Caractérisation biochimique et écologique des corps

Caractérisation biochimique et écologique
des corps multilamellaires produits chez
Dictyostelium discoideum
Mémoire
Alix Denoncourt
Maîtrise en microbiologie
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Alix Denoncourt, 2016
Résumé
Plusieurs protozoaires se nourrissant de bactéries peuvent sécréter des corps
multilamellaires (CML) dans lesquels se retrouvent certaines bactéries pathogènes
ayant résisté à la digestion par la cellule hôte. Ces bactéries enrobées dans des
CML bénéficient de protections supplémentaires contre divers stress et sont
susceptibles d’être aérosolisées et inhalées par l’humain. La présente étude visait à
élucider le rôle physiologique des CML et les mécanismes de leur formation chez
l’amibe modèle Dictyostelium discoideum. L’analyse en spectrométrie de masse du
contenu protéique des CML a révélé la présence de quatre protéines majeures,
incluant SctA communément associée aux pycnosomes. La fonction biologique des
CML reste inconnue, mais il a été déterminé que les amibes et autres protozoaires
pouvaient réinternaliser les CML sécrétés. Ces résultats permettent d’orienter les
recherches afin d’élucider le véritable rôle des CML et ainsi mieux comprendre leur
implication
dans
la
transmission
de
bactéries
pathogènes
d’origine
environnementale.
iii
Abstract
Many protozoa that feed on bacteria secrete multilamellar bodies (MLBs). MLBs
have been found to harbour pathogenic bacteria that are resistant to degradation by
the host cell. MLBs serve to protect these bacteria from various external stresses
and could be aerosolized and subsequently inhaled by humans. The aim of this
study was to elucidate the physiological role of MLBs and the mechanisms governing
their formation in the model amoeba Dictyostelium discoideum. Mass spectrometric
analyses of purified MLBs revealed the presence of four major proteins, including
SctA, a protein generally associated with pycnosomes. The biological function of
MLBs remains unclear, but we demonstrated that the amoeba and another
protozoan can reinternalize secreted MLBs. These results provide new insight into
the role of MLBs in the cell and deepen our understanding of the involvement of
MLBs in the transmission of environmental pathogenic bacteria.
v
Table des matières
Résumé ................................................................................................................... iii
Abstract ................................................................................................................... v
Table des matières ................................................................................................ vii
Liste des tableaux................................................................................................... ix
Liste des figures ..................................................................................................... xi
Liste des abréviations .......................................................................................... xiii
Remerciements .................................................................................................... xvii
Avant-propos ........................................................................................................ xix
Chapitre 1 ................................................................................................................ 1
Introduction............................................................................................................. 1
1.1 Les protozoaires .............................................................................................. 1
1.2 L’amibe Dictyostelium discoideum................................................................... 2
1.3 La voie phago-endocytique ............................................................................. 4
1.4 Les corps multilamellaires ............................................................................... 6
1.5 Relation hôte-bactéries ................................................................................... 9
1.5.1 L’enrobage de bactéries ......................................................................... 12
1.6 Problématique ............................................................................................... 16
1.7 Objectifs spécifiques ..................................................................................... 18
Chapitre 2 .............................................................................................................. 19
Identification de protéines retrouvées sur les corps multilamellaires produits
par Dictyostelium discoideum ............................................................................. 19
2.1 Résumé......................................................................................................... 19
Identification of proteins associated with multilamellar bodies produced by
Dictyostelium discoideum ................................................................................... 20
2.2 Abstract ......................................................................................................... 21
2.3 Introduction ................................................................................................... 21
2.4 Material and methods .................................................................................... 23
2.4.1 Amoeba, bacteria, and antibodies ........................................................... 23
2.4.2 Bacteria/amoebae co-cultures and purification of MLBs .......................... 24
2.4.3 Protein extraction from purified MLBs ..................................................... 24
2.4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses................................................... 25
2.4.5 Immunofluorescence............................................................................... 26
2.4.6 Immunoprecipitation using the H36 antibody........................................... 26
2.4.7 Protein identification by mass spectrometry ............................................ 27
2.5 Results .......................................................................................................... 27
2.5.1 Identification of proteins associated with MLBs ....................................... 27
2.5.2 Confirmation of the presence of SctA on MLBs ....................................... 30
2.5.3 The H36 antibody recognizes many proteins, including one on MLBs ..... 33
2.5.4 Comparison of the anti-SctA and H36 antibodies as MLB markers ......... 35
2.6 Discussion ..................................................................................................... 37
2.7 Acknowledgements ....................................................................................... 41
2.8 Supporting information .................................................................................. 42
Chapitre 3 .............................................................................................................. 45
Caractérisation écologique des CML .................................................................. 45
3.1 Mise en contexte ........................................................................................... 45
3.2 Matériel et méthodes ..................................................................................... 46
3.2.1 Cultures cellulaires et maintenances ....................................................... 46
vii
3.2.2 Production et purification de CML et de billes enrobées .......................... 46
3.2.3 Test de phagocytose par D. discoideum ................................................. 48
3.2.4 Test de phagocytose par T. pyriformis .................................................... 49
3.2.5 Immunofluorescence ............................................................................... 49
3.2.6 Microscopie électronique à transmission (MET) ...................................... 50
3.3 Résultats ....................................................................................................... 51
3.3.1 Production et purification de billes enrobées ........................................... 51
3.3.2 Test de phagocytose par D. discoideum ................................................. 54
3.3.3 Test de phagocytose par T. pyriformis .................................................... 55
Chapitre 4 .............................................................................................................. 63
Discussion générale ............................................................................................. 63
4. 1 Rôles possibles des CML ............................................................................. 66
4.1.1 Communication intercellulaire ................................................................. 66
4.1.2 Cargo ...................................................................................................... 67
4.1.3 Source de nutriments .............................................................................. 68
4.1.4 Déchets métaboliques ............................................................................ 69
4.1.5 Influence écologique sur d’autres micro-organismes ............................... 69
4.2 Conclusion et perspectives ............................................................................ 70
Bibliographie ......................................................................................................... 73
viii
Liste des tableaux
Tableau 1.1 Liste des combinaisons bactérie-protozoaire où l’enrobage de bactéries
a été observé. ......................................................................................................... 15
Table 2.1. Major proteins associated with MLBs based on mass spectrometric
analyses. ................................................................................................................ 29
S2.1 Table. Complete list of proteins associated with MLBs based on mass
spectrometric analyses. .......................................................................................... 42
ix
Liste des figures
Figure 1.1. Le développement multicellulaire chez D. discoideum ............................ 3
Figure 1.2. La voie phago-endocytique chez D. discoideum ..................................... 6
Figure 1.3. Les corps multilamellaires produits par les protozoaires ......................... 7
Figure 1.4. Les corps multilamellaires sont formés par l’invagination des membranes
lysosomales chez D. discoideum .............................................................................. 8
Figure 1.5. Certaines bactéries peuvent survivre à l’intérieur des protozoaires ....... 11
Figure 1.6. L’enrobage de bactéries par les protozoaires ........................................ 14
Figure 1.7. Les protozoaires peuvent enrober des billes de polystyrène dans des
corps multilamellaires ............................................................................................. 16
Figure 2.1. Protein profile of purified MLBs ............................................................. 30
Figure 2.2. SctA is an MLB-associated protein ....................................................... 32
Figure 2.3. MLBs have different morphologies ........................................................ 33
Figure 2.4. The H36 and AD7.5 antibodies recognize the same protein bands in
reducing and non-reducing conditions .................................................................... 35
Figure 2.5. Comparison of the anti-SctA and H36 antibodies as MLB markers. ...... 36
Figure 3.1. Protocole de purification de CML produits par D. discoideum ............... 48
Figure 3.2. Images en microscopie à fluorescence des échantillons de billes
enrobées purifiées .................................................................................................. 53
Figure 3.3. Images en microscopie électronique à transmission des échantillons de
billes enrobées et purifiées ..................................................................................... 54
Figure 3.4. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des
amibes D. discoideum en présence de billes enrobées........................................... 55
Figure 3.5. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des
ciliés T. pyriformis en présence de billes enrobées ................................................. 57
Figure 3.6. Images en microscopie à fluorescence des échantillons contenant des
ciliés T. pyriformis en présence de CML de D. discoideum ..................................... 58
Figure 3.7. Séries d’images en microscopie confocale de corps fécaux produits par
T. pyriformis en présence de CML de D. discoideum après 90 minutes de contact. 59
Figure 3.8. Images en microscopie électronique à transmission des échantillons
contenant des ciliés T. pyriformis en présence de CML de D. discoideum .............. 62
xi
Liste des abréviations
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
ARNm : acide ribonucléique messager
ATP : adénosine triphosphate
BSA : albumine de sérum bovin (Bovine Serum Albumin)
CHAPS : 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate
CML : corps multilamellaire
DAPI : 4',6'-diamidino-2-phénylindole
DTT : Dithiothréitol
EDTA : Éthylène diamine tetra-acétique
G : Gauss
GFP : protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein)
GlcNAc-1-P : N-acétylglucosamine-1-phosphate
IgG: immunoglobuline G
kDa : kilodalton
kV: kilovolt
LB: Lysogeny Broth
M: molaire
MALDI-TOF-MS: Spectrométrie de masse à temps de vol et désorption-ionisation
laser assistée par matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-OfFlight Mass Spectrometry)
MET : microscopie électronique à transmission
MLB : Multilamellar Bodies
mM: millimolaire
PBS : tampon phosphate salin (Phosphate Buffered Saline)
PCB: Plate Count Broth
pH: potentiel hydrogène
PMSF : fluorure de phénylméthylsulfonyle (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)
RPM : rotation par minute
SDS-PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de
dodécylsulfate de sodium (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
TEM : Transmission Electron Microscopy
TSA : Tryptic Soy Agar
V-ATPase ou H+ATPase de type V : pompe à proton de type vacuolaire
xiii
À mes parents, pour la vie qu’ils m’ont
donnée
xv
Remerciements
La réalisation de ce projet de maîtrise a été possible grâce au support et à la
présence de nombreuses personnes. Tout d’abord, je souhaite remercier mon
directeur de recherche, le Dr Steve Charette, pour sa grande disponibilité, son
écoute et ses encouragements continus tout au long de mon projet qui a pris
quelques fois une tournure sinueuse. Steve, merci de m’avoir accordé la chance
inestimable de faire partie de ton équipe. Tu es l’acteur principal de l’atmosphère
incroyable et chaleureuse qui demeure au fil des années au sein de ce laboratoire.
Un grand merci également aux deux autres membres de mon comité d’évaluation,
les Dre Caroline Duchaine et Manon Couture, pour leurs commentaires judicieux et
le temps qu’elles ont accordé à l’encadrement de ce projet. De plus, l’aboutissement
de ces travaux n’aurait pu avoir lieu sans la contribution des organismes
subventionnaires : le CRSNG et le FRQNT pour les bourses de maîtrise et le CRIPA
et l’AELIÉS pour les bourses de voyage et la subvention pédagogique.
Si les années consacrées à ce projet ont été aussi formidables, c’est grâce à de
nombreuses personnes travaillant au sein de l’équipe de recherche. Je ne pourrais
oublier de remercier Valérie, ma première formatrice de stage qui m’a tout appris de
la vie de laboratoire, compagne de voyage hors pair et complice absolue du projet
des bactéries enrobées. Tu as été et reste un modèle pour ma future vie
professionnelle, et une grande amie tout au long de mon séjour au laboratoire. Merci
pour ta grande écoute, ta complicité et de constituer ma source première de potins
croustillants! Je tiens également à remercier Katherine, pour ta générosité et toutes
les fois où tu es venue à mon secours alors que je me débattais avec les Mac,
Cynthia, pour ta bonne humeur constante et Jade, pour ton amitié de longue date, ta
folie divertissante et de m’avoir permis de partager les aléas de la culture des
amibes! Merci à Sabrina, cette force tranquille, en voyage j’y ai découvert une
personne géniale et amusante. Je remercie également Alex et Martin, la relève, et
Antony, pour avoir fait grandir ma culture des mathématiciens et bio-informaticiens
célèbres! Enfin, les anciens : Myriam et son énergie débordante, Mélanie, JeanGuillaume, Stéphanie et Geneviève, qui ont contribué chacun d’eux à rendre chaque
jour au laboratoire si agréable.
xvii
Je ne remercierai jamais assez mes parents, Hélène et Richard, pour nous avoir tout
donné, à moi et à ma sœur, afin que l’on ait les meilleurs outils dans la vie. Je
n’aurais pas pu demander meilleurs parents. À mon père, tout particulièrement,
merci pour ta présence et la fierté que tu me témoignes chaque jour. Merci à ma
grande sœur Estelle d’être présente dans ma vie : malgré nos petits différends
fraternels, je ne t’échangerais pour rien au monde. Pour finir, je remercie également
mes amies Marie-Ève, qui a survécu au baccalauréat avec moi et dont l’amitié m’a
été précieuse toutes ces années, et Audrey : depuis près de 10 ans qu’on se
connaît, tu es restée aussi vraie et attentive qu’au premier jour.
xviii
Avant-propos
Le chapitre 2 de ce mémoire est rédigé sous la forme d’un article scientifique qui a
été soumis à la revue PLOS ONE le 14 mars 2016 (numéro de manuscrit : PONE-D16-10674). Cet article porte sur l’identification des protéines retrouvées sur les corps
multilamellaires produits par l’amibe Dictyostelium discoideum. Les auteurs sont Alix
M. Denoncourt, Valérie E. Paquet, Ahmadreza Sedighi et Steve J. Charette. Tous
les auteurs sont affiliés à l’Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes, Université
Laval.
Mon statut concernant cet article est celui de première auteure. J’ai rédigé la totalité
de l’article à l’exception des sections portant sur les immunoprécipitations avec
l’anticorps H36 et les immunobuvardages de type Western avec les anticorps H36 et
AD7.5 (écrites par S. J. Charette), ainsi qu’une partie de la section Résultats traitant
de l’identification des protéines par spectrométrie de masse (écrite par V. E.
Paquet). S. J. Charette et V. E. Paquet ont également révisé l’article. J’ai réalisé la
majorité des expériences qui y sont présentées. V. E. Paquet a participé activement
à la purification et à la préparation des échantillons de corps multilamellaires pour la
spectrométrie de masse ainsi qu’à l’analyse des résultats de l’identification des
protéines. Les immunoprécipitations avec l’anticorps H36 et les immunobuvardages
de type Western avec les anticorps H36 et AD7.5 ont été effectués par A. Sedighi.
Cette étude a été entièrement réalisée sous la supervision de S. J. Charette.
xix
Chapitre 1
Introduction
1.1 Les protozoaires
Le terme «protiste» regroupe l’ensemble des organismes eucaryotes unicellulaires
qui, par opposition aux organismes supérieurs, ne forment pas de tissus spécialisés,
bien que certaines espèces possèdent un stade multicellulaire. Parmi ceux-ci, les
protistes hétérotrophes sont également connus sous l’appellation de «protozoaire»
qui constitue plutôt un regroupement paraphylétique que d’un véritable taxon (Adl et
al., 2005). Les protozoaires peuvent être classés en quatre grandes catégories selon
leur mode de locomotion, soit le déplacement par pseudopodes (amibes), cils
(ciliés), flagelles (flagellés) ou spores flagellées (sporozoaires). Certains sont des
parasites d’animaux alors que d’autres vivent de façon libre dans l’environnement.
Ces derniers se retrouvent dans pratiquement tous les écosystèmes terrestres et
aquatiques ainsi que dans plusieurs installations artificielles telles que les tours de
refroidissement, les unités dentaires et les réseaux d’eau potable (Greub et Raoult,
2004).
De nombreux protozoaires se nourrissent de bactéries, champignons ou algues par
phagocytose. Les caractéristiques propres à chaque groupe fonctionnel de
protozoaire leur confèrent une niche écologique particulière. Ainsi, les amibes
dominent les systèmes biologiques du sol où elles peuvent avoir accès aux pores de
petite taille dans la matrice du sol par extension de leurs pseudopodes afin d’y
chasser leurs proies (Ekelund et Ronn, 1994). La prédation par les protozoaires
constitue une source majeure de mortalité bactérienne dans les écosystèmes
marins, d’eau douce et du sol (Fenchel, 1987). Ce faisant, les protozoaires
bactériovores participent activement au contrôle des populations bactériennes
(Fenchel, 1987) en plus de favoriser le recyclage des nutriments dans les réseaux
trophiques (Bamforth, 1985). Certains prédateurs bactériens sont plus spécifiques
que d’autres dans la sélection de leurs proies. Par exemple, l’amibe Acanthamoeba
castellanii fait preuve de discrimination entre les différentes bactéries cibles à l’aide
de récepteurs membranaires liant des sucres à la surface des cellules à ingérer
1
(Brown et al., 1975). Par conséquent, les protozoaires constituent d’importants
modulateurs de la structure génétique et fonctionnelle des communautés
microbiennes (Griffiths, 1999; Ronn et al., 2002).
1.2 L’amibe Dictyostelium discoideum
Plusieurs protozoaires sont utilisés à titre d’organismes modèles pour l’étude de
divers processus cellulaires fondamentaux, tirant profit de leurs caractéristiques
communes avec certaines cellules humaines. Le cilié Tetrahymena (Eisen et al.,
2006) ainsi que les amibes Acanthamoeba (Sandstrom et al., 2011) et Dictyostelium
discoideum (Bozzaro et Eichinger, 2011; Cosson et Soldati, 2008; Dallaire-Dufresne
et al., 2011) sont parmi les plus fréquemment employés. D. discoideum est un
phagocyte professionnel ubiquitaire des sols humides se nourrissant de bactéries et
autres micro-organismes. L’utilisation de cette amibe en tant qu’organisme modèle
est de la plus grande praticité : elle croît à la température de la pièce dans un milieu
de culture axénique ou en présence de bactéries digestibles, possède un court
temps de génération (entre 4 et 12 heures) et son petit génome haploïde est
entièrement séquencé et annoté (Eichinger et al., 2005). Cette dernière
caractéristique permet la réalisation de manipulations génétiques de toutes sortes
telles que l’inactivation ciblée de gènes par recombinaison homologue (Charette et
al., 2006a; Kuspa et al., 1995) et l’étiquetage de gènes à l’aide de vecteurs
d’expression (Levi et al., 2000; Manstein et al., 1995).
D. discoideum est également une amibe dite «sociale», c’est-à-dire qu’elle est
capable de former des structures multicellulaires lorsque la nourriture vient à
manquer, une stratégie visant la survie de la collectivité au détriment de l’individu.
D’un état végétatif et solitaire, les cellules évoluent vers différentes phases
d’agrégation, de différenciation cellulaire et de morphogénèse afin de permettre la
formation de corps fructifères supportant des masses de spores capables de résister
à des environnements moins favorables (Figure 1.1) (Kessin, 2001). Ces spores
sont éventuellement dispersées par contact avec des petits invertébrés du sol (ex. :
nématodes) alors que les cellules de la tige des corps fructifères sont sacrifiées. Le
développement multicellulaire chez D. discoideum constitue un vaste sujet de
recherche incluant, entre autres, les surprenantes notions de coopérativité et
2
d’altruisme chez un organisme unicellulaire ainsi que les phénomènes de
communication intercellulaire et de chimiotaxie.
Figure 1.1. Le développement multicellulaire chez D. discoideum. Dans
le sens horaire à partir de l’astérisque (*): en situation de famine, les amibes
sécrètent des vagues d’AMPc menant à l’agrégation d’environ 100 000
cellules en un monticule. Ce dernier s’allonge en hauteur pour former une
pointe constituée des cellules contrôlant l’organisation et le développement
de la structure. Au stade suivant, les amibes peuvent soit procéder
directement à la production des corps fructifères, soit former un plasmode (en
bas à gauche sur l’image). Celui-ci possède de remarquables capacités
photo- et thermotactiques permettant sa migration selon des gradients de
lumière et de chaleur afin de repérer les conditions les plus favorables. Lors
de la culmination des corps fructifères, les cellules de la tige sécrètent de
grandes quantités de cellulose pour rigidifier la structure et meurent durant le
processus. Les cellules restantes s’encapsulent d’une paroi de cellulose et
de mucopolysaccharides caractéristiques des spores, puis celles-ci sont
soulevées jusqu’au sommet de la tige. Image en microscopie électronique:
Copyright, M.J. Grimson & R.L. Blanton, Biological Sciences Electron
Microscopy Laboratory, Texas Tech University.
L’intérêt suscité en recherche par D. discoideum réside également dans le fait de sa
ressemblance saisissante avec les macrophages du système immunitaire animal.
Les leucocytes tels que les macrophages, neutrophiles et cellules dendritiques sont
qualifiés de phagocytes professionnels au regard de leur efficace ingestion de microorganismes, tout comme D. discoideum qui peut internaliser jusqu’à 300 bactéries
3
par heure (Bozzaro et al., 2008; Steinert, 2011). Les amibes et les cellules de
mammifères partagent des stratégies phagocytiques de base similaires (Cosson et
Soldati, 2008) telles que la capacité de repérer et chasser les proies par chimiotaxie
(van Es et Devreotes, 1999) ainsi que les mécanismes de mise à mort des microorganismes faisant intervenir une variété d’enzymes et de transporteurs ioniques).
De plus, le trafic membranaire et la voie endocytique chez D. discoideum sont
hautement similaires aux processus en vigueur chez les macrophages (Cardelli,
2001; Solomon et Isberg, 2000). Par ailleurs, il existe un haut degré de conservation
entre les protéomes de l’humain et de D. discoideum (Eichinger et al., 2005), et cette
orthologie permet l’étude de certaines protéines d’intérêt dans le contexte simplifié
que constitue l’amibe. Enfin, une des contributions les plus notables du modèle
amibien est son utilisation comme hôte alternatif de plusieurs bactéries pathogènes
infectant les macrophages (Bonifait et al., 2011; Bozzaro et al., 2008; Clarke, 2010;
Cosson et Soldati, 2008; Dallaire-Dufresne et al., 2011; Steinert, 2011). D.
discoideum est donc largement employé pour l’étude de la virulence bactérienne et
des interactions hôte-pathogène.
