revue générale Rôle des N-glycanes dans les fonctions des

abc
revue générale
Ann Biol Clin 2007 ; 65 (3) : 237-46
Rôle des N-glycanes dans les fonctions
des glycoprotéines d’enveloppe
du virus de l’hépatite C
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
Role of N-linked glycans in the functions
of hepatitis C virus envelope glycoproteins
A.
M.
L.
A.
D.
Goffard
Lazrek
Bocket
Dewilde
Hober
Service de virologie,
UPRES-EA3610, CHRU Lille,
Faculté de médecine,
Université Lille 2, Lille
<[email protected]>
Résumé. Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus enveloppé dont l’enveloppe virale est constituée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont ancrées
deux glycoprotéines d’enveloppe, E1 et E2. Ces glycoprotéines subissent de
nombreuses modifications co- et post-traductionnelles à l’issue desquelles elles
acquièrent leur conformation définitive. La N-glycosylation se déroule dans le
réticulum endoplasmique et passe par la reconnaissance d’un motif spécifique
d’acides aminés de type Asparagine-X-Sérine/Thréonine-Y. Les glycoprotéines
E1 et E2 du VHC sont des protéines transmembranaires de type I qui s’assemblent pour former des hétérodimères non-covalents. Au cours de leur synthèse,
les glycoprotéines E1 et E2 traversent le réticulum endoplasmique dans lequel
elles subissent différentes modifications dont la N-glycosylation. La glycoprotéine E1 porte 4 ou 5 sites potentiels de N-glycosylation et la glycoprotéine E2
en porte 10 ou 11 en fonction des génotypes viraux. La glycoprotéine E1 de
génotype 1a est glycosylée sur 4 de ces 5 sites potentiels et la glycoprotéine E2
sur les 11 sites potentiels. Les N-glycanes portés par E1 et E2 jouent un rôle
majeur dans la mise en conformation des glycoprotéines et dans la formation
des hétérodimères E1E2. Certains N-glycanes portés par E2 sont par ailleurs
impliqués dans les interactions avec CD81, récepteur potentiel du VHC et
d’autres portés par E1 et E2 jouent un rôle dans l’entrée virale.
doi: 10.1684/abc.2007.0125
Mots clés : virus de l’hépatite C, glycoprotéines d’enveloppe, N-glycanes,
entrée virale
Abstract. Hepatitis C virus (HCV) is an enveloped virus and encodes two
envelope glycoproteins, E1 and E2. E1 and E2 are transmembrane type I
proteins with a N-terminal ectodomain and C-terminal anchor. During their
synthesis, E1 and E2 ectodomains are targeted in the endoplasmic reticulum
lumen where they are modified by N-linked glycosylation. After their synthesis, E1 and E2 assemble as a non-covalent heterodimer. The N-linked glycosylation is based on the recognition of specific asparagine residue in the context
of the consensus sequence Asn-X-Ser/Thr. E1 contains potentially 4 or 5
N-linked glycosylation sites and E2 up to 11. Recent data indicated that some
glycans of glycoproteins E1 and E2 play a major role in protein folding and
heterodimer formation. Some N-linked glycans of E2 were involved in interactions with CD81, a putative cellular receptor for HCV. It appeared that
N-linked glycans of E1 and E2 played an important role of in the viral entry.
Article reçu le 13 septembre 2006,
accepté le 22 février 2007
Key words: hepatitis C virus, envelope glycoproteins, N-linked glycans, viral
entry
Tirés à part : A. Goffard
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
237
revue générale
Le virus de l’hépatite C (VHC) a été découvert en 1989.
C’était le premier agent infectieux découvert à l’aide
d’outils de biologie moléculaire, sans isolement préalable
de particules virales. Depuis, de nombreuses recherches
5’NC
3’NC
CADRE OUVERT DE LECTURE
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
TRADUCTION
C
E1
E2
P NS3
7
NS2
NS NS4B NS5A
4A
NS5B
Figure 1. Organisation génomique du VHC. L’ARN génomique
possède un seul cadre ouvert de lecture (en rose) encadré de
deux régions non codantes (en vert) à partir duquel un précurseur est synthétisé. Les sites de clivages de la ou des signal
peptidases cellulaires sont représentés par des flèches rouges.
Le site d’action de la signal peptide peptidase est individualisé en
orange (SPP). Les sites de clivages par les protéinases virales
sont représentés par des flèches courbes bleues. L’auto-clivage
entre les protéines NS2/3 est représenté par une courbe en
pointillés. Les protéines structurales sont dessinées en rouge et
les protéines non-structurales en violet.
Glucosidase I
Glucosidase II
ont permis une meilleure connaissance du virus, de sa
physiopathologie et des pathologies qu’il entraîne. Cependant, la prise en charge de patients infectés chroniquement
par le VHC, malgré une certaine efficacité, se heurte à un
certain nombre de difficultés : lourdeur des traitements,
apparition de résistances aux antiviraux, patients nonrépondeurs... Dans cette synthèse, nous verrons que les
travaux portant sur la caractérisation des glycoprotéines
de l’enveloppe virale pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Le VHC appartient à la famille des Flaviviridae, au genre
Hepacivirus. Il existe 6 génotypes différents (numérotés
de 1 à 6) et de nombreux sous-types (1a, 1b, 1c, 2a, 2b,
etc.). Le VHC est un virus enveloppé avec un génome de
type ARN simple brin de polarité positive. L’ARN génomique présente un seul cadre de lecture ouvert qui est
transcrit en une polyprotéine organisée en deux régions :
la région N-terminale qui code les protéines structurales
du virus (protéines F, C, E1, E2) et la région C-terminale
qui code les protéines non-structurales (protéines NS2,
NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B) (figure 1). Un petit
peptide, p7, codé dans une région située entre E2 et NS2,
n’a pas encore trouvé une place définitive parmi les protéines structurales ou non-structurales. La polyprotéine est
clivée par des protéases cellulaires (de type signal peptidase et signal peptide peptidase) et virales (NS2-3 et NS34A) pour donner 10 protéines matures. L’enveloppe virale
est constituée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont
ancrées les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2. Elles
sont produites par clivage protéolytique du précurseur du
VHC par une peptidase signal d’origine cellulaire (revue
dans [1]). Les clivages co-traductionnels aux sites C/E1,
E1/E2 et NS2/NS3 produisent E1 et un précurseur de E2,
E2p7NS2. Après clivage, ce précurseur produit E2, p7,
E2p7 et NS2 [2].
