la
réaction a été effectuée à 120°C pendant 20 min, un rapport de 7:1:1 des
composés 14:15:13 a été atteint (Fig. 23). Les produits bruts ont été séparés par
Chromatographie sur colonne de gel de silice avec un rendement de 52% du
composé 14, un rendement de 7% du composé 15, et 7 % de récupération du
composé 13. Un temps plus long de réaction a résulté en la décomposition des
produits sans que les rendements ne soient améliorés. L'utilisation d'un excès de
méthyl-vinyl-cétone n'a pas amélioré le rendement non plus. Le produit d'addition
1,4, 15, peut être traité avec de l'acide d'arsenic et de l'acide phosphorique dans
des conditions de réaction similaires à celle mentionnées ci-dessus pour donner la
quinoléine 14 et de l'amine 13 avec du composé de départ 15 dans un rapport
7:1:1. Par conséquent, l'utilisation d'un large excès d'acide d’arsenic et d'acide
phosphorique à 85 % peut minimiser la formation de l'intermédiaire 15. Les
résultats suggèrent que le produit d'addition 15 est le produit intermédiaire de
réaction conduisant à la quinoléine 14 mais il a également subi une addition de
121
Michael inversée pour fournir l'amine 13 et de la méthyl-vinyl-cétone. Comme les
alkynones conjuguées ont été utilisées dans la synthèse de quinoléines à partir
d'amines aromatiques (184, 191), l'amine 13 a été traitée avec de la 3-butyn-2-one
et de l’acide d'arsenic et de l’acide phosphorique à 100°C. Le produit désiré 14 a
été isolé avec un rendement de 24% associé à la récupération du composé de
départ 13 à hauteur de 28%. Le produit d'addition 1,4 n'a pas été détecté et divers
oligomères non identifiables ont été obtenus. Il est possible que le rendement
inférieur contribue à la facilité de polymérisation de l'alkynone terminale ou la
décomposition du produit d'addition intermédiaire 1,4.
Fig. 23 : Préparation de la quinoléine 14.
La quinoléine 14 a été convertie en composé 16 (182), qui sert de
précurseur pour produire diverses quinoléines substituées représentées en figure
24. Par conséquent, la réduction de la fonction nitro du composé 14 avec de la
poudre de fer dans de l'acide acétique-eau au reflux a donné un rendement de
96% de l'amino-quinoléine 16 (Fig. 24). L'alkylation de 16 avec de l'iodure 17
(192) et du bicarbonate de sodium dans du DMF a produit le composé 18 qui, par
traitement avec de l'hydrazine dans de l'éthanol au reflux a permis d'obtenir la
quinoléine 1.
122
Fig. 24 : Synthèse des quinoléines substituées 1 à 4
Les quinoléines 2-4 ont été synthétisées par l'intermédiaire d'une réaction
d'addition de Michael d'arylamine 16 avec de l'acrylonitrile dans du phenol (193) à
100°C dans un tube scellé et ont donné le produit d'addition 2 (rendement de
61%). Aucune réaction n'a été trouvée lorsque le composé 16 a été traité avec de
l'acrylonitrile dans de l'éthanol au reflux (194). L'éthanolyse de la quinoléine 2
avec de l'HCl (gaz) dans de l'éthanol (195) a produit de l’éthyle imidate 3, qui, par
traitement avec NH3 (gaz) dans de l'éthanol (196) à 50°C pendant 6h a permis
d'obtenir l'amidine 4 (rendement de 57%) avec 13% de composé initial 3 récupéré.
Les quinoléines 5-7 ont été synthétisées par un amination réductrice de
l'amine 16 et d'aldéhydes (Fig. 25). Le traitement de l'amine 16 avec l'aldéhyde 19
dans du méthanol - acide acétique suivi par du cyanoborohydride de sodium (197)
a fourni la quinoléine 5. Un traitement similaire de l'amine 16 avec les aldéhydes
20 et 21 séparément a permis d'obtenir les quinoléines 6 et 7, respectivement.
L'aldéhyde 19 a été préparée à partir de l'oxydation de 4-hydroxyméthylimidazole
avec du dioxyde de manganèse dans du méthanol (rendement 99%) (198).
123
Fig. 25 : Synthèse des quinoléines substituées 5, 6 et 7.
Les effets des quinoléines 1-7 sur la viabilité cellulaire des cellules de
cancer du sein T47D en utilisant un dosage d'exclusion au bleu trypan ont été
examinés. Le test d'exclusion au bleu trypan fournit un moyen rapide et efficace
pour le criblage de multiples médicaments (199). Les essais pour chaque
composé ont été réalisés en triple exemplaire et les significations statistiques sont
affichées avec les valeurs de CI50 dans le tableau 1. Les résultats ont montré que
la valeur de CI50 de la quinoléine 7 est de 16 ± 3 nM, la CI50 la plus basse de
toutes les quinoléines testées. La faible inhibition de la quinoléine 6 pourrait être
due à l'oxydation du soufre du groupement thiophène lors de l'incubation de 2
jours avec les cellules de cancer du sein T47D. Les valeurs de CI50 des
quinoléines 1, 2 et 4 sont dans la gamme nanomolaire, une plage souhaitable
pour les tests pharmacologiques. Le composé 16 (200) n'a pas inhibé la viabilité
des cellules T47D, même à une concentration de 10 µM.
En conclusion, différentes quinoléines substituées ont été synthétisées à
partir d'une addition de Michael en tandem suivie de réactions de substitutions
aromatiques électrophiles de l'aniline substituée avec de la vinyle-méthyle-cétone,
réduction de la fonction nitro et alkylation de la fraction amine résultante. La
séquence de synthèse est courte et se prête à une synthèse à grande échelle.
Plusieurs de ces composés possèdent une activité anticancéreuse puissante
contre les cellules de cancer du sein T47D avec des concentrations de l'ordre du
nanomolaire. En particulier, la quinoléine 7 a montré une valeur CI50 de 16 ± 3 nM
et est digne de nouvelles études pharmacologiques. L'absence de centre
124
asymétrique dans ces molécules prévient la synthèse chirale et la purification
d'énantiomères pour bioévaluation. Des variants des substituants de ces
composés majeurs ainsi que le mécanisme d'action de leur activité anticancéreuse
sont à l'étude et seront communiqués en temps voulu.
Données supplémentaires
Procédé de synthèse, données d'analyse, lignée cellulaire et culture cellulaire et
protocoles de test de viabilité cellulaire. Les données complémentaires associées
à
cet
article
peuvent
être
trouvées
doi:10.1016/j.bmcl.2008.04.024.
125
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en
ligne,
à
126
II/ Bioactivité et cibles moléculaires de nouvelles quinoléines
substituées dans des lignées de cellules tumorales murines et
humaines in vitro
Traduit de l'anglais Perchellet et al. (201)
A/ Résumé
Les quinoléines substituées (PQ), qui réduisent la formation de colonies et
augmentent la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP, ont été
testées pour leur capacité à interagir avec différentes cibles moléculaires dans des
lignées cellulaires tumorales murines et humaines in vitro. Différents marqueurs
des voies de signalisation du métabolisme des cellules tumorales : la
fragmentation de l'ADN, la perturbation de la mitose, l'induction de l'apoptose et
les récepteurs de facteurs de croissance ont été testés in vitro pour évaluer la
cytotoxicité du médicament. Sur la base de son aptitude à inhiber l'activité
métabolique des cultures en suspension de cellules leucémiques L1210 aux jours
2 et 4, in vitro, les PQ1 avec sel d'acide succinique sont l'agent anti-prolifératif le
plus efficace parmi les analogues des quinoléines synthétiques testés. En outre,
l'activité antiproliférative des PQ1 est efficace dans toute une gamme de cultures
monocouches : cellules pancreatiques PAN02, cellules epidermoides A-431 et
cellules tumorales mammaires SK-BR-3 et BT-474. Les PQ1 bloquent également
l'expression de la proteine Ki- 67, un marqueur de la prolifération des cellules
tumorales. Un traitement de 1,5 à 3h avec PQ1 est suffisant pour inhiber
l’incorporation de [3H]-thymidine dans l'ADN, de [3H]-uridine dans l'ARN et de
[3H]-leucine dans les protéines utilisées pour évaluer les taux de synthèse de
macromolécules sur une période de 0,5 ou 1h de marquage pulse dans les
cellules tumorales L1210. Un pré-traitement de 15 min avec les PQ1 inhibe le
transport cellulaire à la fois des nucleosides purines et pyrimidines, sur une
période de 30 sec, in vitro, ce qui suggère que les PQ1 peuvent empêcher
l'incorporation de [3H]-adénosine et de [3H]-thymidine dans l'ADN, car elles
bloquent rapidement l'absorption de ces nucléosides par les cellules tumorales.
127
Dans la mesure où les PQ1 ne réduisent pas la fluorescence du complexe de
bromure d'éthidium - ADN, elles ne se lient pas ou ne destabilisent pas
directement l'ADN double brin. Sur une période de 6 à 48h, les PQ1 ont très peu
d'effets sur l'indice mitotique des cellules L1210 mais stimulent la formation de
nombreuses cellules binucléées et quelques micronoyaux, ce qui suggère que ce
composé pourrait augmenter les anomalies mitotiques, entraîner des altérations
chromosomiques ou une mauvaise ségrégation et bloquer la cytocinèse. Le fait
que les PQ1 induisent l'activité des caspases initiatrices (caspases 2) et
effectrices (caspases 3) et le clivage de la polymérase poly (ADP-ribose)-1 en 1 à
4h et la fragmentation de l'ADN internucléosomale dans les 24 h dans des cellules
L1210, suggère que ce médicament antitumoral peut déclencher les événements
précoces et tardifs nécessaires pour que les cellules subissent l'apoptose.
L'immuno-détection et l'analyse Western blot sur cellules entières montrent que,
contrairement à la 17-(allylamino)-17-déméthoxygeldanamycine et au radicicol, les
PQ1 ne parviennent pas à diminuer le niveau d'expression à 24h et
l'autophosphorylation à 3h de la protéine membranaire HER1 dans les cellules A431 et de la protéine HER2 dans les cellules SK-BR-3, ce qui suggère que ce
composé anti-tumoral est peu susceptible d'interagir avec et d'inhiber les voies de
signalisation de la protéine Hsp90 et du récepteur du facteur de croissance
épidermique (EGF). En conclusion, l'activité antiproliférative des PQ1 est efficace
contre un spectre de cellules tumorales et pourrait interagir avec diverses cibles
membranaires et nucléaires pour renforcer les jonctions communicantes, inhiber le
transport de nucléosides et bloquer la cytokinèse mais ne semble pas perturber
les voies de signalisation médiées par les récepteurs du EGF pour induire un arrêt
de croissance et l'apoptose.
B/ Introduction
Une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQ) a récemment été
rapportée
induire
une
activité
anticancéreuse
intéressante
concernant
l'amélioration de la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP
(GJIC) dans les cellules du cancer du sein (180, 202). La GJIC, qui est
128
responsable de la circulation directe des ions et des molécules dont le poids
moléculaire est inférieur à 1200 Da, est obtenue grâce à deux hemicanaux sur la
surface de cellules opposées (203, 204). L'utilisation du logiciel Autodock, a
permis d'observer plusieurs PQs synthétiques capables de se lier au centre inerte
de l'hemicanal des jonctions GAP, qui est formé par l'association de six protéines
de la famille des connexines. Comme la GJIC est régulée à la baisse par les
oncogènes et régulée à la hausse par les gènes tumeur-suppresseurs (TSGs) et
l'inhibition de la GJIC contribue à la carcinogenèse, la restauration de la GJIC
peut représenter une cible pour des médicaments anticancéreux (205-209). Etant
donné que la GJIC des cellules tumorales est réduite ou modifiée (210), les PQ
synthétiques ont été testées pour leur capacité à améliorer la GJIC et inhiber la
croissance des cellules tumorales. Les PQs, qui ont une affinité de liaison
relativement élevée pour la connexine 43 (Cx43) et peuvent diminuer sa
phosphorylation, ont démontré, par un essai de transfert de colorant, augmenter la
GJIC dans les cellules tumorales mammaires T47D mais pas dans les cellules
épithéliales mammaires normales (202). En outre, ces PQ ont réduit de façon
significative la capacité des cellules de cancer du sein humain T47D à se
développer et former des colonies sur gélose molle in vitro et à développer des
tumeurs lors de xénogreffes chez la souris nude in vivo (202). Étant donné que
des composés anti-tumoraux qui augmentent l'activité GJIC sont rares, la présente
étude a été effectuée pour caractériser davantage l'activité biologique et les cibles
moléculaires des PQ synthétiques dans un spectre de lignées cellulaires
tumorales murines et humaines in vitro. Par exemple, il était intéressant de
déterminer si les composés antitumoraux PQ, qui interagissent avec les jonctions
GAP de la surface cellulaire et inhibent la croissance des cellules tumorales,
pourraient agir comme inhibiteurs d'autres protéines ancrées dans la membrane,
telles que des membres de la famille des récepteurs des facteurs de croissance
épidermique humains (EGF) (HER) qui interviennent dans les voies de
signalisation intracellulaires critiques pour la prolifération des cellules tumorales et
l'angiogenèse. Ainsi, dans une tentative d'identifier le composé le plus puissant de
la série, plusieurs structures PQ ont été synthétisées et comparées avec les
médicaments anticancéreux connus pour leur capacité à inhiber la prolifération de
différentes cellules tumorales, y compris celles qui surexpriment les HER1 (ligand129
dépendants) et les HER2 (ligand-indépendants) et qui sont sensibles à la protéine
de choc thermique de 90 kDa (Hsp90) et les inhibiteurs des HER : 17-(allylamino)17-déméthoxygeldanamycine (17-AAG) et radicicol. Etant donné que la fraction de
cellules tumorales Ki-67 positives est souvent en corrélation avec l'évolution
clinique du cancer, il est également intéressant de déterminer si le traitement aux
PQ inhiberait l'expression de la protéine nucléaire humaine Ki-67, qui est un
excellent marqueur de la prolifération cellulaire tumorale (211).
C/ Matériels et méthodes
i/ Traitement médicamenteux, culture cellulaire et essai de prolifération
Comme indiqué précédemment, les analogues PQ ont été synthétisés par
une modification de la procédure en partant du 4-acétamino-anisole (180, 182,
190). Les solutions de PQ synthétiques et les médicaments anticancéreux connus,
daunorubicine (DAU), mitoxantrone (Mitox), vincristine (VCR), taxol, 17-AAG et
radicicol (tous de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ont été dissous et dilués en
série dans du diméthylsulfoxyde. Les cultures en suspension de cellules murines
de leucémie lymphocytaires L1210 (ATCC, Manassas, Virginie, Etats-Unis) et les
cultures monocouches de cellules d'adéncarcinome canalaire pancréatique
PAN02 (banque de tumeurs DCTD, NCI, USA), de carcinome canalaire mammaire
humain
T-47D,
de
carcinome
épidermoïde
surexprimant
HER1
A-431,
d'adénocarcinome du sein surexprimant HER2 SK-BR- 3 et les cellules de
carcinome canalaire du sein BT-474 (tous de l'ATCC) ont été incubées à 37°C
dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 et maintenues en
croissance exponentielle continue par passages deux fois par semaines dans un
milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum foetal bovin de veau (FCS ;
Atlanta Biologicals, Norcross, GA, USA), de la pénicilline (100 UI/mL) et de la
streptomycine (100 pg / mL). Les suspensions cellulaires de leucémie L1210 ont
été cultivées en triple dans 48 puits de plaques de culture cellulaire Costar
pendant 2 et 4 jours en présence ou en absence (contrôle) de différentes
concentrations de médicaments pour évaluer leur activité anti-proliférative. Les
130
cellules tumorales adhérentes PAN02, A-431, SK-BR-3 et BT-474 ont été
recueillies par traitement à la trypsine, remises en suspension dans du FCS frais,
milieu contenant du RPMI-1640, transférées dans 48 puits de plaques de culture
cellulaire Costar et laissées se fixer pendant 24 h avant d'être incubées pendant 2
à 4 jours supplémentaires en présence ou en absence (contrôle) des
médicaments ci-dessus. Etant donné que les composés ont été ajoutés au milieu
de culture par aliquots de 1 uL, la concentration de véhicule dans le volume
d'incubation final (0,5 mL) n'a jamais dépassé 0,2 % et n'a pas interféré avec les
données. Des concentrations cellulaires décroissantes, telles que 55 000 et 4688
cellules L1210 / 0.5 mL, 7500 et 1875 cellules PAN02 / 0,5 mL, 7,500 et 1,875
cellules A-431 / 0.5 mL, 15 000 et 5 000 cellules SK-BR-3 / 0.5 mL ou 15 625 et
7812 cellules BT-474 / 0,5 mL / puits, ont été mises en culture sur plaque en trois
exemplaires au temps 0 afin de prélever des échantillons contrôles avec des
densités cellulaires approximativement égales, après 2 et 4 jours de culture,
respectivement. La prolifération des cellules tumorales traitées par le médicament
a été évaluée par leur capacité mitochondrial à réduire le réactif 3-(4,5diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium
(MTS) (Promega, Madison, WI, USA) en présence de méthosulfate de phénazine
(PMS, Sigma) en un produit formazan soluble dans l'eau qui absorbe à 490 nm
(212). Au bout de 2 ou 4 jours de culture, les cellules L1210, PAN02, A-431, SKBR-3 et BT-474 contrôles et traitées par le médicament ont été encore incubées à
37 ° C pendant 1,5 à 3,0 h dans l'obscurité, en présence de 0,1 mL des réactifs
MTS et PMS (ratio 2 : 0,1) et leur activité métabolique relative a été estimée par
l'enregistrement de l' absorbance à 490 nm, en utilisant un lecteur de
microplaques Cambridge modèle 750 automatique (Packard, Downers Grove, IL,
USA). Les valeurs à blanc pour un milieu de culture supplémenté avec les réactifs
MTS : PMS en l'absence de cellules ont été soustraites des résultats. Les
données de toutes les expériences biochimiques ont été analysées en utilisant le
test t de Student avec le niveau de signification fixé à p <0,05.
131
ii/ Immunofluorescence et microscopie confocale
Pour l'expression de la protéine Ki-67, les cellules T-47D ont été cultivées
sur des lamelles dans des plaques à 6 puits dans du milieu RPMI et mises à
incuber à 37°C pendant 24, 48 et 72h en présence ou en absence (contrôle) du
composé PQ. Après fixation avec du paraformaldehyde à 2% pendant 20 min
suivie d'une neutralisation avec 50 mM de glycine pendant 5 min, les cellules ont
été lysées avec 0,1% de Triton X-100 pendant 10 min de plus. Les cellules ont été
lavées avec un tampon phosphate saline (PBS) sans Ca2 + / Mg2 + Dulbecco,
bloquées avec 2,5 % d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant 2h
et ensuite incubées avec un anticorps polyclonal primaire (PAB) de lapin anti- Ki67 (H300) (1:250 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) pendant 15h
à 4°C. Après incubation pendant une minute avec du 4', 6'-diamidino-2phénylindole (DAPI), un colorant de l'ADN bleu fluorescent, les cellules ont ensuite
été incubées avec un anticorps (Ab) secondaire de lapin conjugué avec un
colorant Alexa Fluor 488 (Ab) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) pendant 4h à
4°C. Les échantillons ont été scellés et analysés par microscopie à fluorescence
pour la morphologie nucléaire (coloration DAPI) et l'expression du Ki-67 (immunomarquage), en utilisant un microscope confocal Zeiss LSM 510 META (Carl Zeiss,
Thornwood, NY, USA) équipé de micro-manipulateurs (Narishige international,
East Meadow, NY, USA).
iii/ Synthèse de macromolécules et transport de nucléosides
Pour estimer la vitesse de synthèse de l'ADN, les cellules L1210 ont été
remises en suspension dans un milieu contenant du FCS-RPM-1640 frais à une
densité de 0.5x105 cells/0.5 mL, incubées à 37°C pendant 90 min en présence ou
en absence (témoin) de médicaments et marquées par pulses pour 30 minutes
supplémentaires avec 1 uCi de [méthyl-3H]-thymidine (52 Ci / mmol ; GE
Healthcare - Amersham, Piscataway, NJ, USA) (213). Pour les synthèses d'ARN
et de protéines, les cellules ont été incubées à 37°C pendant 3h en présence ou
en absence de médicaments et ensuite marquées par pulses pendant une heure
supplémentaire avec 2 uCi de [5,6-3H]-uridine (35 Ci / mmol ; Perkin -Elmer,
132
Boston, MA, USA) ou 2,5 uCi de L-[3,4,5-3H]-leucine (115 Ci / mmol ; Perkin Elmer), respectivement (213). Les incubations ont été terminées par l'addition de
0,5 mL d'acide trichloroacétique à 10 % (TCA). Après avoir été maintenu sur de la
glace pendant 15 minutes, la matière insoluble en milieu acide a été récupérée sur
filtres en microfibres de verre Whatman GF/A et lavée trois fois avec 2 mL de TCA
à 5% et deux fois avec 2 mL d’EtOH à 100%. Après séchage des filtres, la
radioactivité liée à la matière précipitable à l'acide a été déterminée par comptage
en scintillation liquide (LSC) dans 6 mL de Bio-Safe NA (Research Products
International, Mount Prospect, IL, USA) (213). Pour le transport de nucléosides,
les cellules L1210 (1,2 x 106 cellules / mL) ont été pré-incubées pendant 15 min à
37°C en présence ou en absence (témoin) de médicament et ensuite exposées à
1 uCi de [2,8-3H]-adénosine (25 Ci / mmol ; Moravek biochimiques, Brea, CA,
USA) ou [méthyl-3H]-thymidine pendant seulement 30 secondes pour évaluer
l'absorption cellulaire de purines et de pyrimidines, respectivement, sur cette
période de temps très courte (213, 214). Les réactions ont été diluées avec 2 mL
de PBS glacé et le radio-marqueur non incorporé a été éliminé par centrifugation à
200 g pendant 10 min. Après avoir été lavés trois fois avec 2 mL de PBS glacé,
les culots de cellules intactes ont été récoltés par centrifugation et mis à incuber
pendant 30 min dans 1 mL de tampon de lyse hypotonique (HLB) contenant 10
mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM d'EDTA et 0,2 % de Triton X-100. Les lysats
cellulaires ont été mélangés avec 6 mL de Bio-Safe II (Research Products
International) pour estimer l'absorption cellulaire de [3H]-adénosine ou de [3H]thymidine par les LSC. L'inhibition exercée par le médicament a été exprimée en
pourcentage de [3H]-adénosine ou [3H]-thymidine transporté dans les cellules
tumorales traitées avec le contrôle, sur une période similaire de 30 secondes (213,
214).
iv/ Liaison à l'ADN et tests de fragmentation
Un dosage de déplacement de bromure d'éthidium (EB) a été utilisé pour
évaluer la puissance d'éventuelles liaisons à l'ADN des composés PQ, sur la base
des concentrations CI50 de médicament qui provoque une réduction de 50% de la
fluorescence du complexe ADN-EB à une excitation de 525 nm / émission de 600
133
nm (215). La fluorescence de l'EB, qui est extrêmement faible lorsque non lié
dans l'eau, est stimulée 25 fois après fixation et intercalation dans le milieu
hydrophobe que constitue l'ADN double brin intact. Comme un complexe
hautement fluorescent est formé en quelques millisecondes entre l'ADN et EB,
tout médicament se liant directement à et/ou endommageant l'ADN perturberait
l'intercalation de l'EB et de compromettrait la fluorescence de ce complexe ADN EB. Les mélanges réactionnels (200 uL) contenant des concentrations finales de
20 µg/mL de d'ADN de thymus de veau (CT) (Sigma) et 1 µg/mL d'EB (Sigma)
dans un tampon de Tris-HCl à 5 mM, pH 7,6, avec 0,5 mM d'EDTA, ont été
pipetés dans 96 puits de plaques en polystyrène blanches opaques Costar et,
après incubation en présence ou en absence (témoin) de médicaments pendant
30 min à température ambiante, la fluorescence du complexe EB - ADN a été
détectée à une excitation de 525 nm et une émission de 600 nm, en utilisant un
spectrophotomètre à fluorescence Cary Eclipse équipé avec un lecteur de
microplaques (Varian, Walnut Creek, CA, USA).
Le clivage de l'ADN induit par le médicament a été déterminé par la
précipitation de chromatine intacte, en utilisant des cellules L1210 pré-marquées
avec 1 uCi de [3H]-thymidine pendant 2h à 37°C, lavées avec 3 x 1 mL de PBS
glacé, recueillies par centrifugation, remises en suspension dans du milieu frais à
une densité de 1.2x106 cellules/mL, puis incubées à 37°C pendant 24h en
présence ou en absence de drogues (214, 216). Après centrifugation à 200g
pendant 10 min pour éliminer les médicaments et laver les cellules, les culots de
cellules ont été lysés pendant 20 min dans 0,5 mL de HLB glacé, et centrifugés à
12 000 g pendant 15 min pour recueillir les surnageants. La radioactivité dans les
surnageants (fragments d'ADN de faibles poids moléculaires soluble dans le
détergent) et les culots (chromatine intacte) a été déterminée par LSC. Avant
d'être comptée dans 6 mL de Bio-Safe NA, la chromatine intacte dans les culots a
été incubée pendant 2h à 60°C en présence de 0,6 mL de solubilisant tissulaire
NCS (Amersham) (214, 216). Pour la fragmentation de l'ADN internucléosomale,
les cellules L1210 ont été incubées à 37°C pendant 24h en présence ou en
absence de médicaments et l'ADN a été extrait à partir d'échantillons avec des
densités cellulaires égales (2x106 cellules/mL), en utilisant un procédé de
relargage (214, 216). Les culots cellulaires ont été lavés deux fois avec du PBS,
134
lysés pendant une nuit à 37°C dans 0,34 mL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0,
contenant 2 mM d'EDTA, 400 mM de NaCl, 1 % de SDS et de la protéinase K (0,5
mg/mL), vortéxés pendant 15 secondes avec 0,1 mL de NaCl 6 M et centrifugés
(2500g x 30 min) ; et l'ADN a été précipité à partir des surnageants (0,44 mL) avec
0,88 mL de EtOH à 100% pendant 15 min à 4°C. Après centrifugation (14000g x
15 min) à 4°C, les culots d'ADN séchés à l'air libre ont été dissous dans 0,34 mL
de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, avec EDTA 1 mM (tampon TE) et incubés pendant 2h
à 37°C en présence de RNase (0,1 mg/mL). Après un autre cycle de précipitation
par EtOH et centrifugation, les culots séchés à l'air libre finaux ont été dissous
dans 50 uL de tampon TE et leur concentration en ADN déterminée par
spectrophotométrie à 260 nm. Des quantités égales d'échantillons d'ADN (6 μg /
7.5 µL de tampon TE) ont été mélangées avec 1,5 uL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
contenant 50 mM d'EDTA, 10% de Ficoll 400 et 0,4 % d'Orange G et pipetées
dans chaque puits. Environ 0,5 ug de marqueur moléculaire ADN 100 pb et 0,75
ug d'ADN / EcoRI + HindIII (tous deux de Promega) a été appliqué de la même
façon à chaque gel pour fournir des marqueurs dans la gamme 100-1500 et 12521226 pb, respectivement. L'électrophorèse horizontale des échantillons d'ADN a
été effectuée pendant 3,7 heures à 60 V sur gels d'agarose à 1,5% contenant EB
(1 µg/mL) avec 90 mM de Tris-HCl, pH 8,0, contenant 90 mM d'acide borique et 2
mM d'EDTA comme tampon de migration. Les fragments d'ADN ont été visualisés
et photographiés avec un film Polaroid 667 sous lumière UV à 312 nm, en utilisant
un transilluminateur UV à intensité variable modèle 88A de FisherBiotech (214,
216).
v/ Index mitotique et anomalies
Pour déterminer l'index mitotique, les cellules L1210 (0,5 x 10 6 / 0,5 mL de
milieu RPM-1640 contenant du FCS) ont été incubées en triple pour diverses
périodes de temps à 37°C en présence ou en absence (contrôle) de
concentrations croissantes du médicament expérimental ou d'agents perturbateurs
des microtubules connus, collectées par centrifugation (200g x 10 min) et remises
en suspension dans 1 mL de KCl hypotonique 75 mM pendant 20 min à 4°C.
Après fixation dans 1 mL de MeOH : acide acétique (ratio 3:1), les culots
135
cellulaires finaux ont été recueillis par centrifugation, remis en suspension dans 75
ul de MeOH : acide acétique (3:1), distribués sur des lames de verre, séchés à l'air
à l'air libre, colorés par étalement de 40 uL de cristal violet à 0,1% et couverts par
une lamelle (213). Les figures de mitose avec chromosomes condensés ont été
identifiées au microscope et les critères publiés ont été suivis pour marquer les
cellules binucléées et micronoyaux (217). Les cellules binucléées bloquées en
cytokinèse contenaient soit deux noyaux distincts de taille égale soit deux noyaux
qui touchaient ou chevauchaient des limites nucléaires distinctes ou deux noyaux
reliés par un petit pont nucléoplasmique (217). Des structures circulaires
contenant de la chromatine dans le cytoplasme, au moins 1/3 plus petites que le
noyau principal, entourées par une membrane, soit séparées de, soit chevauchant
légèrement le noyau principal et ayant la même coloration que le noyau principal
ont été considérées comme des micronoyaux contenant soit un chromosome
entier soit un fragment chromosomique acentrique (217). Les fréquences de
cellules binucléées et de micronoyaux ont été utilisés pour estimer la capacité
cytotoxique ou génotoxiques des médicaments (mutagène ou clastogène) pour
bloquer la cytokinèse et induire des lésions chromosomiques ou une mauvaise
ségrégation (217). Le pourcentage de cellules en mitose ou de cellules binucléées
a été déterminé au microscope en comptant un total d'au moins 2000 cellules /
lame et l'indice mitotique ou l'indice de cellules binucléées ont été calculées en
pourcentage de figures de mitose ou de cellules binucléées dans les cultures
traitées / pourcentage de figures mitotiques ou de cellules binucléées dans les
contrôles (213, 217).
vi/ Test Fluorogenic de l'activité des caspases
Les cellules L1210 témoins et traitées avec le médicament (106 cellules /
mL) ont été incubées pendant 1 à 24 h à 37°C, recueillies par centrifugation (10
min à 200 g) et lavées avec 1 mL de PBS glacé. Les culots cellulaires ont été
remis en suspension dans du tampon glacé 10 mM d'HEPES, pH 7,4, contenant
100 mM de NaCl, 100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM d'EGTA,
10 % de saccharose, 1 mM de fluorure de phénylméthyl-sulfonyle (PMSF), 1 mM
de dithiothréitol (DTT) et 100 uM de digitonine (175 u pour le dosage de la
136
caspase-3 et 120 uL pour le dosage de la caspase-2) et ont été lysés pendant 10
min sur de la glace. Les lysats cellulaires ont été centrifugés (14000 g x 20 min) à
4°C pour précipiter les débris cellulaires et les surnageants ont été stockés à 70°C pendant une nuit (214, 216). L'activité des caspases 2 et 3 dans les lysats a
été déterminée dans des mélanges réactionnels contenant 50 uL de tampon de
lyse (Blanc) ou de surnageant (controle ou échantillons traités avec le médicament)
et 50 µl de tampon de réaction (100 mM d'HEPES, pH 7,5, contenant 1 mM
d'EDTA, 10 mM d'EGTA, 10 % de saccharose et 10 mM de DTT) initiés par
l'addition d'aliquots de 5 ul de substrats conjugués à de l'AFC : 5 mM benzyloxycarbonyle (z)-Val-Asp-Val-Ala-Asp (VDVAD)-7-amino-4-trifluorométhylcoumarine
(AFC) ou 1 mM de z-Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-AFC (tous de Calbiochem, La Jolla,
CA, États-Unis) (214, 216). Après incubation pendant 1h à 37°C dans des plaques
en polystyrène blanc opaque à 96 puits Costar, la fluorescence de l'AFC libre
libérée lors du clivage protéolytique du substrat par la caspase appropriée a été
détectée à une excitation de 400 nm et une émission de 505 nm, en utilisant un
spectrophotomètre à fluorescence Cary Eclipse avec lecteur de microplaques. Les
unités arbitraires de fluorescence ont été quantifiés en référence aux courbes
d'étalonnage allant de 0,01 à 6 nmol d'AFC (Sigma) ; les concentrations en
protéines des surnageants ont été déterminées en utilisant le kit BCA Protein
Assay (Pierce, Rockford, IL, USA) et l'activité de clivage VDVAD et DEVD
spécifique des échantillons a été exprimée en nmol d'AFC libéré / mg de protéine
(214, 216).
vii/ Analyse par Western blot du clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase-1
(PARP-1)
Les suspensions de cellules L1210 contrôles et traitées avec le
médicament (1,2 x 106 cellules / mL) ont été incubées pendant 1-20h à 37°C dans
des boîtes de Pétri Falcon 15x60 mm contenant des volumes finaux de 5 mL.
Pour le clivage de la PARP-1, les cellules tumorales (12x106) ont été recueillies
par centrifugation, lavées avec 1 mL de PBS, lysées avec 45 ul de tampon 50 mM
Tris-HCl, pH 6,8 contenant du NaCl 250 mM, du CaCl2 1 mM, du NaF 50 mM,
0,1 % de Triton X-100, de l'urée 6M et des inhibiteurs de protéase (10 µg
137
leupeptine / mL, 8 ug aprotinine / mL, 1 mM PMSF et le cocktail d'inibiteurs de
protéase sans EDTA de Roche Diagnostics Corp (Indianapolis, IN, USA) et
perturbées par sonication avec une micro-pointe conique 12 coups à puissance 4,
en utilisant un processeur à ultrasons portable Vibra 250W (Sonics & Materials,
Danbury, CT, USA) (214, 216, 218). Les lysats cellulaires ont été centrifugés
(14000g x 15 min) et les concentrations en protéines des surnageants
cytosoliques ont été déterminées avec le kit de dosage de protéine BCA. Pour le
clivage de la PARP-1, des aliquotes de surnageants contenant des quantités
égales de protéines (70 µg) ont été incubés avec un tampon contenant du SDS
(concentration finale de 10% de glycerol, 2 % de SDS, 5% de ß -mercaptoéthanol,
0,02 % de bleu de bromophénol) pendant 15 min à 65°C, résolus par
électrophorèse pendant 1 h à 175 V dans un gel de polyacrylamide-SDS 8% et
transférés sur membrane PVDF pendant 90 min (Immobilon- PSQ ; Millipore,
Bedford, MA, USA) en utilisant un modèle HEP 1 Panther Semidry Electroblotter
(Owl Separation Systems, Portsmouth, NH, Etats-Unis) (214, 216, 218). Les
transferts ont été bloqués avec 5% de lait sec non gras dans un tampon 20 mM
Tris-HCl, pH 7,4, avec 0,9 % de NaCl (TBS), contenant 0,05% de Tween-20
(TBST) pendant 90 min à température ambiante. L'immunodétections de PARP-1
ou ß-actine a été effectuée à 4°C pendant une nuit dans du TBST contenant 2%
de lait sec non gras, en utilisant, respectivement : à 0,5 ug / mL d' anticorps de
souris anti-PARP-1 (Ab-2) anticorps monoclonal primaire (mAb) (C-2-10 ;
Calbiochem), qui reconnaît à la fois la protéine PARP-1 native entière de 115 à
116 kDa et son fragment de clivage de 85 à 90 kDa (214, 216, 218), ou anti-ßactine (AC-15) mAb primaire (dilution 1:15000 ; Sigma), qui reconnaît un épitope
situé à l'extrémité N-terminale de l'isoforme ß de l'actine dans une grande variété
de tissus et d'espèces. Après que les membranes ont été rincées trois fois avec
du TBST, elles ont été incubées pendant 1h à température ambiante dans du
TBST contenant 2% de lait sec non gras et un mAb secondaire anti-souris de
chèvre conjugué avec la peroxydase de raifort (dilution 1:30000 ; Oncogene,
Boston, MA, États-Unis) et rincés à nouveau trois fois avec du TBST. Un film
Kodak BioMax a été utilisé pour développer les images des bandes
immunoréactives révélées par coloration par chimioluminescence amplifiée (CL)
en utilisant le substrat SuperSignal West Pico CL (Pierce). Les valeurs de densité
138
intégrée des transferts Western blot ont été comparées par analyse d'image
numérique (Chemi Imager 5500 avec le logiciel AlphaEase FCTM) en utilisant un
Multi Image Light Cabinet (Alpha Innotec, San Leandro, CA, Etats-Unis) (214, 216,
218). La détection de la bande de 42 kDa de la ß-actine a été effectuée en tant
que contrôle interne afin de confirmer une charge égale en protéines.
viii/ Immunodétection du niveau protéique et de l'auto-phosphorylation de HER1 et
HER2
Pour l'immunodétection de cellules entières, les cellules A-431 et SK-BR-3
(2 x 104 cells / 0.2 mL) ont été ensemencées dans des plaques en polystyrène
blanc à 96 puits Nunc F96 MicroWell (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA), laissées se fixer pendant 24h à 37°C, puis incubées pendant une période
supplémentaire de 24h en présence ou en absence (témoin) de médicaments.
Après élimination du milieu de culture par aspiration, les cellules adhérentes dans
chaque puits ont été lavées deux fois avec 70 µL de TBST et incubées à 4°C
pendant 10 minutes dans 50 µL de MeOH glacé. Le MeOH a été éliminé par
lavage avec du TBST (2 x 100 µL) et les plaques ont été incubées avec 100 uL de
SuperBlock (Pierce) pendant 1h à température ambiante. Après aspiration du
SuperBlock, les plaques ont été incubées pendant une nuit à 4°C avec un
anticorps primaire, soit polyclonal (pAb) anti-HER1 de lapin [EGFR (1005) : sc-03]
dirigé contre un épitope à l'extrémité C-terminale de l'EGFR d'origine humaine soit
monoclonal (mAb) anti-HER2 [Neu (9G6) : sc-08] dirigé contre un épitope situé sur
un domaine extracellulaire de Neu gp185 d'origine humaine (tous deux de Santa
Cruz Biotechnology), à une dilution de 1:200 dans du SuperBlock (100 µL/puits).
Chaque puits a été lavé avec du TBST (2 x 100 µL) et incubé pendant 1 h à
température ambiante à la fois avec la peroxydase de raifort liée à l'mAb
secondaire (dilution 1:1000 ; Oncogene) et le réactif Hoechst 33342 (dilution
1:5000 ; Invitrogen, Molecular Probes) dans 50 uL de SuperBlock (219). Après
lavage avec du TBST (2 x 100 µL) pour éliminer l'anticorps non lié et addition du
substrat SuperSignal West Pico CL (20 µL / puits), les plaques ont été lues dans
les 5 min par balayage de chaque puits pendant 0,1 seconde avec le mode CL
(425 nm) d'un lecteur de microplaques à fluorescence Cary Eclipse (219). La
139
lecture des puits où l'pAb primaire ou l'mAb a été omis a été utilisée pour
soustraire le fond. Enfin, les plaques ont été lues avec le modefluorescence (340
nm excitation / 460 nm émission) d'un lecteur de microplaques à fluorescence
Cary Exclipse (219). Les intensités relatives de fluorescence des complexes
réactif Hoechst - ADN ont été utilisées pour normaliser les valeurs relatives de
l'unité CL des complexes immuns pAb - ou mAb primaires - antigène liés à
l'anticorps secondaire lié à la peroxydase de raifort dans le but de comparer les
taux de protéines HER1 ou HER2 sur une base d'un nombre égal de cellules (219).
Et le rapport de luminescence relative : fluorescence des cellules traitées par le
médicament a été exprimé en pourcentage de celui des cellules témoins.
Pour l'analyse par Western blot de la phosphorylation de HER1 et HER2,
les cellules A-431 et SK-BR-3 (1 x 106 cellules / 5 mL) ont été respectivement
ensemencées dans des boîtes de Pétri Falcon 15x60 mm, laissées s'attacher 24h
à 37°C, puis incubées pendant une période supplémentaire de 3h en présence ou
en absence (contrôle) de médicament. Pour les cellules A-431, de l'EGF (100 ng /
mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) a été ajouté au cours des dernières
15 min d'incubation. Après élimination du milieu de culture et lavage avec du PBS
(2 x 2 mL), 2 x 106 cellules adhérentes ont été recueillies par raclage et rinçage
dans un volume total de 4 mL de PBS, centrifugées (800 g x 10 min) à 4°C,
remises en suspension dans 1 mL de PBS glacé pour transfert dans un tube
Eppendorf de 1,5 mL et recentrifugées (2000 g x 6 min) à 4°C. Des échantillons
de cellules ont été lysés pendant 30 min à 4°C avec 65 uL de tampon Tris-HCl 50
mM, pH 7,4, contenant du NaCl 150 mM, de l'EDTA 2 mM, du DTT 1 mM, du NaF
10 mM, 1 % de NP-40, 0,1% de SDS, du sodium d'orthovanadate 1mM, du
pyrophosphate de sodium 5 mM et le cocktail d'inhibiteurs de protéase indiqué cidessus, et ensuite rompues par sonication. Les lysats cellulaires ont été
centrifugés (14000 g x 15 min) et les concentrations protéiques des surnageants
cytosoliques ont été déterminées avec le kit de dosage de protéines BCA. Des
aliquotes de surnageants contenant des quantités égales de protéines (70 ug) ont
été incubés avec un tampon contenant du SDS pendant 5 min à 90°C et résolus
par électrophorèse pendant 1,3 heures à 200 V dans un gel de SDSpolyacrylamide à 8 % avant transfert humide sur membrane de nitrocellulose
Protran (Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA) pendant une nuit à
140
4°C en utilisant le systèmre Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués avec 5 % de BSA dans du
TBST. Tout d'abord, l'immunodétections de HER1 et HER2 phosphorylés (pHER1
et pHER2) a été réalisée à 4°C pendant la nuit dans du TBST contenant 2 % de
BSA, en utilisant 0,5 ug / mL d'anticorps primaire de chèvre anti-pHER1 [p-EGFR
(Tyr 1173) : sc-12351] dirigé contre une courte séquence d'acides aminés
contenant la Tyr 1173 de l'EGFR d'origine humaine phosphorylée ou d'anticorps
primaire de lapin anti-pHER2 [p-Neu (Tyr 1248-R) : sc-12352-R] dirigé contre un
courte séquence d'acides aminés contenant la Tyr 1248 de Neu (homologue de
HER2 isolé à partir de cellules de neuroglioblastome induites chez le rat) d'origine
humaine phosphorylée (tous deux de Santa Cruz Biotechnology). Les blots ont
ensuite été incubés avec un anticorps monoclonal secondaire lié à la peroxydase
de raifort et les bandes de protéines immunoréactives révélées par le réactif de
détection par CL amplifiée tel que décrit ci-dessus. Dans les mêmes expériences,
les transferts ont également été incubés une nuit avec l'anticorps primaire
polyclonal de lapin anti-HER1 et l'anticorps primaire monoclonal de souris antiHER2 suivis de l'anticorps secondaire monoclonal lié à la peroxydase de raifort et
la détection par le réactif de CL amplifiée a été répétée pour confirmer une charge
égale de récepteurs ainsi que pour évaluer et comparer les niveaux
d'autophosphorylation du récepteur après correction avec les niveaux des
protéines HER1 et HER2 chargés.
