IDEIA Lyme Neuroborreliosis

Key Code TSMX7840B
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
US 1 855 2360 190
ROW +31 20 794 7071
compare les différences de la valeur de DO entre des échantillons
de LCR et de sérum6.
dosé pour des utilisations ultérieures (voir la Section 8.2.11).
En raison de l’immunocapture sélective des anticorps des classes
IgG et IgM, il n’y a aucune interférence par compétition de la
part des autres classes d’immunoglobuline. L’usage d’antigène
diagnostique conjugué empêche aussi toute interférence de la
part du facteur rhumatoïde (FR).
Prêt à l'usage. Conserver le Contrôle Positif IgG non utilisé à 2-8°C.
4.
DEFINITIONS
Les symboles suivants sont utilisés dans l’ensemble des
informations relatives au produit..
5.2.6
IDEIA Lyme
Neuroborreliosis
K602811-2 �����������������������������������������
Numéro de référence
Dispositif médical de diagnostic in vitro
96
Consulter le mode d’emploi
FR
Limite de température
(température de conservation)
Dosage immuno-enzymatique pour la détermination des
anticorps IgG et IgM intrathécaux humains dirigés contre Borrelia
burgdorferi sensu lato.
Contenu suffisant pour "n" tests
N
1.
USAGE PREVU
Le kit IDEIA™ Lyme Neuroborréliose est un dosage
immunoenzymatique qui sert à détecter la présence d’anticorps
des classes IgG et IgM humaines et dirigés contre Borrelia
burgdorferi sensu lato. Ce kit est conçu pour aider à établir le
diagnostic de la maladie de Lyme.
2.
RESUME
La maladie de Lyme est une infection polysystémique causée par
le spirochète B. burgdorferi sensu lato et transmise par piqûre
de tique1,2.
La neuroborréliose, qui implique le système nerveux, est une
manifestation courante et grave de la borréliose de Lyme3.
Il est nécessaire d’effectuer un test diagnostique sensible et
fiable pour détecter la neuroborréliose, d’une part parce qu’il
existe un certain nombre d’autres maladies qui produisent
des symptômes analogues, et d’autre part parce que la
neuroborréliose, contrairement à plusieurs de ces maladies,
répond à l’antibiothérapie.
Actuellement, le meilleur indicateur d’une neuroborréliose
évolutive est l’observation d’un changement de nature
inflammatoire au niveau du liquide céphalo-rachidien (LCR), qui se
manifeste particulièrement sous la forme d’une augmentation du
nombre de cellules mononucléaires (pléocytose mononucléaire),
associée à l’apparition d’anticorps spécifiques de Borrelia produits
dans le LCR. La détection d’une réaction immunitaire intrathécale
spécifique est plus importante au point de vue diagnostique que
la mesure des anticorps spécifiques dans le sérum. Qui plus est,
en ce qui concerne la neuroborréliose, la synthèse des anticorps
spécifiques est souvent détectée plus tôt dans le LCR que dans
le sérum4,5.
Code de lot (numéro de lot)
A utiliser avant le (date de péremption)
Fabriqué par
Ajouter de l’eau
5.
REACTIFS FOURNIS
Normalement les teneurs en IgG et en IgM totales du LCR sont
très faibles par rapport à celles obtenues dans le sérum. De ce
fait, quand il y a production intrathécale d’anticorps spécifiques
de B. burgdorferi, la quantité d’anticorps IgG ou IgM spécifiques
dans le LCR représentera un pourcentage bien plus important
de la quantité totale d’IgG et d’IgM, respectivement, que les
pourcentages trouvés dans le sérum. S’il n’y a pas production
d’anticorps spécifiques intrathécaux, ou si la présence
d’anticorps spécifiques dans le LCR est la conséquence soit d’une
contamination du sang, soit d’une transsudation en provenance
du sérum, la valeur de DO pour le LCR moins la valeur de DO pour
le sérum sera <0.
Par conséquent, dans le cas de la neuroborréliose, on obtiendra
une valeur de DO beaucoup plus élevée pour le LCR que pour
l’échantillon de sérum. Dans de tels cas, la valeur de DO pour le
LCR moins la valeur de DO pour le sérum sera, de ce fait, >0.
La comparaison entre les valeurs de DO des échantillons sérum
et LCR, analysées en série, permet de déterminer si des anticorps
spécifiques de B. burgdorferi ont été ou non produits. La formule
pour calculer les résultats de l’analyse a été conçue de manière à
prendre en considération toute variation intra-dosage lorsque l’on
Conjugué Flagellaire, Peroxydase et Tampon de
/
/
Reconstitution -
Reconstituer le Conjugué Flagellaire de Borrelia lyophilisé
biotinylé avec le Tampon de Reconstitution et ajouter 650µL
de Complexe Peroxydase. Mélanger en agitant le flacon par
renversements successifs. Le Conjugué flagellaire reconstitué
doit être préparé au moins une heure avant utilisation. Le
Conjugué Flagellaire Reconstitué doit être conservé entre 2-8°C
et utilisé dans les trois mois.