1.3 La voie phago-endocytique
Les amibes acquièrent les nutriments nécessaires à leur survie par l’internalisation
de molécules via la formation de vésicules. Ce processus est désigné par le terme
«phagocytose» lorsqu’il y a ingestion de particules solides alors que la
macropinocytose réfère à l’engouffrement de fluides dans de larges vacuoles ayant
habituellement de 0,5 à 2 µm de diamètre (Mercanti et al., 2006). Chez D.
discoideum, des souches axéniques ont été sélectionnées en laboratoire pour leur
capacité à s’alimenter par macropinocytose, sans l’apport de bactéries comestibles.
La phagocytose d’une particule est initiée par sa liaison à des récepteurs
membranaires de surface et la transduction subséquente de signaux intracellulaires
induisant la réorganisation locale du cytosquelette d’actine (Mellman, 1996). Il y a
alors invagination de la membrane plasmique en une coupe phagocytique afin
d’encercler la particule qui est engouffrée dans la cellule (Figure 1.2). Le matériel
ingéré se retrouve emprisonné dans un phagosome pendant environ une minute,
avant le retrait du manteau de protéines du cytosquelette entourant la vésicule
4
(Hacker et al., 1997; Maniak et al., 1995). Le phagosome mature fusionne ensuite
rapidement avec des vésicules contenant des pompes à proton de type vacuolaire
(H+-ATPase de type V ou V-ATPase) qui sont incorporées dans la membrane du
compartiment résultant, le lysosome (Bush et al., 1994; Clarke et al., 2002; Nolta et
al., 1994; Temesvari et al., 1996). La fusion des vésicules permet également
l’introduction d’enzymes lysosomales moins de 3 minutes après l’ingestion de
bactéries (Souza et al., 1997) alors que le compartiment est acidifié par l’action des
pompes à protons (Aubry et al., 1993; Padh et al., 1991). Chez D. discoideum, deux
classes d’enzymes de type hydrolase sont acheminées successivement aux
lysosomes : celles portant la modification post-traductionnelle N-acétylglucosamine1-phosphate (GlcNAc-1-P) et celles modifiées avec un mannose-6-phosphate
(Souza et al., 1997). Les protéases à cystéine, modifiées par l’ajout d’un GlcNAc-1P, jouent un rôle majeur dans la dégradation des bactéries internalisées dans les
lysosomes (Mehta et al., 1995; North et Cotter, 1991).
Une fois la digestion de la particule complétée, le compartiment revient à un pH
neutre et se voit dépouillé de plusieurs protéines telles que les pompes H+-ATPase
(Aubry et al., 1993; Padh et al., 1993). Ce lysosome tardif (ou post-lysosome)
acquiert également plusieurs autres marqueurs, notamment l’actine, la coronine et la
vacuoline (Rauchenberger et al., 1997). Parallèlement, le lysosome tardif permet la
formation de structures composées de multiples couches membranaires appelées
corps multilamellaires, ceux-ci ne se formant que lors de la phagocytose de
bactéries et non lors de l’internalisation de fluides (Hohl, 1965; Marchetti et al.,
2004). Le contenu du lysosome tardif est finalement sécrété dans l’environnement
par fusion du compartiment avec la membrane plasmique.
5
Figure 1.2. La voie phago-endocytique chez D. discoideum. A. Schéma
hypothétique de la voie phago-endocytique chez D. discoideum. Plusieurs
protéines distribuées dans la voie phago-endocytique peuvent servir de
marqueurs pour la visualisation des différents compartiments. La protéine
p25 est internalisée lors de la formation de la coupe phagocytique puis est
retournée à la surface via un système d’endosomes de recyclage (Charette
et al., 2006b). La protéine p80 s’accumule quant à elle tout au long de la voie
phago-endocytique (Ravanel et al., 2001) alors que la pompe H+-ATPase est
associée aux lysosomes (Bush et al., 1994; Nolta et al., 1994; Temesvari et
al., 1996) et à la vacuole contractile (Fok et al., 1993). Le cytosquelette
d’actine est impliqué dans la formation de la coupe phagocytique ou
macropinocytique en plus de se retrouver sur les lysosomes tardifs
(Rauchenberger et al., 1997). Enfin, la protéine reconnue par l’anticorps H36
se situe majoritairement sur la membrane plasmique. Ph : phagosome, Ly :
lysosome, LT : lysosome tardif, ER : endosomes de recyclage. Image : Steve
Charette, communication personnelle. B. Les différentes étapes de la
phagocytose de bactéries Klebsiella aerogenes par D. discoideum : adhésion
de l’amibe à la bactérie, internalisation de la proie dans un phagosome, mise
à mort et dégradation de la bactérie. Image en microscopie électronique à
transmission reproduite de Cosson et Soldati, 2008.
1.4 Les corps multilamellaires
Les corps multilamellaires (CML) sont de petites structures protéo-lipidiques
d’origine lysosomale, composées de multiples membranes concentriques et dont
l’aspect se rapproche de celui de pelures d’oignon (Figure 1.3). Une grande variété
de cellules eucaryotes produisent et sécrètent des CML ou des vésicules
apparentées (appelées corps fécaux ou fecal pellets), incluant les amibes, ciliés et
autres protistes phagotrophes (Allen et Wolf, 1979; Buck, 1990, 2005; Chekabab et
al., 2012; Gezelius, 1959; Hohl, 1965; Paquet et al., 2013). Chez D. discoideum, les
CML sont produits abondamment lorsque les cellules se nourrissent activement de
bactéries digestibles, bien que la présence de CML puisse encore être détectée
dans
des
populations
d’amibes
à
différentes
étapes
du
développement
multicellulaire (après ingestion de bactéries) (Hohl, 1965). La morphologie des CML
6
varie grandement selon le type de protozoaire, allant de lamelles concentriques
étroitement assemblées à des spirales de membranes relâchées (Figure 1.3). De
même, la taille de ces structures dépend de l’identité du protozoaire : alors que les
CML produits par D. discoideum sont de l’ordre d’environ 1 µm (Gezelius, 1961;
Mercer et Shaffer, 1960) ceux issus de protozoaires plus imposants tels que
Tetrahymena et Acanthamoeba peuvent atteindre 5 µm de diamètre (Berk et al.,
2008; Berk et al., 1998).
Figure 1.3. Les corps multilamellaires produits par les protozoaires. A.
Image en microscopie électronique à transmission d’un corps multilamellaire
produit par l’amibe D. discoideum en présence de bactéries digestibles
Klebsiella aerogenes. Image : Steve Charette, communication personnelle.
B. Image en microscopie électronique à transmission d’un CML produit par le
cilié Tetrahymena sp. en présence de bactéries digestibles Escherichia coli
DH5α. Image reproduite de Berk et al., 2008. Échelle : A = 0,2 µm et B = 0,5
µm.
La fonction biologique des CML chez les protozoaires est inconnue, malgré que
plusieurs études aient suggéré un rôle d’éjection de déchets bactériens non
digestibles (Gezelius, 1959; Hohl, 1965) ou encore d’externalisation de protéines
(Barondes et al., 1985). Même si l’ingestion de bactéries est nécessaire à la
formation
des
CML
chez D.
discoideum,
le
processus
en
soi
dépend
vraisemblablement du métabolisme du protozoaire. En effet, la composition lipidique
des CML chez D. discoideum, en majorité des phospholipides et des lipides neutres
(ex. : les stérols), révèle une origine amibienne plutôt que bactérienne aux
membranes qui composent ces structures (Paquet et al., 2013). Cette information
7
appuie les observations selon lesquelles les CML seraient le résultat de
l’invagination répétitive de membranes lysosomales à l’intérieur des compartiments
(Denoncourt et al., 2014) (Figure 1.4). En présence de bactéries digestibles comme
en présence d’U18666A, une drogue qui altère le transport intracellulaire du
cholestérol chez les mammifères, l’invagination des membranes lysosomales et la
production de CML sont stimulées chez les cellules (Marchetti et al., 2004). Cela
suggère donc un lien entre le métabolisme des stérols chez les protozoaires et la
formation des CML, mais les mécanismes moléculaires gouvernant ce processus
restent à être élucidés. Enfin, le type de bactérie internalisée a également une
incidence sur la formation des CML puisque la morphologie de ces structures diffère
grandement chez les amibes phagocytant des bactéries à Gram positif
comparativement à celles confrontées à des bactéries à Gram négatif (Denoncourt
et al., 2014).
Figure 1.4. Les corps multilamellaires sont formés par l’invagination
des membranes lysosomales chez D. discoideum. A. Image en
microscopie électronique à transmission d’une cellule de D. discoideum
cultivée en présence de bactéries digestibles K. aerogenes et arborant un
CML intra-lysosomal (flèche) ainsi qu’un profil d’invagination de la membrane
lysosomale (encadré). B. Grossissement de l’encadré en A montrant
l’invagination de la membrane du lysosome. Images reproduites de
Denoncourt et al., 2014. Échelle : A = 2 µm et B = 0,2 µm.
Peu d’informations sont disponibles à propos de la composition protéique des CML
et des gènes impliqués dans leur biogenèse. En fait, une des rares protéines
identifiées sur les CML est la discoidine I (Barondes et al., 1985), une lectine ayant
8
un rôle dans l’adhésion cellulaire et la migration ordonnée des amibes lors du
développement multicellulaire (Springer et al., 1984). Détectée sur les CML à l’aide
d’un anticorps monoclonal spécifique, la discoidine I semblerait toutefois être
associée uniquement aux CML présents et excrétés par les cellules au stade
multicellulaire (Barondes et al., 1985). Certains composants bactériens ont
également été décelés sur les CML, entre autres des polysaccharides capsulaires
(Cooper et al., 1986), non digestibles par les amibes (Osen et al., 1965).
Chez les cellules humaines, des structures appelées «corps lamellaires» peuvent
être considérées comme les analogues morphologiques des CML. En effet, ces
corps lamellaires possèdent le même aspect de multiples couches membranaires
concentriques et se présentent comme des organelles de sécrétion et de stockage
de lipides. Mesurant entre 0,1 et 2,4 µm de diamètre, les corps lamellaires sont
retrouvés chez diverses cellules du corps humain, notamment celles de l’épithélium
pulmonaire. Les corps lamellaires produits par les pneumocytes de type II sont
connus pour leur rôle de véhicule pour les protéines de surfactant pulmonaire.
Toutefois, la formation de ces structures lipidiques diffère vraisemblablement de
celle des CML puisqu’il ne semble pas y avoir de lien avec le processus de
phagocytose. Des corps lamellaires sont également produits chez les macrophages,
des cellules phagocytaires du système immunitaire. Chez ces dernières, les corps
lamellaires auraient une origine lysosomale en plus d’être composés en majorité de
phospholipides et de cholestérol. D’ailleurs, il a été suggéré que les corps
lamellaires constituent un moyen de disposer de l’excès de cholestérol et d’échanger
des lipides entre les différentes cellules. Enfin, certaines maladies impliquant le
métabolisme ou le transport des lipides provoquent l’accumulation pathologique de
membranes lysosomales menant à la formation de corps lamellaires (Schmitz et
Muller, 1991).
1.5 Relation hôte-bactéries
Résultats d’une longue coévolution de plus d’un milliard d’années (Greub et Raoult,
2003), les multiples interactions entre protozoaires et bactéries ont mené à
l’émergence de plusieurs micro-organismes résistants à la prédation. En effet, la
pression exercée par l’activité prédatrice des protozoaires a contribué à la
9
diversification des caractéristiques fonctionnelles chez les populations bactériennes
et à la sélection des adaptations les plus susceptibles de permettre leur survie (Matz
et Kjelleberg, 2005). Parallèlement, ces mécanismes de résistance face aux
prédateurs primitifs présentent de fortes similarités avec les traits de virulence
observés chez les bactéries pathogènes infectant les eucaryotes supérieurs (Adiba
et al., 2010). Ainsi, des agents pathogènes tels que Streptomyces californicus (YliPirila et al., 2007) et Mycobacterium avium (Cirillo et al., 1997) voient leur virulence
augmenter à la suite de leur incubation en présence de protozoaires. Ces derniers,
plus particulièrement les amibes, présentent de nombreuses ressemblances avec
les macrophages du système immunitaire animal, notamment les mécanismes de
phagocytose et la machinerie microbicide. En conséquence, la résistance à la
prédation par les protozoaires est considérée comme étant une condition évolutive
préalable au développement de la pathogénicité bactérienne (King et al., 1988).
Les stratégies de défense contre les prédateurs peuvent impliquer la modification
morphologique de la bactérie, la production de métabolites secondaires ou encore
de systèmes de sécrétion d’effecteurs. Les bactéries résistantes sont dites
extracellulaires lorsque leur action inhibe leur ingestion ou leur reconnaissance par
le prédateur alors que les bactéries intracellulaires peuvent survivre ou se multiplier
à l’intérieur de la cellule hôte. Par exemple, Salmonella enterica parvient à modifier
la composition de ses lipopolysaccharides de surface afin d’entraver sa détection par
l’amibe Naegleria gruberi (Wildschutte et al., 2004). Escherichia coli O157 :H57, une
souche bactérienne causant des colites hémorragiques chez l’humain, sécrète des
exotoxines létales pour le cilié Tetrahymena thermophila (Lainhart et al., 2009).
La stratégie de survie intracellulaire est l’une des plus remarquables. Les bactéries
ingérées sont capables d’éviter la digestion à l’intérieur du prédateur et de se loger
dans des vacuoles ou directement dans le cytoplasme de l’hôte (Figure 1.5A).
D’autres encore peuvent résider dans des kystes, les formes dormantes et
hautement résistantes produites par certains protozoaires confrontés à des
conditions environnementales défavorables (Figure 1.5B). L’exemple le plus connu
de survie et de réplication intracellulaire est sans contredit celui de Legionella
pneumophila, une bactérie pathogène causant de graves infections pulmonaires.
Lorsqu’elles sont phagocytées par des amibes, les légionelles parviennent à
10
détourner la voie phagocytique et à inhiber la fusion entre le phagosome et les
lysosomes afin d’échapper à la dégradation (Bozue et Johnson, 1996). L.
pneumophila recrute ensuite différents organites (mitochondries, petites vésicules et
réticulum endoplasmique rugueux) qui s’associent avec le phagosome, permettant à
la bactérie de se camoufler alors qu’elle se multiplie dans ce compartiment modifié
(Finsel et Hilbi, 2015; Prashar et Terebiznik, 2015). Les légionelles, comme les
protozoaires, abondent dans les environnements d’eau douce et dans de
nombreuses installations hydriques artificielles (tours de refroidissement, douches
domestiques, spas, etc.) à partir desquelles elles sont aérosolisées et inhalées par
l’humain (Abu Kwaik et al., 1998; Fields, 1996). Si les bactéries viennent à atteindre
les voies respiratoires inférieures, elles infectent les macrophages alvéolaires d’une
manière hautement similaire à celle employée chez l’amibe (Horwitz, 1983; Segal et
Shuman, 1999; Swanson et Isberg, 1995). En fait, les protozoaires constituent les
hôtes naturels de L. pneumophila, celle-ci étant moins apte à se répliquer de façon
extracellulaire dans l’environnement (Murga et al., 2001). L’infection chez l’humain
serait alors la conséquence indirecte de l’adaptation de cette bactérie à son hôte
amibien. D’ailleurs, il a été proposé que la légionellose ne soit non pas causée par
les bactéries en libre circulation, mais bien par celles associées aux protozoaires
(Rowbotham, 1980).
Figure 1.5. Certaines bactéries peuvent survivre à l’intérieur des
protozoaires. A. Image en microscopie électronique à transmission d’une
amibe Acanthamoeba astronyxis permettant la survie intracellulaire de
bactéries Pseudomonas aeruginosa après 72 heures de co-culture. B. Après
6 jours de co-culture, les amibes forment des kystes résistants à l’intérieur
desquels se retrouvent les bactéries P. aeruginosa. Images reproduites de
Marciano-Cabral et Cabral, 2003. Échelle : A et B = 1 µm.
11
Les protozoaires sont donc considérés comme de véritables réservoirs de microorganismes pathogènes dans l’environnement, notamment pour les bactéries
Mycobacterium spp. (Krishna-Prasad, 1978), Listeria monocytogenes (Ly et Muller,
1990) et Francisella tularensis (Berdal et al., 1996). En plus de supporter la
prolifération de ces bactéries en grandes quantités, les protozoaires constitueraient
également un vecteur de transmission qualifié de «Cheval de Troie» en ce sens que
les bactéries internalisées sont protégées des premières lignes de défense du
système immunitaire (Barker et Brown, 1994). Par exemple, la capacité de
Mycobacterium avium à infecter les cellules épithéliales intestinales chez la souris
est augmentée lorsque la bactérie est co-inoculée avec l’amibe Acanthamoeba
castellanii (Cirillo et al., 1997). L’accentuation de la virulence n’est pas le seul
avantage dont bénéficient les micro-organismes résidant dans les protozoaires. En
effet, les parasites intracellulaires sont protégés contre une variété de stress
physiques ou chimiques en plus de profiter d’une augmentation de leur survie à long
terme (revu dans (Denoncourt et al., 2014)). Ainsi, la bactérie Afipia felis résiste à la
chloration lorsqu’incluse dans des kystes d’Acanthamoeba polyphaga (La Scola et
Raoult, 1999). Shigella sonnei et Shigella dysenteriae se logeant dans A. castellanii
sont protégées de l’action de la gentamicine (Saeed et al., 2009). Enfin, l’association
de L. pneumophila avec Acanthamoeba sp. diminue de 1,5 à 2 fois l’efficacité des
radiations ultraviolettes à éliminer les bactéries (Cervero-Arago et al., 2014).
Les mécanismes permettant aux bactéries internalisées de s’échapper de leur hôte
ne sont pas toujours bien compris. Dans certaines situations, il y a induction de la
lyse du protozoaire afin de permettre la libération d’une grande quantité de cellules
bactériennes. L’éjection non-lytique de la bactérie est également possible, entre
autres dans le cas de Mycobacterium tuberculosis (Hagedorn et al., 2009). Un autre
processus de sortie méconnu est celui de l’enrobage des bactéries dans des CML
qui sont ensuite sécrétés par exocytose.
1.5.1 L’enrobage de bactéries
L’enrobage de bactéries consiste en l’inclusion de ces micro-organismes dans des
CML ou des corps fécaux produits par les protozoaires. En effet, certaines bactéries
peuvent survivre à l’ingestion par un protozoaire et ainsi résister à la dégradation
12
enzymatique s’opérant dans les lysosomes du prédateur. Elles se retrouvent alors
enrobées dans les CML se formant au terme de la voie phagocytique. Ces
enrobages sont ensuite relâchés dans le milieu extérieur par la fusion du lysosome
tardif avec la membrane plasmique (exocytose) ou par la lyse du protozoaire induite
par les bactéries. Chez D. discoideum, l’enrobage de bactéries survient lorsqu’il y a
phagocytose simultanée de bactéries digestibles, stimulant la formation de CML, et
de bactéries résistantes se retrouvant enrobées dans ces CML (Figure 1.6).
L’enrobage de bactéries est un phénomène complexe et encore mal compris à ce
jour (Denoncourt et al., 2014). L’issue de l’interaction entre une bactérie et un
protozoaire dépend d’une multitude de facteurs, notamment les conditions de
croissance et les proportions relatives entre les deux micro-organismes. De plus,
deux souches d’une espèce bactérienne ne seront pas nécessairement enrobées
par un même protozoaire (Paquet et Charette, 2016), ce qui témoigne de la très
grande variabilité et la complexité qu’impliquent les interactions bactériesprotozoaires.
À l’heure actuelle, cinq espèces bactériennes pathogènes sont connues pour être
enrobées par des protozoaires (Tableau 1.1), mais quelques bactéries nonpathogènes telles que Cupriavidus sp. et Rathayibacter triciti sont aussi maintenant
connues pour être incluses dans des CML (Paquet et Charette, 2016). Les
protozoaires connus pour accomplir de l’enrobage de bactéries appartiennent au
groupe des ciliés ou des amibes.
Le phénomène de l’enrobage de bactéries soulève l’intérêt en recherche du fait que
ces bactéries, toujours viables à l’intérieur des CML, sont protégées contre une
multitude de stress chimiques ou physiques. En effet, la nature lipidique hautement
compactée des CML constituerait une barrière physique limitant l’impact de divers
agents et conditions environnementales sur les bactéries enrobées. Par exemple, L.
pneumophila enrobée dans des CML produits par Acanthamoeba polyphaga ou
Acanthamoeba castellanii peut résister à l’action de biocides couramment employés
dans la désinfection de tours de refroidissement ainsi qu’à des cycles de gel-dégel
(Berk et al., 1998). Lorsqu’elles sont enveloppées dans des corps fécaux sécrétés
par Tetrahymena tropicalis, les légionelles présentent également une augmentation
13
de leur survie à long terme en milieu pauvre en plus d’être significativement plus
infectieuses dans des pneumocytes humains (Koubar et al., 2011). De plus, il a été
démontré que des bactéries E. coli O157:H7 incluses dans des corps fécaux de
Tetrahymena pyriformis étaient capables de se multiplier et de s’échapper de
l’enrobage lorsqu’exposées à un milieu riche (Gourabathini et al., 2008).
Figure 1.6. L’enrobage de bactéries par les protozoaires. A. Schéma
hypothétique de la voie phagocytique chez D. discoideum menant à
l’enrobage de bactéries. Les bactéries digestibles (B. Dig.) sont dégradées
dans les lysosomes alors que les bactéries résistantes (B. Pat.) sont incluses
dans les corps multilamellaires naissants à l’étape du lysosome tardif.
Image : Steve Charette, communication personnelle. B. Image en
microscopie électronique à transmission d’un corps multilamellaire produit
par l’amibe Acanthamoeba castellanii et contenant des bactéries Legionella
pneumophila. Image reproduite de Berk et al., 1998. C. Image en
microscopie électronique à balayage d’un corps fécal en voie d’être sécrété
par le cilié Tetrahymena sp. et contenant de nombreuses bactéries
Escherichia coli O157:H7. Image reproduite de Smith et al., 2012. Échelle : B
= 1 µm et C = 2 µm.
14
Tableau 1.1 Liste des combinaisons bactérie-protozoaire où l’enrobage de
bactéries a été observé.
Bactérie
Protozoaire
Glaucoma spp.
Escherichia coli Tetrahymena
O157
pyriformis
Helicobacter
pylori
Acanthamoeba
astronyxis
Enrobage dans des vésicules
sécrétées, multiplication
intracellulaire
Acanthamoeba
polyphaga
Glaucoma spp.