D/ Résultats
i/ Inhibition de la prolifération des cellules tumorales
Les structures chimiques et les noms de code des 11 quinoléines
substituées synthétisées et testées pour leur capacité à inhiber la prolifération des
cellules tumorales in vitro sont illustrés en figure 26. Les procédés généraux de
synthèse organique de ces composés ont été rapportés (180). Tous les composés
testés à 4 ou 25 µM, à l'exception des PQ2 et PQ5 (données non présentées), ont
inhibé la capacité mitochondriale des cellules leucémiques L1210 à métaboliser le
141
réactif MTS : PMS (Fig. 27). Sur une base de concentration égale, PQ1 (4 µM
inhibent de 75-99 % la prolifération à 2-4 jours), est un agent anti-prolifératif plus
efficace que PQ3 (25 µM inhibent de 84-99 % la prolifération à 2-4 jours) et est
clairement le composé antitumoral le plus puissant de la série dans le système
utilisé : tumeur L1210 (Fig. 27), et a été choisi pour des études ultérieures. En
effet, l'agent antiprolifératif PQ1 conserve son efficacité dans la gamme de
concencentration du µM à travers un spectre de lignées de cellules tumorales
pancréatiques, épidermoïdes et mammaires (Fig. 28). L'inhibition de l'activité
métabolique des cellules tumorales L1210 et SK-BR-3 par PQ1 est significative à
1,6 µM (données non présentées), maximale ou presque maximale à 4 µM et plus
prononcée au bout de 4 jours que 2 jours de culture, ce qui suggère que l'activité
anti-tumorale de ce médicament est une combinaison de concentration et de
durée d'action (Fig. 27 et 28). Cependant, lorsqu'ils sont testés en tant que
témoins positifs dans les mêmes expériences, des médicaments anticancéreux
établis comme DAU, Mitox et radicicol inhibent la croissance de diverses lignées
de cellules tumorales à des concentrations de l’ordre du nM (Fig. 27 et 28). Fait
intéressant, l'activité anti-proliférative de la 17-AAG est comparable à celle des
PQ1 dans une gamme de concentration de l’ordre du µM dans les cellules L1210
(Fig. 27) mais est amelioree de façon spectaculaire dans la plage de
concentrations de l’ordre du nM dans les cellules SK-BR- 3 (Fig. 28) et A-431 ou
BT-474 (données non présentées) qui pourraient avoir besoin de la surexpression
et de la stimulation de HER1 ou de HER2 pour leur croissance. Mais ce n'est pas
le cas pour les PQ1, pour lesquelles un tel changement d'efficacité antiproliférative
n'est pas détecté entre la lignée L1210 et les lignées de cellules tumorales
surexprimant HER1 ou HER2, ce qui suggère que, contrairement à la 17-AAG,
l'activité antitumorale des PQ1 n'est pas affectée par la dépendance du récepteur
de croissance des cellules néoplasiques (Fig. 27 et 28).
142
Fig. 26 : Structures
des differentes
quinoleines
substituees
ii/ Inhibition de l’expression de la protéine Ki-67
Fig. 27 : Inhibition de la croissance des cellules L1210 par
differentes PQ à 2 et 4 jours (barres blanches et rayees,
respectivement). C = contrôle (vehicule). PQ1 = 4 µM,
autres PQ = 25 µM, Mitox = 6.6 nM, radicicol et DAU = 41
nM et 17-AAG = 4 μM. a = non different du contrôle, b = p<
0,05, c = p < 0,01, d = p < 0,005 (par rapport au contrôle).
n=3
Fig. 28 : Inhibition de la croissance des cellules tumorales
Pan02, A-431, BT-474 et SK-BR-3 par PQ1 à 2 et 4 jours
(barres blanches et rayees, respectivement). C = contrôle
(vehicule). PQ1 = 4 µM, Mitox = 6.6 nM, radicicol et DAU = 41
nM et 17-AAG = 4 μM. a = p < 0,01005 (par rapport au contrôle).
n=3
143
Étant donné que la prolifération, la viabilité et la capacité des cellules T-47D
à former des colonies ont été indiquées précédemment être inhibées par des
concentrations de PQ1 de l'ordre du nM (180, 202), la capacité de ce composé à
inhiber le marqueur de prolifération cellulaire Ki-67 a été déterminée dans cette
lignée cellulaire de tumeur mammaire (Fig. 29). La protéine nucléaire Ki-67, qui
est absente des cellules au repos (G0), est présente au cours de toutes les
phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2) et de la mitose. Étant donné que
l'expression de la proteine Ki-67 est strictement associée à la prolifération
cellulaire, il s'agit d'un excellent marqueur pour déterminer la fraction en
croissance de populations de cellules tumorales (211). Par rapport au niveau de la
protéine Ki-67 détecté par immuno-marquage et microscopie à fluorescence dans
les cellules tumorales T-47D non traitées, l'inhibition remarquable de l'expression
de la protéine Ki-67 provoquée par 200 nM de PQ1 à 24-48h et, dans une moindre
mesure, à 72h, donne à penser que ce nouveau composé anti-prolifératif
maintient les cellules tumorales en vie dans la phase de repos et les empêche de
se réinsérer dans le cycle cellulaire (Fig. 28). Après traitement aux PQ1, par
conséquent, il existe moins de cellules tumorales et elles ne parviennent pas à
exprimer la protéine Ki-67 mais l'efficacité des PQ1 à 200 nm peut être plus courte
que 72h (Fig. 28).
Fig. 29 : Inhibition de l’expression de la proteine Ki-67 par PQ1
144
iii/ Inhibition de la synthèse de macromolécules et transport de nucléosides
Un traitement de 90 minutes aux PQ1 est suffisant pour inhiber
l'incorporation de [3H]-thymidine dans l'ADN, utilisé pour évaluer le taux de
synthèse d'ADN sur une période de 30 min de marquage pulsé dans les cellules
tumorales L1210 in vitro (Fig. 30). Bien qu'il puisse être quelque peu trompeur de
comparer les réponses biologiques mesurées à des moments très différents,
l'inhibition de la synthèse d'ADN concentration-dépendante par les PQ1, qui est
maximale à 25 µM, donne à penser que la capacité de ce composé à empêcher
les cellules L1210 a synthétiser de l'ADN à 2h (Fig. 30) peut jouer un rôle dans
son activité anti-proliférative aux jours 2 et 4 (Fig. 27). Dans des conditions
expérimentales similaires, Mitox et 17-AAG sont des inhibiteurs de synthèse de
l'ADN plus efficaces que PQ1 mais pas radicicol (Fig. 30). Fait intéressant, un
traitement de 15 minutes avec 25 à 62,5 µM de PQ1 est suffisant pour bloquer
presque totalement l'absorption cellulaire de [3H]-adénosine (inhibition de 94 à
96%) et de [3H]-thymidine (inhibition de 75 à 99 %) se produisant au cours de
seulement 30s dans des cellules L1210 in vitro (Fig. 31). Dans les mêmes
expériences, les concentrations antitumorales de radicicol et Mitox sont inefficaces
mais 17-AAG partage la capacité des PQ1 à bloquer l'absorption cellulaire à la fois
des nucléosides purines (par inhibition de 79 à 82%) et pyrimidines (inhibition de
69 à 91 %) (Fig. 31). Ces résultats suggèrent que l'activité antiproliférative des
PQ1 et 17-AAG peut diminuer l'incorporation des nucléosides radiomarqués dans
l'ADN à 2h (Fig. 30) car ils empêchent rapidement le système de transport des
nucléosides d'incorporer ces nucleosides radiomarqués dans les cellules L1210
dans les 15 min (Fig. 31). Outre la synthèse d'ADN, un traitement de 3h avec les
PQ1 inhibe également, d'une manière dépendante de la concentration, le taux de
synthèse d'ARN et de protéines, déterminé sur une période de 1h de marquage
pulsé dans les cellules tumorales L1210 in vitro (Fig. 32). En général, les courbes
concentration-réponse pour l’inhibition de la synthèse d'ARN et des protéines par
les PQ1 sont similaires à celle de son inhibition de la synthèse d'ADN : des
concentrations de PQ1 superieures a 10 µM doivent être utilisées pour démontrer
que l'efficacité et l'inhibition maximale sont obtenues à 25 µM. Dans des
conditions similaires, Mitox et 17-AAG inhibent la synthèse d'ARN à un degré plus
145
élevé que les PQ1, alors que le radicicol est légèrement moins efficace (Fig. 32A).
Pour l'inhibition de la synthèse des protéines, Mitox et radicicol sont plus efficaces
que les PQ1 mais 17-AAG est beaucoup moins puissant et ne parvient pas à
inhiber cette réaction de plus de 50%, même à la plus forte concentration testée
(Fig. 32B).
Fig. 30 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-thymidine
par differentes concentrations de PQ1 (●), radicicol (■),
17-AAG ( ▲ ) and Mitox ( ▼ ) dans des cellules L1210.
Incorporation mesuree pendant 30 min apres 90 min
d’incubation à 37˚C. a = non different du controle, b = p
<0,05. n = 3
Fig. 31 : Inhibition du transport cellulaire des bases
puriques (A) et pyrimidiques (B) dans des cellules L1210. 15
min de traitement avec : PQ1, radicicol et 17-AAG = 25
(barres blanches) ou 62.5 μM (rayures diagonales), Mitox =
1.6 (rayures horizontales) ou 4 μM (barres noires) (closed
columns). Resultats exprimes en pourcentage du contrôle
(note C). a = p < 0.0005 (par rapport au contrôle), b = pas
de difference par rapport au contrôle). n = 3
Fig. 32 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-uridine
dans l’ARN (A) et de [3H]-leucine dans les proteines
(B) par differentes concentrations de PQ1 (●),
radicicol (■), 17-AAG (▲) and Mitox (▼) dans des
cellules L1210. Incorporation mesuree pendant 60
min apres une periode d’incubation de 3h a 37˚C. a =
non different du controle, b = p <0,05, c = p < 0.025, d
= p < 0.005 (par rapport au contrôle). n = 3
146
iv/ Liaison et fragmentation de l'ADN
Des concentrations élevées d'antiprolifératif PQ1 et de médicaments
anticancéreux de référence ont été évaluées pour leur affinité de liaison à l'ADN
dans un système acellulaire en utilisant l'essai de déplacement classique EB pour
identifier
les médicaments intercalant ou non intercalant qui déstabilisent la
double hélice d'ADN. Qu'ils soient administrés en pré- ou post-traitements, les
PQ1 et le radicicol à des concentrations de 20 à 125 µM n'induisent pas une perte
de fluorescence de l’éthidium bromide (EB), ce qui suggère que ces composés
antiprolifératifs n'interagissent pas directement avec l'ADN double brin pour
perturber son intégrité structurelle et fonctionnelle et empêcher le colorant de
s'intercaler entre les paires de bases de l'ADN (Fig. 33). En revanche, les témoins
positifs traités au Mitox à des concentrations de 1,28 à 8 µM, qui déstabilisent
l'ADN double brin pour empêcher ou perturber l'intercalation d'EB, présentent une
suppression presque totale (inhibition de 53 à 95%) de la fluorescence du
complexe EB-ADN (Fig. 33). Dans ces conditions expérimentales, l'inhibition
dépendante de la concentration de la liaison de l'EB à l'ADN par Mitox a une CI50
de 1,2 µM (données non présentées). Sur une base de concentration équimolaire,
l'activité de liaison à l'ADN de 20 à 125 µM de 17-AAG, qui inhibe la fluorescence
du complexe EB-ADN de 34 à 68%, est beaucoup plus faible que celle du Mitox
mais suggère que la capacité de ce médicament anticancéreux à interagir
directement avec l'ADN peut également jouer un rôle dans son mécanisme
d'action (Fig. 33).
Fig. 33 : Inhibition de la liaison du bromure
d’ethidium a l’ADN par 1,8 (rayures verticales), 3,2
(rayures diagonales) ou 8 μM (barres noires) de
Mitox, 20 (barres blanches), 50 (rayures diagonales)
ou 125 μM (rayures horizontales) de PQ1, 17-AAG
ou radicicol. Résultats exprimés en pourcentage du
contrôle (note C). a = non différent du contrôle, b =
p <0,05, c = p < 0.005 (par rapport au contrôle). n =
3
147
La
capacité
des
PQ1
à
induire
une
fragmentation
de
l'ADN
internucléosomique à 24h a été évaluée et comparée à celle du 17-AAG, du
radicicol et du Mitox par deux techniques différentes : en utilisant des cellules
L1210 dont l'ADN a été préalablement marqué avec de la [3H]-thymidine pour
détecter des fragments d'ADN de faible poids moléculaire après précipitation de la
chromatine intacte (Fig. 34) ou électrophorèse sur gel d'agarose pour visualiser le
fractionnement typique de l'ADN (multiples d'environ 200 paires de bases) indicatif
de l'apoptose (Fig. 35). Par rapport aux témoins non traités (3,2% de
fragmentation de l'ADN), 25 µM de PQ1, 25 µM de 17-AAG et 4 µM de radicicol
induisent respectivement une augmentation d'un facteur 3,2, 2,1 et 2,8 du niveau
de clivage de l'ADN dans des cellules L1210 à 24h (Fig. 34). Le fait qu'une
stimulation 6,4 fois supérieure de la fragmentation de l'ADN est obtenue par une
concentration de 256 nM de Mitox, 15,6 fois inférieure à celle de radicicol et 97,7
fois inférieure à celle de PQ1 suggère que ce médicament anticancéreux est plus
cytotoxique que les composés ci-dessus (Fig. 34). La capacité des PQ1 à induire
une fragmentation internucléosomale a été confirmée par électrophorèse sur gel
d’agarose d'échantillons d'ADN extraits de cellules L1210 traitées avec des
concentrations croissantes de ce composé anti-prolifératif au bout de 24h (Fig. 35).
Par rapport au témoin non traité, les bandes de clivage de l'ADN avec un motif
caractéristique de fragmentation internucléosomal deviennent de plus en plus
visible en réponse à des concentrations de 1,6 à 25 µM de PQ1 (Fig. 35). Encore
une
fois,
sur
une
base
de
concentration
équimolaire, 256 nM de Mitox est un inducteur
plus puissant de la fragmentation de l'ADN
internucleo-autosomique que 4 µM de radicicol et
25 µM de PQ1 ou 17-AAG, sur la base de la plus
grande intensité des bandes d'ADN fragmenté
extrait d'échantillons de cellules L1210 traitées au
Mitox à 24 h (Fig. 35).
Fig. 34 : Induction de la fragmentation de l’ADN par 4
(barres blanches), 10 (rayures diagonales) ou 25 μM (barres
noires) de PQ1, 17-AAG et radicicol à 24 h dans des cellules
148
L1210 dont l’ADN a préalablement été marque ([3H]). Contrôle positif = fragmentation de l’ADN par
256 nM de Mitox (rayures horizontales). Résultats exprimes par [cpm dans le surnageant / cpm
dans le surnageant + le culot] x 100 à 24h. a = non différent du contrôle, b = p <0,025, c = p <
0.001, d = p < 0.005 (par rapport au contrôle). n = 3
Fig. 35 : Gel de fragmentation de
l’ADN par : Gauche : incubation 24h
à 37°C avec PQ1 1,6, 4, 10 ou 25
µM ou Mitox 256 nM Droite :
incubation 24h à 37°C avec PQ1 25
µM, 17-AAG 25µM, radicicol 4 µM
ou Mitox 256 nM. 6 μg d’ADN / puits
v/ Index mitotique et anomalies
Les populations contrôles de cellules L1210 en culture pendant 24h en
l'absence de médicament ne contiennent que 0,46 % de cellules en mitose (table
2). En relation avec leur capacité à perturber la dynamique des microtubules, un
traitement de 24h à la VCR (vincristine), qui bloque la polymérisation de la
tubuline et l'assemblage des microtubules, ou au taxol, qui abaisse la
concentration critique de tubuline libre nécessaire pour favoriser la polymérisation
et bloque le désassemblage des microtubules, entraîne, respectivement, une
augmentation d’un facteur 25,7 et 8,2 l'index mitotique (Table 2). De tels
médicaments anticancéreux stabilisant et déstabilisant les microtubules, connus
pour bloquer la progression du cycle cellulaire en phase M, ont par conséquent
servi de témoins positifs dans ce dosage antimitotique. Dans des conditions
similaires, les concentrations antiprolifératives de PQ1, 40 à 100 fois supérieures
à celles de la VCR et du taxol induisent une faible augmentation de 2,0 à 2,5 fois
de l'index mitotique des cellules tumorales L1210 à 24h mais stimulent la
formation de nombreuses cellules binucléées (augmentation de 3,2 à 7,4 fois) et
quelques micronoyaux, suggérant que ce composé pourrait accroître les
anomalies mitotiques, entraîner des altérations chromosomiques ou une mauvaise
ségrégation et bloquer la cytocinèse (tableau 2). Dans les mêmes expériences, le
149
composé de déstabilisation des microtubules empêche la formation et réduit le
pourcentage de cellules binucléées en-dessous du niveau de fond observé dans
les cellules témoins non traitées, tandis que le composé de stabilisation des
microtubules taxol produit de grandes augmentations de l'incidence de cellules
contenant deux noyaux (stimulation par 6,8 fois) ou des micronoyaux (stimulation
par 8,4 fois) (Table 2). Ceci est en accord avec le fait que les cellules traitées au
taxol, dont les microtubules du fuseau mitotique sont stabilisés, ne connaissent
pas de cytokinèse à la fin de la mitose et deviennent des cellules binucléées qui,
au cycle suivant de synthèse d'ADN forment des cellules polyploïdes polynucléées
qui finissent par mourir (220).
Tableau 2 : Effets des quinoléines substituées sur l’index mitotique et la fréquence de cellules
binucléés ou avec des micronoyaux dans des cellules tumorales L1210. a = cellules incubées 24h
à 37°C avec le compose et à la concentration indiques, b = Analyse d’au moins 2000 cellules /
lame, n=3, c = Pourcentage de cellules traitées mitotiques ou binucléés divise par le % de cellules
contrôles mitotiques ou binucléés, d = non différent du contrôle, e = p < 0,05, f = p < 0,025, g = p <
0.005 (plus que le contrôle) et h = p < 0,025 (moins que le contrôle)
vi/ Induction du clivage de PARP-1 et de l'activation des caspases effectrices et
initiatrices
Les traitements PQ1, 17-AAG et radicicol qui provoquent la fragmentation
de l'ADN internucléosomale dans des cellules L1210 à 24h ont été testés pour leur
capacité à induire le clivage de la PARP-1, un marqueur précoce de l'apoptose
caractérisé par la disparition de la bande de 116 kDa de l'enzyme native. Pas ou
peu de clivage de la PARP-1 est détecté dans les cellules témoins non traitées
mais la bande du fragment de 85 kDa devient de plus en plus apparente de 1 à
4,5h après le traitement des cellules L1210 avec 25 µM de PQ1 (Fig. 36). 17-AAG
150
et radicicol sont inactifs à 1 à 4,5h et de plus longs temps d'incubation sont
nécessaires pour détecter l'induction du clivage de la PARP-1 par ces
médicaments antitumoraux (Fig. 36). Contrairement aux cellules nécrotiques, qui
contiennent de grandes quantités de PARP-1 non clivée (221), pratiquement
aucune PARP-1 intacte n'est conservée après 20h dans les cellules apoptotiques
traitées avec 4 µM de radicicol, comme indiqué par la disparition presque totale de
la bande de 116 kDa de l'enzyme native (Fig. 36). Cependant, l'enzyme PARP-1
n'est que partiellement clivée par 25 µM de PQ1 à 3 - 4,5h et 10 µM de 17-AAG à
20h, sur la base de l'intensité de la bande du résidu de 116 kDa et de la plus petite
bande du fragment de 85 kDa (Fig. 36). Dans l'ensemble, les résultats suggèrent
que les composés antiprolifératifs PQ1, 17-AAG et radicicol sont des inducteurs
faibles et / ou lents du clivage apoptotique de la PARP -1 et de la fragmentation de
l'ADN internucléosomal.
Fig. 36 : Clivage de la
protéine PARP-1 dans
des cellules L1210
après incubation 1 à
4,5h en présence (ou
absence = contrôle C)
de 25 μM de PQ1 ou
incubation 20h en
présence (ou absence
= contrôle C) de 10
μM de 17-AAG ou 4
μM
de
radicicol.
Flèches = PARP-1 intacte (116 kDa) ou clivée (85 kDa). Actine (42 kDa) = contrôle
Étant donné que la dégradation de la PARP-1 est catalysée par la caspase3, le traitement PQ1 qui s'est avéré induire le clivage de la PARP-1 et la
fragmentation de l'ADN internucléosomique a été testé pour sa capacité à activer
cette caspase effectrice post-mitochondriale clef. L'activité de la caspase 2 a
également été testée parce que la stimulation de cette caspase peut être
nécessaire pour activer la cascade en aval d'autres caspases initiatrices et
effectrices dans les cellules tumorales traitées avec le médicament (214, 216).
L'hypothèse que la cascade d'activation des caspases est impliquée dans le
clivage de la PARP-1 par PQ1 à 1-4,5h (Fig. 36) est étayée par le fait que l'activité
des caspases 2 (1258 % du témoin) et caspases 3 (1810 % du contrôle) présente
une induction maximale dans les cellules L1210 dès 1h après le traitement avec
151
25 µM de PQ1 (Fig. 37). Fait intéressant, les capacités concentration-dépendantes
de 17-AAG, radicicol et Mitox à induire l'activité maximum de la caspase 3 dans
les cellules L1210 à 9 ou 24h (Fig. 38) ressemblent à l'induction de la
fragmentation de l'ADN internucléosomique causée par ces médicaments à 24h
(Fig. 34 et 35), 17-AAG étant l'activateur le plus efficace de la caspase 3 à des
concentrations croissantes jusqu’à 25 µM (468 % du contrôle), radicicol à des
concentrations décroissantes de 4 à 1,6 µM (515 à 570 % du contrôle) et Mitox à
encore plus faibles concentrations de 256 à 640 nM (798-1068 % du contrôle) (Fig.
37).
Fig. 37 : Test fluorogenic de l’activation des
caspases initiatrices et effectrices dans des
cellules L1210. (A) Induction des caspases 2
(barres rayées) et caspases 3 (barres blanches)
incubées pendant 1 à 6h en présence (ou absence
= contrôle C) de 25 μM de PQ1 (n=3). (B)
Induction des caspases 2 et 3 après incubation
pendant 9h en présence (ou absence = contrôle C)
de 17-AAG ou radicicol ou pendant 24h en
présence (ou absence) de Mitox. a = p < 0,01, b =
p < 0,005 (par rapport aux contrôles)
vii/ Niveaux protéiques et autophosphorylation de HER1 et HER2
Les petites molécules qui interagissent avec et inactivent les récepteurs de
l'EGF humains HER1 et HER2 et/ou leur chaperon Hsp90, pourraient bloquer
efficacement les aberrations des voies de signalisation ligand-dépendante et
indépendante qui soutiennent la prolifération de différentes lignées de cellules
tumorales surexprimant HER1 et HER2 (222). Après inhibition de leur chaperon
Hsp90, les protéines HER1 et HER2 déstabilisées subissent généralement la
dégradation protéosomique (223, 224). En effet, l'immunodétection de cellules
entières confirme que les inhibiteurs de Hsp90 connus 17-AAG et radicicol (219,
152
225) régulent à la baisse, d'une manière dépendante de la concentration, le
niveau de la protéine HER1 dans les cellules A- 431 et le niveau de la protéine
HER2 dans les cellules SK-BR-3, la dégradation du récepteur après 24h étant
significative à 41 ou 102 nM et maximale ou presque maximale à 256 nM ou 640 1600 nM (Fig. 38). En revanche, aucune des concentrations du composé
antiprolifératif PQ1 testées jusqu'à 25 µM n'a modifié les taux de protéines HER1
et HER2 dans les cellules tumorales A-431 et SK-BR-3 au bout de 24h, ce qui
suggère que ce médicament est peu susceptible d'inhiber la protéine Hsp90 pour
déstabiliser les voies de transduction médiées par HER1 et HER2 (Fig. 35).
Comme les récepteurs tyrosine kinases HER1 et HER2 sont activés par leur
oligomérisation et autophosphorylation (222, 226), il était intéressant de
déterminer si les PQ1 permettraient de réduire les niveaux de pHER1 dans les
cellules A-431 stimulées par EGF et pHER2 dans les cellules SK-BR-3 après 3h.
Dans la mesure où le premier événement de signalisation après l'oligomérisation
de HER1 et HER2 est l'autophosphorylation, l'inhibition de l'autophosphorylation
du récepteur est un indicateur de la puissance du composé et de sa sélectivité
(227, 228). Encore une fois, l'analyse Western blot indique que, sur une base de
teneur en protéines HER1 et HER2 égale, les PQ1 à 25 µM ne reproduisent pas la
capacité de 4 µM de 17-AAG et radicicol à supprimer les niveaux de pHER1 et
pHER2 respectivement détectés dans les cellules A-431 et SK-BR-3 à 3h (Fig. 39).
Les résultats suggèrent indirectement que les PQ1 ne ciblent pas Hsp90 ou HER1
et HER2 récepteurs kinases pour inhiber la
prolifération
des
cellules
tumorales
et
déclencher l'apoptose.
Fig. 38 : Immunodetection du niveau de HER1 (A) et
HER2 (B). Induction de la dégradation de HER1 dans
des cellules A-431 (A) et HER2 dans des cellules SK-BR3 (B) par différentes concentrations de PQ1 (●), 17-AAG
(■) et radicicol (▲). a = non différent du contrôle, b = p <
0,025, c = p < 0,01 (par rapport au contrôle)
153
Fig. 39 : Inhibition de la phosphorylation des
récepteurs HER1 et HER2 dans des cellules A-431 et
SK-BR-3, respectivement, par incubation 3h avec
PQ1 (25 µM), 17-AAG (4 µM) et radicicol (4 µM). C =
contrôle. Les cellules A-431 surexprimant HER1 ont
été stimulées pendant 15 min avec de l’EGF
E/ Discussion
Les quinoléines, qui ont une activité antipaludéenne, leishmanicide, antibactérienne et anticancéreuses, ont été rapportés inhiber les cassettes ABC
(cassette de transport de médicaments liant l'ATP), l'hypoxie tumorale, la
multirésistance aux médicaments (MDR) et l'activité tyrosine kinase des protéines
(180). La présente étude démontre que les quinoléines substituées PQ1, qui se
sont précédemment avérée inhiber la viabilité des cellules de cancer du sein
humain T-47D et leur capacité à former des colonies sur gélose molle in vitro et à
former des tumeurs suite à xénogreffe chez la souris nude in vivo (180, 202), sont
aussi systématiquement efficaces contre la prolifération des cellules tumorales
dans la gamme de concentrations de l’ordre du µM dans un petit panel de cellules
tumorales leucémiques, pancréatiques, épidermoïdes et mammaires. Le fait que
le composé antitumoral PQ1 soit efficace dans la plage des nM dans les cellules
T-47D (180, 202) est étayé par les données actuelles montrant que 200 nM de
PQ1 peuvent inhiber le marqueur de prolifération cellulaire Ki-67 dans les cellules
de tumeurs T-47D. Bien que l'ampleur de l'inhibition puisse varier et que les PQ1
puissent être plus efficaces contre les cellules T-47D que L1210, l'analyse MTS :
PMS de l'activité métabolique à 2 et 4 jours, le test d'exclusion au bleu trypan de
l'intégrité membranaire à deux jours (180), le test MTT au jour 1 et le dosage de la
croissance des colonies à 7 jours (202) concordent tous à démontrer que PQ1 est
154
un agent antitumoral puissant qui inhibe la prolifération, la viabilité et la capacité
de reproduction de différentes cellules tumorales. PQ1 est l'agent anti-prolifératif le
plus efficace parmi les analogues PQ testés dans les cellules L1210 mais PQ11 a
l'activité anti-proliférative la plus forte dans les cellules T-47D (180), ce qui
suggère
que
ces
quinoléines
substituées
synthétiques
peuvent
inhiber
sélectivement la croissance de certaines des lignées de cellules tumorales
mammaires dans la plage des nM. Les résultats sont encourageants compte tenu
du fait que de puissants composés anti-cancéreux ont été découverts parmi une
poignée d'analogues PQ synthétisés. L'activité antitumorale des PQ1 ouvre la
possibilité de concevoir de nouveaux médicaments anticancéreux à partir de cette
étude. Les PQ1 possèdent une chaîne latérale aminopropyl sur la fonction amine
C9 du cycle quinoléine, ce qui est susceptible d'améliorer sa capacité à interagir
avec les différentes cibles moléculaires dans les cellules.
La protéine Ki-67, qui est absente des cellules au repos (G0), peut être
détectée exclusivement dans les noyaux des cellules progressant à travers les
phases G1, S et G2 du cycle cellulaire et se relocalise à la surface des
chromosomes lors de la mitose (211). Parce que l'expression de la protéine Ki-67
peut être absolument nécessaire pour maintenir la prolifération cellulaire tumorale,
la fraction de cellules tumorales Ki-67 positives est souvent en corrélation avec
l'évolution clinique du cancer (211). Par conséquent, il est important de montrer
que des concentrations de l'odre des nM de PQ1 peuvent considérablement
inhiber l'expression de l'antigène Ki-67 pour au moins 48h, ce qui suggère que ce
nouveau composé anti-tumoral pourrait être efficace pour réduire la fraction en
croissance de populations de cellules tumorales et lutter contre la progression de
la maladie. L'observation de certaines cellules tumorales traitées aux PQ1
exprimant de nouveau l'antigène Ki-67 à 72h peut être due à la dégradation
partielle des médicaments produisant des métabolites inactifs. D'autres études
pharmacocinétiques seraient nécessaires pour évaluer la demi-vie, l'absorption
cellulaire, la conservation et la distribution intracellulaire des composés PQ et
évaluer leur durée d'action.
En accord avec les effets de médicaments anti-cancéreux établis utilisés
comme témoins positifs, des concentrations de PQ1 plus élevées que celles
suffisantes pour inhiber la prolifération des cellules tumorales doivent être utilisées
155
pour inhiber le transport de nucléosides et la synthèse de macromolécules ou
induire une activité maximale des caspases, le clivage de la PARP-1 et la
fragmentation de l'ADN apoptotique. Cette contradiction apparente peut être
simplement dûe à différentes conditions expérimentales et des réponses
cellulaires distinctes à différentes périodes d'exposition au médicament :
l'assimilation cellulaire de nucléosides puriques et pyrimidiques sur une période de
30 secondes est bloquée dans les cellules traitées pour seulement 15 min par les
PQ1 et 17-AAG ; les taux de synthèse protéique et d'acides nucléiques sur 30-60
min sont inhibés dans les cellules traitées sur une période de seulement 2-3h avec
les PQ1, Mitox, 17-AAG ou radicicol ; l'activation des caspases et le clivage de la
PARP-1 sont induits dans les cellules traitées pendant seulement 1-4,5h avec les
PQ1, 9-20h avec la 17-AAG ou le radicicol et 24h avec le Mitox et la fragmentation
internucléosomale de l'ADN maximale se produit 24 heures après le traitement
avec les médicaments anticancéreux, alors que les inhibitions les plus
spectaculaires de la prolifération des cellules tumorales L1210, PAN02, A-431,
SK-BR-3 et BT-474 sont le résultat de traitements médicamenteux de 2 à 4 jours.
Bien que les PQ1 synthétiques soient plus faibles que les médicaments
anticancéreux établis comme DAU, Mitox, 17-AAG et radicicol, l'intérêt de cette
petite molécule peut être dans ses nouvelles cibles moléculaires et mécanismes
de l'activité antitumorale, sur la base de l'observation que les PQ1 peuvent être le
1er composé pouvant interagir avec les jonctions GAP et diminuer la
phosphorylation des Cx43 pour restaurer spécifiquement la GJIC et inhiber la
prolifération cellulaire tumorale et pas celle des tissus normaux (202). Le
mécanisme moléculaire par lequel les PQ1 restaurent la GJIC dans les cellules
tumorales (180, 202) est en cours d'investigation. Une hypothèse est que les PQ1
peuvent empêcher la dégradation de la Cx43 (203) par interaction avec l'ubiquitine
E3 ligase. Les PQ1 pourraient bloquer l'interaction entre le motif PY (prolinetyrosine) des Cx43 et le domaine WW (tryptophane-tryptophane) de l'E3 ubiquitine
ligase.
Les PQ1 imitent la capacité de Mitox, radicicol et 17-AAG à inhiber la
synthèse de l'ADN, de l'ARN et des protéines dans les cellules tumorales L1210
mais, contrairement aux Mitox et radicicol inactifs, présentent l'avantage
supplémentaire de cibler le système de transport des nucléosides et de bloquer
156
rapidement l'absorption cellulaire des nucléosides pyrimidiques et puriques. Par
conséquent, les PQ1 sont susceptibles de perturber d'autres cibles de la
membrane cellulaire en plus des jonctions communicantes et leur capacité à
bloquer dans les 15 min la capture cellulaire de [3H]-adénosine et de [3H]thymidine est susceptible de jouer un rôle dans le mécanisme par lequel ce
composé inhibe après 2-3h les taux d'incorporation des nucléosides puriques et
pyrimidiques requis pour les synthèses d'acides nucléiques. Radicicol (25 à 62,5
µM) et Mitox (1,6 à 4 µM) sont totalement incapables de modifier le transport
cellulaire de [3H]-adénosine et de [3H]-thymidine, même si ces médicaments à de
telles concentrations inhibent de façon maximale l'incorporation de [3H]-thymidine
dans l'ADN. Fait intéressant, la 17-AAG inhibe également le transport de
nucléosides, ce qui suggère que l'inhibition de Hsp90 pourrait ne pas être la seule
cible moléculaire de son mécanisme d'action pour son activité anti-tumorale.
Pour la synthèse de nucléotides, les cellules utilisent des nucléosides
puriques et pyrimidiques générés soit par synthèse de novo soit par des voies de
sauvetage pour la réutilisation de bases préexistantes. Les cellules L1210
possèdent trois types distincts de transporteurs dse nucléosides qui agissent par
osmose (diffusion facilitée) ou mécanismes Na+ dépendants (transport actif concentratif) et sont soit sensibles ou insensibles aux inhibiteurs spécifiques de
transport des nucléosides (229). L'interaction directe des PQ1 avec les
transporteurs des nucléosides reste à déterminer mais ces cibles moléculaires
pourraient être utiles dans une polychimiothérapie pour potentialiser l'action
anticancéreuse des antimétabolites puisque les cellules tumorales pourraient
réguler à la hausse leur système de transport de nucléosides pour compenser les
effets inhibiteurs des antimétabolites sur la synthèse d'acides nucléiques. La MDR
(Multi Drug Resistance - Résistance à plusieurs médicaments) est parfois
associée à une augmentation du nombre de transporteurs de nucléosides et de
leur taux de transport, résultant en une absorption accrue d'adénosine et une
augmentation de la voie de sauvetage des nucléosides, ce qui limite l'efficacité du
méthotrexate et du 5-fluorouracile. En bloquant l'effet de sauvetage de
nucléosides exogènes, des inhibiteurs du transport de nucléosides peuvent
potentialiser ou prolonger l'activité anticancéreuse des antimetabolites qui inhibent
la voie de novo de la synthèse des nucléotides (213). De plus, les inhibiteurs du
157
transport des nucléosides peuvent aussi contourner la résistance à la DAU en
interférant avec à la fois les glycoprotéines et le transport des nucléosides dans
les cellules MDR (213, 229). Ainsi, les PQ1 pourraient également être utiles pour
contourner certains mécanismes de MDR et sensibiliser les cellules tumorales
MDR qui sont devenues insensibles à la cytotoxicité des médicaments
anticancéreux conventionnels endommageant l'ADN.
Le Mitox, approuvé par la FDA (Food and Drug Administration), est un 1,4dihydroxyanthracene-9,10-dione synthétique de la même famille que la DAU mais
moins cardiotoxique. Outre le ciblage de l'enzyme ADN topoisomérase II pour
induire des lésions de l'ADN, le mécanisme d'action des médicaments
antitumoraux de type anthracycline implique l'intercalation de groupements
aglycones plans dans l'ADN pour perturber la replication et la transcription de
l'ADN (230). Par conséquent, les présents résultats EB sont compatibles avec le
fait que le Mitox (1,28 à 8 µM) est un agent réagissant avec l'ADN qui s'intercale
dans l'ADN et provoque des liaisons transversales et des ruptures de brins.
Apparemment, des concentrations supérieures à 20 - 125 µM de 17-AAG peuvent
également se lier à l'ADN purifié et perturber le complexe EB-ADN, ce qui suggère
qu'un certain niveau de dommages à l'ADN peut jouer un rôle dans le mécanisme
d'action de ce médicament anticancéreux. Mais ce n'est pas le cas pour PQ1 et
radicicol, ce qui suggère que ces médicaments, qui ne se lient pas directement à
l'ADN pour inhiber la fluorescence du complexe EB-ADN dans un essai exempt de
cellules, ne sont pas susceptibles de cibler directement l'ADN cellulaire pour
exercer leur activité antitumorale.
L'incapacité des PQ1 à augmenter sensiblement l'indice mitotique des
cellules L1210, comme la VCR et le taxol le font à 24h, suggère que ce composé
n'est pas un poison du fuseau mitotique et présente une faible probabilité
d'intéragir avec la tubuline et de modifier la polymérisation / dépolymérisation des
microtubules pour entrainer son activité anti-proliférative. Mais des concentrations
croissantes du composé antiprolifératif PQ1 de 0,64 à 10 µM pourraient
déclencher des effets génotoxiques accroissant le taux de cellules binucléées et
de micronoyaux dans les cellules tumorales L1210 à 24h. Les cellules binucléées
indiquent que la cytokinèse suivant la division nucléaire est inhibée (217). La
formation de cellules à plusieurs noyaux peut s'en suivre si les cellules binucléées
158
réintègrent le cycle cellulaire et échappent de nouveau à la cytocinèse. Le test du
micronoyau est un indicateur de lésions et d'aberrations chromosomiques induites
par le médicament puisque de telles structures se forment généralement au cours
de la transition métaphase / anaphase de la mitose quand un chromosome retard
entier ou un fragment de chromosome acentrique résultant d'un événement
clastogène ou mutagène ne parvient pas à s'intégrer dans les noyaux des cellules
filles (217). Cependant, les aberrations chromosomiques et non-disjonction /
missegregation pourraient être la conséquence de la perturbation mitotique
prolongée induite par le médicament et pourraient être responsables de
l'incapacité cellulaire à subir la cytocinèse après régression du sillon de clivage
(231). Si compléter la cytocinèse nécessite une ségrégation chromosomique
correcte, il est possible que le traitement aux PQ1 induise des aberrations
chromosomiques et une mauvaise ségrégation augmentant la fréquence de
cellules binucléées.
A la différence du clivage précoce de l'ADN en larges fragments de 50 à
300 kpb, un événement de signalisation initial pouvant induire les cellules
tumorales traitées avec des concentrations relativement faibles de médicaments
anticancéreux endommageant l'ADN de s'engager vers l'apoptose, la dégradation
endonucléolytique secondaire au niveau des sites de liaison internucléosomiques
de l'ADN produisant de petits fragments mono- et oligonucléosomiques de 180200 pb à 24h est un marqueur tardif concomitant avec la preuve morphologique
de l'apoptose (232). En amont de la fragmentation de l'ADN internucléosomale,
l'activation de la cascade des caspases induit le clivage protéolytique d'une large
gamme de substrats. La caspase effectrice 3 clive et inactive l'inhibiteur de
l’ADNase activée par les caspases, libérant ainsi des endonucléases actives qui
se relocalisent dans le noyau pour réaliser la fragmentation de l'ADN
internucléosomale (232). Le clivage et l'inactivation de la PARP-1 induits par la
caspase 3 représentent également un événement précoce requis pour les cellules
tumorales qui ont été exposées à des médicaments anticancéreux endommageant
l'ADN et sont entrées dans le processus d'apoptose. Le clivage de la PARP-1 peut
empêcher la détection et la réparation des lésions de l'ADN, bloquer l'épuisement
de NAD+ et d'ATP causant la mort cellulaire nécrotique et améliorer l'activité des
endonucléases Ca2+ / Mg2+ dépendantes (221, 233). Pour cette raison, la
159
détection de la disparition du fragment de 116 kDa de l'enzyme native et
l'apparition du fragment de 85 kDa suite au clivage de la PARP-1 est un indicateur
précoce et sensible que les cellules L1210 traitées aux PQ1 ou aux médicaments
anticancéreux de référence utilisés comme contrôles positifs sont en cours
d'apoptose (216, 218). Les présentes données indiquent que les concentrations
de PQ1 qui bloquent le transport de nucléosides à 15 min et la synthèse de
macromolécules en 2-3h, stimulent une voie apoptotique qui induit une cascade
d'activation de la caspase initiatrice 2 et de la caspase effectrice 3 à 1h et de
clivage de la PARP-1 une coupure à 1-4,5h en rapport avec leur capacité à
perturber la cytocinèse et déclencher la fragmentation de l'ADN entre les
nucléosomes à 24h et à inhiber la prolifération des cellules tumorales au cours
d'une période de 2 à 4 jours, ce qui suggère que la capacité de cette quinoléine
substituée à induire l'apoptose peut jouer un rôle important dans son mécanisme
d'action moléculaire.
Que les voies extrinsèques ou intrinsèques soient impliquées, toutes les
voies de l'apoptose finissent par converger au niveau de la membrane externe des
mitochondries, où l'activation de la protéine Bcl-2, membre de la famille des
protéines pro-apoptotiques, provoque la transition de perméabilité mitochondriale
(MPT) et la libération de facteurs apoptogènes (214, 216, 232, 234). Les
médicaments anticancéreux endommageant l'ADN sont considérés déclencher
une voie intrinsèque mitochondriale-dépendante dans laquelle des signaux
nucléaires qui comportent divers gènes sensibles à la protéine p53 induisent
directement l'ouverture des pores mitochondriaux médiée par Bax et Bak et la
libération du cytochrome c (cyt c) à partir de l'espace intermembranaire dans le
cytosol qui est le facteur limitant clef dans l'initiation de la cascade postmitochondriale de protéases apoptotiques (232, 235). Le cyt c se lie au facteur
apoptotique 1 activateur des protéases, qui interagit avec la procaspase 9 pour
former le complexe apoptosome, ce qui active la caspase initiatrice en présence
d'ATP (235). Dans les cellules HL-60 traitées, le relargage critique du cyt c
mitochondrial peut se produire entièrement en l'absence d'activation de la caspase
apicale, ce qui suggère que le relargage du cyt c est un événement en amont et
indépendant des caspases dans l'apoptose induite par le médicament (216, 234).
