Convention AVN - 2015-2016

CONVENTION AVN 2015‐2016 dirigée par les Prs Bernard CORVILAIN et Serge GOLDMAN Directeurs du projet : Professeur Bernard CORVILAIN, Chef de service d’Endocrinologie à l’Hôpital Erasme Professeur Serge GOLDMAN, Chef de service de Médecine Nucléaire à l’Hôpital Erasme Groupe hospitalier de recherche formé par : ‐
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Docteur Dominique EGRISE, Docteur en Sciences en Médecine nucléaire à l’Hôpital Erasme Docteur Félicie SHERER, Chercheur au CMMI à l’ULB Docteur Aglaia KYRILLI, Résidente en Endocrinologie à l’Hôpital Erasme Docteur Chiraz GHADDHAB, Résidente en Pédiatrie à l’IRIBHM Docteur Vincent DETOURS, Docteur en Neurosciences à l’IRIBHM Docteur Françoise MIOT, Docteur en Sciences chimiques à l’IRIBHM Budget : 130 000 € (65 000 € par an pendant deux ans) Titre et résumé du projet : Radiosensibilité cellulaire, imagerie du trafic cellulaire et risque individuel de pathologies radio‐
induites Le contexte de la recherche : Cette recherche, menée dans la continuité des travaux déjà entamés précédemment dans le cadre du financement de la Convention AVN, est destinée à mieux connaître les caractéristiques spécifiques de la cellule thyroïdienne qui déterminent sa radiosensibilité. Pour rappel, l’induction de cancers thyroïdiens, en particulier chez les enfants, est la conséquence la plus manifeste sur le plan de la santé publique d’une exposition aux diverses espèces isotopiques qui sont larguées dans l’environnement lors d’un incident nucléaire majeur. La glande thyroïde est caractérisée par une incorporation intensive d’iode destiné à la production des hormones thyroïdiennes et les isotopes radioactifs de l’iode incorporés sont la cause de l’irradiation de la glande lors d’une exposition à ces isotopes. Notre contribution : Les études menées dans notre groupe de recherche portent sur l’impact de l’exposition continue de la glande à des radicaux libres, facteurs d’oxydation de l’ADN qui sont les agents intermédiaires par lesquels l’irradiation exerce son action mutagène et donc cancérigène. Le métabolisme particulier de la glande thyroïde, nécessaire à l’organification de l’iode en vue de son intégration dans les pro‐
hormones thyroïdiennes, comporte en effet l’intervention d’espèces moléculaires oxydantes vis‐à‐vis desquels une protection est assurée en permanence pour maintenir l’intégrité du matériel génétique. Nos recherches comparent les modifications d’expression génique induites par l’exposition de cellules thyroïdiennes, et de cellules d’autres natures, à des radiations ionisantes d’une part et à des agents oxydants d’autre part. Les recherches menées dans le cadre de l’utilisation des radio‐isotopes pour le marquage de cellules destinées à l’imagerie de divers processus pathophysiologiques ou thérapeutiques seront poursuivies. Ces recherches sont menées dans le cadre d’une collaboration entre l’Unité TEP/Cyclotron biomédical de l’Hôpital Erasme et le CMMI, un centre d’imagerie préclinique installé sur le campus ULB de Gosselies. Nos précédents travaux nous ont déjà permis de tester divers modes de marquage cellulaire, parmi lesquels celui faisant appel à un agents de marquage permettant la fixation du traceurs de façon covalente sur les membranes cellulaires s’est montré particulièrement efficient (Lacroix, S., Egrise, D., Van Simaeys, G., Doumont, G., Monclus, M., Sherer, F., Herbaux, T., Leroy, D., and Goldman, S. (2013). [(18) F]‐FBEM, a tracer targeting cell‐surface protein thiols for cell trafficking imaging. Contrast Media Mol Imaging 8, 409–416). Ce marqueur, ainsi que d’autres agents de marquage cellulaire, sont exploités aujourd’hui dans diverses études que nous comptons poursuivre. Parmi ces études, nous mettons actuellement l’accent sur des recherches destinées à mettre au point une méthodologie d’imagerie des processus pathologiques qui entrent successivement en jeu dans la fibrose pulmonaire, une affection aux conséquences aussi dévastatrices que le cancer et pour laquelle nous ne disposons pas aujourd’hui de biomarqueurs efficaces, en particulier pour tester les médicaments qui lui sont destinés. Nos méthodes de marquage cellulaire permettent également au CMMI de répondre à une demande croissante de laboratoires partenaires impliqués dans le développement d’agents cellulaires thérapeutiques, en particulier pour la régénérescence de tissus aussi variés que l’os, le foie, ou le muscle cardiaque. Ces marquages cellulaires permettent également de suivre in vivo l’intervention de cellules impliquées dans des processus immunitaires et inflammatoires. Résumé des recherches de 2012 à 2014 H2O2 produced in large quantities in the thyroid has been suspected to play a role in the pathogenesis of nodules and thyroid cancer. In vitro, physiological amount of H2O2 are able to cause similar DNA damage compared with irradiation and even induce RET/PTC rearrangements found in the vast majority of radiation‐induced thyroid cancers. DNA damage induced by H2O2 has been evaluated and compared to those produced by irradiation in a thyroid model constituted by thyrocytes in primary culture. We first observed DNA damage obtained after a 1 Gy radiation was comparable to those induced by 0.2 mM H2O2 in terms of double strand breaks measured by phosphorylation of histone H2AX. To obtain the same levels of DNA damage lower concentrations of H2O2 were