Principes de la N-glycosylation
N
Asn-X-Ser/Thr-Y
C
Figure 2. Noyau commun des N-glycanes. L’oligosaccharide est
ajouté sur le résidu Asn d’une protéine naissante pour former le
noyau commun des N-glycanes. Les résidus glucoses (triangle
rouge) et mannoses (rond rose) terminaux sont clivés par des
enzymes du réticulum endoplasmique (glucosidases et mannosidase) (d’après [40]). Les carrés bleus représentent des résidus
N-acétylglucosamines.
238
Au cours de leur passage dans le réticulum endoplasmique
et l’appareil de Golgi, les protéines immatures subissent
différentes modifications co- et post-traductionnelles telles
que la formation de ponts disulfures, la N- et la
O-glycosylation, le clivage de peptide signal, les interactions avec les protéines chaperons, etc. À l’issue de ces
transformations, les protéines seront sous leur forme mature
et correctement repliées. La N-glycosylation passe par la
reconnaissance d’un motif spécifique de type AsparagineX-Sérine/Thréonine-Y où X et Y désignent des acides aminés dont la nature a son importance comme nous le verrons
plus loin. Les N-glycanes ont une structure commune formée d’un noyau pentasaccharidique, le trimannosyl-di-Nacétylchitobiose (figure 2). La N-glycosylation s’effectue à
la face luminale du réticulum endoplasmique. La synthèse
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
Protéines d’enveloppe du VHC
des oligosaccharides commence à la face cytosolique du
réticulum endoplasmique. Un transporteur lipidique membranaire, le dolichol, présent à la face cytosolique du réticulum endoplasmique porte une chaîne oligosaccharidique constituée de 5 mannoses et 2 N-acétylglucosamines
(Man5GlcNac2) qui forme le précurseur glycanique. Sous
l’action d’une flipase, le dolichol-Man5GlcNac2 est transloqué vers le côté luminal du réticulum endoplasmique.
Dans le réticulum endoplasmique, le précurseur glycanique va subir quelques modifications avant d’être transféré
“ en bloc ” sur une chaîne polypeptidique en cours de
synthèse (figure 3). Le transfert est assuré par une enzyme
cellulaire, l’oligosaccharyltransférase (OST) qui reconnaît
un motif consensus spécifique, le séquon Asn-XSer/Thr-Y, sur la chaîne polypeptidique naissante. L’oligosaccharide est transféré sur le résidu Asn du séquon.
Tous les séquons potentiels ne sont pas glycosylés avec la
même efficacité. En effet, la présence d’un résidu thréonine est un meilleur substrat pour l’OST que les résidus
sérine [3]. Par ailleurs, la nature des acides aminés X et Y
constituant le séquon peut influencer l’efficacité du transfert de l’oligosaccharide. Ainsi, la présence d’un résidu
proline en position X empêche la N-glycosylation. De
même, des résidus tryptophane, leucine, phénylalanine,
glutamine ou asparagine en position X modifient l’efficacité de transfert sur le résidu asparagine [4]. Enfin, la
présence d’un résidu proline, tryptophane ou glutamine en
position Y est peu favorable au transfert de l’oligosaccharide (tableau 1) [5]. Le précurseur glycanique transféré
sur la protéine naissante va subir différentes étapes de
maturation qui commencent dans le réticulum endoplasmique et se terminent dans l’appareil de Golgi. Au cours
de cette longue maturation, les N-glycosylprotéines
acquièrent une grande diversité glycanique (figure 3). Les
RE
OST
flipase
Ms
dolichol
Transfert du glycane
cytosol
Maturation
Golgi
M1
NAcGlcTf
cytosol
M2
Maturation
Glycosylation terminale
Figure 3. Biosynthèse des protéines N-glycosylées (d’après [40]). La N-glycosylation démarre à la face cytosolique du réticulum
endoplasmique par l’addition de sucres sur le dolicholphosphate. Quand deux N-acétylglucosamines et cinq mannoses ont été ajoutés,
l’oligosaccharide est transloqué à la face luminale du réticulum endoplasmique par une flipase et sept sucres supplémentaires sont
ajoutés sur le précurseur lipidique. Trois résidus glucose sont ajoutés et l’oligosaccharyltransférase (OST) catalyse le transfert du
noyau oligosaccharidique sur un résidu asparagine de la protéine naissante. Les trois résidus glucose sont alors éliminés par les
glucosidases I et II et les résidus mannoses sont éliminés par une ou plusieurs mannosidases du réticulum endoplasmique (Ms). Une
fois que la protéine est correctement repliée, elle quitte le réticulum endoplasmique (flèche rouge) et elle est transportée dans l’appareil
de Golgi où plusieurs mannoses sont retirés (M1). L’addition d’un résidu N-acétylglucosamine (NAcGlcTf) est suivie par l’élimination de
deux mannoses supplémentaires (M2). Les étapes suivantes ajoutent différents sucres terminaux tels que des résidus galactose,
fucose, N-acétylglucosamine, etc. La protéine mature peut alors gagner son compartiment cellulaire de destination (flèche rouge).