Mais un inhibiteur spécifique de la caspase 2 bloque l'activation des caspases 9, 3
160
et 8 dans les cellules HL-60 traitées, démontrant que la caspase 2 peut être
activée en amont des autres caspases initiatrices et effectrices et contrôler leur
activation ultérieure (216, 234). Même si la PQ1 ne se lie pas directement à l'ADN,
la capacité de ce composé antitumoral à interagir avec des enzymes de
maintenance ou des protéines régulatrices et provoquer indirectement des
coupures ou des réticulations dans les brins d'ADN de poids moléculaires élevés,
des aberrations chromosomiques et des perturbations de la cytocinèse restent à
déterminer. Par conséquent, il est un peu prématuré de spéculer sur la nature des
cibles moléculaires initiales, des événements néfastes massifs et des signaux
nucléaires qui induisent les cellules tumorales traitées aux PQ1 à libérer leur cyt c
mitochondrial et à subir l'apoptose, ce qui active la cascade post-mitochondriale
des
caspases
responsable
du
clivage
de
la
PARP-1,
de
l'activation
d'endonucléases et, au final, de la fragmentation internucléosomale de leur ADN,
qui est l'une des manifestations de la fin du processus apoptotique. Les
marqueurs de la MPT liés à l'augmentation soudaine de la perméabilité de la
membrane interne comprennent l'effondrement du potentiel transmembranaire
mitochondrial (Δæm), une expansion de grande amplitude et la libération de Ca2 +
(236, 237). Le relargage du cyt c est un événement universel dans l'apoptose,
mais qui peut se produire avant, indépendamment ou en l'absence de
l'effondrement du Δæm et sans ouverture concomitante des pores de transition de
perméabilité mitochondriale (PTP) et expansion (236, 237). A la différence des
antitumoraux triptycène et analogues du 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione (237,
238), les PQ1 ne provoquent ni effondrement du Δæm ni gonflement mitochondrial
ni libération de Ca2+ dans des systèmes cellulaires et acellulaires (données non
présentées), ce qui suggère que ce composé est peu probable de cibler les
mitochondries pour induire le relargage du cyt c, soit directement, par des
changements de conformation qui perturbent la transition ouvert - fermé du
complexe PTP (238), soit indirectement, par le biais de lésions séquentielles de
l'ADN et activation précoce de la PARP-1 entraînant l’épuisement en NAD+ et le
dysfonctionnement mitochondrial (239). Comme la plupart des médicaments
anticancéreux actuels, PQ1 n'a pas la possibilité de cibler les mitochondries
directement, mais doit d'abord endommager d'autres cibles moléculaires afin de
générer les signaux qui déclenchent la voie mitochondriale de l'apoptose.
161
La 17-AAG, un analogue moins toxique de l'antibiotique ansamycine
geldanamycine, et le macrolide radicicol sont de puissants inhibiteurs de la
protéine Hsp90, un chaperon moléculaire dont l'association est nécessaire pour le
repliement post-traductionnel, la stabilité et la fonction de multiples protéines de
signalisation surexprimées, mutées et chimères qui favorisent la croissance et/ou
la survie des cellules cancéreuses (240). Comme un nombre important de
tumeurs expriment des niveaux accrus de protéine Hsp90 active et de protéines
HER1 et HER2, une approche pour inhiber de multiples voies de transduction du
signal avec un seul agent est de bloquer le site de liaison de l'ATP à la protéine
Hsp90 (241). En inhibant la fonction de la protéine Hsp90, la 17-AAG et le
radicicol provoquent la dégradation protéosomale sélective de plusieurs
oncogènes
:
récepteurs
membranaires
et
protéines
tyrosine
kinases
intracellulaires qui régulent de multiples voies de signalisation de la prolifération
des cellules tumorales, de régulation du cycle cellulaire, de survie cellulaire,
d'invasion, de métastase et d'angiogenèse, et induisent ainsi l’apoptose et les
effets antitumoraux (219, 223-225). Contrairement aux anticorps monoclonaux
volumineux et très spécifiques, les petits inhibiteurs de plusieurs kinases qui
ciblent à la fois les récepteurs HER1 et HER2 pourraient être avantageux pour
bloquer plusieurs étapes le long de différents réseaux de signalisation des
récepteurs tyrosine kinases et inhiber la croissance d'un plus large éventail de
cellules néoplasiques (222, 226-228). Dans la mesure où les PQ1 échouent à
imiter les capacités de la 17-AAG et du radicicol à réduire considérablement la
teneur en protéines et l'état de phosphorylation de HER1 ligand - dépendant et
HER2 ligand - indépendant, respectivement dans les cellules A-431 et SK-BR-3,
surexprimant ces récepteurs, ce nouveau médicament présente une faible
probabilité de cibler la protéine Hsp90 et de réguler à la baisse ou d'inactiver les
oncoprotéines de la voie de signalisation de l'EGF pour inhiber la croissance des
cellules tumorales et favoriser leur apoptose.
Combiner des médicaments qui ciblent différentes voies moléculaires et
obtenir des effets antitumoraux complémentaires ou synergiques est une stratégie
importante dans la chimiothérapie contre le cancer. PQ1, qui cible les jonctions
GAP (202) et diminue l'expression de la protéine Ki-67 dans la plage de
concentrations des nM et inhibe également le transport de nucléosides, bloque la
162
cytocinèse et induit la fragmentation de l'ADN apoptotique dans la gamme des µM,
pourrait perturber un plus large éventail de cibles moléculaires dans les
populations de cellules tumorales non synchronisées et avoir un mécanisme
d'action plus souple que d'autres médicaments affectant un seul de ces
événements. L'incapacité des PQ1 à réduire le niveau protéique et la
phosphorylation des récepteurs de l'EGF dans les membranes des cellules
tumorales renforce la notion selon laquelle l'amélioration de la GJIC (202) joue un
rôle majeur dans le mécanisme de son activité anti-tumorale.
163
164
III/ Les quinoléines substituées de seconde génération
comme médicament anti-cancéreux contre le cancer du sein
Traduit de l'anglais Heiniger et al. (242)
A/ Résumé
Les cellules cancéreuses ont une capacité réduite de communication intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC). Une approche possible pour
réduire la croissance des cellules cancéreuses est d'améliorer la GJIC. Ce rapport
montre que la quinoléine substituée de deuxième génération, PQ7, a un effet
antitumoral. Des analyses de transfert de colorant et de croissance des colonies
ont été effectuées pour mesurer la GJIC et la formation de tumeurs formées de
cellules T47D, cellules de cancer du sein. Les PQ7 à 500 nM induisent une
augmentation d'un facteur 16 de la GJIC dans les cellules T47D. En plus d'une
augmentation de la GJIC, une diminution de 50% de la croissance des colonies a
été observée avec 100 nM de PQ7. Des souris nu / nu traitées avec les PQ7 ont
montré une régression de 100% de la croissance de xénogreffes de tumeurs
formées de cellules T47D. Les résultats montrent que les PQ7 ont un rôle
prometteur en exerçant une activité antitumorale dans les cellules de cancer du
sein humain.
B/ Introduction
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le
monde et la mortalité par cancer du sein est toujours due à des métastases de la
tumeur (243). Le cancer est une maladie complexe et évolutive avec la formation
de défauts à plusieurs étapes génétiques dans une cellule. Le cancer est la
première pathologie à avoir été associée à des défauts dans les jonctions
communicantes. En 1966, Lowenstein et Kanno ont associé la communication au
travers des jonctions GAP (GJIC) avec le contrôle de la croissance cellulaire (2).
Ils ont observé une diminution du couplage électrique dans des hépatomes de rat
par rapport aux hépatocytes normaux. Une série de mécanismes moléculaires a
165
montré que le phénotype du cancer est lié à une perte de couplage (244). Puisque
l'observation la plus évidente dans le phénotype des cellules tumorales est le
dérèglement de la croissance, l'hypothèse de l'ensemble des études est que les
jonctions GAP sont impliquées dans le contrôle de la croissance cellulaire (245).
Un déficit dans les jonctions GAP a été défini comme étant l'absence de plaques
de jonctions GAP observées par des approches ultra-structurales (microscopie
électronique et cryofracture-cryodécapage) ou par diminution de la GJIC (246).
Les jonctions lacunaires sont des canaux transmembranaires hydrophiles
permettant le passage de molécules de moins de 1200 Da entre les cellules à
travers l'espace intra-cytoplasmique. Le passage de petites molécules à travers
les jonctions communicantes suggère que la taille fonctionnelle maximale du pore
pour le canal est d'environ 1,5 nm de diamètre dans des cellules mammifères
(247). Les petites molécules tels que l'AMPc, l'inositol triphosphate, le glucose, et
les ions calcium peuvent passer alors que les grosses molécules telles que des
protéines ou des sucres complexes ne peuvent pas passer à travers des jonctions
GAP (248). Les jonctions GAP sont les seules structures des membranes
cellulaires qui permettent la communication entre cellules adjacentes (249).
Un déficit en jonctions GAP formées de connexines 43 (Cx43) peut être
utilisé comme un marqueur indépendant pour les tumeurs du sein (250). Des
études préliminaires ont montré une régulation à la baisse des Cx26 et Cx43 dans
les cellules primaires dérivées de tumeurs du sein humaines (251), de tumeurs
mammaires de rat (9), et de lignées cellulaires de cancer du sein (250, 252). Dans
la mesure où le promoteur de la Cx26 est situé dans un îlot CpG (cytosine
guanine phosphate), il est supposé que la méthylation de ces sites peut conduire
à la répression du gène (253). Les études cliniques de Singal et al. ont trouvé une
hyperméthylation du gène de la Cx26 ; cependant, l'inhibition d'une ADN
méthyltransférase n'a pas induit l'expression du gène (252). Au contraire, Tan et
al. ont trouvé que seule une lignée de cellules de cancer du sein sur huit testées
était hyperméthylée dans la région du promoteur de la Cx26 mais que, dans ce
cas, l’hyperméthylation est en corrélation avec une perte complète de l'ARNm qui
a été récupéré après le traitement avec un inhibiteur d'une ADN méthyltransférase
(254). En outre, le promoteur de la Cx26 s'est avéré être méthylé dans plus de
50% des échantillons de tissus de patients testés, bien que de façon hétérogène.
166
Ces résultats contradictoires suggèrent que le gène de la Cx26 peut en effet être
un suppresseur de tumeur inactivé par méthylation, mais ce n'est probablement
pas le seul mécanisme de régulation à la baisse de l'expression (253). Une
régulation à la hausse des formes phosphorylées de la Cx43 a été observée dans
les cellules myoépithéliales et les cellules luminales transformées de carcinomes
in situ et toutes les cellules de carcinomes du sein invasifs (255). Les connexines
sont principalement présentes sur la membrane cellulaire, mais dans certaines
tumeurs, malgré une augmentation de l'expression des connexines, elles sont
généralement séquestrées dans les compartiments intracellulaires. KanczugaKoda et al. ont rapporté que le niveau d'expression de la Cx43, qui était
cytoplasmique dans 90% des tumeurs, est en corrélation positive avec le grade
histologique avancé de la tumeur (256).
Plusieurs petites molécules organiques, tels que l'ester caféate de
phénéthyle (CAP) (207), le sodium 4-phénylbutyrate (257), le liarozole (258), le
lycopène (259), et la lovastatine (260), ont été rapportés réguler à la hausse ou
restaurer la GJIC. Il a été précédemment rapporté qu'une nouvelle classe de
quinoléines substituées (nom de code, PQ) pouvait augmenter l'activité des
jonctions GAP dans les cellules cancéreuses du sein T47D (202). Cette étude a
démontré que la première génération de quinoléines substituées induisait
efficacement l'apoptose, diminuait la viabilité des cellules, et atténuait la
croissance tumorale. Une deuxième génération de PQ, analogue à la première
génération, a été synthétisée comme décrit dans le protocole rapporté (180). Le
but de cette étude était d'examiner une deuxième génération de quinoléines
substituées qui active spécifiquement l'activité GJIC et ensuite inhibe la croissance
tumorale de xénogreffes de cellules T47D chez des souris. Les résultats ont
démontré que cette deuxième génération de petites molécules fournissait un
traitement prometteur pour le cancer du sein.
167
C/ Matériels et méthodes
i/ Matériaux
Le composé PQ7, 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle) amino]-4-méthyl-5-(3trifluoromethylphenyloxy) quinoléine, a été préparé en suivant le mode opératoire
rapporté (180).
ii/ Lignée cellulaire et culture cellulaire
La lignée cellulaire T47D de cancer du sein humain a été achetée à
l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont été
cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum fœtal de veau
(Atlanta
Biologicals,
Lawrenceville,
GA,
USA)
et
10%
d'antibiotiques-
actinomycosiques à 37 ° C avec 5% de CO2 dans des flacons de 75 cm2.
iii/ Analyse par Western blot
Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI additionné de sérum
jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 90% dans des flacons de 75 cm2. Les
cellules ont été conservées dans un média de privation : DMEM sans phénol
rouge avec 5% de sérum filtré sur charbon toute une nuit. Les cellules ont été
supplémentées avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures.
Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid, puis ont été récoltées en
utilisant un tampon de lyse cellulaire (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA
0,5 mM, et 0,5% de Triton X-100) avec des inhibiteurs de proteases dilués à
1:1000 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Le lysat cellulaire a été traité par
ultrasons et centrifugé à 13.000 tours par minute pendant 30 minutes à 4°C. Vingtcinq mg d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide-SDS à 10% (PAGE) et transférés sur membrane de nitrocellulose
(Midwest Scientific, St. Louis, Missouri, USA). La membrane de nitrocellulose a
été bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température ambiante puis
incubée avec l'anticorps monoclonal de lapin anti-Cx43 à 1:500 (Santa Cruz
Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA), l'anticorps de lapin anti-caspase-9 à 1:
168
500 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), et l'anticorps de lapin anti-actine à
1:1000
(Sigma-Aldrich).
Les
transferts
Western
ont
été
détectés
par
chimioluminescence (Pierce, Rockford, Illinois, USA).
iv/ Activité des jonctions GAP
Pour l'analyse de transfert de colorant (SL / DT), les cellules ont été
cultivées jusqu'à atteindre 90% de confluence sur des lamelles, supplémentées
avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures. Après cela, les
cellules ont été lavées trois fois avec du PBS puis 2,5 ul d'un mélange contenant
1% de Lucifer yellow et 75% de rhodamine dextran ont été ajoutés au centre de la
lamelle. Deux coupes se croisant au centre de la lamelle ont été effectuées. Après
trois minutes, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et incubées à 37 °
C dans un milieu de culture tissulaire pendant 20 minutes. Les cellules ont ensuite
été lavées avec du PBS trois fois et fixées dans 2,5% de paraformaldehyde
pendant 10 minutes. Les cellules ont été montées sur une lame, scellées et
visualisées sous un microscope à fluorescence en utilisant les objectifs × 4 et ×
10.
v/ Croissance des colonies sur gélose molle
Les cellules ont été traitées avec 0, 10, 100 ou 1000 nM de PQ7 pendant
14 jours. Des plaques de gélose de base ont été préparées contenant 0,8% d'agar
et 0,4% d'agar dans un mélange d'éléments nutritifs Ham's F12. Les cellules (5 x
104444'4 cellules par puits de 33 mm2) ont été suspendues dans 100 uL de lmilieu
Ham's F12 avec 0,4% d'agar et étalées. Ces plaques ont été maintenues à 37°C
pendant 14 jours et examinées pour la présence de colonies. Des colonies
individuelles de 50 um ou plus ont été examinées.
vi/ Exclusion au bleu Trypan
La viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant la méthode d'eclusion au
bleu trypan. Un total de 1 x 104 cellules T47D de cancer du sein ont été traitées
avec différentes concentrations de PQ7 pendant 48 heures. Une suspension
cellulaire a été mélangée avec du colorant bleu trypan, puis examinée
169
visuellement pour les cellules viables avec l'appareil Cellometer Auto T4
(Nexcelom). La présentation graphique comprend trois échantillons indépendants.
vii/ Tumeurs de xénogreffes de cellules T47D chez les souris nu / nu
Les souris nu / nu ont été commandées auprès de The Jackson Laboratory,
(Bar Harbor, ME, USA). Les souris ont été inoculées avec de l'estradiol-17β (1,7
mg / pastille) avant une injection sous-cutanée de 1 x 107 cellules T47D de cancer
du sein, dans la région du coussinet adipeux mammaire inguinal. Un test de
viabilité cellulaire des cellules T47D a été effectué avant l'injection. La taille de la
tumeur a été mesurée en trois dimensions avec un étrier tous les 2 jours à partir
du jour sept. Les souris ont été observées pour un changement de comportement,
d'apparence ou de poids. Lorsque les tumeurs ont atteint 30-50 mm3, trois
animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de traitement. Les animaux
ont été injectés avec 1 uM de PQ7 tous les deux jours et des mesures
quotidiennes de la taille de la tumeur ont été réalisées.
viii/ Analyse statistique
Le niveau de signification a été examiné pour une p-value inférieure à 0,05
en utilisant le t-test de Student. Toutes les données sont présentées sous forme
de moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes provenant
de différents lots.
D/ Résultats
La communication intercellulaire est maintenue par la GJIC dans de
nombreux organes. Plusieurs activateurs de la GJIC ont été rapportés ; toutefois,
un médicament efficace ciblant les jonctions GAP n'est pas disponible sur le
marché à l'heure actuelle. L'objectif de cette étude était de synthétiser de petites
molécules qui activent spécifiquement l'activité GJIC et inhibent la croissance des
cellules cancéreuses. Une deuxième génération de quinoléines substituées a été
conçue et son activation de l'activité des jonctions GAP et sa capacité à entrainer
la mort de cellules de cancer du sein humain ont été démontrées. L'effet des PQ7
170
sur l'activité GJIC dans les cellules de cancer du sein T47D a été testé. Les
résultats ont démontré que 500 nM de PQ7 entrainaient une augmentation
significative de l'activité des jonctions GAP par rapport aux témoins, sans
traitement PQ7, en utilisant le test de transfert de colorant (Fig. 40A). La distance
de transfert de colorant entre la section de coupe et les cellules contenant le
colorant les plus éloignées a été mesurée. Une présentation graphique de trois
expériences indique que 500 nM de PQ7 provoquent une augmentation d'un
facteur 16 de la distance de transfert du colorant par rapport au contrôle (Fig.
40B). Auparavant, il a été démontré que les cellules épithéliales mammaires
normales (CEM) présentent une absorption uniforme du colorant Lucifer yellow
(202). Ceci est dû à la forte activité des jonctions GAP existant dans ces cellules
normales. Ces résultats ont démontré que les PQ7 sont suffisantes pour
provoquer une augmentation de l'activité GJIC dans le test SL / DT.
Fig. 40 : Activité des jonctions GAP. A. Traitement
pendant 24h avec différentes concentrations de PQ7.
Lignes
rouges :
sections
initiales
(rhodamine-
dextran). Fluorescence verte : passage du colorant
depuis la ligne de section. B. Distance de transfert (3
réplicas)
171
Divers oncogènes (par exemple ras, raf, neu, src, mos) régulent à la baisse
la GJIC, tandis que plusieurs gènes suppresseurs de tumeur peuvent réguler à la
hausse la GJIC. Ainsi, l'effet de l'activité régulée à la hausse par les PQ7 des
jonctions communicantes sur la formation et la croissance de colonies de cellules
T47D a été examiné. Les cellules ont été cultivées dans de la gélose molle pour
évaluer leur capacité de croissance indépendante d'ancrage, ce qui est une
caractéristique clef de la transformation des cellules en raison de l'importance des
interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour la suppression tumorale. Les
cellules T47D ont été traitées avec 0, 10, 100 et 1000 nM de PQ7 pendant 7 jours.
Une présentation graphique des trois résultats de l'expérience est présentée avec
une échelle logarithmique de concentrations de PQ7. L'effet des PQ7 sur les
cellules T47D s'est avéré être une inhibition significative de la croissance des
colonies de cellules T47D par rapport au témoin (Fig. 41). Les PQ7 à 100 nM ont
inhibé de 50% la croissance des colonies par rapport aux témoins sans traitement.
Fait intéressant, la même concentration (100 nM de PQ7) n'a eu aucun effet sur
les CEM (données non présentées). Ceci suggère que 100 nM de PQ7 peuvent
provoquer une augmentation de l'activité GJIC et par la suite peuvent réduire la
croissance des colonies de cellules T47D. En outre, la viabilité cellulaire des
cellules T47D a également été testée (Fig. 42). A 100 nM pendant 48 heures, les
PQ7 réduisent la croissance des cellules T47D de 94%. Cela confirme l'idée que
les monocouches de cellules ont plus de surface exposée pour la prise du
traitement.
Fig. 41 : Formation de colonies sur gélose molle
après 14 jours à 37°C en présence de différentes
concentrations de PQ7. C = contrôle. * = p<0,0.5.
Fig. 42 : Effet des PQ7 sur la viabilité cellulaire. 1x10
cellules
ont
été
traitées
avec
4
différentes
concentrations de PQ7. * = p<0,05
172
Des extraits de cellules entières traitées à la PQ7 ont été analysés pour des
changements dans les protéines de jonctions GAP, connexines. Les cellules ont
été traitées avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures.
L'analyse Western blot a été réalisée contre Cx43 (Fig. 43). Un anticorps antiactine a été utilisé comme témoin de chargement. Les résultats montrent que les
PQ7 augmentent l'expression de Cx43 dans des cellules de cancer du sein T47D.
Ce résultat a été confirmé par microscopie confocale (données non présentées).
L'effet des PQ7 sur l'apoptose a été examiné en effectuant une analyse par
Western blot contre la caspase 9 (Fig. 44). Pour les traitements à 500 et 1000 nM,
les résultats ont montré une augmentation de l'expression de la caspase 9.
Fig. 43 : Effet des PQ7 sur l’expression de Cx43 dans
des cellules T47D après 24h de traitement.
Fig. 44 : Effet des PQ7 sur les caspases 9 activées
après 24h de traitement
L'effet anti-tumoral des PQ7 a également été observé avec l'utilisation d'un
modèle animal. Des souris nu / nu ont été implantées avec du 17β œstradiol (1,7
mg / pastille) avant l'injection sous-cutanée de 1 x 107 cellules T47D de cancer du
sein, dans la région du coussinet adipeux mammaire inguinal. Les résultats de
xénogreffes de tumeurs ont montré une diminution de la taille des tumeurs dans le
groupe traité aux PQ7 par rapport au témoin au jour 2. Les résultats ont montré
une diminution de 100% de la croissance tumorale après sept injections du
traitement PQ7 par rapport au témoin (Fig. 45). Les résultats détudes précédentes
in vivo (180) suggèrent que le composé PQ est éliminé du corps de la souris en
environ deux jours ; par conséquent, des injections du médicament ont été
effectuées tous les deux jours pour obtenir des résultats optimaux.
173
Fig. 45 : Croissance de xénogreffes de cellules T47D
chez des souris nu/nu préalablement traitées au 17βœstradiol (1,7 mg / pastille). Injection sous-cutanée de
7
1x10 cellules en région inguinale. Résultats après 14
jours de traitement (7 injections)
E/ Discussion et conclusion
Les effets anti-tumoraux de la première génération de quinoléines
substituées ont déjà été mis en évidence. Ces effets comprennent une
augmentation de l'activité GJIC, ainsi que l'atténuation de la croissance tumorale
de xénogreffes chez des souris nudes (202). Cette étude a démontré l'efficacité
d'une molécule de deuxième génération et le rôle de ces composés prometteurs
dans le traitement du cancer.
Il y a plus de 40 ans, la perte de GJIC a été décrite dans les cellules
cancéreuses et a conduit à l'hypothèse que les déficits de GJIC sont impliqués
dans la carcinogenèse (261). De nombreux rapports ont confirmé que les
jonctions GAP sont souvent réduites ou absentes dans les cellules cancéreuses.
Une co-culture de cellules tumorales avec des cellules normales, ou avec des
cellules sur-exprimant des connexines, conduit à un retard de la croissance
néoplasique par l'établissement d'une communication fonctionnelle comme
observé avec le transfert de colorant (261). Ce retard de croissance tumorale a
été empêché par la co-culture des cellules transformées avec des cellules
normales présentant des jonctions compétentes transfectées avec un réactif antisens spécifique des connexines (262). Ainsi, ces résultats indiquent que des
signaux provenant de cellules normales adjacentes peuvent inverser le phénotype
malin et que leur incapacité à accomplir ceci est due à un manque de GJIC.
La relation entre la communication cellulaire et la croissance cellulaire a été
établie de telle sorte que la capacité des cellules à communiquer au travers des
jonctions GAP est négativement liée à leur activité de croissance. Dans cette
étude, il a été démontré que l'augmentation de l'activité GJIC dans les cellules
T47D pouvait provoquer une diminution de la croissance des cellules (Figures 40,
41 et 42). Saez et al. (263) ont également observé que l'augmentation de GJIC est
174
directement liée à l'effet anti-tumoral dans des lignées cellulaires de cancers
mammaires humains. Dans les tissus normaux, les jonctions communicantes sont
actives et bien régulées avec le cytoplasme des cellules voisines (264-266). Grâce
au passage de molécules de signalisation, la GJIC contribue à la régulation de la
prolifération cellulaire, de la différenciation, de la mort cellulaire, et au maintien de
l'homéostasie. De nombreuses études montrent clairement que l'altération de la
GJIC est impliquée dans la progression du cycle cellulaire. Dans la plupart des
types cellulaires, la GJIC est réduite à la fin des phases G1, S et M (205). L'état
spécifique du cycle cellulaire dans lequel la GJIC et/ou l'expression des
connexines sont modifiées, cependant, dépend à la fois du type cellulaire et de la
nature de la connexine à l'étude. Cette étude a apporté la preuve que la PQ7
augmentait l'expression de la Cx43 dans des cellules de cancer du sein humain
T47D (Figure 43). Cette information peut aider à expliquer l'augmentation
subséquente de la GJIC dans les cellules traitées avec PQ7.
Pour étudier l'effet de PQ7 chez les souris porteuses de tumeur, une étude
de xénogreffes de tumeurs formées de cellules T47D a été effectuée. Les
résultats ont montré une diminution de 100% de la croissance tumorale avec le
traitement à la PQ7 par rapport au témoin après sept injections (Figure 45),
fournissant ainsi la preuve que PQ7 a un effet anti-tumoral dans ce modèle
animal. Les données montrent clairement que PQ7 est un agent anticancéreux
efficace. Par rapport à la diminution de 70% dans une étude similaire utilisant des
quinoléines substituées de première génération (202), il est clair que la quinoléine
substituée PQ7 est une amélioration par rapport à la première génération de ces
composés.
En résumé, PQ7 améliore spécifiquement l'activité GJIC. Une augmentation
de l'activité GJIC induite par PQ7 provoque une diminution significative de la
croissance cellulaire des colonies. La diminution de la viabilité des cellules et de la
croissance des cellules des colonies peut être attribuée à l'apoptose induite par
PQ7 à la suite d'une régulation de la caspase-9 active. Le traitement par PQ7
conduit ensuite à une augmentation de l'expression de la Cx43 dans des cellules
de cancer du sein T47D, conduisant probablement à l'augmentation de la GJIC.
175
Dans l'ensemble, il est évident que la deuxième génération de quinoléines
substituées a un effet plus puissant sur la GJIC que la première génération de ces
composés. Par conséquent, cette deuxième génération a un rôle encore plus
prometteur dans le traitement du cancer du sein. Le mécanisme de mise en valeur
de la GJIC par des composés PQ est encore à l'étude.
176
IV/ Les activateurs des jonctions GAP augmentent l'efficacité
du cisplatine dans la réduction des tumeurs mammaires
Traduit de l'anglais Shishido SN, Nguyen TA (267)
A/ Résumé
Le traitement au cisplatine a un taux de réponse global de 19% dans des
modèles animaux de tumeurs malignes. L'augmentation de l'activité des jonctions
GAP dans les cellules tumorales est une cible pour améliorer les thérapies
antinéoplasiques. Nous avons montré auparavant qu'une nouvelle classe de
quinoléines substituées (PQs) agissait comme enhancer des jonctions GAP et
avait la capacité d'augmenter la communication intercellulaire au travers des
jonctions GAP dans les cellules des tumeurs mammaires. Nous avons examiné
l'effet d'un traitement combinant les PQ et les traitements antinéoplasiques actuels
dans un modèle animal, montrant une augmentation de l'efficacité de ces derniers
par l'amélioration des jonctions communicantes. Les souris ont été implantées
avec de l'estradiol-17ß (1,7 mg/pastille) avant injection de 16107 cellules T47D
(cancer du sein) en sous-cutanée, en région inguinale dans le coussinet adipeux
mammaire. Les animaux ont été traités par voie intrapéritonéale avec du DMSO
(témoin), du cisplatine (3,5 mg/kg), PQ (25 mg/kg), ou une combinaison de
cisplatine et PQ. Le cisplatine seul entraîne une diminution de la croissance de la
tumeur mammaire de 85% tandis que le traitement combinant cisplatine et PQ1 ou
PQ7 a montré une réduction supplémentaire de 77 % et 22% de la croissance
tumorale après sept traitements tous les 2 jours, respectivement. Les résultats
histologiques ont montré une augmentation significative des protéines des
jonctions GAP : Cx43 et Cx26, dans les tissus traités avec PQ comparés au
contrôle ou au traitement au cisplatine. En outre, la coloration des capases 3 dans
les tumeurs traitées par une combinaiseon PQ et cisplatine est augmentée par
rapport au traitement avec le cisplatine seul. Nous avons montré pour la première
fois une augmentation de l’efficacité des traitements antinéoplasiques par leur
association avec les PQ, une classe d'activateurs des jonctions GAP.
177
B/ Introduction
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le
monde entier et la mortalité est causée par les métastases de la tumeur (268).
Des anomalies dans les cellules néoplasiques, telles que l'excès de prolifération,
l'invasion et les métastases, ont un rôle crucial dans la perte de l'homéostasie
tissulaire (264, 265, 269). Les jonctions GAP sont les seuls jonctions
communiquantes trouvées dans les tissus animaux, dans toutes les espèces,
responsables du passage direct des ions et des molécules de poids moléculaire
inférieur à 1200 daltons (3). Les jonctions GAP connectent directement les
cytoplasmes de cellules voisines, afin de permettre le passage de molécules de
signalisation intercellulaires et les régulateurs homéostatiques tels que les signaux
anti-apoptotiques et les facteurs de croissance. Les jonctions intercellulaires sont
importantes dans le maintien de l'homéostasie cellulaire, la différenciation
cellulaire, et la mort cellulaire. Une
des caractéristiques principales de la
formation de cancer est la perte de communication intercellulaire au travers des
jonctions GAP (GJIC) par la diminution de l'expression ou l'absence de jonctions
GAP (2).
La restauration de GJIC dans les cellules tumorales est une approche
permettant d'augmenter la propagation de médicaments cytotoxiques et, par suite,
d'améliorer la chimiothérapie. L'utilisation d'un enhancer des jonctions GAP peut
potentialiser l'effet de voisinage de composés cytotoxiques, tels que le cisplatine
et le paclitaxel. Récemment, une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQs)
a été synthétisée et s'est révélée posséder une activité inhibitrice puissante contre
les cellules de cancer du sein T47D (valeur de CI50 de 16 nM pour PQ7 et 119
nM pour PQ1) par le renforcement des GJIC (180, 202). PQ7 a la capacité de
renforcer la GJIC entre les cellules néoplasiques en augmentant l'expression de
connexines 43 (Cx43) (242). De plus, in vivo, le traitement PQ7 sur des souris
nudes ayant subit des xénogreffes de T47D a montré une diminution de 100% de
la croissance tumorale après sept injections intrapéritonéales (242). Cet agent est
capable de normaliser la GJIC et a des propriétés de prévention de la
carcinogénèse.
178
Le cisplatine est un des agents de chimiothérapie les plus largement
utilisés en clinique mais l'insuffisance rénale est un problème commun chez les
patients. La néphrotoxicité du cisplatine est dose-dépendante et ainsi la dose qu'il
est possible d'utiliser est limitée (270). Le principal mécanisme de toxicité du
cisplatine est par l'intermédiaire de la formation d'adduits platine-ADN qui
induisent un arrêt du cycle cellulaire (271, 272). Les autres principaux
mécanismes d'action comprennent une protéine de réticulation de l'ADN, la
production de dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) qui entraînent un stress oxydatif
(273), et une voie cellulaire interdépendante médiée par les jonctions GAP (274).
La voie cellulaire interdépendante de la toxicité du cisplatine requiert une protéine
kinase ADN-dépendante (PK) de signalisation ainsi qu'une communication
intercellulaire par les jonctions GAP efficace (274). He et al. (275) ont montré que
les jonctions GAP composée de Cx32 sont des éléments nécessaires de toxicité,
ce qui suggère que les cellules doivent être compétentes pour la GJIC. Les
dommages engendrés par le cisplatine dans une cellule déclenchent un signal
DNA-PK dépendant transmis par GJIC aux cellules voisines. Jensen et Glazer
(274) ont montré qu'en inhibant la GJIC au lindane, les fibroblastes embryonnaires
de souris (MEF) immortalisés sont protégés contre la toxicité du cisplatine, alors
qu'en augmentant la GJIC par transfection de cellules MCF-7 du cancer du sein
avec des Cx43 entrainait une sensibilité accrue au traitement. L'induction de
l'apoptose/nécrose par le cisplatine dans une cellule peut provoquer un "signal de
mort" qui est transmis aux cellules voisines à travers des jonctions communicantes.
L'augmentation de l'activité des jonctions GAP ou l'amélioration de la GJIC
dans les cellules tumorales fournissent les cibles pour l'amélioration des thérapies
antinéoplasiques. Tanaka et Grossman (276) ont démontré que la transfection de
cellules de cancer de la vessie humaines avec des Cx26 pouvait empêcher la
formation de tumeurs. En association avec le cisplatine, une augmentation de la
GJIC promeut apoptose, arrêt du cycle cellulaire et diminution de BCL-2 (276).
Une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQs) possède une activité
inhibitrice contre les cellules cancéreuses du sein grâce à l'amélioration de la
GJIC. L'objectif de cette étude était d'examiner l'effet du traitement combinant PQ
et traitements antinéoplasiques dans un modèle xénogreffe de tumeur, montrant
179
une augmentation de l'efficacité du traitement antinéoplasique cisplatine (cisdiamminedichloroplatine), via l'amélioration des jonctions communicantes.
C/ Matériels et méthodes
i/ Déclaration éthique
L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médicine comparée
(CMG) au Collège de médecine vétérinaire de l'Université d'État du Kansas. Les
animaleries du CMG sont entièrement accréditées par l'association internationale
pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire
(AAALAC). La conformité de certains aspects de la protection des animaux est
contrôlée régulièrement par le personnel vétérinaire. Les protocoles de soins aux
animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel de
protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université d'État du Kansas,
Manhattan (Numéro de protocole : 2985), suivant les directives du NIH.
ii/ Composés
Les composés PQ1, 6-Methoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-methyl-5-(3trifluoromethyl-phenyloxy) quinoléines, et PQ7, 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle)
amino]-4-méthyl-5-(3-trifluoro-methylphenyloxy) quinoléine, ont été gracieusement
fourni par le Dr Duy H. Hua (Kansas State University, Manhattan, KS). Le
cisplatine, cis-diamminedichloroplatine (II), a été acquis auprès de Sigma Aldrich
(St. Louis, MO).
iii/ Lignées cellulaires et culture cellulaire
La lignée cellulaire de cancer du sein humain T47D a été achetée auprès
de l'American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA). Les cellules ont été
cultivées dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal
180
(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) à 37°C avec 5% de CO2 dans des
flasques T- 125 cm2.
iv/ Xénogreffe de cellules tumorales T47D chez la souris nude
Les souris nu/nu ont été commandées auprès de Charles River
Laboratories International (Wilmington, MA, USA) et implantées avec du 17-bestradiol (1,7 mg/pastille, Innovative Research of America, Sarasota, FL) avant
l'injection de 16107 cellules cancéreuses T47D par voie sous-cutanée, en région
inguinale, dans le coussinet adipeux mammaire. La viabilité cellulaire des cellules
T47D a été évaluée avant l'injection. La taille des tumeurs a été mesurée en deux
dimensions avec des pieds à coulisse tous les 2 jours en commençant au jour 7.
Les souris ont été observées pour un changement de comportement, l'aspect et le
poids. Lorsque les tumeurs ont atteint 0,50 mm3, six animaux ont été assignés au
hasard à chaque groupe de traitement. Les souris ont reçu 25 mg/kg de PQ1 ou
PQ7 dans du sel d'acide succinique, 3,5 mg/kg de cisplatine, ou une combinaison
de cisplatine et de PQ par injection intrapéritonéale de 100 mL. Les composés ont
été dissous dans du DMSO, qui a été utilisé en tant que contrôle en utilisant le
même volume.
v/ Analyse Western blot
Le tissu a été récolté à partir des souris et des extractions de cellules
entières effectuées en utilisant un tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5
mM, EGTA 0,5 mM et 0,5 % de Triton X-100) un inhibiteur de protéase dilué à
1:1000 (Sigma- Aldrich, Saint Louis, M, USA). Le tissu a été homogénéisé par
l'intermédiaire de l'OMNI Bead Ruptor 24 à une vitesse de 5,65 m/s pendant 45
secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. 25
mg d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur gel SDSPAGE à10% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest
scientifique, Saint Louis, MO, USA). La membrane de nitrocellulose a été bloquée
dans 5% de lait pendant une heure à température ambiante puis mis à incuber
avec des anticorps monoclonaux dirigés contre Cx43, Cx32, Cx26 , caspase 3,
181
caspase 8, et caspase 9 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) et
actine (Sigma-Aldrich) à une dilution de 1:1000. Les transferts ont été détectés par
des réactifs de détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford,
Illinois, Etats-Unis) et visualisés par Fluorochem E système d'imagerie.
vi/ Immunohistochimie
Toutes les tumeurs ont été prélevées et fixées dans une solution de
formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine préalablement à leur
sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Des sections de paraffine
(5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le déparaffinage a été
réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 % d'éthanol. L'antigène
extraction a été effectuée dans une solution tampon de citrate et de la vapeur. Les
lames ont été ensuite incubées pendant une nuit à température ambiante avec un
anticorps polyclonal (dilution 1:50). Les anticorps comprennent : connexines 43,
32, 26 ; caspases 3, 8, 9 ; survivine ; Cycline D1 ; Ki- 67 et Mig (Santa Cruz
Biotechnologies, Santa Cruz, Californie, États-Unis). Après lavages dans plusieurs
bains de PBS, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires
biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les lames ont été lavées et les
immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du complexe avidine
biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été visualisées avec de la 3,3diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration hemalun-eosine. Les
sections ont été observées et les images capturées avec un microscope Nikon 80i
sous un grossissement 40x et 60x.
vii/ Analyse statistique
La signification statistique a été examinée avec une p-value de 0,05 en
utilisant l'analyse t- test de Student. Toutes les données sont présentées en tant
que moyennes pour l'intervalle de confiance de 95 % d'au moins trois expériences
indépendantes.
182
D/ Résultats
i/ Croissance de xénogreffes de cellules tumorales T47D chez la souris nude
Les souris ont été implantées avec le 17ß -estradiol (1,7 mg/pastille) avant
injection de 16 107 cellules T47D (cancer du sein) par voie sous-cutanée en
région inguinale dans le coussinet adipeux mammaire. Sept jours après l'injection
des cellules, les animaux ont été répartis au hasard dans chaque groupe de
traitement. Les animaux ont été traités par voie intrapéritonéale avec du DMSO en
tant que témoin (solvant du médicament), du cisplatine, PQ1, PQ7, ou une
combinaison de cisplatine et PQ dans un volume total de 100 ml. Tous les
traitements ont réduit significativement la taille de la tumeur (Fig. 46) par rapport
au témoin. Le cisplatine seul a entrainé une diminution de la croissance de la
tumeur mammaire de 85% tandis que le traitement combinant cisplatine et PQ1 a
montré une réduction supplémentaire de 77% après sept traitements tous les 2
jours (p-value de 0,012). PQ1 diminue davantage la croissance de la tumeur de
97% au bout de sept injections par rapport au traitement au cisplatine seul avec
une p-value de 0,001. Les données démontrent que PQ7 seul et en combinaison
avec le cisplatine a réduit significativement les tumeurs de xénogreffes de T47D
par rapport au témoin (p-value 0,001). Avec PQ7 seul, il y avait une réduction de
19% supplémentaire de la taille de la tumeur par rapport au cisplatine. Le
traitement combinatoire avec le cisplatine a encore diminué la taille de la tumeur
T47D par 77 % et 22 % pour PQ1 (p-value : 0.028) et PQ7, respectivement, par
rapport au cisplatine seul. Le traitement combinant le cisplatine avec PQ a montré
une
plus
grande
réduction
du
volume de la tumeur par rapport au
cisplatine seul.
Fig. 46 : Croissance de xénogreffes chez la
souris nude. Résultats après 7 injections
intra-péritonéales de DMSO, cisplatine (3.5
mg/kg), PQ7 (25 mg/kg) ou une association
de cisplatine et PQ7.
183
ii/ Expression de protéines des xénogreffes
Fig. 47 : Immunohistochimie sur des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D. A. Magnification
x40 B, C et D. Magnification x60
184
Les modifications morphologiques sont la base pour le diagnostic de cancer
contemporain. La coloration à l'hémalun éosine (H&E) une morphologie
consistente de toutes les xénogreffes en dépit du traitement reçu (Fig. 47A). Les
sections de tumeurs ont montré un nid solide de cellules tumorales à
prédominance mal différenciées avec de grands noyaux irréguliers, chromatine
granulaire grossière, nucléoles proéminents, et activité mitotique élevée. Les
cellules néoplasiques étaient plus grandes que l'épithélium normal avec une
morphologie épithélioïde caractéristique et pléomorphisme nucléaire marqué.
L'histologie ne montre pas de caractéristiques importantes d'apoptose ou de
nécrose pour aucun des groupes de traitement.
Les cellules adjacentes sont en mesure d'échanger des régulateurs
d'homéostasie tels que des signaux anti-croissance et des facteurs apoptotiques,
par la voie des jonctions GAP hydrophiles. Chaque jonction GAP est constituée de
deux hémi-canaux (connexons) qui sont incorporés dans la membrane plasmique.