Salmonella
enterica
Enrobage dans des vésicules
(Gourabathini et
sécrétées, multiplication et fuite hors
al., 2008)
des vésicules
Survie intracellulaire, enrobage dans (Smith et al.,
des vésicules sécrétées
2012)
Tetrahymena
tropicalis
Listeria
monocytogenes
Références
Tetrahymena sp.
Acanthamoeba
castellanii
Legionella
pneumophila
Issue de l'interaction
Colpoda spp.
(Marciano-Cabral
et Cabral, 2003)
Enrobage dans des vésicules
(Berk et al., 1998)
sécrétées, protection contre des
biocides et à des cycles de gel-dégel
Enrobage dans des vésicules
sécrétées
Enrobage dans des vésicules
sécrétées, survie à long terme,
protection contre la gentamicine,
infectivité accrue
Enrobage dans des vésicules
sécrétées
Enrobage dans des vésicules
sécrétées, protection contre
l'hypochlorite de sodium, protection
contre la gentamicine
(Berk et al., 2008)
(Koubar et al.,
2011)
(Gourabathini et
al., 2008)
(Raghu Nadhanan
et Thomas, 2014)
Glaucoma sp.
Tetrahymena
pyriformis
Enrobage dans des vésicules
sécrétées
(Gourabathini et
al., 2008)
Tetrahymena sp.
Enrobage dans des vésicules
sécrétées, survie accrue, protection
contre de faibles concentrations
d'hypochlorite de calcium
(Brandl et al.,
2005)
Tableau reproduit de Denoncourt et al., 2014.
Bien que les mécanismes dirigeant l’enrobage des bactéries ne soient pas connus, il
est établi que ce processus est sous le contrôle du protozoaire et non de la bactérie
résistante. En effet, l’amibe D. discoideum parvient à enrober des billes de
polystyrène dans des CML, ces billes physiologiquement inertes permettant de
mimer le comportement des bactéries résistantes (Figure 1.7) (Denoncourt et al.,
2014). Ainsi, il convient qu’étudier la physiologie du protozoaire est primordial dans
la compréhension du phénomène de l’enrobage de bactéries.
15
Figure 1.7. Les protozoaires peuvent enrober des billes de polystyrène
dans des corps multilamellaires. Image en microscopie électronique à
transmission d’une bille de polystyrène enrobée dans un corps multilamellaire
par l’amibe D. discoideum en présence de bactéries digestibles K.
aerogenes. Image reproduite de Denoncourt et al., 2014. Échelle = 0,2 µm.
1.6 Problématique
Les données rassemblées à ce jour sur l’enrobage de bactéries permettent
d’entrevoir un rôle pour ce processus dans la persistance et la propagation de
bactéries pathogènes dans l’environnement. En effet, les bactéries enrobées
conservent leur viabilité et sont aptes à se libérer des CML lorsque des conditions
favorables se présentent. Protégées contre l’action des désinfectants et d’autres
agressions du milieu extérieur, elles représentent donc une difficulté supplémentaire
dans l’éradication des agents pathogènes. Certaines études indiquent également
que la virulence des bactéries pathogènes pourrait être exacerbée après leur
passage dans un protozoaire (Cirillo et al., 1997; Koubar et al., 2011). De plus, la
quantité de CML et de corps fécaux relâchés dans l’environnement pourrait être très
importante considérant l’ubiquité des protozoaires et leur étroite association avec les
bactéries. Enfin, le nombre de bactéries pathogènes pouvant être enrobées par un
protozoaire est pratiquement incalculable puisque, chaque interaction entre un
protozoaire et une souche bactérienne étant unique, les possibilités de
combinaisons sont pratiquement infinies.
16
L’aspect central de la problématique entourant le phénomène de l’enrobage de
bactéries est que l’aérosolisation et l’inhalation subséquente de CML chargés
d’agents pathogènes pourraient constituer un vecteur d’importance dans la
transmission d’infections respiratoires. Les installations hydriques artificielles telles
que les tours de refroidissement et les réseaux d’eau potable, mais également les
étendues d’eau douce stagnante supportent communément la croissance de
protozoaires et de bactéries potentiellement pathogènes, et sont donc susceptibles
de générer des aérosols assortis de CML contaminés. Rowbotham fut le premier à
émettre l’hypothèse que des vésicules d’origine amibienne contenant de grandes
quantités de bactéries L. pneumophila soient les principaux véhicules de
transmission de la maladie du Légionnaire (Rowbotham, 1980, 1986). En effet, les
CML sont suffisamment petits (moins de 5 µm) pour atteindre les voies respiratoires
inférieures lorsqu’inhalés par l’humain et, une fois à l’intérieur des alvéoles
pulmonaires, les bactéries pathogènes incluses dans les CML pourraient facilement
infecter les macrophages et autres cellules de l’hôte. L’enrobage de bactéries dans
des CML porte vraisemblablement plus à conséquence que leur inclusion dans des
kystes ou des cellules végétatives de protozoaires puisque la taille réduite des CML
leur permettrait de s’infiltrer plus profondément dans le tractus respiratoire que les
kystes ou les cellules végétatives.
Les données préliminaires montrent que les CML produits par D. discoideum
peuvent être aérosolisés et que leur structure n’est pas endommagée lors du
processus (V. Paquet, communication personnelle). Ainsi, cela suggère que des
bactéries incluses dans des CML pourraient survivre aux stress imposés par
l’aérosolisation et conserver leur potentiel infectieux. Le phénomène de l’enrobage
de bactéries pourrait donc expliquer pourquoi de fortes doses infectieuses de microorganismes peuvent être propagées sur de très longues distances sans souffrir de la
dessiccation (Nguyen et al., 2006; Nygard et al., 2008).
La problématique du présent projet porte sur le manque de connaissances que nous
avons sur la fonction biologique des CML et les processus de formation de ces
structures chez l’amibe. La compréhension des mécanismes de formation des CML
pourrait permettre de développer des outils pour mieux contrôler leur production
dans l’environnement et ainsi limiter l’enrobage de bactéries pathogènes dans
17
certaines installations humaines critiques. Le premier pas vers ces réalisations serait
l’identification précise des éléments composant les CML, notamment le contenu
protéique qui demeure inconnu à ce jour. De plus, l’implication des CML dans la
propagation de bactéries infectieuses consiste en un phénomène plutôt accidentel :
le véritable rôle des CML dans la physiologie des protozoaires reste encore à être
découvert. La formation de CML ou de structures apparentées est un processus
conservé parmi un grand nombre de cellules eucaryotes, et il est donc peu probable
que de telles structures ne possèdent pas une quelconque fonction d’importance
chez ces organismes. Une autre avenue pour étudier cet aspect de la problématique
est de considérer le rôle des CML d’un point de vue écologique. Quelle est
l’importance de la sécrétion de CML pour une population d’amibes? Pour répondre à
cette question, il importe de déterminer l’impact de la production des CML sur les
populations de protozoaires cohabitant dans un écosystème.
1.7 Objectifs spécifiques
La présente étude vise à élucider les mécanismes de formation et le rôle
physiologique des CML chez l’amibe D. discoideum. À cet effet, la caractérisation à
la fois biochimique et écologique des CML a été entreprise. Les objectifs spécifiques
associés à ce projet sont :
1. Identifier et caractériser les protéines majeures retrouvées sur les CML.
Les fonctions des protéines détectées pourraient donner des indications sur
les acteurs moléculaires régissant la production des CML ou sur la fonction
biologique de ces structures. Cet objectif correspond au chapitre 2 du
présent document et est exposé sous la forme d’un article scientifique.
2. Analyser l’impact de la production de CML dans des populations de
protozoaires. Dans un contexte écologique où la cohabitation entre divers
protozoaires et bactéries est inévitable, il importe d’évaluer la possibilité de
réinternalisation des CML par d’autres protozoaires. En déterminant quelles
sont les interactions entre les CML et différentes populations de protozoaires,
des indices sur la fonction biologique de ces structures pourraient être
obtenus. Cet objectif correspond au chapitre 3 du document.
18
Chapitre 2
Identification de protéines retrouvées sur les
corps multilamellaires produits par
Dictyostelium discoideum
2.1 Résumé
L’amibe Dictyostelium discoideum sécrète des CML lorsqu’elle se nourrit de
bactéries digestibles. La présente étude visait à élucider le rôle physiologique des
CML et les mécanismes moléculaires dirigeant leur formation. Quatre protéines
majeures ont été identifiées sur les CML par spectrométrie de masse, incluant SctA
et une protéine contenant un domaine cytidine/déoxycytidylate déaminase (CDD).
SctA est un constituant des pycnosomes, des structures membraneuses
continuellement sécrétées par les cellules. La présence de SctA sur les CML a été
confirmée par immunofluorescence et par immunobuvardage de type Western à
l’aide d’un anticorps spécifique anti-SctA. La protéine CDD, de fonction inconnue,
pourrait constituer une des protéines reconnues par l’anticorps H36 utilisé
précédemment comme marqueur de CML. Des analyses d’immunofluorescence et
de cytométrie en flux ont confirmé que H36 est un meilleur marqueur de CML que
l’anti-SctA. Cette étude est une étape additionnelle pour élucider le rôle des CML
dans la physiologie des protozoaires.
19
Identification of proteins associated with
multilamellar bodies produced by Dictyostelium
discoideum
Alix M. Denoncourt1,2,3, Valérie E. Paquet1,2,3, Ahmadreza Sedighi1,2,3, and Steve J.
Charette1,2,3
1. Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes, Pavillon Charles-EugèneMarchand, Université Laval, Quebec City, QC, Canada
2. Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de
Québec (Hôpital Laval), Quebec City, QC, Canada
3. Département de biochimie, de microbiologie et de bio-informatique, Faculté des
sciences et de génie, Université Laval, Quebec City, QC, Canada
20
2.2 Abstract
Dictyostelium discoideum amoebae produce and secrete multilamellar bodies
(MLBs) when fed digestible bacteria. The aim of the present study was to elucidate
the physiological role of MLBs. The lipid composition of MLBs is mainly amoebal in
origin, suggesting that MLB formation is a protozoa-driven process that could play a
significant role in amoebal physiology. We identified four major proteins on purified
MLBs using mass spectrometry in order to better understand the molecular
mechanisms governing MLB formation and, eventually, to elucidate the true function
of
MLBs.
These
proteins
included
SctA
and
a
protein
containing
a
cytidine/deoxycytidylate deaminase (CDD) zinc-binding region. SctA is a component
of pycnosomes, which are membranous materials that are continuously secreted by
amoebae. The presence of SctA on MLBs was confirmed by immunofluorescence
and Western blotting using a specific anti-SctA antibody. The CDD protein may be
one of the proteins recognized by the H36 antibody, which was used as a MLB
marker in a previous study. The function of the CDD protein is unknown.
Immunofluorescence and flow cytometric analyses confirmed that the H36 antibody
is a better marker of MLBs than the anti-SctA antibody. This study is an additional
step to elucidate the potential role of MLBs and revealed that only a small set of
proteins appeared to be present on MLBs.
2.3 Introduction
Multilamellar bodies (MLBs) are structures of lysosomal origin composed of multiple
concentric membrane layers (Schmitz and Muller, 1991). They are produced by
various types of eukaryotic cells, including protozoa such as Dictyostelium
discoideum, which are soil organisms that feed mainly on bacteria by phagocytosis.
They produce MLBs ranging in size from 0.5 to 2 µm and secrete them into the
environment (Gezelius, 1961; Mercer and Shaffer, 1960; Paquet et al., 2013).
D. discoideum MLBs are produced in abundance when the cells are grown in the
presence of digestible bacteria but are virtually absent when the cells are grown in
nutrient liquid medium (Denoncourt et al., 2014; Hohl, 1965; Marchetti et al., 2004;
Paquet et al., 2013). Contrary to what was suggested in the literature, MLBs do not
21
appear to be a waste disposal system that serves only to eliminate undigested
bacterial remains. They are likely formed by repetitive inward budding of the
membrane of lysosomal compartments (Denoncourt et al., 2014; Marchetti et al.,
2004). Moreover, based on biochemical analyses of purified MLBs, it appears that
lipids in MLBs are mainly amoebal in origin rather than being similar to the bacterial
lipid profile. These results indicate that MLB membranes are the product of amoebal
metabolism (Paquet et al., 2013). Hence, even if digestible bacteria are required for
D. discoideum to produce MLBs, the process depends largely on the metabolic
capability of the amoebae. MLBs may thus play a significant albeit unknown role in
amoebal physiology.
MLBs, which are also called expelled vesicles and fecal pellets, are produced by
various types of protozoa and are also involved in the bacteria packaging process, a
phenomenon observed when ingested bacteria can resist enzymatic degradation
that normally occurs in the phago-endocytic pathway before being packaged in
MLBs or related structures. To date, viable packaged bacteria have been observed
in the case of five bacterial pathogenic species, including the respiratory pathogen
Legionella pneumophila (reviewed in (Denoncourt et al., 2014). Bacteria packaged in
vesicles are more resistant to a variety of stresses, including biocides and antibiotics
(Berk et al., 1998; Brandl et al., 2005; Koubar et al., 2011; Raghu Nadhanan and
Thomas, 2014). The bacteria packaging process may thus be involved in the
persistence and transmission of some pathogenic bacteria. It has been suggested
that bacteria-containing MLBs would also be small enough to be aerosolized and to
be inhaled by humans (Berk et al., 1998).
Given that MLB formation is under the control of the protozoa, the elucidation of the
molecular mechanisms governing this process would provide a better understanding
of the bacteria packaging phenomenon. This objective cannot be achieved without a
more extended knowledge of the biochemical composition of MLBs and, more
specifically of the protozoal proteins associated with these structures. Identifying
these proteins and their functions may provide clues to the physiological roles of
MLBs. Some proteins have already been identified on D. discoideum MLBs,
including discoidin I and a cysteine proteinase, as well as yet unidentified
glycosylated proteins (Barondes et al., 1985; Emslie et al., 1998; Fukuzawa and
22
Ochiai, 1993). However, discoidin I appears to be associated with MLBs solely in
specific circumstances associated to multicellular development since vegetative cells
do not contain this protein (Barondes et al., 1985; Fukuzawa and Ochiai, 1993).
In the present study, we used a proteomic approach to identify four major proteins on
purified MLBs, including SctA and a protein containing a cytidine/deoxycytidylate
deaminase (CDD) zinc-binding region. Based on immunoprecipitation and mass
spectrometric analyses, the CDD protein may be one of the epitopes recognized by
the H36 antibody (Mercanti et al., 2006). This antibody has been used as an MLB
marker (Paquet et al., 2013), but its epitope is unknown.
2.4 Material and methods
2.4.1 Amoeba, bacteria, and antibodies
D. discoideum DH1-10 cells (Cornillon et al., 2000) were grown at 21°C in HL5
medium supplemented with 15 µg/mL of tetracycline as previously described
(Mercanti et al., 2006). They were subcultured twice a week in fresh medium to
prevent the cultures from reaching the confluence. They were also grown on
bacterial lawns as described below.
K. aerogenes bacteria were grown on LB agar (Millipore, USA) at 37°C, typically for
24h, before being used for the bacteria/amoebae co-culture experiments.
The H36 antibody (monoclonal mouse antibody) has been previously described
(Mercanti et al., 2006). The anti-SctA antibody (B4.2) is a monoclonal mouse
antibody (Sabra et al., 2016). Both antibodies were kindly provided by P. Cosson.
The AD7.5 mouse monoclonal antibody, which recognizes N-acetylglucosamine-1phosphate, was a gift from Hudson H. Freeze (Sanford-Burnham Medical Research
Institute, La Jolla, CA, USA) (Mehta et al., 1996).
23
2.4.2 Bacteria/amoebae co-cultures and purification of MLBs
2 x 106 D. discoideum cells were grown with K. aerogenes on HL5 agar in 15 cm
Petri dishes for 7 days at 21°C to obtain large phagocytic plaques. Samples of the
phagocytic plaques collected using sterile pipette tips were diluted in fresh HL5
medium and were processed for immunofluorescence as described below.
D. discoideum cells were grown in the presence of K. aerogenes to induce them to
secrete large amount of MLBs. The amoebae and bacteria were mixed in a
proportion of 1:1000, respectively. They were plated on HL5 agar and were
incubated at 21°C. After 5 or 6 days, the bacterial lawn was almost entirely
consumed by the D. discoideum cells. At this point, the co-culture was harvested
using a sterile scraper, resuspended in 10 mL of starvation buffer (2 mM Na2HPO4,
14.7 mM KH2PO4, 100 mM sorbitol, 100 µM CaCl2, and 1 % HL5) (Smith et al.,
2010), and centrifuged at 450 x g for 5 min to pellet the amoebae. The supernatant
was mixed with 5 x 107 D. discoideum cells freshly grown in liquid HL5. The new coculture was shaken at 200 rpm overnight at 21°C and was centrifuged at 450 x g for
5 min. The supernatant contained MLBs and particles (<0.5 µm) of various
appearances. To concentrate the MLBs and separate them from the particulate
material, 1 mL of supernatant was deposited on a 6-mL sodium bromide gradient
ranging in density from 1.0 to 1.5 g/mL in a glass tube. The tube was centrifuged at
3220 x g for 45 min at room temperature. The yellowish aggregate corresponding to
the pure MLB fraction (Paquet et al., 2013) was collected using a Pasteur pipette
and was transferred to a 1.5-mL tube. The purified MLBs were washed twice with
PBS by centrifuging them at 17,000 x g for 10 min between each wash. The protein
concentration of the pelleted MLBs was determined using the Quick Start™ Bradford
Protein Assay kit 1 (Bio-Rad, Canada). The purified MLBs were stored at 4°C in a
small volume of fresh 1x PBS. The purified MLBs were examined by transmission
electron microscopy (TEM) as previously described (Paquet et al., 2013).
2.4.3 Protein extraction from purified MLBs
The pellet of purified MLBs was resuspended in denaturation solution to obtain a
concentration of 0.5 µg/µL. Two different denaturation solutions (DS1 and DS2) were
used to determine whether the composition of the solution had an impact on the
24
identification of the proteins. The DS1 solution was composed of 10 M urea, 2%
CHAPS, 50 mM DTT, and 1 M thiourea. The DS2 solution was composed of 10 M
urea, 2% CHAPS, and 200 mM DTT. The proteins were solubilized and denatured at
95˚C for 5 min. The samples were mixed by inversion for 1 h and were centrifuged at
17,000 x g for 10 min. One-half volume of 3x TEX loading buffer was added to obtain
a final concentration of 1x TEX. The lipidic structures were disrupted using a syringe
and a 26G needle, and the mixture was heated at 95˚C for a further 5 min. The
heating steps were omitted for samples that were to be assessed by Western
blotting with the anti-SctA and H36 antibodies.
2.4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses
The solubilized proteins were separated on 10% SDS-PAGE or 4-20% nUView TrisGlycine gradient gels (NuSep, USA) in reducing (5% (v/v) 2-mercaptoethanol added
to the samples loaded on the gel) or non-reducing conditions. Four major protein
bands were excised from the gels run in non-reducing conditions for mass
spectrometric analyses (see below). Samples were also separated on 12% SDSPAGE gels for mass spectrometric analyses of total MLB proteins. Gels run in
reducing conditions were used for Western blotting with the anti-SctA, H36, and
AD7.5 antibodies. Gels run in non-reducing conditions were also used for Western
blotting with H36 and AD7.5 antibodies.
Protein bands were electrotransferred to nitrocellulose membranes, which were
immersed in 50 ml TBS (10 mM Tris, pH 7.4, and 150 mM NaCl) for 5 min. The
membranes were incubated with TBSM (10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, and 7%
skim milk) overnight at 4°C to block non-specific binding. The membranes were
washed five times for 5 min with TBST (10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, and 0.1%
Tween 20) and were incubated for 90 min at room temperature with the anti-SctA
antibody (undiluted hybridoma supernatant), H36 (ascite diluted 1:20,000 in TBST),
or AD7.5 antibody (hybridoma supernatant diluted 1:50 in TBST). They were washed
three times for 5 min in TBST and were incubated for 1 h at room temperature with
peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich, Canada) or goat antimouse IgG IRDye 680RD (Li-cor, USA). They were washed six times for 5 min in
TBST. The protein bands were revealed using an ECL chemiluminescent detection
25
reagent (Millipore, USA), and images were acquired using photosensitive films or
were directly acquired with the Odyssey Fc Imaging System (Li-cor, USA).
2.4.5 Immunofluorescence
Samples containing axenic cells or cells and material from the periphery of
phagocytic plaques resuspended in HL5 were allowed to adhere to glass coverslips
for 60 min and were then fixed for 30 min in 4% paraformaldehyde. The coverslips
were rinsed with PBS containing 40 mM NH4Cl and then with PBS. The samples
were permeabilized for 5 min with PBS containing 0.1% saponin, and the coverslips
were then immersed in PBS containing 0.2% bovine serum albumin (PBS-BSA) at
room temperature for at least 5 min to block non-specific binding sites. The samples
were incubated for 45 min with the appropriate primary mouse antibody (1:3 antiSctA or 1:1000 H36 in PBS-BSA containing 1:200 Alexa 568-coupled phalloidin
(Invitrogen, Canada)). The samples were rinsed with PBS-BSA and were incubated
with an Alexa 488-coupled mouse IgG secondary antibody (Invitrogen, Canada). The
coverslips were then mounted on glass slides using Prolong Gold (Invitrogen,
Canada). Images were acquired using an Axio Observer Z1 microscope equipped
with an Axiocam camera (Carl Zeiss, Canada).
For the flow cytometric analyses, purified MLBs were labelled with the primary antiSctA or H36 antibody and then the secondary Alexa 488-coupled antibody as
described above. The samples on the coverslips were suspended in PBS and were
analyzed using a Guava easyCyte™ 8HT Sampling Flow Cytometer (Millipore,
Canada).
2.4.6 Immunoprecipitation using the H36 antibody
D. discoideum cells (approx. 2 x 107) grown in liquid HL5 medium were centrifuged
for 5 min at 1400 x g. They were resuspended in 5 mL of lysis buffer (PBS containing
1% NP-40, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) and were
kept on ice for 20 min. The cell lysate was centrifuged at 13,000 x g for 15 min at
4°C. Protein A sepharose beads or Protein G sepharose beads (200 µL; SigmaAldrich, Canada) were washed three times with 1 mL of lysis buffer without PMSF.
