OEufs et larves aquatiques

Œufs et larves aquatiques:
caractérisation et limitations des modèles.
L’anecdote des étiquettes: « j’ai sous les yeux deux petits embryons conservés dans
des flacons d’alcool sur lesquels j’ai oublié de mettre une étiquette. Je suis maintenant
incapable de déterminer le genre auquel ils appartiennent. Ce sont peut-être des
lézards, des oiseaux, ou même des mammifères. » Karl von Baer, 1928.
Des crétins et des têtards géants
« Sans un minimum d’hormone thyroïdienne au bon moment
lors du développement, le têtard de grenouille reste une larve
et le bébé humain un crétin»
Jacques Legrand 1983
Les hormones thyroïdiennes contrôlent la métamorphose
T3
55
60
Leloup and Buscaglia, 1977
63
66
stages
Xenopus development
Xenopus (Xenopus laevis)
ENDOGENOUS ENERGY SUPPLY
(autotrophic)
ENERGY EXOGENOUS SUPPLY
(heterotrophic)
Consumption of vitellus reserves
Fertilization Hatching
J0
St. 1
St. 8
Metamorphosis
Embryo
Eleutheroembryo
J1
St. 26
J2 à J8
St. 37 to 48
EMBRYONIC PERIOD
Ethical Alternative
Fini et al. 2012
Maturation
Sexual
secondary
Larvae heterotrophic
freely swimming
J9 à J45
St. 49 à 59
J46 à J58
St. 60 à 65
PRE
METAMORPHIC
LARVAE
PRO
METAMORPHIC
LARVAE
AMA OECD test
J59 à J240
St. 66
JUVENILE
J240
ADULT
Essai transcriptionnel in vivo.
Potentiel perturbateur
Activation du
gène cible
Promoteur
Gène cible
Activation du
gène rapporteur
Promoteur
Réaction naturelle /
Effet biologique
GFP
Production d’une
protéine
fluorescente
In vivo: éliminer les faux positifs
Chemicals
in vitro
WatchFrog
7
in vivo
Avantages du modèle amphibien
•
•
•
•
•
•
Milliers larves
Transparence
Petite taille (quelques millimètres)
Contact direct avec l’échantillon
Possibilité de détecter plusieurs effets à la fois
Forte sensibilité (ng/L hormones)
WatchFrog
8
Trois axes hormonaux – critères physiologiques spécifiques
• Modèle de perturbation thyroïdienne chez l’amphibien: biomarqueur THbZIP
Critères visés: OCDE 231 Perturbation de la
métamorphose et du développement.
• Modèle de perturbation œstrogénique chez le poisson: biomarqueur
Choriogenin H et marqueurs de détermination sexuelle
Critères visés: OCDE 229 et 230 Perturbation de la
de la reproduction.
• Modèle de perturbation androgénique chez le poisson:
biomarqueur spiggin de l’épinoche
Critères visés: OCDE doc guide 148
Capacité des épinoches mâles à nidifier.
9
Amphibian Metamorphosis Assay
OCDE Physiological criteria for Thyroid disruption :
Amphibian metamorphosis.
OECD Test Guideline 231 – Amphibian Metamorphosis Assay :
• 21 days exposure
• Morphological measurements (weight, snout-to-vent length, hind limb
length, stage).
• Histopathology of the thyroid gland.
