Œufs et larves aquatiques: caractérisation et limitations des modèles. L’anecdote des étiquettes: « j’ai sous les yeux deux petits embryons conservés dans des flacons d’alcool sur lesquels j’ai oublié de mettre une étiquette. Je suis maintenant incapable de déterminer le genre auquel ils appartiennent. Ce sont peut-être des lézards, des oiseaux, ou même des mammifères. » Karl von Baer, 1928. Des crétins et des têtards géants « Sans un minimum d’hormone thyroïdienne au bon moment lors du développement, le têtard de grenouille reste une larve et le bébé humain un crétin» Jacques Legrand 1983 Les hormones thyroïdiennes contrôlent la métamorphose T3 55 60 Leloup and Buscaglia, 1977 63 66 stages Xenopus development Xenopus (Xenopus laevis) ENDOGENOUS ENERGY SUPPLY (autotrophic) ENERGY EXOGENOUS SUPPLY (heterotrophic) Consumption of vitellus reserves Fertilization Hatching J0 St. 1 St. 8 Metamorphosis Embryo Eleutheroembryo J1 St. 26 J2 à J8 St. 37 to 48 EMBRYONIC PERIOD Ethical Alternative Fini et al. 2012 Maturation Sexual secondary Larvae heterotrophic freely swimming J9 à J45 St. 49 à 59 J46 à J58 St. 60 à 65 PRE METAMORPHIC LARVAE PRO METAMORPHIC LARVAE AMA OECD test J59 à J240 St. 66 JUVENILE J240 ADULT Essai transcriptionnel in vivo. Potentiel perturbateur Activation du gène cible Promoteur Gène cible Activation du gène rapporteur Promoteur Réaction naturelle / Effet biologique GFP Production d’une protéine fluorescente In vivo: éliminer les faux positifs Chemicals in vitro WatchFrog 7 in vivo Avantages du modèle amphibien • • • • • • Milliers larves Transparence Petite taille (quelques millimètres) Contact direct avec l’échantillon Possibilité de détecter plusieurs effets à la fois Forte sensibilité (ng/L hormones) WatchFrog 8 Trois axes hormonaux – critères physiologiques spécifiques • Modèle de perturbation thyroïdienne chez l’amphibien: biomarqueur THbZIP Critères visés: OCDE 231 Perturbation de la métamorphose et du développement. • Modèle de perturbation œstrogénique chez le poisson: biomarqueur Choriogenin H et marqueurs de détermination sexuelle Critères visés: OCDE 229 et 230 Perturbation de la de la reproduction. • Modèle de perturbation androgénique chez le poisson: biomarqueur spiggin de l’épinoche Critères visés: OCDE doc guide 148 Capacité des épinoches mâles à nidifier. 9 Amphibian Metamorphosis Assay OCDE Physiological criteria for Thyroid disruption : Amphibian metamorphosis. OECD Test Guideline 231 – Amphibian Metamorphosis Assay : • 21 days exposure • Morphological measurements (weight, snout-to-vent length, hind limb length, stage). • Histopathology of the thyroid gland. • Cost : 70 000Euros/substance XETA : an in vivo Transcriptionnal assay Thyroid signaling Reporter gene activation THbZIP Promoter Production of fluorescent protein GFP THbZIP : -transcription factor involved in metamorphosis -direct thyroid response gene 11 Thyroid Signalling Hypothalamus CRH Pituitary - TSH SYNTHESIS DEIODINASE METABOLISM OF THYROID HORMONES IThyroid Gland Blood Vessels Tg TPO TH Thyroid Disruption HT-TT UDP-GT TH-GLUC Clearance TRANSPORT Free TH Target Cells TH TR TH RECEPTORS INTERACTIONS TR TH/bZIP GFP MODULATE GFP EXPRESSION Normalised mean fluorescence (Arbituary units) T3 dose response ISAREN 2014 OECD RING TEST : XETA 13 Overview of the protocol EXPOSURE 72h dark 21°C, renewal every 24h Sorting embryos (manually) 8 mm -Stage 45 -Health (alive and no malformation) -Homogenous pigmentation TEST MEDIUM T3 T3 + T4 Substance -Each chemical is tested at 5 concentrations in the presence or absence of T3 (5 nMolar) -n=20 embryos per concentration -3 replicates per test substance ( each replicate is an