26
The beads were resuspended in 300 µL of lysis buffer. A portion of the beads (100
µL) was stored at 4°C while 200 µL was mixed with 800 µL of lysis buffer and 50 µL
of H36 antibody. The mixture was shaken for 1 h at 4°C and was then washed twice
with lysis buffer. The H36 antibody-bound beads were resuspended in a final volume
of 200 µL of lysis buffer and were mixed (50 µL of Protein A- or G sepharose beads)
with 650 µL of cell lysate or 650 µL of lysis buffer (control). An aliquot (50 µL) of the
beads not bound to H36 antibody was also mixed with 650 µL of cell lysate as a
second control. The mixtures were prepared in duplicate, incubated for 24 h at 4˚C,
and washed three times with lysis buffer.
Immunoprecipitated proteins were separated by SDS-PAGE on a 10% acrylamide
gel under non-reducing conditions without boiling the samples. The gel was stained
with Coomassie blue to reveal the proteins. Multiple bands were visible on the gels,
with a major band at 47 kDa, as previously observed (Mercanti et al., 2006). The 2535, 47, and 75-kDa protein bands were excised.
2.4.7 Protein identification by mass spectrometry
The identity of the proteins excised from the SDS-PAGE gels (purified MLBs and
H36
immunoprecipitation)
was
determined
by
matrix-assisted
laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) at the
CHUL proteomic platform (CHUL, Quebec City, QC, Canada). The MALDI-TOF-MS
was performed twice following the immunoprecipitation procedure using Protein A
sepharose beads and once following the immunoprecipitation procedure using
Protein G sepharose beads to ensure the validity of the protein identification. In the
case of purified MLBs, the complete set of solubilized proteins was analyzed three
times with three different preparations of purified MLBs.
2.5 Results
2.5.1 Identification of proteins associated with MLBs
The extraction and solubilization of the MLB-associated proteins require the use of
solutions containing high concentrations of chaotropic agents such as urea because
27
they were embedded in compact multilamellar lipidic layers. MLBs are mainly
composed of amoebal lipids (Paquet et al., 2013) and, as such, they could not be
loaded on SDS-PAGE gels without undergoing a solubilization step with the
appropriate buffer. Several chaotropic agents and detergents were used based on
the denaturation solutions commonly used for protein electrophoresis. These agents
break hydrogen and disulfide bonds and disrupt Van der Waals forces and noncovalent interactions between proteins and non-proteinaceous compounds such as
lipids (Rabilloud, 1999). For example, urea maintains proteins in their denatured
state and keeps them soluble, while CHAPS promotes solubilization and minimizes
protein aggregation (Molloy et al., 1998). Thiourea was also added because it was
suspected that large amounts of protein would be solubilized and it was necessary to
prevent them from precipitating, which would have resulted in poor resolution due to
smeared bands (Rabilloud, 1998). The denaturation solution disrupted the 3-D
conformation of the proteins and, more importantly, enabled us to separate the
proteins from the lipids without disturbing the amino acid chains (Rabilloud, 1999).
After solubilization, the MLB proteins were separated on SDS-PAGE gels and were
excised for mass spectrometric analyses.
The list of MLB proteins identified by mass spectrometry is given in Table 2.1. This
table does not include actin, tubulin, mitochondrial proteins, histones, peroxiredoxin,
phosphoglycerate mutase, ribosomal proteins, and elongation factors, which were
intentionally left off the list. These are the proteins that are most frequently detected
in mass spectrometric analyses regardless of the sample type (Petrak et al., 2008;
Wang et al., 2009) and would likely be false positives. The presence of actin was still
assessed by fluorescent phalloidin staining of purified MLBs, with negative results
(data not shown). The complete list of identified proteins is given in supplementary
S2.1 Table. The remaining proteins were ranked based on the number of times they
were identified in three mass spectrometric analyses of different preparations of
purified MLBs. These proteins were detected with the two denaturation solutions,
suggesting that the proteomics results were consistent regardless of the protein
solubilization method used. Four proteins were found in the MLB preparations in
each analysis. These proteins were, in decreasing proportion, PonC (ponticulin-like
proteins) (Q54LC2, Q54LC3, Q54LC0, Q54LC1, Q54LB9), PhoPQ (Q86JB6), SctA
(O77257), and the product of gene DDB_G0292096 (Q54DP5), which will be
28
referred to as CDD. PonC proteins are 15-kDa actin-binding proteins associated with
the plasma membrane (Wuestehube and Luna, 1987), PhoPQ is a hypothetical
protein similar to AprA, an autocrine repressor of proliferation (Brock and Gomer,
2005), and SctA is an 18-kDa protein with an unknown function and a predicted
peptide signal. The initial characterization of this protein is shown in a companion
article (Sabra et al., 2016). The fourth protein, based on the information in
dictybase.org, contains a cytidine and deoxycytidylate deaminase (CDD) zincbinding region, a carbohydrate-binding domain, and a predicted peptide signal.
Table 2.1. Major proteins associated with MLBs based on mass spectrometric
analyses.
Protein
PonC
Description
Gene ID
Molecular
weight (kDa)
Ponticulin-like proteins
DDB_G0286717
DDB_G0286715
DDB_G0286721
DDB_G0286719
DDB_G0286723
15
PhoPQ-activated
pathogenicity-related
DDB_G0276897
56
protein
SctA
Secreted Protein A
DDB_G0278725
18
Cytidine/deoxycytidylate
deaminase zinc-binding
CDD
DDB_G0292096
35
domain-containing
protein
The table does not include ribosomal proteins, elongation factors, actin, tubulin,
mitochondrial proteins, peroxiredoxin, phosphoglycerate mutase, or histones, which
commonly generate false positives in proteomic studies (Petrak et al., 2008; Wang et
al., 2009). Only proteins identified in three independent analyses are shown.
PhoPQ
The protein profile of purified MLBs is shown in Figure 2.1. The molecular weights of
the most abundant proteins were less than 25 kDa. Four bands were excised from
the gels for identification by mass spectrometry. The band at ~10 kDa could not be
identified while the band at ~18 kDa was composed of SctA and PonC. The CDD
protein was identified in the 46 kDa band. The slice at 56 kDa was also excised
because it corresponded to the molecular weight of one of the major proteins
detected in the total MLB extract. As expected, the PhoPQ protein was identified in
29
the 56 kDa band. The molecular weights of proteins did not necessarily correspond
to the molecular weights of the associated band. This may have been due to posttranslational modifications of the proteins (such as glycosylation or cleavage), which
would have affected their migration on the gel.
Figure 2.1. Protein profile of purified MLBs. Proteins were extracted from
purified MLBs, solubilized with denaturation solutions, and run on an SDSPAGE gel. The gel was stained with Coomassie blue to reveal the proteins.
Most of the proteins had low molecular weights. Only a few major bands are
visible on the gel. Based on mass spectrometric results, the 18-kDa band
was a mix of the SctA and PonC proteins, while the 46 and 56-kDa bands
corresponded to the CDD and PhoPQ proteins, respectively. The 10-kDa
band gave inconclusive results.
2.5.2 Confirmation of the presence of SctA on MLBs
Since SctA was identified in each of the mass spectrometric analyses and since a
specific anti-SctA monoclonal antibody was available (Sabra et al., 2016), the
association of SctA with MLBs was verified by immunofluorescence and Western
blot analyses. The cellular localization of the protein was also assessed in axenic
conditions and in the presence of digestible bacteria (K. aerogenes), which are
required for the production of MLBs. Figure 2.2A shows epifluorescence microscopic
30
images of D. discoideum cells grown axenically that were stained with DAPI and
phalloidin (actin), and labelled with anti-SctA antibody. Several SctA-positive dots
were visible in the D. discoideum cells (as described by Sabra et al. (Sabra et al.,
2016)), and some of these dots appeared to be enclosed in actin-positive postlysosomes. Interestingly, SctA-positive structures were also observed in the
extracellular medium despite the fact that D. discoideum does not produce MLBs in
the absence of digestible bacteria. These structures are likely pycnosomes, which
are
membranous
materials
that
are
continuously
formed
in
endosomal
compartments and are secreted by the cells. SctA is known to be a marker of
pycnosomes in D. discoideum cells (Sabra et al., 2016). The strong and oversized
fluorescence of the extracellular dots, which is accentuated by the use of
epifluorescence microscopy, suggested that these small structures contain large
concentrations of SctA.
In the presence of K. aerogenes, D. discoideum produced SctA-positive extracellular
MLBs, which can be distinguished from pycnosomes by their larger size in
differential interference contrast microscopy (DIC) (Figure 2.2B). Several MLBs were
detected by DIC but not all of them were SctA-positive. SctA was also observed in
dot-like structures inside the amoebae. Purified MLBs are shown in Figure 2.2C.
While most of the structures appeared to be SctA positive, the intensity of the
fluorescence was uneven. This might explain why some of the MLBs (produced in
the presence of K. aerogenes) shown in Figure 2.2B were not SctA-positive. In
addition, in samples containing amoebae, bacteria, and debris, it was harder to
distinguish the weak signal of MLBs with fewer SctA proteins. The SctA labelling was
also concentrated in dots rather than being spread out uniformly in the MLBs. It is
possible that more or less compact pycnosomes are embedded in the MLBs, which
would explain the faint labelling of MLBs by the anti-SctA antibody. Indeed, some
MLBs exhibited regions of non-concentric membrane layers (Figure 2.3), which are
similar to the pycnosome structures inside the cells (See Sabra et al., 2016). It has
been shown that SctA-positive structures, likely pycnosomes, are incorporated into
intraendosomal membranes in cells treated with U18666A (Sabra et al., 2016), a
drug that induces the formation of multilamellar structures in endosomes (Marchetti
et al., 2004).
31
Figure 2.2. SctA is an MLB-associated protein. Immunofluorescence
analyses using the anti-SctA antibody on (A) axenic cells, (B) cells grown
with bacteria, and (C) purified MLBs. The cell cultures and purified material
were deposited on glass slides. Nuclei or bacterial DNA were stained with
DAPI, actin was stained with fluorescent phalloidin, and the cells were
labelled using the anti-SctA antibody and a peroxidase-conjugated secondary
antibody. In axenic conditions, SctA was observed in dot-like structures within
the cells and on secreted pycnosomes. In the presence of bacteria (not
visible on the photograph), SctA was found on extracellular MLBs, which are
larger structures than pycnosomes. Some of the MLBs did not appear to be
SctA-positive. Purified MLBs were all labelled with the anti-SctA antibody but
the intensity of fluorescence was uneven. The arrows indicate MLBs and
pycnosomes. (D) Western blot analysis with the anti-SctA antibody. The
protein was detected in ~10 and 18-kDa bands in the MLB sample and in 10
and 17-kDa bands in the cell lysate (500,000 axenically grown cells). The
purified MLB and cell lysate samples contained 5% 2-mercaptoethanol and
denaturation solution. Scale bar: A to C = 5 µm.
32
Figure 2.3. MLBs have different morphologies. Transmission electron
microscopic images of MLBs composed of (A) concentric membrane layers,
(B) a mix of concentric membrane layers and amorphous material, and (C)
amorphous material. The SctA protein may be associated with the
amorphous material whose structure is similar to that of pycnosomes (Bush
et al., 1994; Sabra et al., 2016). Scale bar: A to C = 0.5 µm.
The presence of SctA on purified MLBs was also assessed by Western blotting. The
anti-SctA antibody (Figure 2.2D) detected two bands (~10 and 18 kDa), one of which
corresponded to the molecular weight of SctA (18 kDa). The mass spectrometric
analysis confirmed that the 18-kDa band was indeed SctA. The Western blotting
analysis also confirmed the presence of the two bands associated with SctA in the
cell lysate, although the protein was detected in much lower quantity. This was not
surprising given that, in axenic conditions, the protein is mostly found in the
supernatant (possibly associated with pycnosomes) while much less is present in the
cells (Sabra et al., 2016). One of the bands detected in the cell lysate was slightly
lower than in the MLB sample. It is possible that post-translational modifications are
added to the SctA protein when included in MLBs, which would change its apparent
molecular weight.
2.5.3 The H36 antibody recognizes many proteins, including one
on MLBs
An immunoprecipitation approach done on total cell lysates combined with a mass
spectrometry analysis was used to identify the nature of the antigen recognized by
the H36 antibody. The main protein detected by this analysis was cysteine
proteinase 7 (CP7), or proteinase-1, which is a 47-kDa protein encoded by the cprG
gene (Ord et al., 1997). However, CP7 was never detected by the mass
33
spectrometric analyses performed on purified MLBs (Table 2.1). CP7 is the principal
proteolytic enzyme in D. discoideum vegetative cells (Gustafson and Thon, 1979;
Mehta et al., 1996) and is also the main protein recognized by the AD7.5 monoclonal
antibody, which binds to N-acetylglucosamine-1-phosphate (Mehta et al., 1996).
Since the H36 antibody also recognizes many proteins, a Western blot analysis of a
total extract of D. discoideum cells was performed in parallel using both antibodies.
Interestingly, the migration profiles of the proteins detected by the AD7.5 antibody
were different in reducing and non-reducing conditions (Mehta et al., 1995). In nonreducing condition, the antibody recognized two major bands (47 and 55 kDa) while,
in reducing conditions, multiple smaller molecular weight bands were detected
(Figure 2.4), as previously described (Mehta et al., 1995; Ord et al., 1997),
suggesting that the two bands detected in non-reducing conditions may contain
many different proteins. As shown in Figure 2.4, the H36 and AD7.5 antibodies both
generated the same band profiles in reducing and non-reducing conditions,
confirming that the antigen recognized by the H36 antibody is also Nacetylglucosamine-1-phosphate, a post-translational modification that can be found
on many proteins. These results also suggested that a protein other than CP7 was
detected on the MLBs by the H36 antibody, which would explain why CP7 was not
identified on MLBs by mass spectrometry. Interestingly, the CDD protein, which was
one of the four major proteins associated with purified MLBs, was also detected by
immunoprecipitation with the H36 antibody.
A Western blot was performed on purified MLBs using the H36 antibody to determine
whether the CDD protein is the major epitope on MLBs recognized by this antibody.
Unfortunately, no band was detected in the MLB sample (data not shown). Many
reasons could explain this result, especially given that the epitope recognized by the
H36 antibody is a post-translational modification. It is likely that the epitope on the
CDD protein was altered during the solubilization step used to extract the proteins
from the MLBs.
34
Figure 2.4. The H36 and AD7.5 antibodies recognize the same protein
bands in reducing and non-reducing conditions. A total cell extract of D.
discoideum cells grown in liquid HL5 medium was prepared in the (A)
absence or (B) presence of 2-mercaptoethanol (2-Me). The extract was
separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes, and two
tracks of each membrane were blotted with the H36 or AD7.5 antibody. This
experiment was repeated twice with identical results.
2.5.4 Comparison of the anti-SctA and H36 antibodies as MLB
markers
The H36 antibody may be a more suitable MLB marker than the anti-SctA antibody.
The efficiency of the two antibodies as MLB markers was compared by
immunofluorescence and flow cytometry. Figure 2.5 shows fluorescent microscopic
images of purified MLBs labelled with the anti-SctA (A) and H36 (B) antibodies. In
the case of the anti-SctA antibody, the labelling was not uniform and appeared as
dots scattered throughout the MLBs. In the case of the H36 antibody, the labelling
remained at the surface of the MLBs, giving them a ring-like appearance. The
fluorescent signal was less intense for the anti-SctA antibody than for the H36
antibody.
The labelling efficiency and fluorescence intensity of the two MLB markers was also
assessed in flow cytometric experiments (Figure 2.5C). Unmarked MLBs were used
as a control to determine the gate delimiting unmarked and marked MLB. In the case
of the anti-SctA antibody, only ~40% of the MLBs exhibited more intense
fluorescence than the unlabelled MLB control. In the case of the H36 antibody, 60%
to 70% of the MLBs exhibited more intense fluorescence than the unstained MLB
35
control. In general, the fluorescence of the H36-labelled MLBs was more intense
than that of the anti-SctA-labelled MLBs. This may because there are more H36
antibody binding sites on the MLBs or because they are more accessible than the
binding sites of the anti-SctA antibody. The avidity of the H36 antibody for its epitope
may also be higher than that of the anti-SctA antibody. These results confirmed the
immunofluorescence results in that the labelling with the H36 antibody was more
intense and more evenly distributed than that of the anti-SctA antibody.
Figure 2.5. Comparison of the anti-SctA and H36 antibodies as MLB
markers. Immunofluorescence analyses of purified MLBs using the (A) antiSctA and (B) H36 antibodies. SctA labelling was not uniform and the protein
appeared to be concentrated in aggregates in the MLBs. H36 labelling was
only seen on the surface of MLBs, creating a ring-like appearance. The
purified MLBs were deposited on glass slides and were processed for
immunofluorescence using the anti-SctA or H36 antibodies. (C) Flow
cytometric analysis of purified MLBs labelled with the anti-SctA or H36
antibody. Approximately 40% of the MLBs were labelled with the anti-SctA
antibody while 60-70% were labelled with the H36 antibody. The fluorescence
of the labelled MLBs was much more intense with the H36 antibody than with
the anti-SctA antibody. Scale bar: A and B = 5 µm.
36
2.6 Discussion
The aim of the present study was to investigate the protein composition of MLBs in
order to better understand the molecular mechanisms governing MLB formation in D.
discoideum. Four major proteins associated with MLBs were identified (PonC,
PhoPQ, SctA, and CDD). The presence of SctA was confirmed by Western blot and
immunofluorescence analyses using an anti-SctA antibody. The protein was
concentrated in aggregates in some MLBs while others appeared to contain less
SctA. The CP7 protein was also identified as the main epitope of the H36 antibody,
which was used as an MLB marker in a previous study (Paquet et al., 2013).
However, CP7 was not detected on the MLBs. The H36 antibody likely binds to Nacetylglucosamine-1-phosphate given the high degree of similarity of the protein
profiles detected by it and the AD7.5 antibody, which binds to N-acetylglucosamine1-phosphate (Mehta et al., 1996). Other proteins were identified by the H36 antibody,
including the CDD protein, which may be the epitope recognized on MLBs by this
antibody. It was showed that the H36 antibody was a better MLB marker that the
anti-SctA antibody based on immunofluorescence and flow cytometric analyses.
To ensure that mass spectrometry is a reliable way to identify the MLB proteins, the
analyses were performed three times and only proteins that were identified more
than once were retained. This kind of filtering is necessary since multiple
identifications by repeated analyses increases the confidence in the protein
identifications and results in fewer false positives (Elias et al., 2005). Proteins with a
low peptide count were eliminated in order to reduce the number of false positives, a
practice supported by experimental data (Elias et al., 2005). Several protein
categories that are more likely to give rise to false positives were also eliminated
because they are commonly detected in proteomic studies. These categories include
heat shock proteins, ribonucleoproteins, actin, ATP synthase, peroxiredoxins,
tubulin, elongation factors, and phosphoglycerate mutase (Petrak et al., 2008; Wang
et al., 2009). Since many of the listed proteins are part of the minimal cellular stress
proteome, it has been proposed that proteins that are detected by mass
spectrometric analyses and that overlap this list should only be used as biomarkers
for cellular stress (Wang et al., 2009).
37
As mentioned above, the aim of the present study was to better understand the
formation of MLBs and their physiological role in D. discoideum by identifying
proteins associated with MLBs. However, many of the proteins we detected have
unknown functions or have not been well characterized. For example, the function of
SctA is unknown, but was described in a study by Sabra et al. as a constitutively
secreted protein associated with membranous materials (pycnosomes) (Sabra et al.,
2016). They reported that SctA is mostly found in the extracellular medium rather
than inside the cells. This finding and the fact that we were unsuccessful in our
attempt to overexpress SctA in cells (data not shown) suggested that high
intracellular concentrations of the protein may be toxic and that the cells may use
pycnosomes or MLBs to secrete excess SctA. As observed in the present study and
as Sabra et al. showed, SctA is present in dot-like structures within endosomal
compartments, especially in post-lysosomes, in axenically grown cells. Given that
intra-endosomal budding associated with MLB formation occurs in lysosomes and
post-lysosomes, it is reasonable to conclude that some SctA-rich structures may be
present in MLBs. This may explain why it is difficult, in immunofluorescence
analyses, to distinguish between constitutively secreted SctA-rich pycnosomes and
the smaller SctA-containing MLBs formed in the presence of digestible bacteria. In
addition, the intra-endosomal pycnosomes described by Sabra et al. have a nonconcentric multilamellar morphology similar to that of some MLBs containing regions
of tangled lamellae (Figure 2.3). It is thus possible that the SctA proteins detected on
MLBs may be associated with non-concentric membranes that may be remnants of
pycnosomes. However, it is difficult to conclude that MLBs are a way of disposing of
undesirable proteins since SctA can be secreted in the absence of MLBs.
As with SctA, the presence of the CDD protein on MLBs does not provide a clear
indication about the role of these structures. The CDD protein contains a cytidine
and deoxycytidylate deaminase region and a carbohydrate-binding domain
according to a gene ontology annotation, but no further information is available in the
literature or the databases. Since the CDD protein does not possess a
transmembrane domain, it may be associated with MLBs through interactions with
other glycosylated MLB proteins.
38
Ponticulin-like proteins (PonC) are similar to the ponticulin coded by the ponA gene,
which is a membrane actin-binding protein with a nucleation capacity (Hitt et al.,
1994a; Hitt et al., 1994b). It is tempting to assert that the PonC proteins detected on
MLBs may be involved in actin-dependent invagination of lysosomes leading to the
formation of MLBs. On the other hand, these PonC proteins may be false positives
given their association with actin. As such, the presence of PonC proteins on MLBs
should be verified using molecular tools such as specific antibodies. However, these
tools are not currently available.
The presence of the PhoPQ protein on MLBs could, however, be of some
significance. PhoPQ is a hypothetical protein similar to AprA, which is an autocrine
repressor of proliferation secreted by growing cells (Brock and Gomer, 2005). The
AprA protein functions as a chemorepellant for vegetative cells but not for starved
cells (Phillips and Gomer, 2012). By homology to the role of AprA, PhoPQ may
provide a recognition signal of MLBs. For example, we do not know whether MLBs
are reinternalized after secretion or whether there is a molecular signal that induces
or prevents the phagocytosis of extracellular MLBs. We also do not know whether
MLBs are intercellular communication “devices” or simply waste disposal structures.
