Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II Thèse de doctorat de l’université de la Méditerranée Spécialité : Microbiologie moléculaire et Biotechnologie présentée par Magali Hebrard pour obtenir le grade de docteur de l’université de la Méditerranée Etude des systèmes antioxydants dans le métabolisme et la virulence de Salmonella typhimurium Jury composé du : Dr. Françoise Norel Dr. Claude Parsot Pr. Josep Casadesús Dr. Stéphane Méresse Pr. Frédéric Barras Dr. Laurent Aussel Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de thèse Co-directeur de thèse Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II Thèse de doctorat de l’université de la Méditerranée Spécialité : Microbiologie moléculaire et Biotechnologie présentée par Magali Hebrard pour obtenir le grade de docteur de l’université de la Méditerranée Etude des systèmes antioxydants dans le métabolisme et la virulence de Salmonella typhimurium Jury composé du : Dr. Françoise Norel Dr. Claude Parsot Pr. Josep Casadesús Dr. Stéphane Méresse Pr. Frédéric Barras Dr. Laurent Aussel Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de thèse Co-directeur de thèse Table des matières Page Liste des abréviations……………………………………………………………............ 1 AVANT-PROPOS………………………………………………………………………. 3 INTRODUCTION Partie « Salmonella typhimurium » …………………………………………………...... 5 I- Introduction au genre Salmonella…………………………………………............ 5 1- Classification du genre Salmonella………………………………………. 5 2- Epidémiologie associée à S. typhimurium…………………………………5 3- La résistance aux antibiotiques chez S. typhimurium……………………...6 II- L’établissement de l’infection par S. typhimurium………………………………..6 1- La maladie déclenchée chez l’homme : la gastroentérite………………… 6 2- La maladie déclenchée chez la souris : la fièvre typhoïde……………….. 7 III- Les mécanismes de défense de l’organisme hôte…….…………………………... 7 1- Deux barrières naturelles : l’estomac et l’intestin…………………………8 2- Les mécanismes de défense du macrophage ……………………………...9 a. La fusion endolysosomale et la formation du phagolysosome…. 9 b. Les peptides antimicrobiens cationiques (CAMP)…………....... 10 c. La NADPH phagocyte oxydase………………………………… 10 d. L’oxyde nitrique synthase inductible……………………………12 e. Synergie d’action entre les deux enzymes…………………........ 13 f. Autres enzymes impliquées dans la production de FAO.............. 14 g. La protéine Slc11a1……………………………………………...15 IV- Les facteurs de virulence de S. typhimurium ………………………………….......15 1- Les systèmes de sécrétion de type III (SSTT) de S. typhimurium………...15 a. Le SSTT codé sur l’îlot de pathogénicité 1…………………….. 15 b. Le SSTT codé sur l’îlot de pathogénicité 2…………………….. 17 c. Ilots de pathogénicité et transfert latéral de gènes……………... 20 2- PhoP/PhoQ……………………………………………………………….. 20 a. Présentation de PhoP/PhoQ…………………………………….. 21 b. Activation par les ions Mg2+……………………………………. 21 c. Implication de PhoP/PhoQ dans la virulence de S. typhimurium. 21 3- Le plasmide pSLT………………………………………………………... 23 a. L’opéron spv……………………………………………………. 23 b. L’opéron pef……………………………………………………..23 4- Les superoxyde dismutases périplasmiques……………………………….24 a. Présentation de SodCI et SodCII………………………………. 24 b. Comparaisons entre SodCI et SodCII…………………………. 25 5- RpoS, le facteur sigma alternatif de la phase stationnaire………………... 25 a. Régulation de RpoS…………………………………………….. 25 b. Le régulon rpoS……………………………………………….... 26 c. Implication de RpoS dans la virulence de S. typhimurium……... 27 Partie « Stress oxydant »……………………………………………………………….. 28 I- Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO)……………………………………....... 28 1- Les radicaux libres………………………………………………………... 28 a. L’oxygène moléculaire…………………………………………..28 b. L’anion superoxyde…………………………………………….. 28 c. Le radical hydroxyle……………………………………………. 29 d. L’anion radicalaire carbonate……………………………………29 2- Les FAO non radicalaires………………………………………………… 30 a. L’oxygène singulet……………………………………………... 30 b. Le peroxyde d’hydrogène…………………….………………… 30 3- Origine des FAO…………………………………………………………. 30 a. Les FAO d’origine endogène…………………………………... 30 b. Les FAO d’origine exogène……………………………………. 31 4- Les cibles des formes actives de l’oxygène……………………………..... 31 a. Les cibles de l’anion superoxyde……………………….……….32 b. Les cibles du peroxyde d’hydrogène…………………………. 32 c. Les cibles du radical hydroxyle…………………….…………... 33 d. Les lipides bactériens sont-ils une cible des FAO ?.................... 33 5- Les mécanismes de défense bactériens contre les FAO………………….. 34 a. Les superoxyde dismutases…………………………………….. 34 b. Les catalases et les peroxyrédoxines…………………………….34 c. Les systèmes de réparation protéique…………………………... 35 6- La régulation des systèmes d’adaptation au stress oxydant ……………... 35 a. Le système SoxR/SoxS…………………………………………. 36 b. Le régulateur OxyR…………………………………………….. 36 7- Les formes actives de l’azote………………………………………….…..37 a. Les réactions chimiques générées en présence de NO....…….. 37 b. Présentation du NO. et des FAN………………………….……. 38 c. Production des FAN……………………………………………. 39 8- Les cibles des FAN...................................................................................... 40 9- Les mécanismes de défense contre les FAN …………………………….. 41 a. Les enzymes catalysant l’élimination du NO.…………..…….. 41 b. Les enzymes catalysant l’élimination du peroxynitrite………… 42 II- Les méthionine sulfoxyde réductases…………………………………………….. 43 1- La méthionine…………………………………………………………….. 43 a. Caractéristiques de la méthionine………………………………. 43 b. La méthionine, une "éponge" à stress oxydant………................ 43 2- Les méthionine sulfoxyde réductases…………………………………….. 44 a. Aspects biochimiques…………………………………………... 44 b. Réaction catalytique……………………………………………. 44 3- Organisation génétique et régulation …………………………………….. 44 a. Organisation génétique…………………………………………. 44 b. Régulation de msrA et msrB……………………………………. 45 4- Les substrats des Msr …………………………………………………….. 45 a. La protéine ribosomale L12…………………………………….. 45 b. La protéine chaperon groEL……………………………………. 45 c. Le complexe SRP………………………………………………. 46 5- Rôle de MsrA et MsrB dans la pathogénicité………………………….…. 46 a. Erwinia chrysanthemi…………………………………………... 46 b. Mycoplasma genitalium………………………………………… 46 c. Streptococcus pneumoniae……………………………………... 47 III- Les catalases………………………………………………….…………………... 47 1- Les caractéristiques des trois groupes……………………………………. 47 a. Les catalases monofonctionnelles……………………………….47 b. Les catalases-peroxydases……………………………………… 49 c. Les catalases à manganèse …………………………………….. 50 2- Rôle des catalases dans la physiologie des bactéries pathogènes………… 50 a. Helicobacter pylori …………………………………………….. 50 b. Agrobacterium tumefaciens…………………………………….. 51 c. Pseudomonas aeruginosa………………………………………. 51 d. Salmonella typhimurium…………………………………………51 IV- Les peroxyrédoxines……………………………………………………………… 52 1- Les peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines……………………………… 52 a. La réaction des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines……….. 52 b. Les caractéristiques générales d’AhpC……………….…………53 c. Régulation d’ahpC …………………………………………….. 53 d. Rôle d’AhpC dans la physiologie des bactéries pathogènes…… 53 2- Les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines…………………………….. 55 a. La réaction des peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines……… 55 b. Localisation cellulaire de Tpx……………………………..…… 56 c. Régulation de tpx………………………………………….……. 56 d. Rôle de Tpx dans la physiologie des bactéries pathogènes…….. 57 3- Les peroxyrédoxines à 1 cystéine………………………………………… 57 RESULTATS Partie 1 : Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant Hpx°……..… 59 I- Construction du mutant 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE katN::cat (Hpx°)………… 59 II- Caractérisation phénotypique du mutant Hpx°…………………………………... 59 III- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° au peroxyde d’hydrogène…………..….. 61 IV- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° à l’anion superoxyde et l’ion carbonate… 62 V- Etude du profil d’oxydation protéique du mutant Hpx° chez S. typhimurium…… 62 VI- Etude de la virulence du mutant Hpx°………………………………………….… 64 VII-Etude de la contribution individuelle des catalases KatG et KatE………….…… 66 Partie 2 : Caractérisation d’un biosenseur vivant du peroxyde d’hydrogène……………. 68 I- Construction du plasmide PahpC-GFP……………………………………………68 II- Caractérisation du biosenseur vivant en milieu de culture……………………….. 69 III- Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages murins…………….. 70 IV- Implication de la NADPH phagocyte oxydase dans la production des FAO par le macrophage………………………………………………………………………….72 Partie 3 : Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant HpxF- ……... 74 Article Partie 4 : Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium…………………………….……………………………………………… 76 I- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx…………………… 76 II- Etude de la virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx……………………............ 76 III- Etude du rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans les macrophages……78 IV- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence de FAO ou FAN……………………………………………………………………… 82 Partie 5 : Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium…………………………………….………………………... 87 I- Construction de mutants des gènes msrA et msrB de S. typhimurium…………… 87 II- Caractérisation phénotypique des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-……… 88 III- Etude de la sensibilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpxen présence d’H2O2…………………………………………………………………... 88 IV- Evaluation du niveau d’oxydation protéique des mutants msrAB-, Hpxet msrAB- Hpx- au cours de la croissance bactérienne……………………………….. 89 V- Etude de la mobilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-………………... 90 VI- Etude de la virulence des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx-………………. 91 DISCUSSION ET PERSPECTIVES………………………………………………….. 94 MATERIELS ET METHODES……………………………………………………….. 101 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES …………………………………………….. 117 Avant-Propos S. typhimurium est une bactérie enteropathogène dont la capacité à être virulente est, en partie, assurée par deux systèmes de sécrétion qui lui permettent l’internalisation et la survie dans des cellules hôtes. Ces systèmes de sécrétion sont des facteurs de virulence, classiquement définis comme des composés dont l’absence va résulter en l’abolition du potentiel de virulence de la bactérie sans en altérer le métabolisme. Au cours de mon travail de thèse, j’ai pu montrer que des enzymes cytoplasmiques du métabolisme de S. typhimurium participaient également aux capacités pathogéniques de la bactérie, ce qui nous a conduit à nous poser la question de la définition de la virulence chez S. typhimurium. Depuis dix ans, le laboratoire de F. Barras travaille sur la thématique du stress oxydant chez Escherichia coli. Mon arrivée dans le laboratoire a coïncidé avec le démarrage d’un nouveau sujet, le stress oxydant chez S. typhimurium. Le stress oxydant est défini comme un déséquilibre entre les formes actives de l’oxygène (FAO), produits dérivés de l’oxygène comme par exemple l’H2O2, et les systèmes impliqués dans leur élimination. La conséquence est l’endommagement de l’ensemble des macromolécules biologiques (acides nucléiques, protéines, lipides). Les catalases et les peroxyrédoxines participent à l’élimination de l’H2O2. Au cours de ma thèse, j’ai montré que S. typhimurium possédait cinq enzymes impliquées dans l’élimination de l’H2O2, 3 catalases, KatG, KatE et KatN ainsi que deux peroxyrédoxines, AhpCF et TsaA. Ces cinq protéines participent également à l’établissement de la virulence de la bactérie en condition d’infection dans des macrophages murins et dans la souris. En effet, les macrophages sont pourvus d’un complexe enzymatique appelé NADPH phagocyte oxydase qui produit de l’anion