5.2.8
Solution d'arrêt -
Prête à l’emploi. Conserver la Solution d'Arrêt non utilisée à 2-8°C.
6.
AUTRES REACTIFS
6.1. REACTIFS
Eau fraîchement désionisée ou distillée.
7.
MATERIEL
Le matériel suivant est nécessaire:
Eprouvette graduée (2L)
Tubes à essais d'une capacité approximative de 5mL
Micropipettes de précision et embouts jetables permettant de
dispenser des volumes de 10 à 1000µL
5.1.
Agitateur de plaque de microtitration pouvant atteindre une
vitesse minimale de 500rpm et doté d’un diamètre orbital de 3
à 4mm. Pour connaître les agitateurs de plaque compatibles,
veuillez contacter votre distributeur local(e).
CONTENU DU TEST IDEIA LYME NEUROBORRELIOSIS
Un livret d’instructions d’utilisation.
48 micro-puits (6 barrettes de 8 micro-puits)
revêtus d’anticorps anti-IgG humaines (couleur
verte). 48 micro-puits (6 barrettes de 8 micropuits) revêtus d’anticorps anti-IgM humaines
(couleur jaune). Les micro-puits non utilisés
peuvent être conservés dans une poche en
plastique refermable hermétiquement fournie
à cet effet.
Un flacon de chacun des produits suivants:
100mL Diluant pour Echantillon: Solution
tamponnée avec agent anti-microbien et
couleur rouge.
50mL Tampon de Lavage concentré x25:
Solution tamponnée avec détergent et agent
anti-microbien.
1,5mL Contrôle Positif IgG: Sérum humain
dans une solution tampon avec agent antimicrobien et colorant vert.
1,5mL Contrôle Positif IgM: Sérum humain
dans une solution tampon avec agent antimicrobien et colorant jaune.
Conjugué Flagellaire lyophilisé: flagelles de
B. afzelii biotinylés à reconstituer avant usage
avec la solution tampon de reconstitution
et formant un complexe avec un conjugué
streptavidine-peroxydase.
12,5mL Tampon de Reconstitution: solution
tamponnée avec agent anti-microbien and
colorant bleu.
1mL Complexe Peroxydase: Conjugué
streptavidine-peroxydase dans une solution
tampon contenant des protéines porteuses
et un agent anti-microbien.
12mL Substrat: peroxyde stabilisé et
3,3’-5,5’-tétraméthylbenzidine dans une
solution tampon diluée. Le substrat TMB
n’est pas carcinogène. Cependant, il convient
de porter un équipement de protection
personnelle, afin d’éviter toute exposition
directe.
25mL Solution d’Arrêt: Acide sulfurique
0,46mol/L.
5.2.
PREPARATION, CONSERVATION ET REUTILISATION DES
CONSTITUANTS DU KIT
Le format de kit IDEIA Lyme Neuroborreliosis permet de pratiquer
jusqu’à 6 cycles individuels pendant une période de 3 mois avant
la date de péremption. Pour des performances optimales, il
convient de préparer et de conserver les composants du kit
inutilisés en respectant les consignes suivantes:
5.2.1
Micro-puits -
Ouvrir la poche contenant la microplaque en coupant le long du
joint. Détacher le nombre requis de barrettes anti-IgG humaines
(code couleur vert) et de barrettes anti-IgM humaines (code
couleur jaune) et les replacer sur le cadre. Chaque barrette
permet le dosage en double réplique du LCR et du sérum d’un
patient; les quatre micropuits restants de la barrette sont utilisés
pour le Contrôle Positif et le tampon. Chaque barrette IgG et IgM
supplémentaire permet d’analyser des échantillons en paire de
deux patients. Il est possible de détecter les anticorps de la classe
des IgG et des IgM dans les échantillons de LCR et de sérum de
11 patients en utilisant un cadre complet de 6 barrettes IgG et de
6 barrettes IgM.
Papier absorbant propre (pour sécher les micropuits en les
tapotant)
Couvercle en plastique pour la plaque à micro-puits
Minuterie
Appareil automatique de lavage pour microplaques (facultatif)
ou matériel adapté au lavage de 8 barrettes de micropuits (voir
la Section 10.2.3).
Remarque: si moins de 8 micropuits de test doivent être lavés
dans un laveur automatique équipé d’un support pour 8
micropuits, il faut veiller à remplir entièrement la barrette à
l’aide de micropuits vides.
Spectrophotomètre ou lecteur de plaques EIA capable de lire
l’absorbance à 450nm (longueur d’onde de référence de 620650nm) sur une plaque à 96 micropuits répartis en barrettes de
8 puits. (facultatif: voir la Section 10,3 intitulée Interprétation des
résultats).
Il existe pour ce test des Notes d’Application pour l’utilisation
sur des systèmes automatisés ouverts. Veuillez contacter votre
distributeur local(e).
8.
PRECAUTIONS
- Pour usage diagnostique in vitro. L’utilisateur doit
maitriser les procédures générales de laboratoire et être
spécifiquement formé pour I’emploi de ce test.