PhoPQ may in fact provide a molecular signal to the cells telling them what to do
with extracellular MLBs. Future studies on reinternalization may provide clues about
the physiological role of MLBs.
As mentioned in the introduction, a cysteine proteinase (ddCP38B) may be
associated with secreted MLBs. Emslie et al. (1998) reported that MUD 62 and MUD
166 antibodies, which recognize type 3 O-linked glycosylations on many proteins,
including ddCP38B, immunolabel intracellular and secreted MLBs (Emslie et al.,
1998). Since ddCP38B was the main protein detected by the two antibodies, the
authors concluded that ddCP38B is associated with MLBs. However, their results are
very similar to ours with respect to the H36 antibody, which recognizes CP7, a
protein that is not found on MLBs. It is possible that ddCP38B is not associated with
MLBs and that another protein with a type 3 O-linked glycosylation on MLBs is
recognized by the MUD 62 and MUD 166 antibodies. This other protein may in fact
be one of the major proteins we detected in our analysis. We investigated this
possibility using the DictyOGlyc 1.1 server (Gupta et al., 1999). It appeared that only
39
the CDD protein has potential O-linked glycosylation sites. Based on this information
and on the molecular weight of the CDD protein, the protein reported by Emslie et al.
may in fact have been the CDD protein. Lastly, we did not detect a cysteine
proteinase based on our results from the mass spectrometric analysis of purified
MLBs.
Discoidin I, an endogenous lectin involved in cell-substratum adhesion and ordered
cell migration (Springer et al., 1984), has also been detected on MLBs in a previous
study (Barondes et al., 1985). This protein is synthesized and secreted soon after
the cells are starved and binds to glycoconjugates containing N-acetylgalactosamine
or galactose (Rosen et al., 1973). It was suggested that the MLBs may in fact serve
as vehicles for transporting discoidin I to the extracellular space where it exerts its
function (Barondes et al., 1985) in a process similar to that of lung surfactant
externalized in lamellar bodies by type II cells (Goerke, 1974). We only detected
discoidin I once in our three mass spectrometric analyses (data not shown).
However, since it is only present in cells entering the multicellular stage, it implies
that MLBs formed at the vegetative state will not contain it. The presence of discoidin
I on MLBs also depends on the ingestion of bacterial glycoconjugate ligands by the
cells. Indeed, MLBs produced by amoebae fed boiled Klebsiella pneumoniae cells
(which retain their discoidin I ligand) contained the lectin, while MLBs produced by
amoebae fed boiled Escherichia coli cells (which had lost their discoidin I ligand) did
not (Cooper et al., 1986).
The present study was limited by several aspects of secreted and transmembrane
proteins. These proteins are subject to glycosylation, which can affect peptide
detection by mass spectrometry. It is thus likely that some proteins associated with
MLBs were not detected due to post-translational modifications. This is especially
true for proteins with low molecular weights whose identification is more susceptible
to be affected by post-translational modifications, as it may be the case for the 10
kDa band of the MLB protein profile (Figure 2.1). Moreover, MLBs are highly
resistant lipidic structures from which it is difficult to extract and solubilize
transmembrane proteins. The denaturation and gel migration solutions may also
have interfered with the detection of peptides and the recognition of epitopes by the
antibodies in the Western blot analyses. Furthermore, the compact structures of
40
MLBs may have reduced the accessibility of epitopes in the immunofluorescence
analyses. Lastly, fusing GFP genes or other tags with secreted or transmembrane
protein genes may alter protein functions or locations. In the present study, we
produced a GFP-fused version of SctA but were unable to detect accumulations of
these proteins in cells or in MLBs, possibly due to the toxicity of the overexpressed
protein (data not shown). For all these reasons, we do not consider that our list of
MLB-associated proteins is complete and other proteins may be identified in the
future using other experimental strategies.
The present study provided new biochemical clues about the composition of MLBs.
The functional characterization of the four major MLB proteins that we identified is of
great interest. Elucidating the molecular mechanism governing MLB formation is
essential to better understand the bacteria packaging process and, as such, the
transmission and persistence of pathogenic bacteria. Future studies should also
investigate whether the biochemical composition of MLBs varies with the food source
given that the type of ingested bacteria can affect the morphology of the MLBs
(Denoncourt et al., 2014).
2.7 Acknowledgements
We are grateful to P. Cosson (University of Geneva, Switzerland) and H. H. Freeze
(Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA, USA) for the antibodies
and bacterial strains. We also thank P. Cosson for his critical reading of the
manuscript.
41
2.8 Supporting information
S2.1 Table. Complete list of proteins associated with MLBs based on mass
spectrometric analyses.
Protein
Gene ID
PonC
Ponticulin-like protein
DDB_G0286717
DDB_G0286715
DDB_G0286721
DDB_G0286719
DDB_G0286723
15
3
PhoPQ
PhoPQ-activated
pathogenicity-related
protein
DDB_G0276897
56
3
SctA
Secreted Protein A
DDB_G0278725
18
3
EfbA
Elongation factor 2
S60 ribosomal protein
L13
S60 ribosomal protein
L13a
Cytidine/deoxycytidylate
deaminase zinc-binding
domain-containing
protein
60S ribosomal protein
L4
Major actin
DDB_G0288373
93
3
DDB_G0291870
24
3
DDB_G0275881
21
3
DDB_G0292096
35
3
DDB_G0277803
40
3
DDB_G0289553
42
2
Elongation factor 1
alpha
DDB_G0269134
DDB_G0269136
50
2
ADP/ATP translocase
Major vault protein B
Mitochondrial
processing peptidase
beta subunit
Nucleoside diphosphate
kinase
40S ribosomal protein
S4
V-ATPase subunit M
S60 ribosomal protein
L14
ATP synthase
DDB_G0267454
DDB_G0291127
33
95
2
2
DDB_G0288777
53
2
DDB_G0273069
DDB_G0273805
17
2
DDB_G0277975
17
2
DDB_G0291858
93
2
DDB_G0277975
17
2
DDB_G0294012
57
2
Peroxiredoxin 4
Major vault proteinalpha
DDB_G0274859
29
2
DDB_G0269156
94
2
rpl13
rpl13a
CDD
rpl4
act1
Ef1A
ancA
mvpB
mppB
ndkC
rps4
vatM
rpl14
atp1
Prdx4
mvpA
42
Molecular
Number of
weight identifications
(kDa)
on 3 analyses
Description
Phosphoglycerate
mutase
S60 ribosomal protein
rpl36
L36
60S ribosomal protein
rpl28
L28
40S ribosomal protein
rps8
S8
Elongation Factor 1
efa1G
Gamma
S60 ribosomal protein
rpl21
L21
tubB
Beta tubulin
40S ribosomal protein
rps9
S9
Carboxylesterase, type
Carboxylesterase
B family protein
pGAM
DDB_G0285311
28
2
DDB_G0271668
12
2
DDB_G0282379
14
2
DDB_G0291864
24
2
DDB_G0282979
47
2
DDB_G0279387
18
2
DDB_G0269196
51
2
DDB_G0289877
21
2
DDB_G0279717
59
2
H2AX
Histone H2A
DDB_G0279667
17
2
act3
Actin
40S ribosomal protein
S18
Porin
ATP synthase Beta
subunit
DDB_G0289487
42
1
DDB_G0276415
18
1
DDB_G0271848
30
1
DDB_G0269916
71
1
DDB_G0273249
DDB_G0273623
70
1
DDB_G0293298
71
1
DDB_G0268664
47
1
rps18
porA
atp5b
Hsp70
mshp70
aatA
Heat shock protein 70
Stress-70 protein,
mitochondrial
Aspartate
aminotransferase
Proteins identified only once and with three peptide counts or fewer are not listed in
the table.
43
Chapitre 3
Caractérisation écologique des CML
3.1 Mise en contexte
Le chapitre 2 portant sur l’identification des protéines majeures retrouvées sur les
CML visait à élucider le rôle des CML dans la physiologie cellulaire des protozoaires.
Le chapitre 3 se consacre plutôt à déterminer la fonction de ces structures d’un point
de vue écologique, c’est-à-dire dans un contexte plus proche des conditions qui
prévalent dans l’environnement où de nombreux micro-organismes cohabitent
étroitement. L’objectif était donc d’évaluer si les CML présents dans un milieu ont
une influence sur les protozoaires auxquels ils sont confrontés. Une des premières
possibilités à vérifier était celle de la réinternalisation des CML par les cellules les
ayant produits. La phagocytose est une activité quasi constante chez les amibes :
lorsque mises en présence de particules aussi bien inertes que bactériennes, les
amibes tentent invariablement de les ingérer. Ainsi, l’absence d’internalisation de
CML par les cellules serait une indication que ces structures affectent le
comportement habituel des amibes. La même hypothèse était à vérifier en utilisant
une autre espèce de protozoaire totalement différente de celle ayant produits les
CML. De cette manière, il serait possible d’évaluer si la production de CML peut
affecter le comportement des autres espèces d’un écosystème. L’étude des
interactions entre les CML et les protozoaires pourrait aider à la compréhension de
leur fonction écologique dans les communautés microbiennes.
Le chapitre 3 présente les résultats de ces investigations. Ainsi, les CML produits
par D. discoideum ont été confrontés à des amibes de la même espèce ainsi qu’au
cilié Tetrahymena pyriformis afin de déterminer si la réinternalisation des CML par
ces protozoaires était possible.
45
3.2 Matériel et méthodes
3.2.1 Cultures cellulaires et maintenances
La souche DH1-10 de D. discoideum (Cornillon et al., 2000) a été cultivée à 21°C en
milieu HL5 liquide (1,43% de bacto peptone (Oxoid, Canada), 0,72% d'extrait de
levure, 50 mM de maltose monohydrate, 3,6 mM de Na2HPO4 et 3,6 mM de KH2PO4,
additionné de 15 µg/mL de tétracycline) (Mercanti et al., 2006). Deux fois par
semaine, des aliquotes de cellules ont été prélevées et déposées dans du milieu
frais pour éviter une trop grande confluence des cellules, la concentration visée étant
de 1 x 106 cellules/mL (Froquet et al., 2009).
La souche A du cilié T. pyriformis (ATCC) a été cultivée à 21°C en milieu PP liquide
(2% de protéose peptone et 10 µM de FeCl3, additionné de 250 µg/mL de
streptomycine et de pénicilline G, et 1,25 µg/mL d’amphotéricine B) (Orias, 2000) ou
en milieu SPP liquide (2% de protéose peptone, 0,1% d’extrait de levure, 0,2% de
glucose et 33 µM de FeCl3, additionné de 250 µg/mL de streptomycine et de
pénicilline G, et 1,25 µg/mL d’amphotéricine B) (Gorovsky et al., 1975). Le milieu
SPP a été utilisé lorsqu’une croissance rapide des ciliés était nécessaire. Pour les
maintenances, des aliquotes de cellules ont été prélevées et remises en culture
dans du milieu frais à raison d’une ou deux fois par semaine.
Les bactéries K. aerogenes (fournies par P. Cosson, Université de Genève, Suisse)
ont été décongelées à partir d’une culture conservée à -80°C par inoculation d’un
milieu Lysogeny Broth (LB) agar (37 g/L, EMD Millipore) ou Tryptic Soy Agar (TSA)
(40 g/L, EMD Millipore). Les géloses ont ensuite été incubées à 37°C durant 24h.
3.2.2 Production et purification de CML et de billes enrobées
Les CML ont été produits et purifiés en grandes quantités à partir d’une co-culture de
D. discoideum et de K. aerogenes, une bactérie digestible à Gram négatif, selon le
protocole établi par Paquet et al. (Figure 3.1) (Paquet et al., 2013). Ce protocole a
également été adapté pour la production de billes de polystyrène fluorescentes
enrobées dans des CML.
46
Sur une gélose HL5 agar de 15 cm de diamètre, 2 x 106 amibes et 800 µL d’une
culture de K. aerogenes à une densité optique de 1 ont été étendues à l’aide d’un
râteau stérile. Pour la production de billes enrobées, les quantités étaient de 2 x 106
amibes, 750 µL de K. aerogenes et 50 µL de billes de polystyrène fluorescentes de 1
µm (concentration à 2,65%, Polysciences Inc.). La co-culture a ensuite été incubée à
21°C jusqu’à ce que le tapis bactérien soit entièrement phagocyté par les amibes
(typiquement 6 jours). La biomasse obtenue sur la gélose a été récoltée et remise en
suspension dans 20 mL de tampon starvation (2 mM de Na2HPO4, 14.7 mM de
KH2PO4, 100 mM de D-sorbitol, 100 µM de CaCl2 et 1% de HL5) (Smith et al., 2010).
Les CML ont été solubilisés par inversion pendant 2 heures puis le tout a été
centrifugé 5 minutes à 450 x g pour séparer les CML des amibes, celles-ci se
retrouvant dans le culot résultant. Le surnageant a ensuite été récolté et une portion
de 10 mL a été mélangée à 5 x 107 amibes et 10 mL de tampon starvation dans une
fiole Erlenmeyer en verre stérile. Après une incubation de 24 heures à 21°C avec
agitation à 200 RPM, le milieu a été de nouveau centrifugé 5 minutes à 450 x g pour
conserver uniquement le surnageant contenant les CML. Pour concentrer et séparer
les CML d’éventuelles bactéries résiduelles, une aliquote de 1 mL de surnageant a
été déposée sur un gradient de densité au bromure de sodium (six couches de 1 mL
d’une densité allant de 1,0 à 1,5 g/mL) formé dans un tube en verre (13 x 1 cm) à
l’aide d’une seringue et d’une aiguille 18G. Après une centrifugation de 45 minutes à
3220 x g, différentes couches étaient visibles dans le gradient de densité (Figure
3.1). L’agrégat jaunâtre correspondant à la portion de CML purifiés a été prélevé
avec une pipette Pasteur et déposé dans un tube de 1,5 mL. Pour les échantillons
contenant des billes de polystyrène, les deux autres couches visibles dans le
gradient ont été prélevées pour analyse. Enfin, les CML purifiés ont subi deux
lavages avec du tampon PBS (1,9 mM de NaH2PO4, 8,1 mM de Na2HPO4 et 154
mM de NaCl, pH ajusté à 7,3) en les centrifugeant 10 minutes à 17 000 x g entre
chaque lavage. Chaque échantillon de CML a été conservé à 4°C dans 200 µL de
PBS. Les billes enrobées purifiées ont été marquées par immunofluorescence pour
l’observation au microscope à épifluorescence et ont été préparées pour la
microscopie électronique à transmission (MET) (voir plus loin).
47
Figure 3.1. Protocole de purification de CML produits par D.
discoideum. A. Illustration des différentes étapes du protocole de purification
des CML et des billes enrobées. B et C. Plusieurs couches d’échantillon sont
visibles après la centrifugation des tubes de gradient. L’agrégat jaunâtre
correspondant aux CML purifiés est encerclé en blanc. D. Les échantillons de
billes enrobées purifiées se retrouvent dans la couche supérieure ainsi que
dans l’agrégat situé un peu plus bas dans le gradient (flèches). Figure
modifiée et reproduite de Paquet et al., 2013.
3.2.3 Test de phagocytose par D. discoideum
Des amibes D. discoideum ont été mises en contact avec des billes enrobées
purifiées à partir d’une co-culture de D. discoideum et de bactéries K. aerogenes.
Les cellules issues des tests de phagocytose ont été analysées en microscopie à
fluorescence et en MET. Pour ce faire, des aliquotes de 10 µL de billes enrobées ou
de billes libres diluées 1/200 (contrôle négatif) ont été déposées sur des lamelles de
microscope placées dans une plaque de 6 puits. Par la suite, 450 µL de milieu HL5
contenant 1 x 106 amibes/mL ont été ajoutés sur les lamelles pour permettre le
48
contact entre les billes et les cellules. Le tout a été incubé pour 15, 30 ou 45 minutes
à la température de la pièce. Le milieu déposé sur les lamelles a été retiré par
aspiration et les cellules adhérées ont été marquées par immunofluorescence (voir
la section 3.2.5 pour le protocole).
3.2.4 Test de phagocytose par T. pyriformis
Le cilié T. pyriformis a été confronté à des CML de D. discoideum, des billes
enrobées par D. discoideum et des billes libres, et les échantillons de cellules ont été
marqués par immunofluorescence et préparés pour l’observation en MET. Des
aliquotes de 200 µL de milieu Plate Count Broth (PCB) (0,5 % d’extrait de levure, 1%
de tryptone et 0,2% de dextrose) contenant 1 x 106 cellules/mL ont été mélangées à
20 µL de CML, de billes enrobées ou de billes libres diluées 1/200 dans des tubes
de 1,5 mL. Les cultures ont été incubées pendant 15, 30, 45 ou 90 minutes à la
température de la pièce avec inversion des tubes.
Enfin,
500 µL de
paraformaldéhyde 8% (protocole d’immunofluorescence) ou de solution de fixation
2X (protocole de préparation des échantillons pour la MET) ont été ajoutés aux
tubes.
3.2.5 Immunofluorescence
Les échantillons de billes enrobées purifiées, dilués 1:3 dans du PBS, ont été
déposés pendant 1 heure sur une lamelle de microscope (22 mm x 22 mm) placée
dans un puits d’une plaque de 6 puits. Le milieu a ensuite été retiré des puits par
aspiration et le matériel adhérant aux lamelles a été fixé durant 30 minutes avec 500
µL de paraformaldéhyde 4%. Pour les tests de phagocytose par D. discoideum, la
solution de paraformaldéhyde était ajoutée directement après le test et le retrait du
milieu présent sur les lamelles. La solution de fixation a été retirée par aspiration et
les puits ont été lavés avec 2 mL de PBS contenant 40 mM de NH4Cl, puis avec 2
mL de PBS. Les échantillons ont ensuite été perméabilisés avec du méthanol froid
pendant 2 minutes et les lamelles ont été immergées dans le PBS de nouveau. Le
PBS des puits a été remplacé par 2 mL de PBS contenant 0,2% de BSA (PBS-BSA)
pour une incubation de 5 minutes. Les lamelles ont été transférées dans une
nouvelle plaque de 6 puits sèche et incubées avec 100 µL de la solution d’anticorps
49
primaire (IgG de souris H36 ascite (Mercanti et al., 2006), dilution 1 : 1000 dans du
PBS-BSA) pendant 45 minutes. Les puits ont été rincés trois fois avec 1 mL de PBSBSA, le dernier rinçage étant d’une durée d’au moins 5 minutes. Les lamelles ont été
transférées dans une nouvelle plaque sèche et incubées avec 100 µL de la solution
d’anticorps secondaires (IgG anti-souris Alexa Fluor 568 ou Alexa Fluor 488
(Invitrogen), dilué 1 : 400 dans du PBS-BSA) pendant 30 minutes à l’abri de la
lumière. De nouveau, les puits ont été rincés trois fois avec 1 mL de PBS-BSA en
calculant 5 minutes pour le dernier lavage. Le milieu a été remplacé par 2 mL de
PBS puis les lamelles ont été montées sur des lames de microscope (25 X 75 X 1
mm) avec 10 µL de Prolong Gold (Invitrogen). Les lames ont été scellées avec du
vernis à ongles et conservées à 4°C. Les échantillons ont été observés au
microscope à épifluorescence Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) ou au microscope
confocal inversé LSM 700 (Carl Zeiss).
Pour les échantillons provenant des tests de phagocytose par T. pyriformis, les
mêmes étapes du protocole d’immunofluorescence ont été effectuées, mais en
utilisant des tubes de 1,5 mL comme supports et en centrifugeant 5 minutes à
17 000 x g entre chaque étape.
3.2.6 Microscopie électronique à transmission (MET)
Les échantillons de billes enrobées purifiées et ceux provenant des tests de
phagocytose par D. discoideum et T. pyriformis ont été préparés pour l’observation
en MET. Les divers échantillons ont été fixés pendant 3 heures dans un tampon de
cacodylate de sodium 0,1M à pH 7,3 contenant 2% de glutaraldéhyde et 0,3% de
tetroxyde d’osmium (solution de fixation). Le matériel a ensuite subi trois lavages de
10 minutes dans le tampon cacodylate de sodium puis a été déshydraté dans une
succession de bains d’éthanol (5 minutes dans l’éthanol 30%, 5 minutes dans
l’éthanol 50%, 5 minutes dans l’éthanol 70%, 10 minutes dans l’éthanol 95% et 1
heure dans l’éthanol 100%). Les échantillons ont été enrobés dans de la résine
Epon en présence d’oxyde de propylène (pour les échantillons ne contenant pas de
billes de polystyrène) ou d’éthanol 100% (pour les échantillons contenant des billes).
Dans le premier cas, les échantillons ont été lavés deux fois 30 minutes dans le
solvant d’oxyde de propylène, suivi d’un bain Epon : oxyde de propylène (1 :1)
50
durant 24 heures, de l’évaporation du solvant et d’un nouveau bain d’Epon pendant
24 heures. Dans le second cas, des bains successifs de 2 heures dans de l’Epon :
éthanol 100% de différents ratios (1 :2, 1 :1, 2 :1, 3 :1 et 4 :1) ont été réalisés, suivi
d’un dernier bain d’Epon durant 24 heures. Les échantillons ont ensuite été incubés
24 heures à 37°C puis trois jours à 60°C pour permettre la polymérisation de la
résine à la suite de quoi de fines tranches d’échantillon (60 à 80 nm d’épaisseur) ont
été coupées. Ces dernières ont été colorées au citrate de plomb 0,1% pendant 8
minutes puis à l’acétate d’uranyle 3% pendant 5 minutes sur des grilles de nickel.
Enfin, les échantillons ont été observés au microscope électronique à transmission
JEOL JEM-1230 à 80 kV.