superoxyde. Cette FAO a une très forte propension à se dismuter en H2O2. Nous avons montré que KatE, KatG, KatN, AhpCF et TsaA éliminaient l’H2O2 produit par le macrophage, garantissant ainsi la viabilité de S. typhimurium en condition d’infection. Ces résultats sont présentés page 74 de ce manuscrit (Hebrard et al., 2009). Nous nous sommes ensuite intéressés à la perception du stress oxydant en condition d’infection par S. typhimurium. Pour cela, une sonde moléculaire détectant l’H2O2 a été construite puis introduite dans une bactérie sauvage afin d’obtenir un « biosenseur vivant » du peroxyde d’hydrogène. A l’aide de cette souche, nous avons montré que la bactérie ressentait de l’H2O2 en condition d’infection dans des macrophages murins. Cela nous a permis de 3 mieux étudier le « burst oxydatif » tel que la bactérie le perçoit dans sa vacuole en condition d’infection. Ces résultats ont souligné l’importance des enzymes éliminant l’H2O2 chez S. typhimurium. Ce travail est présenté page 68 de ce manuscrit. Au cours de ce travail, nous avons également montré que trois peroxyrédoxines de S. typhimurium, AhpCF, TsaA et Tpx participaient à l’établissement de la virulence. Nous avons montré que ces 3 enzymes ne semblaient pas essentielles pour éliminer les FAO ou les FAN produites par la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible, respectivement. Un travail ultérieur permettra de comprendre le rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium en condition d’infection dans les macrophages. Ce travail est présenté page 76 du manuscrit. Enfin, nous avons étudié l’implication d’un système de réparation protéique, les méthionine sulfoxyde réductases. Ces enzymes réparent les méthionines oxydées libres ou enchâssées au sein des protéines. S. typhimurium possède deux méthionine sulfoxyde réductases, MsrA et MsrB. Les résultats obtenus ont montré que les caractéristiques d’un mutant ∆msrA ∆msrB étaient proches de celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été inactivés dans une souche dépourvue de 2 catalases, KatG et KatE et d’une peroxyrédoxine, AhpC. Dans cette souche accumulant de l’H2O2 endogène, la contribution de MsrA et MsrB devient évidente pour lutter contre les effets liés au stress oxydant. Ce travail est présenté page 87 du manuscrit. Ainsi, au cours de ce travail de thèse, j’ai pu abordé les thématiques de la pathogénèse de Salmonella typhimurium et du stress oxydant. Ces deux thématiques font l’objet de synthèses bibliographiques qui sont présentées dans la première partie de ce manuscrit. 4 INTRODUCTION Salmonella typhimurium Introduction S. typhimurium Salmonella Sisal Salmonella enterica Salmonella bongori Sous-espèce V (SE V) SE I enterica SE II salamae Salmonella typhoïdiques adaptées aux primates et aux humains Fièvre entérique S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C S. Sendai SE IIIa arizonae SE IIIb diarizonae S. Typhimurium S. Enteritidis + 1500 autres SE VI indica Salmonella non-typhoïdiques non restreintes aux humains Gastro-entérite Non-invasive SE IV houtanea Bactériémie S. Typhimurium S. Enteritidis S. Dublin S. Virchow S. Heidelberg Extra-intestinale (invasive) Infection localisée S. Cholaraesuis S. Typhisuis S. Typhimurium S. Enteritidis S. Dublin Bactériémie S. Cholaraesuis S. Typhisuis S. Typhimurium S. Enteritidis S. Dublin S. Virchow S. Heidelberg Figure 1 : Diagramme représentant le genre Salmonella (adapté de Langridge, Wain et Nair, site web EcoSal « Module 8.6.2.2 ») Les espèces et sous-espèces (SE) composant le genre Salmonella ont été définies par biotypage, hybridation ADN/ADN, analyse de l’ARN 16S et électrophorèse d’isoenzymes ou MEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis). Salmonella est divisée en deux espèces : bongori et enterica. L’espèce enterica comporte 6 sous-espèces dont la sous-espèce enterica. Celle-ci est elle-même divisée en deux groupes : le groupe des Salmonella typhoïques et le groupe des Salmonella non typhoïques à l’intérieur duquel est classée S. typhimurium. Introduction S. typhimurium I- Introduction au genre Salmonella 1- Classification du genre Salmonella Le genre Salmonella fait partie de la famille des Enterobacteriaceae et se divise en deux espèces : - Salmonella enterica - Salmonella bongori Salmonella enterica est l’espèce la plus représentée. Elle est elle-même divisée en 6 sousespèces (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtanae, indica) et en de nombreux sérovars (plus de 2000) tels que Enteritidis, Typhi, Typhimurium…(Fig. 1). La nomenclature des Salmonella est constituée du genre, de l’espèce, de la sous-espèce et du serovar, par exemple, Salmonella enterica sous-espèce enterica serovar Typhimurium. Au cours de cette thèse, une abréviation sera utilisée pour nommer les bactéries du genre Salmonella. Je parlerai soit de S. typhimurium, soit de S. typhi, pour Salmonella enterica sousespèce enterica serovar Typhimurium et Salmonella enterica sous-espèce enterica serovar Typhi, respectivement. Les génomes de S. typhimurium et d’Escherichia coli possèdent plus de 84% d’identité de séquence nucléique (comparaison réalisée à partir des souches référencées, LT2 pour Salmonella et K12 pour E. coli ) (McClelland et al., 2001). Ces deux bactéries se sont différenciées l’une de l’autre il y a 120 à 160 millions d’années. Le génome de S. typhimurium LT2 comprend un chromosome de 4,8 millions de paires de bases et un plasmide de virulence de 94 kb (Fig. 2). Les principales caractéristiques de ce génome sont représentées dans le tableau 1 (McClelland et al., 2001). 2- Epidémiologie associée à S. typhimurium Les salmonelles sont des microorganismes pathogènes responsables de gastro-entérites, de toxi-infections alimentaires et de fièvres typhoïdes. Elles pénètrent dans l’organisme par voie orale après ingestion d’aliments ou d’eau contaminés. La plupart des animaux constituent un réservoir à salmonelles. Deux problèmes majeurs découlent de la prévalence de cette bactérie. D’abord, Salmonella constitue un problème de santé publique mondial, principalement dans les pays en voie d’industrialisation où les normes sanitaires ne sont pas correctement appliquées. Ensuite, elle représente un problème économique. Aux Etats-Unis, le coût des maladies associées à des pathogènes alimentaires peut atteindre 23 milliards de dollars par an. 5 Introduction S. typhimurium (B) (A) Distribution des gènes Spécifique de Typhimurium Spécifique de Salmonella Présent dans tous les génomes Autre possibilité Figure 2 : Représentation circulaire du génome de S. typhimurium (adapté de McClelland et al., 2001) (A) Le chromosome de S. typhimurium. Les deux cercles externes représentent l’orientation des séquences codantes, avec le brin sens représenté à l’extérieur et le brin anti-sens à l’intérieur. Le rouge indique les régions homologues présentes dans 8 autres génomes d’entérobactéries (S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. arizonae, S. bongori, E. coli K12, E. coli O157:H7, K. pneumoniae). Le vert indique les gènes ayant un homologue chez au moins une autre Salmonella mais pas chez les E. coli ou chez K. pneumoniae. Le bleu indique les gènes présents seulement chez S. typhimurium LT2. Le gris indique les autres possibilités. Le cercle interne noir est le contenu en G+C; le cercle pourpre/jaune est le biais en GC. Les positions de l’origine de réplication (ORI) et du terminus (TER) sont indiquées. (B) Le plasmide pSLT de S. typhimurium. Le plasmide n’est pas à l’échelle. Le code couleur est le même que pour (A). Paramètre Chromosome Plasmide pSLT Taille (pb) 4857432 93939 GC% 53% 53% Groupes d’ARN ribosomaux 7 0 ARNs de transfert 85 0 Pseudogènes ARN de transfert 1 0 ARNs structuraux 11 1 Séquences codantes (dont les pseudogènes) 4489 108 Tableau 1 : Principales caractéristiques du génome de S. typhimurium (adapté de McClelland et al., 2001) Introduction S. typhimurium Le centre national de référence (CNR) de Salmonella situé à l’Institut Pasteur a pour mission de surveiller l’évolution d’épidémies de plusieurs bactéries entéropathogènes. Selon le rapport annuel d’activité 2007 du CNR, 8124 isolements humains de Salmonella ont été réalisés en France métropolitaine, dans les territoires d’outre-mer et à Monaco. Sur ces 8124 isolements, plus de 37% des Salmonella isolées appartiennent au sérovar Typhimurium, ce qui en fait le sérovar le plus représenté. Le second sérovar le plus représenté est le sérovar Enteritidis qui a été identifié dans près de 27% des souches prélevées. 3- La résistance aux antibiotiques chez S. typhimurium S. typhimurium est naturellement sensible à tous les antibiotiques actifs sur les entérobactéries. En Europe, les premiers isolats de salmonelles résistantes aux antibiotiques ont été réalisés au début des années 1960. L’analyse de la sensibilité du sérovar Typhimurium aux antibiotiques montre des niveaux élevés de multi-résistances depuis 1993. Dans notre pays, cette multi-résistance est surtout due à l’établissement du clone phage type DT104, au début des années 1990 (Helms et al,. 2005). Le clone DT104 est résistant à l’ampicilline, au chloramphénicol, à la streptomycine, aux sulfamides et aux tétracyclines (Type de résistance ACSSTu). Les gènes impliqués dans la résistance ACCSSTu sont tous retrouvés sur le chromosome de S. typhimurium DT104 au niveau d’une région de 12,5 kb, elle-même insérée sur un îlot génomique appelé Salmonella Genomic Island I (SGI) (Threlfall et al., 1994). Ils sont soit codés sur deux intégrons (Sandvang et al., 1998), soit situés entre ces deux intégrons. La résistance à l’ampicilline est assurée par la production d’une β-lactamase, la résistance au chloramphénicol et à la tétracycline par une pompe à efflux, la résistance à la streptomycine par une mutation du site de fixation du ribosome et enfin la résistance aux sulfamides par une dihydropteroate synthase qui permet la biosynthèse de folate, étape inhibée par les sulfamides. II- L’établissement de l’infection par S. typhimurium Après pénétration de S. typhimurium dans l’organisme par voie orale, la bactérie transite par l’estomac et par la lumière intestinale. Suivant l’hôte infecté, les voies de dissémination au travers de l’intestin ainsi que les symptômes associés à l’infection diffèrent. 1- La maladie déclenchée chez l’homme : la gastroentérite 6 Introduction S. typhimurium Salmonella Lumen Pénétration Diarrhée Phase aiguë Sécrétion d’eaux et d’électrolytes Adhérence Cellules épithéliales intestinales Lamina propria Multiplication Digestion lysosomale Dissémination Invasion des tissus systémique profonds Phase Phagocytose par des systémique neutrophiles et des macrophages Figure 3 : Représentation schématique de la barrière épithéliale intestinale et de la voie d’entrée de S. typhimurium au travers des entérocytes (adapté du livre Medical Microbiology, 4ème édition) S. typhimurium a la capacité d’adhérer au niveau de l’épithélium intestinal. Cette adhésion peut entraîner une destruction des cellules en surface ainsi que la sécrétion d’eau et d’électrolytes. La phase aiguë de l’infection est alors déclarée, elle est caractérisée par de la fièvre et des diarrhées. S. typhimurium a également la capacité de traverser les entérocytes. A l’intérieur de ceux-ci, la bactérie va pouvoir se multiplier. Dans la lamina propria, la bactérie est phagocytée par des neutrophiles et des macrophages et va pouvoir disséminer dans tout l’organisme. Il s’agit de la phase systémique de l’infection. Introduction S. typhimurium Chez l’homme, S. typhimurium déclenche une infection localisée au niveau de l’intestin appelée entérite. Après adhésion à la bordure en brosse qui constitue la membrane plasmique des cellules épithéliales intestinales, S. typhimurium provoque la rupture des microvillosités et envahit les entérocytes dans lesquels elle prolifère. Les entérocytes endommagés sont alors remplacés par des cellules immatures (Fig. 3). Les fonctions d’absorption de l’intestin s’en trouvent altérées. S. typhimurium sécrète, de plus, une entérotoxine cytotonique qui perturbe la sécrétion d’eau et d’électrolytes. Les symptômes fréquemment déclenchés lors de gastroentérite à Salmonella sont la fièvre, les nausées, les crampes abdominales, les vomissements et les diarrhées. 