Ces connexons sont formés par six protéines de connexines (265), dont on
dénombre 21 différents gènes humains identifiés (277). Seules trois protéines de
connexine sont exprimées dans le tissu du sein humain : Cx43, Cx32 et Cx26
(278). L'analyse immunoblot et l'immunohistochimie ont été menées sur les
xénogreffes de tumeurs T47D de souris récoltés après 7 injections intrapéritonéales de DMSO, cisplatine, PQ1, PQ7, ou un traitement associant du
cisplatine et PQ. Les tumeurs traitées avec PQ seuls et en combinaison ont
montré une augmentation des protéines des jonctions GAP (connexines 43, 32 et
26), par rapport aux témoins et aux tumeurs traitées au cisplatine seul (Figure 2B).
Le traitement au cisplatine a diminué l'expression des Cx43 par rapport au témoin
(Figure 47B). L'analyse Western blot des homogénats de tumeur des souris
traitées a montré que PQ1 a augmenté de manière significative l'expression de
Cx43 dans des xénogreffes T47D par un facteur de 3,9 par rapport au témoin (pvalue = 0,003) et 4,9 par rapport au cisplatine (p-value : 0,007) (Figure 48A).
185
Fig. 48 : Expression protéique dans des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D. En gras :
p<0,05 par rapport au control ou au traitement au cisplatine.
La voie de signalisation apoptotique induite par le traitement est déterminée
par analyse de l'expression de la caspase. Deux grandes voies de signalisation
conduisent à l'apoptose. L'une est la libération mitochondriale d'effecteurs pro186
apoptotiques tels que les caspases-9, ce qui conduit à l'apoptose caspasedépendante ou indépendante (279). L'autre implique l'interaction des récepteurs
de mort cellulaire avec des protéases associées et l'activation des caspases-8
(280). Les données indiquent qu'il ya une augmentation de la densité de coloration
des protéines apoptotiques (caspase-3, -8 et -9) avec le traitement PQ en
comparaison du contrôle et du cisplatine seul (Figure 48C), ce qui est confirmé par
analyse par Western blot (Figure 48B). Le traitement au cisplatine a augmenté
l'expression des capases-9 d'un facteur 3,76 (p-value : 0,007) et des caspases-3
d'un facteur 2,7 (p-value : 0,0004) dans les xénogreffes T47D par rapport au
témoin (Figure 3B). Le traitement PQ1 a augmenté l'expression des caspases-3, 8, -9 dans les tumeurs par rapport au contrôle par un facteur 5.4 (p-value : 0,0001),
2,0 (p-value : 0,003) et 1,6 respectivement. Comparativement au traitement
cisplatine, PQ1 a augmenté l'expression des caspases-3 d'un facteur 2,0 (p-value :
0,0007). PQ7 a également augmenté l'expression des caspases-3, - 8 et -9 par
rapport au témoin d'un facteur 1,6 (p-value : 0,015), 2,8 et 3,8 (p-value : 0,001)
respectivement. Ceci suggère que PQ régulent positivement l'expression de
molécules de signalisation apoptotique entrainant une augmentation de la mort
cellulaire. Le traitement combinant PQ et cisplatine n'a pas augmenté
significativement l'expressiona des caspases-3 ou -9 par rapport au cisplatine seul.
L'expression des caspases-8 était significativement augmenté avec le traitement
combinant PQ et cisplatine par un facteur 2,6 (p-value : 0,02) et 2,2 (p-value : 0,01)
pour les associations avec PQ1 et PQ7, respectivement. Il existe une
augmentation significative de l'apoptose dans les cellules traitées avec PQ7 par
rapport à celles traitées avec le cisplatine seul, mais la taille des tumeurs entre les
groupes ne sont pas significativement différentes.
Des protéines qui inhibent l'apoptose assurent la protection des cellules
tumorales contre des composés cytotoxiques. La survivine est un membre de la
famille des inhibiteurs de l'apoptose qui est exprimée au cours de l'embryogenèse
et dans les cellules tumorales en tant que protéine anti-apoptotique qui est
capable de réguler la mitose (281-283). La survivine est fortement exprimée dans
une variété de tumeurs et son expression est corrélée avec une rechute accélérée
et la résistance à la chimiothérapie (284). Les tumeurs de xénogreffe T47D ont été
isolées après le traitement pour déterminer l'expression de la survivine. Toutes les
187
tumeurs qui ont reçu le traitement montrent une coloration immunohistochimique
intense pour la survivine mais l'expression nétait pas uniforme dans le tissu
comme pour le contrôle (Fig. 47D). L'analyse par Western blot des tumeurs
indique que le traitement au cisplatine a réduit de manière significative
l'expression de la survivine par rapport au témoin 1,4 fois (p-value : 0,02 ; Fig.
48C). Le traitement PQ1 a augmenté l'expression de la survivine d'un facteur 2,1
(p-value : 0,04) par rapport au cisplatine. PQ7 a montré une augmentation d'un
facteur 0,36 dans l'expression de la survivine par rapport au témoin (p-value :
0,006) et une augmentation d'un facteur 2,25 par rapport au traitement au
cisplatine (p-value : 0,0045).
La prolifération cellulaire a été évaluée avec les biomarqueurs Ki-67 et
cycline D1. Ki- 67 se trouve dans les cellules se divisant rapidement et est utilisé
pour déterminer la vitesse de prolifération cellulaire. La cycline D1 est un
régulateur clé du cycle cellulaire dont la surexpression entraine une progression
rapide de la phase G1 à la phase S de la mitose (285). Toutes les tumeurs isolées
qui ont été traitées ont montré une diminution de l'expression de Ki- 67 par
immunohistochimie (Fig. 47D). Les tumeurs traitées ont moins de cellules
exprimant le Ki- 67 mais les cellules qui expriment cette protéine présentent une
régulation à la hausse par rapport au témoin. L'expression de la cycline D1 dans
les xénogreffes T47D a été significativement plus faible avec le traitement PQ par
rapport au contrôle par un facteur 1,5 (p-value : 0,0007) et 0,46 (p-value : 0,008)
pour PQ1 et PQ7 respectivement (Fig. 47D et 48C). Ceci indique que le traitement
PQ régule à la baisse l'expression de protéines de prolifération Ki-67 et cycline D1
dans les xénogreffes.
iii/ Étude histologique des organes métaboliques
L'examen histologique des reins et du foie chez des souris ayant subi une
xénogreffe n'a montré aucune différence significative de la morphologie en raison
du traitement reçu. Pour déterminer s'il y avait un changement dans l'expression
des protéines des organes métaboliques, une analyse par immunoblot et
immunohistochimie a été réalisée. Dans les reins, on a observé une augmentation
de l'expression de Cx43 et une diminution de l'expression de la survivine suite au
188
traitement PQ (Fig. 49A). L'expression des caspases-3 était augmentée après le
traitement par le cisplatine, ce qui n'est pas surprenant étant donné que la
néphrotoxicité est commune suite à un traitement au cisplatine. Le rein a montré
une diminution de l'expression des caspases 3 par traitement PQ1. Le foie a
montré une augmentation de l'expression de la caspase-3 par traitement par le
cisplatine (Fig. 49B), suggérant la possibilité d'une hépatotoxicité induite par le
cisplatine. Le traitement PQ en association avec le cisplatine a semblé diminuer
l'expression
des
caspases-3
comparativement
au
cisplatine
seul.
Une
augmentation supplémentaire dans l'expression de la survivine due au traitement
PQ a été observé mais pas de différence significative de l'expression des Cx43
dans le foie entre les différents groupes de traitement.
Les lymphokines induites par l'interféron-gamma (LIG) sont utilisées
comme biomarqueur pour la signalisation inflammatoire, ce qui indique la
cytotoxicité due au traitement. La libération accrue de chimiokines CXC cible les
lymphocytes T activés, ce qui provoque une augmentation des concentrations
intracellulaires d'ions de calcium et le chimiotactisme (286). Les reins isolés à
partir d'animaux traités au cisplatine ont montré une augmentation de l'expression
de LIG (Fig. 49A). Les associations de cisplatine et PQ ont montré moins de
coloration que le cisplatine seul alors que le traitement aux PQ montre de faibles
niveaux d'expression de LIG. Le foie a révélé un schéma de coloration similaire
pour l'expression de LIG avec chaque traitement (Fig. 49B). La diminution de
l'expression de LIG suggère que PQ peut fournir une protection contre la réponse
inflammatoire du traitement par le cisplatine. Pour déterminer si la GJIC normale
de divers organes a été potentiellement affectée par le traitement, l'expression de
Cx43 a été observée. L'utérus, le cœur et le cerveau n'ont montré aucun
changement dans l'expression de Cx43 avec aucun des traitements (Fig. 50). Il n'y
a pas d'effet délétère observable successif à l'augmentation de l'expression des
connexines dans les cellules du foie et des reins. D'autres études doivent être
menées pour déterminer les effets de cette réponse.
189
Fig. 49 : Immunohistochimie des organes métaboliques. MIG = monokine induced by IFN-gamma.
A. Reins. B. Foie. Organes prélevés après 7 injections intra-péritonéales. Magnification x60
190
Fig. 50 : Expression de la Cx43 dans des organes prélevés sur des souris nude après 7 injections
intra-péritonéales. Magnification x40
E/ Discussion
Dans cette étude, on a utilisé des xénogreffes de cellules T47D afin de
déterminer les effets du traitement combinant cisplatine et enhancers des
jonctions GAP, PQs, chez des souris porteuses de tumeurs. Les résultats ont
montré une diminution de la croissance tumorale avec le traitement PQ, à la fois
seuls et en association avec le cisplatine, par rapport au témoin au bout de sept
injections (Figure 46). L'association cisplatine et PQ1 a significativement réduit la
taille des tumeurs par rapport au cisplatine seul, ce qui prouve que PQ1 peut
augmenter l'efficacité des médicaments anti-néoplasiques dans ce modèle animal.
Auparavant, PQ7 a démontré sa capacité à augmenter la GJIC par une
augmentation de l'expression des connexines 43 (242). Ici, nous montrons une
expression accrue des connexines 43, 32 et 26, ce qui suggère une augmentation
subséquente de la communication cellule-cellule qui permettrait une circulation
plus efficace du cisplatine. L'expression des protéines dans les coupes de tissus
indique que la connexine 43 est régulée par le traitement PQ. Les résultats
confirment les données antérieures (287) : la cytotoxicité du cisplatine dépend de
la GJIC. Il existe une augmentation de la réponse médiée par le cisplatine avec
l'amélioration de la GJIC.
191
La diminution de la taille des tumeurs observée avec le traitement PQ peut
être attribuée à une augmentation de l'apoptose à la suite d'une régulation à la
hausse des caspases- 3, caspases-8 et caspases-9 (Figure 47B). L'analyse
Western blot a montré une augmentation significative de l'expression des
caspases-3 dans les tumeurs traitées au PQ1 par rapport au témoin (Figure 48).
Ces résultats suggèrent que PQ1 et PQ7 sont des agents anticancéreux. Le
traitement au cisplatine n'a pas réguleé à la hausse l'expression des caspases-8
dans la mesure où l'apoptose induite par le cisplatine est régulée par les
caspases-9 (288). De plus, l'expression des caspases n'a pas été diminuée suite
au traitement au cisplatine, ce qui indique qu'il n'y a pas de résistance au
cisplatine observée au sein des tumeurs induites par xénogreffes de cellules T47D.
L'expression des caspases-8 dans les tumeurs T47D de souris traitées au PQ
montre une augmentation de l'apoptose par induction des voies de signalisation
des caspases 8 et 9 par rapport au cisplatine et au contrôle.
L'apoptose est reconnue comme l’un des principaux modes d'induction de
mort cellulaire par le cisplatine. À partir des résultats histologiques, on observe
une augmentation significative de l'apoptose dans les cellules traitées aux PQ par
rapport à celles traitées avec le cisplatine seul. Les tailles des tumeurs traitées au
cisplatine seul, PQ7 seul et l'association cisplatine et PQ7 ne sont pas
significativement différentes en dépit des différences dans l'expression des
caspases. Le processus d'apoptose produit plusieurs populations distinctes de
cellules à différents stades : du stade précoce au stade de nécrose secondaire
(289, 290). Par conséquent, la différence de taille des tumeurs peut être dûe à une
évacuationt insuffisante au cours de la période de 14 jours. Il a été démontré
précédemment que les jonctions GAP induisaient une mort cellulaire synchrone
des cellules couplées (291), ce qui suggère que les PQ affectent la mort cellulaire
par augmentation de l'expression des connexines et, indirectement, par induction
des deux voies de l'apoptose par le biais d'une augmentation de l'expression des
caspases.
L'analyse Western blot a montré une expression fortement variable des
protéines avec des homogénats d'organes entiers, probablement en raison de la
présence de plusieurs types de tissus dans chaque organe. Kadle et al. (292) ont
montré que les différentes formes de Cx43 ont une distribution tissu-spécifique, ce
192
qui suggère des différences importantes dans l'expression des protéines à 'échelle
des tissus. Plus de données sur la distribution tissu-spécifique de protéines, en
particulier des connexines, sont nécessaires pour déterminer avec précision les
effets de l'utilisation d'un enhancer des jonctions GAP.
Le traitement associant cisplatine et PQ n'était pas significativement
différent des PQ seules. Wang et al. (287) ont démontré que des concentrations
élevées de cisplatine inhibent fortement la GJIC par des interactions directes avec
les connexines et par une réduction indirecte de l'expression des connexines. Le
cisplatine peut donc agir comme un compétiteur des enhancers des jonctions GAP.
Il est possible que PQ7 n'ait pas augmenté de manière significative l'efficacité du
cisplatine dans le traitement combinatoire en raison de la compétition directe entre
les composés lorsqu'ils ciblent les jonctions communicantes. Le cisplatine a
montré une inhibition pour les hémicanaux formés d'hétéromères de façon
concentration dépendante (287), ce qui est supporté par les données
immunohistochimiques et immunoblot des Cx32 et Cx26 (diminution de
l'expression). Le cisplatine induit un ''signal de mort'' transmis aux cellules voisines
via GJIC (274). L'amélioration de la GJIC peut permettre la transmission de ce
"signal de mort" plus efficacement entre les cellules. Peterson - Roth et al. (293)
ont montré que le niveau de Cx43 exprimées dans une cellule cancéreuse module
la réponse cellule-cellule médiée par le cisplatine. La surexpression et l'activation
de la tyrosine kinase src sont observées en clinique dans de nombreux types de
cancer traités au cisplatine (294-296). Les oncoprotéines telles que src,
promeuvent la croissance et la survie cellulaire lors de l'exposition à des agents
cytotoxiques (297-299), protégeant ainsi les cellules cancéreuses des agents de
chimiothérapie. Le cisplatine induit spécifiquement Src à phosphoryler les résidus
tyrosines des Cx43, diminuee la GJIC, et augmenter la survie des cellules ;
élevant ainsi la survie des cellules voisines en perturbant la transmission du
"signal de mort" via la GJIC (293). L'amélioration de la GJIC avec les PQ peut
contrer les effets de src dans les cellules cancéreuses at ainsi augmenter
l'efficacité du cisplatine en améliorant la transmission du "signal de mort". Il est
largement accepté que les cellules cancéreuses sont déficientes en GJIC et/ou
connexines et le fait que le cisplatine inhibe la GJIC peut contribuer au
développement de tumeurs résistantes au cisplatine. Le développement de
193
médicaments et de méthodes qui peuvent améliorer ou restaurer la GJIC peut être
une nouvelle façon efficace pour améliorer les méthodes de chimiothérapie et de
radiothérapie, également dépendante de la GJIC (291).
L'insuffisance rénale chez les patients atteints de cancer est un problème
commun. La néphrotoxicité du cisplatine est clairement dose-dépendante et
augmente avec la fréquence d'administration et la dose cumulative (300).
L'augmentation de la communication cellule-cellule présentée par les cellules
tumorales est observée dans le rein et le foie mais pas dans les autres organes
vitaux. Il n'y a pas d'anomalie morphologique ou moléculaire observabls en raison
de l'augmentation de l'expression des connexines. Le traitement au cisplatine seul
induit une augmentation des caspases et de l'expression des LIG, ce qui n'est pas
le cas du traitement aux PQ (Figure 50). Le traitement combinatoire réalisé dans
cette étude montre que les PQ peuvent être utilisées pour diminuer la cytotoxicité
du cisplatine. Ceci fournit la possibilité d'un nouveau traitement combinatoire
contre le cancer du sein utilisant du cisplatine à une dose réduite pour éviter la
toxicité rénale. Les données de cette étude conduisent à l'idée que les PQ, à des
concentrations inférieures à celles requises pour des effets anticancéreux,
peuvent améliorer l'efficacité des agents de chimiothérapie, permettant l'utilisation
de concentrations plus faibles de médicament, ce qui diminue l'étendue des effets
secondaires néfastes en raison de la cytotoxicité des composés.
Les enhancers des jonctions GAP s'avèrent accélérer la mort cellulaire par
apoptose dans les cellules tumorales du cancer du sein tout en augmentant
l'expression des connexines. Ceci est prometteur pour l'utilisation des PQs pour le
transfert d'effets toxiques médié par les jonctions GAP. La diminution de la
distribution de la survivine dans les cellules tumorales traitées aux PQs indique
aussi un bon pronostic pour les patients après le traitement dans la mesure où la
survivine est fortement exprimée dans une gamme de tumeurs humaines et son
expression est directement corrélée avec, à la fois une rechute accélérée et une
résistance à la chimiothérapie (284). Les études futures se concentreront sur la
potentialisation d'autres médicaments antinéoplasiques grâce à l'amélioration de
l'activité des jonctions GAP, ainsi que sur l'allongement de la période de traitement
à 21 ou 28 jours et l'observation d'une potentielle réapparition de tumeurs après
rémission.
194
L'effet suppresseur de croissance des PQs a déjà été établi dans plusieurs
lignées cellulaires de cancer du sein (202, 242). Les effets antitumoraux des PQs
sur des xénogreffes de cancer du sein en association avec des agents
antinéoplasiques chez des souris nude montrent des résultats encourageants,
démontrant que les PQs seules peuvent atténuer la croissance des tumeurs.
L'augmentation de l'efficacité du cisplatine par les PQs n'est pas additive en raison
de l'effet significatif des PQs sur la croissance de la tumeur. Il est intéressant de
noter que le cisplatine diminue la communication cellulaire pour antagoniser
l'expression des connexines et les PQs. Le traitement combinant PQs et
médicaments antinéoplasiques est un traitement prometteur contre le cancer du
sein, qui montre que l'efficacité de composés anti-néoplasiques peut être accrue
par la stimulation des jonctions communicantes. Les résultast de notre étude ont
introduits une nouvelle classe de médicaments anticancéreux, améliorant le
traitement actuel du cancer du sein.
195
196
V/ Traitement combinatoire avec l'activateur des jonctions
GAP et le tamoxifène dans des cellules de cancer du sein
Traduit de l'anglais Shishido SN, Nguyen TA (301)
A/ Résumé
Le tamoxifène est un médicament de choix pour les patients atteints de
tumeurs du sein répondant au système endocrinien. Cependant, la résistance au
tamoxifène est devenue une préoccupation majeure pour le traitement du cancer
du sein. Des thérapies combinant le tamoxifène et différents médicaments sont
fréquemment étudiées. Dans cette étude, nous avons testé l'efficacité de
quinoléines substituées (nom de code = PQ1, un activateur des jonctions GAP) en
association avec le tamoxifène dans les cellules T47D. Un test de croissance
cellulaire a été réalisé en utilisant de la gélose molle pour mesurer la croissance
des colonies, tandis que la prolifération cellulaire a été mesurée par le test MTT
dans les cellules T47D. Les niveaux de Ki67, survivine et BAX ont été mesurés en
utilisant la microscopie confocale ainsi qu'une analyse western blot. Le marquage
au bromodéoxyuridine triphosphate pour visualiser l'apoptose a également été
examiné dans le traitement des cellules T47D. Nous avons observé une
diminution de 55% de la croissance des colonies en présence de la combinaison
de tamoxifène et PQ1, alors que le tamoxifène seul avait peu d'effet. Une
combinaison de 10 umol / L de tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L de PQ1 a abouti
à une viabilité cellulaire de seulement 16 % par rapport aux témoins à 48 h dans
les cellules T47D par le test MTT. Nous avons constaté une augmentation
significative de la protéine BAX à 1h en présence de 500 nmol / L de PQ1 seule,
10 umol / L de tamoxifène seul, et la combinaison de PQ1 et de tamoxifène. Une
augmentation d'un facteur deux de la caspase active 3 a été observée en
présence d'un traitement combinant 10 umol / L tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L
de PQ1. En outre, l'analyse par cytométrie de flux a montré une augmentation de
50% du nombre de cellules apoptotiques en présence de la combinaison de
tamoxifène et PQ1 par rapport au contrôle. Par ailleurs, les résultats montrent que
le traitement combinant tamoxifène et PQ1 réduit de manière significative
197
l'expression de la survivine dans les cellules T47D. Des études d'inhibiteurs des
jonctions GAP avec le carbenexolone ont également été réalisées qui confirme le
rôle des jonctions lacunaires dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. Le
traitement associant tamoxifène et PQ1 présente une augmentation significative
de l'expression de la protéine BAX, de l'activation de la caspase 3 et de la
fragmentation de l'ADN. Le tamoxifène seul et en combinaison avec PQ1 a montré
une diminution de l'expression de la survivine, alors que PQ1 seule s'est révélée
être indépendante de la voie médiée par la survivine. Ceci suggère que
l'augmentation de l'activité des jonctions lacunaires peut potentialiser l'effet du
tamoxifène. Le traitement associant tamoxifène et PQ1 a également montré une
diminution significative de la viabilité cellulaire par rapport à un traitement au
tamoxifène seul. L'inhibiteur des jonctions GAP carbenexolone s'est avéré
augmenter la prolifération cellulaire par augmentation de l'expression de la cycline
D1, test MTT et expression du facteur Ki67. Il a en outre diminué la mort cellulaire.
Cette étude montre pour la première fois que le traitement combinatoire de
tamoxifène et PQ1 (un activateur des jonctions GAP) peut être utilisé pour
potentialiser l'apoptose de cellules de cancer du sein humain T47D. Ainsi, un
activateur des jonctions lacunaires, PQ1, pourrait modifier soit la durée soit la
dose de tamoxifène utilisées cliniquement chez les patients atteints de cancer du
sein.
B/ Introduction
Le tamoxifène est l'un des agents de chimiothérapie les plus fréquemment
utilisés avec succès pour le traitement des cancers du sein répondant au système
endocrinien (302). Le tamoxifène est mieux connu comme un modulateur des
récepteurs aux œstrogènes en raison de ses multiples activités (303). Chez la
plupart des patients, les cancers qui répondent initialement au tamoxifène
acquièrent progressivement une résistance au traitement et nécessitent des
thérapies systémiques alternatives (304). Malgré l'utilisation extensive de ce
médicament, les mécanismes précis qui confèrent une résistance restent
inconnus. Un certain nombre de mécanismes ont été proposés pour contrôler la
résistance anti-oestrogène des cancers du sein positifs aux récepteurs aux
198
œstrogènes (ER +) (305) mais de nombreux détails de ces mécanismes
continuent de ne pas être clairs (306). Il s'agit notamment de changements dans
l'immunité de l'hôte, du système endocrinien de l'hôte, ou la pharmacocinétique de
l’anti-œstrogène (302). Dans le cadre du système endocrinien de l'hôte, certaines
tumeurs deviennent spontanément hormone indépendantes malgré la présence
de ER; dans d'autres, les tumeurs qui sont d'abord ER + deviennent ER- au cours
du temps (307, 308). De nombreux essais ont été effectués en utilisant le
traitement combinant des molécules de chimiothérapie et le tamoxifène, mais les
résultats ont été controversés (309-314).
Les jonctions lacunaires sont les canaux intercellulaires de la membrane
plasmique qui permettent le passage de petites molécules d'une cellule à l'autre.
Le flux de molécules à travers les canaux est appelé communication intercellulaire
au travers des jonctions GAP (GJIC) (315). La GJIC existe dans la plupart des
cellules de mammifère et est impliquée dans la croissance, la différenciation et
l'homéostasie cellulaires. Elle joue également un rôle clef dans la survenue de la
mort cellulaire par apoptose (316). Pendant des décennies, il a été montré que les
cellules en mitose dans le cycle cellulaire présentent une GJIC diminuée (317319). Par conséquent, elle conduit à un état où la communication entre les cellules
est négativement liée à la capacité de la cellule de croître. En raison de son effet
sur la croissance cellulaire, de nombreuses études ont été menées pour trouver
une corrélation entre GJIC et cancer. De nombreuses études in vitro et in vivo ont
montré que les agents favorisant les tumeurs conduisent à une diminution de la
GJIC (320-325). L'analyse des protéines et des l'ARNm a montré une diminution
de l'expression des connexines dans les lésions prénéoplasiques, ainsi que dans
les carcinomes hépatocellulaires (326, 327).
Dans une étude précédente, nous avons présenté un nouvel activateur des
jonctions lacunaires, une quinoléine substituée (nom de code = PQ1). Nous avons
montré que PQ1 (200 nmol / L) provoquait une augmentation de 70% de la GJIC
dans les cellules T47D ; cependant, il n'y avait aucun effet du traitement PQ1 sur
la GJIC des cellules épithéliales mammaires normales. En plus d'une
augmentation de la GJIC, 80 à 95% d'atténuation de la croissance a été observée
par le traitement PQ1 dans un essai de croissance des colonies. En outre, on a
observé une augmentation de la caspase 3 dans les cellules traitées avec PQ1,
199
suggérant une possible implication de l'apoptose ainsi que l'augmentation de
l'activité des jonctions GAP (202).
Les effets antitumoraux du tamoxifène sont présumés être dus à son
activité anti-oestrogénique, médiée par l'inhibition compétitive de la liaison des
œstrogènes aux ER et ensuite l'activation de l'apoptose (328, 329). L'inhibition de
l'expression de gènes régulés par les œstrogènes entraîne une diminution de la
croissance et de la prolifération cellulaire (330). Comme les PQ1 ont également
montré une augmentation de la caspase-3 et une diminution de la croissance des
tumeurs du sein, nous émettons l'hypothèse que le traitement combinant
tamoxifène et activateur des jonctions lacunaires, PQ1, pourrait encore améliorer
l'effet apoptotique dans les cellules de cancer du sein humaines T47D. Le but de
cette étude était d'examiner l'effet du traitement combinatoire de PQ1 et du
tamoxifène sur les cellules de cancer du sein T47D. Les résultats ont montré une
augmentation de la mort cellulaire T47D dans une thérapie combinatoire de
tamoxifène et PQ1. Une augmentation significative de la protéine BAX et de la
caspase 3 suivie par une augmentation de l'apoptose a été observée par
incorporation à différents temps de dosage de l’apoptose-bromodéoxyuridine
triphosphate (APO-BrdU) en présence de PQ1 et de tamoxifène. En outre, une
diminution de la croissance des colonies, de la viabilité cellulaire estimée par le
test au 3 - (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium bromure (MTT), et
une augmentation de la fragmentation de l'ADN a été observée lors du traitement
combinatoire de PQ1 et de tamoxifène. Nous avons également réalisé des études
portant sur les inhibiteurs en utilisant le carbenoxolone (CBX), un inhibiteur connu
des jonctions GAP (331), seul et en combinaison avec le tamoxifène. CBX (20
mmol/L) a entrainé une diminution significative des protéines Cx43, BAX et
caspase 3 et une augmentation significative de la cycline D1. Le test MTT a
montré une augmentation significative de cellules en prolifération. En outre,
l'expression du Ki67 a été augmentée en présence de la combinaison de CBX et
de tamoxifène. Le dosage de l'apoptose par Apo-BrdU a montré une diminution
significative de la mort cellulaire en présence du CBX (20 mmol / L) par rapport au
tamoxifène.
200
C/ Matériels et méthodes
i/ Lignées cellulaires et culture
La lignée cellulaire de cancer du sein humain T47D a été achetée chez
American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, Virginie, USA). Les cellules ont
été cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin
(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, Géorgie, États-Unis), 10% d'antibiotiqueantimycosique à 37°C avec 5% de CO2 dans des flacons de 75 cm2. Le citrate de
tamoxifène et carbenexolone ont été achetés chez Sigma (St. Louis, Missouri,
USA).
ii/ Morphologie cellulaire
Les cellules (5.000 cellules / mL) ont été ensemencées dans une plaque à
six puits et supplémentées avec 200 nmol / L de PQ1 seul, 10 mmol / L de
tamoxifène seul, une combinaison de tamoxifène et PQ1 ou une combinaison
d'oestrogènes et de tamoxifène (10 nmol / L) pendant 1, 24, 48 et 72 h. Les
cellules ont été observées sous un microscope en utilisant un objectif � 40.
iii/ Croissance des colonies en utilisant de l'agar mou
Les cellules ont été traitées avec de l'éthanol, 200nmol / L de PQ1, 10
mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 200 nmol / L de PQ1 et 10 mmol /
L de tamoxifène pendant 7 jours. Des plaques de gélose de base sont préparées,
contenant 0,8 ou 0,4% de gélose dans du milieu RPMI. Les cellules (5 x 104
cellules / puits de 33 mm2) ont été mises en suspension dans 100 ml de milieu
RPMI avec 0,4% de gélose et étalées. Ces plaques ont été maintenues à 37°C
pendant 7 jours et examinées pour la présence de colonies. Des colonies
individuelles de 50 mm ou plus ont été examinés.
iv/ Test MTT
Le test au MTT a été réalisé avec des cultures de cellules dans une plaque
à 96 puits incubées avec 200 ou 500 nmol / L de PQ1, 10 mmol / L de tamoxifène
201
seul ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L de
PQ1 à 1, 48 et 72 h. Les études d'inhibiteurs des jonctions GAP en utilisant 20
mmol / L de CBX seul, 10 mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 10
mmol / L de tamoxifène et 20 mmol / L de CBX ont été effectuées à 72 h dans des
cellules T47D. La solution MTT a été métabolisée par les cellules (période
d'incubation) pendant 1h à 37°C. MTT est un sel de tétrazolium (jaune) clivé
cristaux de formazan par la succinate déshydrogénase. Dans les cellules viables,
plus de colorant formazan sera produit. Après solubilisation des cristaux de MTT
avec la solution de solubilisation 0,35 N HCl, le colorant a été mesuré par
spectrophotométrie à 540 nm avec soustraction de l'arrière-plan à 650 nm.
v/ Analyse Western blot
Les cellules ont été cultivées dans du RPMI supplémenté de sérum jusqu'à
ce qu'elles soient confluentes à 90% dans des flacons de 25 cm2. Les cellules ont
été incubées avec PQ1 seule, tamoxifène seul à 10 mmol / L ou une combinaison
de tamoxifène et PQ1 pendant 1, 48 ou 72 h. Pour les études d'inhibition des
jonctions GAP, les cellules ont été incubées avec 20 mmol / L de CBX seul, 10
mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 20
mmol / L de CBX pendant 72 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS
froid et récoltées en utilisant un tampon de lyse cellulaire (20 mmol / L de Tris pH
7,5, 0,5 mmol / L d'EDTA, 0,5 mmol / L d'EGTA, 0,5% de Triton X-100) avec une
des inhibiteurs de protéases à une dilution de 1:1000 (Sigma-Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA) pendant 10 minutes avant d'être incubées sur un agitateur pendant
30 minutes à 41°C. Les cellules ont été vortexées et centrifugées à 13000 rpm
pendant 30 minutes à 41°C. La concentration en protéines de tous les échantillons
a été estimée par la méthode de Bradford en utilisant un spectrophotomètre.
Quarante microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 10% et transférés sur membrane
de nitrocellulose (Midwest Scientific, St. Louis, Missouri, USA). La membrane de
nitrocellulose a été bloquée dans du lait à 5% pendant 1 h à température ambiante
et incubée avec des anticorps polyclonaux anti-Bcl2 de lapin (1 : 200), anti-BAX
de souris (1 : 200) ; (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, Californie, États-
202
Unis), un anticorps polyclonal de lapin anti-caspase 3 (1: 500 ; BD Pharmingen,
San Diego, Californie, Etats-Unis), un anticorps polyclonal de lapin anti-survivine
(1: 1000 ; Novus Biologicals, Colorado, USA), un anticorps anti-cycline D1 de lapin
(1 : 1000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, Massa- chusetts, USA) et un
anticorps polyclonal de lapin anti-actine (1 : 1000 ; Sigma-Aldrich). Les transferts
Western ont été détectés par chimioluminescence (Amersham, Pittsburgh,
Pennsylvanie, États-Unis).
vi/ Immunofluorescence et microscopie confocale
Les cellules ont été cultivées sur lamelles dans des plaques à six puits
dans du milieu RPMI. Les cellules ont été traitées avec PQ1 seule, tamoxifène
seul ou une combinaison de tamoxifène et de PQ1 pendant 1, 48 ou 72 h. Les
cellules ont également été incubées avec 20 mmol / L de CBX seul, 10 mmol / L
de tamoxifène ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 20 mmol / L
de CBX pendant 72 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldehyde à 2%
pendant 20 min et ensuite neutralisées avec 50 mmol / L de glycine pendant 5
min. Les cellules ont été lysées avec 0,1% de Triton X-100 pendant 10 min
supplémentaires. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été bloquées avec
2,5% de BSA dans du PBS pendant 2 h et ensuite incubées avec des anticorps
primaires de lapin anti-Ki67 (1: 250 ; Santa Cruz) et anti-BAX souris (1: 50 ; Santa
Cruz), anti-survivine de lapin (1 : 250 ; Novus Biologicals) pendant 15 h à 41°C.
Après cette étape, les cellules ont été incubées dans du 40-6-diamidino-2phenylindole (DAPI) pendant une minute et ensuite incubées avec des anticorps
secondaires anti-souris et anti-lapin Alexa fluor 488 et 568 (Molecular Probes,
Eugene, Oregon, États-Unis) pendant 4h à 41°C, respectivement. Les cellules ont
été analysées pour déterminer la morphologie nucléaire par coloration avec du
DAPI. Les échantillons ont été scellés et analysées en utilisant un microscope
confocal (Carl Zeiss LSM 510 META, Narashige, Minnesota, États-Unis).
vii/ Dosage de l'apoptose par cytométrie de flux
Les cellules ont été cultivées dans des flacons de 35 mm2 et ensuite le
milieu a été additionné de PQ1 seul, tamoxifène seul ou une combinaison de
203
tamoxifène et PQ1 pendant 1, 48 ou 72h. Les cellules ont été traitées à la trypsine
et colorées grâce au kit APO-BrdU TUNEL Assay (Molecular Probes # A23210,
Carlsbad, Californie, USA) selon le protocole du fabricant. La liaison APO-BrdU a
été analysée par cytométrie de flux en utilisant un système BD FACSCalibur (BD
Biosciences, San Jose, Californie, États-Unis) et les données obtenues ont été
analysées en utilisant le logiciel CellQuest (BD Biosciences). De l'iodure de
propidium a été utilisé pour distinguer les cellules nécrotiques des cellules
apoptotiques.
viii/ Analyse statistique
Le niveau de signification a été examiné pour une p-value inférieure à 0,05
à l'aide de l'analyse t-test de Student. Toutes les expériences ont été réalisées au
moins trois fois individuellement et sont présentées sous forme de moyenne ±
écart-type.
D/ Résultats et discussion
Le cancer du sein est la deuxième cause de décès par cancer chez les
femmes en Amérique du Nord. Le tamoxifène a été le seul agent de choix dans le
traitement des cas de cancer du sein hormono-sensible depuis 1971. Bien qu'il ait
été montré que le tamoxifène était 50% plus efficace que le placebo dans la
prévention de l'apparition du cancer du sein chez les populations à haut risque, le
risque de développer un cancer de l'utérus était augmenté de plus de 40% (332).
Le traitement au tamoxifène inclut l'utilisation de ce médicament pendant au moins
5 ans chez la plupart des patients. Le traitement à long terme au tamoxifène induit
une résistance, dont le mécanisme reste encore à élucider (303). Par conséquent,
il est nécessaire d'élaborer des modalités efficaces pour améliorer l'efficacité du
tamoxifène. Dans cette étude, nous avons étudié l'effet combinatoire de la PQ1 et
du tamoxifène. PQ1 a été montrée être un activateur des jonctions intercellulaires
et induire la mort cellulaire à la fois dans les traitements in vitro et in vivo (202). Le
tamoxifène a également montré une induction de la mort cellulaire par apoptose in
vitro
et in vivo (333-335). Cet effet était concentration-dépendant. A des
concentrations nanomolaires (nmol / L) de tamoxifène, seul un arrêt de croissance
204
se produit, alors qu'à des concentrations micromolaires (umol / L), une induction
de la mort cellulaire a été observée dans des cultures cellulaires (332). La plupart
des patients atteints de cancer du sein reçoivent une dose quotidienne de 20-40
ug de tamoxifène (336, 337). Il est difficile de traduire directement la dose de
tamoxifène depuis un contexte clinique vers des études in vitro ou in vivo.
Cependant, Mandlekar et Kong (332) ont montré une CI50 de 9-10 umol / L dans
les lignées cellulaires de cancer du sein BT-20, MCF-7, et MDA-231. Les résultats
d'études cliniques ont montré qu'à l'état d'équilibre les concentrations de
tamoxifène dans le plasma pouvaient atteindre jusqu'à 1 umol / L et les
concentrations moyennes intratumorales étaient encore plus élevées, environ 4
umol / L. Nous avons trouvé différentes concentrations (1-20 umol / L) de
tamoxifène être utilisées dans différents tests sur cellules (338-340). Sur la base
de ces études, nous avons choisi d'observer l'effet de 10 umol / L de tamoxifène
dans des cellules de cancer du sein T47D. La PQ1 et le tamoxifène affectent la
morphologie cellulaire, la prolifération et la croissance des colonies des cellules
T47D.
Notre étude antérieure a montré une augmentation considérable de la GJIC
et l'activation des caspases 3 en présence de PQ1 dans les cellules T47D (202).
La morphologie cellulaire était également affectée en présence de 200 nmol / L de
PQ1 à 24, 48 et 72 h, avec des cellules qui se détachaient de la plaque de culture.
En présence de 10 umol / L de tamoxifène pendant 24, 48 et 72 h, les cellules ont
montré un changement marqué dans la morphologie, incluant contraction, forme
irrégulière, et certaines cellules flottantes dans le milieu de culture (Fig. 51A-C).
Cependant, aucun effet sur la morphologie cellulaire n'a été observé à 1 h en
présence de 200 à 500 nmol / L de PQ1 seul et en combinaison avec 10 umol / L
de tamoxifène (données non présentées). La combinaison de tamoxifène et PQ1 a
également montré une perte complète de la structure des cellules. Les cellules ont
partiellement retrouvé leur structure en présence de 10 umol / L de tamoxifène et
10 nmol / L de 17b-oestradiol. Ces résultats suggèrent que le traitement
combinatoire de tamoxifène et PQ1 peut potentialiser l'effet du tamoxifène.
205
Fig. 51 : Effet des PQ1 sur la morphologie des cellules T47D. PQ1 200 nmol/L, tamoxifène 10
µmol/L, œstradiol 10 nmol/L. A/ 24h de traitement B/ 48h de traitement C/ 72h de traitement
L'essai de croissance de colonies mesure la formation de colonies dans la
gélose molle, qui est utilisée pour mesurer l'indépendance d'ancrage des cellules
(une caractéristique des cellules cancéreuses). Nous avons observé une
diminution de 55% de la croissance des colonies en présence de la combinaison
de tamoxifène et de PQ1 (Fig. 52). Ceci suggère que le traitement combinatoire
de tamoxifène et PQ1 est suffisant pour provoquer une diminution significative de
la croissance des colonies après une incubation de 7 jours par rapport aux
traitements au tamoxifène ou PQ1 seuls. Le traitement à l'éthanol, un solvant
témoin, ne montre aucun effet sur la croissance des colonies de cellules T47D. Le
test MTT avec 200 et 500 nmol / L de PQ1 a montré une viabilité cellulaire à 48
heures de 60 et 50%, respectivement (Fig. 53). Le tamoxifène (10 mmol / L) a
montré 30% de viabilité cellulaire, tandis que la combinaison de tamoxifène et
PQ1 a abouti à une viabilité des cellules à 48 heures de 16% par rapport aux
témoins dans des cellules T47D. L'utilisation combinée du tamoxifène (10 mmol /
206
L) et PQ1 (200 et 500 nmol / L) conduit à une diminution de la croissance
cellulaire de 50% par rapport au traitement au tamoxifène seul à 48 h. A 72 h, le
traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1 (200 et 500nmol / L) a donné lieu à
20 et 13% de viabilité cellulaire, respectivement. Ainsi, 48 h suffisent pour
provoquer une diminution significative de la viabilité cellulaire avec le traitement
combinant tamoxifène et PQ1. Fait intéressant, la viabilité cellulaire n'a été
affectée par aucune des deux concentrations de PQ1, 200 ou 500 nmol / L, à 1 h ;
cependant, le traitement au tamoxifène seul a entraîné une diminution de 28% de
la croissance cellulaire. La viabilité cellulaire, mesurée par le test MTT, a été
grandement affectée après 48 h par rapport à 72 h en présence de PQ1 seule ou
de tamoxifène seul ou de leur combinaison.
Fig. 52 : Réduction de croissance des
colonies de cellules T47D (par rapport au
control). PQ1 : 200 nmol/L, tamoxifène : 10
µmol/L. Apres 7 jours sur agar mou, seules
les colonies de plus de 50 µm ont été
comptées. * = p<0,05
Fig. 53 : Évaluation
de la prolifération
des cellules T47D
au moyen du test
MTT, en présence
de PQ1 (200 ou
500 nmol/L) et/ou
de tamoxifène (10
µmol/L). * = p <
0.005 à 48 h et ** =
p < 0.05 à 72 h
(dans la comparaison du traitement au tamoxifène seul ou en association avec PQ1)
207
Fig. 54 : Expression du marqueur de
division
cellulaire
utilisés
comme
Ki-67.
Œstrogènes
antagonistes
du
tamoxifène
L'expression des protéines
est mesurée dans certains cas de
cancer du sein symptomatique
afin
d'identifier
les
facteurs
pronostic qui sont associés avec
le comportement biologique des
tumeurs individuelles. Ki67 est
une protéine nucléaire largement
utilisée comme marqueur de la
prolifération
cellulaire.
