Polymorphismes de l’ADN Présentation et mise en évidence Introduction • Recherche de gènes responsables de maladies génétiques : • • • • • • Analyse de pedigrees où la maladie est présente Sur quel chromosome ? À quel endroit du chromosome ? … Séquence du gène, fonction de la protéine… Nécessité d’avoir des repères le long des chromosomes pour aller à la pêche… C. Camus 2007 1 Chromosome 21 Carte des marqueurs connus C. Camus 2007 Introduction • • Les marqueurs polymorphes sont des loci présentant plusieurs allèles (de 2 à beaucoup) qui vont servir de balises le long des chromosomes Ce sont rarement des gènes, mais tous se transmettent entre générations comme des gènes C. Camus 2007 2 I- Les Marqueurs polymorphes RFLP bi-allèliques Minisatellites Microsatellites SNP (single nucleotide polymorphism) 1. 2. 3. 4. C. Camus 2007 1-RFLP bi-allèliques • • Restriction Fragment Length Polymorphism À un locus donné, un site de restriction va être soit présent soit absent • • Une mutation ponctuelle suffit Mise en évidence : Southern blot ou PCR C. Camus 2007 3 1-RFLP bi-allèliques : 1 kb Allèle 1 Southern blot 2 kb 3 kb Allèle 2 Digestion par l’enzyme Southern blot avec une sonde ( 1/1 ) recouvrant le RFLP 2/2 1/2 3 kb 2 kb 1 kb C. Camus 2007 1-RFLP bi-allèliques : PCR Allèle 1 Allèle 2 PCR avec 2 amorces encadrant le RFLP Digestion par l’enzyme puis électrophorèse 1/1 2/2 1/2 1 kb 0,6 kb 0,4 kb C. Camus 2007 4 1-RFLP bi-allèliques : localisation • • Dans toute séquence non codante (97% ADN) Dans une séquence codante sans conséquence sur la fonction du gène • Si le polymorphisme touche la 3ème base du codon • • • • • • Allèle 1 CAG Gln Allèle 2 CAA Gln ATC Ile ATC Ile TTA (site BglII AGATCT) Leu TTA (site BglII absent) Leu Si le changement d’acide aminé n’a pas d’effet sur la fonction Cas particulier : la mutation étudiée crée un polymorphisme (cf diagnostic direct) C. Camus 2007 2-Minisatellites = RFLP multi-allèliques = VNTR (variable number of tandem repeats) CTGGATTAGCTTAAGCGT CTTAGTAGGATGGATGGA GGAGGTTCAGGTGAT--GGAGGTTCAGGTGATGGA GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGA GGAGGTTCAGGTGAT--ACCTGGGATTCTTCGATC minisatellite PS3 porcin allèle à 7 répétitions C. Camus 2007 5 2- minisatellites • • • • Répétitions en nombre variable d’une séquence de 10 à 50 pb à un locus donné Une même séquence de minisatellite va se retrouver à différents loci sur tout le génome Analyse locus par locus Analyse de la répartition d’un minisatellite sur le génome entier C. Camus 2007 2-Minisatellites - mise en évidence des allèles à un locus • • • Le contexte autour du minisatellite est spécifique d’un locus Analyse par Southern blot ou PCR La sonde ou les amorces s’hybrident autour du minisatellite : locus-spécifiques C. Camus 2007 6 2-minisatellites : Southern blot 2 kb Allèle 1 3 kb Allèle 2 Digestion par l’enzyme Southern blot avec une sonde ( = spécifique d’un LOCUS 1/1 ) adjacente au minisatellite 2/2 1/2 3 kb 2 kb C. Camus 2007 2-minisatellites : PCR Allèle 1 Allèle 2 PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite = spécifique d’un LOCUS 1/1 2/2 1/2 C. Camus 2007 7 Exemple sonde C. Camus 2007 2-Minisatellites - mise en évidence des allèles sur tout le génome • • • Analyse par Southern blot uniquement (PCR = locus spécifique) La sonde s’hybride sur le minisatellite Applications : médecine légale, tests de paternité C. Camus 2007 8 chromosomes Nb répet. sonde = Empreinte génétique Chr 1 Chr 12 Chr 6 Chr 19 Chr 9 C. Camus 2007 2- Minisatellites - empreinte génétique - - Chaque individu a une empreinte différente (sauf les jumeaux monozygotes) : Utilisation en médecine légale Chaque bande présente chez un individu doit l’être également soit chez sa mère soit chez son père : test d’exclusion de paternité (M= mother, C= child, F= father) - C. Camus 2007 9 2-Minisatellites - récapitulation • Les minisatellites sont • Poly-alléliques : grand nombre d’allèles différents à un locus donné (en fonction du nombre de répétitions de la séquence) • Multi-locus : une même séquence de minisatellite va se trouver à différents endroits dans le génome (à chaque fois avec différents allèles possibles) C. Camus 2007 3-Microsatellites • 1-6pb répétées n fois (5!n!40) • • • • • Ex : TGTGTGTGTG….. ! 