3.3 Résultats
3.3.1 Production et purification de billes enrobées
Afin de déterminer si les CML peuvent être réinternalisés après leur sécrétion par les
amibes, un marqueur pouvant être utilisé en microscopie à fluorescence était
nécessaire. L’anticorps H36, précédemment caractérisé par Paquet et al., 2013 et
dans le chapitre 2 de ce mémoire, permet de visualiser les CML en ciblant un sucre
présent sur ces structures ainsi que sur la membrane plasmique des cellules (voir
Figure 3.4). Toutefois, le marquage avec H36 ne permet pas de distinguer aisément
les membranes internes, ce qui complique la visualisation des CML potentiellement
ingérés par les cellules. Pour cette raison, il a été décidé d’utiliser des billes de
polystyrène fluorescentes comme marqueurs de CML. D’une taille de 1 µm, ces
billes peuvent être enrobées dans des CML lorsque les amibes les ingèrent en
même temps que des bactéries digestibles. Ainsi, en exposant des amibes naïves
(qui n’ont jamais été en contact avec des bactéries) à des billes enrobées purifiées, il
serait possible de visualiser la potentielle internalisation de billes fluorescentes (donc
de CML) par les cellules. Puisque les billes sont recouvertes d’une couche de
membranes caractéristiques des CML, il était peu probable que la présence d’une
particule
étrangère
à
l’intérieur
du
CML
affecte
sa
reconnaissance
(si
reconnaissance il y a) par les amibes.
51
La première étape était donc la production et la purification d’une grande quantité de
billes enrobées selon le protocole présenté précédemment. Les gradients de densité
permettant la séparation des diverses particules présentes dans les échantillons
contenaient deux couches : la plus basse, peu concentrée, était celle correspondant
aux CML non associés à des billes (CML «vides»). La couche supérieure ainsi qu’un
agrégat de matériel situé légèrement plus bas étaient fortement colorés et ont été
prélevés à des fins d’analyse (Figure 3.1D).
Une immunofluorescence avec l’anticorps H36 a été réalisée sur l’échantillon
prélevé de la couche supérieure des gradients afin d’évaluer les proportions de billes
enrobées et de billes non enrobées (billes libres). Il était particulièrement important
de s’assurer de travailler avec des échantillons exempts de toute bille libre. En effet,
si plusieurs billes non enrobées étaient présentes dans l’échantillon mis au contact
des amibes, il serait impossible de déterminer si les éventuelles billes internalisées
par les cellules étaient enrobées ou non. La question de ré-ingestion des CML par
les amibes ne pourrait donc pas être résolue. Au contraire, la présence de CML
«vides» dans l’échantillon n’était pas problématique puisque seules les billes
fluorescentes seraient comptabilisées dans les analyses. La figure 3.2 montre les
résultats de l’immunofluorescence effectuée sur les échantillons prélevés des
gradients de densité. Le marquage des CML avec H36 produit un aspect en anneau
tout autour de la structure alors que les billes fluorescentes sont visibles
lorsqu’excitées à une longueur d’onde de 488 nm. Parmi tous les champs
microscopiques observés, chaque bille était entourée d’un anneau positif à H36,
donc enrobée dans des couches membranaires provenant de CML. Aucune bille
libre n’a été aperçue lors des analyses en microscopie à fluorescence.
Une seconde vérification de la pureté des échantillons a été effectuée en
microscopie électronique à transmission (Figure 3.3). Cette technique permet de
distinguer avec précision les membranes des CML entourant les billes et ainsi
apporter la confirmation ultime de l’absence de billes libres dans l’échantillon. Les
champs microscopiques montraient une bonne quantité de billes enrobées parmi de
nombreux CML «vides» et quelques bactéries résiduelles. Puisque ces derniers –
CML comme bactéries – ne sont pas problématiques pour les tests de phagocytose
de CML contenant des billes, il n’était pas nécessaire de s’en inquiéter. L’élément
52
important était que chaque bille présentait une ou plusieurs couches membranaires
à sa surface, bien que la plupart n’étaient enrobées que par une mince bicouche
lipidique. Ce fin enrobage était plutôt attendu puisque, les billes étant pratiquement
aussi volumineuses que les CML qui leur servent de véhicule (environ 1 µm), il est
probablement difficile pour les amibes de produire plus de membranes à l’intérieur
de leurs post-lysosomes. À faible grossissement, certaines billes semblaient
dénuées d’enrobage, mais une observation plus détaillée permettait de constater la
présence d’un fragment de membrane attaché aux billes. Il est plausible que les
frêles couches membranaires puissent se rompre lors des étapes de centrifugation
nécessaires à la purification des billes enrobées. En somme, les analyses
microscopiques effectuées ont permis de confirmer l’absence de billes libres dans
les échantillons et ainsi procéder aux tests de phagocytose de billes enrobées.
Figure 3.2. Images en microscopie à fluorescence des échantillons de
billes enrobées purifiées. Les échantillons ont été marqués à l’aide de
l’anticorps H36 ciblant l’enrobage de CML autour des billes fluorescentes.
Toutes les billes visibles dans les champs microscopiques semblent
entourées du marquage en anneau caractéristique de l’anticorps H36 ciblant
les CML. L’enrobage autour des billes n’est pas discernable en contraste
d’interférence différentiel (DIC) à cause de la grande réfringence des billes.
Échelle = 5 µm.
53
Figure 3.3. Images en microscopie électronique à transmission des
échantillons de billes enrobées et purifiées. A. Toutes les billes visibles
dans les champs microscopiques sont enrobées dans des CML (flèches). La
grande majorité des enrobages autour des billes sont plutôt minces, à peine
quelques couches de membranes. De nombreux CML ne contenant pas de
billes sont présents dans l’échantillon. Quelques bactéries résiduelles
provenant des co-cultures initiales sont également présentes (têtes
d’épingle). B. Certaines billes se retrouvent dans un enrobage plus épais. C.
L’enrobage autour des billes est parfois constitué d’une seule membrane
(flèche) qui semble se détacher de la particule. Échelles : A = 2 µm, B = 1
µm et C = 0,5 µm.
3.3.2 Test de phagocytose par D. discoideum
Les billes enrobées par D. discoideum ont été mises en contact avec des amibes
naïves de la même espèce afin de déterminer si elles seraient phagocytées par ces
dernières. Après seulement 15 minutes de temps de contact, plusieurs cellules
avaient déjà ingéré une bille enrobée (Figure 3.4). Le même résultat a été obtenu
avec les échantillons de billes libres utilisés à titre de contrôle positif (résultats non
montrés). Après 30 et 45 minutes, certaines cellules contenaient jusqu’à cinq billes
enrobées dans leurs endosomes. Cette simple constatation permettait donc
d’affirmer que les amibes peuvent bel et bien phagocyter leurs propres CML.
L’enrobage autour des billes internalisées n’était pas toujours distinguable avec
l’anticorps H36, possiblement à cause de l’interférence engendrée par le signal émis
par le reste de la cellule. Cette même raison est à l’origine de l’utilisation de billes
fluorescentes comme marqueurs de CML. Quant aux billes enrobées visibles dans le
milieu extracellulaire, il était difficile de déterminer s’il s’agissait de celles provenant
directement de l’échantillon purifié ou alors si les billes enrobées ingérées par les
amibes avaient été ré-expulsées par après. En effet, la question demeurait : que
deviennent les CML une fois ingérés?
54
Figure 3.4. Images en microscopie à fluorescence des échantillons
contenant des amibes D. discoideum en présence de billes enrobées. A
à C. Après un temps de contact de 30 minutes, une ou plusieurs billes
enrobées sont visibles à l’intérieur des cellules. Les billes situées dans le
milieu extracellulaire présentent un enrobage positif au marquage par
l’anticorps H36. En B, on distingue des marquages H36 en anneaux autour
des billes à l’intérieur de la cellule (flèche) : il pourrait s’agir de l’enrobage des
billes ou alors simplement de la membrane de l’endosome contenant la
particule. Échelles : A à C = 5 µm.
3.3.3 Test de phagocytose par T. pyriformis
Les billes enrobées par D. discoideum ont également été présentées à une autre
espèce de protozoaire, le cilié T. pyriformis. L’objectif de cette mise en scène était
de déterminer si l’issue de l’interaction serait la même que celle obtenue avec les
amibes, à savoir l’internalisation des CML. Cette fois-ci, par contre, les CML ne
constituaient pas des particules susceptibles d’être reconnues comme faisant partie
du soi par les ciliés, au contraire des amibes qui avaient elles-mêmes généré les
multicouches membranaires enveloppant les billes. Les résultats de ce test sont
55
sans équivoque : après seulement 15 minutes de contact entre les ciliés et les billes
enrobées, ces dernières se retrouvaient en grande quantité à l’intérieur des cellules
(Figure 3.5). Les billes étaient regroupées en petits amas dans ce qui était fort
probablement les vacuoles alimentaires des ciliés. Le même constat était applicable
aux cellules ayant été confrontées à un échantillon de billes libres (résultats non
montrés), ce qui laissait penser que ces protozoaires ne faisaient pas la distinction
entre les billes de polystyrène et les CML d’amibes. Ainsi, il était évident que les
CML pouvaient être réinternalisés par des protozoaires complètement différents de
celui qui les avaient produits. Un fait intéressant à noter était le marquage H36
visible autour des billes enrobées ingérées par les ciliés, ce qui n’était pas le cas
chez les amibes. L’épitope de H36 n’étant pas présent dans les cellules de T.
pyriformis, le signal émis par les CML internalisés était plus aisément distinguable
sans l’interférence provenant d’autres composantes cellulaires. Cette situation
signifiait deux choses : que de simples CML «vides» pouvaient être utilisés pour
visualiser leur ingestion par les ciliés, mais également qu’il était maintenant possible
de connaître le sort des CML phagocytés en microscopie à fluorescence. En effet,
alors que chez les amibes, il était ardu d’évaluer le devenir de l’enrobage autour des
billes internalisées, le marqueur H36 allait permettre ces analyses chez T. pyriformis.
Les investigations ont donc été poursuivies afin de déterminer le devenir des CML
«vides» phagocytés par les ciliés. Après 45 minutes de temps de contact entre les
cellules et les CML, une forte accumulation de matériel positif à H36 était visible
dans les vacuoles alimentaires, signifiant une ingestion importante de CML (Figure
3.6). Plus encore, des cellules en cours de sécrétion de corps fécaux H36-positifs
ont été aperçues et plusieurs de ces structures étaient visibles dans le milieu
extracellulaire. Les corps fécaux ne sont pas produits en milieu axénique : ils se
forment uniquement lors de l’ingestion de particules, et peuvent contenir des
particules enrobées si celles-ci sont non digestibles (ex : bactéries L. pneumophila
enrobées par T. tropicalis (Berk et al., 2008; Koubar et al., 2011)) ou en être
dépourvus si les particules sont dégradables (ex : bactéries E. coli digérées par
Tetrahymena sp. (Berk et al., 2008)). Ainsi, les corps fécaux H36-positifs observés
contenaient-ils des CML intacts enrobés ou ces derniers étaient-ils dégradés avant
leur inclusion dans les corps fécaux?
56
Figure 3.5. Images en microscopie à fluorescence des échantillons
contenant des ciliés T. pyriformis en présence de billes enrobées. Après
un temps de contact de 15 minutes, de nombreuses billes enrobées se sont
accumulées dans les vacuoles alimentaires des ciliés. Le marquage H36 de
l’enrobage autour des billes parvient à pénétrer à l’intérieur des cellules.
Échelle = 5 µm.
En étudiant plus attentivement l’aspect du marquage H36 à l’intérieur des corps
fécaux, il a été possible d’y apercevoir les anneaux caractéristiques des CML tels
qu’ils sont constatés chez les CML inaltérés (Figure 3.6B). Si les CML avaient été
endommagés durant leur transit chez les ciliés, un marquage H36 plus diffus à
l’intérieur des corps fécaux aurait été attendu. Au contraire, les résultats obtenus
laissaient entrevoir la possibilité d’une accumulation de CML intacts à l’intérieur des
corps fécaux. Pour s’en assurer, des analyses en microscopie confocale ont été
effectuées de manière à obtenir une meilleure résolution de la structure interne des
corps fécaux (Figure 3.7). Les images acquises à différents plans focaux à l’intérieur
de ces structures ont permis de visualiser avec plus de précision les CML
enveloppés. Ainsi, la présence de CML apparemment intacts dans les corps fécaux
semblait un phénomène récurrent puisque des anneaux H36 étaient visibles dans la
plupart des structures. L’anticorps H36 semblait toutefois marquer uniquement les
57
CML situés en périphérie du corps fécal : plus le plan observé était proche du centre
de la structure, moins les anneaux H36 étaient distinguables et plus un marquage
parfaitement sphérique autour du corps fécal était obtenu. À ce stade des analyses,
il était possible que les CML les plus profondément enfouis soient plus altérés que
les autres ou alors que l’anticorps n’est tout simplement pas capable de pénétrer
jusqu’au centre de la structure.
Figure 3.6. Images en microscopie à fluorescence des échantillons
contenant des ciliés T. pyriformis en présence de CML de D.
discoideum. A. Après 45 minutes de contact, les vacuoles alimentaires des
ciliés contiennent du matériel positif au marquage par l’anticorps H36
témoignant de l’ingestion d’une grande quantité de CML. Certaines cellules
semblent en cours de sécrétion de corps fécaux fortement positifs au
marquage de CML (flèche). B. Plusieurs corps fécaux sont visibles dans le
milieu extracellulaire après 45 minutes de contact entre les ciliés et les CML.
Il est possible de distinguer le marquage H36 en anneau caractéristique des
CML à l’intérieur même des corps fécaux. Échelles : A et B = 5 µm.
58
Figure 3.7. Séries d’images en microscopie confocale de corps fécaux
produits par T. pyriformis en présence de CML de D. discoideum après
90 minutes de contact. A et B. Les différentes tranches de 0,5 µm réalisées
par la microscopie confocale permettent de distinguer les CML enrobés dans
les corps fécaux. Les CML sont marqués avec l’anticorps H36 leur donnant
un aspect en anneau. En B, de gauche à droite : plus le plan focal s’éloigne
du centre du corps fécal, plus les CML enrobés sont visibles distinctement.
Échelles : A et B = 5 µm.
La confirmation de la structure des corps fécaux est venue des analyses en MET
réalisées sur des échantillons de ciliés ayant été en contact avec des CML durant 45
ou 90 minutes (Figure 3.8). Dans les cellules provenant des échantillons de 45
minutes, les vacuoles alimentaires étaient chargées de matériel plus ou moins
densément empaqueté. Au temps 90 minutes, toutes les vacuoles étaient très
opaques à cause de la densité élevée du matériel. Des plans plus rapprochés des
vacuoles ont permis d’y visualiser les CML compressés les uns sur les autres. Les
vacuoles les plus claires contenaient une grande quantité de CML peu compactés et
un espace était visible entre ceux-ci et la membrane du compartiment cellulaire. Au
contraire, les vacuoles de teinte foncée étaient remplies de CML fortement
comprimés qui prenaient un aspect bombé sous la pression, à la manière d’un relief
en topographie. Les corps fécaux expulsés dans le milieu extracellulaire étaient à
l’image des vacuoles, c’est-à-dire des structures très sphériques chargées de CML
denses et compressés. En théorie, un corps fécal de 5 µm de diamètre pourrait
contenir un peu plus d’une centaine de CML de 1 µm de diamètre, mais ce nombre
59
pourrait être beaucoup plus important compte tenu de la compression que subissent
les CML. Enfin, plusieurs vacuoles alimentaires et corps fécaux contenaient ce qui
semblait être une cellule bactérienne incluse au travers des CML empaquetés
(Figure 3.8E et F). Il s’agissait vraisemblablement de bactéries K. aerogenes
résiduelles provenant des échantillons purifiés de CML, puisque de telles cellules ont
été aperçues dans les échantillons de billes enrobées (Figure 3.3A).
Toutes ces données permettent d’éclaircir le sort des CML ingérés par le cilié T.
pyriformis. Les CML internalisés se retrouvent dans une vacuole alimentaire où ils
s’accumulent par centaines. Puis, ils sont progressivement comprimés les uns sur
les autres, un peu à la manière d’un compacteur à déchets, possiblement pour
faciliter la formation et l’expulsion du corps fécal vers l’extérieur. Malgré la
compression que subissent les CML, ceux-ci conservent relativement bien leur
structure de lamelles concentriques, ce qui explique qu’il est toujours possible de
distinguer les anneaux H36 en microscopie à fluorescence. En somme, loin d’être
dégradés lors de leur phagocytose par les ciliés, les CML sont inclus dans des corps
fécaux à l’instar de plusieurs bactéries résistantes (voir Tableau 1.1).
60
61
Figure 3.8. Images en microscopie électronique à transmission des
échantillons contenant des ciliés T. pyriformis en présence de CML de
D. discoideum. (Voir page précédente) A. Après 45 minutes de contact, les
vacuoles alimentaires des ciliés sont chargées de CML. Certaines vacuoles
sont très opaques à cause d’une plus grande densité de matériel (flèches)
alors que d’autres sont moins engorgées (têtes d’épingle). B. Après 90
minutes de contact, toutes les accumulations de CML à l’intérieur des ciliés
ont une densité de matériel élevée. C. Agrandissement de l’image en A de
trois vacuoles alimentaires contenant des CML. Ceux-ci semblent être
compactés progressivement à l’intérieur des vacuoles, ce qui produit
différents niveaux de densité à mesure que les CML sont comprimés les uns
sur les autres. D. Vacuole contenant des CML distinctement identifiables
avant leur compression. E. Vacuole contenant des CML fortement compactés
leur donnant un aspect en relief. F. Des corps fécaux contenant des CML
compressés ont été sécrétés dans le milieu extracellulaire. Les flèches en E
et F montrent des structures semblables à des bactéries ayant été enrobées
dans les corps fécaux en même temps que les CML. Échelles : A et B = 10
µm, C = 5 µm, D et E = 2 µm et F = 1 µm.
62
Chapitre 4
Discussion générale
Le présent projet visait à élucider les mécanismes de formation et le rôle des CML
chez D. discoideum, ces structures étant suspectées de contribuer à la survie
bactérienne et à la propagation de certains micro-organismes pathogènes dans
l’environnement. En effet, la machinerie moléculaire impliquée dans la biogenèse
des CML et, par conséquent, dans le phénomène de l’enrobage de bactéries était
totalement inconnue. De plus, la même incertitude prévalait en ce qui concerne
l’utilité des CML dans la physiologie et l’écologie des protozoaires. Les objectifs de
ce projet consistaient donc à 1) identifier et caractériser les protéines retrouvées sur
les CML afin de déduire le mécanisme de leur formation et 2) vérifier si les CML
peuvent être réinternalisés après leur sécrétion pour mieux comprendre leur
interaction avec les protozoaires.
Pour ce faire, des échantillons purifiés de CML ont été analysés par spectrométrie
de masse et quatre protéines majeures ont été identifiées : PonC, SctA, PhoPQ et
CDD. Toutefois, le profil de migration du contenu protéique des CML ne contenait
que très peu de bandes sur le gel SDS-PAGE, signifiant que peu de protéines
majeures étaient associées à ces structures. Ce résultat n’était pas si surprenant :
en effet, étant formés dans un compartiment d’origine lysosomale, les CML sont en
quelque sorte des produits de dégradation. Plusieurs protéines associées aux
membranes lysosomales sont donc susceptibles d’être dégradées lors de
l’invagination des membranes menant à la formation des CML. Avant la présente
étude, seulement une protéine, la lectine Discoidine I, avait été localisée sur les CML
à l’aide d’un anticorps spécifique (Barondes et al., 1985). Cette protéine, synthétisée
uniquement lors du développement multicellulaire et liant les sucres contenant du Nacétylgalactosamine ou du galactose (Rosen et al., 1973), a également été identifiée
dans la matrice extracellulaire, une composante permettant l’accumulation de
protéines sécrétées (Cooper et Barondes, 1984; Huber et O'Day, 2015). Par contre,
les expériences réalisées au cours du présent projet n’ont permis de détecter cette
protéine qu’une seule fois sur trois analyses de spectrométrie de masse,
possiblement à cause de la méthode de détection qui diffère grandement de celle
63
employée par Barondes et al. Il est également possible que la majorité des CML
contenus dans les échantillons purifiés soient issus de cellules végétatives n’ayant
pas entrepris la synthèse de la Discoidine I.
Des quatre protéines majeures identifiées au cours de ce projet, seulement SctA a
pu être confirmée sur les CML à l’aide d’une seconde méthode, en l’occurrence une
immunofluorescence effectuée directement sur les CML avec un anticorps
spécifique contre cette protéine. Ainsi, on ne peut pas exclure la possibilité que
certaines des autres protéines identifiées soient issues de vésicules provenant de
cellules éclatées qui auraient été purifiées en concomitance avec les CML. Cela
reste donc à être vérifié ultérieurement. De plus, puisque le type de bactérie utilisée
pour la production de CML par les amibes influence la morphologie de ces structures
(Denoncourt et al., 2014), le contenu protéique pourrait également différer en
conséquence. Jusqu’à présent, toutes les analyses de spectrométrie de masse ont
été effectuées avec la même espèce bactérienne (K. aerogenes).
Peu d’informations sur les mécanismes de formation ou le rôle des CML ont pu être
dégagées de l’identification des protéines PonC, SctA, PhoPQ et CDD. En effet, ces
protéines, peu ou pas du tout caractérisées, n’ont pas de fonction connue. Tout de
même, certaines données disponibles sur les domaines structuraux présents dans
ces protéines permettent d’élaborer quelques hypothèses. Premièrement, les
protéines PonC sont similaires à la ponticuline (PonA), une protéine permettant
l’ancrage du cytosquelette d’actine à la membrane plasmique (Hitt et al., 1994a; Hitt
et al., 1994b). Ainsi, PonC pourrait être impliquée, via son association avec l’actine,
dans les mécanismes de formation des CML lors de l’invagination de la membrane
lysosomale. La protéine CDD, quant à elle, possède un domaine de liaison aux
sucres commun aux enzymes hydrolytiques de type cellulase (Finn et al., 2016). Il
est possible que la protéine CDD soit recrutée dans les lysosomes pour y accomplir
la dégradation du matériel ingéré, puis qu’elle soit incorporée aux CML
subséquemment. Enfin, le domaine PhoPQ-activated pathogenicity-related de la
protéine PhoPQ (produit du gène DDB_G0276897) est également retrouvé chez des
protéines régulatrices bactériennes importantes pour la virulence de S. enterica
(Groisman, 2001). Chez S. enterica et E. coli, le régulon PhoPQ consiste en un
système à deux composantes (PhoP et PhoQ) qui active une série de gènes
64
spécifiques (Monsieurs et al., 2005). Chez D. discoideum, quatre protéines en
excluant la protéine PhoPQ (DDB_G0276897) possèdent ce domaine PhoPQactivated, notamment la protéine AprA. Cette dernière agit en tant que répresseur
autocrine de prolifération cellulaire lorsque sécrétée (Brock et Gomer, 2005) et
chémorépulsif chez les cellules végétatives (Phillips et Gomer, 2012). Toutes ces
données laissent donc entrevoir une action régulatrice extracellulaire pour la
protéine PhoPQ (DDB_G0276897).