needed in other cell lines like F208 fibroblasts, immortalized human thyrocyte line, XCGD, and till 10 times less in T‐cells. Gene expression study showed that T‐ cells and thyrocytes responded similarly to irradiation by an up‐regulation of apoptosis and DNA repair genes. On the contrary, H2O2 treatment provoked a totally different transcriptional response in T‐cells and in thyrocytes; 1000 times more genes saw their expression modulated in T‐cells than in thyrocytes. These results were supported by the fact that kinetic of DNA repair were totally comparable after irradiation in the two cell types and in the other cells tested; total repair was observed after 2 hours. The expression of a few genes was exclusively modulated by H2O2 in thyrocytes. Among them genes involved in the defence against oxidative stress were up‐regulated such as heme oxygenase 1 (OH‐1), Glutathione peroxidase 2 (GPx2), the GPx5, thioredoxin reductase 1, Glutamate‐cysteine ligase. GPX enzyme activity was increased in thyrocytes one hour after exposure to H2O2 and not to irradiation. No GPX activity could be detected in T‐cells. The activation of GPX activity by H2O2 was specific of thyrocytes in primary culture since it was not observed in different cell lines tested. HO‐1 expression measured by RT PCR was up‐regulated by H2O2 in thyrocytes 4 to 8 hours after treatment, was not changed in T‐cells and was increased but to a lesser extent in the other cell lines compared to thyrocytes. Irradiation never changed the expression of OH‐1. DNA repair kinetics revealed that while all cell types tested repaired quickly (within 2 hours) DNA damage induced by irradiation, DNA damage induced by H2O2 was repaired more slowly (within 8 hours) in all tested cells except in T‐cells where no repair occurred. We have also demonstrated that a first exposure of thyrocytes to H2O2 may weak the repair process of the cell after irradiation or a second H2O2 exposure. In the same experiment, a first exposure to irradiation did not slow down DNA repair after H2O2 or a second irradiation. This observation strongly suggests an inhibition of the DNA repair machinery under H2O2 stress. Along this study we have compared and determined a different response of thyrocytes to H2O2 and ɣ‐irradiation. As we know that the main identified risk factor of thyroid cancer is a therapeutic ɣ‐
irradiation or an accidental β‐irradiation due to I131 exposure, we have measured and compared in our in vitro experimental model of thyrocytes in primary culture the effect of 1 to 10 Gy Cs137 and I131 irradiation. The levels and degree of damages are different. Less global damage was observed with I131 but the relative proportion of severe damage was higher. This was demonstrated by the comet assay that recorded more stage 5 (high degree of damage). Experimental implementations are currently ongoing to measure and characterize the type of DNA damage induced by I131. In conclusion of this annual report we have determined that while cells respond similarly to ɣ‐
irradiation, thyrocytes are especially well equipped to protect them against H2O2 by developing efficient defences. The overall results support our hypothesis that H2O2 is a mutagen, which can cause thyroid tumors especially in case of deficiency in protection systems. Assessment of cell trafficking is of great importance for the evaluation of cell‐based therapies. In the context of translational medicine, radioactive methods, in particular positron emission tomography (PET), offer the best sensitivity for the detection of whole body cell distribution. Most of our work in 2013 was dedicated to the validation of [18F]‐4‐fluorobenzamido‐N‐ethylamino‐
maleimide (FBEM) as an effective tool for cell labelling and in vivo cell trafficking. In contrast to commonly used labelling agents, [18F]‐FBEM forms a covalent bond with thiols groups present on the cells surfaces. We have shown that covalent tethering of the PET probe to the cell can provide a stable labelling that does not require any active transport system or specific receptor to be present and does not seem to affect cell viability. (S. Lacroix et al , Contrast Media & Molecular Imaging 2013 , 8 409‐416 ). The efficiency of the labelling with [18F]‐FBEM was tested in different cell types among them leukocytes, neutrophils, trypanosomas. [18F]‐FBEM ‐ labelled leukocytes PET‐CT enabled us to monitor leukocyte recruitment in a mouse model of pulmonary fibrosis. (B. Bondue , F.Sherer et al PET‐CT with [18F]‐FDG and [18F]‐FBEM ‐ labelled leukocytes for metabolic activity and leukocyte recruitment monitoring in a mouse model of pulmonary fibrosis. in preparation). [18F]‐FBEM labelling of trypanosoma has allowed observing their biodistribution in mice during the few hours following contamination. Since the short half‐life of [18F] (110 min) allows cells to be tracked for a few hours only, we performed preliminary experiments to label cells with [89 Zr] that has a half‐life of 3,3 days. The labelling was performed using p‐isothiocyanatobenzyl‐desferrioxamine B (Df‐Bz) as a chelate. The first results indicate a good labelling efficiency but a negative effect of the labelling on the cell viability. In future experiments we plan to modulate redox status and other metabolic pathways (ROS generation, apoptosis) before and/or during the labelling process, aiming at an improvement the cell viability.