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
239
revue générale
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
N-glycanes jouent un rôle important au cours de la synthèse des protéines virales et dans les interactions entre le
virus et son hôte. Ainsi, les glycanes peuvent être impliqués dans la stabilité et le repliement des protéines virales
et dans l’assemblage des particules virales. Ils peuvent
aussi jouer un rôle dans les interactions entre le virus et les
cellules hôtes, dans l’entrée virale ou dans l’immunogénicité des protéines virales.
Mise en conformation
des glycoprotéines
dans le réticulum endoplasmique
Dans le réticulum endoplasmique, parallèlement à la
N-glycosylation, les N-glycosylprotéines acquièrent leur
conformation définitive (conformation secondaire, tertiaire et quaternaire). La mise en conformation des
N-glycosylprotéines est un phénomène dynamique assisté
par des protéines résidentes du réticulum endoplasmique,
des protéines chaperons. L’interaction des protéines
immatures avec les protéines chaperons de mise en
conformation va éviter qu’elles ne s’engagent trop vite
dans une voie de sécrétion, faciliter l’assemblage des protéines oligomériques et éviter leur engagement dans une
voie de dégradation. L’immunoglobulin heavy chain binding protein (BiP ou grp78) et la peptide disulfure isomérase (PDI) sont des protéines chaperons qui interviennent
essentiellement lors de la mise en conformation des protéines. Elles interagissent transitoirement avec les protéines naissantes jusqu’à leur mise en conformation correcte
Tableau 1. Nature des acides aminés (AA) influençant l’efficacité
de la N-glycosylation.
Asn-X-Ser/Thr-Y
Contexte favorable
en X [4]
Petit acide aminé
AA chargés
positivement
AA portant
un résidu hydroxy
AA hydrophobes
de grande taille
AA chargés
négativement
Contexte favorable
en Y [5]
Glycine
Lysine, Arginine,
Histidine
Sérine, Thréonine
Sérine, Thréonine
Contexte défavorable
en X [4]
Contexte défavorable
en Y [5]
Proline
Leucine, Phénylalanine,
Tryptophane, Tyrosine
Acide glutamique, Acide
aspartique
Proline
Tryptophane
Arginine
Acide glutamique
La nature des acides aminés qui constituent le séquon peut modifier les
conditions locales et influencer l’activité de l’oligosaccharyltransférase
[4, 5]. En général, la présence d’un résidu sérine en troisième position
rend le séquon plus sensible à la structure des acides aminés en X et en
Y. L’influence d’un résidu cystéine en position X ou Y dépend de son
implication éventuelle dans la formation d’un pont disulfure.
240
qui favorise alors la dissociation des complexes formés
avec la protéine chaperon [6]. À côté des protéines chaperons qui interviennent dans la mise en conformation des
protéines, trois protéines ont été décrites comme étant
spécifiques des N-glycosylprotéines : la calnexine (CNX),
la calréticuline (CRT) et l’ERp57. La CNX est une protéine transmembranaire de type I, résidente du réticulum
endoplasmique qui reconnaît spécifiquement les
N-glycosylprotéines [7]. La CRT est un analogue soluble
de la CNX présente dans la lumière du réticulum endoplasmique. La calnexine et la calréticuline interagissent
avec le co-chaperon ERp57. L’ERp57 (ou grp58 ou ER60)
est une protéine soluble résidente du réticulum endoplasmique ayant des homologies avec la PDI (revue dans [8]).
Elle est généralement associée à la CNX ou à la CRT.
L’association de la protéine immature avec la CNX ou la
CRT permet sa rétention dans le réticulum endoplasmique
jusqu’à ce qu’elle ait acquis sa conformation définitive et
terminé sa maturation. Une fois qu’elles sont correctement
repliées et maturées, les glycoprotéines se dissocient des
protéines chaperons et quittent le réticulum endoplasmique.
Les glycoprotéines E1 et E2 du VHC
Les glycoprotéines E1 et E2 sont des protéines transmembranaires de type I avec un ectodomaine N-terminal
N-glycosylé et un ancrage membranaire hydrophobe
carboxy-terminal. Au cours de leur maturation dans le
réticulum endoplasmique, les protéines E1 et E2 s’assemblent pour former des hétérodimères. Deux voies d’assemblage permettent la formation des hétérodimères : une
voie dite “ productive ” qui aboutit à la formation des
hétérodimères E1E2 non-covalents et une voie dite “ non
productive ” qui aboutit à la formation d’agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures [2, 9]. Les complexes
non-covalents se replient lentement après leur association
à la CNX (figure 4) [9, 10]. Cet hétérodimère pourrait être
la forme de pré-bourgeonnement du complexe E1E2 présent à la surface des particules virales [11]. Le repliement
de E1 est dépendant de la co-expression de E2, alors que
E2 atteint un état conformationnel avancé en l’absence de
E1 [12]. Par ailleurs, l’interaction entre les domaines
transmembranaires de E1 et de E2 est indispensable au
repliement de E1, en même temps que l’expression de E2
[11]. L’interaction des deux domaines transmembranaires
pourrait stabiliser la protéine E1 immature et rapprocher
les ectodomaines de E1 et de E2, favorisant le repliement
de E1. Par ailleurs, la glycoprotéine E1 influence également le repliement de E2 [13, 14]. La mise en conformation de E1 et de E2 est contrôlée par les protéines chaperons du RE : la CNX s’associe plutôt aux hétérodimères
non covalents [10], alors que la CRT et la BiP interagissent préférentiellement avec les agrégats liés de façon
covalente [10, 15].