8.1. PRECAUTIONS DE SECURITE
8.1.1
Le sérum utilisé dans la préparation des contrôles
positifs a été testé séparément et est négatif aux
antigènes de surface du virus de l’hépatite B et aux
anticorps anti-VIH et anti-hépatite C. Cependant, les
contrôles positifs doivent tout de même être considérés
comme des matériaux potentiellement infectieux.
8.1.2
La Solution d'Arrêt contient de l'acide sulfurique
(0,46mol/L). Eviter le contact avec la peau et les yeux
en portant un vêtement de protection approprié et un
appareil de protection des yeux.
8.1.3
Ne pas manger, boire, fumer, conserver ou préparer des
aliments ni se maquiller dans la zone de travail.
8.1.4
Ne pas pipetter à la bouche.
8.1.5
Porter des gants jetables pour manipuler les échantillons
cliniques et toujours se laver les mains après avoir
travaillé avec des échantillons infectieux.
8.1.6
Éliminez l’ensemble des échantillons cliniques et des
contrôles positifs conformément à la législation en
vigueur.
8.1.7
Fiche toxicologique disponible pour les utilisateurs
professionnels, sur demande.
8.1.8
Le substrat de TMB contient de la 1-méthyl-2pyrrolidone (NMP) à une concentration >5 % et <10 %,
classifiée comme un danger par la règlementation de
la Communauté européenne (CE) en vigueur. Voici les
mentions de danger (H) et les conseils de prudence (P)
appropriés.
DANGER
H360
Peut nuire à la fertilité ou au fœtus.
P201
Se procurer les instructions avant
utilisation.
P202
Ne pas manipuler avant d’avoir lu et
compris toutes les précautions de
sécurité.
P281
Utiliser l’équipement de protection
individuel requis.
P308+P313 EN CAS d’exposition prouvée ou
suspectée: consulter un médecin.
Prêt à l'emploi. Conserver le Diluant non utilisé à 2-8°C.
8.2. PRECAUTIONS DE NATURE TECHNIQUE
8.2.1
Les constituants ne doivent pas être utilisés après la
date limite d'utilisation indiquée sur les étiquettes. Ne
pas mélanger ou interchanger les divers portions/lots
de réactifs, à l'exception des réactifs types (Diluant
pour Echantillons, solution Tampon de Lavage, Substrat
et Solution d'Arrêt) qui sont aussi utilisés dans les kits
IDEIA Borrelia burgdorferi IgG (Réf. No. K602911-2) et
IDEIA Borrelia burgdorferi IgM (Réf. No. K603011-2).
5.2.3
8.2.2
Les réactifs sont fournis à des concentrations dosées
fixes. Les performances du test seront altérées si les
réactifs sont modifiés ou conservés dans des conditions
autres que celles décrites dans la Section 5.2.
8.2.3
Eviter toute contamination des réactifs.
8.2.4
Utiliser des pipettes ou des embouts de pipette
jetables individuels pour chaque échantillon, témoin
ou réactif afin d'éviter la contamination croisée soit des
échantillons, soit des témoins, car cela donnerait des
résultats erronés.
Placer les micropuits inutilisés dans la poche plastique refermable,
avec le dessiccateur, refermer la poche soigneusement et la
conserver entre 2-8°C. Il est possible d’utiliser les micropuits
pendant les 12 semaines qui suivent la première ouverture, à
condition qu’ils soient conservés de la sorte.
5.2.2
Diluant pour Echantillons Solution Tampon de Lavage Concentrée -
Fournie concentrée x25. Préparer une solution de lavage
fraîchement dosée en ajoutant une unité de Tampon de Lavage
concentré à 24 unités d'eau fraîchement désionisée ou distillée
(ou ajouter le contenu du Tampon de Lavage concentré à 1200mL
d’eau fraîchement désionisée ou distillée). Reconstituer la
solution de Lavage Tamponnée fraîchement dosée, en fonction
des besoins, le jour de son utilisation. Stocker le concentré
inutilisé à une température comprise entre 2-8°C.
Ne pas conserver le reste du Tampon de Lavage fraîchement
8.2.6
Stocker l’eau désionisée ou distillée destinée à la dilution
des réactifs concentrés dans des conteneurs propres
afin d’empêcher toute contamination microbienne.
8.2.7
Ne pas utiliser un substrat qui a une couleur bleue avant
de l'ajouter aux micro-puits.
8.2.8
Protéger le Substrat de la lumière.
8.2.9
Ne pas réutiliser les micro-puits.
8.2.10
Le matériel de lavage manuel ou automatique ne doit
présenter aucune contamination microbienne, et il
doit être étalonné et entretenu conformément aux
instructions du fabricant.
8.2.11
Ne pas conserver le Tampon de Lavage fraîchement
dosé inutilisé en vue d’une utilisation future. Lorsqu’ils
ne sont pas utilisés, les réservoirs à Tampon de Lavage
doivent être rincés avec de l’eau désionisée ou distillée,
puis sécher à l’air libre.
Substrat -
Prêt à l’emploi. Conserver le Substrat non utilisé à 2-8°C.