2- La maladie déclenchée chez la souris : la fièvre typhoïde Chez la souris, S. typhimurium est capable de franchir la barrière intestinale sans créer de lésion. Elle envahit la muqueuse intestinale et se multiplie à l’intérieur de phagocytes présents dans le tissu lymphoïde associé à l’intestin. Puis, elle est disséminée dans l’organisme à l’aide de ces mêmes phagocytes et colonise les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate et le foie où elle prolifère à l’intérieur des différentes populations cellulaires retrouvées dans ces organes, notamment les macrophages (Fig. 3). Dans les cas de chronicité, la bactérie est retrouvée dans la vésicule biliaire ou dans la moelle osseuse. En 1892, Loeffler observe la maladie déclenchée par S. typhimurium chez la souris. Il conclut que les symptômes déclenchés se rapprochent de ceux de la fièvre typhoïde causée par S. typhi chez l’homme dont l'évolution est habituellement grave voire mortelle (Loeffler, 1892). Ainsi, l’interaction entre la souris et S. typhimurium devient un modèle d’étude pour comprendre les déterminants moléculaires mis en place lors de la fièvre typhoïde aussi bien du côté de l’hôte que du côté de la bactérie. III- Les mécanismes de défenses de l’organisme hôte Lors d’une contamination par S. typhimurium, les mécanismes de défense de l’organisme hôte sont primordiaux pour contrôler la progression de l’infection. Dans ce chapitre, nous allons aborder certains mécanismes de défense présents chez l’homme ou chez la souris. Nous nous intéresserons d’abord aux barrières naturelles rencontrées dans l’estomac et dans l’intestin. Puis, nous présenterons la réponse développée par une cellule immunitaire, le macrophage, suite à la phagocytose d’un organisme étranger. 7 Introduction S. typhimurium 1- Deux barrières naturelles à l’invasion bactérienne : l’estomac et l’intestin Après pénétration dans l’organisme, le premier obstacle rencontré par les bactéries entéropathogènes est le pH acide de l’estomac. La présence d’acide chlorhydrique sécrété par les cellules pariétales ou oxyntiques entraîne une acidification de l’environnement, le pH résiduel se situe aux alentours de 1∼2. La majorité des microorganismes est incapable de survivre dans ces conditions. L’estomac représente ainsi une barrière efficace pour lutter contre de nombreuses infections. L’intestin accomplit des fonctions essentielles telles que la digestion, le transport des nutriments, le transport de l’eau… Il forme également une barrière efficace pour lutter contre l’invasion et la dissémination des microorganismes commensaux ou pathogènes. Les mécanismes de résistance mis en place par l’intestin sont nombreux et complexes. Nous aborderons quelques exemples illustrant la diversité de ces mécanismes. Les cellules du foie déversent en continue de la bile dans l’intestin. Elle est constituée principalement de sels biliaires, de cholestérol et de bilirubine. La bile est un détergent pouvant agir sur les lipides et notamment sur les membranes biologiques. De plus, les sels biliaires entraînent une modification de la pression osmotique pouvant ainsi altérer le repliement des protéines bactériennes de membranes externes ou périplasmiques. L’intestin est également « tapissé » par un nombre important de microorganismes composant la microflore. Cette microflore restreint de façon passive la croissance des bactéries pathogènes, notamment en entrant en compétition pour la biodisponibilité des nutriments (Stecher et al., 2008). De plus, elle libère des sous-produits de l’activité métabolique tels que le propionate ou le butyrate qui peuvent être délétères pour la survie des autres bactéries (Scheppach et al., 1992). Un troisième exemple de mécanisme de défense mis en place dans l’intestin est illustré par la production de peptides antimicrobiens cationiques (CAMP) par les cellules épithéliales de l’intestin. Les CAMP sont des composés centraux de l’immunité innée produits par les mammifères, oiseaux, insectes et plantes pour se protéger des infections bactériennes (Bals et al., 2003). Ils sont retrouvés sur de nombreuses muqueuses telles que l’épithélium respiratoire ou le tractus intestinal. Ils sont également retrouvés dans des cellules immunitaires où ils représentent le mécanisme d’élimination bactérienne le plus efficace après la réponse oxydative (Hancock et al., 2000; Canny et al., 2002). Ils agissent selon de nombreuses 8 Introduction S. typhimurium Peptides antimicrobiens Figure 4 : Modèle des mécanismes d’interactions des peptides antimicrobiens avec la membrane interne bactérienne (adapté de Papo et al., 2003) Les peptides antimicrobiens produits par les muqueuses et par certaines cellules immunitaires agissent notamment en perturbant la membrane interne des bactéries. Il existe 4 mécanismes majeurs d’interaction entre les peptides et les membranes. (A) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne des bactéries sans perturber la structure membranaire (B) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne mais perturbent la structure membranaire (C) Les peptides antimicrobiens s’alignent parallèlement à la membrane interne mais perturbent la structure membranaire et s’y insèrent en formant des pores (D) Les peptides antimicrobiens s’insèrent profondément dans la membrane et forment des pores transmembranaires. Introduction S. typhimurium stratégies soit en perméabilisant la membrane interne et externe des bactéries (notamment en interagissant avec le lipide A du LPS) (Fig. 4), soit en inhibant la production du peptidoglycane ou soit en modulant plusieurs fonctions intracellulaires bactériennes (Hancock et al., 2000). Un dernier exemple de mécanisme de défense présent dans l’intestin est le système immunitaire associé aux muqueuses intestinales. Pour lutter contre l’invasion des bactéries entéropathogènes, la muqueuse intestinale est drapée par un tissu lymphoïde qui se divise en trois parties (Fig. 5) : - les plaques de Peyer et nodules lymphoïdes isolés : dans cette partie de l’intestin sont localisées les cellules M (microfold), qui sont spécialisées dans le transport d’antigène d’un côté à l’autre de l’intestin. L’antigène est transporté par un mécanisme de pinocytose qui est un processus non spécifique d’endocytose cellulaire de petites entités telles que les bactéries - les ganglions mésentériques lymphoïdes qui sont des carrefours de la circulation lymphoïde - le tissu lymphoïde diffus de la lamina propria qui permet le drainage des cellules immunitaires chargées de bactéries vers les ganglions mésentériques 2- Les mécanismes de défense développés par le macrophage Les macrophages sont des cellules de l’immunité innée dont le rôle est de détruire des éléments étrangers ayant pénétré dans l’organisme. Pour cela, plusieurs stratégies sont mises en place : la formation d’une vésicule digestive, la production de peptides antimicrobiens cationiques, la production de formes actives de l’oxygène et de l’azote ou encore l’appauvrissement du cytosol eucaryote en nutriments. a. La fusion endolysosomale et la formation du phagolysosome La reconnaissance des éléments étrangers se fait grâce à la présence de récepteurs localisés à la membrane du macrophage. Ces récepteurs interagissent avec certaines structures spécifiques des composants procaryotes. Une des familles de récepteurs les plus étudiées est la famille des Toll Like Receptor (TLR), comme par exemple le LPS receptor TLR-4/MD-2 qui est capable de reconnaitre le lipopolysaccharide (LPS). L’interaction des TLR avec des composants procaryotes déclenche l’activation immunologique du macrophage et le mise en 9 Introduction S. typhimurium Figure 5 : Schéma représentant les muqueuses intestinales et le système immunitaire afférant Le tissu lymphoïde intestinal se divise en trois parties : les plaques de Peyer et follicules lymphoïdes isolés, les nœuds mésentériques lymphatiques, le tissu lymphoïde diffus de la lamina propria. Au niveau des plaques de Peyer, les cellules M sont chargées de la capture des antigènes. Par la suite, ces antigènes sont acheminés vers les nœuds lymphatiques mésentériques. Les phagocytes présents dans le tissu de la lamina propria s’acheminent également vers les nœuds mésentériques où ils présentent leur antigène de surface aux cellules immunitaires spécialisées. Introduction S. typhimurium place de réponses inflammatoires (Blander et al., 2004; Miller et al., 2005). Ce phénomène se caractérise par la production de cytokines, molécules « signal » qui permettent l’amélioration des capacités bactéricides, dégradatives et sécrétoires du macrophage. Ainsi, après reconnaissance de la bactérie par le macrophage, ce dernier déclenche la phagocytose (Fig. 6) (Flannagan et al., 2009). Classiquement, ce processus permet la capture et la dégradation de l’élément étranger. Il s’agit d’un mécanisme séquentiel au cours duquel la bactérie internalisée est logée au sein d’une vacuole appelée phagosome. Le phagosome va subir une série de transformations qui résulte de son interaction avec les vésicules de la voie d’endocytose. Différentes étapes de maturation sont reconnues, phagosome précoce, phagosome intermédiaire et phagosome tardif, qui correspond à la formation du phagolysosome, stade d’évolution ultime. Durant sa maturation, le phagosome se charge en enzymes lytiques (plus de 40 enzymes sont retrouvées dans le phagosome) et subit une acidification progressive causée par la présence d’une ATPase vacuolaire qui pompe les protons et les délivre dans la lumière du phagosome (Flannagan et al., 2009). Après destruction de la bactérie, le macrophage présente à sa surface les antigènes bactériens qui seront reconnus spécifiquement par des cellules de l’immunité acquise. b. Les peptides antimicrobiens cationiques (CAMP) En plus des enzymes lytiques, le macrophage synthétise des peptides antimicrobiens cationiques tels que le lysozyme et les peptides antimicrobiens reliés aux cathélicidines (CRAMP) (Rosenberger et al., 2004). Les lysozymes ont la particularité de reconnaître et de cliver les liaisons osidiques β1-4 entre les dimères de N-Acétyl-glucosamine et de N-Acétylmurique composant le peptidoglycane (Sharon, 1967). La paroi bactérienne est alors dégradée et les bactéries deviennent sensibles à de nombreux stress, comme par exemple le stress osmotique. Les CRAMP sont des peptides cationiques structurés en hélice alpha et qui ont une activité antimicrobienne ciblée à la fois vers les bactéries à Gram + et vers les bactéries à Gram (Zaiou et al., 2002). Chez S. typhimurium, ces protéines empêchent la division cellulaire bactérienne induisant ainsi la filamentation de la bactérie et sa mort. c. La Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate (NADPH) phagocyte oxydase 10 Introduction S. typhimurium Figure 6 : Modèle des différentes étapes aboutissant à la phagocytose d’une bactérie La phagocytose est initiée après contact avec un élément étranger, comme par exemple une bactérie. Des pseudopodes se forment au niveau de la membrane eucaryote et permettent l’internalisation de la bactérie. Cette dernière se retrouve dans une vésicule de phagocytose qui fusionne avec d’autres vésicules contenant des enzymes lytiques (1) et (2). Le phagosome mature en phagolysosome dans lequel la bactérie est décomposée par des hydrolases lysosomales. Introduction S. typhimurium Le « burst oxydatif » constitue une des stratégies bactéricides les plus efficaces. La notion de « burst oxydatif » a été évoquée pour la première fois en 1933 par Baldridge et Gerard. Il fut dénommé ainsi en raison de la grande quantité d’oxygène consommée après ingestion d’un microorganisme par la cellule phagocytaire. Le burst oxydatif se caractérise par la production d’importantes quantités d’anion superoxyde (O2.