partie 2

Nombre de B mémoires différenciés in vitro en CS d'antiHBs en fonction des taux sériques d'anti-HBs
10000
1000
100
10
1
1
10
Anti-HBs
100
SCs/106
1000
lymphocytes B
Tuaillon et al. J Immunol Methods. 2007
Infection à EBV
• Virus ubiquitaire
• > 90% population mondiale
• Persistance à vie
• Contrôlé par le système immunitaire
Pathogenèse
• EBV infecte le LB naïf
• Il persiste dans les lymphocytes B mémoire circulants
(Souza et al. PNAS 2005).
• Représente un réservoir de 1 à 50 cellules B mémoire
infectées /106 lymphocytes B circulants (Khan et al.
Immunity 1996).
• Dans la MNI, 50% LB mémoire infectés (Souza et al. J.
Immunol. 2007).
• Induction de la phase lytique après différenciation des
cellules B mémoire en plasmablastes (Laichalk et al. J.
Virol. 2005).
Exploration
Unwanted
cells are
crosslinked to
red blood
cells
plasma
Cellules B enrichies
Ficoll-Hypaque
Ficoll-Hypaque
centrifugation
Globules rouges et
rosettes
CD40L-transfected
CDw32L
cells
CD40L
J7
CD40
+ IL-2 + IL-10
Énumération des cellules
sécrétrices d’Ag EBV par ELISpot
Cellules B
mémoire
Quantification du génome EBV
dans les surnageants de culture
par PCR en temps réel
Cellules sécrétrices d’Ag EBV
J7
Un immunospot = une
empreinte cellulaire
Caractéristiques d’un spot :
- le diamètre
- la couleur
- la forme
- la saturation
- le contraste
- le gradient de diffusion
Determination of EBV-infected B cells producing EBV-antigens
B cell
subsets
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
mediane
25th
percentile
75th
percentile
7
ZEBRA-Ag-SCs/10 B cells
7
MA-Ag-SCs/10 B cells
7
EBV virions/10 B cells
200
190
480
130
60
80
80
150
50
70
70
20
20
40
10
10
12
20
21
10
20
10
83
80
80
17
14
17
70
10
960
150
20
18580
900
1300
53200
960
18580
2100
9360
40200
ND
ND
ND
500
ND
2100
E nume ra tion of E BV -infe cte d B ce ll subse ts producing E BV -a ntige ns
EBV healthy carriers
1
2
3
4
17
7
6
6
MA-Ag-SCs / 10 B cells
ND
ND
3
ND
EBV DNA copies/10 7 B cells*
ND
36
1940
ND
143
156
407
51
20
10
30
10
353
ND
23100
ND
B cell subsets
Splenic marginal zone B cell subset
ZEBRA-Ag-SCs / 10 B cells
Memory B cell subset
ZEBRA-Ag-SCs / 10 B cells
MA-Ag-SCs / 10 B cells
7
EBV DNA copies/10 B cells*
* EBV DNA copies were quantified in culture supernatants of each cell subsets.
Réservoir fonctionnel EBV
• Mise en évidence d’un réservoir EBV inductible
– < 50 × 10-6 cellules B initient la réplication virale
• Mise en évidence d’un réservoir EBV fonctionnel
– 15% de ces cellules produisent des virions
– < 4 × 10-6 cellules B produisent des particules virales
MNI
• Mise en évidence de cellules
– spontanément sécrétrices EBV ex vivo?
– Responsables de la charge virale plasmatique?
• Mise en place d’un réservoir EBV
– cellules B mémoire oui
– Latent et inductible oui
Mise en évidence de cellules
spontanément sécrétrices EBV ex vivo ?????
B mémoire réservoir EBV en constitution
t
Exploration de la Maladie
Résiduelle en Cancérologie
Cancer de la Prostate
Prostate
Technique
ELISPOT-PSA
NBT-BCIP
PSA
Ac2 anti-PSA
total
Ac1 anti-PSA
total
Lignée cellulaire LNCAP
500 cellules
 175 sfc
Sécrétion = 35%
29 ± 4,9%
0%
0%
27 ± 2,1%
Cellules CK+
Cellules PSA+
Cellules LNCaP
Cellules CK+
Cellules PSA+
Cellules PC3
LNCaP cells
(cells/well)
PSA-ELISPOT assaya
(spots /well)
PSA-immunometric assayb
(µg/L in supernatant)
LNCaP cells
PC-3 cells
LNCaP cells
PC-3 cells
100 000
/
0
1.29  0.17c
0
10 000
/
0
0.03  0.02
0
1 000
259.0  24.7
0
0
0
100
24.0  2.1
0
0
0
10
3.7  1.2
0
0
0
1
0.3  0.4
0
0
0
ELISPOT-PSA = 4 log plus sensible que le test ELISA !