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
Protéines d’enveloppe du VHC
induisent théoriquement un contexte conformationnel qui
rend le séquon inaccessible pour l’OST [5]. Ces données
ont été vérifiées expérimentalement lors d’un travail qui a
montré que ce site n’est pas glycosylé [17]. Un site, en
position 250, est présent uniquement sur les séquences de
E1 de génotypes 1b et 6. L’occupation de ce site a été
confirmée par les données expérimentales [2]. L’analyse
de 388 séquences de E2 a permis d’identifier 11 sites
potentiels de N-glycosylation [16]. Globalement, tous les
sites présents sont conservés sur au moins 99 % des
séquences (figure 5). Certains auteurs ont noté une petite
variabilité locale de certains séquons dont la position du
résidu asparagine peut varier de quelques acides aminés
Les glycoprotéines E1 et E2 portent de nombreux motifs
de N-glycosylation : 4 ou 5 pour E1 et 10 ou 11 pour E2
en fonction des génotypes viraux. Une analyse portant sur
768 séquences de E1 a identifié jusqu’à 6 sites potentiels
de N-glycosylation [16]. Cinq de ces sites, en positions
196, 209, 234, 305 et 325, apparaissent conservés sur plus
de 96 % des séquences (figure 5). Le site en position 325
présente un résidu tryptophane en position X et un résidu
proline en position Y (Asn-Trp-Ser-Pro). Ces deux résidus
E2
E2
E1
E1
E2
E1
calnexine
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
Variabilité des sites de N-glycosylation
de E1 et E2 en fonction
du génotype viral
1
2
3
Figure 4. Repliement de E1 et E2 en présence de la CNX. Les ectodomaines des glycoprotéines E1 et E2 sont orientées dans la
lumière du réticulum endoplasmique (1). Les complexes E1E2 se replient lentement après leur association à la CNX (2). Cet
hétérodimère pourrait être la forme de pré-bourgeonnement des glycoprotéines d’enveloppe (3).
196 209
234 253
305
353
192
99% 99% 96% 32%
417 423 430 448
383
99%
476
532 540 556 576
623 658
718
384
100% 99%
75%
100% 89% 99%
746
100%100%
Figure 5. Niveaux de conservation des sites potentiels de glycosylation de E1 et de E2. Les sites potentiels de glycosylation de E1 (en
haut) et de E2 (en bas) sont représentés en rouge. Les numéros des sites correspondent aux positions sur la souche H de génotype
1a de référence. Les pourcentages de conservation sont indiqués en dessous de chaque site. Les domaines transmembranaires sont
figurés en jaune pour E1 et en rouge pour E2.
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
241
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
revue générale
[18]. Ces variations concernent essentiellement les positions 430 (variations entre 430 et 431), 476 (variation
entre 476 et 479) et 576 (variation entre 576 et 581) de E2.
L’analyse des régions 476 et 576 montre qu’elles sont
particulièrement sujettes à des insertions ou à des délétions de quelques acides aminés. Ainsi le séquon en position 476 se trouve localisé dans la région hypervariable 2
du VHC (HVR-2) définie entre les positions 474 et 482
[19]. Dans notre analyse, cette variabilité locale n’a pas
été prise en compte. La conservation d’un séquon dans
cette région a paru plus importante que la variabilité locale
de la position du résidu asparagine. En effet, la conservation d’un séquon semble souligner l’importance du site de
glycosylation pour la structure ou la fonction de la glycoprotéine E2. Les séquons en positions 430 et 576 paraissent donc fortement conservés (99 % chacun). Par contre,
le séquon en position 476 sur E2 apparaît moins conservé
(75 %) dans les séquences de génotype 1, plus particulièrement de génotype 1b, et est absent des séquences de
génotype 5. De même, le site en position 540 est absent
des séquences de génotypes 3 et 6. Étant donné le petit
nombre de séquences de génotypes 5 et 6 publiées (2 et 8
séquences respectivement), le degré de variabilité de ces
génotypes demande à être confirmé par l’étude d’un plus
grand nombre de séquences. En conclusion, les séquences
de génotype 1b présentent un site potentiel de glycosylation supplémentaire, en position 250, sur E1 et un site
potentiellement moins conservé, en position 476, sur E2.
N-glycosylation
des glycoprotéines E1 et E2
La caractérisation de E1 a montré que les séquons présents
ne sont pas tous occupés par des chaînes glycaniques [17].
Lorsque chaque site de N-glycosylation (en positions 196,
209, 234, 305 et 325) est muté isolément et les protéines
mutantes sont exprimées dans des systèmes d’expression
différents, le site en position 325 n’est pas glycosylé. Ce
séquon présente un résidu proline en position Y et il a été
montré que ce type de résidu diminue très fortement l’efficacité de glycosylation [5]. D’ailleurs, le remplacement du
résidu proline par une glycine rend possible la glycosylation. In vitro, l’efficacité de glycosylation n’est pas la
même pour chacun des 4 sites occupés par des glycanes.
En effet, la mutation de plusieurs sites de glycosylation a
montré que le site 305 est partiellement glycosylé, alors
que les sites 196, 209 et 234 sont glycosylés à 100 %
[17, 20]. La glycoprotéine E2 présente 11 sites potentiels
de glycosylation dont un, le site en position 476, n’est pas
conservé dans tous les génotypes de VHC [21]. Nous
avons montré que les 11 sites potentiels de N-glycosylation de E2 de génotype 1a sont effectivement glycosylés [20]. Une étude préalable avait montré que la protéine
242
E2 tronquée de son domaine transmembranaire était glycosylée sur 10 sites potentiels [22]. En effet, la glycosylation des sites 623 et 645 n’a pas lieu si l’extrémité
C-terminale de la protéine est tronquée.