Le
tamoxifène a été montré entrainer
une diminution de l'expression de
Ki67 chez les patients atteints de
cancer du sein et dans des lignées
cellulaires de cancer du sein
(341). Par conséquent, l'effet du
traitement
combinatoire
tamoxifène
et
PQ1
sur
de
la
coloration Ki67 dans les cellules T47D a été mesurée. La coloration Ki67 a été
réduite en présence de 200 nmol / L de PQ1 à 24, 48 et 72 heures (Fig. 54). En
présence de tamoxifène seul, aucune coloration Ki67 n'a été observée à 24, 48 et
72h. Le traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1 a également montré une
absence de coloration Ki67, tandis que le traitement combinatoire d'œstrogènes et
de tamoxifène a montré une expression de Ki67, ce qui suggère que les
œstrogènes peuvent partiellement antagoniser l'effet du tamoxifène. Ces résultats
suggèrent que PQ1 a un effet sur la coloration Ki67 et il ne contrecarre pas l'effet
du tamoxifène lorsqu'il est utilisé en combinaison, alors que les œstrogènes
peuvent inverser l'effet du tamoxifène. En outre, PQ1 a clairement un effet sur la
prolifération des cellules T47D.
208
i/ Effet des PQ1 et du tamoxifène sur des protéines apoptotiques
La mort cellulaire programmée ou apoptose, a lieu soit par l'activation des
récepteurs de mort soit en raison d'une rupture de l'intégrité de la membrane
mitochondriale. Le cytochrome c, un acteur clef dans l'induction de la cascade de
l'apoptose, est libéré de l'intérieur des mitochondries dans le cytosol de la cellule
par l'interaction de deux protéines importantes impliquées dans l'apoptose, BAX et
Bcl2. En fonction des signaux apoptotiques, la protéine pro-apoptotique BAX est
activée, tandis que les protéines anti-apoptotiques, tels que Bcl2, empêchent
l'apoptose par hétérodimérisation avec BAX (342, 343). Globalement, le ratio de
BAX et Bcl2 détermine l'intégrité de la membrane mitochondriale. Dans cette
étude, nous avons réalisé une étude temps-dépendante par traitement des
cellules avec PQ1 et tamoxifène seuls et en combinaison pendant 1, 48 et 72 h.
Nous avons constaté une augmentation significative de la protéine BAX à 1 h en
présence de 500 nmol / L de PQ1 seul, tamoxifène seul, et d'une combinaison de
tamoxifène et PQ1 (Fig. 55A). Nous avons également observé une diminution de
Bcl2 en présence de tamoxifène seul et de tamoxifène en combinaison avec PQ1
à 1 h. À 48 h, une diminution significative a été observée dans l'expression de
Bcl2 avec 500 nmol / L de PQ1 seul et avec une combinaison de tamoxifène et
PQ1. En outre, il y avait une augmentation significative de la protéine BAX dans le
traitement combinatoire utilisant PQ1 (200 et 500 nmol / L) et tamoxifène à 48 h.
Zhang et al. (338) ont montré une diminution de Bcl2, mais aucun effet sur BAX
dans les cellules MCF-7 en présence de 10 mmol / L de tamoxifène à 72 h. Nous
avons constaté qu'à 72 h, les protéines BAX et Bcl2 ont été considérablement
augmentée et diminuée, respectivement, en présence de tamoxifène et de
l'association de tamoxifène et de 200 ou 500 nmol / L de PQ1. Ces résultats
indiquent
que
le
traitement
combinatoire
non
seulement
augmente
significativement BAX mais également diminue Bcl2. Le rapport de Bcl2 et BAX
est diminué de manière significative à une heure en présence de tamoxifène seul
et PQ1 seule ou en combinaison. Par conséquent, il indique que PQ1 a une action
rapide sur l'activation de Bax. L'effet sur la réduction de l'expression de Bcl2 est
relativement lent, restant constante à 48h avant d'augmenter de nouveau à 72 h.
209
Fig. 55 : Expression des protéines impliquées dans les voies de l'apoptose.
Après
l'activation
de
Bax,
une
cascade
d'événements
conduits
principalement par l'activation des caspases protéolytiques résultant dans le
traitement des protéines intracellulaires de structure et des enzymes de régulation,
ce qui aboutit à la mort cellulaire par apoptose (344). L'activation de la caspase 3,
une caspase exécutive, est considérée être l'une des dernières étapes dans la
voie de la cascade de l'apoptose (339). Par conséquent, nous avons examiné
l'effet de la combinaison de tamoxifène et PQ1 sur l'activation de la caspase 3.
Fait intéressant, nous n'avons trouvé aucune activation de la caspase 3 à 1 h (Fig.
55B). Cependant, il y avait une augmentation significative de la caspase 3 à 48 et
72 h en présence de PQ1 seule, de tamoxifène seul, et de la combinaison de
tamoxifène et PQ1, ce qui indique que l'activation de la caspase 3 prend du temps
et persiste au moins jusqu'à 72h. Une augmentation de 50% de la caspase active
3 a été observée avec 200 et 500 nmol / L de PQ1 à 72 h. Une augmentation d'un
210
facteur deux a été observée de caspase active 3 en présence d'un traitement
combinatoire de tamoxifène et PQ1. Un histogramme des trois expériences avec ±
SD (standard deviation) et la signification statistique p <0,05 pour 48h et pour 72h
pour la caspase 3 fournit des informations plus détaillées (Fig. 55B). L'analyse
densitométrique montre que la caspase 3 augmente de façon significative à 48 et
72 h en présence de 200 et 500nmol / L de PQ1 seule et en combinaison avec le
tamoxifène, par rapport à leurs témoins respectifs. Ceci suggère que la
combinaison de tamoxifène et de PQ1 aboutissent à une mort cellulaire accrue
des cellules T47D.
Dans cette étude, nous avons également observé l'effet du tamoxifène et
de la PQ1 sur un inhibiteur des protéines de l'apoptose, la survivine (un groupe de
protéines impliquées dans l'inhibition des caspases 3, 7 et 9) (282, 345).
L'augmentation de l'expression de la survivine est censée protéger les cellules
contre une possible induction de l'apoptose par défaut dans le cas de mitose
aberrante (346). De nombreuses études sur des échantillons cliniques ont montré
que l'expression de la survivine est invariablement régulée à la hausse dans les
cancers humains et est associée à la résistance à la chimio-thérapie liée à un
mauvais pronostic, ce qui suggère que la survivine module la survie des cellules
cancéreuses (347). Gazzaniga et al. (345) ont trouvé que la survivine ne peut pas
être utilisée comme un facteur pronostique de la rechute d'un cancer superficiel de
la vessie. Cependant, dans des modèles précliniques de tumeurs de la vessie,
l'inhibition de l'expression et / ou de la fonction de la survivine a été montré
empêcher la prolifération des cellules tumorales, et induire l'apoptose spontanée
ou induite par la chimiothérapie de façon marquée (348). Nous n'avons trouvé
aucun effet sur la survivine à 1h (Fig. 55C) ; cependant, à 48 et 72 h, nous avons
trouvé une importante diminution de l'expression de la survivine dans le traitement
utilisant le tamoxifène seul et le traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1
(200 ou 500 nmol / L). Ceci suggère que le tamoxifène diminue l'expression de la
survivine, alors que PQ1 seule n'a pas d'effet sur l'expression de la survivine dans
les cellules T47D jusqu'à 72 h. En outre, ces données ont été confirmées par
microscopie confocale avec laquelle a été détectée une diminution des protéines
survivine et BAX (Fig. 56A et B). Les résultats de la microscopie confocale ont
montré l'absence de survivine dans les cellules traitées au tamoxifène à 48 et 72h.
211
Fig. 56 : Expression des protéines survivine et BAX observée par immunofluorescence. A/
survivine B/ BAX
ii/ Mesure de l'apoptose par la morphologie nucléaire et cytométrie de flux
L'effet du tamoxifène et de PQ1 sur la coloration nucléaire a été mesuré en
utilisant
le
DAPI.
L'apoptose
est
caractérisée
par
des
changements
morphologiques tels que le rétrécissement de la taille de la cellule, la
condensation de la chromatine et la désintégration de la cellule en petits
fragments (corps apoptotiques) (349). Dans cette étude, nous avons trouvé plus
de cellules subissant le processus d'apoptose, ce qui se présentait par
212
bourgeonnement et fragmentation en présence de PQ1 et de tamoxifène seuls et
en combinaison (données non présentées). Le kit de dosage TUNEL APO-BrdU a
été utilisé pour détecter la fragmentation de l'ADN des cellules apoptotiques. Au
cours de l'apoptose, la fragmentation de l'ADN expose les groupes 30-OH
auxquels
la
désoxy-nucléotidyl
transférase
peut
ajouter
des
désoxyribonucléotides. La 5-Bromo-20-50 désoxyuridine-triphosphate est un
analogue de la désoxythymidine, qui est incorporé au niveau du groupe 30-OH.
Nous avons constaté une augmentation de l'incorporation de la 5-bromo-20-50
désoxyuridine-triphosphate en présence de PQ1 et de tamoxifène seuls et en
combinaison à 48 et 72 h (Fig. 57). Une augmentation de 50% de cellules
apoptotiques a été observée à 48 et 72 h, en présence d'un traitement
combinatoire de tamoxifène et PQ1. Il n'y avait pas d'effet sur l'apoptose du
tamoxifène ou de PQ1 à 1h. Bien que la cascade de l'apoptose commence en une
heure, indiquée par une augmentation de BAX et une diminution de Bcl2,
l'activation des caspases et les dommages de l'ADN requièrent plus d'une heure.
Les résultats indiquent que la combinaison de PQ1 (200 et 500 nmol / L) et de
tamoxifène (10 mmol / L) entraîne une augmentation de l'apoptose par rapport à
des traitements individuels.
Fig.
57
:
Analyse
des
cellules
apoptotiques par marquage APO-BrdU et
flow cytométrie. Green = 72h
213
iii/ Effet de l'inhibiteur des jonctions GAP, CBX, sur les protéines Cx43, BAX,
caspase 3 et cycline D1
CBX a été utilisé comme inhibiteur non spécifique des jonctions GAP dans
de nombreuses études. Jusqu'à présent, dans nos études, nous avons conclu que
PQ1 était un activateur des jonctions GAP, qui, en présence de tamoxifène,
diminue la prolifération cellulaire et augmente la mort cellulaire. Des expériences
utilisant un inhibiteur des jonctions lacunaires peuvent en outre confirmer le rôle
important des jonctions lacunaires dans la prolifération cellulaire. Par conséquent,
nous avons mené des études utilisant 20 mmol / L de CBX seul, et 20 mmol / L de
CBX en présence de 10 mmol / L de tamoxifène. Nous avons effectué des études
Western blot, de morphologie cellulaire et de dosage MTT à différent temps et on
a trouvé que 20 mmol / L de CBX à 72 h étaient suffisants pour diminuer la Cx43,
sans provoquer de changement dans la morphologie des cellules et sans être
cytotoxique pour les cellules T47D (données non présentées). Nous avons
effectué un Western blot pour les protéines Cx43, BAX, caspase 3 et cycline D1.
Nous avons observé que CBX (20 mmol / L) dans les cellules T47D diminuait
l'expression des protéines Cx43, BAX, et caspase 3 et augmentait l'expression de
la cycline D1, alors que la combinaison de tamoxifène et CBX diminuait
l'expression de la caspase 3 et de la cycline D1 à 72h (Fig. 58A). La cycline D1 est
un proto-oncogène et un régulateur important de la transition de la phase G1 à la
phase S dans de nombreux différents types de tissus. La concentration de la
protéine Cycline D1 augmente à mesure que la cellule entre dans la phase G1 et
la transition des phases G1 à S (350). Nos données suggèrent que l'inhibition des
jonctions GAP par CBX provoque une plus importante entrée de cellules dans le
cycle cellulaire et augmente la prolifération cellulaire, ce qui setraduit par une
augmentation significative de l'expression de la cycline D1. Cet effet a été observé
en présence de la combinaison de CBX et de tamoxifène, ce qui suggère en outre
que l'inhibition des jonctions GAP diminue l'effet du tamoxifène sur la prolifération
cellulaire. CBX seul a diminué significativement l'expression des protéines BAX et
caspase 3, alors que la combinaison de CBX et de tamoxifène n'a pas eu d'effet
significatif sur BAX et caspase 3. Cela pourrait être dû soit à un fort effet du
tamoxifène sur la mort cellulaire soit à une diminution de l'activité du CBX.
214
Fig. 58 : Etude de l'inhibition des jonctions GAP en utilisant le CBX. A/ Western blot B/ Test MTT *
= p < 0.05 à 72 h en présence de CBX seul par rapport au contrôle et ** = p < 0.05 à 72 h en
présence de CBX et tamoxifène par rapport au tamoxifène seul C/ Expression de la protéine Ki-67
D/ Marquage APO-BrdU et analyse par flow cytométrie
iv/ Effet du CBX sur le test MTT, l'expression de la protéine Ki67 et le dosage de
l'apoptose par cytométrie de flux
Le test MTT a montré une augmentation de la prolifération cellulaire en
présence de CBX seul et de la combinaison de CBX et de tamoxifène à 72 h (Fig.
58C). Cependant, le tamoxifène seul a montré une diminution significative de la
prolifération cellulaire. Ceci suggère que l'inhibition des jonctions lacunaires
affecte la prolifération des cellules, ce qui confirme que les activateurs des
jonctions GAP, en présence de tamoxifène peuvent réduire la croissance
cellulaire. Nous avons également observé l'effet de CBX sur l'expression de la
protéine Ki67 dans les cellules T47D à 72 h (Fig. 58B). La protéine Ki67 était
significativement accrue en présence de CBX seul par rapport au tamoxifène. La
combinaison de tamoxifène et CBX a également montré une expression de Ki67,
ce qui indique que l'inhibition des jonctions lacunaires affecte la prolifération des
215
cellules. Cela a été confirmé par l'expression de la cycline D1 et le test MTT. Le
dosage de l'apoptose la méthode TUNEL d'incorporation d'APO-BrdU a montré
une diminution de la mort cellulaire en présence de CBX ; cependant, la mort
cellulaire n'a pas été affectée en présence de tamoxifène et CBX (Fig. 58D). Le
tamoxifène seul a par ailleurs provoqué une augmentation de la mort cellulaire par
rapport au témoin. Dans le dosage de l'apoptose, nous avons utilisé de l'iodure de
propidium pour établir une distinction entre cellules nécrotiques et apoptotiques.
Les cellules qui n'ont pas incorporé l'iodure de propidium mais pnt incorporé
l'APO-BrdU-isothiocyanate
de
fluorescéine
ont
été
comptées
comme
apoptotiques. Par conséquent, ce dosage exclut les cellules nécrotiques et permet
de mesurer la quantité de cellules apoptotiques. Dans l'ensemble, les données
permettent de conclure que l'inhibition des jonctions lacunaires à l'aide de 20
mmol / L de CBX peut augmenter la prolifération cellulaires et réduire la mort des
cellules, mais une plus forte dose de CBX est nécessaire pour réduire la mort
cellulaire en présence de la combinaison de tamoxifène et de CBX. Ces données
concernant les inhibiteurs des jonctions GAP suggèrent que des activateurs de
jonctions GAP tels que PQ1 peuvent être utilisés comme cibles thérapeutiques
dans les cellules cancéreuses dans lesquelles les activateurs des jonctions
lacunaires peuvent diminuer la prolifération des cellules et provoquer la mort
cellulaire.
E/ Conclusion
Le tamoxifène a été le médicament de choix pour le traitement des tumeurs
du sein sensibles aux hormones, mais la résistance au tamoxifène été un
problème pour très longtemps. On montre pour la première fois que l'effet
combinatoire de PQ1, un activateur des jonctions GAP, avec le tamoxifène a une
utilisation potentielle pour le traitement contre le cancer du sein. Nous avons
constaté une diminution de la prolifération cellulaire par le test MTT et une
diminution significative dans le test de croissance des colonies. Nous avons
observé une augmentation significative de l'expression de la protéine BAX,
l'activation de la caspase 3 et la fragmentation de l'ADN en présence d'un
traitement combinatoire de PQ1 et de tamoxifène par rapport aux traitements
216
individuels. Nous avons également constaté que l'expression de la survivine était
significativement diminuée en présence de tamoxifène seul, et d'une combinaison
de tamoxifène avec soit 200 soit 500 nmol / L de PQ1. Cependant, la PQ1 seule
n'affecte pas l'expression de la survivine dans les cellules T47D comme observé à
1, 48, et 72 h. Les études d'inhibiteurs des jonctions lacunaires réalisées à l'aide
de 20 mmol / L de CBX confirment en outre que les jonctions communicantes
jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. En
outre, la possibilité que PQ1 affecte d'autres caspases pour induire l'apoptose n'a
pas été couverte par cette étude ; par conséquent, nous ne pouvons pas exclure
la participation d'autres caspases. Nous proposons que PQ1 permette au
tamoxifène (poids moléculaire = 371,51) de passer à travers les jonctions
communicantes entre les cellules, provoquant une action rapide du tamoxifène. À
l'appui de nos données, Jensen et Glazer (274) ont montré que l'expression forcée
de la Cx43 dans des cellules MCF-7 a donné lieu à une sensibilité accrue des
cellules au cisplatine à haute densité. Notre travail montre que la thérapie
combinatoire avec tamoxifène et PQ1 montre un rôle plus prometteur dans
l'induction de l'apoptose par activation de la caspase 3. Les études futures
porteront sur l'effet combinatoire de PQ1 et tamoxifène in vivo ainsi que la
réduction de la concentration du tamoxifène en présence de PQ1.
F/ Importance
Notre étude suggère que le traitement combinatoire permet une diminution
de la concentration du tamoxifène (inférieure à 10 mmol / L) dans l'utilisation
clinique. Le fait que le traitement combinatoire avec des activateurs des jonctions
GAP puisse abaisser la concentration de l'agent chimiothérapeutique aura une
forte implication puisque cela pourrait réduire les effets secondaires de ces
médicaments. Cependant, dans un contexte clinique, de nombreux facteurs sont
impliqués et les résultats ne peuvent pas être complètement prévisibles. En outre,
des études pharmacocinétiques sur la PQ1 pourraient faire la lumière sur l'effet
possible de la PQ1 en combinaison avec d'autres agents de chimiothérapie dans
un essai clinique. À l'avenir, nous procéderons à des études combinatoires de
PQ1 et de tamoxifène (dose réduite de mmol / L à nmol / L) et nous observerons
217
ses effets sur des systèmes cellulaires. Une grande partie des travaux présentés
ont porté sur des cellules de cancer du sein ; cependant, le rôle des activateurs
des jonctions lacunaires (PQ1) dans la sensibilité au médicament n'a pas besoin
d'être limitée au cancer du sein. Une variété d'autres cancers pourrait profiter d'un
mécanisme très similaire et, par conséquent, d'autres maladies pourraient
bénéficier des voies de modulation par les jonctions GAP
218
Troisième partie
Tests thérapeutiques
sur un modèle de
tumeurs spontanées
chez la souris MMTVPyVT
219
220
I/ La souris transgénique MMTV-PyVT comme modèle de
carcinome mammaire à plusieurs stades et efficacité du
traitement antinéoplasique
Traduit de l'anglais Shishido SN, Delahaye A, Beck A, Nguyen TA (351)
A/ Résumé
Les modèles animaux sont couramment utilisés pour analyser le
mécanisme de la carcinogenèse ainsi que le développement et le criblage de
médicaments puissants. Bien que de nombreux modèles animaux de cancer du
sein aient été utilisés dans la recherche, peu présentent plusieurs phases de la
tumorigenèse. La souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634 Mul/J
(également connue sous le nom PyVT) a été établie pour déterminer l'effet de
l'expression de l'antigène moyen T du polyomavirus spécifiquement dans la
glande mammaire. Ici, le modèle
PyVT avec trois stades distincts de
développement de la tumeur (Phases de pré-développement, développement
précoce et tardif) a été utilisé comme système modèle pour la mesure de la
croissance tumorale, la charge tumorale et les métastases de carcinomes
mammaires. En outre, le profil d'expression des marqueurs moléculaires survivine
et Ki-67, a été déterminé. Trois composés antinéoplasiques ont été testés sur une
période de 14 jours pour déterminer leur efficacité à atténuer la croissance
tumorale à chaque stade de développement. Il est intéressant que le cisplatine et
le paclitaxel aient été déterminés comme étant des médicaments anticancéreux
inefficaces, tandis que le tamoxifène a significativement réduit la croissance
tumorale aux stades de pré-développement et de développement précoce de la
formation tumorale.
B/ Introduction
Les modèles in vivo sont importants pour la recherche translationnelle et
peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme de carcinogenèse ou la
221
pharmacodynamie et le développement de thérapies contre le cancer. Les
modèles animaux pour étudier la formation de cancer devraient inclure des
caractéristiques telles que les cibles moléculaires, le métabolisme des
médicaments, la pharmacocinétique / dynamique, la distribution des médicaments,
des similitudes anatomiques, le microenvironnement, l'angiogenèse et la
métastase. Variation de la taille de la tumeur est le point critique le plus largement
utilisé pour déterminer l'efficacité d'un médicament, mais la fréquence de tumeur,
la survie et la charge tumorale sont d'autres facteurs importants. Ainsi, les
systèmes de modèles spécifiques sont avantageux pour la mesure de la charge
tumorale, de la sensibilité aux médicaments et du potentiel métastatique. L'activité
antitumorale des agents de chimiothérapie est généralement déterminée chez la
souris immunodéficiente transplantée avec des tumeurs humaines, mais ces
xénogreffes de tumeurs présentent une perte potentielle de pouvoir tumorigène,
un potentiel métastatique limité dans de nombreuses lignées cellulaires et une
perte de linéarité avec un volume de plus en plus important de la tumeur (352).
Des modèles animaux ont évolué depuis les modèles de tumeurs
syngéniques transplantables de souris aux modèles animaux à tumeurs induites
chimiquement, transgéniques, et de tumeurs spontanées. De nombreux agents de
chimiothérapie ont montré des résultats prometteurs dans des modèles
précliniques et malgré tout eu une activité minimale dans les essais cliniques.
Cela a conduit au scepticisme vis à vis des xénogreffes et des modèles de
tumeurs syngéniques. De nouvelles techniques, y compris des modèles de souris
transgéniques, ont le potentiel d'être plus prédictives. La carcinogenèse est un
processus en plusieurs étapes et toutes les étapes de développement doivent être
prises en compte dans la conception de traitements plus efficaces. Dans la
mesure où plusieurs modèles transgéniques mammaires de cancer du sein
humain progressent au travers des phases bien définies du cancer, ce sont des
systèmes pré-cliniques utiles pour tester l'efficacité de la chimio-prévention et des
agents de chimiothérapie. L'utilisation de modèles de carcinome mammaire
transgéniques permet une étude détaillée des réponses spécifiques de chaque
stade aux agents antinéoplasiques, définissant le moment opportun pour
l'intervention avec des composés spécifiques.
222
La souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634 Mul/J (également
connue sous le nom PyVT) est un nouveau modèle in vivo pour l'étude de la
formation des carcinomes mammaires et des metastases avec une utilité clinique
importante. Le modèle PyVT est porteur de l'antigène moyen T du polyomavirus
avec le promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (MMTV) qui dirige
l'expression de façon spécifique dans le tissu mammaire (353). L'oncogène PyVT
active de multiples voies oncogènes, telles que la protéine tyrosine kinase src et la
phosphatidylinositol-3-kinase (354), conduisant à un phénotype de tumeur
agressive. Des études antérieures indiquent que les femelles vierges portant le
transgène développent un carcinome canalaire multifocal, peu différencié, très
envahissant avant 10 - 12 semaines d'âge, avec une incidence élevée de
métastases pulmonaires issues de la tumeur mammaire primaire (355). A 5
semaines d'âge les femmes développent des lésions focales non invasives qui
sont classés en quatre groupes : simples, solides, kystiques et mixtes (solides et
kystiques) (356). Les lésions solides sont constituées de grands foyers d'une
masse dense de cellules atypiques en feuillets nodulaires. Les lésions kystiques
varient en taille et en complexité et sont bordées par un épithélium multicouche
avec des quantités importantes de liquide clair (356). Les tumeurs précancéreuses
sont morphologiquement
des cellules néoplasiques hétérogènes et très
proliférantes avec atypies qui contiennent une micro-vascularisation anormale et
restent dans la membrane basale (356).
L'expression de MMTV - PyVT est variable dans les tumeurs (356), ce qui
suggère que le transgène n'est pas nécessaire pour le maintien de la tumeur
maligne. Le modèle PyVT représente un processus en plusieurs étapes en raison
de lésions progressant d'une hyperplasie à un phénotype mixte adénome /
néoplasie mammaire, puis aux carcinomes précoce et tardif avec métastases
pulmonaires (355, 356). La métastase de la tumeur primaire à des sites distants
demeure une cause importante de décès dans de nombreux types de cancer, ce
qui souligne l'importance d'un modèle métastatique. Ce modèle de carcinogenèse
mammaire spontanée est un outil puissant pour étudier le mécanisme associé à la
progression
tumorale
et
le
développement
chimiothérapeutiques.
223
de
nouveaux
agents
Ce modèle n'a pas été utilisé pour tester l'efficacité de nombreux composés
anti-néoplasiques malgré sa pertinence clinique pour le cancer du sein humain.
Les composés utilisés ici sont le cisplatine, le paclitaxel et le tamoxifène. Le
mécanisme d'action est brièvement expliqué. Le cisplatine induit des dommages
au sein des tumeurs par formation d'adduits d'ADN, suivie par une inhibition de la
croissance cellulaire et induction de l'apoptose. Le paclitaxel empêche la
prolifération cellulaire en se liant à la tubuline et en inhibant le désassemblage des
microtubules dans la cellule. Le tamoxifène est un modulateur sélectif des
récepteurs aux oestrogènes (SERM) qui inhibe de façon compétitive la liaison de
l'oestradiol aux récepteurs aux oestrogènes. Les effets de ces composés sur la
souris porteuse du transgène MMTV-PyVT n'ont pas encore été rapportés.
La présente étude examine les caractéristiques du développement tumoral
et détermine les effets du traitement anti-néoplasique sur la carcinogenèse et la
métastase en utilisant le modèle de tumeur mammaire induit par le transgène
MMTV-PyVT. De façon intéressante, avec la progression e la malignité, on
observe une augmentation des niveaux d'expression de la protéine Ki-67 et de la
survivine associée à une diminution de l'expression des récepteurs aux
œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR). Cela confirme les travaux antérieurs
sur ce modèle. Nous avons montré pour la première fois l'activité anticancéreuse
du tamoxifène, pas du cisplatine ou du paclitaxel, sur un modèle de tumeur
mammaire à plusieurs étapes de développement.
C/ Matériels et méthodes
i/ Animaux
Une colonie de souris transgéniques FVB-TgN (MMTV-PyVT) (The Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME) a été établie. Pour identifier la descendance
transgénique, l'ADN génomique a été extrait à partir d'un écrêtage de queue de
1,5 cm. Toutes les souris porteuses du transgène PyVT ont développé des
tumeurs mammaires. Le développement de tumeurs chez les souris femelles
positives pour le transgène a été suivi de près tous les 2 - 3 jours. L'apparition de
224
tumeurs a été enregistrée ainsi que l'âge de l'animal auquel des masses
anormales palpables ont été détectées. La taille des tumeurs a été mesurée en
deux dimensions avec un pied à coulisse tous les 2 jours. Les souris à chaque
stade de développement tumoral ont été réparties au hasard en quatre groupes
expérimentaux : 1) les animaux témoins recevant le solvant (DMSO) ; 2) les
animaux traités avec 3,5 mg / kg de cisplatine ; 3) les animaux traités avec 10 mg /
kg de paclitaxel ; et 4) les animaux traités avec 20 mg / kg de tamoxifène. Tous les
traitements ont été administrés par injection par voie intrapéritonéale (IP) tous les
deux jours pendant 14 jours. Les soins aux animaux et les protocoles utilisés ont
été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des
animaux (IACUC) à Kansas State University, Manhattan, Kansas suivant les
directives du NIH.
ii/ Composés
Le cis-Diammineplatinum (II) dichlorure (P4394), le paclitaxel (T1912) et le
tamoxifène (T5648) ont été achetés chez Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
iii/ Anticorps
Les anticorps primaires : Anti-ERa (sc-8002, anticorps monoclonal de
souris), anti-ERb (sc-8974, anticorps polyclonal de lapin), anti-PR (sc-166170,
anticorps monoclonal de souris), anti-survivine (sc- 374616, monoclonal de souris)
et anti-Ki67 (sc-23900 , anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de
lapin) de Cell Signaling (Boston, MA) ; anti-pan épithéliale (MAB1631) et antiépithélium pigmentaire (MAB1059) de Chemicon ; et anti- Her2 (AP7629e,
anticorps polyclonal de lapin) et anti-p53 (AP 6266b, anticorps polyclonal de lapin)
de Abgent (San Diego, CA) ont été utilisés à la fois pour les analyses western blot
et immunohistochimiques (IHC).
225
iv/ Analyse Western Blot
Le tissu de tumeur de la glande mammaire a été homogénéisé dans 500
mL de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5 %
de Triton X-100) avec des inhibiteurs de protéase à une dilution de 1:1000
(Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI
Bead Ruptor 24 (Omni International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s
pendant 45 secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30
minutes à 4°C. Vingt -cinq ug d'extrait de cellules entières ont été résolus sur gel
de SDS polyacrylamide à 10% (PAGE) et transférés sur une membrane de
nitrocellulose (Midwest scientifique, Saint Louis, MO). La membrane de
nitrocellulose a été bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température
ambiante, puis mise à incuber avec des anticorps monoclonaux (1:1000). Les
transferts western blot ont été détectés par des réactifs de détection par
chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, IL) et visualisés par le système
d'imagerie Fluorochem E (ProteinSimple, Santa Clara, CA).
v/ Immunohistochimie (IHC)
Les carcinomes mammaires et les organes ont été prélevés et fixés dans
une solution de formaldéhyde à 10% et incorporés dans de la paraffine
préalablement à leur sectionnement sur lames à une épaisseur de 5 um. Les
coupes en paraffine (5 um) ont été séchées à 60 ° C pendant 25 minutes. Le
déparaffinage a été réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 %
d'éthanol. L'antigène extraction a été effectuée dans une solution tampon de
citrate (1 x) dans une chambre à vapeur. Les lames ont ensuite été incubées
pendant une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (Dilution
1:50). Après lavages dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées
avec des anticorps secondaires biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les
lames ont été lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation
avec du complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été
visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration
226
hemalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec un
microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.
vi/ Analyse statistique
La signification statistique a été déterminée pour une p-value ≤ 0,05 en
utilisant un t-test standard. Les données sont présentées comme la moyenne ±
l'intervalle de confiance à 95 % d'un minimum de six échantillons par groupe de
traitement.
D/ Résultats
Les souris transgéniques femelles FVB-TgN (MMTV-PyVT) ont développé
des tumeurs dès l'âge de 4 semaines. Tous les 10 coussinnets adipeux
mammaires ont développé des tumeurs avec une charge tumorale maximale
atteinte autour de 12 semaines d'âge. Le développement tumoral a été divisé en
trois phases sur la base de la mesure de la taille des tumeurs et de la fréquence
de formation de tumeurs. Le stade de pré-développement tumoral a commencé à
4 - 5 semaines d'âge, consistant en un état précancéreux où aucune tumeur n'a
été palpée et le tissu mammaire est apparu normal à l'observation brute. Le stade
précoce de développement a été limité à 6 - 8 semaines d'âge, représenté par
l'observation brute de 1 - 2 tumeurs solides dans le tissu mammaire. La phase
tardive a été basée sur la présence de l'ensemble des 10 tumeurs mammaires
primaires avec métastases pulmonaires secondaires ; cette phase est apparue
après 10 semaines d'âge. Des sections représentatives du tissu pulmonaire ont
été colorées avec de l'hémalun-éosine (H & E) pour l'examen histopathologique
afin de déterminer la présence de métastases.
Pour confirmer que les tumeurs PyVT étaient d'origine épithéliale, une
analyse immunohistochimique a été réalisée à chaque étape du développement
avec le facteur pan épithélium, facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire, et l’Ecadhérine (Fig. 59). Il y avait une forte coloration positive pour le facteur pan
épithélium aux stades de pré-développement et de développement précoce,
227
tandis que le stade tardif a montré une faible coloration. Ceci était cohérent pour le
facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire (PEDF) et l'E-cadhérine. Ceci est
indicatif d'une transition dans le phénotype cellulaire, ce qui démontre le
processus de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dans ce modèle.
Les cancers du sein sont régulièrement testés pour le statut des récepteurs
hormonaux [récepteur aux œstrogènes (ER), récepteur à la progestérone (PR) et
récepteur humain au facteur de croissance épidermique 2 (HER2)] en raison de
leur relation avec les différents sous-types et leur impact sur le pronostic, le
traitement et la survie globale. Les tumeurs PyVT isolées à partir de tous les
stades de développement se sont avérées ER- et HER2-positives (Figure 60).
Seules les tumeurs de stades précoce et tardif exprimaient des niveaux
détectables de PR. Ceci a été confirmé par analyse Western blot (données non
présentées). L'expression du récepteur aux oestrogènes (ER), du récepteur à la
progestérone (PR) et du récepteur humain au facteur de crissance épidermique 2
(HER2) est un facteur pronostique et prédictif reconnu. L'ER est trouvé dans 50 %
- 80% des cancers du sein (357). Le PR est un marqueur de substitution d'un ER
fonctionnel et est exprimé dans 60 % - 70 % des cancers du sein invasifs avec
une positivité plus importante chez les femmes plus âgées et ménopausée (358).
HER-2/neu également connu sous le nom C-erbB2 (HER-2), est un protooncogène situé sur le chromosome 17 et la protéine (HER 2) est surexprimée
dans 15 % - 25 % des carcinomes du sein invasifs associés à un mauvais
pronostic (359).
228
Fig. 59 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT aux stades de pré-développement,
développement précoce et développement tardif. Bleu = contre-coloration hemalun. Barre = 50µm.
Fig. 60 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT. Barre = 50µm. n=6
229
Il a été montré que les tumeurs exprimaient p53 (Fig. 60). P53 est un
marqueur pronostique pour le cancer du sein inflammatoire, une forme plus
agressive que le cancer du sein localement avancé (360). Il s'agit d'un senseur de
stress cellulaire et régulateur majeur de la programmation apoptotique (361). Le
rôle de la protéine p53 est de maintenir la stabilité du génome en tant que
régulateur de la transcription multifonctionnel participant au cycle cellulaire (362).
Dans les cellules dans lesquelles le gène p53 est actif, il fonctionne comme un
gène de survie et sa perte sensibilise la cellule au stress génotoxique (363). Des
niveaux élevés d'expression de p53 ont été associés à un mauvais pronostic (364).
Les cellules néoplasiques ont de multiples techniques de survie contre les
signaux de mort, telles que l'utilisation d'inhibiteurs de l'apoptose. La protéine antiapoptotique survivine est une protéine membre de la famille des inhibiteurs de
l'apoptose exprimée dans une gamme de types de tumeurs qui régule la mitose
(281-283). L'expression de la survivine est corrélée avec la résistance à la
chimiothérapie et à une rechute accélérée (284). L'analyse par immunotransfert de
l'homogénat de tumeur a indiqué que l'expression de la survivine augmentait avec
le développement de la tumeur (Fig. 61A). Ceci a été confirmé par
immunohistochimie (Fig. 61C).
La prolifération cellulaire a été déterminée par l'expression du facteur Ki- 67,
qui est détectable pendant toutes les phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2,
et la mitose) mais absent dans les cellules au repos (G0) (365). Une expression
élevée de la protéine Ki-67 est associée avec un taux de récidive plus élevé du
cancer du sein et une mauvaise survie des patients (366). Ki- 67 est l'un des cinq
gènes de prolifération parmi les 16 gènes associés au cancer, qui contribuent de
manière significative au score Oncotype (367). L'analyse Western blot du Ki-67
sur les tumeurs PyVT a montré une augmentation des niveaux d'expression avec
la progression de la tumeur vers un phénotype malin (Fig. 361). Ceci a été
confirmé par immunohistochimie (Fig. 61C).
230
Fig. 61 : Expression de marqueurs moléculaires aux trois stades de développement. A et B/
Western blot et leur analyse des protéines survivine (A) et Ki-67 (B). C/ Immunohistochimie des
tumeurs aux trois stades de développement. Bleu = contre-coloration hemalun. Barre = 20 µm
L'examen histopathologique des tumeurs mammaires a été réalisé pour
chaque groupe de traitement aux trois stades de développement tumoral.
Lorsqu'elles sont présentes, les tumeurs ont été classées comme adénome /
néoplasie mammaire intraépithéliale (MIN), carcinome précoce ou carcinome tardif
(Fig. 62). Adénome / MIN impliquaient l'expansion des acini et canaux par une
prolifération de cellules épithéliales néoplasiques polygonales avec coalescence
multifocale des canaux et des acini affectées. Les cellules néoplasiques
présentaient des atypies cellulaires minimales et un index mitotique faible (02/champ à un grossissement x400). La prolifération néoplasique n'a pas franchi la
membrane basale et il y avait un manque de tissu conjonctif fibreux au sein de la
tumeur. Les carcinomes précoces étaient non encapsulés et modérément bien
délimités, avec des nids serrés et acini de cellules néoplasiques présentant des
atypies cellulaires légères à modérées et de 1 - 3 cellules en mitose par champ à
fort grossissement. Les cellules néoplasiques ont violé la membrane basale et
étaient séparées multifocalement par une quantité faible à modérée de stroma
fibro-vasculaire. Les carcinomes tardifs étaient non encapsulés, mal délimités et
231
invasifs, composés de feuillets de nids serrés et acini de cellules néoplasiques
séparées par des quantités modérées de stroma fibro-vasculaire. L'anisocytose et
l'anisocaryose étaient modérées et il y avait en moyenne 1-3 mitoses / champ à
grossissement 400x. Les tumeurs au stade de pré-développement tumoral étaient
soit des adénomes / MIN ou des carcinomes précoces, tandis que les tumeurs
précoces étaient toutes des carcinomes précoces. Les tumeurs tardives étaient
toutes des carcinomes tardifs.
Fig. 62 : Evaluation histo-pathologique de tumeurs mammaires de souris PyVT colorées à
l’hemalun-éosine (H&E). A/ Adénome / MIN B/ Carcinome précoce C/ Carcinome tardif. Barre = 50
µm. n = 3
Le carcinome mammaire développé par le modèle transgénique PyVT est
caractérisé par un modèle métastatique impliquant le tissu pulmonaire. Aucune
métastase pulmonaire n'a été observée au cours de la phase préliminaire de
développement tumoral. Les foyers métastatiques n'étaient pas généralement
trouvés chez les souris au stade précoce, mais quelques-unes développent de
petites lésions à environ 8 semaines d'âge (Fig. 63A). Les souris au le stade tardif
de développement avaient formées de grosses tumeurs secondaires dans
l'épithélium pulmonaire ; ce qui a été déterminé par observation macroscopique et
histopathologie (Fig.
63B-D). Les tumeurs pulmonaires présentaien des
caractéristiques histopathologiques similaires à celles du tissu mammaire.
Fig. 63 : Métastases de tumeurs mammaires
dans les poumons, colorées à l’hemalun-éosine.
A/ Stade précoce de développement B-D/ Stade
tardif de développement Barre = 50 µm. n = 3
232
La croissance tumorale a été surveillée pendant deux semaines au cours
de chaque étape de développement. Le volume tumoral initial pour les souris au
stade de pré-développement était de 7,57 ± 10,77 mm3 à 5 semaines d'âge. Deux
semaines après l'évaluation initiale des souris au stade de pré-développement, les
tumeurs se sont développées pour attaindre un volume total moyen de 309,04 ±
16,63 mm3 (Fig. 64A). Lors de la phase précoce de développement, le volume
tumoral initial a été mesuré à 6 semaines d'âge pour être 133,33 ± 76,59 mm3. A
8 semaines d'âge, 14 jours après la mesure initiale, les souris au stade précoce
ont développé un volume tumoral total moyen de 450,71 ± 39,56 mm3 (Fig. 64B).
Le stade tardif de développement tumoral a commencé à 10 semaines d'âge,
lorsque les souris avaient un volume tumoral initial de 588,3 ± 78,87 mm3. 14
jours après la mesure initiale du volume tumoral, le volume tumoral total était de
1727,21 ± 50,82 mm3 (Fig. 64C).
L'effet des trois composés anti-néoplasiques sur le développement de
tumeurs a été testé dans le modèle de souris PyVT. Le traitement par le cisplatine
ou le paclitaxel n'a pas atténué de manière significative la croissance tumorale aux
stades de pré-développement, de développement précoce ou tardif (données non
présentées). En revanche, le traitement par le tamoxifène a, quant à lui,
significativement atténué la croissance tumorale au cours des phases de prédéveloppement et de développement précoce des tumeurs (Fig. 64A-B). Le
volume tumoral était significativement différent entre les souris traitées au
tamoxifène et celles traitées au DMSO au cours de la phase de prédéveloppement tumoral du jour 10 au jour 14 (Fig. 64A). Le changement de
volume tumoral au cours de cette période de 14 jours a montré une réduction
significative de 124 mm3 du traitement au tamoxifène par rapport au témoin (pvalue = 0,018). Lors de la phase précoce de développement, il existait une
différence significative en termes de volume tumoral entre les groupes traités au
tamoxifène et contrôles au jour 14 (Figure 64B). Le tamoxifène a significativement
diminué le volume tumoral initial de 148 mm3 à un volume final de 306 mm3 après
14 jours de traitement (p = 0,013) avec une taille moyenne des tumeurs après 14
jours de traitement au tamoxifen 144 mm3 inférieure à celle du volume de final
des tumeurs contrôles, ce qui représente une réduction de 31 %. Le traitement au
tamoxifène n'a pas réduit de manière significative la croissance des tumeurs au
233
cours du stade tardif de développement tumoral (Fig. 64C). Il n'y avait pas de
changement observable dans la formation de lésions pulmonaires métastatiques.
Fig. 64 : Croissance tumorale chez les souris PyVT femelles. Tumeurs mesurées tous les deux
jours. A/ Stade de pré-développement B/ Stade précoce C/ Stade tardif. Tamoxifène : 20 mg/kg.
DMSO = véhicule. 7 injections intra-péritonéales sur une période de 14 jours. * = p < 0,05 (par
rapport au contrôle)
E/ Discussion
Tout au long de l'histoire, les scientifiques ont utilisé une multitude de
modèles animaux pour résoudre des problèmes médicaux, développer de
nouvelles techniques et traitements et guérir les maladies. Des souris
génétiquement modifiées sont produitent dans le domaine du cancer, ce qui
permet aux chercheurs d'étudier plusieurs aspects du cancer. De nombreux types
d'animaux transgéniques ont été développés, dont la plupart ont été utilisés en
petits nombres comme outils d'investigation de la fonction des gènes in vivo.
Plusieurs caractéristiques du modèle PyVT le rendent idéal pour la recherche,
telles que la stabilité de la colonie, le comportement prévisible de la croissance
tumorale, le phénotype métastatique et sa similitude clinique avec les néoplasmes
humains.