Réservoirs à réactifs pour la pipette à 8 canaux (facultatif)
3.
PRINCIPE DU DOSAGE
Le test a pour base le principe de capture ELISA et consiste en un
dosage par capture d’IgG humaine et d’un dosage par capture
d’IgM humaine, pour détecter la présence d’anticorps des classes
IgG et IgM produits et dirigés contre B. burgdorferi. Le dosage par
capture d’IgG humaine est décrit en détail:
Le dosage par capture d’IgM humaine est analogue au dosage par
capture d’IgG humaine, à la seule différence que les micro-puits
sont revêtus d’anticorps de capture anti-IgM humaine.
Prêt à l'usage. Conserver le Contrôle Positif IgM non utilisé à
2-8°C.
5.2.7
Eviter la contamination avec des ions métal et des
agents oxydants.
Contrôle Positif IgM -
Pipette à 8 canaux pour fournir 100µL (facultatif)
Le test utilise le flagelle de la souche DK1 de B.afzelii natif purifié
comme antigène diagnostique. Ce flagelle est extrêmement
immunogène, provoque une réaction immunitaire précoce,
prononcée et persistante7,8 et constitue l’antigène principal pour
la réaction des anticorps intrathécaux9,10. Comparé à l’antigène
classique, qui est à base d’extrait cellulaire du spirochète
entier, l’antigène flagelle natif et purifié améliore la sensibilité
diagnostique et la spécificité des dosages sérologiques pour
la borréliose de Lyme5,11. Qui plus est, on peut se servir des
flagelles comme antigène diagnostique dans toutes les régions
géographiques étant donné que les flagelles d’une souche de
B. burgdorferi ne diffèrent pas beaucoup de ceux d’une autre
souche de cette même bactérie.
Après lavage des micro-puits pour éliminer tout excès de
protéine, on verse dans les micro-puits un complexe de flagelles
de Borrelia natif biotinylé et d’un conjugué streptavidineperoxydase (Conjugué flagellaire). Le conjugué flagellaire sera lié
à l’IgG spécifique de B. burgdorferi uniquement tandis que l’IgG
non spécifique de B. burgdorferi ne se fixera pas à l’anticorps
flagellaire. Le conjugué flagellaire en excès est éliminé par
lavage. La quantité de conjugué flagellaire liée par micropuits est
visualisée par ajout d’un substrat chromogène, ce qui entraîne
une coloration bleue. La réaction est interrompue en ajoutant de
l’acide, ce qui fait virer la couleur du bleu au jaune. L’intensité
de la coloration correspond à la teneur en IgG spécifique de B.
burgdorferi capturée à la phase solide de l’échantillon.
5.2.5
8.2.5
Contrôle Positif IgG -
96 - Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour
permettre 96 déterminations. La date de péremption du kit est
indiquée sur l’étiquette extérieure de la boîte. Conserver les
composants non utilisés à une température comprise entre 2 et
8 °C.
Le kit IDEIA Lyme Neuroborréliose est conçu pour la détection
sensible et directe des anticorps des classes IgG et IgM humaines
produits et dirigés contre B. burgdorferi 6. Il n’est pas nécessaire
de mesurer des substances de référence (comme l’albumine,
etc.) et d’apporter des corrections compliquées en raison de
la transsudation des anticorps sériques dans le LCR causée
par les dégâts au niveau de la barrière sang-LCR. Même une
contamination sanguine du LCR pendant une ponction lombaire
ne donnera pas des résultats faussement positifs.
Des échantillons de LCR et de sérum de patient sont placés dans
des micro-puits revêtus d’anticorps spécifiques de l’IgG humaine.
La dilution du LCR et du sérum garantit que l‘anticorps de capture
anti-IgG humaine soit saturé avec l’IgG du LCR ou avec l’IgG
sérique. De ce fait, on capture la même quantité d’IgG totale à
partir du LCR ou du sérum dans les micro-puits.
5.2.4
PRELEVEMENT
ET
CONSERVATION
DES
ECHANTILLONS
9.1. PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS
Le kit IDEIA Lyme Neuroborréliose permet d'analyser
simultanément des échantillons humains de LCR et de sérum. Ces
échantillons de LCR et sérum doivent être prélevés chez le patient
au même moment. Il est nécessaire de recueillir un minimum
de 0,5mL, et de préférence 1 à 2mL, de LCR, car cette quantité
permettra de répéter l'analyse et/ou la performance de l'analyse
avec une dilution de LCR plus faible. En ce qui concerne le sérum,
0,5mL suffit.
9.
L'analyse d'échantillons troubles et visqueux peut donner des
résultats douteux dûs à des erreurs lors du prélèvement à la
pipette.
Les échantillons de LCR et de sérum peuvent être conservés
pendant 14 jours à 2-8°C avant d'être analysés, et pendant un
minimum de 6 mois à une température de –20°C ou inférieure.
9.2. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Diluer les échantillons de LCR 1+4 en ajoutant 100µL de LCR à
400µL de Diluant pour Echantillons.