-) suite à l’activation du macrophage. Ce phénomène de respiration non mitochondrial est catalysé par la NADPH phagocyte oxydase (Babior, 1999; Segal, 2005; Cross et al., 2004). La NADPH phagocyte oxydase est une enzyme multimérique composée de deux protéines membranaires, gp91-Phox et p22-Phox, qui constituent le flavocytochrome b558 hétérodimérique, et de trois protéines cytosoliques, p47-Phox, p67-Phox et Rac (Babior et al., 2002; Vignais, 2002). Un composant cytosolique non essentiel supplémentaire, p40-Phox, semble avoir un rôle régulateur. Après activation du macrophage suite à la phagocytose d’une particule étrangère, les sousunités membranaires s’associent à la membrane de la vésicule d’endocytose et sont bientôt rejointes par les trois sous-unités cytosoliques afin de reconstituer la NADPH phagocyte oxydase. Cette enzyme catalyse la réduction univalente d’oxygène moléculaire par des électrons provenant du NADPH pour former de l’anion superoxyde directement dans la lumière de la vésicule de phagocytose (Fig. 7). L’anion superoxyde est une espèce chargée et ne peut donc pas traverser les membranes de façon passive. Deux possibilités s’offrent à lui pour pénétrer dans la bactérie : - soit via des porines spécifiques des solutés anioniques. Il se retrouve alors dans le périplasme bactérien où il pourra (i) oxyder certaines macromolécules périplasmiques (Golubeva et al., 2006), ou (ii) être dismuté en peroxyde d’hydrogène par les superoxyde dismutases périplasmiques de S. typhimurium - soit par une dismutation spontanée de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène directement dans l’espace vacuolaire La production d’anion superoxyde a lieu majoritairement durant les 4 premières heures de l’infection. Les cytokines proinflammatoires, telles que le TNFα (Tumor Necrosis Factor), l’IFNγ (Interféron γ) et le facteur GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) stimulent l’activité de la NADPH phagocyte oxydase. Certains facteurs procaryotes comme le 11 Introduction S. typhimurium NADPH gp91-PHOX NADP+ p40-PHOX Activation p67-PHOX Rac1/2GTP p47-PHOX p22-PHOX O2 O2.- Figure 7 : Modèle d’activation de la NADPH phagocyte oxydase (El-Benna et al., 2008) Lorsque le macrophage est inactif, seules les sous-unités gp91-Phox et p22-Phox sont localisées à la membrane. Suite à l’activation du macrophage, les sous-unités cytosoliques p67-Phox, p47-Phox et p40-Phox s’assemblent au niveau des deux sous-unités membranaires pour former la NADPH phagocyte oxydase. En présence de NADPH et d’O2, cette enzyme synthétise de l’anion superoxyde et du NADP+ directement dans la vésicule de phagocytose. Introduction S. typhimurium LPS peuvent également activer la transcription de gènes qui codent pour les composants de l’oxydase (Cassatella et al., 1990). La maladie granulomateuse chronique (CDG) illustre l’importance de la NAPDH phagocyte oxydase dans le contrôle de la prolifération des bactéries pathogènes intracellulaires. Il s’agit d’un syndrome d’immunodéficience causé par l’inactivation du système NADPH phagocyte oxydase (Roos et al., 1992). La CGD est une maladie héréditaire qui résulte du dysfonctionnement d’au moins 4 gènes : gp91-Phox, p22-Phox, p47-Phox ou p67-Phox. Une CGD se caractérise par des infections récurrentes de champignons ou de bactéries associées à une absence de burst oxydatif. S. typhimurium est la seconde cause d’infection bactérienne dans les cas de CDG, soulignant ainsi le rôle essentiel de la NADPH phagocyte oxydase dans la résistance de l’hôte contre S. typhimurium. L’importance de la NADPH phagocyte oxydase a également été démontrée au cours d’une étude réalisée sur des souris déficientes pour cette enzyme (Vazquez et al., 2000). Dans cette étude, les auteurs ont montré que des souris dépourvues de NADPH phagocyte oxydase devenaient plus sensibles à l’infection systémique de S. typhimurium et que cette sensibilité était liée à un défaut dans l’activité bactéricide des macrophages (Fig. 8). La même équipe a montré que l’activité bactéricide de macrophages dérivés du péritoine murin était une propriété dépendante de la présence de la NADPH phagocyte oxydase (Vazquez et al., 2001). d. L’oxyde nitrique synthase inductible L’oxyde nitrique synthase inductible (NO. synthase inductible) est une enzyme eucaryote également impliquée dans le contrôle de la réplication bactérienne dans le macrophage. Elle catalyse l’oxydation de la L-arginine en oxyde nitrique (NO.). De façon similaire à la NADPH phagocyte oxydase, cette hémoprotéine dimérique utilise l’oxygène moléculaire et les électrons fournis par le NADPH pour produire du NO. (Nathan et al., 1994; Stuehr et al., 1992). Il existe trois isoformes de NO. synthases : la NO. synthase endothéliale, la NO. synthase neuronale et la NO. synthase inductible. La NO. synthase inductible est localisée dans le macrophage et associée, la plupart du temps, à des activités antibactériennes (Cherayil et al., 2001). 12 Introduction S. typhimurium Figure 8 : Expérience de survie de S. typhimurium dans des macrophages péritonéaux (VazquezTorres et al., 2000) La survie de S. typhimurium a été étudiée dans des macrophages péritonéaux de fonds génétiques différents issus de souris C5BL/6. Dans des macrophages sauvages, S. typhimurium est totalement éliminée au bout de 15 heures d’infection (courbe bleue). Dans des macrophages dépourvus de NAPDH phagocyte oxydase (phox KO), S. typhimurium n’est pas éliminée mais n’est pas capable de proliférer. Dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible (iNOS KO), S. typhimurium est éliminée durant les premiers temps de l’infection puis commence à proliférer dans les temps tardifs de l’infection. Enfin, dans des macrophages dépourvus des deux enzymes (iNOS KO/phox KO), S. typhimurium n’est plus éliminée et commence à proliférer après 5 heures d’infection. Ces résultats indiquent que la NADPH phagocyte oxydase est responsable de l’élimination de la bactérie dans les temps précoces de l’infection, et que la NO. synthase inductible contrôle la prolifération de la bactérie durant les temps tardifs de l’infection. Introduction S. typhimurium L’expression de la NO. synthase inductible est régulée au niveau transcriptionnel et peut être stimulée après interaction avec des composés procaryotes ou en réponse à des cytokines (Il-1, TNFα, IFNγ) (Muhl et al., 1999). Plusieurs études ont renforcé l’hypothèse d’un rôle antimicrobien pour la NO. synthase inductible dans les macrophages : - certaines souches de S. typhimurium atténuées dans leur pouvoir infectieux redeviennent virulentes dans des souris dépourvues de NO. synthase inductible (De Groote et al., 1995; De Groote et al., 1996; Fang, 1997; Lundberg et al., 1999) - des souris dépourvues de NO. synthase inductible sont beaucoup plus sensibles lors d’une infection par S. typhimurium (Vazquez-Torres et al., 2000; Mastroeni et al., 2000; Shiloh, 1999) - des formes actives de l’oxyde nitrique (FAN) telles que le S-nitrosogluthation, le NO2, le NaNO2 ou encore le peroxynitrite ont une activité bactéricide sur S. typhimurium in vitro (De Groote et al., 1997; De Groote et al., 1995; Saito et al., 1991; Chen et al., 1998) A la différence de la NAPDH phagocyte oxydase membranaire, la NO. synthase inductible est une enzyme cytosolique. L’oxyde nitrique est donc produit directement dans le cytosol eucaryote. Etant non chargé, il a la capacité de traverser toutes les membranes biologiques. e. Synergie d’action entre la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible L’orchestration de la NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase inductible peut être résumée de la façon suivante : dans les premiers temps de l’infection, la NADPH phagocyte oxydase est activée et produit de l’anion superoxyde, qui évolue rapidement vers d’autres Formes Actives de l’Oxygène (FAO). Cette enzyme contribue ainsi au contrôle de la prolifération bactérienne dans les temps précoces de l’infection. Ensuite, la NO. synthase inductible est activée. Elle produit du NO. qui évolue également en d’autres espèces, limitant ainsi la prolifération des bactéries qui auraient survécu à la première enzyme (Vazquez-Torres et al., 2000) (Fig. 9). L’anion superoxyde et l’oxyde nitrique peuvent agir selon deux voies. Ils peuvent soit agir directement en endommageant les macromolécules biologiques de la bactérie présente dans le phagosome, soit indirectement en évoluant vers d’autres formes plus nocives. Ainsi, l’anion 13 Introduction S. typhimurium (A) (B) Figure 9 : Modèle pour l’action séquentielle de la NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase inductible (Vazquez-Torres et al., 2001) Dans ce modèle, la NADPH phagocyte oxydase produit de l’anion superoxyde dans la lumière d’une vésicule (A) qui se dismute spontanément en H2O2. L’H2O2 est une forme active de l’oxygène qui est diffusible, elle atteint le cytoplasme bactérien où elle se combine avec le fer ferreux pour former le radical hydroxyle ou le radical FeO.. Cette étape se déroule durant les temps précoces de l’infection. (B) Après le burst oxydatif, la NO. synthase inductible produit du NO. à partir d’arginine et d’oxygène moléculaire dans le cytosol du macrophage. Le NO. est un composé diffusible, il atteint le cytoplasme bactérien. L’autooxydation du NO. aboutit à la production d’un oxydant puissant le NO2 ou d’un composé nitrosylant, le N2O3. En présence de fer et de groupement thiols (RSH), des S-nitrosothiols et des complexes dinitrosyl/fer (DNIC) peuvent être formés à partir du NO.. Le NO., le NO2 , le N2O3, les Snitrosothiols et les DNIC contribuent à l’inhibition de la réplication bactérienne. Abbréviation : DNIC : Dinitrosyl Iron Complex Introduction S. typhimurium superoxyde peut être dismuté en péroxyde d’hydrogène qui est lui-même précurseur de radical hydroxyle, composé oxydant puissant. L’oxyde nitrique peut évoluer vers le dioxyde d’azote, ou vers les formes nitrate et nitrite. L’action de ces FAO et FAN seront abordées dans le chapitre dédié au stress oxydant. La NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible peuvent-elles avoir une action coordonnée ? Des études ont montré que dans des macrophages dépourvus de NADPH phagocyte oxydase, la production de NO. était augmentée (Vazquez-Torres et al., 2001). De manière complémentaire, ils ont mis en évidence que des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible produisaient plus d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène. Ces résultats indiquent que les FAO et FAN sont capables d’interagir, suggérant donc une synergie entre la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible. Pourtant, la production de FAO et de FAN semble séparée dans le temps, avec la production de formes actives de l’oxygène durant les temps précoces de l’infection et de formes actives de l’azote durant les temps tardifs (Mastroeni et al., 2000; Vazquez-Torres et al., 1996) (Fig. 9). Afin d’expliquer ces résultats, la production de peroxynitrite a été particulièrement étudiée. Cette forme active de l’azote résulte de la combinaison entre l’anion superoxyde et l’oxyde nitrique. Le peroxynitrite possède de fortes activités antibactériennes (De Groote et al., 1995; Vazquez-Torres et al., 1996; Brunelli et al, 1995). La question de sa présence dans la vacuole contenant Salmonella est un sujet de débat. Il semblerait que le peroxynitrite soit produit dans le macrophage mais non retrouvé dans la bactérie (Vazquez-Torres et al., 2000) f. Autres enzymes impliquées dans la production de FAO La myéloperoxydase (MPO) est une protéine hémique tétramérique associée aux granules des phagocytes. Cette enzyme représente 5% du poids sec des neutrophiles (Pham et al., 2003) et une proportion plus faible chez les monocytes. La MPO n’est pas produite par les macrophages issus de lignées cellulaires mais semble être présente dans certains macrophages issus de lignées primaires (Daugherty et al., 1994). Elle est capable de générer divers oxydants tels que le peroxyde d’hydrogène, le nitrite et l’acide hypochloreux. L’activité antibactérienne de la MPO n’a jamais été clairement établie dans les macrophages murins. En effet, contrairement à la CDG, une déficience en MPO n’est pas associée à phénotype de sensibilité du système immunitaire. Enfin, la NADPH phagocyte oxydase ne nécessite pas la présence de la MPO pour son action antimicrobienne (Daugherty et al., 1994). 