La protéine SctA a été l’objet d’une première caractérisation récemment et est
maintenant
connue
pour
être
associée
aux
pycnosomes,
des
structures
membraneuses continuellement formées dans les endosomes et sécrétées par les
cellules axéniques (Sabra et al., 2016). Ainsi, la présence de SctA sur les CML
pourrait être simplement attribuable à l’incorporation des pycnosomes dans les CML
lorsque les deux structures se retrouvent simultanément dans les lysosomes tardifs
de l’amibe. N’étant pas toujours présente sur les CML (voir Figure 2.5A), la protéine
SctA est peu probablement impliquée dans les mécanismes de formation de ces
structures. Le rôle de SctA dans les cellules reste toutefois à déterminer et il pourrait
être d’importance. En effet, toutes les tentatives pour générer un mutant par
inactivation du gène sctA furent infructueuses jusqu’à présent (résultats non
montrés), ce qui pourrait signifier que la protéine est essentielle à la survie des
cellules. Par contre, une trop grande quantité de SctA intracellulaire semble toxique
pour les amibes puisque les essais de surexpression de la protéine ont été tout
aussi vains (résultats non montrés). La fine régulation de la production de SctA
paraît donc indispensable. Deux possibilités sont envisageables quant au rôle de
SctA : celle-ci pourrait agir de façon intracellulaire et l’excédent de protéines serait
alors impérativement sécrété à l’extérieur via les pycnosomes, ou alors la fonction
de SctA pourrait être accomplie lors de la sécrétion de la protéine dans le milieu
extracellulaire. Cependant, un doute subsiste quant à la nature des pycnosomes. En
effet, ces structures pourraient constituer des artéfacts issus des cellules cultivées
en milieu axénique, car ces souches d’amibes sont en réalité des mutants
sélectionnés pour leur capacité à croître en milieu liquide et à se nourrir par
macropinocytose. Les amibes d’origine environnementale, quant à elles, se
nourrissent de bactéries par phagocytose et la production de pycnosomes n’a pas
65
été investiguée chez ces souches. Ainsi, sans la formation de pycnosomes, les CML
constitueraient alors le véhicule principal pour la sécrétion de SctA.
4. 1 Rôles possibles des CML
Grâce aux tests de phagocytose de billes enrobées présentés au chapitre 3, il a été
déterminé que les amibes pouvaient réinternaliser leurs propres CML. Plus encore,
un autre protozoaire, le cilié T. pyriformis, était également en mesure de phagocyter
ces structures, mais aucune dégradation ou digestion des CML n’a été observée à
l’intérieur des cellules. Au contraire, les CML étaient compactés les uns sur les
autres à l’intérieur des vacuoles alimentaires pour être finalement évacués sous la
forme de corps fécaux denses. Les CML ne semblent donc pas être digestibles pour
T. pyriformis, mais cela reste à vérifier dans le cas de D. discoideum. Plusieurs
questions subsistent également, à savoir si les CML pourraient influencer le
comportement cellulaire et, dans l’affirmative, de quelle manière. À ce sujet,
plusieurs hypothèses sont envisageables et détaillées ci-dessous.
4.1.1 Communication intercellulaire
Une première possibilité est que les CML pourraient porter une molécule signal
capable d’induire un comportement cellulaire en réaction à une situation particulière,
dans ce cas-ci la phagocytose de bactéries digestibles. Ainsi, la sécrétion de CML
dans le milieu pourrait coordonner des réactions dans l’ensemble de la population
d’amibes. La candidate idéale au rôle de molécule signal serait la protéine PhoPQ
qui, comme mentionné précédemment, est hautement similaire à certaines protéines
régulatrices telles que AprA. Une fois les CML sécrétés par les amibes, la protéine
PhoPQ pourrait dégager un signal dans le milieu auquel les cellules environnantes
réagiraient. D’un autre côté, sachant que les amibes phagocytent leurs CML, il est
également plausible qu’un signal intracellulaire soit déclenché uniquement lors de la
réinternalisation. Un aspect intéressant à vérifier serait l’influence chimiotactique des
CML. En effet, les amibes D. discoideum sont connues pour réagir de concert et
communiquer par l’intermédiaire de gradients chimiotactiques, par exemple les
gradients d’AMPc au cours du développement multicellulaire (Kessin, 2001). La
réinternalisation des CML est-elle le résultat d’une attraction chimiotactique ou
66
simplement un processus «passif» au même titre que la phagocytose de billes? Par
ailleurs, une molécule chimioattractante présente sur les CML pourrait également
viser d’autres fins que la réinternalisation, par exemple avertir les individus de la
population de la présence de bactéries digestibles. Chez des amibes cultivées en
présence de Klebsiella pneumoniae, l’ARNm de PhoPQ est exprimé fortement
quatre heures après l’épuisement de la nourriture puis la production chute
brutalement avant d’atteindre huit heures (Parikh et al., 2010; Rot et al., 2009), cet
intervalle de temps correspondant à la phase d’agrégation des cellules au stade
multicellulaire (Kessin, 2001). Ainsi, peut-être la protéine PhoPQ portée par les CML
joue-t-elle un rôle au cours du développement multicellulaire. Enfin, on ne peut pas
exclure l’hypothèse que PhoPQ agisse, positivement ou négativement, sur la
prolifération cellulaire comme son analogue AprA. Par exemple, une grande quantité
de CML sécrétés, et donc de PhoPQ extracellulaire, pourrait indiquer aux cellules de
réduire leur rythme de division alors que les sources de nourriture (c’est-à-dire les
bactéries digestibles) s’épuisent.
4.1.2 Cargo
Il a été suggéré dans la littérature que les CML puissent servir de cargo pour
transporter des protéines à l’extérieur où elles accompliraient leur fonction
(Barondes et al., 1985). C’est le cas de la Discoidine I qui, étant impliquée dans
l’adhésion au substrat et la migration ordonnée des cellules au cours du stade
multicellulaire (Springer et al., 1984), serait livrée jusqu’à la matrice extracellulaire
via les CML. Le même principe a été envisagé concernant les corps lamellaires
produits par les pneumocytes humains de type II qui permettraient d’acheminer les
protéines de surfactant pulmonaire vers l’épithélium alvéolaire (Schmitz et Muller,
1991). Dans le même ordre d’idées, les CML de D. discoideum pourraient avoir pour
fonction de véhiculer des concentrations élevées d’enzymes ayant des fonctions
hydrolytiques vers l’extérieur afin de s’attaquer à des biofilms bactériens
particulièrement coriaces. La protéine CDD, qui possède un domaine de liaison aux
sucres
habituellement
retrouvé
chez
les
cellulases
et
une
région
cytidine/déoxycytidylate déaminase, pourrait constituer l’une de ces enzymes. De
plus, la présence d’un peptide signal dans la séquence protéique de la CDD suggère
que sa fonction principale serait extracellulaire.
67
4.1.3 Source de nutriments
Les CML étant phagocytés par les amibes et le cilié T. pyriformis, il n’est pas
invraisemblable que ces structures constituent des éléments nutritifs pour les
protozoaires. En fait, il pourrait s’agir de réserves de nutriments, principalement de
nature lipidique, emmagasinées par les cellules en présence d’une grande quantité
de nourriture. Ces accumulations de nutriments seraient alors sécrétées dans le
milieu en vue d’une utilisation éventuelle. Les amibes cultivées de façon axénique,
sans bactéries à leur disposition pour fabriquer ces réserves, seraient alors portées
à phagocyter les CML qui leur sont présentés plutôt que le milieu de culture liquide.
Les CML pourraient alors permettre l’échange de lipides entre des amibes nourries
avec des bactéries et d’autres n’ayant pas eu cette chance. Les membranes des
CML, principalement composées de phospholipides et de lipides neutres comme les
stérols (Paquet et al., 2013), seraient dégradées par la cellule afin de réutiliser ces
molécules. Cette théorie de transfert de composants lipidiques a aussi été proposée
dans le cas des macrophages humains qui s’échangeraient le cholestérol contenu
dans leurs corps lamellaires (Schmitz et Muller, 1991). Un moyen pour investiguer
cette hypothèse serait de visualiser en MET des amibes ayant phagocyté des CML
contenant des billes de polystyrène. Cela permettrait éventuellement de déterminer
si l’enrobage autour des billes internalisées a été dégradé, car de nature nutritive, ou
alors si les billes enrobées sont tout simplement expulsées, avec ou sans l’ajout
d’une nouvelle couche lipidique.
Toutefois, si les CML contiennent réellement des éléments nutritifs, leur abondance
ne prévient pas une population amibienne d’entreprendre le développement
multicellulaire lorsque toutes les bactéries digestibles du milieu ont été
consommées. En effet, les co-cultures de D. discoideum et de K. aerogenes utilisées
pour le protocole de production massive de CML permettaient la formation de
nombreux corps fructifères malgré l’évidente profusion de CML sécrétés. Ainsi, il est
possible que les CML ne servent pas à la consommation immédiate et qu’ils soient
incorporés aux corps fructifères comme réserves, un peu à la manière des bactéries
digestibles amenées dans les boules de spores des amibes «fermières» (Brock et
al., 2011). De nombreuses souches de D. discoideum limitent leur consommation de
bactéries afin d’en conserver une partie qui est acheminée jusqu’aux corps
fructifères et dispersée en même temps que les spores amibiennes. De cette façon,
68
les spores ayant abouti dans un milieu pauvre en nourriture bénéficient de leurs
propres réserves de bactéries qui ont voyagé avec elles. Le même principe pourrait
donc s’appliquer aux CML. Enfin, il n’est pas à exclure que les CML constituent des
réserves nutritives non pas pour les protozoaires, mais bien pour les bactéries
«d’élevage» entraînées dans les corps fructifères. Ces bactéries pourraient alors
dégrader les CML pour leur subsistance au moyen de lipases, jusqu’à leur propre
consommation par les amibes «fermières».
4.1.4 Déchets métaboliques
Un argument en défaveur de l’hypothèse présentant les CML comme une source de
nutriments est qu’il a été déterminé dans la présente étude que le cilié T. pyriformis
ne digérait pas ces structures après leur phagocytose. Au contraire, les CML
n’étaient que compressés les uns sur les autres pour permettre leur évacuation
comme de simples déchets non digestibles, et il est possible que la situation soit
similaire chez D. discoideum. Ainsi, comme il a été proposé dans la littérature
(Gezelius, 1959; Hohl, 1965; Mercer et Shaffer, 1960), les CML pourraient constituer
des déchets cellulaires expulsés par les amibes et leur réinternalisation serait plutôt
accidentelle. Par contre, sachant que les lipides contenus dans les CML proviennent
du protozoaire et non des bactéries ingérées (Paquet et al., 2013), le coût
énergétique pour produire une telle quantité de membranes est non négligeable pour
la cellule. Une dépense énergétique de cette ampleur pour pratiquement rien est
donc difficilement imaginable. En effet, on peut envisager que l’évolution aurait
favorisé l’utilisation de ce système d’éjection de déchets à d’autres fins, par exemple
pour transporter des protéines vers l’extérieur de la cellule.
4.1.5 Influence écologique sur d’autres micro-organismes
Enfin, il ne faut pas exclure la possibilité que les CML n’aient pas véritablement de
fonction autre que la sécrétion de déchets métaboliques pour les amibes, mais qu’ils
influenceraient le comportement de certains micro-organismes cohabitant dans le
même environnement. Par exemple, ils pourraient contenir une molécule signal qui
inhiberait la croissance d’autres protozoaires à des fins de compétition ou alors qui
attirerait des proies bactériennes. Ce sont ces hypothèses qui ont motivé les
69
expériences mettant en présence les CML de D. discoideum avec l’autre espèce de
protozoaire totalement différente qu’est le cilié T. pyriformis. Pour l’instant, aucune
incidence notable des CML n’a été observée sur la croissance ou la prolifération des
ciliés. Toutefois, la détection de probables bactéries incluses dans les corps fécaux
produits en présence de CML (Figure 3.8) laisse entrevoir la possibilité d’une
interaction tripartite entre les ciliés, les CML et les bactéries. En effet, la bactérie K.
aerogenes étant normalement digestible pour T. pyriformis (Curds et Cockburn,
1968), il était étonnant de constater sa présence apparemment intacte à l’intérieur
des corps fécaux de T. pyriformis constitués des CML de D. discoideum. Cela
pourrait signifier que l’ingestion simultanée de bactéries et d’une grande quantité de
particules non digestibles comme les CML permet aux premières de résister à la
dégradation à l’intérieur du protozoaire. Ainsi, une surcharge de matériel ingéré par
le cilié limiterait sa capacité à digérer les proies bactériennes qui s’échapperaient
alors via les corps fécaux. Ce phénomène pourrait être d’importance dans certains
milieux eutrophes tels que les canalisations de diverses installations hydriques
artificielles où l’abondance de matière organique serait susceptible de bénéficier aux
bactéries phagocytées.
4.2 Conclusion et perspectives
Ce projet visait à obtenir des indications sur les mécanismes de formation et la
fonction biologique des CML chez l’amibe D. discoideum. Quatre protéines majeures
associées aux CML ont été identifiées, mais leur manque de caractérisation et
l’absence de fonctions connues ont limité les conclusions pouvant être tirées quant
au rôle des CML. Toutefois, la présence sur les CML de PhoPQ, une protéine
hautement similaire au répresseur de prolifération AprA, permet d’envisager que les
CML puissent porter une molécule signal affectant le comportement cellulaire des
amibes. De plus, il a été prouvé que ces dernières pouvaient réinternaliser leurs
propres CML, bien que le sort de ces structures à l’intérieur des amibes reste à être
résolu. Par contre, l’internalisation des CML par le cilié T. pyriformis a permis de
déterminer que ceux-ci n’étaient pas digérés par le protozoaire et qu’ils étaient
comprimés les uns sur les autres dans les vacuoles alimentaires pour être
finalement expulsés sous la forme de corps fécaux. En somme, plusieurs possibilités
subsistent quant au rôle des CML chez l’amibe – méthode de communication
70
intercellulaire, cargo, source de nutriments ou simples déchets métaboliques – et
des investigations plus poussées sont nécessaires pour élucider la question.
Les perspectives de ce projet incluent de nombreuses avenues. Premièrement, il
serait pertinent de vérifier si les CML exercent un effet chimiotactique sur les amibes
et si la croissance des ciliés est perturbée ou augmentée en présence de CML. De
plus, le destin de l’enrobage autour des billes enrobées internalisées par les amibes
devra être déterminé, possiblement par des analyses en MET. Par ailleurs, les
gènes des quatre protéines identifiées sur les CML pourront être clonés en phase
avec la GFP afin de créer des marqueurs permettant de visualiser le processus de
formation des CML en microscopie à fluorescence. L’utilisation de billes de
polystyrène fluorescentes et de marqueurs lipidiques pourrait complémenter ces
analyses. La surexpression et l’inactivation de ces gènes d’intérêt, plus
particulièrement celui de PhoPQ, seraient également utiles pour élucider les
fonctions des protéines associées aux CML.
Éventuellement, il serait intéressant d’analyser le contenu protéique des CML ou des
corps fécaux produits par d’autres types de protozoaires, par exemple l’amibe
Acanthamoeba ou le cilié Tetrahymena. Ainsi, la détection de protéines analogues à
celles retrouvées sur les CML de D. discoideum permettrait d’entrevoir une tendance
parmi les éléments nécessaires à la formation ou la fonction de ces structures.
Idéalement, l’identification d’une protéine présente sur tous les CML ou corps fécaux
sécrétés par les protozoaires procurerait un marqueur universel de CML.
Enfin, ces indicateurs de CML serviront ultimement à analyser la présence et
l’importance de ces structures sur le terrain, notamment dans les installations
hydriques à risque de promouvoir le phénomène de l’enrobage de bactéries. Une
meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inclusion des bactéries à
l’intérieur des CML contribuera à élaborer des stratégies afin de contrôler ou
diminuer ce phénomène et ainsi limiter la propagation de bactéries pathogènes dans
l’environnement.
71
Bibliographie
Abu Kwaik, Y., Gao, L.Y., Stone, B.J., Venkataraman, C., and Harb, O.S. (1998).
Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial
ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol 64, 3127-3133.
Adiba, S., Nizak, C., van Baalen, M., Denamur, E., and Depaulis, F. (2010). From
grazing resistance to pathogenesis: the coincidental evolution of virulence
factors. PLoS One 5, e11882.
Adl, S.M., Simpson, A.G., Farmer, M.A., Andersen, R.A., Anderson, O.R., Barta,
J.R., Bowser, S.S., Brugerolle, G., Fensome, R.A., Fredericq, S., et al. (2005).
The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the
taxonomy of protists. J Eukaryot Microbiol 52, 399-451.
Allen, R.D., and Wolf, R.W. (1979). Membrane recycling at the cytoproct of
Tetrahymena. J Cell Sci 35, 217-227.
Aubry, L., Klein, G., Martiel, J.L., and Satre, M. (1993). Kinetics of endosomal pH
evolution in Dictyostelium discoideum amoebae. Study by fluorescence
spectroscopy. J Cell Sci 105 ( Pt 3), 861-866.
Bamforth, S.S. (1985). The role of protozoa in litters and soils. J. Protozool. 32, 404409.
Barker, J., and Brown, M.R. (1994). Trojan horses of the microbial world: protozoa
and the survival of bacterial pathogens in the environment. Microbiology 140 (
Pt 6), 1253-1259.
Barondes, S.H., Haywood-Reid, P.L., and Cooper, D.N. (1985). Discoidin I, an
endogenous lectin, is externalized from Dictyostelium discoideum in
multilamellar bodies. J Cell Biol 100, 1825-1833.
Berdal, B.P., Mehl, R., Meidell, N.K., Lorentzen-Styr, A.M., and Scheel, O. (1996).
Field investigations of tularemia in Norway. FEMS immunology and medical
microbiology 13, 191-195.
Berk, S.G., Faulkner, G., Garduno, E., Joy, M.C., Ortiz-Jimenez, M.A., and Garduno,
R.A. (2008). Packaging of live Legionella pneumophila into pellets expelled by
Tetrahymena spp. does not require bacterial replication and depends on a
dot/Icm-mediated survival mechanism. Appl Environ Microb 74, 2187-2199.
Berk, S.G., Ting, R.S., Turner, G.W., and Ashburn, R.J. (1998). Production of
respirable vesicles containing live Legionella pneumophila cells by two
Acanthamoeba spp. Appl Environ Microbiol 64, 279-286.
Bonifait, L., Charette, S.J., Filion, G., Gottschalk, M., and Grenier, D. (2011).
Amoeba host model for evaluation of Streptococcus suis virulence. Appl
Environ Microbiol 77, 6271-6273.
Bozue, J.A., and Johnson, W. (1996). Interaction of Legionella pneumophila with
Acanthamoeba castellanii: uptake by coiling phagocytosis and inhibition of
phagosome-lysosome fusion. Infect Immun 64, 668-673.
Bozzaro, S., Bucci, C., and Steinert, M. (2008). Phagocytosis and host-pathogen
interactions in Dictyostelium with a look at macrophages. International review
of cell and molecular biology 271, 253-300.
Bozzaro, S., and Eichinger, L. (2011). The professional phagocyte Dictyostelium
discoideum as a model host for bacterial pathogens. Curr Drug Targets 12,
942-954.
73
Brandl, M.T., Rosenthal, B.M., Haxo, A.F., and Berk, S.G. (2005). Enhanced survival
of Salmonella enterica in vesicles released by a soilborne Tetrahymena
species. Appl Environ Microbiol 71, 1562-1569.
Brock, D.A., Douglas, T.E., Queller, D.C., and Strassmann, J.E. (2011). Primitive
agriculture in a social amoeba. Nature 469, 393-396.
Brock, D.A., and Gomer, R.H. (2005). A secreted factor represses cell proliferation in
Dictyostelium. Development 132, 4553-4562.
Brown, R.C., Bass, H., and Coombs, J.P. (1975). Carbohydrate binding proteins
involved in phagocytosis by Acanthamoeba. Nature 254, 434-435.
Buck, K., Bolt, P., and Garrison, D. (1990). Phagotrophy and fecal pellet production
by an athecate dinoflagellate in Antarctic sea ice. Mar. Ecol. Prog. Ser. 60, 7584.
Buck, K., Marin, R., and Chavez, F. (2005). Heterotrophic dinoflagellate fecal pellet
production: grazing of large, chain-forming diatoms during upwelling events in
Monterey Bay, California. Aquat. Microb. Ecol. 40, 293-298.
Bush, J., Nolta, K., Rodriguez-Paris, J., Kaufmann, N., O'Halloran, T., Ruscetti, T.,
Temesvari, L., Steck, T., and Cardelli, J. (1994). A Rab4-like GTPase in
Dictyostelium discoideum colocalizes with V-H(+)-ATPases in reticular
membranes of the contractile vacuole complex and in lysosomes. J Cell Sci
107 ( Pt 10), 2801-2812.
Cardelli, J. (2001). Phagocytosis and macropinocytosis in Dictyostelium:
phosphoinositide-based processes, biochemically distinct. Traffic 2, 311-320.
Cervero-Arago, S., Sommer, R., and Araujo, R.M. (2014). Effect of UV irradiation
(253.7 nm) on free Legionella and Legionella associated with its amoebae
hosts. Water research 67, 299-309.
Charette, S.J., Cornillon, S., and Cosson, P. (2006a). Identification of low frequency
knockout mutants in Dictyostelium discoideum created by single or double
homologous recombination. J Biotechnol 122, 1-4.
Charette, S.J., Mercanti, V., Letourneur, F., Bennett, N., and Cosson, P. (2006b). A
role for adaptor protein-3 complex in the organization of the endocytic pathway
in Dictyostelium. Traffic 7, 1528-1538.