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le génome humain Présents sur tout le génome Mise en évidence par PCR exclusivement Migration en gel d’acrylamide (plus résolutif que l’agarose) C. Camus 2007 10 3-microsatellites : PCR Allèle 1 Allèle 2 PCR avec 2 amorces encadrant le microsatellite = spécifique d’un LOCUS 1/1 2/2 1/2 C. Camus 2007 3-microsatellites : PCR C. Camus 2007 Lahiri et al, biochemical and molecular medicine 60, 70–75 (1997) 11 3-microsatellites : PCR Test de paternité Amorces fluorescentes et analyse informatique (lecture laser) Bandes bleues : marqueur ms11 Bandes vertes : marqueur ms152 et ms 131 Bandes jaunes : marqueur ms63 Bandes rouges : standard de taille interne Analyse médico-légale D12S256 D5S168 D2S187 D6S798 Victim‘s DNA 6,7 15,8 12,13 7,7 Killer’s DNA 8,8 13,2 12,11 4,6 Suspect’s DNA 8,8 13,2 12,11 4,6 C. Camus 2007 4- Single Nucleotide polymorphism = SNP - Causés par mutagénèse chimique ou erreurs de réplication - bi-alléliques - ratio des allèles : 99,99:0,01 ! 50:50 - Nb loci identifiés chez l’Homme >> 5 millions - taux de mutation 1.109/génération - en conséquence, peu de mutations nouvelles dans l’espèce C. Camus 2007 12 4- Single Nucleotide polymorphism = SNP Mise en évidence : - idéal : le polymorphisme correspond à un RFLP - PCR-SSCP - Allèle-Specific Oligonucleotide (ASO) ! Micro-arrays - séquençage -… C. Camus 2007 Les marqueurs polymorphes • Pour être informatifs, il faut : " " qu’ils soient poly-alléliques Que chaque allèle soit bien représenté : # Si sur 6 allèles, un allèle représente 98%, la majorité de la population sera homozygote pour cet allèle C. Camus 2007 13 II- Applications 1. 2. 3. 4. 5. Gestion de la variabilité génétique Sélection assistée par marqueur génétique Contrôles de filiation Médecine légale Diagnostic de maladies génétiques Diagnostic indirect par analyse de liaison Diagnostic direct 1. 2. 6. Cartographie et clonage positionnel C. Camus 2007 II- Applications 1. 2. Sélection assistée par marqueur génétique Gestion de la variabilité génétique 1. Utilisation de marqueurs associés aux caractères d’intérêt. Pas besoin d’attendre l’expression de ces caractères (qualité lait, viande, etc…) pour savoir si l’animal les expriment C. Camus 2007 14 II- Applications 3. Médecine légale Empreintes génétiques par minisatellites ou microsatellites (un par un, plusieurs loci) 4. Contrôles de filiation Elevages (canin, félins, chevaux, etc…) C. Camus 2007 5- Diagnostic de maladies génétiques • Diagnostic indirect par analyse de liaison Marqueurs à proximité de la mutation responsable de la maladie : liaison génétique Suivre la ségrégation de la maladie au fil des générations en suivant celle des marqueurs Historique familial pour mettre en évidence des recombinaisons C. Camus 2007 15 5- Diagnostic de maladies génétiques Ex : maladie autosomique récessive. Mutation inconnue mais marqueurs à proximité identifiés 6 m D 5 N E 7 m A 2 N C 7 m A 6 D 6 m D 2 A $ 1er enfant malade $ 2ème enfant : diagnostic prénatal ? Microsatellite 1 (allèles = chiffres) Microsatellite 2 (allèles = lettres) C. Camus 2007 5- Diagnostic de maladies génétiques • • • Quand c’est possible, étudier la ségrégation de plusieurs marqueurs situés de part et d’autre de la mutation responsable : haplotype Haplotype : association d’allèles de loci contigus sur un même chromosome Permet de mettre en évidence des recombinaisons C. Camus 2007 16 5- Diagnostic de maladies génétiques Diagnostic direct • • • • • Rare mais très intéressant du point de vue diagnostique RFLP bi-allèliques uniquement (dans phase codante) La mutation responsable de la maladie fait apparaître (ou disparaître) un site de restriction La mise en évidence du site de restriction indique de façon certaine si la mutation est présente ou pas C. Camus 2007 5- Diagnostic direct : exemples Syndrome d’hyperthermie maligne • • • • • • = sensibilité à l’halothane = syndrome de stress (porc) Mutation ponctuelle : viande PSE (pale, soft, exsudative) Mutation au nucléotide 1843 du gène ryr1 - (récepteur à la ryanodine) - récessif létal sous halothane GCGCTC ! GTGCTC apparition d’un site BsiHKA1 Diagnostic : purification ADN, amplification par PCR puis digestion par BsiHKA1 et électrophorèse N/N N/m m/m N BsiHKA1 m C. Camus 2007 17 5- Diagnostic direct : exemples BLAD : Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency • • • • • Race Holstein, récessif, létal Mutation A ! G au nucléotide 383 du gène CD18 - (ß2 integrin - changement aa128 Asp ! Gly) apparition d’un site HaeII Diagnostic : purification ADN, amplification par PCR puis digestion par HaeII et électrophorèse N/N N/m m/m N HaeII m C. Camus 2007 6- Cartographie et clonage positionnel • • Plus on connaît de marqueurs polymorphes sur un génome, plus la localisation des gènes va être facilitée On recherche des liaisons génétiques entre un caractère ou une maladie, et des marqueurs C. Camus 2007 18