14 Introduction S. typhimurium La xanthine oxydase (XO) est une molybdo-enzyme qui peut générer des FAO grâce au processus de dégradation de l’hypoxanthine ou de la xanthine en acide urique. La production de XO en réponse aux cytokines proinflammatoires (Vorbach et al., 2003) ainsi qu’une amélioration de la réplication microbienne dans des phagocytes ou des souris infectées après administration d’inhibiteur de la XO laissent suggérer une rôle important joué par la XO dans l’immunité innée (Takao et al., 1996; Umezawa et al., 1997). g. La protéine Slc11a1 La protéine Slc11a1, aussi dénommée NRAMP1, est une protéine du macrophage impliquée dans la résistance naturelle de la cellule à l’infection bactérienne. Slc11a1 influence l’expression de la réponse immunitaire antimicrobienne de la cellule (Blackwell et al., 2003). Elle est capable de limiter l’accès de la bactérie au fer cellulaire en réduisant les taux de fer dans la vacuole dans laquelle est retrouvée la bactérie (Nairz et al., 2009). Ce métal joue un rôle central dans l’interaction entre hôte et pathogène. Sa disponibilité est donc un critère déterminant pour la survie de la bactérie dans le macrophage. IV- Les facteurs de virulence de S. typhimurium S. typhimurium est une bactérie enteropathogène intracellulaire facultative. Cela signifie qu’elle a la capacité de franchir la barrière intestinale et qu’elle peut survivre à l’intérieur des cellules hôte. Ces propriétés lui sont conférées par différents facteurs de virulence, dont les principaux sont détaillés dans le chapitre à suivre. 1- Les systèmes de sécrétion de type III de S. typhimurium Les facteurs de virulence majeurs de S. typhimurium sont deux systèmes de sécrétion de type III (SSTT). La fonction principale des systèmes de sécrétion est de délivrer des protéines procaryotes directement dans le cytosol eucaryote. Le premier système de sécrétion de type III est localisé sur l’îlot de pathogénicité 1 (SPI-1) et le second système sur l’îlot de pathogénicité 2 (SPI-2) du chromosome bactérien. Ils présentent de grandes similarités de structure avec l’appareil flagellaire. Ces deux systèmes de sécrétion interviennent à des phases distinctes du cycle infectieux de S. typhimurium. a. Le système de sécrétion de type 3 codé sur l’îlot de pathogénicité 1 15 Introduction S. typhimurium (A) (B) Figure 10 : Microscopie électronique et reconsitution de la structure de l’appareil de sécrétion de type 3 (Galān et Zhou, 2000; Moraes et al., 2008 ) (A) Microscopie électronique de l’appareil de sécrétion de type 3 purifié. (B) Architecture globale du système de sécrétion de type 3 réalisée à partir de cristaux. Le système de sécrétion est composé du stator qui est inséré dans la membrane interne, de la sécrétine qui est insérée dans le peptidoglycane et la membrane externe et enfin de l’aiguille qui traverse la membrane de la cellule hôte. Introduction S. typhimurium Le SSTT SPI-1 a été découvert au cours d’une étude portant sur l’identification des gènes de S. typhimurium impliqués dans la pénétration de bactéries à l’intérieur de cellules non phagocytaires (Galān et Curtiss, 1989). L’îlot de pathogénicité 1 (SPI-1) est localisé au centisome 63 du chromosome de S. typhimurium (Galān, 1999). Cet îlot code pour les composants structuraux, pour les protéines effectrices sécrétées (effecteurs), pour les chaperons des effecteurs et pour les protéines régulatrices d’un appareil de sécrétion de type 3 (SSTT) (Mills et al., 1995). Certains effecteurs sont également retrouvés à l’extérieur du SPI1, isolés sur des régions chromosomiques. Les protéines de structure s’assemblent pour former un complexe ressemblant à une seringue, appelé injectisome et qui constitue l’élément au travers duquel les effecteurs sont sécrétés (Fig. 10). Cette structure multiprotéique traverse les membranes internes et externes bactériennes ainsi que la membrane de la cellule hôte (Kubori et al., 1998). Rôle du système de sécrétion SPI-1 Ce système de sécrétion est nécessaire pour initier la phase d’infection intestinale. Il permet à S. typhimurium de traverser les cellules épithéliales. Les effecteurs bactériens sont adressés vers le cytosol eucaryote et déclenchent une réorganisation du cytosquelette de la cellule épithéliale. Les filaments d’actine se réarrangent et entraînent une invagination de la membrane eucaryote. Celle-ci forme alors des « pseudopodes » qui permettent à la bactérie de pénétrer dans la cellule, ce mécanisme d’entrée est appelé « Trigger » par opposition au mécanisme « Zipper » qui est un phénomène de pinocytose déclenché par certaines bactéries ne nécessitant pas de système de sécrétion de type III (Takeuchi, 1967). Il s’en suit la formation d’une poche macropinocytique composée de la membrane de la cellule épithéliale, S. typhimurium se retrouvant alors insérée à l’intérieur d’un compartiment cellulaire appelé Salmonella Containing Vacuole (SCV) (Fig. 11 et 12). Activation du système de sécrétion SPI-1 En plus des gènes impliqués dans la structure de l’injectisome ou de ceux codant pour les effecteurs ou les chaperons, SPI-1 contient également des gènes codant pour des protéines régulatrices de son expression (Fig. 13). Ces régulateurs sont impliqués dans l’activation du système de sécrétion en contrôlant des gènes sur l’îlot de pathogénicité et à l’extérieur de celui-ci. HilA (Hyper invasive locus A) est le régulateur central du système de sécrétion. Il est 16 Introduction S. typhimurium Figure 11 : Microscopie électronique d’un évènement de macropinocytose de Shigella flexneri par une cellule épithéliale (Roger Wepf, Philippe Sansonetti et Ariel Blocker, http://www.bristol.ac.uk/cellmolmed/research/blocker-group.html) Shigella flexneri est internalisée par une cellule épithéliale. Ce phénomène est commun à celui réalisé par les entérocytes suite au contact de S. typhimurium (« Trigger mechanism »). La membrane eucaryote s’invagine suite à une réorganisation du cytosquelette, les pseudopodes apparaissent. Ils permettent ensuite l’internalisation de la bactérie dans le cytosol eucaryote. Figure 12 : Microscopie électronique colorée de changements morphologiques subis par les cellules épithéliales après contact avec S. typhimurium (http://www.med.yale.edu/micropath/galan/Pages/galan_overview.html) Des cellules épithéliales en culture internalisent S. typhimurium (en vert). Les cellules réarrangent leur surface au niveau des points de contact avec les bactéries. Ces réarrangements sont causés par une réorganisation du cytosquelette de la cellule hôte et initiés par les effecteurs de S. typhimurium pour permettre l’entrée de la bactérie dans la cellule. Introduction S. typhimurium un membre de la famille ToxR/OmpR et active les opérons inv/spa et prg/org qui codent pour les composants structuraux de l’appareil de sécrétion (Bajaj et al., 1995; Darwin et al., 1999; Eichelberg et al., 1999; Lostroh et al., 2000) (Fig. 14). En plus de son rôle direct dans la régulation des gènes de SPI-1, HilA est également l’activateur d’un second régulateur transcriptionnel, InvF. Ce régulateur fait partie de la famille AraC et induit également l’expression des effecteurs localisés sur l’opéron sic ainsi que des gènes isolés sur le génome, sopE et sigD, qui codent également pour des effecteurs (Darwin et al., 1999; Kaniga et al., 1994). L’expression de hilA est elle-même régulée par deux autres activateurs transcriptionnels, HilC et HilD. Les facteurs physicochimiques déclenchant l’activation du SSTT SPI-1 Les facteurs physicochimiques participent également à la régulation du SSTT SPI-1. Il a été montré que la tension en oxygène était un régulateur clé de l’expression des gènes d’invasion. En effet, les gènes codés par SPI-1 sont exprimés en présence de faibles pressions en oxygène à travers HilA (Jones et al., 1994; Bajaj et al., 1996). L’osmolarité est également un signal probable déclenchant l’invasion. A partir de 300 Osm, l’expression de hilA est induite et cause des changements dans la structure de l’ADN, affectant ainsi la transcription des gènes d’invasion (Galan et al., 1990; Bajaj et al., 1996). Le pH neutre est un autre signal d’invasion qui permet l’activation de l’expression de hilA (Bajaj et al., 1996). Enfin, des acides organiques spécifiques affectent aussi la régulation des gènes d’invasion (Lawhon et al., 2002). Un parallèle pourrait être fait entre ces facteurs et les conditions environnementales de l’intestin, lieu du déclenchement de la phase d’invasion. En effet, il a été montré que la lumière intestinale était en microaérobiose, que la pression osmotique y était très forte, que le pH était neutre, et enfin que des acides organiques étaient sécrétés par la microflore intestinale. b. Le système de sécrétion de type 3 codé sur l’îlot de pathogénicité 2 S. typhimurium possède un autre système de sécrétion de type 3, localisé au niveau du centisome 30, appelé l’îlot de pathogénicité 2 (SPI-2) (Hensel et al., 1998). Ce système est structuralement proche du 1er système de sécrétion. Il ressemble également à un 17 Introduction S. typhimurium Composants de l’appareil de sécrétion de type III Chaperonnes ou translocases Effecteurs sécrétés Régulateurs transcriptionnels Figure 13 : Représentation schématique de l’organisation de l’îlot de pathogénicité 1 de S. typhimurium (Lostroh et al., 2001) En bleu et rayé noir sont retrouvés les gènes codant pour les composants de l’appareil de sécrétion, en violet les chaperons ou translocases, en vert les effecteurs et en rouge les régulateurs transcriptionnels. La longueur de chaque gène est approximativement à l’échelle. sipB et sipC sont bicolores car ils peuvent servir simultanément de chaperons et d’effecteurs. Figure 14 : Représentation schématique de la régulation de l’expression du système de sécrétion de type III SPI-1 de S. typhimurium (Lostroh et al., 2001) La régulation des différents facteurs codés sur le SPI-1 mène à la production du SSTT SPI-1. Quand les conditions environnementales in vitro deviennent favorables pour l’expression des gènes d’invasion, HilD déréprime le promoteur hilA. Les cercles suivis d’une ligne en pointillé indiquent les ARNm, alors que les flèches indiquent la traduction des protéines. Le trait doublé par une flèche de chaque côté montre que HilA active directement l’expression de gène de structure tel que prg ou de gène de régulation tel que invF. La transcription d’invF est initiée au promoteur PinvF, elle résulte en la production d’un long ARNm qui continue au moins jusqu’à sicA. InvF, en complexe avec SicA, active directement l’expression d’effecteurs tels que SipB, SopE et SopB/SigD. HilD, comme indiqué par la flèche orange, a également une légère contribution sur l’expression de invF en activant le promoteur situé en amont du start de traduction de invF . Introduction S. typhimurium « injectisome », qui traverse les membranes internes et externes de la bactérie ainsi que la membrane plasmique de la cellule hôte. Sur SPI-2 sont retrouvés des gènes