Chekabab, S.M., Daigle, F., Charette, S.J., Dozois, C.M., and Harel, J. (2012).
Survival of enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence of
Acanthamoeba castellanii and its dependence on Pho regulon.
MicrobiologyOpen 1, 427-437.
Cirillo, J.D., Falkow, S., Tompkins, L.S., and Bermudez, L.E. (1997). Interaction of
Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infect
Immun 65, 3759-3767.
Clarke, M. (2010). Recent insights into host–pathogen interactions from
Dictyostelium. Cell Microbiol. 12, 283-291.
Clarke, M., Kohler, J., Arana, Q., Liu, T., Heuser, J., and Gerisch, G. (2002).
Dynamics of the vacuolar H(+)-ATPase in the contractile vacuole complex and
the endosomal pathway of Dictyostelium cells. J Cell Sci 115, 2893-2905.
Cooper, D.N., and Barondes, S.H. (1984). Colocalization of discoidin-binding ligands
with discoidin in developing Dictyostelium discoideum. Developmental biology
105, 59-70.
Cooper, D.N.W., Haywood-Reid, P.L., Springer, W.R., and Barondes, S.H. (1986).
Bacterial glycoconjugates are natural ligands for the carbohydrate binding site
of discoidin I and influence its cellular compartmentalization. Developmental
biology 114, 416-425.
74
Cornillon, S., Pech, E., Benghezal, M., Ravanel, K., Gaynor, E., Letourneur, F.,
Bruckert, F., and Cosson, P. (2000). Phg1p is a nine-transmembrane protein
superfamily member involved in Dictyostelium adhesion and phagocytosis. J
Biol Chem 275, 34287-34292.
Cosson, P., and Soldati, T. (2008). Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria.
Curr Opin Microbiol 11, 271-276.
Curds, C.R., and Cockburn, A. (1968). Studies on the growth and feeding of
Tetrahymena pyriformis in axenic and monoxenic culture. Journal of general
microbiology 54, 343-358.
Dallaire-Dufresne, S., Paquet, V.E., and Charette, S.J. (2011). [Dictyostelium
discoideum: a model for the study of bacterial virulence]. Can J Microbiol 57,
699-707.
Denoncourt, A.M., Paquet, V.E., and Charette, S.J. (2014). Potential role of bacteria
packaging by protozoa in the persistence and transmission of pathogenic
bacteria. Frontiers in microbiology 5, 240.
Eichinger, L., Pachebat, J.A., Glockner, G., Rajandream, M.A., Sucgang, R.,
Berriman, M., Song, J., Olsen, R., Szafranski, K., Xu, Q., et al. (2005). The
genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum. Nature 435, 43-57.
Eisen, J.A., Coyne, R.S., Wu, M., Wu, D., Thiagarajan, M., Wortman, J.R., Badger,
J.H., Ren, Q., Amedeo, P., Jones, K.M., et al. (2006). Macronuclear genome
sequence of the ciliate Tetrahymena thermophila, a model eukaryote. PLoS
biology 4, e286.
Ekelund, F., and Ronn, R. (1994). Notes on protozoa in agricultural soil with
emphasis on heterotrophic flagellates and naked amoebae and their ecology.
FEMS Microbiol Rev 15, 321-353.
Elias, J.E., Haas, W., Faherty, B.K., and Gygi, S.P. (2005). Comparative evaluation
of mass spectrometry platforms used in large-scale proteomics investigations.
Nature methods 2, 667-675.
Emslie, K.R., Birch, D., Champion, A.C., and Williams, K.L. (1998). Localisation of
glycoproteins containing type 3 O-linked glycosylation to multilamellar bodies in
Dictyostelium discoideum. Eur J Protistol 34, 321-328.
Fenchel, T. (1987). Ecology of protozoa: the biology of free-living phagotrophic
protists, Science Tech. Publishers edn.
Fields, B.S. (1996). The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol 4, 286290.
Finn, R.D., Coggill, P., Eberhardt, R.Y., Eddy, S.R., Mistry, J., Mitchell, A.L., Potter,
S.C., Punta, M., Qureshi, M., Sangrador-Vegas, A., et al. (2016). The Pfam
protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids
Res 44, D279-285.
Finsel, I., and Hilbi, H. (2015). Formation of a pathogen vacuole according to
Legionella pneumophila: how to kill one bird with many stones. Cell Microbiol
17, 935-950.
Fok, A.K., Clarke, M., Ma, L., and Allen, R.D. (1993). Vacuolar H(+)-ATPase of
Dictyostelium discoideum. A monoclonal antibody study. J Cell Sci 106 ( Pt 4),
1103-1113.
Froquet, R., Lelong, E., Marchetti, A., and Cosson, P. (2009). Dictyostelium
discoideum: a model host to measure bacterial virulence. Nature protocols 4,
25-30.
Fukuzawa, M., and Ochiai, H. (1993). Different subcellular localizations of discoidin I
monomer and tetramer in Dictyostelium discoideum cells: using conformationspecific monoclonal antibodies. Experimental cell research 204, 61-72.
75
Gezelius, K. (1959). The ultrastructure of cells and cellulose membranes in Acrasiae.
Experimental cell research 18, 425-453.
Gezelius, K. (1961). Further studies in the ultrastructure of Acrasiae. Experimental
cell research 23, 300-310.
Goerke, J. (1974). Lung surfactant. Biochim Biophys Acta 344, 241-261.
Gorovsky, M.A., Yao, M.C., Keevert, J.B., and Pleger, G.L. (1975). Isolation of microand macronuclei of Tetrahymena pyriformis. Methods in cell biology 9, 311327.
Gourabathini, P., Brandl, M.T., Redding, K.S., Gunderson, J.H., and Berk, S.G.
(2008). Interactions between food-borne pathogens and protozoa isolated from
lettuce and spinach. Appl Environ Microbiol 74, 2518-2525.
Greub, G., and Raoult, D. (2003). History of the ADP/ATP-translocase-encoding
gene, a parasitism gene transferred from a Chlamydiales ancestor to plants 1
billion years ago. Appl Environ Microbiol 69, 5530-5535.
Greub, G., and Raoult, D. (2004). Microorganisms resistant to free-living amoebae.
Clin Microbiol Rev 17, 413-433.
Griffiths, B.S., Bonkowski, M., Dobson, G., and Caul, S. (1999). Changes in soil
microbial community structure in the presence of microbial-feeding nematodes
and protozoa. Pedobiologia 43, 297-304.
Groisman, E.A. (2001). The pleiotropic two-component regulatory system PhoPPhoQ. J Bacteriol 183, 1835-1842.
Gupta, R., Jung, E., Gooley, A.A., Williams, K.L., Brunak, S., and Hansen, J. (1999).
Scanning the available Dictyostelium discoideum proteome for O-linked
GlcNAc glycosylation sites using neural networks. Glycobiology 9, 1009-1022.
Gustafson, G.L., and Thon, L.A. (1979). Purification and characterization of a
proteinase from Dictyostelium discoideum. J Biol Chem 254, 12471-12478.
Hacker, U., Albrecht, R., and Maniak, M. (1997). Fluid-phase uptake by
macropinocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci 110 ( Pt 2), 105-112.
Hagedorn, M., Rohde, K.H., Russell, D.G., and Soldati, T. (2009). Infection by
tubercular mycobacteria is spread by nonlytic ejection from their amoeba hosts.
Science 323, 1729-1733.
Hitt, A.L., Hartwig, J.H., and Luna, E.J. (1994a). Ponticulin is the major high affinity
link between the plasma membrane and the cortical actin network in
Dictyostelium. J Cell Biol 126, 1433-1444.
Hitt, A.L., Lu, T.H., and Luna, E.J. (1994b). Ponticulin is an atypical membrane
protein. J Cell Biol 126, 1421-1431.
Hohl, H.R. (1965). Nature and development of membrane systems in food vacuoles
of cellular slime molds predatory upon bacteria. J Bacteriol 90, 755-765.
Horwitz, M.A. (1983). Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease
bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J Exp Med 158,
1319-1331.
Huber, R.J., and O'Day, D.H. (2015). Proteomic profiling of the extracellular matrix
(slime sheath) of Dictyostelium discoideum. Proteomics 15, 3315-3319.
Kessin, R.H. (2001). Dictyostelium: Evolution, cell biology, and the development of
multicellularity, Cambridge University Press edn.
King, C.H., Shotts, E.B., Jr., Wooley, R.E., and Porter, K.G. (1988). Survival of
coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl
Environ Microbiol 54, 3023-3033.
Koubar, M., Rodier, M.H., Garduno, R.A., and Frere, J. (2011). Passage through
Tetrahymena tropicalis enhances the resistance to stress and the infectivity of
Legionella pneumophila. FEMS Microbiol Lett 325, 10-15.
76
Krishna-Prasad, B.N., and Gupta, S. K. . (1978). Preliminary report on engulfment
and retention of mycobacteria by trophozoites of axenically grown
Acanthamoeba castellanii Douglas. Curr. Sci. 47, 245-247.
Kuspa, A., Dingermann, T., and Nellen, W. (1995). Analysis of gene function in
Dictyostelium. Experientia 51, 1116-1123.
La Scola, B., and Raoult, D. (1999). Afipia felis in hospital water supply in association
with free-living amoebae. Lancet 353, 1330.
Lainhart, W., Stolfa, G., and Koudelka, G.B. (2009). Shiga toxin as a bacterial
defense against a eukaryotic predator, Tetrahymena thermophila. J Bacteriol
191, 5116-5122.
Levi, S., Polyakov, M., and Egelhoff, T.T. (2000). Green fluorescent protein and
epitope tag fusion vectors for Dictyostelium discoideum. Plasmid 44, 231-238.
Ly, T.M.C., and Muller, H.E. (1990). Ingested Listeria monocytogenes survive and
multiply inprotozoa. J Med Microbiol 33, 51-54.
Maniak, M., Rauchenberger, R., Albrecht, R., Murphy, J., and Gerisch, G. (1995).
Coronin involved in phagocytosis: dynamics of particle-induced relocalization
visualized by a green fluorescent protein Tag. Cell 83, 915-924.
Manstein, D.J., Schuster, H.P., Morandini, P., and Hunt, D.M. (1995). Cloning
vectors for the production of proteins in Dictyostelium discoideum. Gene 162,
129-134.
Marchetti, A., Mercanti, V., Cornillon, S., Alibaud, L., Charette, S.J., and Cosson, P.
(2004). Formation of multivesicular endosomes in Dictyostelium. J Cell Sci 117,
6053-6059.
Marciano-Cabral, F., and Cabral, G. (2003). Acanthamoeba spp. as agents of
disease in humans. Clinical Microbiology Reviews 16, 273-307.
Matz, C., and Kjelleberg, S. (2005). Off the hook--how bacteria survive protozoan
grazing. Trends Microbiol 13, 302-307.
Mehta, D.P., Etchison, J.R., and Freeze, H.H. (1995). Characterization, subcellular
localization, and developmental regulation of a cysteine proteinase from
Dictyostelium discoideum. Archives of biochemistry and biophysics 321, 191198.
Mehta, D.P., Ichikawa, M., Salimath, P.V., Etchison, J.R., Haak, R., Manzi, A., and
Freeze, H.H. (1996). A lysosomal cysteine proteinase from Dictyostelium
discoideum contains N-acetylglucosamine-1-phosphate bound to serine but not
mannose-6-phosphate on N-linked oligosaccharides. J Biol Chem 271, 1089710903.
Mellman, I. (1996). Endocytosis and molecular sorting. Annual review of cell and
developmental biology 12, 575-625.
Mercanti, V., Charette, S.J., Bennett, N., Ryckewaert, J.J., Letourneur, F., and
Cosson, P. (2006). Selective membrane exclusion in phagocytic and
macropinocytic cups. J Cell Sci 119, 4079-4087.
Mercer, E.H., and Shaffer, B.M. (1960). Electron microscopy of solitary and
aggregated slime mould cells. The Journal of biophysical and biochemical
cytology 7, 353-356.
Molloy, M.P., Herbert, B.R., Walsh, B.J., Tyler, M.I., Traini, M., Sanchez, J.C.,
Hochstrasser, D.F., Williams, K.L., and Gooley, A.A. (1998). Extraction of
membrane proteins by differential solubilization for separation using twodimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 19, 837-844.
Monsieurs, P., De Keersmaecker, S., Navarre, W.W., Bader, M.W., De Smet, F.,
McClelland, M., Fang, F.C., De Moor, B., Vanderleyden, J., and Marchal, K.
77
(2005). Comparison of the PhoPQ regulon in Escherichia coli and Salmonella
typhimurium. J Mol Evol 60, 462-474.
Murga, R., Forster, T.S., Brown, E., Pruckler, J.M., Fields, B.S., and Donlan, R.M.
(2001). Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model
potable-water system. Microbiology 147, 3121-3126.
Nguyen, T.M., Ilef, D., Jarraud, S., Rouil, L., Campese, C., Che, D., Haeghebaert, S.,
Ganiayre, F., Marcel, F., Etienne, J., et al. (2006). A community-wide outbreak
of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can
contaminated aerosols spread? J Infect Dis 193, 102-111.
Nolta, K.V., Rodriguez-Paris, J.M., and Steck, T.L. (1994). Analysis of successive
endocytic compartments isolated from Dictyostelium discoideum by magnetic
fractionation. Biochim Biophys Acta 1224, 237-246.
North, M.J., and Cotter, D.A. (1991). Regulation of cysteine proteinases during
different pathways of differentiation in cellular slime molds. Developmental
genetics 12, 154-162.
Nygard, K., Werner-Johansen, O., Ronsen, S., Caugant, D.A., Simonsen, O.,
Kanestrom, A., Ask, E., Ringstad, J., Odegard, R., Jensen, T., et al. (2008). An
outbreak of legionnaires disease caused by long-distance spread from an
industrial air scrubber in Sarpsborg, Norway. Clinical infectious diseases : an
official publication of the Infectious Diseases Society of America 46, 61-69.
Ord, T., Adessi, C., Wang, L., and Freeze, H.H. (1997). The cysteine proteinase
gene cprG in Dictyostelium discoideum has a serine-rich domain that contains
GlcNAc-1-P. Archives of biochemistry and biophysics 339, 64-72.
Orias, E., Hamilton, E. P., and Orias, J. D. (2000). Tetrahymena as a laboratory
organism: Useful strains, cell culture, and cell line maintenance. Methods Cell
Biol. 62, 189-211.
Osen, O.M., Rosen, S.M., and Horecker, B.L. (1965). Fate of the cell wall of
Salmonella typhimurium upon ingestion by the cellular slime mold:
Polysphondylium pallidum. Biochem Biophys Res Commun 18, 270-276.
Padh, H., Ha, J., Lavasa, M., and Steck, T.L. (1993). A post-lysosomal compartment
in Dictyostelium discoideum. J Biol Chem 268, 6742-6747.
Padh, H., Lavasa, M., and Steck, T.L. (1991). Endosomes are acidified by
association with discrete proton-pumping vacuoles in Dictyostelium. J Biol
Chem 266, 5514-5520.
Paquet, V.E., and Charette, S.J. (2016). Amoeba-resisting bacteria found in
multilamellar bodies secreted by Dictyostelium discoideum: social amoebae
can also package bacteria. FEMS Microbiol Ecol 92.
Paquet, V.E., Lessire, R., Domergue, F., Fouillen, L., Filion, G., Sedighi, A., and
Charette, S.J. (2013). Lipid composition of multilamellar bodies secreted by
Dictyostelium discoideum reveals their amoebal origin. Eukaryot Cell 12, 13261334.
Parikh, A., Miranda, E.R., Katoh-Kurasawa, M., Fuller, D., Rot, G., Zagar, L., Curk,
T., Sucgang, R., Chen, R., Zupan, B., et al. (2010). Conserved developmental
transcriptomes in evolutionarily divergent species. Genome Biol 11, R35.
Petrak, J., Ivanek, R., Toman, O., Cmejla, R., Cmejlova, J., Vyoral, D., Zivny, J., and
Vulpe, C.D. (2008). Deja vu in proteomics. A hit parade of repeatedly identified
differentially expressed proteins. Proteomics 8, 1744-1749.
Phillips, J.E., and Gomer, R.H. (2012). A secreted protein is an endogenous
chemorepellant in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A 109,
10990-10995.
78
Prashar, A., and Terebiznik, M.R. (2015). Legionella pneumophila: homeward bound
away from the phagosome. Curr Opin Microbiol 23, 86-93.
Rabilloud, T. (1998). Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins
in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 19, 758-760.
Rabilloud, T. (1999). Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis. An outline.
Methods in molecular biology 112, 9-19.
Raghu Nadhanan, R., and Thomas, C.J. (2014). Colpoda secrete viable Listeria
monocytogenes within faecal pellets. Environ Microbiol 16, 396-404.
Rauchenberger, R., Hacker, U., Murphy, J., Niewohner, J., and Maniak, M. (1997).
Coronin and vacuolin identify consecutive stages of a late, actin-coated
endocytic compartment in Dictyostelium. Curr Biol 7, 215-218.
Ravanel, K., de Chassey, B., Cornillon, S., Benghezal, M., Zulianello, L., Gebbie, L.,
Letourneur, F., and Cosson, P. (2001). Membrane sorting in the endocytic and
phagocytic pathway of Dictyostelium discoideum. Eur J Cell Biol 80, 754-764.
Ronn, R., McCaig, A.E., Griffiths, B.S., and Prosser, J.I. (2002). Impact of protozoan
grazing on bacterial community structure in soil microcosms. Appl Environ
Microbiol 68, 6094-6105.
Rosen, S.D., Kafka, J.A., Simpson, D.L., and Barondes, S.H. (1973).
Developmentally regulated, carbohydrate-binding protein in Dictyostelium
discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A 70, 2554-2557.
Rot, G., Parikh, A., Curk, T., Kuspa, A., Shaulsky, G., and Zupan, B. (2009).
dictyExpress: a Dictyostelium discoideum gene expression database with an
explorative data analysis web-based interface. BMC Bioinformatics 10, 265.
Rowbotham, T.J. (1980). Preliminary report on the pathogenicity of Legionella
pneumophila for freshwater and soil amoebae. J Clin Pathol 33, 1179-1183.
Rowbotham, T.J. (1986). Current views on the relationships between amoebae,
legionellae and man. Israel journal of medical sciences 22, 678-689.
Sabra, A., Leiba, J., Mas, L., Louwagie, M., Couté, Y., Journet, A., Cosson, P., and
Aubry, L. (2016). Pycnosomes: condensed endosomal structures secreted by
Dictyostelium amoebae. Submitted to PLOS ONE. Manuscript number: PONED-16-05334.
Saeed, A., Abd, H., Edvinsson, B., and Sandstrom, G. (2009). Acanthamoeba
castellanii an environmental host for Shigella dysenteriae and Shigella sonnei.
Arch Microbiol 191, 83-88.
Sandstrom, G., Saeed, A., and Abd, H. (2011). Acanthamoeba-bacteria: a model to
study host interaction with human pathogens. Curr Drug Targets 12, 936-941.
Schmitz, G., and Muller, G. (1991). Structure and function of lamellar bodies, lipidprotein complexes involved in storage and secretion of cellular lipids. J Lipid
Res 32, 1539-1570.
Segal, G., and Shuman, H.A. (1999). Legionella pneumophila utilizes the same
genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages.
Infect Immun 67, 2117-2124.
Smith, C.D., Berk, S.G., Brandl, M.T., and Riley, L.W. (2012). Survival characteristics
of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during
passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol Ecol
82, 574-583.
Smith, E.W., Lima, W.C., Charette, S.J., and Cosson, P. (2010). Effect of starvation
on the endocytic pathway in Dictyostelium cells. Eukaryot Cell 9, 387-392.
Solomon, J.M., and Isberg, R.R. (2000). Growth of Legionella pneumophila in
Dictyostelium discoideum: a novel system for genetic analysis of host-pathogen
interactions. Trends Microbiol 8, 478-480.
79
Souza, G.M., Mehta, D.P., Lammertz, M., Rodriguez-Paris, J., Wu, R., Cardelli, J.A.,
and Freeze, H.H. (1997). Dictyostelium lysosomal proteins with different sugar
modifications sort to functionally distinct compartments. J Cell Sci 110 ( Pt 18),
2239-2248.
Springer, W.R., Cooper, D.N., and Barondes, S.H. (1984). Discoidin I is implicated in
cell-substratum attachment and ordered cell migration of Dictyostelium
discoideum and resembles fibronectin. Cell 39, 557-564.
Steinert, M. (2011). Pathogen-host interactions in Dictyostelium, Legionella,
Mycobacterium and other pathogens. Seminars in cell & developmental biology
22, 70-76.
Swanson, M.S., and Isberg, R.R. (1995). Association of Legionella pneumophila with
the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun 63, 3609-3620.
Temesvari, L.A., Rodriguez-Paris, J.M., Bush, J.M., Zhang, L., and Cardelli, J.A.
(1996). Involvement of the vacuolar proton-translocating ATPase in multiple
steps of the endo-lysosomal system and in the contractile vacuole system of
Dictyostelium discoideum. J Cell Sci 109 ( Pt 6), 1479-1495.
van Es, S., and Devreotes, P.N. (1999). Molecular basis of localized responses
during chemotaxis in amoebae and leukocytes. Cellular and molecular life
sciences : CMLS 55, 1341-1351.
Wang, P., Bouwman, F.G., and Mariman, E.C. (2009). Generally detected proteins in
comparative proteomics--a matter of cellular stress response? Proteomics 9,
2955-2966.
Wildschutte, H., Wolfe, D.M., Tamewitz, A., and Lawrence, J.G. (2004). Protozoan
predation, diversifying selection, and the evolution of antigenic diversity in
Salmonella. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 10644-10649.
Wuestehube, L.J., and Luna, E.J. (1987). F-actin binds to the cytoplasmic surface of
ponticulin, a 17-kD integral glycoprotein from Dictyostelium discoideum plasma
membranes. J Cell Biol 105, 1741-1751.
Yli-Pirila, T., Huttunen, K., Nevalainen, A., Seuri, M., and Hirvonen, M.R. (2007).
Effects of co-culture of amoebae with indoor microbes on their cytotoxic and
proinflammatory potential. Environmental toxicology 22, 357-367.
80