Diluer les échantillons de sérum 1+200 en ajoutant 10µL de
sérum à 2mL de Diluant pour Echantillons.
10.
PROCEDURE D'ANALYSE
VEUILLEZ VOUS RÉFÉRER À LA SECTION 8.2, PRÉCAUTIONS
DE NATURE TECHNIQUE, AVANT DE SUIVRE LA PROCÉDURE
D'ANALYSE.
10.1. NOTES RELATIVES A LA PROCEDURE
10.1.1 Les réactifs types (Diluant pour Echantillons, Solution
Tampon de Lavage Concentrée, Substrat, et la Solution
d'Arrêt) et une procédure d'analyse analogue sont aussi
utilisés pour les kits IDEIA Borrelia burgdorferi IgM
(réf. K603011-2) et IDEIA Borrelia burgdorferi IgG (réf.
K602911-2). Cela permet de pouvoir effectuer les trois
essais en parallèle.
10.1.2 La validation de la performance du dosage a pour base
l'analyse en double simultanée de tous les échantillons.
Si les échantillons du patient ne doivent être analysés
qu'une seule fois, il est recommandé aux utilisateurs de
ne pratiquer l’analyse qu'après s'être familiarisés avec
les caractéristiques de la performance du dosage. La
variation intra-dosage (CV%) est approximativement
50% plus marquée lorsqu’on se fonde sur une seule
détermination.
10.1.3 Si l'on ne dispose pas d'un agitateur fonctionnant à 500
tours/minute, la vitesse d'agitation des barrettes de
micro-puits pendant les 2 étapes d'incubation peut être
réduite à 300 tours/minute, sans que la performance
du dosage ne soit affectée; un protocole d’incubation
statique est également disponible. Pour toute
information complémentaire concernant des protocoles
adéquats, veuillez contacter votre distributeur local(e).
10.2. PROCEDURE DU DOSAGE
REMARQUE: La procédure de dosage exige l’utilisation d’un
agitateur de plaque de microtitration. Pour connaître les
agitateurs compatibles, veuillez contacter votre distributeur
local(e).
En cas d’utilisation de barrettes multiples, il est recommandé
d’avoir recours à une pipette à 8 canaux pour l’ajout du Conjugué,
du Substrat et de la Solution d’Arrêt.
10.2.1 Ajout d’échantillons et de contrôles
Placer le nombre de micropuits nécessaire sur le support de
micropuits. Ajouter 100µL de LCR et de sérum de patient dilués
à des micropuits en double de la barrette verte anti-IgG et de la
barrette jaune anti-IgM. Ajouter 100µL de Contrôle Positif IgG
à deux micropuits anti-IgG et 100µL du Contrôle Positif IgM à
deux micropuits anti-IgM. Ajouter le Diluant pour Echantillon
aux micropuits distincts IgG et IgM. (Au moins un micropuits
de Diluant pour Echantillon doit être inclus à chaque lot
d’échantillons testé).
10.2.2 Incubation des échantillons
Recouvrir les micropuits et laisser incuber dans un agitateur
à température ambiante (20-25°C) sous agitation pendant
60 minutes.
10.2.3 Lavage des micropuits
Laver les micropuits à l’aide de Tampon de Lavage fraîchement
dosé (voir la Section 5.2.3).
La technique de lavage utilisée a un impact majeur sur les
performances du test. Veiller à complètement remplir (avec au
moins 350µL de Tampon de Lavage fraîchement dosé) puis vider
les puits.
Il est primordial de réaliser quatre cycles de lavage, à l’aide de
techniques automatiques ou manuelles, comprenant une période
d’imprégnation de 2 minutes lors du deuxième lavage, ou une
période d’imprégnation totale de 2 minutes sur l’ensemble du
cycle.
Lavage manuel
En cas de lavage manuel des micropuits, aspirer ou faire tomber
le contenu des micropuits. Utiliser ensuite du Tampon de Lavage
fraîchement dosé pour remplir complètement les micropuits,
puis les vider entièrement.
Entre chaque étape du processus de lavage, veiller à ôter tout
Tampon de Lavage restant en tapotant les micropuits renversés
sur un morceau de papier absorbant propre. L’efficacité d’un
lavage manuel est accrue si le Tampon de Lavage est introduit
de façon inclinée afin de produire un vortex dans les micropuits.
Après le dernier lavage, la plaque doit être renversée et tapotée
sur du papier absorbant afin de faire disparaître toute trace de
Tampon de Lavage.
Lavage automatique
Les appareils de lavage automatiques doivent être programmés
pour effectuer quatre cycles de lavage et pour inclure une période
d'imprégnation de 2 minutes sur l’ensemble du cycle de lavage.
Les appareils de lavage doivent être correctement étalonnés afin
d’assurer un remplissage et un vidage complets des micropuits
entre chaque lavage. Après le dernier lavage, la plaque doit
être renversée et tapotée sur du papier absorbant pour faire
disparaître toute trace de Tampon de Lavage.