codant pour la structure et la régulation du système de sécrétion, pour les effecteurs ainsi que pour leurs chaperons. Rôle du système de sécrétion SPI-2 Ce second système de sécrétion est également très important puisqu’il garantit à la bactérie sa survie et sa prolifération dans le macrophage. De façon générale, après phagocytose d’une particule étrangère dans le macrophage, celle-ci se retrouve dans un phagolysosome où elle est digérée 15 à 30 minutes après son entrée. S. typhimurium a évolué de façon à pouvoir survivre et proliférer dans les macrophages. Ces capacités lui sont, en partie, conférées par ce second système de sécrétion de type III. A l’aide des effecteurs sécrétés SPI-2 dépendants, S. typhimurium détourne certaines machineries du macrophage à son profit. A l’aide de la vésicule de phagocytose, elle aménage une vacuole qui lui permet de proliférer à l’abri de l’environnement hostile du macrophage. La formation de cette vacuole est un processus dynamique et complexe impliquant un remodelage membranaire, des réarrangements des filaments d’actine, des mouvements de microtubules ou encore l’extension de tubules. Au final, la bactérie se retrouve dans une vacuole spécialisée appelée la Salmonella-Containing-Vacuole (SCV) qui la protège du système immunitaire inné. Au travers de l’analyse de différentes classes de mutants de gènes de SPI-2, ce système de sécrétion a été montré important pour lutter notamment contre la fusion des endolysosomes eucaryotes riches en enzymes lytiques avec la vésicule contenant S. typhimurium (Uchiya et al., 1999; van der Velden et al., 2000), contre l’entrée en apoptose des macrophages qui constitue une façon d’éliminer S. typhimurium (van der Velden et al., 2000), ou encore pour le maintien de la vacuole bactérienne à l’aide d’un réseau de filament d’actine (Méresse et al., 2001). Une étude publiée en 2000 par l’équipe de Ferric Fang a montré une implication du système de sécrétion SPI-2 dans le contrôle de l’assemblage de la NADPH phagocyte oxydase (Vazquez-Torres et al., 2000). Dans ce travail, les auteurs ont étudié les capacités de prolifération de divers mutants de S. typhimurium dans des macrophages sauvages et dépourvus de NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-). Dans des macrophages sauvages, un mutant du SSTT-2 est incapable de proliférer. Par contre, dans des macrophages gp91-/-, la 18 Introduction S. typhimurium capacité de prolifération de ce mutant est restaurée. Les auteurs ont proposé qu’un effecteur du SPI-2 altérerait l’assemblage de la NADPH phagocyte oxydase à la membrane de la SCV (Vazquez-Torres et al., 2000). De la même façon, une étude réalisée en 2002 a montré que le SSTT-2 interférait avec la NO. synthase inductible (Chakravortty et al., 2002). Les auteurs ont effectué des expériences d’infection de souris en utilisant comme précédemment un mutant du SSTT-2. Ils ont montré que cette souche était altérée dans sa capacité à survivre dans des macrophages sauvages. Par contre, en condition d’infection dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible, un mutant du SSTT-2 était toujours capable de survivre. Ainsi, ces résultats suggèrent que l’une des stratégies mise en place par S. typhimurium consiste à agir directement sur les enzymes responsables de la production des FAO et des FAN produites par le macrophage à travers le SSTT-2. Cette bactérie possède pourtant un arsenal enzymatique antioxydant très important. Une question peut alors être posée : les enzymes antioxydantes de S. typhimurium ont-elles un rôle durant l’infection du macrophage ? Régulation des gènes codant pour le système de sécrétion SPI-2 Parmi les régulateurs majeurs du système de sécrétion SPI-2 dépendant, on trouve SsrA/SsrB, SlyA et PhoP/PhoQ. SsrA/SsrB est un système de régulation à deux composants localisé sur SPI-2. SsrB est le régulateur de réponse et SsrA, le senseur du signal (Walthers et al., 2007). Ce système à deux composants est essentiel pour l’expression des gènes codant pour le système de sécrétion de type III et ses effecteurs. En l’absence de ce système, S. typhimurium est incapable de proliférer dans les macrophages et de survivre dans la souris. SsrB est capable de se fixer sur la région promotrice de ssrA, mais cette région n’est pas librement accessible à son facteur de transcription. En effet, des protéines contrôlant la topologie de l’ADN (H-NS, StpA, Hha, YdgT) recouvrent la région promotrice. En l’absence de SsrB, l’expression du SSTT-2 est réprimée par défaut d’accessibilité de l’ARN polymérase sur ses séquences cibles (Marshall et al., 2000). En présence de SsrB, il y a une compétition avec ces répresseurs pour l’accession à la région promotrice. SsrB entraîne donc une levée de répression de la transcription des gènes codant pour le système de sécrétion. SlyA est un facteur de transcription de S. typhimurium faisant partie de la famille de MarR, famille de facteur de transcription participant à l’adaptation de la bactérie à son 19 Introduction S. typhimurium environnement. La virulence des bactéries dépourvues du gène slyA est fortement atténuée dans les souris, ainsi que la résistance au peroxyde d’hydrogène (Libby et al., 1994; Daniels et al., 1996; Buchmeier et al., 1997). SlyA est une protéine de fixation à l’ADN qui montre une forte affinité pour les régions palindromiques (Stapleton et al., 2002), notamment pour le promoteur de ssrA (Okada et al., 2007). De la même façon que SsrB, SlyA régule l’expression du SSTT-2 en délogeant H-NS de la région promotrice de ssrA, facilitant ainsi l’accès à l’ARN polymérase (Ellison et al., 2006). PhoP/PhoQ est également un système de régulation à deux composants impliqué dans la régulation des gènes codant pour le SSTT SPI-2. PhoP, le régulateur transcriptionnel est capable de se fixer sur le promoteur du gène ssrB (Feng et al., 2004). PhoP/PhoQ participe également à la virulence de S. typhimurium indépendamment du SSTT-2. Cet aspect sera abordé plus loin. Outre les facteurs protéiques, la limitation en carbone, des faibles concentrations en ions Mg2+ ou Ca2+ et un pH acide induisent également l’expression des gènes du SPI-2 in vitro (Deiwick et al., 1999; Beuzon et al., 1999). c. Ilots de pathogénicité et transfert latéral de gènes S. typhimurium possède de nombreux îlots de pathogénicité, qui ont tous été acquis grâce à un transfert latéral de gène. Le pourcentage en GC de ces îlots est plus faible que celui des autres régions chromosomiques de la bactérie, ce qui est une caractéristique des transferts latéraux de gènes. Les sites d’insertion de beaucoup de ces îlots sont localisés prés de régions codantes pour des ARN de transfert. Ces ARN de transfert sont fortement conservés dans le règne bactérien et sont connus pour être des points d’ancrage pour l’intégration des phages tempérés dans le génome (Hacker et Kaper, 2000). Tous les îlots de pathogénicité de S. typhimurium, sauf exception avec le SPI-1, ont été trouvés associés avec des régions codant pour les ARN de transfert. Par exemple, le locus du SPI-2 a été retrouvé associé avec le gène tRNAValV (Hensel et al., 1997). L’acquisition par S. typhimurium des îlots de pathogénicité, par transfert horizontaux de gènes, est une des résultantes de la divergence évolutive entre les bactéries E. coli et S. typhimurium. 2- PhoP/PhoQ Outre les systèmes de sécrétion de type 3, PhoP/PhoQ constitue également un facteur de virulence majeur chez S. typhimurium. Il participe à l’adaptation aux environnements carencés 20 Introduction S. typhimurium en magnésium et régule de nombreuses fonctions cellulaires chez les bactéries à Gram négatif. Il peut agir dépendamment ou indépendamment du SSTT-2. a. Présentation de PhoP/PhoQ PhoP/PhoQ est constitué d’une protéine membranaire senseur PhoQ et d’une protéine régulatrice cytoplasmique PhoP. Son activation est en partie contrôlée par la concentration en ions Mg2+ et Ca2+ (Garcia-Vescovi et al., 1996). Ce système est activé en présence de concentration micromolaire en Mg2+ et réprimé en présence de concentration millimolaire en Mg2+ (Garcia-Vescovi et al., 1996; Kato et al.,1999). Hormis le Mg2+, de fortes concentrations en Ca2+ ainsi qu’en Mn2+ peuvent réprimer le régulon phoP (Garcia-Vescovi et al. 1996). Les peptides antimicrobiens sont également capables d’induire l’opéron phoP/phoQ. b. Activation par les ions Mg2+ Le senseur PhoQ possède deux segments transmembranaires, 1 boucle périplasmique et un long domaine cytoplasmique responsable de l’autophosphorylation. Il ressent la présence d’ions Mg2+ grâce à sa boucle périplasmique (Garcia-Vescovi et al., 1996). En présence d’une faible concentration en ions Mg2+, PhoQ s’autophosphoryle et transfère son phosphate à PhoP. PhoP phosphorylé fixe le promoteur des gènes constituant son régulon, il a, à la fois, un rôle d’activateur et de répresseur transcriptionnel. Parmi les gènes activés par PhoP, phoP et phoQ sont positivement autorégulés (Soncini et al., 1995). c. Implication de PhoP/PhoQ dans la virulence de S. typhimurium La régulation des gènes codant pour le système de sécrétion de type III SPI-1 Nous avons précédemment vu que PhoP/PhoQ participait à l’activation de la transcription des gènes codant pour le SSTT-2. En plus de ce système de sécrétion, PhoP/PhoQ régule également le SSTT-1. Paradoxalement, la survie d’une souche exprimant constitutivement phoP et présentant une augmentation de la transcription d’un facteur 10 des gènes activés par PhoP est dramatiquement atténuée dans sa virulence, notamment pour les temps précoces de l’invasion (Miller et Mekalanos, 1990). Ce phénotype peut être expliqué par le fait que PhoP réprime l’expression de hilA, régulateur majeur de l’expression du SSTT-1 (Bajaj et al., 21 Introduction S. typhimurium 1996). PhoP/PhoQ a également un rôle d’activateur de la transcription pour certains loci appartenant au SSTT-1, loci importants pour l’étape d’invasion de S. typhimurium. La transcription des gènes orgB et orgC est directement activée par PhoP en condition d’invasion (Aguirre et al., 2006). Résistance aux peptides antimicrobiens et modification du LPS Les peptides antimicrobiens, retrouvés dans les cellules immunitaires, déstabilisent la membrane interne et externe bactérienne. Le système PhoP/PhoQ est activé en présence de faibles concentrations en peptides antimicrobiens (Bader et al., 2003). Il active un système d’adaptation permettant à S. typhimurium de résister à l’action de ces peptides à travers le système à deux composants, PmrA/PmrB. Il semblerait que PmrA/PmrB soit impliqué dans la régulation d’environ 100 gènes, dont le rôle est, entre autres, de permettre la résistance aux peptides antimicrobiens à travers la modification de composition du LPS (Gunn et al., 2008). Certains composants sont alors greffés sur le lipide A du LPS entraînant un masquage des groupements phosphates dont la charge positive facilite l’interaction électrostatique avec les peptides antimicrobiens. PhoP active également la transcription de pagA, dont le rôle est aussi de modifier chimiquement la composition du LPS dans le but d’empêcher l’interaction entre le LPS et le peptide antimicrobien (Bishop et al., 2000). Rôle de PhoP/PhoQ dans le contrôle de la réplication bactérienne dans des fibroblastes Au cours de l’infection, S. typhimurium contrôle son niveau de prolifération intracellulaire. Cette constatation a été mise en évidence dans des fibroblastes et des cellules dendritiques, cellules localisées à proximité de l’épithélium intestinal et proposées pour être des cellules de transit de S. typhimurium au cours de l’infection systémique (Cano et al., 2001). PhoP/PhoQ parait être impliqué dans le contrôle de la prolifération puisque une souche de S. typhimurium dépourvue d’un système PhoP/PhoQ fonctionnel prolifère 20 fois plus qu’une souche sauvage dans les mêmes conditions (Cano et al., 2001). Les auteurs de l’étude ont proposé que le contrôle de la réplication intracellulaire permettait à S. typhimurium de rester masquée des cellules immunitaires afin de persister dans l’organisme. 