• Cost : 70 000Euros/substance
XETA : an in vivo Transcriptionnal assay
Thyroid signaling
Reporter gene
activation
THbZIP Promoter
Production of
fluorescent
protein
GFP
THbZIP :
-transcription factor involved in metamorphosis
-direct thyroid response gene
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Thyroid Signalling
Hypothalamus
CRH
Pituitary
-
TSH
SYNTHESIS
DEIODINASE
METABOLISM OF THYROID HORMONES
IThyroid Gland
Blood Vessels
Tg
TPO
TH
Thyroid
Disruption
HT-TT
UDP-GT
TH-GLUC
Clearance
TRANSPORT
Free TH
Target Cells
TH
TR
TH
RECEPTORS
INTERACTIONS
TR
TH/bZIP
GFP
MODULATE GFP EXPRESSION
Normalised mean fluorescence
(Arbituary units)
T3 dose response
ISAREN 2014
OECD RING TEST : XETA
13
Overview of the protocol
EXPOSURE
72h dark 21°C, renewal every 24h
Sorting embryos
(manually)
8 mm
-Stage 45
-Health (alive and no malformation)
-Homogenous pigmentation
TEST MEDIUM
T3
T3 + T4
Substance
-Each chemical is tested at 5 concentrations in the
presence or absence of T3 (5 nMolar)
-n=20 embryos per concentration
-3 replicates per test substance
( each replicate is an independent experiment,
different spawns and solutions)
Substance + T3
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OECD Conceptual Framework for the testing and
assessment of endocrine disrupters
• Level 1 : Existing data and non-test information
• Level 2 : In vitro assay providing data about selected endocrine mecanism(s)/pathways
• Level 3 : In vivo assay providing data about selected endocrine mecanism(s)/pathways
-> Xenopus Embryonic Thyroid Assay
Amphibian Metamorphosis Assay,
• Level 4 : In vivo assay providing data on adverse effects on endocrine relevant endpoint
• Level 5 : In vivo assay providing more comprehensive data on adverse effect on
endocrine relevant endpoints over more extensive parts of the life cycle of the organism
Detection of œstrogen and
aromatase disruption using
transgenic medaka
choriogenin
vitellogenin
Induction of estrogenic signalling via aromatase
5α
reductase
DHT
Dose Response asssay
30000000
***
Fluorescence
25000000
20000000
***
15000000
***
10000000
5000000
***
0
Témoin
EE2EE2
10-10M
15 ng/L
EE2 EE2
5.10-10M
45 ng/L
25/11/2013
EE2EE2
10-9M
64 ng/l
EE2EE2
10-8M
488 ng/L
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Sensibilité
Quelques nanogrammes de contraceptif par litre
Perturbation endocrinienne et sexuelle
chez le médaka (Oryzias latipes)
Rejet d’effluents
d’industries de pâtes à
papier
Source: environnement Canada
Source: D. Papoulias/ USGS
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La lignée 42sp50-GFP_ChgH-GFP
Choriogenin H: quantification
d’activité œstrogénique
42sp50: marqueur du sexe
phénotypique:  présence d’oocytes
en développement
Phénotype
mâle
Phénotype
femelle
23
Traitement à l’oestradiol 24h
Observation à DPH 7
Traitement à l’oestradiol à JPF0
25
Traitement au dihydrotestostérone 24h
Observation à DPH 7
Traitement au dihydrotestostérone à JPF0
27
Perspectives
Quantification
d’œstrogènicité - ChgH
Visualisation du sexe
phénotypique - 42sp50
Validation en cours
Sensibilité aux œstrogènes
Fenêtre d’exposition pour
observer des effets sur le sexe
phénotypique
Utilisation du modèle avec
détermination de sexe génétique
par génotypage
Intégration du marqueur
fluorescent du sexe génétique
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RAPID SCREENING OF
(ANTI-)ANDROGENS USING
SPIGGIN-GFP REPORTER MEDAKA
« Spiggin » larvae respond to androgens
Stickleback male is a
caring father
(Gasterosteus aculeatus)
Original Spiggin assay…
…involve catching wild sticklebacks
…require careful considerations on the circannual
cycle
…are based on a 21-day treatment period
…are quantified with ELISA
Antibodies not commercially available
No standards available
Confidentiel
Solutions industrielles
Analyse en laboratoire
20 tests / semaine
SMQ
Prototype FrogBox
Suivi en temps réel sur site
WatchFrog
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Rendre visible la qualité de l’eau
Eau perturbatrice du
développement qui provoque des
retards de croissance.
BRUXELLES
Eau de qualité pour
l’environnement.
Senne
Mesures biologiques (axes thyroïdiens et
oestrogéniques) parfaitement corrélées
(R²=0,89) sur 6 mois et 250 mesures au
suivi analytique de 138 micropolluants.
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Avantages et limitations
Modèles aquatiques intégrant des biomarqueurs.
Compromis pertinence / miniaturisation.
Critères physiologiques – éliminer les faux positifs
Sensibilité relative à cette spécificité.
Alternative éthique. L’in vivo à l’échelle du vitro.
Limitation aux stades embryonnaires.
Système endocrinien intégré.
Pas d’évaluation Trans-générationnelle.
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Industrialiser les tests de perturbation
endocrinienne.
• Disposer d’une capacité de production
industrielle et robotisée
• Diffuser notre technologie au plus grand
nombre.
• Essais OCDE en cours et normes
françaises publiées.
• Solution éprouvée dans les situations de
crises.
• Faciliter la décision industrielle et
environnementale.
[email protected] - www.watchfrog.fr
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