Le procédé EMT implique que les cellules épithéliales de carcinome
acquièrent des marqueurs mésenchymateux, tels que la vimentine, de manière à
accroître leur potentiel métastatique [367, 368], ainsi que la perte des molécules
d'adhésion cellulaire épithéliales [368, 369]. L'altération de l'expression des Ecadhérines est le marqueur typique des cellules épithéliales dans l'EMT (370) ; en
outre, la perte de fonctionnalité des E-cadhérines favorise l'EMT (371). Les
changements observés dans l'expression du marqueur épithélial dans les tumeurs
234
PyVT isolées sont compatibles avec le processus d'EMT. Par ailleurs, la
diminution de PEDF, une protéine sécrétée multifonctionnelle avec des fonctions
anti-angiogéniques et anti-oncogènes, est associée à la progression vers la
malignité et un mauvais pronostique pour le patient (372).
Les tumeurs mammaires PyVT se sont avérées ER +, PR +, P53 + et HER2 + par immunohistochimie. Cela contredit les résultats de Maglione et al. (356),
qui indiquaient que les tumeurs identifiées comme des néoplasies mammaires
intraépithéliales (MIN) n'avaient pas de niveaux détectables d'antigène PR.
Maglione et al. utilisaient des femelles vierges de 9 semaines d'âge avec le
transgène PyVT ; c'est dans la tranche d'âge entre les stages de développement
précoce et tardif définis ici. La différence entre les résultats peut être due au taux
de dilution de l'anticorps primaire utilisé pour l'immunohistochimie. Maglione et al.
utilisaient un rapport de 1:1800, résultant en aucune présentation de l'antigène. Ici,
nous avons utilisé un rapport de 1:50 selon les recommandations du fabricant,
fournissant plus d'anticorps pour se lier à une petite quantité d'antigène. De plus,
l'expression des récepteurs hormonaux montre un changement cyclique au cours
du cycle oestral chez la souris (373, 374). Cette variation implique que la phase du
cycle, et donc le moment de la récolte des tissus, peut déterminer l'expression de
PR dans les carcinomes mammaires recueillis.
D'autres études sur le phénotype tumoral PyVT indiquent une perte de
l'ERa et du PR lors de la progression vers la malignité de la tumeur (355). Les
résultats présentés ici appuient ces conclusions. En outre, ERß s'est également
avéré diminuer avec l'augmentation de malignité (Fig. 60). Les gènes ER
partagent une large homologie mais diffèrent quant à leur distribution et à leurs
fonctions dans de nombreux types de tissus. Alors qu’ERα est un marqueur
pronostique connu dans le cancer du sein, le rôle d’ERβ est moins clair. Une
diminution de l'expression de la protéine ERß a été montrée dans la transition de
la glande mammaire normale à une tumeur pré-invasive (375). La perte de la
protéine ERß dans les carcinomes invasifs est en corrélation avec les taux
d'ARNm reportés dans les tumeurs du sein (376). Dans l'ensemble, ces résultats
démontrent pour la première fois une régulation à la baisse au cours de la
carcinogenèse du récepteur ERß dans le modèle PyVT.
235
Il est intéressant que l'expression de ER et Ki- 67 soit mutuellement
exclusive dans les tissus mammaires normaux avant la ménopause, mais la coexpression se produit dans le cancer du sein ER +. Avec l'âge, la population de
cellules ER + augmente, tandis que le nombre de cellules Ki-67+ diminue dans le
tissu mammaire sain (377). La transformation d'un tissu normal à une néoplasie
peut inverser ce phénotype. Les résultats présentés ici montrent que le nombre de
cellules ER + diminue et le nombre de cellules Ki-67 + augmente avec la
progression tumorale vers un phénotype malin. L'augmentation observée de
l'expression du facteur Ki-67 correspond à la constatation précédente que la
cycline D1, un régulateur du cycle cellulaire également utilisé en tant que
marqueur moléculaire pour la prolifération, augmente au cours de la progression
tumorale PyVT (355).
Une forte expression de la protéine survivine est observée dans la majorité
des types de cancer et est associée à une tumeur progression et chimiorésistance
(378). Une expression élevée est aussi associée à une maladie agressive et a une
forte corrélation avec un mauvais pronostic pour le malade. Le modèle PyVT a
une expression accrue de la protéine survivine avec progression du phénotype de
la tumeur vers la malignité. La survivine peut réguler le cycle cellulaire, la
cytocinèse et l'apoptose à travers de multiples interactions, comme par exemple
avec la protéine de choc thermique 90 (379), Smac/Diablo (380), Cdk4 (381) et
p53 (382). L'augmentation observée de l'expression de la survivine suggère
qu'elle joue un rôle dans la formation et le développement tumoral dans le modèle
PyVT.
La protéine p53 est un suppresseur de tumeur qui empêche la progression
du cycle cellulaire et pourrait induire l'apoptose (383, 384). Les tumeurs PyVT se
sont révélées être positives pour la protéine p53 à chaque étape de
développement. Fait intéressant, la séquence du promoteur de la survivine a deux
sites de liaison de p53 (385). La surexpression de la protéine survivine sauve les
cellules néoplasiques de l'apoptose induite par p53 (382). L'augmentation de
l'expression de la survivine avec la progression tumorale associée à une forte
expression de la p53 suggère que la cellule éhappe à l'apoptose dépendante de
p53 par le biais de la régulation à la hausse de la survivine.
236
De précédentes investigations sur le modèle transgénique PyVT se sont
limitées à étudier la fonction des gènes ou la caractérisation histologique afin de
prouver la similitude clinique avec le cancer du sein humain. Ce modèle n'a pas
été utilisé pour tester l'efficacité de composés anti-néoplasiques, malgré le
développement tumoral en diférents stades et les similitudes avec le cancer du
sein humain. Les composés cisplatine, paclitaxel et tamoxifène ont été choisis en
raison de leur popularité dans le traitement du cancer. Il est intéressant de
constater que le cisplatine et le paclitaxel ne sont pas des traitements
anticancéreux efficaces, alors que le tamoxifène atténue efficacement la formation
tumorale dans le modèle PyVT. L'absence de réponse au cisplatine et au
paclitaxel suggère des mécanismes potentiels de résistance, comme une
réduction de l'accumulation du composé à l'intérieur des cellules néoplasiques en
raison de barrières membranaires ou d'une augmentation de l'efflux, des
mécanismes de réparation rapide, ou une modulation des voies de l'apoptose.
Il y a un besoin urgent de médicaments chimiothérapeutiques efficaces et à
faible toxicité et d'agents de chimio-prévention contre les carcinomes mammaires.
Ici, l'effet inhibiteur du tamoxifène est démontré sur le développement de tumeurs
dans le modèle MMTV-PyVT. Le tamoxifène a été amplement étudié mais c'est la
première fois que son efficacité dans un modèle de carcinome mammaire en
plusieurs étapes avec métastases pulmonaires a été démontrée. L'exposition au
tamoxifène
avant
l'apparition
de
tumeurs
mammaires
palpables
réduit
significativement la charge tumorale et atténue la croissance tumorale. Toutefois,
lorsque l'exposition au tamoxifène a commencé après l'apparition de tumeurs
mammaires visibles, il a été moins efficace sur l'atténuation de la croissance et du
développement de métastases tumorales, sans modifier la charge tumorale
primaire. Le mécanisme par lequel le tamoxifène a supprimé le développement
tumoral peut être associé à la séquence du promoteur MMTV dans ce modèle
induit par le transgène. La séquence du promoteur MMTV contient un élément de
réponse aux hormones (HRE) qui peut se lier aux récepteurs aux progestatifs,
androgènes et glucocorticoïdes. Une hormone qui se lie à son récepteur peut
entrer dans le noyau où le complexe peut se lier à l'HRE et stimuler la séquence
MMTV. Le MMTV est activé par un niveau élevé d'oestrogènes et un progestatifs,
régulant à la hausse l'expression des gènes cibles et induisant la formation de
237
cancer (386). Des traitements avec de l'oestradiol exogène et de la progestérone
a montré une augmentation de l'expression de l'ARNm MMTV (387). Par
conséquent, par traitement avec le tamoxifène, l'hormone est incapable de se lier
à l’ER, de se transloquer vers le noyau et lier l'HRE dans la séquence du
promoteur MMTV. Cela empêche l'activation du promoteur et réduit l’expression
de l'antigène PyVT.
Il a été montré que le tamoxifène était efficace seulement pendant les
phases de pré-développement et de développement précoce des tumeurs. Des
recherches précédentes ont montré que les tumeurs avaient une expression
variable de l'antigène PyVT, ce qui indique une importance de l'expression du
transgène dans l'initiation de la formation de tumeurs mais pas dans la persistance
d'un phénotype malin (356). Ceci suggère que, lors des étapes de prédéveloppement et de développement précoce des tumeurs, lorsque le transgène
est plus fortement exprimé, le tamoxifène peut empêcher l'activation subséquente
du MMTV et l'expression de l'antigène PyVT. En outre, la constatation que le
tamoxifène supprimait efficacement le développement des tumeurs mammaires
spontanées à ces stades fournit la preuve que ce composé peut être
bénéfiquement utilisé comme agent de chimioprévention et de chimiothérapie pour
une intervention précoce pour réduire la morbidité et la mortalité associées à cette
maladie néoplasique.
La région de la longue répétition terminale (LTR) du promoteur du MMTV a
été montré précédemment de ne pas être modulée à la baisse par les effets antiœstrogéniques du tamoxifène (388) mais cette étude a été menée dans la lignée
cellulaire de cancer du sein T47D transfectée de façon stable avec la LTR du
MMTV. Il n'existe pas de données indiquant que les concentrations systémiques
en œstrogènes ou le traitement au tamoxifène dans le modèle de souris
transgénique ne modifient pas l'activation du promoteur. De multiples études
menées sur des souris transgéniques en utilisant la séquence de promoteur
MMTV présentent des effets anticancéreux avec l'utilisation du tamoxifène (389392) mais elles n'indiquent pas si la séquence du promoteur joue un rôle dans
l'efficacité du composé.
Cette étude porte sur la souris transgénique PyVT utilisée comme modèle
pour la recherche sur le cancer du sein et le développement de médicaments. La
238
croissance tumorale a été contrôlée depuis un stade pré-cancéreux jusqu'à un
stade métastatique. Le phénotype de la tumeur a été déterminé pour trois
périodes distinctes de développement mettant l'accent sur un changement dans le
phénotype cellulaire (i.e. EMT) et l'expression des récepteurs hormonaux, une
modification de la prolifération, les modes de survie et une analyse
histopathologique détaillée des lésions de carcinome mammaire. Pour la première
fois ce modèle a été utilisé pour déterminer l'efficacité de trois composés
antinéoplasiques communs sur le développement des carcinomes mammaires
spontanés. Le tamoxifène peut atténuer la formation du carcinome du sein s'il est
administré suffisamment tôt pour inhiber la transformation des cellules normales.
Le mécanisme de chimioprévention par le tamoxifène pourrait impliquer une
réduction du nombre total de cellules transformées par le transgène MMTV-PyVT.
Ces données suggèrent que le tamoxifène, et pas le cisplatine ou le paclitaxel,
peut améliorer les résultats cliniques chez les patients avant le diagnostic de la
maladie au stade métastatique et pourrait réduire la morbidité et la mortalité
associée au cancer du sein.
239
240
II/ Effet anticancéreux de la molécule PQ1 sur le modèle de
souris MMTV-PyVT
Traduit de l'anglais : Shishido SN, Delahaye A, Beck A, Nguyen TA (393)
A/ Résumé
Les modèles animaux sont couramment utilisés pour analyser les
mécanismes de la carcinogenèse, ainsi que le développement et le criblage de
médicaments puissants. Ici, la souche transgénique FVB / N-Tg (MMTV-PyVT)
634Mul / J (également connue sous le nom PyVT) a été utilisée en tant que
système modèle pour mesurer la charge tumorale, la sensibilité aux médicaments,
et les métastases de carcinomes mammaires. La perte de communication
intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC) et la régulation à la baisse de
l'expression des connexines sont caractéristiques des cellules néoplasiques. La
quinoléine
substituée,
6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl)
amino]-4-méthyl-5-(3-
phényloxy-trifluorométhyl) quinolone (PQ1), a été démontrée pour rétablir la GJIC
et augmenter l'expression des connexines dans des lignées cellulaires de cancer
du sein tout en n'affectant pas les cellules mammaires normales, ce qui suggère
que cette molécule peut fournir un traitement anticancéreux efficace avec moins
d'effets néfastes. Le modèle de souris développant des tumeurs mammaires de
façon spontanée : PyVT a été utilisé pour déterminer les effets biologiques et
histologiques de PQ1 sur la tumorigenèse et les métastases à trois stades de
développement : Pré-tumeur, tumeur précoce et tumeur tardive. Le traitement par
PQ1 à chacun des trois stades de développement a significativement réduit la
croissance tumorale. Le traitement PQ1 a également augmenté l'expression de
Cx43 aux stades pré-tumoral et tumeur précoce, alors qu'il a empêché une
augmentation de l'expression de la Cx46 au cours du stade de formation tumorale
tardive. Cette étude montre que l'expression de la Cx43 et la croissance cellulaire
néoplasique sont inversement liées, mais que PQ1 peut modifier la croissance des
tumeurs par le ciblage des protéines des jonctions lacunaires pour prouver
l'efficacité clinique dans le traitement de tumeurs mammaires spontanées.
241
B/ Introduction
Les traitements du cancer à l'aide de chimiothérapies qui ciblent la
destruction des cellules qui prolifèrent conduisent à des effets secondaires graves
en raison du manque de spécificité pour les cellules cancéreuses. Une
caractéristique des cellules cancéreuses est la perte de communication
intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC). La GJIC maintient
l'homéostasie tissulaire par le partage de petits métabolites via des canaux dans
la membrane cellulaire de cellules voisines. Kanno et Loewenstein ont rapporté
l'absence de couplage électrique dans les hépatomes de rat en 1966 (2). Ceci a
été observé dans des hépatomes chimiquement induits et transplantés (2, 394)
qui diffèrent de manière significative des cellules hépatiques normalement bien
couplées. Le manque de couplage électrique est vite devenu une caractéristique
commune trouvée dans les tumeurs solides, chimiquement induites, transplantées
ou spontanément formées. Il y a plus de 40 ans, la recherche a confirmé qu'une
carence en jonctions GAP et donc en GJIC était associée aux phénotypes
cancéreux (245, 265). De nombreux agents de promotion des tumeurs, tels que le
phénobarbital, ont été montré pour empêcher laGJIC (321, 395). Ceci renforce
l'hypothèse qu'une carence en GJIC conduit à la tumorigenèse.
Des traitements qui ciblent les jonctions communicantes offrent une
spécificité pour les cellules néoplasiques, tandis que la restauration de GJIC
pourrait efficace- ment atténuer la croissance des tumeurs avec moins d'effets
néfastes pour l'hôte. La PQ1, 6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-méthyl-5-(3trifluorométhyl-phényloxy) quinolone, a été trouvée présenter des activités
inhibitrices puissantes contre des cellules de cancer du sein T47D grâce à
l'amélioration de la GJIC (180, 202). Ce composé a la capacité d'améliorer la GJIC
dans les cellules cancéreuses et a des propriétés anticancéreuses. Des études
antérieures indiquent que l'administration de PQ1 par gavage a une faible toxicité
pour les tissus normaux, est sans effet indésirable observable (396) tout en
atténuant considérablement la croissance tumorale (267).
La souche FVB transgénique / N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul / J (également
connue sous le nom PyVT) est utilisée dans cette étude comme un nouveau
242
modèle in vivo pour la formation de cancer du sein humain et de métastases. Le
modèle PyVT est porteur de l'antigène moyen T du polyomavirus avec le
promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (MMTV) qui dirige
l'expression de façon spécifique dans le tissu mammaire (353). Les femelles
vierges qui portent le transgène développent des carcinomes canalaires mal
différenciés, multifocaux et invasifs avant l'âge de 10 à 12 semaines de l'âge, avec
une forte incidence de métastases pulmonaires provenant de la tumeur mammaire
primaire (355). Des lésions non invasives se développent dès l'âge de 5 semaines
et sont classées en quatre groupes : simple, solide, kystique et mixte (solide et
kystique) (356). Les tumeurs pré-malignes PyVT sont formées de cellules
néoplasiques morphologiquement hétérogènes, très proliférantes, avec des
noyaux atypiques, qui restent dans confinées au sein de la membrane basale
(356). Des études antérieures indiquent de faibles niveaux de récepteurs aux
oestrogènes (ER) et de p53 détectables, et pas de cellule positive pour les
récepteurs aux progestérones (PR) (356). Le modèle PyVT peut être utilisé pour
représenter un processus en plusieurs étapes en raison des lésions progressant
d'une simple hyperplasie à un phénotype mxte adénome / néoplasie intraépithéliale mammaires, suivies par un carcinome précoce puis tardif avec
métastases pulmonaires (355, 356). Les lésions PyVT sont également
cliniquement similaires aux hyperplasies atypiques humaines, ce qui ajoute à la
valeur de ce modèle spontané.
La présente étude se focalise sur l'utilisation de la PQ1 comme traitement
du carcinome mammaire dans le modèle spontané murin PyVT. Nous avons
profité de la production in situ de tumeurs mammaires chez les souris
transgéniques pour déterminer les effets biologiques et histologiques de PQ1 sur
la tumorigenèse spontanée et les métastases. Le développement des tumeurs a
été divisé en trois périodes : stade pré-tumoral (souris de 4 semaines d'âge),
stade tumoral précoce (souris de 6 à 8 semaines d'âge) et stade tumoral tardif
(souris de plus de 10 semaines d'âge). Pour chaque étape, les groupes traités et
les groupes témoins ont été évalués. Les résultats ont démontré une réduction
significative de la croissance tumorale chez les souris traitées par avec PQ1 par
rapport aux contrôles traités avec du DMSO ou sans traitement. En outre, des
études Western blot et immunohistochimiques ont montré une augmentation de
243
l'expression des connexines dans les tumeurs traitées. Pour la première fois, la
modification de l'expression des connexines a été corrélée à la croissance
tumorale dans un modèle animal spontané de carcinome mammaire.
C/ Matériel et méthodes
i/ Composés
La quinoléine substituée PQ1, 6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-méthyl-5(3-tri-fluorométhyl-phényloxy) quinolone, a été synthétisée par le laboratoire du Dr
H. Hua Duy (180).
ii/ Animaux
Une colonie de souris transgéniques FVB-TgN (MMTV-PyVT) (The Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME) a été établie. Pour identifier la descendance
transgénique, l'ADN génomique a été extrait à partir d'un écrêtage de queue de
1,5 cm. Le développement de tumeurs chez les souris femelles positives pour le
transgène a été suivi de près. L'apparition de tumeurs a été enregistrée ainsi que
l'âge de l'animal auquel des masses anormales palpables ont été détectées. La
taille des tumeurs a été mesurée en deux dimensions avec un pied à coulisse tous
les 2 jours à partir de quatre semaines d'âge. Les souris ont été observées pour
un changement de comportement, d'apparence ou de poids. Lorsque les animaux
ont atteint la tranche d'âge spécifique, six animaux ont été assignés au hasard à
chaque groupe de traitement. Les animaux traités ont reçu 25 mg / kg de PQ1 par
injection intrapéritonéale (IP). Les soins aux animaux et les protocoles utilisés ont
été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des
animaux (IACUC) à Kansas State University, Manhattan, Kansas suivant les
directives du NIH.
244
iii/ Anticorps
Les anticorps primaires : Anti-Cx46 (sc-20859, anticorps polyclonal de
chèvre), anti-PKCa (sc-8393, anticorps monoclonal de souris) et anti-Cx43 (sc13558, anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling (Boston,
MA) ; anti-p53 (AP6266b, anticorps polyclonal de lapin) de Abgent (San Diego, CA)
ont été utilisés à la fois pour les analyses Western blot et immunohistochimiques
(IHC).
iv/ Analyse Western blot
Le tissu des tumeurs mammaires et d'organes sélectionnés (cerveau, cœur,
foie et reins) a été homogénéisé dans 500 mL de tampon de lyse cellulaire (Tris
20 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5% de Triton X-100) avec des
inhibiteurs des protéases à une dilution de 1:1000 (Sigma-Aldrich, Saint Louis,
MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI Bead Ruptor 24 (Omni
International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s pendant 45 secondes,
suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C. Vingt-cinq
microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus sur gel de SDS
polyacrylamide à 10% (PAGE) et transférés sur une membrane de nitrocellulose
(Midwest scientifique, Saint Louis, MO). La membrane de nitrocellulose a été
bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température ambiante, puis mise
à incuber avec des anticorps monoclonaux (1:1000). Les transferts western blot
ont été détectés par des réactifs de détection par chimioluminescence amplifiée
(Pierce, Rockford, IL) et visualisés par le système d'imagerie Fluorochem E
(ProteinSimple, Santa Clara, CA).
v/ Immunohistochimie
Les carcinomes mammaires et les organes ont été prélevés et fixés dans
une solution de formaldéhyde à 10% et incorporés dans de la paraffine
préalablement à leur sectionnement sur lames à une épaisseur de 5 um. Les
245
coupes de paraffine (5 um) ont été séchées à 60�°C pendant 25 minutes. Le
déparaffinage a été réalisé avec 100% de xylene et 100%, 90%, 75% et 50%
d'éthanol. L'extraction antigénique a été effectuée dans une solution tampon de
citrate (1x) dans une chambre à vapeur. Les lames ont ensuite été incubées
pendant une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (dilution
1:50). Après lavage dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées avec
des anticorps secondaires biotinylés (dilution 1: 1000) pendant 15 min. Les lames
ont été lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du
complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été
visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB), suivie d'une contre-coloration
à l'hémalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec
un microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.
vi/ Analyse statistique
La signification statistique a été déterminée pour une p-value inférieure ou
égale à 0,05. Les données sont présentées comme la moyenne plus ou moins
l'intervalle de confiance à 95% d'un minimum de trois échantillons par groupe de
traitement.
D/ Résultats
Les souris transgéniques femelles FVB-TgN (MMTV) PyVT ont développé
des tumeurs à 5 semaines d'âge, avec le potentiel de développer des tumeurs
dans les 10 coussinets adipeux mammaires. Le développement tumoral a été
divisé en trois phases en fonction de la taille des tumeurs et de la fréquence de
formation tumorale. Le stade de pré-développement tumoral a eu lieu de 4 à 5
semaines d'âge et se composait d'un état précancéreux où aucune tumeur n'état
palpable et le tissu mammaire semblait normal à l'observation. Le stade précoce
de développement représentait la formation de tumeurs solides dans le tissu
mammaire à 6-8 semaines d'âge avec l'observation d'une ou deux tumeurs solides.
Le stade tardif commençait après 10 semaines d'âge et se présentait sous forme
246
de tumeurs primaires sur l'ensemble des 10 glandes mammaires avec métastases
pulmonaires secondaires. La présence de métastases a été confirmée par
coloration hémalun-éosine (H&E) des sections représentatives du poumon et
examen histopathologique.
La croissance tumorale sur une période de 14 jours avec sept injections IP
de DMSO pour le contrôle ou PQ1 a montré un effet significatif du traitement PQ1
sur le développement néoplasique à chacun des trois stades de développement
chez la souris PyVT femelle (Fig. 65). Il n'y avait pas de différence significative
entre les témoins (groupe sans aucun traitement et groupe de traitement DMSO).
Le volume tumoral initial pour toutes les souris au stade de pré-développement
était de 14,74 ± 11 mm3. Il y avait une différence significative dans les volumes
des tumeurs entre les souris traitées avec PQ1 et DMSO au cours du stade de
pré-développement tumoral du jour 4 au jour 14 (Fig. 65A). Le traitement PQ1 a
diminué de manière significative la taille de la tumeur initiale (évaluée au jour 0) à
6,4 mm3 au cours de la période de traitement de 14 jours (p = 0,046). La
croissance tumorale finale des souris témoins traitées au DMSO était de 377 mm3.
Le changement de volume de la tumeur au cours de la période de 14 jours a
montré une réduction significative de 40 mm3 avec le traitement PQ1 par rapport
aux deux témoins (p <0,0001 ; Figure 65B). Il y a eu une réduction de 56% de la
taille initiale de la tumeur chez les souris au stade de pré-développement tumoral
après traitement PQ1.
Le volume de la tumeur initiale pour toutes les souris à un stade précoce
était de 129 ± 49 mm3. Au cours de ce stade de développement il y avait une
différence significative de volume tumoral entre les groupes de traitement des
jours 8 à 14 (Fig. 65C). Le traitement PQ1 a diminué de manière significative la
taille initiale de la tumeur à un volume final de 72 mm3 après 14 jours de
traitement (p = 0,0002), tandis que le volume final pour le groupe témoin traité au
DMSO était de 410 mm3. La taille moyenne des tumeurs après 14 jours de
traitement PQ1 était 57 mm3 inférieure au volume initial, ce qui est une réduction
significative de 44% de la taille initiale de la tumeur par rapport aux témoins (p
<0,0001; Figure 65D). Le traitement PQ1 au cours de la phase précoce de
développement a entraîné une réduction de 53 et 56% du volume initial de la
tumeur par rapport aux contrôles : absence de traitement et traitement au DMSO,
247
respectivement.
Au stade tardif de développement de la tumeur, les souris ont commencé le
traitement avec un volume tumoral initial de 610 ± 104 mm3. Le traitement PQ1 a
atténué la croissance des tumeurs par rapport au témoin, indiqué par un volume
final de 1 727 mm3 pour le contrôle traité au DMSO et 968 mm3 après traitement
PQ1 sur une période de 14 jours (p = 0,0001 ; Fig. 65E).
Fig. 65 : Croissance tumorale (en mm3) chez la femelle PyVT femelle. A, B/ Stade de prédéveloppement tumoral. C, D/ Stade précoce. D, E/ Stade tardif. Les jours 0-12 correspondent aux
7 injections et le jour 14 correspond à la fin de l’étude (mesures avant prélèvement des organes).
PQ1 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rapport aux contrôles : pas de traitement et traitement au DMSO).
n=6
248
Le traitement PQ1 conduit à une réduction significative de la croissance
tumorale par rapport aux témoins (psans ttt = 0,001, pDMSO = 0,016); les contrôles ont
augmenté de 1 463 et 1 008 mm3 pour l'absence de traitement et le DMSO,
respectivement, tandis que les tumeurs traitées avec la PQ1 n'ont augmenté que
de 382 mm3 (Fig. 65F). Il s'agit d'une réduction de 26 et 38% de la croissance
tumorale avec le traitement PQ1 par rapport aux contrôles : aucun traitement et
DMSO, respectivement.
Les souris PyVT ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires qui
peuvent développer des tumeurs au cours de leur vie. La charge tumorale a été
surveillée au cours du traitement, et le nombre final de tumeurs pour chaque
traitement à chaque étape de développement est présenté en figure 2. Au cours
de toutes les étapes, il n'y avait pas de différence significative entre les charges
tumorales des groupes témoins. Le traitement avec PQ1 au cours du stade de
pré-developpement a réduit significativement le nombre de tumeurs développées
après le traitement (p = 0,0002 ; Fig. 66A). Au cours de la phase précoce de
formation tumorale, le traitement PQ1 a réduit significativement la charge tumorale
par rapport au groupe témoin traité au DMSO (p = 0,02 ; Fig. 66B). Le groupe
contrôle sans traitement pour ce stade de développement avait une plus grande
variation dans le nombre de tumeurs développées que dans le groupe témoin
traité au DMSO, ceci étant la différence n'était pas significative. Il n'y avait pas de
différence significative dans la charge tumorale entre les groupes expérimentaux
au stade tardif de dévloppement (Fig. 66C).
Fig. 66 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle. A/ Stade de prédéveloppement tumoral. B/ Stade précoce. C/ Stade tardif. PQ1 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rapport au contrôle : traitement au DMSO).
249
L'examen histopathologique a été mené sur les tumeurs mammaires pour
chaque groupe de traitement aux trois stades de développement tumoral. Les
tumeurs ont été classées comme adénome / néoplasie intra-épithéliale mammaire
(MIN), carcinome précoce, ou carcinome tardif. Les tumeurs contrôles au stade de
pré-développement étaient soit des adénomes / MIN soit des carcinomes
précoces, tandis que les tumeurs traitées avec PQ1 semblaient être des
carcinomes précoces ou tardifs. Les tumeurs contrôles au stade précoce de
développement étaient toutes des carcinomes précoces. Les tumeurs traitées
avec PQ1 variaient de adénome / MIN à carcinomes précoces et tardifs. Aucune
métastase pulmonaire n'a été observée pour les phases de développement pré et
précoce pour les deux groupes de traitement. Les tumeurs témoins et traitées
avec PQ1 au stade tardif de développement étaient toutes des carcinomes tardifs.
Les souris témoins au stade tardif présentaient plusieurs foyers métastatiques
dans les poumons, tandis que le traitement PQ1 a entrainé moins de souris
présentant des lésions métastatiques et moins de foyers métastatiques par souris.
L'analyse immunoblot de l'expression des connexines indique que le
traitement PQ1 a diminué l'expression de la Cx46 (Fig. 67A) et augmenté
l'expression de la Cx43 (Fig. 67B) au cours de la cancérogenèse. Au cours du
développement tumoral chez les souris PyVT contrôles, l'expression des Cx43 et
Cx46 a augmenté du stade de pré-développement au stade tardif. Les données
suggèrent que la protéine des jonctions GAP connexine 43 est exprimée à des
niveaux plus élevés chez les animaux traités avec PQ1 par rapport aux témoins et
le contraire pour la connexine 46. L'expression de la Cx46 dans les tumeurs PyVT
traitées avec PQ1 depuis le stade de pré-développement et le stade tardif
présentaient des niveaux significativement inférieurs à celui des contrôles (ppré =
0,019, pprécoce = 0,007). Au stade de pré-développement et au stade précoce les
tumeurs traitées avec PQ1 présentaient un niveau d'expression de la Cx43
significativement plus élevé que les témoins (ppré = 0,0003, pprécoce = 0,03). Au
cours du stade tardif de formation tumorale, la connexine 46 est moins exprimée
chez les souris traitées que chez les témoins, alors qu'il n'y avait pas de
changement significatif dans l'expression de la connexine 43. Ceci s'explique par
l'augmentation globale des deux connexines 43 et 46 au cours du développement
tumoral et des métastases.
250
L'expression des connexines est régie par un certain nombre de facteurs,
tels que la tension transmembranaire et transjonctionnelle, les ions cytosoliques
(Ca2+ et H+) et des modifications post-traductionnelles, principalement le statut de
phosphorylation (397-399). Toutes les connexines, à l'exception de la Cx26, sont
des phosphoprotéines ciblées par plusieurs kinases telles que la sarcoma kinase
(Src), la protéine kinase C (PKC), la protéine kinase A (PKA) et la proteines kinase
activée par le facteur mitogène (MAPK), requises pour un trafic efficace,
l'assemblage et le désassemblage, la dégradation et l'ouverture des hémicanaux
et / ou des jonctions GAP (398, 400, 401). La régulation de la GJIC par
phosphorylation est à la fois connexine et kinase spécifique (398, 402). Le rôle de
la PKCa dans la modification de l'expression des connexine induite par le
traitement PQ1 a été déterminé dans les tumeurs PyVT à chaque stade de
développement par analyse western blot (Fig. 67C) et IHC (Fig. 68). Il n'y avait
pas de changement significatif dans l'expression de la PKCα.
Fig. 67 : Expression des protéines x46 (A), Cx43 (B), PKC-α (C) et survivine (D) dans les tumeurs
PyVT aux trois stades de développement. Western blot et leur analyse. C = contrôle (DMSO). PQ
= PQ1 25 mg/kg, 7 injections IP. * = p < 0,05 par rapport au contrôle. n = 4
251
Les cellules néoplasiques utilisent des inhibiteurs de l'apoptose comme
protection contre les composés cytotoxiques. La protéine anti-apoptotique
survivine est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l'apoptose
exprimée dans une variété de types de tumeurs qui régule la mitose (281-283).
L'expression de la survivine est en corrélation avec la résistance à la
chimiothérapique et une rechute accélérée. Les tumeurs PyVT traitées avec du
DMSO ou PQ1 à chaque stade de développement ont été analysées pour
l'expression de la protéine anti-apoptotique survivine. Le traitement PQ1 a diminué
significativement l'expression de la survivine dans les tumeurs mammaires au
cours des stades de pré-développement (p = 0,014) et de développement précoce
(p = 0,028) (Fig. 67D).
L'histopathologie des tumeurs PyVT récoltées n'a pas montré de différence
significative de morphologie. L'IHC des tumeurs traitées avec PQ1 à toutes les
étapes de la formation tumorale a montré une coloration cytoplasmique positive de
la Cx43 plus forte et une coloration positive cytoplasmique de la Cx46 plus faible
que dans les tumeurs contrôles (Fig. 68). Il n'y avait pas de changement significatif
dans l'expression de la protéine Ki-67. Le carcinome mammaire développé par le
modèle transgénique PyVT est caractérisé par un modèle métastatique impliquant
le tissu pulmonaire. Les souris au stade de développement tumoral tardif
présentaient de nombreuses grosses tumeurs secondaires dans l'épithélium
pulmonaire, ce qui a été déterminé par observation et histopathologie. Une seule
lésion métastatique a été trouvée dans les échantillons de poumon recueillis à
partir des souris traitées avec PQ1, ce qui indique une diminution à la fois de la
taille et de la fréquence des métastases pulmonaires secondaires avec traitement
PQ1 (Fig. 69). Les tumeurs représentées sur les figures 69A et 69B présentent un
volume calculé de 5,9 x 106 um3 et 4188 um3 respectivement. Les tumeurs
pulmonaires présentaient des caractéristiques histopathologiques similaires à
celles du tissu mammaire.
Plusieurs organes vitaux (cerveau, cœur, foie et reins) ont également subis
un examen histopathologique afin de déterminer les effets néfastes potentiels de
l'administration de PQ1. Il n'y avait pas de changement morphologique dans les
tissus par rapport au témoin, ce qui indique que PQ1 a une spécificité pour cibler
les cellules néoplasiques plutôt que le tissu sain (Fig. 70A). Un examen plus
252
approfondi par IHC des Cx43, Cx46, PKCa et Ki-67 dans le foie a montré une forte
coloration cytoplasmique positive des Cx43, Cx46 et PKCa dans le tissu traité
avec PQ1 (Fig. 70B). Il n'y avait pas de changement significatif pour la protéine Ki67. L'exposition systémique à la PQ1au cours d'une période de 14 jours n'a eu
aucun effet nocif observable sur la santé ou le comportement des animaux.
Fig. 68 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles. A/ Stade de prédéveloppement tumoral. B/ Stade précoce. C/ Stade tardif. PQ1 : 25 mg/kg. Barre = 10 µm. n = 6
E/ Discussion
PQ1 est le premier composé ciblant les jonctions lacunaires en tant que
médicament anticancéreux dans un modèle de tumeur mammaire spontané. Cette
253
molécule a été montrée précédemment pour être un activateur spécifique de la
GJIC in vitro (8) et conduire à une augmentation de l'expression des connexines
conduisant à une diminution significative de la croissance tumorale sur modèle de
xénogreffe de cellules de cancer du sein humain T47D chez des souris nude (242).
Cette étude traduit les résultats in vitro de PQ1 obtenus précédemment dans un
contexte in vivo utilisant un modèle de carcinome mammaire spontané. Les souris
génétiquement modifiées permettent aux chercheurs d'étudier plusieurs aspects
du cancer. Plusieurs caractéristiques du modèle PyVT en font un modèle idéal
pour la recherche, comme la stabilité des colonies, le comportement prévisible de
la croissance tumorale et la similitude avec les néoplasmes humains. L'efficacité
de PQ1 à réduire la croissance des cellules tumorales est mise en évidence dans
le modèle de souris PyVT sur une période de 2 semaines. Les résultats ont
montré une réduction de 43 et 53% en volume des tumeurs par rapport à la taille
initiale aux stades de pré-développement et de développement précoce,
respectivement, alors que la réduction du volume tumoral au stade tardif de
développement avec le traitement PQ1 était de 26% par rapport aux témoins
traités au DMSO après sept injections de traitement.
Fig. 69 : Métastases de tumeurs mammaires dans l’épithélium pulmonaires, colorées à l’hemalunéosine. A/ Contrôle au stade tardif de développement B/ Femelles traitées avec PQ1 au stade
tardif de développement. Barre = 50 µm. n = 3
L'analyse moléculaire de l'expression des protéines a montré une
augmentation générale de l'expression de la Cx43 et une diminution de la Cx46
chez les souris PyVT traitées avec PQ1. Au stade de pré-développement tumoral,
254
l'expression de la Cx43 était augmentée et l'expression de la Cx46 diminuée avec
le traitement PQ1. PQ1 modifie le profil global des connexines par la régulation
positive de la Cx43 et la régulation à la baisse de la Cx46. La perte générale de la
GJIC est en corrélation avec des phénotypes tumorigènes, mais les différentes
connexines jouent des rôles distincts à des stades spécifiques de la progression
cancéreuse. Il a été observé dans des études antérieures que la proportion des
connexines constitutives des jonctions communicantes diffère suivant le stade
tumoral. La protéine Cx46 est exprimée à haut niveau à la fois dans les lignées
cellulaires de cancer du sein et les tumeurs du sein humaines (403). La réduction
d'expression de la Cx46 dans des xénogreffes de tumeurs du sein humain inhibe
la croissance tumorale chez des souris nude (403). Ceci indique que la Cx46 est
régulée à la hausse pour promouvoir la croissance et le développement des
tumeurs dans les tumeurs de cancer du sein au stade précoce. D'autres
connexines des jonctions GAP (Cx43, Cx32 et Cx26) sont considérées comme
des suppresseurs de tumeurs car la perte de celles-ci est corrélée avec une
progression des tumeurs du sein (404).
Cx46 est une nouvelle protéine des jonctions GAP dans le tissu mammaire
qui est spécifique de l'hypoxie. Burr et al. (405) ont émis l'hypothèse que la Cx46
avait des effets pro-tumoraux en raison de sa capacité à empêcher la mort
hypoxique. Les tumeurs solides peuvent présenter une régulation à la hausse de
la Cx46 pour survivre aux conditions hypoxiques répandues au cours du stade de
développement avancé, tout en induisant une perte de la Cx43, ce qui promeut la
croissance tumorale. Le traitement PQ1 altère l'expression à la fois de la Cx43 et
de la Cx46 de telle sorte qu'il normalise le tissu tumoral et empêche la croissance
tumorale. L'augmentation de la Cx43 pourrait induire une régulation à la baisse de
la Cx46, la sensibilisation des cellules tumorales à des conditions hypoxiques et
atténuer le développement tumoral. Les stades avancés de développement des
tumeurs solides sont généralement constitués de tumeurs avec plusieurs centres
hypoxiques, ce qui les rend difficiles à traiter en raison du taux plus faible de
prolifération cellulaire. PQ1 pourrait être utilisé pour restaurer l'homéostasie
normale des cellules hypoxiques et induire la mort cellulaire des cellules non
régulées.
255
Fig. 70 : Evaluation de tissus normaux issus de souris PyVT. A/ Coloration H&E n = 3. B/
Immunohistochimie Contrôle = DMSO, PQ1 = 25 mg/kg, 7 injections IP au stade tardif de
développement. Bleu = contre-coloration à l’hemalun n = 6. Barre = 10 µm
La diminution de l'expression de la protéine survivine dans le tissu
néoplasique due au traitement PQ1 trouvée pendant les phases de prédéveloppement et de développement précoce des tumeurs soutient l'hypothèse cidessus. L'expression de la survivine dans les tissus normaux est régulée au cours
du développement et est faible dans la plupart des tissus les plus différenciées.
Dans les cellules cancéreuses, la survivine élevée est souvent associée avec un
indice de prolifération élevé (406), des niveaux réduits d'apoptose (407), la
résistance à la chimiothérapie (408) et l'augmentation du taux de récurrence
tumoral (409). Le traitement PQ1 a diminué l'expression de la survivine, ce qui
suggère que les cellules tumorales sont sensibilisées aux conditions de stress,
comme l'hypoxie. Nos données suggèrent que la PQ1 peut agir comme un
256
perturbateur de la survivine, indépendant de sa fonction sur les jonctions GAP,
pour sensibiliser les cellules cancéreuses.
Les taux de prolifération des tumeurs ont été évalués dans le but de
corréler l'expression avec un pronostic. La protéine Ki-67 est l'un des régulateurs
du cycle cellulaire que l'on peut observer par IHC. L'anticorps anti-Ki-67 réagit
avec une protéine nucléaire non histone qui est exprimée à haut niveau dans
toutes les phases actives de la mitose, sauf G0 (410). Un index Ki-67 élevé par
IHC est associé à une mauvaise différenciation des tumeurs, une taille importante
et un risque accru de récurrence (411). Il n'y avait pas de changement observable
dans l'expression de la protéine Ki-67 due au traitement PQ1, ce qui indique que
PQ1 n'est pas impliquée dans la prolifération des cellules néoplasiques dans le
modèle PyVT.
Avec le développement des tumeurs PyVT, se produit une augmentation de
l'expression des Cx43 et Cx46, qui peut être caractéristique d'une augmentation
du potentiel métastatique de la lésion. La tumeur métastatique, représenté par le
stade tardif de développement, a une expression significativement plus élevé de
Cx46 par rapport aux autres stades de développement (Fig. 68A), ce qui suggère
que cette régulation à la hausse pourraitt contribuer à la tumorigenèse. Avec le
traitement PQ1, l'élévation de l'expression de la Cx46 au cours du développement
est diminuée, ce qui laisse supposer que le traitement atténue la formation de
tumeurs et de retarde le processus de métastase. Cette hypothèse est étayée par
la réduction de l'incidence de formation de tumeurs secondaires dans l'épithélium
pulmonaire avec le traitement PQ1. Les tumeurs primaires qui présentent
initialement une GJIC diminuée deviennent compétentes pour la GJIC au cours du
stade métastatique (246). L'expression accrue des connexines et la GJIC
diminuée sont en corrélation avec une capacité invasive et la métastase dans une
variété de types de cellules cancéreuses, notamment du cancer du sein. Les
profils d'expression des connexines changent de celui d'une cellule métastatique à
un profil plus semblable à celui d'une cellule de l'épithélium mammaire normal
avec expression du gène suppresseur de métastase BRMS1 (412). Ceci suggère
que la composition en connexines des jonctions communicantes contribue au
potentiel métastatique. Bien que la fonctionnalité des jonctions GAP n'ait pas été
testée, les données présentées montrent un haut niveau d'expression des Cx43 et
257
Cx46 au cours du stade tardif de développement et de la métastase.