Rôle des N-glycanes dans la formation
des hétérodimères non-covalents E1E2
La présence de N-glycanes à la surface des glycoprotéines
E1 et E2, en influençant leur mise en conformation, peut
jouer sur la formation des hétérodimères E1E2 noncovalents. Plusieurs approches ont montré que la mutation
des sites 209 et 234 de E1 a peu ou pas d’effet sur l’assemblage des complexes E1E2, alors que la mutation du site
196 et, de manière prédominante, celle du site 305 de E1
réduisent considérablement la formation des hétérodimères E1E2 non covalents [17]. Plus précisément, la mutation du site 196 réduit de 54 % la formation des hétérodimères et la mutation du site 305 entraîne une réduction de
71 % de formation de ces complexes [20]. L’efficacité de
la N-glycosylation de E1 est dépendante de la présence
d’une séquence en aval de celle-ci sur la polyprotéine
virale [11]. En effet, lorsque E1 est exprimée seule, elle
n’est pas glycosylée efficacement. La séquence en aval de
E1, en l’occurrence l’extrémité N-terminale de E2, améliore la glycosylation de E1 soit en créant une pause traductionnelle permettant une glycosylation complète de
E1, soit en imposant une conformation à E1 plus favorable
à la N-glycosylation. Cette conformation pourrait être présentée transitoirement avant le clivage de la polyprotéine
entre E1 et E2 et le clivage de la polyprotéine E1-E2 serait
retardé. Ce délai de clivage pourrait être nécessaire pour la
glycosylation de E1. Les N-glycanes portés par E2
influencent aussi la formation des hétérodimères noncovalents E1E2. En effet, la mutation des N-glycanes en
position 540, 556 et 623 de E2 réduit la formation des
hétérodimères E1E2 de 49 %, 67 % et 64 % respectivement [20]. La mutation des autres sites de glycosylation
de E2 a peu ou pas d’effet sur la formation des hétérodimères non-covalents. Finalement, la formation des hétérodimères non-covalents E1E2 implique les deux glycoprotéines si bien que la mutation des sites 196 et 305 de E1 et
des sites 540, 556 et 623 de E2 induit un défaut de repliement des glycoprotéines qui réduit fortement la formation
de ces complexes.
Rôle des N-glycanes dans
les interactions avec CD81,
récepteur potentiel du VHC
Les hétérodimères E1E2 non covalents sont présents à la
surface de la particule virale [23] et sont donc impliqués
dans des interactions entre le VHC et son récepteur celluAnn Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
Protéines d’enveloppe du VHC
laire potentiel. À l’heure actuelle, le récepteur cellulaire
du VHC n’est pas connu. Les résultats accumulés suggèrent que plusieurs structures cellulaires pourraient être
impliquées dans l’entrée du VHC dans les cellules cibles,
dans un système impliquant par exemple un récepteur et
un co-récepteur (revue récente dans [24]). La protéine
cellulaire CD81, récepteur potentiel du VHC [25], appartient à la famille des tétraspanines. Ce sont des protéines
impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires
(revue dans [26]). Les protéines de cette famille ont une
structure commune : quatre domaines transmembranaires
définissant deux boucles extracellulaires, l’une plus large
(LEL) que l’autre. Ces protéines ont une distribution ubiquitaire et leurs nombreuses fonctions font qu’elles sont
qualifiées de « facilitateurs moléculaires ». La fixation du
VHC à un récepteur cellulaire potentiel se fait par l’intermédiaire de la glycoprotéine d’enveloppe E2 [27]. L’interaction entre CD81 et E2 met en jeu la boucle LEL de
CD81 et est dépendante de la conformation de la glycoprotéine E2 [28]. Les N-glycanes portés par E2, en modifiant la conformation de E2, peuvent être impliqués dans
les interactions entre E2 et CD81. Il a été montré que la
mutation ponctuelle des N-glycanes situés en positions
556 et 623 sur E2 empêche l’interaction de E2 avec CD81
[20]. Ces mutations modifient probablement le domaine
de fixation de E2 à CD81. Par ailleurs, d’autres acides
aminés de E2 (en positions 420, 527, 529 et 535) qui ne
sont pas concernés par la N-glycosylation sont eux directement impliqués dans les interactions avec CD81 [29].
Par contre, aucun des N-glycanes porté par E1 ne semble
jouer un rôle dans les interactions entre E2 et CD81. Ces
dernières années, de nombreuses équipes se sont lancées à
la recherche des protéines cellulaires impliquées dans
l’entrée du VHC dans ses cellules cibles. Ainsi, la protéine
scavenger receptor class B type 1 (SR-B1) qui interagit
avec une région hypervariable de E2 (HVR1) semble jouer
un rôle modulateur en modifiant la constitution lipidique
de la membrane plasmique des cellules hôtes du VHC
(revue récente dans [24]).