Résultat positif pour la production d'anticorps IgG intrathécaux
dirigés contre B. burgdorferi:
10.2.4 Ajout de conjugué
Mélanger le Conjugué Flagellaire en agitant le flacon par
renversements successifs. Ajouter 100µl de Conjugué Flagellaire
dans chaque micropuits.
I IgM <0,3
ou
DO lcr <0,150
Résultat positif pour la production d'anticorps IgM intrathécaux
dirigés contre B. burgdorferi:
10.2.5 Incubation du conjugué
Recouvrir les micropuits et laisser incuber dans un agitateur
à température ambiante (20-25°C) sous agitation pendant
60 minutes.
11.4.2 Interprétation Semi-quantitative
10.2.6 Lavage des micropuits
Laver les micropuits selon les instructions données en 10.2.3.
10.2.7 Ajout et incubation du substrat
Ajouter 100µL de Substrat dans chaque micropuits.
Recouvrir les micropuits et laisser incuber à température
ambiante (20-25°C) sans agiter pendant 10 minutes.
10.2.8 Arrêt de la réaction
Ajouter 100µL de Solution d’Arrêt dans chaque micropuits.
Mélanger soigneusement. Le produit coloré est stable pendant 30
minutes. Ne pas exposer à la lumière du soleil car un blanchissage
optique du produit coloré risquerait de se produire.
I IgG ≥0,3
Résultat négatif pour la production d'anticorps IgM intrathécaux
dirigés contre B. burgdorferi:
L'indice d'anticorps spécifiques est une mesure de la production
d'anticorps intrathécaux semi-quantitative très sensible parce
qu'elle est fonction du taux de la production d'anticorps
intrathécaux, de la perméabilité de la barrière sang-LCR, et de
la teneur en anticorps sériques spécifiques. Ainsi donc, dans des
échantillons post-traitement consécutifs, un changement ne doit
être considéré comme significatif que si un indice positif tombe
en-dessous de 0,3, ou s'il se divise ou se multiplie par plus de 5.
Ces valeurs ne sont données qu'à titre indicatif.
11.4.3 Commentaires Relatifs à l'Interprétation des Résultats
En outre, si le spectrophotomètre, ou le lecteur de plaque EIA,
permet l’utilisation d’une longueur d’onde de référence de 620–
650nm, une lecture à double longueur d’onde doit être effectuée
afin d’éliminer toute interférence possible causée par des
aberrations telles que la présence de poussière ou de marques
sur la surface optique des micropuits.
Résultats Positifs
Un indice IgG et/ou IgM >0,3, accompagné d'une pléocytose
mononucléaire dans le LCR, évoque très fortement la présence
d'une neuroborréliose de Lyme. (A elle seule, une valeur DOLCR élevée n'est pas indicatrice d'une production d'anticorps
intrathécaux).
10.4. RESUME DE LA PROCEDURE DE DOSAGE IDEIA LYME
NEUROBORRELIOSIS
11.
CONTROLE DE QUALITE ET INTERPRETATION DES
RESULTATS
11.1. TAMPON DE CONTRÔLE
Calculer les valeurs de DO moyennes correspondant aux deux
micro-puits pour le tampon de contrôle.
La valeur de DO moyenne du tampon de contrôle doit être
inférieure à 0,100 mais supérieure à 0,000 (lecture de longueur
d’onde double).
Si la valeur dépasse 0,100, cela peut être dû à un lavage inadéquat
ou bien à la contamination du substrat. Si la valeur est inférieure
à 0,000, le lecteur de plaques doit effectuer un nouveau blanc sur
l'air et la lecture des micro-puits doit être de nouveau réalisée.
Si les exigences du contrôle de la qualité ne sont pas satisfaites,
les résultats de l'analyse ne sont pas valides et le dosage doit être
refait.
11.2. CONTRÔLE POSITIF IgG ET CONTRÔLE POSITIF IgM
Calculer les valeurs de DO moyennes correspondant au Contrôle
positif IgG et au Contrôle Positif IgM. La différence entre les
valeurs de DO individuelles des analyses en double réplique et la
valeur de DO moyenne ne doit pas dépasser 15%.
La valeur de DO moyenne du Contrôle Positif IgG et du Contrôle
Positif IgM, respectivement, doit atteindre au moins 0,500. Si ces
valeurs sont inférieures à 0,500, cela peut être dû à un lavage
inadéquat, à une agitation inadéquate pendant les incubations,
ou à une température ambiante trop basse, tout particulièrement
pendant l'incubation avec le Substrat.
Si les exigences du contrôle de la qualité ne sont pas satisfaites,
les résultats de l'analyse ne sont pas valides et le dosage doit être
refait.
11.3. ECHANTILLONS DES PATIENTS
Calculer la DO moyenne de LCR (DOLCR) et de sérum (DOSérum)
de chaque patient, pour la détermination IgG et IgM. Les valeurs
de DO ne doivent pas varier de plus de 15% par rapport à la
moyenne. Si tel est le cas, les échantillons doivent être à nouveau
analysés. Cependant, si le résultat des deux puits analysés est
négatif, il se peut qu'une différence de plus de 15% soit acceptée
sans que l'on refasse l'analyse car des valeurs de DO basses sont
mesurées avec moins de précision.