22 Introduction S. typhimurium Régulateurs Gènes de structure Figure 15 : Représentation schématique de l’organisation génétique de l’opéron spv (Guiney et al., 2005) L’opéron spv est constitué des gènes de structure spvA, spvB, spvC, spvD et du régulateur spvR. spvR possède ses propres signaux de transcription. Cet opéron contribue à la virulence de S. typhimurium notamment en lui permettant de survivre dans les organes lymphoïdes secondaires. La régulation de l’opéron spvABCD dépend de l’activateur transcriptionnel SpvR et du facteur σ alternatif RpoS. L’expression de spvR est elle-même régulée par RpoS. Introduction S. typhimurium 3- Le plasmide pSLT Il existe de nombreux exemples de bactéries pathogènes pour qui les gènes localisés sur des plasmides sont primordiaux pour l’établissement de la virulence, nous pouvons citer comme exemples les espèces Shigella ou Yersinia. S. typhimurium ATCC 14028 possède également un plasmide de virulence, pSLT, dont les produits des gènes participent à la pathogénèse. a. L’opéron spv S. typhimurium possède un plasmide de virulence de 94 kb sur lequel est retrouvée une région conservée de 8 kb, l’opéron spv (Gulig et al., 1993). Cet opéron code pour cinq gènes, spvABCD et spvR, qui contribuent à l’établissement de l’infection systémique de la bactérie dans la souris (Fig. 15). Ces gènes sont requis pour l’étape précoce de l’infection dans les cellules intestinales et pour l’étape tardive de l’infection dans les organes lymphoïdes secondaires en modulant le taux de croissance bactérienne durant la phase systémique. L’opéron spv possède deux régulateurs transcriptionnels, SpvR et le facteur sigma alternatif, RpoS. SpvR active l’expression de l’opéron spv ainsi que sa propre expression (Coynault et al., 1992). Le gène codant pour SpvR est régulé par le facteur sigma alternatif, RpoS qui peut également activer directement l’expression de spv (Kowarz et al., 1994). La virulence conférée par l’opéron spv est notamment due à l’action de SpvB. Cette protéine possède une activité ADP-ribosyle transférase, essentielle pour la virulence dans le modèle murin (Fig. 16) (Lesnick et al., 2001; Tezcan-Merdol et al., 2001). SpvB entraîne une ADPribosylation de l’actine monomérique G la rendant incapable de polymériser en filament d’actine F. Elle agit ainsi comme une toxine intracellulaire en modifiant le niveau de polymérisation des filaments d’actine, phénomène notamment important pour la formation des phagolysosomes. Avec SPI-1 et SPI-2, l’opéron spv constitue le troisième exemple de facteurs de virulence de S. typhimurium dont l’action aboutit à la modification du cytosquelette de la cellule dans laquelle la bactérie réside (Fig. 17). b. L’opéron pef Le plasmide pSLT possède également un second opéron, pef, probablement impliqué dans l’établissement de la virulence. Cet opéron code pour les composants d’un fimbriae, qui sont des structures ancrées à la membrane plasmique bactérienne et orientées vers l’extérieur. Les fimbriae sont notamment impliqués dans la liaison avec d’autres composants extracellulaires. 23 Introduction S. typhimurium Actine G Actine F SpvB Figure 16 : Représentation schématique du mode d’action de SpvB (Guiney et al., 2005) spvB est codé sur l’opéron spv. SpvB agit comme une toxine au niveau du cytosquelette en dépolymérisant l’actine. Dans le macrophage, il y a un équilibre entre les monomères d’actines G et les filaments d’actines F polymérisés. SpvB possède un domaine ADP ribosyle transférase. Elle est capable de se lier de façon covalente à l’ADP-ribose des monomères d’actines G empêchant leur incorporation dans les polymères d’actine F. La conséquence est un appauvrissement de la cellule en filaments d’actines F. Le cytosquelette est alors désorganisé. Introduction S. typhimurium L’implication de l’opéron pef dans la virulence de S. typhimurium n’a pas encore été établie mais les propriétés d’adhérence des entéropathogènes sont cruciales, en effet, il a été montré que la protéine FimH, adhésine composant les fimbriae de type I, était requise lors de l’interaction de S. typhimurium avec les cellules dendritiques (Guo et al., 2007). Ces dernières, localisées dans l’épithélium intestinal, sont capables de capturer S. typhimurium dans la lumière intestinale à l’aide de leur dendrite. FimH permet une meilleure fixation et internalisation de la bactérie à l’intérieur de la cellule dendritique. 4- Les superoxyde dismutases périplasmiques S. typhimurium possède quatre superoxyde dismutases dont deux sont périplasmiques. Ces dernières feront l’objet de ce paragraphe, la fonction des deux superoxyde dismutases cytoplasmiques sera introduite dans le chapitre Stress Oxydant. a. Présentation de SodCI et SodCII Deux superoxyde dismutases périplasmiques sont retrouvées chez S. typhimurium, SodCI et SodCII (Fang et al., 1999). Ces enzymes sont responsables de la dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène (Fridovich, 1974). Elles possèdent dans leur site actif des atomes de cuivre et de zinc permettant le passage des électrons lors de la réaction de réduction. Pour cela, elles sont appelées des superoxyde dismutases Cu/Zn. Le gène codant pour SodCII est localisé sur le chromosome de la bactérie. Cette enzyme est l’orthologue de SodC d’Escherichia coli, qui est également une protéine à cuivre/zinc périplasmique (Canvin et al., 1996). sodC2 est régulé par RpoS et l’anoxie et ne semble pas important pour la virulence de S. typhimurium (Fang et al., 1999). SodCII participe à l’élimination de l’anion superoxyde produit par le métabolisme bactérien dans le périplasme (Voir section stress oxydant). SodCI, absente chez E.coli, est codée par le bactériophage Gifsy-2 qui est impliqué dans l’établissement de la virulence. Chez S. typhimurium, ce bactériophage a été acquis par un transfert latéral de gène. De nombreux phages sont capables de s’intégrer dans les génomes bactériens au niveau de régions particulières, formant ainsi des prophages. sodC1 est régulé par PhoP/PhoQ et participe à la virulence de S. typhimurium, notamment lors de l’étape de prolifération dans le macrophage (Golubeva et al., 2006). Les auteurs de l’étude ont suggéré 24 Introduction S. typhimurium Lumière intestinale SPI1 Plaques de Peyer SPI2 spv Foie et Rate Macrophages Figure 17 : Représentation schématique des sites d’action des systèmes de sécrétion de type trois et du plasmide de virulence de S. typhimurium (Guiney et al., 2005) S. typhimurium possède trois facteurs de virulence majeurs, le système de sécrétion de type trois SPI-1 (SPI1) pour l’invasion bactérienne, le système de sécrétion de type trois SPI-2 (SPI2) pour la prolifération dans les macrophages et l’opéron spv pour l’établissement et la survie dans les organes lointains. Dans chacun des trois cas, la bactérie remodèle le cytosquelette de la cellule à l’intérieur de laquelle elle est localisée, la cellule épithéliale pour le SPI-1, le macrophage pour le SPI-2 et pour l’opéron spv. Introduction S. typhimurium que l’importance de SodCI était liée au fait que cette enzyme protègeait une protéine essentielle située dans le périplasme de S. typhimurium (Golubeva et al., 2006). Cette protéine cible serait dégradée ou inactivée par l’anion superoxyde produit par la NADPH phagocyte oxydase. b. Comparaisons entre SodCI et SodCII Pourquoi seule SodCI est-elle impliquée dans la virulence de S. typhimurium ? Ces deux protéines possèdent 60% d’identité de séquence protéique. Malgré ce fort niveau d’identité, SodCI et SodCII n’ont pas la même implication chez S. typhimurium. Des expériences réalisées sur l’activité enzymatique des deux protéines ne permettent pas d’expliquer cette différence (Krishnakumar et al., 2007). Il semblerait plutôt que les propriétés structurales de SodCI puissent expliquer ce phénomène car elles lui confèrent une grande résistance à la dégradation par les protéases (Krishnakumar et al., 2007). En effet, SodCII est sensible à l’action des protéases alors que SodCI y est résistante. Il a ainsi été proposé que l’environnement vacuolaire étant riche en protéases, seule SodCI ne serait pas dégradée et pourrait éliminer l’anion superoxyde produit par la NADPH phagocyte oxydase. 5- RpoS, le facteur sigma alternatif de la phase stationnaire RpoS, σS ou σ38, est un facteur de régulation global au stress, présent chez toutes les γprotéobactéries. Cette protéine constitue l’une des sous-unités de l’ARN polymérase, qui est induite en début de phase stationnaire où elle rentre en compétition avec la sous-unité sigma 70 pour l’accès à l’ARN polymérase. Chez S. typhimurium, une souche dépourvue du gène codant pour RpoS est altérée dans sa capacité à résister à différents types de stress, à s’adapter à la carence nutritive, et à établir la virulence (Fang et al., 1992; Norel et al., 1992; RobbeSaule et al., 1995; Nickerson et al., 1997). Même si RpoS ne peut pas être définie comme un facteur de virulence au sens premier du terme, sa contribution est essentielle pour S. typhimurium en condition d’infection. a. Régulation de rpoS La régulation de rpoS se produit au niveau transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post traductionnel. RpoS est induite lors de carences en carbone, en phosphore, en azote et en acides aminés, par une osmolarité forte, un pH acide et un choc 25 Introduction S. typhimurium thermique (Gentry et al., 1993; Lange et al., 1994; Lange et al., 1991; Muffler et al., 1996; Lee et al., 1995; Bearson et al., 1996). Les protéines H-NS, Fis et la protéine CRP (cAMP Receptor Protein) participent également à la régulation de rpoS. ArcA/ArcB est un système de régulation à deux composants régulant également rpoS. ArcA/ArcB est un régulateur global intervenant lors du passage de la bactérie d’un environnement aérobie à un environnement anaérobie, il intervient aussi en fonction de l’état d’oxydoréduction des quinones (Malpica et al., 2006). ArcA/ArcB régule rpoS à un niveau transcriptionnel et post-traductionnel, soit par fixation de ArcA sur la région promotrice de rpoS réprimant ainsi son expression, soit en induisant la dégradation de RpoS par activation de la protéase ATP-dépendante ClpX via RssB (Mika et al., 2005). RssB est le régulateur de réponse principal impliqué dans la proteolyse de RpoS. Il est capable de délivrer RpoS directement au niveau des résidus catalytiques de la protéase ClpX (Becker et al., 1999; Stüdemann et al., 2003). BarA/UvrY est un autre système à deux composants impliqué dans la régulation transcriptionnelle de rpoS (Mukhopadhyay et al., 2000). Il participe à l’activation de la transcription de rpoS mais sa contribution n’est pas essentielle. Le rôle de BarA/UvrY semble être global : il affecte le métabolisme du carbone, la mobilité, la formation de biofilm et contribue à la virulence de souches d’E. coli uropathogènes (Pernestig et al., 2001 et 2003; Teplitski et al., 2003). Enfin, le système RscC/RscD/RscB participe à l’activation de la traduction de RpoS. Il s’agit d’un système participant à la mobilité bactérienne ainsi qu’à l’établissement de biofilms. b. Le régulon rpoS Chez E. coli et en condition de stress, 10 % du génome (≈ 430 gènes) est contrôlé par RpoS (Weber et al., 2005). Il en résulte une grande diversité dans la nature des gènes contrôlés par ce régulateur. RpoS peut jouer le rôle d’activateur et de répresseur transcriptionnels. Le premier gène appartenant au régulon rpoS à avoir été identifié est le gène codant pour la catalase KatE (Loewen et Triggs, 1984; Mulvey et Loewen, 1989). Les séquences promotrices reconnues par RpoS et σ70 sont très proches, ce chevauchement pouvant être expliqué par une forte similarité de structure entre les deux protéines. Pourtant, in vivo, ces deux sous-unités σ sont capables d’induire la transcription de gènes distincts (Becker et al., 2001), grâce à des régulateurs additionnels pouvant les orienter ainsi que des séquences spécifiques localisées dans les promoteurs (Ojangu et al., 2000; Arnqvist et al., 1994; Barth et al., 1995). 