Rôle des N-glycanes dans l’infectiosité
de pseudo-particules du VHC
Jusque récemment, il n’existait pas de système de culture
cellulaire permettant de propager le virus, plusieurs modèles d’étude du VHC ont donc été mis en place pour analyser la réplication ou la physiopathologie du virus. Un outil
simple à utiliser et donnant des résultats reproductibles a
été développé qui aboutit à la production de pseudoparticules rétrovirales exprimant les glycoprotéines
d’enveloppe du VHC à leur surface [30, 31]. Ce modèle
utilise un vecteur rétroviral, le virus de la leucémie murine
(MLV) ou le VIH, qui exprime les glycoprotéines d’enveAnn Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
loppe E1 et E2 du VHC (ppVHC). Les rétrovirus ont été
choisis pour leurs capacités à encapsider de l’ARN génomique viral rétrotranscrit en ADN proviral, à exprimer des
protéines d’enveloppe étrangères et à intégrer leur provirus dans le génome de cellules hôtes. Ces caractéristiques
sont donc utilisées pour produire des pseudo-particules
virales exprimant les glycoprotéines d’enveloppe du VHC
à leur surface et encapsidant un gène rapporteur (gène de
la green fluorescent protein ou de la luciférase) [32]. Les
pseudo-particules produites par ce système rétroviral sont
infectieuses dans différents systèmes cellulaires [30]. Les
pseudo-particules virales produites sont sécrétées dans le
milieu extracellulaire. Elles sont neutralisées aussi bien
par des anticorps sériques provenant de patients infectés
par le VHC que par des anticorps monoclonaux dirigés
contre E2. Ces données suggèrent que les glycoprotéines
d’enveloppe portées par les pseudo-particules MLV/VHC
sont dans une conformation proche de celle des virions
sauvages. Cet outil est particulièrement intéressant pour
étudier les étapes précoces de l’infection virale.
La production de ppVHC exprimant des mutants de glycosylation est un outil pour étudier l’impact des N-glycanes
portés par E1 et E2 sur l’infectiosité des ppVHC [20].
L’infectiosité de ppVHC exprimant les mutants de glycosylation comparée à celle de ppVHC exprimant E1 et E2
sauvages a permis de constituer 3 groupes : le groupe 1 est
formé de ppVHC dont l’infectiosité est proche de 100 %
(N-glycanes mutés en positions 234 de E1 et 430, 476,
532, 540 et 576 de E2), le groupe 2 est constitué de
ppVHC dont l’infectiosité est diminuée de plus de 50 %
(N-glycanes mutés en positions 196, 209 et 305 de E1 et
417 et 658 de E2), et le groupe 3 est formé de ppVHC non
infectieuses (N-glycanes mutés en positions 423, 448, 556
et 623 de E2) (tableau 2). Ces résultats montrent que la
mutation des N-glycanes présents aux positions 234 de E1
et aux positions 430, 476, 532, 540 et 576 de E2
n’influence pas l’infectiosité des ppVHC (groupe 1). La
faible infectiosité des ppVHC exprimant des glycoprotéines E1 mutées en positions 196 et 305 peut être expliquée
par le défaut de repliement que nous avons évoqué précédemment. De même, l’absence d’infectiosité des ppVHC
exprimant une glycoprotéine E2 mutée aux positions 556
et 623 était attendue du fait du défaut de repliement de E2
induit par ces mutations. Par contre, l’absence d’infectiosité des ppVHC exprimant une glycoprotéine E1 mutée en
position 209 (groupe 2) et des glycoprotéines E2 mutées
aux positions 423 et 448 (groupe 3) ne pouvait pas être
expliquée par un défaut de repliement ou d’incorporation
de ces glycoprotéines et suggère donc que les N-glycanes
présents à ces positions sont directement impliqués dans
l’entrée virale. Enfin, la réduction de l’infectiosité des
ppVHC exprimant une glycoprotéine E2 mutée aux positions 417, 476, 532 ou 658 suggère que ces N-glycanes
243
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
revue générale
jouent un rôle modulateur dans l’entrée virale. À partir de
ces résultats, plusieurs hypothèses peuvent être émises.
L’une d’elle est l’implication des glycoprotéines E1 et E2
dans les mécanismes de fusion membranaire qui permettent l’entrée des virus enveloppés dans les cellules hôtes.
En effet, les virus enveloppés ont mis en place différents
mécanismes pour entrer dans leurs cellules cibles. Un de
ces mécanismes passe par l’endocytose du virus après son
attachement à un récepteur cellulaire. Différentes étapes
constituent le processus de l’entrée virale dont l’une est la
fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire
(revue dans [33]). Les mécanismes de l’entrée virale sont
contrôlés par les glycoprotéines d’enveloppe qui subissent
des modifications conformationnelles importantes permettant la fusion des membranes cellulaires et virales. Les
protéines impliquées dans cette fusion membranaire ont
été appelées « protéines de fusion » et l’étude des mécanismes d’entrée des différentes familles de virus enveloppés a permis de définir des protéines de fusion de classe I
et des protéines de fusion de classe II [34]. Actuellement,
les glycoprotéines d’enveloppe du VHC ont été intégrées à
la famille des protéines de fusion de classe II [35]. Dans
ce cas, la glycoprotéine E2 serait la protéine de fusion
proprement dite et la glycoprotéine E1 la protéine accessoire. Pourtant, l’activité fusogène des glycoprotéines E1
et E2 du VHC fait encore l’objet de nombreuses controverses qui ne sont pas tranchées. Nos résultats suggèrent
que les glycanes en position 209 de E1 et 423 et 448 de E2
sont impliqués dans l’activité fusogène des glycoprotéines
d’enveloppe ou dans les interactions entre les particules
virales et leurs récepteurs et/ou co-récepteurs. Nos résultats ont montré que les glycanes présents à ces positions
ne semblent pas impliqués dans les interactions avec
CD81. D’autres études sont cependant nécessaires pour
tester les interactions entre les mutants de glycosylation et
les autres candidats récepteurs du VHC connus pour le
moment.