La formule pour obtenir l'indice d'anticorps spécifiques est
donnée ci-dessous. Calculer l'indice d'anticorps spécifiques pour
IgG (IIgG) et IgM (IIgM), respectivement. Le calcul de l'indice
ne doit pas être effectué si la valeur de DO moyenne de la
détermination LCR est inférieure à 0,15. Tout résultat d'analyse
de ce genre sera considéré comme négatif.
DO lcr
Indice = x (DOLCR - DO sérum)
DO sérum
11.4. INTERPRETATION DES RESULTATS
11.4.1 Interprétation Qualitative
Interpréter les résultats de la manière suivante:
Résultat négatif pour la production d'anticorps IgG intrathécaux
dirigés contre B. burgdorferi:
ou
I IgG <0,3
DO lcr <0,150
IDEIA Lyme Neuroborréliose
Nombre de
patients
Résultat positif pour anticorps IgG intrathécaux produits
18
Résultat négatif pour anticorps IgG produits
7
Résultat positif pour anticorps IgM intrathécaux produits
12
Résultat négatif pour anticorps IgM intrathécaux produits
13
Résultat positif pour anticorps IgG et/ou IgM intrathécaux produits
19
Résultat négatif pour anticorps IgG et IgM intrathécaux produits
6
Plus la valeur de l'indice obtenu est élevée, plus la production
d'anticorps intrathécaux spécifiques est prononcée. Les valeurs
de l'indice peuvent atteindre, et même dépasser 100.
Vérifier que le fond des micropuits est propre avant de procéder
à la lecture, et vérifier qu’aucun corps étranger n’est présent dans
les micropuits. Le lecteur doit effectuer un blanc sur l'air (c'està-dire en l'absence de plaque sur le support) avant que la plaque
ne soit scannée.
La lecture photométrique des micropuits doit s'effectuer dans
les 30 minutes suivant l'ajout de la Solution d'Arrêt. Mélanger
le contenu des micropuits et lire l’absorbance de chaque puits
à l’aide d’un spectrophotomètre approprié ou d’un lecteur de
plaque EIA pouvant lire l’absorbance à 450nm.
14.
CARACTERISTIQUES SPECIFIQUES DE PERFORMANCE
On a analysé des échantillons de LCR et de sérum prélevés chez 25
patients avec une neuroborréliose de Lyme cliniquement définie
au moyen du kit IDEIA pour la Neuroborréliose de Lyme.
I IgM ≥0,3
Expression des Résultats
Théoriquement, il y a production d'anticorps intrathécaux si
DOlcr/DOsérum >1. Cependant, cette supposition n'est pas sûre
en raison de la variation intra-dosage, surtout pour les valeurs
basses de DO. La différence DO nette (DOlcr - DOsérum) donne
une information plus précise mais, en raison de la variation intradosage, la différence DO minimale indicatrice d'une synthèse des
anticorps intrathécaux augmentera au fur et à mesure que les
valeurs DO augmenteront. Ces inconvénients sont éliminés en
multipliant le rapport DO par la différence DO, tel qu'exprimé par
l'indice d'anticorps spécifiques (I). La limite inférieure de la valeur
de l'indice, soit 0,3 pour un résultat positif, garantit que DOlcr est
bien significativement plus élevée que DOsérum6.
10.3. INTERPRETATION DES RESULTATS DES TESTS
10.3.1 Lecture photométrique
d'anticorps spécifiques dans le LCR due à une transsudation en
provenance du sérum ou à une contamination sanguine du LCR
donnera des indices d'anticorps <0.
On a obtenu un indice d'anticorps spécifique >0,3 pour IgG
chez 72% et pour IgM chez 48% des 25 patients avec une
neuroborréliose de Lyme précoce. Un seul patient a eu une
synthèse spécifique d’IgM sans synthèse d’IgG concomitante.
Toutefois, certains patients avec de faibles indices IgG ont eu des
indices IgM >0,3. De ce fait, l'évidence diagnostique est accrue
en examinant les synthèses spécifiques des IgG et des IgM. On a
réussi à diagnostiquer une neuroborréliose de Lyme précoce chez
19 des 25 patients (76%) avec le kit IDEIA pour la Neuroborréliose
de Lyme.
14.1. RÉACTIVITÉ CROISÉE
Un résultat positif indique toujours une synthèse d'anticorps
dirigés contre Borrelia burgdorferi, sauf dans le cas d'échantillons
provenant de patients atteints de neurosyphilis. Ces échantillons
peuvent donner des résultats faussement positifs. Toutefois,
l'indice d'anticorps spécifiques de B. burgdorferi reste très bas.
De plus, les anticorps dans le LCR qui provoquent une réaction
croisée, et les anticorps sériques, appartiennent à la classe des
IgG3.
On ne connaît toujours pas la signification de l'activation des
lymphocytes B polyclonaux intrathécaux en tant que cause de
résultats IgM" faussement positifs"3.
15.
REFERENCES
1.
Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis
JP. (1982)
2.
Lyme disease - a tick-borne spirochetosis?