122 Patients
- 48 patients “cancer de la prostate”:
* 24 localisés = LPCa (73,5 ans), avant et après PT
(T1-T3, M0)
* 24 métastatiques = MPCA (71,5 ans)
(T3, M1)
- 31 patients “pathologie bénigne de la prostate”
* 27 HBP (69 ans)
* 4 PA (60 ans)
- 35 patients “sans maladie prostatique” (67 ans)
- 8 donneurs sains (67 ans)
5-28 ml de sang
1 SCs
150 000 cells/puits
Patient avec cancer de la prostate
RESULTATS
Groupe LPCa
24 patients
PSA-SC
5 + (41.6%)
7
12 patients avant PT
(médiane 9.2 -172)
0+
12
12 patients après PT
(1-12 mois)
P = 0.04
PSA sérique
(ng/ml)
15 (4,5–20)
34 (22–5300)
(p = 0,001)
1,2 (0–5,5)
Groupe MPCa
PSA-SC
20 +
62 (14 – 167)
4
24 patients
(83,3%)
(médiane 29: 1 - 684)
20/24 vs 5/12
(MPCa)
(LPCa)
PSA sérique
(ng/ml)
P = 0,02
92,5 (0,3 – 8400)
Groupe HBP, PA, contrôles
PSA-SC
27 HBP
4 PA
27 NPD
8 contrôles
+
0 +
0 +
0 +
0
PSA sérique
(ng/ml)
5,3 (0,7 – 19,8)
10,4 (2 – 14,8)
6 (0,2 – 71)
<4
Spécificité = 100%
(IC 95% : 94,6 - 100)
Sensibilité = 69.4%
(IC 95% : 54,4 - 84,5)
Immunocytochimie
Cytokératine
PSA
MPCa
MPCa
Contrôle
CONCLUSION
Nouvelle application de la technique ELISPOT
Détection de cellules circulantes sécrétrices
de PSA
Cellules prostatiques
Tumorales
chez la plupart des patients au stade M+
chez des patients au stade M0
! Absence de ces
chirurgical récent
cellules
après
traitement
EXPLORATION DU RESERVOIR
VIRAL CELLULAIRE VIH-1
INFECTION VIH-1
Réservoirs
plasmatique : charge virale exprimée en nombre de copies/ml
de plasma (patients non traités et traités)
cellulaires : lymphocytes T CD4+, monocytes, etc.
d’organes : ganglionnaire, muqueux,SNC, etc.
Lymphocytes TCD4+ infectés dans le compartiment circulant
- cellules en cycle viral (patients non traités)
- cellules quiescentes (patients non traités et traités)
Le RESERVOIR VIH-1 dans le
Compartiment Circulant
n
Lymphocytes TCD4+ ayant intégré
l’ADN proviral
n
Vaisseau sanguin
M n
M
M n
n
M
n
M
Mo
n
n
M
n
M
n
M
M
n
n
n
n
n
n
n
n
M
n
n
n
M
n
M
PN
n
M
Fréquence théorique 103 à 105 dans le compartiment
circulant
Soit 1 à 100 cellules/ml de sang (Fauci & Siliciano)
La Problématique : ces cellules sont
- des lymphocytes T CD4+ infectés par le VIH-1
- quiescentes (DNA proviral intégré dans le DNA), ce DNA est capable
d’être transcrit et traduit au cours de l’activation cellulaire
- insensibles aux traitements anti-rétroviraux
-non reconnues par le système immunitaire
-présentes et persistentes chez les patients bons répondeurs aux
traitements anti-rétroviraux
- très rares, leur nombre a été estimé par modèle mathématique entre
105 à 107 cellules dans l’organisme (A. Fauci NIH Bethesda et R. Siliciano Johns
Hopkins Hospital, Baltimore),
Le prototype d’un réservoir viral cellulaire
Comment explorer ce
RESERVOIR
VIRAL CELLULAIRE VIH-1 ?