L'expression de la PKCa ne varie pas entre les groupes de traitement. La
PKC est la principal kinase régulant la GJIC par phosphorylation du domaine Cterminal (398), qui a été montré être nécessaire pour le désassemblage des Cx43
dans les cellules épithéliales du cristallin (413). Morley et al. (414) ont montré que
l'inhibition de la PKC (PKCa et / ou PKCb1) augmentait la GJIC pour réduire la
prolifération des cellules tumorales, ce qui était dû à un acheminement modifié
des connexines. Les données présentées ici montrent une altération de
l'expression des connexines sans changement dans l'expression de la PKCa. Ceci
suggère que la PQ1 affecte l'expression des connexines à travers un mécanisme
qui soit n'a pas d'incidence sur la PKCa, mais plutôt une autre isoforme de la PKC;
soit n'implique pas la phosphorylation du domaine C-terminal des connexines.
Le promoteur MMTV est un promoteur inductible par une hormone
glucocorticoïde (415) qui a été utilisé comme un système idéal pour la génération
de modèles de développement de tumeurs chez des souris transgéniques dans
les glandes mammaires et les tissus urogénitaux en raison de sa haute et
inductible activité dans ces tissues (416). L'évaluation pathologique des tumeurs
après le traitement a conduit à l'observation que que les tumeurs traitées avec
PQ1 au stade de pré-développement étaient histologiquement décrites comme
étant des carcinomes précoces ou tardifs, alors que les tumeurs contrôles étaient
des adénomes / MIN ou carcinomes précoces, ce qui implique que le traitement
conduit à une augmentation de la malignité. Pour préciser les résultats, une seule
des six tumeurs évaluées dans ce groupe de traitement a été caractérisée comme
carcinome tardif, ce qui peut être dû à la variation biologique dans le modèle
transgénique. Cette augmentation de la malignité peut être expliquée par
différents niveaux d'expression du transgène due à la variation du nombre de
copies, ou différentes expressions spatiale ou temporelle du transgène dans le
tissu. Une augmentation de l'incidence des tumeurs est commune avec une
expression élevée du transgène dans le tissu mammaire avec des effets
hormonaux sur le MMTV (417). Des niveaux d'expression quantitativement
différents sont possibles en raison de différences dans le nombre de copies du
transgène, ce qui conduit à une variation de l'incidence tumorale et du phénotype.
Par conséquent, la tumeur unique caractérisée comme plus agressive par
258
l'évaluation pathologique peut simplement avoir des niveaux plus élevés du
nombre de copies du transgène. En outre, le stade de pré-développement tumoral
se produit en concurrence avec la puberté, au cours de laquelle des niveaux
d'hormones en circulation proche des niveaux adultes sont présents. La maturité
sexuelle murine coïncide normalement avec une augmentation de la circulation de
gonadotrophine peu après 4 semaines d'âge. Le moment précis où la maturité
sexuelle se produit est très variable entre les souris. Des niveaux élevés
d'hormones circulantes peuvent affecter l'activation de la séquence du promoteur,
conduisant à une variation dans la tumorigenèse. Les niveaux d'expression du
transgène pour les échantillons tumoraux n'ont pas été déterminés.
L'efficacité de plusieurs médicaments anticancéreux est limitée par leur
toxicité pour les cellules normales et à croissance rapide des tissus vitaux.
L'administration par gavage de PQ1 a montré que l'exposition des organes vitaux
avait une faible toxicité (396). Pour cette étude, le foie et les reins ont été
examinés histologiquement pour déterminer les effets potentiellement néfastes de
l'exposition systémique à un activateur des jonctions GAP. Le traitement PQ1 n'a
montré aucun effet nuisible observable sur ces organes. Il est certain que
l'augmentation observée par IHC dans l'expression des Cx43 et Cx46 dans le foie
peut provoquer des lésions. Aucune toxicité aiguë n'a été observée dans cette
étude. Des études de survie à long terme après le traitement PQ1 sont
nécessaires pour déterminer si le tissu normal est vraiment affecté.
Les cellules normales peuvent envoyer un signal aux cellules malignes
adjacentes pour qu'elles restaurent leur phénotype ou induisent l'apoptose (261)
mais le défaut d'expression des connexines intervient dans la régulation de la
prolifération, la différenciation et la mort cellulaire, l'entretien de l'homéostasie et la
réduction de la mitose en fin de G1, S et M (205), ce qui suggère une implication
dans la carcinogenèse (2). Une nouvelle classe d'activateurs des jonctions GAP
modifie la croissance tumorale dans un modèle animal de carcinome mammaire
spontané, sans effets secondaires apparents. Cette étude apporte une preuve
supplémentaire que l'expression des connexines et la croissance cellulaire sont
inversement corrélées dans les lésions malignes, ce qui confirme les résultats de
Saez et al. (263). Les études antérieures sur la PQ1 effectuées sur des cellules
T47D chez des souris nude, et ces résultats obtenus en utilisant un modèle de
259
carcinome mammaire spontané, sont prometteurs pour le développement d'une
nouvelle chimiothérapie pour le traitement du cancer du sein et potentiellement
d'autres types de cancer, chez l'Homme. PQ1 peut également être combinée avec
d'autres médicaments anticancéreux pour réduire leur toxicité et augmenter leur
efficacité.
260
III/ Biodisponibilité et efficacité d'un stimulant des jonctions
GAP (PQ7) dans un modèle de tumeur mammaire murin
Traduit de l'anglais : Shishido et al. (418)
A/ Résumé
La perte de communication intercellulaire au travers des jonctions GAP
(GJIC) est caractéristique des cellules néoplasiques, ce qui suggère que la
restauration avec un enhancer des jonctions GAP peut être une nouvelle option
thérapeutique avec moins d'effets néfastes que les traitements antinéoplasiques
traditionnels. Un enhancer des jonctions GAP, le 6-methoxy-8-[(2- furanylmethyl)
amino]-4-methyl-5-(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoline (PQ7), a été évalué sur
le tissu normal chez des souris C57BL/6J saines dans une étude systémique de la
distribution des médicaments. L'analyse par immunotransfert des organes vitaux
indique une réduction de l'expression de Cx43 chez les animaux traités aux
quinoléines substituées PQ7 sans changement morphologique observable.
Ensuite, la souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également
connue sous le nom PyVT) a été utilisée comme modèle murin de formation
spontanée de tumeurs mammaires pour déterminer les effets biologiques et
histologiques des PQ7 sur la tumorigenèse et la métastase à trois stades de
développement : pré-tumeur formation, tumeur précoce, tumeur tardive. Les PQ7
ont été évaluées avoir une faible toxicité par administration intrapéritonéale, avec
la majorité du composé détectée dans le cœur, le foie et les poumons six heures
après injection. Le traitement des animaux porteurs de tumeur avec PQ7 a montré
une réduction de 98% de la croissance des tumeurs, tout en diminuant la charge
tumorale totale par rapport aux souris témoins au cours de l’étape de prédéveloppement. Le traitement PQ7 a entrainé une augmentation de l'expression
des Cx43 dans le tissu néoplasique pendant la pré-formation tumorale ; toutefois,
cet effet n'a pas été observé au stade tardif de formation des tumeurs. Cette étude
montre que l'enhancer des jonctions GAP, PQ7, a une faible toxicité pour les
tissus normaux des souris C57BL/6J en bonne santé, tout en ayant une efficacité
clinique dans le traitement de tumeurs mammaires spontanées chez les souris
261
PyVT. En outre, la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP et
la croissance cellulaire néoplasique se sont avérées être inversement liées, tandis
que le traitement aux PQ7 inhibe la croissance tumorale en ciblant l'expression
des jonctions GAP.
B/ Introduction
La communication intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC) joue
un rôle important dans le maintien de l'homéostasie tissulaire. La GJIC est le
processus dans lequel de petits métabolites sont partagés directement par des
cellules contiguës qui ont leurs cytoplasmes reliés par des canaux aqueux appelés
jonctions communicantes. La perte de GJIC est liée à la pathogenèse de plusieurs
maladies telles que la surdité et la perte auditive, les cataractes, maladies de la
peau, la dysplasie oculodentodigital et le cancer (419). L'amélioration ou la
restauration de jonctions communicantes fonctionnelles pourraient être une option
de thérapeutique pour ces maladies. Ici nous nous concentrons sur la
pathogenèse du cancer en relation avec la perte de l'expression des protéines de
jonctions GAP. Une classe de quinoléines substituées a été décrite dans l'article
de Shi et al. et les effets du composé de première génération (PQ1) comme
enhancer des jonctions GAPdans des lignées cellulaires de cancer du sein ont été
explorés (180, 202). Le composé de deuxième génération, le 6-methoxy-8-[(2furanylmethyl) amino]-4-methyl-5-(3- trifluoromethylphenyloxy) quinoline (PQ7), a
montré une amélioration de l'activité GJIC dans les cellules cancéreuses, avec un
effet plus puissant sur la GJIC que la première génération PQ1 (242).
De nombreux procédés de traitement du cancer utilisent des agents de
chimiothérapie qui ciblent les cellules mitotiques mais ce n'est pas spécifique des
cellules cancéreuses et conduit à des effets secondaires graves. La perte de la
GJIC par les cellules cancéreuses est spécifique, ce qui suggère que la
restauration de la GJIC peut fournir un traitement avec moins d'effets néfastes sur
l'hôte. Des études antérieures indiquent que l'administration de PQ1 par gavage
oral a une faible toxicité pour les tissus normaux de souris C57BL/6J en bonne
santé, sans effet indésirable observable (396), tout en atténuant sensiblement la
262
croissance des xénogreffes de tumeurs chez des souris nude (267). Ici, on explore
la distribution et les effets anti-néoplasiques des PQ7.
Cette première étude a déterminé la distribution systémique des PQ7 après
injection intrapéritonéale chez des souris C57BL/6J saines. La distribution du
médicament aux organes vitaux a été déterminée à différentes périodes de temps
après l'injection. L'analyse par observation histologique des tissus traités aux PQ7
n'a pas montré de modification significative dans l'organisation ou la structure des
tissus, ce qui suggère une faible toxicité. Ensuite, les PQ7 ont été utilisées en tant
que traitement du carcinome mammaire dans un modèle murin formation
spontanée de tumeurs mammaires. La génération in situ de tumeurs mammaires
chez la souche transgénique FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également
connue sous le nom PyVT) a été utilisée pour déterminer les effets biologiques et
histologiques des PQ7 sur la tumorigenèse et la métastase spontanée. Le modèle
de PyVT porte l'antigène moyen T du polyomavirus avec une expression
spécifique au tissu mammaire entraînée par le virus de la tumeur mammaire de la
souris (MMTV) (353). Les femelles vierges qui portent le transgène développnt
des carcinomes canalaires infiltrants peu différenciés, multi-focalaux avant 10-12
semaines d'âge, avec une incidence élevée de métastases pulmonaires issues de
la tumeur mammaire primaire (355). Les lésions focales non invasives se
développent en 5 semaines et sont classées en quatre groupes : simples, solides,
kystiques et mixtes (solides et kystiques) (356). Le développement des tumeurs a
été divisé en trois périodes de temps : stade pré-tumoral (jusqu'à l'âge de 4
semaines), stade tumoral précoce (de 6 à 8 semaines) et stade tumoral tardif (plus
de 10 semaines). Pour chaque stade, l'effet de l'administration de PQ7 a été
évalué et l'expression de protéines des jonctions GAP a été mesurée sur le tissu
traité.
263
C/ Matériels et méthodes
i/ Déclaration éthique
L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médicine comparée
(CMG) au Collège de médecine vétérinaire de l'Université d'État du Kansas. Les
animaleries du CMG sont entièrement accréditées par l'association internationale
pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire
(AAALAC). La conformité de certains aspects de la protection des animaux est
contrôlée régulièrement par le personnel vétérinaire. Les protocoles de soins aux
animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel de
protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université d'État du Kansas,
Manhattan (Numéro de protocole : 2950), suivant les directives du NIH.
ii/ Composés
PQ7,
6-methoxy-8-[(2-furanylmethyl)
amino]-4-
methyl-5-(3-
trifluoromethylphenyloxy) quinoléine a été préparé comme indiqué précédemment
(180).
iii/ Animaux
Des souris femelles C57BL/6J (The Jackson Laboratories, Bar Harbor,
Maine 04609 USA) d'environ 5 semaines d'âge ont été utilisées dans les
expériences de distribution. Toutes les souris ont été logées ensemble dans un
environnement à température contrôlée (72 F / 22°C) avec un cycle lumièreobscurité de 12 heures et un accès illimité à de la nourriture standard pour souris
et de l'eau. Six animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de
traitement et 25 mg / kg de PQ7 leur ont été administrés par injection
intrapéritonéale (IP). A 6, 12, 24 et 36 heures après injection, tous les organes ont
été prélevés à partir des animaux euthanasiés par inhalation de dioxyde de
carbone.
264
Une colonie de souris transgéniques FVB-TgN (MMTV-PyVT) (The Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME) a été créée pour les études de carcinomes
mammaires. Pour identifier la descendance transgénique, l'ADN génomique a été
extrait à partir d'un écrêtage de queue de 1,5 cm. Toutes les souris portant le
transgène PyVT ont développé des tumeurs mammaires. Le développement de
tumeurs chez lessouris femelles positives a été suivi de près tous les 2-3 jours.
L'apparition de tumeurs a été enregistrée comme l'âge auquel des masses
palpables anormales ont été détectés. La taille des tumeurs a été mesurée en
deux dimensions avec un pied à coulisse tous les 2 jours dès 5 semaines d'âge.
Le volume des tumeurs a été déterminé par l'équation suivante : Volume = 1/2
(Longueur) * (largeur)2. Les souris ont été observées pour un changement de
comportement, l'aspect et le poids. Lorsque les animaux ont atteint une tranche
d'âge spécifique, six animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de
traitement et administré 25 mg / kg par injectionIP de PQ7. Les protocoles de
soins aux animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel
de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à Kansas State University,
Manhattan, Kansas, suivant les directives du NIH.
iv/ Études de distribution des PQ7 chez la souris (HPLC et spectrométrie de
masse)
a/ Extraction des PQ7 des organes et du plasma
Les organes ont été coupés en petits morceaux, suivi par l'addition de 4 mL
d'eau déminéralisée et 10 ml d'une solution de rapport 9:1 d'acétate d'éthyle et de
1-propanol. Des échantillons de plasma ont été directement mélangés avec 4 mL
d'eau et 10 mL d'une solution 9:1 d’acétate d'éthyle et de 1-propanol. Les
solutions de tissus et de plasma ont été séparément traitées par ultrasons pendant
40 minutes et 10 minutes, respectivement ; et la couche organique a été séparée
à l'aide d'une ampoule à décanter. La couche aqueuse a été extraite deux fois
avec 10 mL d'une solution 9:1 d'acétate d'éthyle et de 1-propanol. Les couches
organiques ont été combinées, lavées avec 5 mL de saumure, séchées sur
MgSO4 anhydre et concentrées à sec à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le résidu a
265
été dilué avec 1 mL de 1-propanol et filtré à travers un filtre discal de 0,2 um
(polytetrafluoroethylene, or PTFE, de 0,2 um, Fisherbrand) et analysé par
chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse
comme décrit ci-dessous.
b/ Quantification de PQ7 par HPLC
L'analyse par HPLC a été réalisée sur un Varian Prostar 210 avec un
détecteur UV-visible et une colonne en phase inverse (250 x 21,20 mm, 10
microns, Phenomenex, S. No : 552581-1). Un flux de 5 mL / min et une détection
de la longueur d'onde de 254 nm ont été utilisés. Un gradient d'élution du solvant
A, contenant de l'eau désionisée et 0,01 % d'acide trifluoroacétique, et du solvant
B, contenant de l'acétonitrile et 0,01 % d'acide trifluoroacétique, a été appliqué
pour l'analyse. L'acide 1, 2, 4,5-benzènetétracarboxylique (BTA) a été utilisé
comme étalon interne pour quantifier la quantité de PQ7 dans les extraits
tissulaires. Des solutions de 100 uL de divers mélanges de PQ7 et BTA ont été
injectés dans un instrument de HPLC, les aires des pics correspondant aux PQ7
et BTA et ont été intégrées à partir du chromatogramme HPLC et les rapports
entre les pics ont été obtenus. Les résultats des rapports des aires des pics HPLC
et des ratios de concentrations de PQ7 et BTA ont été placés sur un graphique, et
une ligne de corrélation linéaire a été obtenue à partir du graphique. Par
conséquent, l'utilisation de ce schéma de corrélation, le rapport des surfaces des
pics HPLC de PQ7 et BTA à partir d'extraits de tissus et la quantité connue
ajoutée de BTA aux extraits de tissus, la quantité de PQ7 dans l'extrait tissulaire a
été determinée. Ensuite, 100 µL d'un mélange 1:1 en volume des extraits de
tissus ou de plasma et de BTA de concentration connue ont été injecté dans l'
HPLC ; les pics correspondant aux PQ7 et BTA ont été intégrées dans le
chromatogramme HPLC, et le rapport de leurs masses a été déterminé. Comparer
le rapport des masses des pics de PQ7 dans l'extrait et le niveau de BTA au
rapport des masses des pics de PQ7 et BTA de la courbe de référence, la masse
de PQ7 dans les organes et le plasma a été quantifiée.
266
v/ Spectroscopie de masse
Un spectromètre de masse Applied Biosystem API 2000 LS/MS/MS a été
utilisée pour l'analyse. L'éluant correspondant au pic de PQ7 de la HPLC a été
recueillie et injecté dans le spectromètre de masse. Une masse de 406,
correspondant à la masse M + 1 de PQ7, a été trouvée dans le spectre de masse,
et le motif de fragmentation de cette masse M + 1 est similaire à celui de la PQ7
d'origine, vérifiant l'identité de PQ7.
vi/ Anticorps
Les anticorps primaires : anti-Cx46 (sc-20859, anticorps polyclonal de
chèvre), anti-PKCa (sc-8393, anticorps monoclonal de souris) et anti-Cx43 (sc13558, anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,
CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling (Boston,
MA) ont été utilisés à la fois pour les analyses western blot et l'immunohistochimie
(IHC).
vii/ Analyse Western blot
Les tissus des tumeurs des glandes mammaires et des organes choisis
(coeur, poumons, foie, rate, reins, utérus et cerveau) ont été homogénéisés dans
500 mL de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM,
0,5 % de Triton X- 100) et des inhibiteurs de protéases à une dilution de 1:1000
(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI
Bead Ruptor 24 (Omni International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s
pendant 45 secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30
minutes à 4°C. Vingt-cinq microgrammes d'extrait de cellules entières ont été
résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS 10% (PAGE) et
transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest scientifique, Saint Louis,
MO). Les membranes de nitrocellulose ont été bloquées dans 5% de lait pendant
une heure à température ambiante, puis mis à incuber avec des anticorps
monoclonaux (1:1000). Les transferts ont été détectés par des réactifs de
267
détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, Illinois, Etats-Unis)
et visualisés par le système d'imagerie Fluorochem E (ProteinSimple, Santa Clara,
CA).
viii/ Immunohistochimie (IHC)
Les carcinomes mammaires et les organes ont été prélevés et fixés dans
une solution de formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine
préalablement à leur sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Les
sections de paraffine (5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le
déparaffinage a été réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 %
d'éthanol. L'antigène extraction a été effectuée dans une solution tampon de
citrate dans une chambre à vapeur. Les lames ont été ensuite incubées pendant
une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (dilution 1:50).
Après lavages dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées avec des
anticorps secondaires biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les lames ont été
lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du
complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été
visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration
hemalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec un
microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.
ix/ Analyse statistique
La signification statistique a été déterminée pour une p-value ≤ 0,05. Les
données sont présentées comme la moyenne ± l'intervalle de confiance à 95 %
d'un minimum de trois échantillons par groupe de traitement.
\
268
D/ Résultats
i/ Distribution des PQ7
La connaissance de la distribution des PQ7 dans un système biologique est
importante pour l’utilisation potentielle de ce composé comme agent anticancéreux. PQ7 à 25 mg / kg a été administrée à 5 semaines d'âge chez les
souris femelles par injection intrapéritonéale. La quantité totale de PQ7
administrée à chaque animal a été définie comme 100%. Six heures après
l'injection de PQ7, seulement 8,14 % du composé était détectable dans le tissu
prélevé. À 12, 24 et 36 heures après l'administration 4,65, 1,53 et 0,29 % du
composé d'origine étaient mesurable par HPLC, respectivement. Six heures après
le traitement, la majorité des PQ7 ont été détectées dans le cœur, le foie, les
poumons et l'utérus à des taux de 1,4 % (107 uM), 1,3 % (98,74 uM), 1,2 % (90,90
uM) et 1,1 % (82,02 uM) de la quantité totale administrée, respectivement (Fig. 71).
Un niveau inférieur détectable a été mesuré dans les reins 0,85 % ; 65,94 uM) et
le cerveau (0,92 % ; 71,34 uM). A 12 heures post-exposition, la concentration de
PQ7 a changé dans le foie de 1,28 % 6 heures après l'injection à 0,47 % (34,73
M). A ce temps, PQ7 n'était plus détectable dans la rate. 24 heures après injection,
le composé n'était plus détectable dans le cœur ou l'utérus, tandis que les
poumons et l'intestin présentaient les concentrations les plus élevées, 0,41 %
(31,83 uM) et 0,48 % (38,05 uM), respectivement. Après 24 heures de traitement,
aucune PQ7 n'a été trouvée dans la plupart des organes testés ou le plasma. À 36
heures après l'exposition, le composé a été détecté en quantité limitée dans
l'intestin (0,21 % ; 15,01 uM) et le foie (0,07 % ; 5,21 uM). La tendance de
distribution des PQ7 est restée assez constante dans tous les tissus testés, dont
le plasma.
Les résultats ont été obtenus à partir d'échantillons de taille n = 6 souris.
269
Fig. 71 : Distribution du compose PQ7. Les souris traitées avec 25 mg/kg de PQ7 ont été
euthanasiées après 6, 12, 24 ou 36h. Quantité totale de PQ7 administrée = 100%. n = 6
270
ii/ Analyse des organes vitaux après exposition aux PQ7
Fig. 72 : Effet du
compose PQ7 sur
l’expression des
Cx43 dans les
tissus normaux. A/
Immunohistochimi
e. Injection unique
de PQ7 25 mg/kg.
Bleu = contrecoloration à
l’hemalun. n = 6.
B/ Représentation
graphique de
l’analyse Western
blot. Contrôle =
souris non traitées.
Résultats
exprimés en
pourcentage de
l’intensité de la
bande d’actine
(contrôle). * = p <
0,05 par rapport
au contrôle (souris
non traitées)
Plusieurs organes vitaux (cerveau, cœur, foie et reins) ont été examinés
par histopathologie afin de déterminer les effets potentiellement néfastes de
l'administration de PQ7 en une dose unique ou en 7 doses réparties sur une
271
période de 14 jours. Aucun changement morphologique, signe d'hémorragie ou
d'inflammation dans les tissus n'ont été observés par rapport au contrôle. Ceci
indique que les PQ7 n'avaient pas de toxicité pour les tissus normaux des souris
C57BL/6J saines. Toutes les souris exposées au PQ7 n'ont pas souffert d'effets
néfastes sur leur état de santé ou de modification du comportement.
Les PQ7 se sont avérées améliorer la GJIC et augmenter l'expression des
connexines (Cx) dans les cellules néoplasiques (242, 267). Les niveaux
d'expression des Cx43 dans les organes traités aux PQ7 et les organes non
traités ont été comparés. Cx43 ont été détectées dans tous les tissus testés (Fig.
72A). Le traitement aux PQ7 a initialement diminué l'expression des Cx43 dans le
cœur, les poumons, le foie, l'utérus et le cerveau à 6 heures après injection (Fig.
72B). La rate présentait une diminution significative de l'expression des Cx43 à 12
heures après l'injection. Le coeur et le foie ont récupérés des niveaux d'expression
normaux après 24 heures. L'expression des Cx43 dans les poumons, l'utérus et le
cerveau est restée nettement inférieure à la normale au cours des 36 heures
observées. Il n'y avait aucun effet secondaire observable en raison des niveaux
d'expression diminués. Les reins n'ont pas connu de changement dans
l'expression des Cx43.
iii/ Effet des PQ7 sur la croissance tumorale dans un modèle de formation
spontanée de tumeurs mammaires
Les souris transgéniques FVB-TgN (MMTV) PyVT femelles ont développé
des tumeurs dès l'âge de 5 semaines et atteint la charge tumorale maximale à
environ 15 semaines d'âge. Le développement des tumeurs a été divisé en trois
phases sur la base de la mesure de : la taille des tumeurs, la fréquence de
formation des tumeurs et la présence de métastases pulmonaires. Le stade prétumoral s'est produit à environ 4-5 semaines d'âge, constitué d'un état
précancéreux où aucune tumeur n'était palpable et le tissu mammaire semblait
normal sur simple observation. Le stade précoce de développement est
représenté par la formation de tumeurs solides dans le tissu mammaire et
l'observation de 1 ou 2 tumeurs solides entre 6-8 semaines d'âge. Le stade tardif
s'est produit après 10 semaines d'âge et se composait de la présence de
272
l'ensemble des 10 tumeurs mammaires primaires et des métastases pulmonaires
secondaires. La présence de métastases dans le poumon a été confirmée par
coloration hémalun-éosine (H&E) de sections représentatives du tissu suivie par
examen histopathologique.
Fig. 73 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT femelle. A, B/ Stade de prédéveloppement tumoral. C, D/ Stade précoce. D, E/ Stade tardif. Les jours 0-12 correspondent aux
7 injections et le jour 14 correspond à la fin de l’étude (mesures avant prélèvement des organes).
PQ7 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rapport aux contrôles : pas de traitement et traitement au DMSO).
n=6
273
La croissance tumorale sur une période de 14 jours avec 7 injections IP de
PQ7 ou DMSO a montré un effet significatif du traitement PQ7 sur le stade prédéveloppement néoplasique chez les souris femelles PyVT. Le volume des
tumeurs initiales pour toutes les souris au stade pré-tumoral était de 14,27 ± 13
mm3. Il y avait une différence significative du volume tumoral entre les souris
traitées aux PQ7 et au DMSO pendant la phase pré-développement du jour 8 au
jour 14 (Fig. 73A). Les PQ7 ont considérablement atténué la croissance des
tumeurs avec un volume final de 27,8 mm3 après la période de traitement de 14
jours (p-value = 0,0008). La croissance tumorale finale des souris témoins traitées
au DMSO était de 377 mm3. Le changement de volume de la tumeur au cours de
la période de 14 jours montre une atténuation significative de la taille des tumeurs
suite au traitement PQ7 par rapport aux deux contrôles (p-value sans traitement =
0,005, p-value DMSO = 0,0005 ; Fig. 73B). Il y avait une différence de 98% entre
les changements globaux de croissance tumorale après traitement aux PQ7.
Le volume initial des tumeurs pour toutes les souris au stade précoce était
de 104 ± 53 mm3. Au cours de ce stade de développement il n'y a pas eu de
différence significative dans la croissance des tumeurs entre les groupes de
traitement (Fig. 73C et 73D). Lors de la phase tardive de développement tumoral,
les souris ont commencé le traitement avec un volume initial des tumeurs de 676
± 134 mm3. Les PQ7 n'ont pas atténué la croissance tumorale par rapport au
contrôle lors de la phase tardive de développement (Fig. 73E et 73F).
Les
souris PyVT ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires qui peuvent
développer des tumeurs au cours de leur vie. Le nombre total de tumeurs
palpables, défini comme étant la charge tumorale, a été contrôlé au cours du
traitement et le nombre final de tumeurs pour chaque groupe de traitement à
chaque étape du développement est présenté (Fig. 74A et 74C). Au cours de
chacune des trois étapes il n'y avait pas de différence significative entre les
charges tumorales entre les deux groupes de contrôle. Le traitement aux PQ7 lors
de l'étape de pré-développement réduit significativement le nombre de tumeurs
développées après traitement (p < 0,00001 ; Fig. 74A). Il n'y avait pas de
différence de la charge tumorale entre les groupes expérimentaux de stade
précoce ou tardif de développement tumoral (Fig. 74B et 74C).
274
Les tumeurs ont été analysées afin de déterminer la quantité de PQ7
détectable environ 48 heures après la dernière injection IP. A chaque stade de
développement, le composé d'origine était mesurable dans le tissu néoplasique
récolté à partir des animaux traités. Les stades pré-tumoral et précoce de
formation tumorale présentaient une concentration de 37 pM de PQ7, alors que
les tumeurs de stade tardif avaient une concentration de 1,1 nM de PQ7 (Fig. 75A).
Ceci indique que le composé d'origine est resté dans la tumeur pendant au moins
48 heures après une période de traitement de 14 jours avec 7 injections IP.
iv/ Analyse pathologique des tumeurs PyVT après traitement aux PQ7
Fig. 74 : Nombre de tumeurs développées chez la
souris
PyVT
femelle.
A/
Stade
de
pré-
développement tumoral. B/ Stade précoce. C/
Stade tardif. PQ7 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par
rapport aux contrôles).
L'examen
histopathologique
des
tumeurs mammaires de souris PyVT a été
réalisé pour chaque groupe de traitement
aux
trois
stades
de
développement
tumoral. Lorsqu'elles sont présentes, les
tumeurs ont
adénome
été
/
classées comme
néoplasie
intra-épithéliale
mammaire (MIN), carcinome précoce ou
carcinome tardif. Un adénome / MIN
impliquait une expansion des acini et
canaux par une prolifération de cellules
épithéliales
néoplasiques
polygonales
avec coalescence multifocale des canaux
et
des
acini
affectées.
Les
cellules
néoplasiques présentaient des atypies
275
cellulaires minimales et un index mitotique faible (0-2 par champ à un
grossissement de 40x). La prolifération néoplasique était limitée par la membrane
basale et il y avait un manque de tissu conjonctif fibreux au sein de la tumeur. Les
carcinomes précoces étaient non encapsulé et modérément bien délimités, avec
des nids serrés et acini de cellules néoplasiques avec des atypies cellulaire
légères à modérées et 1-3 mitoses par champ à 40X. Les cellules néoplasiques
ont passé la membrane basale et étaient séparées de façon multifocale par une
quantité faible à modérée de stroma fibro-vasculaire. Les carcinomes tardifs
étaient non encapsulés, mal délimités et invasifs, composés de feuillets de nid
serrés et d'acini de cellules néoplasiques séparées par une quantité modérée de
stroma fibro-vasculaire. Les anisocytoses et anisocaryoses étaient modérées et
on observait en moyenne 1-3 mitoses par champ à 40X. Les carcinomes
adénosquameux étaient des carcinomes tardifs avec différenciation squameuse.
Fig. 75 : Analyse de tumeurs isolées de souris PyVT femelles 48h après la dernière injection. A/
Quantité de PQ7 dans l’homogénat. B, C et D : Expression des protéines Cx43, Cx46 (B) et PKC-α,
respectivement. Représentation graphique de l’analyse Western blot. PQ7 25 mg/kg, 7 injections
IP aux trois stades de développement. * = p < 0,05 par rapport au contrôle. n = 4
276
Les tumeurs de pré-développement des contrôles étaient soit des
adénomes/MIN soit des carcinomes précoces tandis que les tumeurs traitées aux
PQ7apparaissaient comme des hyperplasies focales ou des adénomes/MIN ou
des carcinomes précoces. Les tumeurs contrôles de stade précoce étaient toutes
des carcinomes précoces. Les tumeurs traitées aux PQ7 au même stade variaient
entre adénomes / MIN, carcinomes précoces et carcinomes tardifs. Au stade tardif,
les tumeurs contrôles comme traitées aux PQ7 étaient des carcinomes tardifs. En
outre, quelques tumeurs traitées aux PQ7 au stade tardif ont été identifiées
comme des carcinomes adénosquameux. L'examen histologique des tissus
pulmonaires à partir de toutes les souris à un stade avancé n'a montré aucune
différence significative en termes de présence de foyers métastatiques entre les
groupes de traitement.
v/ Effet de PQ7 sur l'expression de la connexine dans le tissu néoplasique
Il a été montré que les PQ7 amélioraient la GJIC et augmentaient
l'expression des Cx43 dans les cellules de cancer du sein (242) ; par conséquent,
la composition différentielle de protéines connexines dans les tumeurs traitées aux
PQ7 a été déterminée. Bien que la plupart des connexines soient des tumeursuppresseurs, il a été montré que les Cx46 étaient régulées à la hausse dans des
lignées cellulaires de cancer du sein et d'autres tumeurs pour fournir une
protection dans des conditions d'hypoxie (403). L'analyse immunoblot de
l'expression des connexines indique que le traitement PQ7 a augmenté
l'expression des Cx43 (Fig. 75B) et diminué l'expression des Cx46 (Fig. 75C)
durant les stades précoces de la carcinogenèse. Au cours du développement des
tumeurs PyVT chez les souris contrôles, il y avait une augmentation de
l'expression des Cx43 et Cx4 du stade pré-tumoral au stade tardif. Les données
suggèrent que la protéine connexine 43 des jonctions GAP a été exprimée à des
niveaux plus élevés chez les animaux traités aux PQ7 par rapport aux témoins et
le contraire pour la connexine 46 en début de formation des tumeurs. L'expression
des Cx46 dans les tumeurs traitées aux PQ7 aux stades pré-développement et
tardift était significativement moins élevée que celle des témoins (p-value pré =
0,016, p-value tardif = 0.0007). Les tumeurs traitées aux PQ7 au stade de pré277
développement avaient des niveaux d'expression des Cx43 significativement plus
élevés que les témoins (p-value pré = ,040) tandis que durant la phase tardive,
elles
avaient
significativement
moins de Cx43 que
les
témoins
(p-
value tardif = 0.03).
Ceci
peut
s'expliquer
par
l'augmentation
globale à la fois
des connexines 43
et des connexines
46
durant
le
développement
tumoral et létastase
chez
les
souris
PyVT.
Fig.
76 :
Immunohistochimie de
tumeurs
issues
de
souris PyVT femelles.
Contrôle = DMSO. PQ7
25 mg/kg, 7 injections
IP aux trois stades de
développement. Barre
= 10 µm. n = 6
278
L'histopathologie des tumeurs PyVT récoltées n'a montré aucune différence
significative dans la morphologie. L'immunohistochimie des tumeurs traitées aux
PQ7 aux stades de pré-développement et de développement précoce montrait
une plus forte coloration cytoplasmique des Cx43 alors que durant la phase
tardive la coloration cytoplasmique des Cx43 était plus forte dans le tissu contrôle
par rapport au tissu traité (Fig. 6A). L'immunohistochimie des Cx46 a indiqué une
coloration positive plus faible des tumeurs traitées par rapport aux témoins. Cela
confirme l'analyse moléculaire mentionnée précédemment.
Les protéines des jonctions GAP sont des phosphoprotéines qui sont
ciblées par des kinases pour l'acheminement, l'assemblage et désassemblage, la
dégradation et la fermeture des hemicanaux (398, 400, 401). La phosphorylation
régule la GJIC de manière spécifique à la fois de la kinase et de la connexine (398,
402). Comme les PQ7 modifient l'expression des connexines, nous avons exploré
le rôle de PKCa dans les tumeurs traitées aux PQ7 à chaque étape du
développement par analyse western blot (Fig. 75D) et immunohistochimie (Fig.
76C). Aucune modification significative de l'expression de la protéine kinase PKCa
n'a été observée suite au traitement PQ7. De façon intéressante, dans les tumeurs
contrôles, il semblait y avoir une plus forte coloration au stade de prédéveloppement par rapport au stade tardif de développement des tumeurs, ce qui
suggère une diminution de la phosphorylation et de la dégradation des connexines.
E/ Discussion
L'utilisation efficace des médicaments antinéoplasiques dépend de la
capacité à équilibrer la mort des cellules tumorales et la toxicité inhérente pour
l'hôte. Les agents antinéoplasiques qui agissent principalement sur la division
rapide et la croissance des cellules ont de multiples effets secondaires et sont
dose-limitante. La première génération de stimulants des jonctions GAP
administrée par gavage a précédemment montré une faible toxicité chez les
animaux sains (396). Dans cette étude, nous avons réalisé des injections intrapéritonéales pour assurer une exposition systémique d'une quantité constante de
PQ7 à toutes les souris. L'exposition systémique de souris C57B/6J et PyVT aux
279
PQ7 en une seule ou plusieurs doses, respectivement, n'a montré aucun effet
préjudiciable pour les organes vitaux. L'absorption du composé dans un tissu
spécifique dépend de la disponibilité du composé dans le sang et l'importance de
la vascularisation. Les plus hauts niveaux de PQ7 étaient détectables dans le foie,
le cœur, les poumons et l'utérus, ce qui peut être dû au fait que ce sont des tissus
fortement vascularisés. De façon intéressante, les PQ7 sont détectables dans le
cerveau, ce qui indique une bonne pénétration de la barrière hématoencéphalique. Les 25 mg / kg de PQ7 administrés à des souris d'environ 20g
étaient équivalents à 9,56 mM. Les résultats indiquent que la concentration de 9,5
mM de PQ7 peut être distribuée à tous les organes vitaux et métabolisée chez la
souris C57B/6J.
L'exposition de souris C57B/6J et PyVT à une seul ou plusieurs doses de
PQ7 systémique, respectivement, n'a montré aucun effet préjudiciable sur les
organes vitaux, ce qui indique une faible toxicité (353, 396). La quantité totale de
PQ7 détectée dans le tissu au bout de six heures était seulement de 8,1%. Ceci
suggère que la majorité de la molécule mère est métabolisée et / ou éliminée en
moins de six heures. La demi-vie de PQ7 dans le foie semble être d'environ 6
heures, suggérant un métabolisme ou une
complète en 48 heures. Le délai
optimal entre les injections à des fins de traitement serait donc de 48 heures, ce
qui s'est avéré avoir des effets chez les souris porteuses de tumeur (267).
Les niveaux de PQ7 mesurés dans le tractus intestinal ont une forte
variabilité, cependant le composé était détectable au plus haut niveau dans cet
organe 36 heures après l'exposition. La muqueuse muqueuse intestinale
accumule des lipides et des composés hydrophobes, qui ont une perméabilité
accrue dans le tractus intestinal. Ceci suggère que PQ7 les peuvent être
sécrétées dans le tractus gastro-intestinal par le canal biliaire pour l'excrétion
fécale et potentiellement réabsorbées par la muqueuse intestinale en raison de
son caractère lipophile. Cette hypothèse est étayée par l'absence de PQ7
détectées dans le plasma ou les reins après 24 heures, ce qui indique que
l'excrétion urinaire de la molécule mère est complète en 24 heures après l'injection.
Collectivement, ces résultats suggèrent que le traitement PQ7 peut être utile dans
le ciblage des néoplasies du tractus gastro-intestinal.
280
Les souris PyVT représentent un nouveau modèle in vivo pour la formation
de carcinomes mammairse avec métastases présentant une utilité clinique
importante.
Les
tumeurs
précancéreuses
PyVT
sont
morphologiquement
hétérogènes avec des cellules néoplasiques hautement prolifératives contenant
une microvasculature anormale et des noyaux atypiques, tout en restant à
l'intérieur de la membrane basale (356). L’expression du MMTV-PyVT est variable
dans les tumeurs (356), ce qui indique que le transgène n'est pas nécessaire pour
le maintien de la malignité mais uniquement pour l'initiation des cellules
néoplasiques. Le modèle PyVT peut être utilisé comme un modèle à plusieurs
niveaux de la cancérogenèse due à l'évolution des lésions d'un état précancéreux
avec un phénotype mixte d'hyperplasie et adénome / néoplasie intra-épithéliale
mammaires, suivi d'un carcinome précoce et tardif avec métastases pulmonaires
éventuelles [8,9]. La formation de tumeurs secondaires dans les poumons est
avantageuse pour l'étude du processus métastatique, qui est la cause de décès
dans de nombreux types de cancer. La pathologie des lésions néoplasiques est
cliniquement semblable à celle des humains (356), soulignant la valeur de ce
modèle spontané dans cette étude.
La prolifération cellulaire et l'apoptose sont des facteurs importants dans la
carcinogenèse (420) et
la GJIC est un facteur clef dans le processus
cancérogène. Une GJIC réduite dans les tissus pré-néoplasiques et néoplasiques
peut mener à une prolifération excessive des cellules, différenciation anormale et
inhibition de l'apoptose, ce qui conduit à la perte d'homéostasie. Plus de 100
carcinogènes non mutagènes et mutagènes ont été signalés inhiber la GJIC in
vitro et in vivo (421-423). Ces composés sont chimiquement divers et incluent des
produits pharmaceutiques, des hydrocarbures aromatiques polycycliques, des
produits végétaux et des pesticides. L'inhibition de la GJIC est le mieux corrélée
avec la carcinogénicité dans plusieurs tests in vitro (424). Ceci montre que le
mécanisme carcinogène de multiples agents implique la régulation à la baisse de
la GJIC. Par conséquent, un composé qui restaure la GJIC est essentiel pour la
prévention et le traitement du cancer. La capacité à normaliser la GJIC dans les
cellules
néoplasiques
pourrait
restaurer
développement d'autres tumeurs.
281
l'homéostasie
et
prévenir
le
Beaucoup de promoteurs de tumeurs régulent à la baisse GJIC pour
permettre à la cellule initiée de proliférer et d'échapper à l'apoptose (425). La
régulation à la baisse de la GJIC est un processus réversible, ce qui indique que
l'intervention qui renforcerait la GJIC pourrait prévenir la promotion et la
progreesion du tissu néoplasique. Les PQ7 se sont précédemment avérées
augmenter l'expression des protéines des jonctions GAP et améliorer la GJIC (202,
242). Les données présentées ici montrent que les PQ7 retardent le
développement des carcinomes mammaires, ce qui suggère qu'elles pourraient
être utilisées comme un composé de chimio-prévention primaire du cancer du sein.
Les souris PyVT ont une modification génétique qui les prédispose au
développement de carcinomes mammaires mais avec un traitement aux PQ7 au
stade pré-cancéreux, le développement de ces tumeurs malignes a été retardé de
façon significative. L'utilisation d'intervention chimique avant qu'une cellule initiée
ne devienne indépendante des stimuli promoteurs pourrait induire une régression
du tissu néoplasique, ce qui est un procédé de chimio-prévention.
Le cancer est une maladie importante dans le monde, en dépit d'une
amélioration des connaissances sur la carcinogenèse et des options de traitement.
Des traitements plus efficaces contre le cancer sont nécessaires. En raison de
l'implication de la GJIC dans le développement du cancer et la métastase, il s'agit
d'une cible prometteuse pour de nouvelles thérapies. L'amélioration de la GJIC a
été démontrée améliorer l'efficacité de divers types de thérapies contre le cancer à
travers l'effet de voisinage (426-432). La GJIC pourrait augmenter la distribution
des composés chimiothérapeutiques dans des tissus qui sont faiblement
vascularisés et présentent une faible distribution des médicaments, ce qui est
particulièrement important pour les composés hydrophiles qui sont incapables de
passer à travers la membrane cellulaire (433). En outre, il a été démontré qu'une
amélioration de la GJIC augmentait la sensibilité des cellules cancéreuses à des
agents chimiothérapeutiques classiques (276, 434). Bien que les PQ7 ne soient
pas un composé anticancéreux efficace à lui seul au cours des stades avancés du
développement tumoral, il peut être utilisé en association avec de multiples types
de chimiothérapies pour améliorer la mortalité des cellules néoplasiques.