independent experiment, different spawns and solutions) Substance + T3 14 OECD Conceptual Framework for the testing and assessment of endocrine disrupters • Level 1 : Existing data and non-test information • Level 2 : In vitro assay providing data about selected endocrine mecanism(s)/pathways • Level 3 : In vivo assay providing data about selected endocrine mecanism(s)/pathways -> Xenopus Embryonic Thyroid Assay Amphibian Metamorphosis Assay, • Level 4 : In vivo assay providing data on adverse effects on endocrine relevant endpoint • Level 5 : In vivo assay providing more comprehensive data on adverse effect on endocrine relevant endpoints over more extensive parts of the life cycle of the organism Detection of œstrogen and aromatase disruption using transgenic medaka choriogenin vitellogenin Induction of estrogenic signalling via aromatase 5α reductase DHT Dose Response asssay 30000000 *** Fluorescence 25000000 20000000 *** 15000000 *** 10000000 5000000 *** 0 Témoin EE2EE2 10-10M 15 ng/L EE2 EE2 5.10-10M 45 ng/L 25/11/2013 EE2EE2 10-9M 64 ng/l EE2EE2 10-8M 488 ng/L 19 Sensibilité Quelques nanogrammes de contraceptif par litre Perturbation endocrinienne et sexuelle chez le médaka (Oryzias latipes) Rejet d’effluents d’industries de pâtes à papier Source: environnement Canada Source: D. Papoulias/ USGS 22 La lignée 42sp50-GFP_ChgH-GFP Choriogenin H: quantification d’activité œstrogénique 42sp50: marqueur du sexe phénotypique: présence d’oocytes en développement Phénotype mâle Phénotype femelle 23 Traitement à l’oestradiol 24h Observation à DPH 7 Traitement à l’oestradiol à JPF0 25 Traitement au dihydrotestostérone 24h Observation à DPH 7 Traitement au dihydrotestostérone à JPF0 27 Perspectives Quantification d’œstrogènicité - ChgH Visualisation du sexe phénotypique - 42sp50 Validation en cours Sensibilité aux œstrogènes Fenêtre d’exposition pour observer des effets sur le sexe phénotypique Utilisation du modèle avec détermination de sexe génétique par génotypage Intégration du marqueur fluorescent du sexe génétique 28 RAPID SCREENING OF (ANTI-)ANDROGENS USING SPIGGIN-GFP REPORTER MEDAKA « Spiggin » larvae respond to androgens Stickleback male is a caring father (Gasterosteus aculeatus) Original Spiggin assay… …involve catching wild sticklebacks …require careful considerations on the circannual cycle …are based on a 21-day treatment period …are quantified with ELISA Antibodies not commercially available No standards available Confidentiel Solutions industrielles Analyse en laboratoire 20 tests / semaine SMQ Prototype FrogBox Suivi en temps réel sur site WatchFrog 35 Rendre visible la qualité de l’eau Eau perturbatrice du développement qui provoque des retards de croissance. BRUXELLES Eau de qualité pour l’environnement. Senne Mesures biologiques (axes thyroïdiens et oestrogéniques) parfaitement corrélées (R²=0,89) sur 6 mois et 250 mesures au suivi analytique de 138 micropolluants. 36 Avantages et limitations Modèles aquatiques intégrant des biomarqueurs. Compromis pertinence / miniaturisation. Critères physiologiques – éliminer les faux positifs Sensibilité relative à cette spécificité. Alternative éthique. L’in vivo à l’échelle du vitro. Limitation aux stades embryonnaires. Système endocrinien intégré. Pas d’évaluation Trans-générationnelle. 37 Industrialiser les tests de perturbation endocrinienne. • Disposer d’une capacité de production industrielle et robotisée • Diffuser notre technologie au plus grand nombre. • Essais OCDE en cours et normes françaises publiées. • Solution éprouvée dans les situations de crises. • Faciliter la décision industrielle et environnementale. [email protected] - www.watchfrog.fr 38