Science 216: 1317-9.
Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG,
Burgdorferi W, et al. (1983)
Un indice IgM >0,3 est d'habitude compatible avec une maladie
qui dure depuis au moins 6 mois. La synthèse d'IgM spécifique
intrathécale indique fortement la présence d'une neuroborréliose,
mais la présence d’IgM n’est pas obligatoire. Chez les patients qui
ont une neuroborréliose évolutive depuis plus de 6 mois, seule
une synthèse d'IgG spécifique apparaîtra, et on détectera un
indice IgG >0,3.
3.
The spirochetal etiology of Lyme disease.
N Engl J Med 308: 733-40.
Hansen K. (1994)
Lyme neuroborreliosis: Improvements of the laboratory diagnosis and a
survey of epidemiological and clinical features in Denmark 1985 - 1990.
Acta Neurol Scand (suppl. 151); 89: 1-44.
Stiernstedt GT, Granström M, Hederstedt B, Sköldenberg B. (1985)
Résultats Négatifs
Un résultat négatif, soit un indice IgG et IgM <0,3, accompagné
d'une pléocytose mononucléaire dans le LCR, n'exclut pas le
diagnostic clinique d'une neuroborréliose de Lyme. Cela se
produit tout particulièrement quand peu de temps s'écoule entre
l'apparition des symptômes neurologiques et le prélèvement du
sérum et du LCR.
Chez la plupart des patients non traités présentant des signes
cliniques bien définis de la neuroborréliose, les anticorps
spécifiques peuvent être détectés dans le LCR au cours de
la seconde semaine suivant l'apparition des symptômes
neurologiques6. Chez les patients avec une neuroborréliose
précoce mais qui obtiennent un résultat négatif à l'analyse, il se
peut qu'un échantillon prélevé à une date ultérieure donne un
résultat positif, même après instauration du traitement.
Un indice IgM <0,3 n'exclut pas toujours une synthèse d'IgM
spécifique. Une valeur de DO d'IgM élevée dans le LCR (>1,0),
qui est égale ou même inférieure à la valeur IgM correspondante
dans le sérum, pourrait encore indiquer la présence d'une
synthèse d'anticorps intrathécaux, si on peut exclure la possibilité
d'un trouble grave au niveau de la barrière sang-LCR6.
Echantillons post-traitement
Evaluation d'échantillons LCR/Sérum post-traitement consécutifs :
après une antibiothérapie appropriée, un indice IgM spécifique
diminuera, et après 6 à 9 mois, l'indice est d'habitude <0,3. Un
indice IgG élevé persistera parfois pendant de nombreuses
années, même si le malade est complètement rétabli.
Un indice IgG >0,3 non accompagné d'une pléocytose
mononucléaire dans le LCR est un résultat rare, si ce n'est dans
des échantillons prélevés après un traitement. De ce fait, ce
résultat pourrait indiquer qu'un épisode de neuroborréliose s'est
produit auparavant.
12.
LIMITES DE PERFORMANCE
12.1. Une contamination sanguine excessive de l'échantillon
de LCR peut donner des indices d'anticorps spécifiques
faussement bas.
12.2. En raison de la relation antigénique entre B. burgdorferi
et Treponema pallidum, il est possible que des réactions
croisées sérologiques (bien que cela soit rare) se
produisent chez des patients qui ont des antécédents de
neurosyphilis. La discrimination sérologique est possible
en se servant de l'essai d'hémagglutination passive pour
le sérodiagnostic de la syphilis (TPHA) ou de tests sur
les cardiolipides non-tréponémiens: le test VDRL, le test
rapide sur la réagine plasmatique (RPR), et la réaction de
Wassermann. Ces tests donneront un résultat négatif chez
les patients qui n'ont qu'une infection à B. burgdorferi.
12.3. Une antibiothérapie antérieure risque d'abroger la
réaction des anticorps et, de ce fait, rendre les résultats
sérologiques moins prévisibles.
12.4. Les échantillons prélevés durant le premier stade de la
maladie peuvent donner des résultats négatifs lors de
l'analyse (voir Section 11).
12.5. Les performances du test seront altérées si les réactifs
sont modifiés ou stockés dans des conditions autres que
celles décrites dans la Section 5.2.
12.6. Le résultat du test doit être interpété en considérant les
informations données par les études épidémiologiques,
l’évaluation clinique du patient et les autres analyses
diagnostiques.
13.
VALEURS ATTENDUES
Un indice d'anticorps spécifiques >0,3 indique toujours la
présence d'une synthèse intrathécale d'anticorps spécifiques.
Chez des patients avec une neuroborréliose, la synthèse
d'anticorps intrathécaux débute d'habitude durant la seconde
semaine suivant l'apparition des symptômes neurologiques. La
production spécifique d'IgG et/ou d'IgM est détectable chez plus
ou moins 80% des patients avec une neuroborréliore définie dès
le début de la troisième semaine et chez tous les patients 6 à 8
semaines après l'apparition des symptômes neurologiques6.
L'absence de production d'anticorps intrathécaux ou la présence
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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