L'analyse moléculaire de l'expression protéique a montré une augmentation
générale de l'expression des Cx43 et Cx46 au cours du développement tumoral.
282
Cx46 est une protéine des jonctions GAP spécifique des conditions d'hypoxie
dans le tissu mammaire suggérée avoir des effets pro-tumoraux en empêchant la
mort par hypoxie (405). Lorsqu'une tumeur se développe en taille, les cellules
néoplasiques dans le centre de la masse pourraient réguler à la hausse
l'expression des Cx46 afin de survivre aux conditions d'hypoxie. En outre, une
augmentation de l'expression des Cx43 est normalement corrélée à un potentiel
métastatique (246, 412). De façon intéressante, l'expression des Cx43 chez les
animaux traités aux PQ7 a une relation de réciprocité avec l'expression des Cx43
chez les souris témoins, tandis que l'expression des Cx46 dans le tissu traité reste
faible malgré le stade de développement. Les PQ7 affectent l'expression de
chaque connexine différemment au cours du développement tumoral. En
particulier, la diminution d'expression des Cx46 et l'augmentation des Cx43
observées suite au traitement aux PQ7 au cours de la phase de prédéveloppement peut être la clef pour la prévention ou le retard à la formation des
tumeurs. De plus amples connaissances sur le rôle de chaque protéine des
jonctions GAP dans la tumorigenèse sont nécessaires.
Le stimulant des jonctions GAP PQ7 ne présente ici aucun effet secondaire
apparent sur les organes vitaux lorsqu'il est distribué en systémique à tous les
organes vitaux ; et est capable d'altérer le développement d'un carcinome
mammaire spontané. Ces résultats sont prometteurs pour le développement d'un
nouveau composé de chimio-prévention ou pour une utilisation en association
avec d'autres molécules de chimiothérapie dans le traitement du cancer du sein.
283
284
IV/ Effet de molécules anti-néoplasique sur un modèle de
tumeur spontanée chez le mâle
Traduit de l'anglais : Shishido et al. (435)
A/ Résumé
Le cancer du sein chez le mâle est une maladie rare. Le nombre limité de
cas cliniques est la raison pour laquelle les traitements primaires pour les hommes
sont tirés d'études de cancer du sein chez la femme. Ici, la souche transgénique
FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également connue sous le nom PyVT) a été
utilisée en tant que système modèle pour mesurer la charge tumorale et l'effet
d'agents antinéoplasiques : tamoxifène cisplatine et paclitaxel sur la tumorigenèse
à un stade précoce de développement de carcinome mammaire dans un modèle
de souris mâles. Le traitement au cisplatine a réduit significativement le volume
tumoral alors que le paclitaxel et le tamoxifène n'ont pas diminué la croissance
tumorale. Il a été montré que le traitement au cisplatine induisait l'apoptose,
observée par une formation réduite de tumeurs, grâce à la réduction de
l'expression des protéines Bcl- 2 et survivine ainsi qu'une augmentation de
l’expression des caspases 3 par rapport aux témoins. Le traitement au tamoxifène
altère de manière significative les niveaux d'expression des récepteurs hormonaux
de la tumeur, tout en régulant à la hausse Bcl-2 et cycline D1. Ceci suggère une
importance de la signalisation hormonale chez les hommes dans la pathogenèse
du cancer du sein. Les résultats de cette étude fournissent des informations
précieuses vers une meilleure compréhension du cancer du sein masculin et
peuvent aider à guider les décisions thérapeutiques.
B/ Introduction
Le cancer du sein masculin représente 1% de tous les cas de cancer du
sein etl provoque environ 0,5% de tous les décès par cancer chez les hommes
aux Etats-Unis (436). La connaissance de cette pathologie et des traitements
285
appropriés demeure limitée en raison de la rareté de grandes cohortes de patients
masculins souffrant de cancer du sein. Le traitement du cancer du sein masculin
est donc extrapolé à partir d'études cliniques menées chez les femmes (437). Le
cancer du sein masculin présente, le plus souvent, à un stade avancé, des
masses fermes et indolores en région sous-aréolaire qui deviennent adhérentes
au muscle grand pectoral et à la peau (438). Le cancer du sein chez l'homme est
diagnostiqué à un stade plus avancé que le cancer du sein des femmes,
conduisant à une tendance pour de petites tumeurs à se propager aux ganglions
lymphatiques axillaires. Le taux de survie à 5 ans pour le cancer du sein
métastatique chez les hommes est inférieur à 20 % tandis que la médiane de
survie est seulement d'environ 15 mois (439, 440). Le pronostic du cancer du sein
masculin est similaire à celui des femmes pour le même stade évolutif.
Le cancer du sein masculin diffère du cancer du sein des femmes dans de
nombreux aspects. Notamment, le cancer du sein masculin est diagnostiqué chez
des patients plus âgés, à un stade plus avancé, avec une répartition bimodale de
l'âge/fréquence (439, 441). Il présente également des différences raciales (441),
de sous-types histologiques, des variations immunophénotypiques distinctes (439,
441, 442), de faibles taux de survie (439) et des mutations génétiques
différentielles, comme un polymorphisme de CYP17 (443), des récepteurs
androgènes (AR) (444), et des mutations de CHEK2 (445). Il a également été
démontré que le cancer du sein masculin présentait une fréquence plus élevée
d'expression de récepteurs hormonaux (RH) (80 à 90 %) que es femmes (75%), le
récepteur aux œstrogènes (ER) et le récepteur à la progestérone (PR) (439, 440).
On ne sait pas s'il ya une relation entre ER + carcinomes mammaires masculins et
la survie des patients (439, 446, 447). Cela peut être dû à des différences dans la
fonction de l’ER chez les hommes par rapport aux femmes (448). Il s'agit d'une
régulation à la hausse de l'expression des ER chez les mâles en raison de
niveaux d'oestrogène naturellement plus faibles dans le micro-environnement
tissulaire, ce qui conduit à une augmentation des oestrogènes cibles (449). Un
exemple est la protéine Bcl-2 qui est un inhibiteur de l'apoptose et est surexprimée
dans le cancer du sein chez l'homme (450).
Les sous-types moléculaires des cancers mammaires des mâles sont
basés sur l'expression de certains marqueurs de protéines dans le tissu
286
néoplasique qui sont utilisés pour évaluer leur liaison avec les caractéristiques
pathologiques observées et l'évolution chez les patients. Il est important de noter
que la positivité des RH des carcinomes mammaires des mâles peut ne pas avoir
la même valeur pronostique dans le cancer du sein chez la femme. Il est difficile
de savoir si le récepteur épidermique humain du facteur de croissance 2 (HER2)
joue un rôle pronostique ou prédictif dans le cancer du sein chez l'homme (451,
452). Dans une étude comparative entre les cancers du sein invasifs chez les
hommes et les femmes, le phénotype le plus commun était luminal A (HR+ /
HER22), tandis que HR2 et HER2 + n'ont pas été identifiés chez les hommes
(453). Dans une autre étude, les tumeurs luminales A représentaient 82,8%,
luminal B (+) HR2/HER2 6,2% et les tumeurs de type basal (HR2/HER22) 9,6% de
la cohorte de cancers du sein chez l'homme (454). Contrairement à ceux-ci, une
autre série n'a rapporté aucune différence significative entre les sous-types de
tumeurs (455). Ces études montrent que la distribution des sous-types
moléculaires dans le cancer du sein masculin est variable mais qu'il est également
différent comparativement aux cohortes de cancers du sein chez la femme. Ceci
est indicatif d'une différence dans la carcinogenèse entre les hommes et les
femmes.
Certaines populations sont plus à risque de développer un cancer du sein
masculin. Les principaux facterus de risques sont des facteurs génétiques ou un
déséquilibre hormonal. Environ 20% des hommes atteints d'un cancer du sein ont
des antécédents familiaux de cancer du sein ou de l'ovaire (456). Des mutations
dans les gènes BRCA1 ou BRCA2 sont les plus importants facteurs de risque
génétiques connus du cancer du sein masculin. Plus spécifiquement la mutation
du gène BRCA2 entraine un risque de développer un cancer du sein masculi au
cours de sa vie de 7% (457), ce qui représente un plus grand risque que pour les
femmes ayant une prédisposition génétique pour cette maladie. Un changement
dans le rapport des oestrogènes et de la testostérone est également un facteur
important contribuant à un cancer du sein chez l'homme. Les personnes atteintes
du syndrome de Klinefelter ont des niveaux bas de testostérone, ce qui augmente
le risque de développer un cancer du sein masculin au cours de sa vie à environ
5% (456).
287
L'approche
thérapeutique
couramment
utilisée
consiste
en
une
mastectomie, une évaluation des ganglions axillaires et une hormonothérapie,
potentiellement une chimiothérapie adjuvante supplémentaire. L'hormonothérapie,
principalement le tamoxifène, est la pierre angulaire du traitement contre le cancer
du sein masculin et est considérée comme le traitement de première ligne du
cancer métastatique du sein masculin, avec un taux de réponse global de 49%
(458). Dans une autre étude (459), il a été signalé que le tamoxifène a augmenté
le taux de survie actuarielle à 5 ans (61% contre 44%) et la survie sans maladie
(55% contre 28%) de 39 patients masculins souffrant de cancer du sein par
rapport au groupe contrôle historique (460). Les hommes tolèrent en général bien
le tamoxifène, avec des effets secondaires les plus fréquemment rapportés tels
que diminution de la libido, prise de poids, bouffées de chaleur, troubles de
l'humeur et dépression. Cependant, il est important de noter qu'il n'y a pas eu
d’études randomisées afin d'évaluer les taux de réponses réelles ou la toxicité du
tamoxifène chez les hommes. Le rôle des autres médicaments anti-néoplasiques
couramment utilisés pour le traitement du cancer du sein chez les femmes n'a pas
encore été déterminé chez les hommes.
Les progrès dans le diagnostic et le traitement du cancer du sein des
femmes ont entraîné une baisse constante de l'incidence et une amélioration des
résultats cliniques tandis que le cancer du sein masculin a connu une constante
une augmentation de l'incidence au cours des dernières décennies et une
amélioration beaucoup plus lente sur les résultats cliniques (461). Le traitement
contre le cancer du sein masculin est extrapolé à partir des essais cliniques
portant sur les femmes, en dépit de tableaux cliniques et de pathogenèses
distincts, ainsi que l'absence d'amélioration clinique chez les patients. Il existe un
besoin pour une nouvelle prise en charge clinique du cancer du sein masculin. Les
différences majeures entre les patients masculins et féminins en matière
d'endocrinologie et de réponse des cancers du sein suggèrent la nécessité
d'explorer des options de traitement alternatives.
La souche de souris transgéniques FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634-Mul/J
(aussi dénommée PyVT) est un nouveau modèle in vivo de la formation de
tumeurs mammaires et de leurs métastases. Le modèle PyVT a une expression
tissu-spécifique
de l'antigène moyen T du Polyoma virus sous le contrôle du
288
promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (353). Les tumeurs
prémalignes des souris PyVT sont morphologiquement hétérogènes avec une
microvascularisation anormale, hautement prolifératives avec des noyaux
atypiques et restent confinées à l'intérieur de la membrane basale avant
métastase dans les poumons (356). Des études montrent que, même à des
stades
précoces
de
développement
mammaire,
les
coussinets
adipeux
mammaires étaient clairement anormaux avec une croissance irrégulière des
branches latérales, des bourgeons terminaux agrandis et d'importantes masses
tumorales. Les mâles développent généralement des tumeurs mammaires au plus
tard à 15 semaines et atteignent la charge tumorale maximale à environ 25
semaines d'âge.
La présente étude se focalise sur l'utilisation de la génération in situ de
tumeurs mammaires mâles par le modèle PyVT pour déterminer l'efficacité des
médicaments anti-néoplasiques : le cisplatine, le paclitaxel et le tamoxifène pour
atténuer la croissance des tumeurs. Les avantages potentiels de chaque option de
traitement sont révélés pour un modèle de tumeur mammaire masculin.
C/ Matériel et méthode
i/ Déclaration éthique
L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médecine comparée
(CMG) au Collège de médecine vétérinaire de l'Université d'État du Kansas. Les
animaleries du CMG sont entièrement accréditées par l'association internationale
pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire
(AAALAC). La conformité de certains aspects de la protection des animaux est
contrôlée régulièrement par le personnel vétérinaire. Les protocoles de soins aux
animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel de
protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université d'État du Kansas,
Manhattan (Numéro de protocole : 2985), suivant les directives du NIH.
289
ii/ Modèle de souris
Les souris PyVT ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar
Harbor, Maine, Etats-Unis). Les souris ont été suivies tous les deux jours pour
contrôler l'apparition de tumeurs. La taille des tumeurs a été mesurée en deux
dimensions avec un pied à coulisse. Les souris ont été observées pourun
comportement anormal, un changement de l'apparence ou une perte de poids. Si
les animaux présentaient des signes de douleur, une croissance extrême de la
tumeur (supérieure à 1,5 cm) ou une perte de l'état corporel, ils ont été
euthanasiés avant la fin de la période d'expérimentation. Les souris ont été
sacrifiées à 10, 15 et 20 semaines d'âge afin d'examiner l'épithélium mammaire et
la formation des tumeurs. Tous les traitements ont été effectués sur des souris
jugées à un stade de développement précoce des tumeurs soit 15 semaines d'âge.
Le poids moyen de ce groupe d'âge était de 28-32 grammes. Les souris ont été
divisées au hasard en quatre groupes expérimentaux : 1. animaux témoins
recevant uniquement le solvant (DMSO) ; 2. Animaux traités avec 3,5 mg/kg de
cisplatine ; 3. Animaux traités avec 10 mg/kg de paclitaxel ; et 4. Animaux traités
avec 40 mg/kg de tamoxifène. Tous les traitements ont été administrés par voie
intra-péritonéale.
iii/ Anticorps
Les anticorps primaires : Survivin (sc-8807, anticorps polyclonal de chèvre),
caspase 3 (sc-56046, anticorps monoclonal de souris), cycline D1 (sc-8396,
anticorps monoclonal de souris), Bcl-2 (sc-492, anticorps polyclonal de lapin), ERa
(sc-8002, anticorps monoclonal de souris), ERb (sc-8974, anticorps polyclonal de
lapin) et PR (sc-166170, anticorps monoclonal de souris) de Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de
lapin) et anti-HER2 (4290, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling
(Boston, MA) ont été utilisés à la fois pour les analyses Western blot et
immunohistochimiques (IHC).
290
iv/ Immunohistochimie
Toutes les tumeurs ont été prélevées et fixées dans une solution de
formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine préalablement à leur
sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Des sections de paraffine
(5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le déparaffinage a été
réalisé avec 100% de xylène et 100%, 90%, 75%, 50% d'éthanol. L'antigène
extraction a été effectuée dans une solution tampon de citrate et de la vapeur. Les
lames ont été ensuite incubées pendant une nuit à température ambiante avec un
anticorps polyclonal (dilution 1:50). Après lavages dans plusieurs bains de PBS,
les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires biotinylés (1:1000)
pendant 15 minutes. Les lames ont été lavées et les immunomarquages ont été
amplifiés par incubation avec du complexe avidine biotine (ABC) pendant 10
minutes. Les cellules ont été visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB)
suivie d'une contre-coloration hemalun-eosine. Les sections ont été observées et
les images capturées avec un microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et
60x.
v/ Analyse Western blot
Le tissu de tumeurs des glandes mammaires a été homogénéisé dans 500
ml de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5 % de
Triton X-100) avec un inhibiteur de protéase à une dilution de 1:1000 (SigmaAldrich, Saint -Louis, MO). Le tissu a été homogénéisé par l'intermédiaire de
l'OMNI Bead Ruptor 24 à une vitesse de 5,65 m/s pendant 45 secondes, suivi par
une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. Vingt-cinq
microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur
gel SDS-PAGE à10% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest
scientifique, Saint Louis, MO, USA). Les membranes de nitrocellulose ont été
bloquées avec 0,5 % de lait dans une solution de Tris saline tamponnée et de
Tween 20 (TBST) en utilisant le dispositif SNAPid (Millipore) à température
ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire à
une dilution de 1:1000, suivi par un anticorps secondaires lié à la la peroxidase de
291
Raifort (HRP) (1:2000). Les transferts ont été détectés par des réactifs de
détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, Illinois, Etats-Unis)
et visualisés par Fluorochem E système d’imagerie (ProteinSimple, Santa Clara,
CA).
vi/ Analyse statistique
Toutes les données sont présentées comme moyennes pour l'intervalle de
confiance de 95 % d'au moins trois expériences indépendantes pour l'analyse
moléculaire et six échantillons pour les études animales. La signification
statistique a été examinée avec une p-value de 0,05.
D/ Résultats
i/ Caractérisation du modèle de souris PyVT et effets du traitement sur
l'expression des récepteurs hormonaux
Les mâles de la lignée transgénique FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J
ont développé des tumeurs dès l'âge de 14 semaines. Les dix coussinets adipeux
mammaires ont développé des tumeurs et la charge tumorale maximale a été
atteinte à environ 25 semaines d'âge. Le développement des tumeurs dans ce
modèle spontané a été divisé en trois phases sur la base de la mesure de la taille
des tumeurs, la fréquence de formation de tumeurs, et la présence de métastases
dans les poumons. La phase de "pré-développement" tumoral chez les souris
PyVT s'est produite à 10-13 semaines d'âge et consistait en un état précancéreux
où aucune tumeur n'était palpable et le tissu mammaire semblait normal sur
simple observation. Le stade précoce de développement représente la formation
de tumeurs solides dans le tissu mammaire à 15-18 semaines d'âge. A ce stade,
on observe 1 ou 2 tumeurs solides. Le stade tardif consiste en la présence de
l'ensemble des 10 tumeurs mammaires primaires et de métastases secondaires
aux poumons, ce qui apparaît eu lieu à plus de 20 semaines. La présence de
métastases a été confirmée par coloration hémalun-éosine (H&E) de sections
292
représentatives du poumon et examen histopathologique. Ce rapport met l'accent
sur le stade précoce de la formation de tumeurs et a examiné l'effet de
médicaments antinéoplasiques sur la croissance de la tumeur à ce stade.
Les tumeurs mammaires ont été isolées à partir de chaque groupe de
traitement pour déterminer l'expression des récepteurs hormonaux (ER, PR et
HER2). L'immunohistochimie de coupes de tumeurs témoins montre une faible
coloration positive de HER2 et une forte coloration positive d’ERβ (Fig. 77A). Le
traitement au tamoxifène a entraîné une augmentation de la coloration nucléaire
positive des ERa dans les tumeurs isolées, tout en diminuant la coloration positive
des ERb. L'analyse Western blot a été réalisée pour déterminer les niveaux
d'expression quantifiables de chaque récepteur hormonal dans le tissu traité. Les
tumeurs contrôles expriment ERa, ERb, PR et HER2 (Fig. 77B). Les animaux
traités au tamoxifène présentaient une expression accrue des ERa (p-value =
0,0021) et PR (p-value = 0,0300 ; Figure 77B), tout en induisant une diminution
significative de l'expression des HER2 (p-value = 0,0002) et ERb (p-value =
0,0002). Les souris ayant reçu le traitement au paclitaxel ont présenté une
réduction significative de l'expression des ERa et ERb par rapport aux souris
témoins (p = 0,0201 et 0,0219, respectivement), sans changement de l'expression
de PR et HER2. De façon intéressante, les animaux traités au cisplatine n'ont
montré aucun changement dans l’expression d’ERa, ERb, PR ou HER2, ce qui
suggère que le traitement n'affecte pas l'expression des marqueurs moléculaires.
ii/ Effet du cisplatine sur le développement précoce des souris PyVT
La croissance tumorale sur une période de 14 jours de traitement au
cisplatine avec une administration tous les deux jours indique un effet significatif
du traitement sur le développement néoplasique au cours de la phase précoce de
la formation des tumeurs (Fig. 78). Le volume initial des tumeurs pour toutes les
souris était de 66.86 +/- 21.99 mm3. La différence entre les volumes tumoraux
chez les souris traitées au DMSO et au cisplatine était significative à partir de 8
jours de traitement et jusqu'à 14 jours (Fig. 78A). Le volume final des tumeurs
pour les souris traitées au DMSO (témoins) était de 293.33 +/- 71.39 mm3, tandis
que les souris traitées au cisplatine avait un volume final de 100.18 +/- 105.78
293
mm3. Le changement de volume de la tumeur au cours de la période de 14 jours
montre une réduction significative de 215,59 mm3 avec le traitement au cisplatine
par rapport au témoin (p-value = 0,00044 ; Fig. 78B). Il s'agit d'une différence
globale de 90,71 % de croissance tumorale après traitement au cisplatine.
Les souris contrôles ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires
ayant développés des tumeurs au cours de la période de traitement.
Fig. 77 : Phénotype des souris PyVT males au cours du stade précoce de développement.
Contrôle = DMSO, tamoxifène 40 mg/kg, paclitaxel 10 mg/kg et cisplatine 3,5 mg/kg ; 7 injections
IP. A/ Immunohistochimie. Bleu = contre-coloration à l’hemalun. n = 6. B/ Western blot. n = 4 C/
Représentation graphique de l’analyse Western blot. Reference = intensité de la bande du contrôle
(DMSO)
294
Fig. 78 : Croissance tumorale (en mm3)
chez la souris PyVT male traitée au
cisplatine. A/ Cisplatine 3,5 mg/kg Les
jours
0-12
correspondent
aux
7
injections et le jour 14 correspond à la
fin
de
l’étude
prélèvement
des
(mesures
organes).
avant
B/
Modification de la taille des tumeurs à
la fin de l’étude. C/ Nombre de tumeurs
développées chez la souris PyVT male
à la fin des 14 jours. * = p < 0,05 (par
rapport
aux
contrôles :
pas
de
traitement et traitement au DMSO). n =
6
iii/ Effet du paclitaxel sur le développement précoce de PyVT souris
Le volume initial des tumeurs pour toutes les souris traitées avec soit
paclitaxel soit DMSO était de 137.34 +/- 93.05 mm3. Il n'y avait pas de différence
significative dans les volumes tumoraux entre les groupes de traitement à
n'importe quel moment au cours de la période de traitement de 14 jours (Fig. 79A).
Le changement dans la croissance tumorale au cours de la période de traitement
de 14 jours a indiqué une réduction significative de la croissance suite au traitment
au paclitaxel (p-value = 0,029, Fig. 79B). Les souris témoins ont présenté une
croissance tumorale globale du 237.68 +/- 65.78 mm3, tandis que chez les souris
295
traitées au paclitaxel elle était de 75.10 +/- 134.57 mm3. En outre, le traitement au
paclitaxel a réduit significativement la charge tumorale en moyenne de 2,5
tumeurs (p-value = 0,00022, Fig. 79C).
iv/ Effet du tamoxifène sur le développement précoce des souris PyVT
Fig. 79 : Croissance tumorale (en mm3)
chez la souris PyVT male traitée au
paclitaxel. A/ Paclitaxel 10 mg/kg Les
jours 0-12 correspondent aux 7 injections
et le jour 14 correspond à la fin de l’étude
(mesures
avant
prélèvement
des
organes). B/ Modification de la taille des
tumeurs à la fin de l’étude. C/ Nombre de
tumeurs développées chez la souris
PyVT male à la fin des 14 jours. * = p <
0,05 (par rapport aux contrôles : pas de
traitement et traitement au DMSO). n = 6
Les
tamoxifène
respectifs
souris
et
ont
traitées
leurs
au
contrôles
commencé
le
traitement avec un volume initial
des tumeurs de 127.91+/-122.53
mm3. Le traitement au tamoxifène
n'a pas affecté la croissance des
tumeurs par rapport aux animaux
témoins au cours de la période de
traitement (Fig. 80A et 80B). On a
noté cependant une réduction significative de la charge tumorale d'environ quatre
tumeurs (p-value = 0,00478, Fig. 80C).
296
v/ Expression protéique dans les tumeurs isolées de souris PyVT
Fig. 80 : Croissance tumorale (en mm3)
chez la souris PyVT male traitée au
tamoxifène. A/ Tamoxifène 40 mg/kg
Les jours 0-12 correspondent aux 7
injections et le jour 14 correspond à la
fin
de
l’étude
prélèvement
(mesures
des
organes).
avant
B/
Modification de la taille des tumeurs à la
fin de l’étude. C/ Nombre de tumeurs
développées chez la souris PyVT male à
la fin des 14 jours. * = p < 0,05 (par
rapport aux contrôles : pas de traitement
et traitement au DMSO). n = 6
Une
analyse
par
immunotransfert a été réalisé afin
de déterminer l'expression de
marqueurs
moléculaires
du
cancer du sein chez le mâle :
protéine
Bcl-2,
caspase-3,
survivine et cycline D1 (Fig. 81A).
Bcl-2 a montré une corrélation
avec un faible taux de cellules
mitotiques et des tumeurs de bas grade, ce qui suggère qu'il peut être un
marqueur biologique important dans la pathogenèse du cancer du sein des
patients de sexe masculin (462). Le tamoxifène a augmenté l'expression de Bcl- 2
de 65% par rapport au témoin (p = 0,0131). Le paclitaxel a réduit de manière
significative l'expression de Bcl-2 de 22% (p-value = 0,0346). Le traitement au
cisplatine a entrainé une diminution significative de 17% de l'expression de Bcl-2.
L'immunohistochimie montre une forte coloration de Bcl- 2 du contrôle et des
tumeurs traitées (Fig. 81B). Les tumeurs traitées au tamoxifène semblent avoir
une plus forte coloration de Bcl-2, ce qui confirme l'analyse western blot.
297
La capacité à induire la signalisation apoptotique dans les cellules
tumorales a été déterminée par analyse de l'expression des caspases. Le
cisplatine a augmenté l'expression de caspase 3 de 55% (p-value = 0,0001) par
rapport aux tumeurs contrôles (Fig. 81A). Les traitements au tamoxifène et au
paclitaxel n'ont pas changé l'expression des caspases 3. Les tumeurs contrôles
présentent une très faible coloration positive pour la caspase 3. Tous les
composés anticancéreux montrent une augmentation de coloration positive par
rapport au témoin mais le cisplatine et le tamoxifène ont la coloration positive la
plus forte pour la caspase 3 (Fig. 81B).
Les cellules tumorales sont hautement prolifératives ; par conséquent, nous
avons exploré l'expression de la cycline D1 en tant que biomarqueur pour la
prolifération cellulaire. Cycline D1 est un régulateur clef du cycle cellulaire dont la
surexpression entraîne une rapide progression de la phase G1 à la phase S de la
mitose [30]. L'analyse de l'expression de la cycline D1 a indiqué que le tamoxifène
a augmenté de manière significative l'expression de 96% (p-value = 0,0115),
tandis que le paclitaxel et le cisplatine ne modifient pas de manière significative
les niveaux d'expression (Fig. 81A). Les tumeurs contrôles avaient une faible
coloration positive pour la cycline D1. Les tumeurs traitées au tamoxifène
présentaient une forte coloration positive tandis que les tumeurs traitées au
paclitaxel et cisplatine présentaient une faible coloration positive pour la cycline
D1 (Fig. 81B).
Des protéines qui inhibent l'apoptose assurent la protection des cellules
tumorales contre des composés cytotoxiques. La survivine est une protéine
membre de la famille des inhibiteurs de l'apoptose qui est exprimée au cours de
l'embryogenèse et dans les cellules tumorales en tant que protéine antiapoptotique qui est capable de réguler la mitose (281-283). La survivine est
fortement exprimée dans une variété de tumeurs et son expression est corrélée à
la fois à une rechute accélérée et à une résistance à la chimiothérapie (284). Les
traitements au tamoxifène et au cisplatine ont réduit de manière significative
l'expression de la survivine de 77% (p-value = 0,0019) et 48% (valeur p 0,0001),
respectivement (Fig. 81A). L'immunohistochimie des tumeurs témoins ont montré
une forte coloration positive pour la survivine (Fig. 81B). Les tumeurs traitées au
298
tamoxifène et au cisplatine ont une faible coloration positive pour la survivine par
rapport au paclitaxel et au tissu contrôle.
vi/ Examen pathologique des tumeurs mammaires chez le mâle
Fig. 81 : Expression des marqueurs moléculaires Bcl-2, caspase 3, cycline D1 et survivine.
Contrôle = DMSO, tamoxifène = 20 mg/kg, paclitaxel = 10 mg/kg et cisplatine = 3,5 mg/kg A/
Western blot et représentation graphique au stade précoce de développement. Reference =
intensité de la bande du contrôle. n = 4. B/ Immunohistochimie. n = 3
299
L'examen pathologique des tumeurs mammaires a été réalisé pour chaque
groupe de traitement. Les tumeurs ont été classées en deux catégories carcinome
au stade précoce ou carcinome au stade tardif. Un carcinome débutant consistait
en un néoplasme modérément délimité avec des acini de cellules épithéliales
néoplasiques proliférantes avec atypie cellulaire et invasion de la membrane
basale. Un carcinome tardif consistait en des tumeurs mal délimitées composées
de feuillets d'acini de cellules épithéliales néoplasiques séparés par un stroma
fibro-vasculaire avec une perte de l'architecture mammaire, une augmentation de
la prolifération et une plus vaste invasion.
Les tumeurs témoins ont été caractérisées par une hyperplasie focale avec
des ganglions lymphatiques et tissus adipeux normaux ou des lésions de
carcinome précoce. Les traitements au cisplatine et au paclitaxel n'ont montré
aucun changement significatif de l'histopathologie et les tumeurs ont conservé
leurs caractéristiques de carcinome précoce. Les souris traitées au tamoxifène ont
développé des tumeurs caractéristiques de cancer tardif, ce qui suggère une
augmentation de la malignité due au traitement.
E/ Discussion
Le modèle transgénique PyVT a été utilisé ici pour les études
translationnelles de cancer du sein masculin en raison de son profil pathologique
et d'expression de protéines cliniquement pertinentes. Les modèles de cancer du
sein masculin sont limitées mais le manque de cas cliniques fait de ce modèle de
souris transgéniques un modèle
vital pour comprendre
les différences
pathologiques du cancer du sein masculin par rapport aux homologues féminins.
Le modèle PyVT mâle a fourni l'occasion d'aborder l'efficacité des traitements en
utilisant les médicaments anti-néoplasiques : tamoxifène, paclitaxel et cisplatine.
Le tamoxifène est mieux connu comme un modulateur des récepteurs aux
œstrogènes (SERM) en raison de ses multiples activités (303). En raison de la
forte positivité des récepteurs hormonaux dans le cancer du sein masculin, le
tamoxifène est le traitement adjuvant standard. Le paclitaxel, approuvé par la
Food and Drug Administration (FDA, "Agence américaine des produits
300
alimentaires et médicamenteux") pour traiter les cancers du sein et de l'ovaire, est
un traitement de première ligne du cancer du sein métastatique chez la femme. Le
paclitaxel favorise l'assemblage des microtubules stables et inhibe leur
dépolymérisation (463), interférant par conséquent avec la fonction normale des
microtubules et prévenant la progression du cycle cellulaire (464). Le cisplatine est
un médicament de chimiothérapie à base de platine utilisé pour traiter une variété
de cancers par la formation d'adduits de platine-ADN qui induisent l' arrêt du cycle
cellulaire (271, 272). Ces composés ont des modes d'actin radicalement différents.
Ici, nous avons déterminé l'efficacité de chacun à atténuer la croissance de la
tumeur mammaire dans un modèle masculin.
Cette étude montre que la formation précoce de tumeurs mammaires chez
le mâle est sensiblement atténuée par un traitement au cisplatine tandis que le
tamoxifène et le paclitaxel n'ont pas d'effet sur la croissance tumorale. Ceci
suggère que les options de traitement doivent être réexaminées pour les patients
masculins souffrant de cancer du sein. Le tamoxifène est le traitement principal
actuel mais les résultats indiquent qu'il n'atténue pas efficacement la croissance
tumorale. Le cisplatine s'est avéré être le traitement anti-néoplasique le plus
efficace testé, ce qui suggère une nécessité de changer les composés pour les
traitements primaires des patients mâles atteints de cancer du sein. De façon
intéressante, les trois composés anti-néoplasiques : cisplatine, paclitaxel et
tamoxifène réduisent le nombre total de tumeurs développées, indiquant qu'ils
pourraient avoir une propriété chimio-préventive.
L'expression des récepteurs hormonaux est le principal moyen de profil des
carcinomes mammaires. Les tumeurs PyVT mâles se sont avérées ERa/b +, PR +
et HER2 +. Le traitement au tamoxifène a augmenté l'expression à la fois des ERa
et PR, tout en conduisant à une diminution de l'expression des HER2 et ERb, ce
qui indique une relation inverse entre les isoformes des ER due au traitement par
le tamoxifène. Les tumeurs sensibles aux hormones sont généralement basées
sur l'expression du seul ERα. Le rôle d’ERβ dans la pathologie et le traitement du
cancer du sein reste largement inconnu. Les fonctions de ces deux récepteurs aux
oestrogènes sont radicalement différentes en réponse à la fois aux œstrogènes et
aux composés anti-œstrogéniques (465, 466). Plusieurs rapports indiquent que
l'exposition aux œstrogènes des cellules de cancer du sein exprimant ERα conduit
301
à une augmentation de la prolifération, tandis que l'exposition de cellules
exprimant ERβ, soit seule, soit en association avec ERα, aboutit à une inhibition
de la prolifération cellulaire (467-469). Ceci suggère qu’ERβ peut fonctionner plus
comme un suppresseur de tumeur qu'un promoteur de tumeur. L'expression du
récepteur ERβ a été trouvée dans 47% des tumeurs du sein classées comme ERα
négatives (470). De façon intéressante, le paclitaxel a réduit l'expression du
récepteur ERβ mais n'a pas affecté l'expression du récepteur ERα, PR ou HER2.
La pertinence clinique de l'expression de ERβ est incertaine ; plusieurs études
indiquent une corrélation avec l'amélioration de la survie (471, 472), tandis que
d'autres suggèrent une faible corrélation ou un mauvais pronostic (473, 474). Ces
résultats soulignent la nécessité d'élucider la fonction du récepteur ERb dans la
pathologie et le traitement du cancer du sein.
La régression tumorale se produit lorsque la vitesse de prolifération
cellulaire est inférieure au taux de mort cellulaire. Pour déterminer la signalisation
apoptotique
en
réponse
aux
traitements
anti-néoplasiques,
les
niveaux
d'expression de caspase 3 ont été mesurés dans toutes les tumeurs. Le cisplatine
a été le seul composé à induire une augmentation significative des caspases 3, ce
qui indique l'induction de l'apoptose due au traitement. Ceci est observé
grossièrement par une réduction significative de la taille de la tumeur. Le
tamoxifène et le paclitaxel n'ont pas d'effet apoptotique observable. La survivine,
inhibiteur de l'apoptose, a été mesuré dans le tissu tumoral après traitement aux
composés anti-néoplasiques. Une diminution significative de l'expression de la
survivine a été observée après traitement au tamoxifène ou au cisplatine. Ceci
indique que les deux traitements réduisent les signaux anti-apoptotiques,
favorisant ainsi la mort cellulaire. Le traitement au cisplatine favorise et induit
l'apoptose, ce qui entraîne une diminution de volume tumoral. Le traitement au
tamoxifène favorise seulement
l'apoptose, sensibilisant ainsi les cellules à la
signalisation apoptotique mais ne conduisant pas directement à la mort cellulaire.
Bcl-2 est un autre régulateur de l'apoptose mais il a été démontré être un
marqueur biologique important dans la pathogenèse du cancer du sein masculin,
en corrélation avec un faible nombre de cellules mitotiques et de plus petites
tumeurs de grade histologique inférieur (462). Bcl-2 est un biomarqueur
également critique pour le cancer du sein féminin dans la prédiction de la survie
302
du patient (475). Dans cette étude, le tamoxifène s'est révélé augmenter
l'expression de Bcl-2 tandis que le paclitaxel et le cisplatine ont diminué les
niveaux d'expression par rapport aux tumeurs contrôles. L'expression de la
survivine avec d'autres gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-2 réduit l'apoptose
des cellules cancéreuses (476). L'expression de Bcl-2 devrait présenter une
corrélation avec la survivine, qui a été observée avec le traitement par le cisplatine
dans lequel les deux protéines présentent une expression réduite par rapport aux
tumeurs témoins. Il est intéressant d'observer que les tumeurs traitées au
tamoxifène montrent une relation inverse entre Bcl-2 et survivine. Les protéines
Bcl-2 se trouvent dans la membrane mitochondriale externe sous forme de
dimères (477). Il est suggéré que le rôle physiologique de l'expression de la
protéine Bcl-2 et le contrôle de l'homéostasie dans le tissu mammaire normal
impliquent une régulation positive par l'estradiol et négative par la progestérone
(478). De plus, dans les cellules cancéreuses du sein, il a été montré que
l'oestradiol stimulait, alors que la progestérone inhibait, l'expression de la protéine
Bcl-2 (479). Ceci suggère une régulation de Bcl-2 par les récepteurs hormonaux,
en particulier une régulation positive de Bcl-2 par ERα et une régulation négative
par PR. Ici, nous montrons que le traitement au tamoxifène augmente l'expression
d’ERα et diminue ERb, ce qui peut conduire à l'augmentation de l'expression de
Bcl-2.
Les cellules néoplasiques hautement proliférantes et les tumeurs de grade
histologique élevé ont été associées à une expression accrue des marqueurs
cellulaires pour la prolifération. Une expression anormale de la cycline D1 est
commune dans le cancer du sein chez la femme (480, 481). La pertinence
pronostique des protéines de prolifération Ki67 et cycline D1 n'ont pas été
confirmés chez les patients masculins atteints de cancer du sein. Il a été montré
que la cycline D1 était surexprimée dans 77% des cancers du sein chez l'homme
(462). Fait intéressant, dans une cohorte de patients de sexe masculin souffrant
de cancer du sein, la surexpression de la cycline D1 était prédictive d'une
meilleure survie des patients tandis que les niveaux élevés d'expression des
cyclines A et B augmentent le risque de décès de cancer du sein d'un facteur 2-3
(482). Chez les souris mâles PyVT, le traitement au tamoxifène a accru
l'expression de la cycline D1 sans altérer de manière significative la croissance
303
tumorale. Ceci est en contradiction avec les conclusions de Nilsson et al., tout en
affirmant que la cycline D1 ne peut pas être un marqueur moléculaire approprié
pour le cancer du sein masculin.
Les différences dans la physiologie des patients hommes et femmes
atteints de cancer du sein requièrent une approche de traitement différente, en
particulier en ce qui concerne la thérapie hormonale. De plus amples recherches
sont nécessaires pour déterminer le rôle des composés anti-œstrogéniques tels
que le tamoxifène dans le traitement du cancer du sein masculin. Des rapports
épars sont insuffisants pour recommander des directives de traitement. Sur la
base des différences connues dans la biologie du cancer du sein mâle et femelle,
il serait pragmatique de considérer des options de traitement qui ne modifient pas
la signalisation hormonale ou au moins pas en tant que seul agent de traitement
du cancer du sein chez l'homme.
Cette étude offre une occasion unique d'étudier les effets de certains
médicaments anticancéreux dans un modèle de tumeur mammaire masculin. Les
résultats montrent les effets du traitement avec trois médicaments antinéoplasiques reconnus qui n'ont pas été évalués de manière efficace dans le
système mâle en raison des faibles taux d'événements cliniques de cancer du sein
masculin. Les résultats de cette étude fournissent des informations précieuses
vers la meilleure compréhension du cancer du sein masculin et peuvent aider à
guider les décisions thérapeutiques.
304
Conclusion
Au travers de ces études, nous avons vu que les quinoléines substituées
entrainaient un ralentissement de la croissance, voire une réduction du volume
tumorale. Leur effet est d'autant plus marqué que le traitement est effectué à un
stade précoce de développement. Des études plus poussées de toxicité seraient
requises, mais ces premières études suggèrent une possible application
préventive chez les patients à haut risque. Par ailleurs, conformément à
l'hypothèse émise à l'origine, les quinoléines substituées agissent en synergie
avec d'autres molécules de chimiothérapie comme le cisplatine ou le tamoxifène
permettant d'obtenir une meilleure efficacité dans le traitement contre le cancer du
sein. Ces études se sont montrées prometteuses dans un modèle de xénogreffes
de lignées cellulaires de cancer du sein humain, ce qui est intéressant puisque les
cellules humaines sont la cible du traitement ; mais aussi dans un modèle de
tumeurs spontanées murin qui est également essentiel puisque la tumeur est avec
son micro-environnement. En effet, dans de nombreux cas, des molécules
prometteuses dans des modèles de xénogreffes s'avèrent inefficace chez les
patients, ce qui peut être attribué, au moins en partie, aux interactions des cellules
cancéreuses avec leur stroma qui, comme nous l'avons vu précédemment, joue
un rôle majeur dans la carcinogenèse.
Nous avons également vu que le traitement était d'autant plus efficace que
la tumeur était traitée à un stade précoce, ce qui souligne l'importance d'un
diagnostic tôt au cours du développement tumoral. Ceci étant, le diagnostic se
base essentiellement sur les examens cliniques et mammographies. Ces deux
méthodes sont certes utiles mais requiert que la tumeur atteigne une taille
suffisante pour être détectée. Au cours des dernières années, des progrès
énormes ont été faits en matière de connaissance des gènes impliqués dans la
carcinogenèse. Ainsi, nous savons qu'un patient porteur d'une mutation dans un
allèle des gènes BRCA présente un risque de développer un cancer du sein au
cours de leur vie s'élevant à 60 à 80%. Le problème que nous rencontrons,
cependant, réside dans la quantité de mutations accumulées par les cellules
305
cancéreuses. Par exemple, une cellule de mélanome possède, en moyenne, plus
de 30 000 mutations dans ses génomes. Par conséquent, même si nous
connaissons de nombreux gènes impliqués dans la carcinogenèse, il est encore à
ce jour difficile d'évaluer les quels sont absolument critiques pour la formation de
tumeurs. Mon projet de recherche actuel se concentre sur la base moléculaire de
l'évolution de l'état multicellulaire en utilisant les algues vertes Volvocine comme
modèle d'étude. L'hypothèse étant que les gènes ayant permis l'acquisition de
l'état multicellulaire sont des gènes clefs dans la carcinogenèse. En comprenant
mieux quels sont ces gènes clefs, il serait alors possible d'élargir les tests qui
existent pour BRCA à d'autres gènes mais aussi de développer des tests
permettant la détection de cellules cancéreuses dans le flux sanguin.
306
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