Perspectives
Comme nous venons de le voir, les N-glycanes associés
aux glycoprotéines E1 et E2 du VHC jouent un rôle essentiel à la fois dans le repliement des glycoprotéines mais
aussi dans l’entrée virale. C’est pourquoi les glycoprotéines E1 et E2 peuvent être la cible de nouvelles molécules
thérapeutiques anti-VHC. En effet, la cyanovirine-N est
une molécule qui présente une activité antivirale initialement démontrée pour le VIH-1 et le VIH-2 [36], puis pour
d’autres virus tels que le virus Influenza A [37]. L’activité
antivirale de la cyanovirine–N est basée sur sa capacité à
bloquer certains N-glycanes (les glycanes de type Man-8
et Man-9) présents sur les glycoprotéines d’enveloppe.
L’analyse des glycanes associés aux glycoprotéines E1 et
244
Tableau 2. Impact de la mutation des N-glycanes portés par E1
et E2 sur l’infectiosité des ppVHC.
Position des sites
de glycosylation
Pourcentage
d’infectiosité
des ppVHC
Groupe
Interprétation
E1
196
209
234
305
36 %
20 %
74,5 %
23 %
2
2
1
2
Défaut de repliement
Entrée virale ?
Défaut de repliement
E2
417
41 %
2
423
430
448
476
532
540
556
576
623
658
0
100 %
0
71 %
68 %
100 %
0
91 %
0
27 %
3
1
3
1
1
1
3
1
3
2
Modulation de
l’entrée virale ?
Entrée virale ?
Entrée virale ?
Défaut de repliement
Défaut de repliement
Défaut de repliement
Modulation de
l’entrée virale ?
Les positions des sites de glycosylation sont numérotées en fonction des
positions sur la souche H de génotype 1a de référence. Les pourcentages
d’infectiosité sont obtenus en comparant l’infectiosité des ppVHC exprimant chaque mutant de glycosylation à celle de ppVHC exprimant les
glycoprotéines E1 et E2 sauvages. Ces pourcentages d’infectiosité ont
permis de définir trois groupes (de 1 à 3, voir texte). L’interprétation des
résultats d’infectiosité des ppVHC est présentée dans la dernière colonne.
E2 du VHC a montré qu’ils étaient de type oligomannosidique [9]. Une analyse plus précise des glycanes associés
à E1E2 a montré la présence de trois types d’oligosaccharides : Man9, Man8 et Man7GlcNAc2 [38]. Ces structures
pourraient donc être bloquées par le cyanovirine-N. Il a
été montré que, in vitro, la cyanovirine-N bloque l’infectiosité de ppVHC exprimant les glycoprotéines E1 et E2
du VHC [39]. Testée dans un nouveau système de culture
cellulaire qui permet d’amplifier de façon reproductible et
satisfaisante le VHC [23], la cyanovirine-N empêche
l’infection des cellules par le VHC [39]. Les auteurs de
cette étude ont montré que l’activité antivirale de la
cyanovirine-N est liée au blocage des interactions entre la
glycoprotéine E2 du VHC et la protéine cellulaire CD81.
D’autres essais sont maintenant nécessaires pour confirmer l’effet antiviral de la cyanovirine-N et évaluer son
intérêt dans la prise en charge des patients infectés chroniquement par le VHC.
Remerciements. Les auteurs remercient J. Dubuisson
(CNRS-UMR 8161, Institut de biologie de Lille) d’avoir
accueilli Anne Goffard en thèse de sciences qui a servi de
base à cette synthèse, et pour la relecture critique de ce
travail et l’autorisation de la reproduction des figures.
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
Protéines d’enveloppe du VHC
Références
1. Penin F, Dubuisson J, Rey FA, Moradpour D, Pawlotsky JM. Structural biology of hepatitis C virus. Hepatology 2004 ; 39 : 5-19.
2. Dubuisson J, Hsu HH, Cheung RC, Greenberg HB, Russell DG,
Rice CM. Formation and intracellular localization of hepatitis C virus
envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and
Sindbis viruses. J Virol 1994 ; 68 : 6147-60.
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
3. Kasturi L, Eshleman JR, Wunner WH, Shakin-Eshleman SH. The
hydroxy amino acid in an Asn-X-Ser/Thr sequon can influence N-linked
core glycosylation efficiency and the level of expression of a cell surface
glycoprotein. J Biol Chem 1995 ; 270 : 14756-61.
4. Shakin-Eshleman SH, Spitalnik SL, Kasturi L. The amino acid at the
X position of an Asn-X-Ser sequon is an important determinant of
N-linked core-glycosylation efficiency. J Biol Chem 1996 ; 271 : 6363-6.
5. Mellquist JL, Kasturi L, Spitalnik SL, Shakin-Eshleman SH. The
amino acid following an asn-X-Ser/Thr sequon is an important determinant of N-linked core glycosylation efficiency. Biochemistry 1998 ; 37 :
6833-7.
6. Hendrick JP, Hartl FU. The role of molecular chaperones in protein
folding. FASEB J 1995 ; 9 : 1559-69.
7. Ou WJ, Cameron PH, Thomas DY, Bergeron JJ. Association of folding intermediates of glycoproteins with calnexin during protein maturation. Nature 1993 ; 364 : 771-6.
8. Freedman RB, Hirst TR, Tuite MF. Protein disulphide isomerase :
building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci 1994 ; 19 :
331-6.
9. Deleersnyder V, Pillez A, Wychowski C, et al. Formation of native
hepatitis C virus glycoprotein complexes. J Virol 1997 ; 71 : 697-704.
10. Choukhi A, Ung S, Wychowski C, Dubuisson J. Involvement of
endoplasmic reticulum chaperones in the folding of hepatitis C virus
glycoproteins. J Virol 1998 ; 72 : 3851-8.
11. Dubuisson J, Duvet S, Meunier JC, et al. Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 is dependent on the presence of a downstream sequence on the viral polyprotein. J Biol Chem 2000 ; 275 :
30605-9.
12. Michalak JP, Wychowski C, Choukhi A, et al. Characterization of
truncated forms of hepatitis C virus glycoproteins. J Gen Virol 1997 ;
78 : 2299-306.
13. Cocquerel L, Op de Beeck A, Lambot M, et al. Topological changes
in the transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins. Embo J 2002 ; 21 : 2893-902.
14. Brazzoli M, Helenius A, Foung SK, Houghton M, Abrignani S,
Merola M. Folding and dimerization of hepatitis C virus E1 and E2
glycoproteins in stably transfected CHO cells. Virology 2005 ; 332 :
438-53.
15. Dubuisson J, Rice CM. Hepatitis C virus glycoprotein folding :
disulfide bond formation and association with calnexin. J Virol 1996 ;
70 : 778-86.
16. Goffard A, Dubuisson J. Glycosylation of hepatitis C virus envelope
proteins. Biochimie 2003 ; 85 : 295-301.
17. Meunier JC, Fournillier A, Choukhi A, et al. Analysis of the glycosylation sites of hepatitis C virus (HCV) glycoprotein E1 and the influence
of E1 glycans on the formation of the HCV glycoprotein complex. J Gen
Virol 1999 ; 80 : 887-96.
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007
18. Zhang M, Gaschen B, Blay W, et al. Tracking global patterns of
N-linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins : HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin. Glycobiology 2004 ; 14 : 1229-46.
19. Kato N, Ootsuyama Y, Tanaka T, et al. Marked sequence diversity in
the putative envelope proteins of hepatitis C viruses. Virus Res 1992 ;
22 : 107-23.
20. Goffard A, Callens N, Bartosch B, et al. Role of N-linked glycans in
the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J Virol 2005 ;
79 : 8400-9.
21. Nakano I, Fukuda Y, Katano Y, Hayakawa T. Conformational epitopes detected by cross-reactive antibodies to envelope 2 glycoprotein of
the hepatitis C virus. J Infect Dis 1999 ; 180 : 1328-33.
22. Slater-Handshy T, Droll DA, Fan X, Di Bisceglie AM, Chambers TJ.
HCV E2 glycoprotein : mutagenesis of N-linked glycosylation sites and
its effects on E2 expression and processing. Virology 2004 ; 319 : 36-48.
23. Wakita T, Pietschmann T, Kato T, et al. Production of infectious
hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med
2005 ; 11 : 791-6.
24. Cocquerel L, Voisset C, Dubuisson J. Hepatitis C virus entry : potential receptors and their biological functions. J Gen Virol 2006 ; 87 :
1075-84.
25. Pileri P, Uematsu Y, Campagnoli S, et al. Binding of hepatitis C virus
to CD81. Science 1998 ; 282 : 938-41.
26. Levy S, Todd SC, Maecker HT. CD81 (TAPA-1) : a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system. Annu
Rev Immunol 1998 ; 16 : 89-109.
27. Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus : cytofluorimetric
assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc Natl
Acad Sci USA 1996 ; 93 : 1759-63.
28. Flint M, Thomas JM, Maidens CM, et al. Functional analysis of cell
surface-expressed hepatitis C virus E2 glycoprotein. J Virol 1999 ; 73 :
6782-90.
29. Owsianka AM, Timms JM, Tarr AW, et al. Identification of conserved residues in the e2 envelope glycoprotein of the hepatitis C virus that
are critical for CD81 binding. J Virol 2006 ; 80 : 8695-704.
30. Bartosch B, Dubuisson J, Cosset FL. Infectious hepatitis C virus
pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. J Exp Med 2003 ; 197 : 633-42.
31. Hsu M, Zhang J, Flint M, et al. Hepatitis C virus glycoproteins
mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles.
Proc Natl Acad Sci USA 2003 ; 100 : 7271-6.
32. Op De Beeck A, Voisset C, Bartosch B, et al. Characterization of
functional hepatitis C virus envelope glycoproteins. J Virol 2004 ; 78 :
2994-3002.
33. Hernandez LD, Hoffman LR, Wolfsberg TG, White JM. Virus-cell
and cell-cell fusion. Annu Rev Cell Dev Biol 1996 ; 12 : 627-61.
34. Earp LJ, Delos SE, Park HE, White JM. The many mechanisms of
viral membrane fusion proteins. Curr Top Microbiol Immunol 2005 ;
285 : 25-66.
35. Yagnik A, Lahm A, Meola A, et al. A model for the hepatitis C virus
envelope glycoprotein E2. Proteins 2000 ; 40 : 355-66.
245
revue générale
36. Boyd MR, Gustafson KR, McMahon JB, et al. Discovery of
cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120 : potential
applications to microbicide development. Antimicrob Agents Chemother
1997 ; 41 : 1521-30.
39. Helle F, Wychowski C, Vu-Dac N, Gustafson KR, Voisset C, Dubuisson J. Cyanovirin-N inhibits hepatitis C virus entryby binding to envelope protein glycans. J Biol Chem 2006 ; 281 : 25177-83.
40. Helenius A, Aebi M. Intracellular functions of N-linked glycans.
Science 2001 ; 291 : 2364-9.
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
37. O’Keefe BR, Smee DF, Turpin JA, et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrob Agents Chemother 2003 ; 47 : 2518-25.
38. Duvet S, Cocquerel L, Pillez A, et al. Hepatitis C virus glycoprotein
complex localization in the endoplasmic réticulum involves a determinant for retention and not retrieval. J Biol Chem 1998 ; 273 : 32088-95.
246
Ann Biol Clin, vol. 65, n° 3, mai-juin 2007