26 Introduction S. typhimurium c. Implication de RpoS dans la virulence de S. typhimurium Une étude réalisée en 1992 a montré pour la première fois l’implication de RpoS dans la virulence de S. typhimurium (Fang et al., 1992). Dans cette étude, les auteurs ont analysé la dose létale (DL50) de S. typhimurium nécessaire pour tuer des souris BALB/c. La DL50 du mutant rpoS est 1000 fois plus élevée que celle de la souche sauvage, ce qui indique que le mutant rpoS est fortement affecté dans ses capacités de virulence dans la souris. RpoS est un régulateur transcriptionnel global, les gènes appartenant à son régulon ont des implications très diverses et le phénotype du mutant rpoS obtenu dans les souris peut être expliqué de nombreuses façons. L’opéron spv, précédemment exposé, est activé par RpoS (Kowarz et al., 1994). Cette opéron participe, entre autre, à l’établissement de la bactérie dans les organes lymphoïdes secondaires. RpoS est également activé en présence de peptides antimicrobiens et participe à la résistance à ces composés (Bader et al., 2003). Un traitement de S. typhimurium avec des peptides antimicrobiens présensibilise la bactérie aux effets du stress oxydant. Les bactéries deviennent alors plus résistantes aux effets liés au stress oxydant, notamment au peroxyde d’hydrogène. Ce phénomène peut, en partie, être expliqué par le fait que le régulon rpoS de S. typhimurium est constitué, entre autres, des gènes sodCII, katE, et katN, enzymes possédant une activité antioxydante (Fang et al., 1999; Ibanez-Ruiz et al., 2000; Robbe-Saule et al., 2001). 27 Le stress oxydant Introduction Stress oxydant Figure 1 : Schéma de production des différentes formes actives de l’oxygène (FAO) à partir de l’oxygène moléculaire (Ziegelhoffer et al., 2009) Ce schéma représente les changements se produisant au niveau de l’orbitale externe de l’O2 au cours de la production des FAO. L’oxygène singulet, 1O2, est produit grâce à un transfert d’énergie sur l’oxygène moléculaire. Les électrons de la couche externe de cette FAO ont un spin parallèle. Le transfert d’un électron sur une molécule d’oxygène moléculaire (O2) aboutit à la production d’anion superoxyde (O2.-), qui possède un électron non apparié sur son orbitale externe. Le transfert d’un second électron produit de l’H2O2, structure stable possédant des électrons appariés sur l’orbitale externe. Enfin, le transfert d’un 3ème électron aboutit au clivage réducteur de l’H2O2 en radical hydroxyle (.OH) et en eau. Abbréviation: 1O2 : oxygène singulet, H2O2 : peroxyde d’hydrogène, O2.- : anion superoxyde, .OH : radical hydroxyle Introduction Stress oxydant L’oxygène moléculaire est apparu sur terre il y a 2 milliards d’années grâce à la photosynthèse oxygénique réalisée par les cyanobactéries. Il assure la survie de nombreux êtres vivants en permettant la production d’énergie via la respiration cellulaire. Par des réactions de transfert d’électrons ou de transfert d’énergie, il peut être converti en formes actives de l’oxygène (FAO), composés capables d’oxyder l’ensemble des macromolécules biologiques. Quand l’équilibre entre production de FAO et systèmes d’élimination des FAO (systèmes antioxydants) est rompu aux profits des FAO, la cellule est en état de stress oxydant (Harman et al., 1956). I- Les formes actives de l’oxygène (FAO) 1- Les radicaux libres La stabilité d’un composé chimique est liée à l’organisation de sa couche électronique externe. Dans un composé stable, les électrons sont appariés 2 à 2. Un radical libre est un atome ou une molécule ayant un ou plusieurs électrons non appariés sur son orbitale externe. Les électrons libres confèrent une grande instabilité et réactivité à la molécule car ils cherchent à s’apparier à un autre électron. Leur durée de vie est très courte. La plupart des FAO sont des radicaux libres, leur instabilité et réactivité leur confèrent leur nocivité. a. L’oxygène moléculaire L’oxygène moléculaire (O2) est une espèce biradicalaire avec une structure orbitale originale, il possède deux électrons non appariés à spin parallèle sur son orbitale externe (Fig. 1), alors que dans la plupart des cas, les électrons non appariés ont un spin antiparallèle. Due à des restrictions thermodynamiques, la réduction bivalente de l’oxygène en eau est la réaction prépondérante. Pourtant, dans certains cas thermodynamiquement défavorables, des réductions monovalentes de l’oxygène moléculaire peuvent se produire. La première forme résultant d’une réduction monovalente est l’anion superoxyde (O2.-). Cette réaction endothermique est catalysée par une oxydase. b. L’anion superoxyde L’anion superoxyde (O2.-) provient de la réduction univalente de l’oxygène moléculaire (Fig. 1). Il possède un atome non apparié sur sa couche orbitale externe. Son potentiel d’oxydoréduction (E°= -0,33V) lui permet de servir à la fois de réductant univalent ou bien d’oxydant univalent. Même si l’anion superoxyde n’est pas très réactif, il est cependant le 28 Introduction Stress oxydant précurseur d’autres FAO plus nocives. Il peut se dismuter en peroxyde d’hydrogène (H2O2) soit spontanément (Fridovich, 1983), soit enzymatiquement par une réaction catalysée par les superoxyde dismutases (Sod) (McCord et Fridovich, 1969). Contrairement à la plupart des réactions spontanées, l’autodismutation de l’anion superoxyde est rapide (constante de dismutation : 8.10-4M-1sec-1), la dismutation de l’anion superoxyde par les superoxyde dismutases est, toutefois, 106 fois plus rapide que le processus spontané. Sa charge électrique le rend incapable de diffuser à travers les membranes biologiques. c. Le radical hydroxyle Le radical hydroxyle (.OH) est un puissant oxydant, il peut également résulter de plusieurs réactions : Clivage réducteur du peroxyde d’hydrogène : H2O2 + e- + H+ → H2O + .OH Coupure homolytique du peroxyde d’hydrogène catalysée par les métaux : Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + -OH Cette réaction a été décrite pour la première fois en 1876 par Fenton. Elle s’interrompt par épuisement de l’ion Fe2+, sauf en présence d’O2.-, qui régénère l’ion Fe2+ en réduisant l’ion Fe3+ produit selon la réaction : Fe3+ + O2.- → Fe2+ + O2 Haber et Weiss ont identifié le radical hydroxyle comme étant l’agent oxydant de cette réaction. La réaction dite de Haber-Weiss (1934) donne alors : O2.- + H2O2 → .OH + -OH Le fait que cette réaction ne puisse se produire en absence de catalyseur métallique est aujourd’hui généralement accepté. d. L’anion radicalaire carbonate L’anion radicalaire carbonate (CO3.) est un oxydant possédant un électron non apparié sur son orbitale externe. En tant qu’espèce chargée, il constitue un agent oxydant important en environnement aqueux (Augusto et al., 2002). Il peut être produit : - soit à partir du CO2 : CO2 + H2O → H2CO3 → HCO3. + H+ → CO3. + 2H+ - soit à partir du radical hydroxyle : HCO3. + .OH → CO3. + H2O - soit à partir du peroxynitrite : ONOO- + CO2 → ONOOCO2- → .NO2 + CO3. 29 Introduction Stress oxydant 2- Les FAO non radicalaires a. L’oxygène singulet L’oxygène singulet (1O2) est une forme excitée de l’oxygène moléculaire dans laquelle les électrons appariés ont un spin antiparallèle (Fig. 1). Il est formé par transfert d’énergie à l’oxygène moléculaire, par exemple au moment de la capture d’énergie solaire par les photosystèmes des bactéries photosynthétiques. Les pigments présents dans les photosystèmes transfèrent de l’énergie à l’oxygène moléculaire produisant ainsi de l’oxygène singulet (Cogdell et al., 2000). Il faut 22 Kcal à l’oxygène pour être transformé en espèce singulet, cette énergie est rarement produite au cours des réactions biochimiques. b. Le peroxyde d’hydrogène Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) peut résulter de trois réactions (Naqui et al., 1986) : Dismutation de l’anion superoxyde : O2.- + O2.- + 2H+ → H2O2 + O2 Réduction univalente de l’anion superoxyde : O2.- + e- + 2H+ → H2O2 Réduction bivalente de l’oxygène : O2 + 2e- + 2H+. → H2O2 L’H2O2 n’est pas une espèce radicalaire car chacun de ses électrons est apparié. Il est tout de même capable d’oxyder certaines macromolécules biologiques en interagissant avec des métaux de transition (métal pouvant atteindre un grand degré d’oxydation) et est également précurseur d’une FAO très réactive, le radical hydroxyle (.OH) (Fig. 1). L’H2O2 est extrêmement diffusible, il peut traverser les membranes biologiques de la même façon que l’eau par les aquaporines (Seaver et al., 2001). Il est le substrat des catalases et des peroxydases qui le réduisent en eau (Loew, 1901; Seaver et al., 2001). 3- Origine des FAO Les FAO proviennent de deux sources distinctes. La première source est endogène (c’est-àdire intracellulaire), dans ce cas, la production de FAO est une conséquence passive du métabolisme aérobie. La seconde source est exogène, les FAO sont produites directement dans le milieu environnant, puis perçues par la bactérie. a. Les FAO d’origine endogène La chaîne respiratoire aérobie est le principal lieu de production endogène des FAO. Par exemple, au cours du transfert des électrons du NADH vers les ubiquinones via les différents 30 Introduction Stress oxydant Périplasme Membrane interne Cytoplasme . Figure 2 : Schématisation de la production cytoplasmique de FAO chez E. coli (adapté de Imlay, 2003) Au cours de la respiration aérobie, le cofacteur flavinique FADH2 de la NADH deshydrogènase II (Ndh II) peut distribuer par inadvertance des électrons à l’oxygène moléculaire présent dans le cytoplasme. Il en résulte la production d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène directement dans le cytoplasme bactérien. Introduction Stress oxydant composants de la chaîne respiratoire aérobie, 0,5% des électrons va être capté par l’oxygène moléculaire (Messner et al., 1999). La fuite électronique se situe au niveau du cofacteur flavinique FADH2 de la NADH déshydrogénase II (Fig. 2). Il en résulte la production d’H2O2 et d’O2.-. Les mêmes comportements ont été rapportés pour d’autres enzymes dont la succinate déshydrogénase, la fumarate réductase, la NADH déshydrogénase I, la glutamate synthase, la lipoamide déshydrogénase, et la sulfite réductase (Geary et al., 1977; Grinblat et al., 1991; Kussmaul et al., 2006; Messner et al., 1999; Messner et al., 2002). A l’aide de mutants d’E. coli dépourvus de catalases et de peroxyrédoxine, l’H2O2 et l’O2.- produits par le métabolisme bactérien ont pu être directement mesurés dans le milieu de culture (Seaver et al., 2001). Ainsi, il a été estimé que 10 à 15 µM/s d’H2O2 et 5 µM/s d’O2.-étaient formés par E. coli au cours de la phase exponentielle de croissance dans un milieu saturé en O2. De l’anion superoxyde produit selon le même mécanisme peut également être retrouvé dans le périplasme, il est estimé que 3 µM/s d’O2.- sont formés dans le périplasme d’E. coli en phase exponentielle de croissance (Han et al., 2001). b. Les FAO d’origine exogène Les lactobacilles sont des microorganismes commensaux de l’homme, retrouvés notamment dans la microflore de l’intestin. Ils participent à la résistance aux infections bactériennes, notamment grâce à la production de peroxyde d’hydrogène à des concentrations millimolaires à l’aide de flavoprotéines qui convertissent l’O2 en H2O2 (Eschenbach et al., 1989). La NADPH phagocyte oxydase produit de l’anion superoxyde à partir d’oxygène moléculaire. Cette enzyme est retrouvée dans de nombreuses cellules immunitaires et participe au contrôle de la prolifération bactérienne (Babior, 1999). La vitesse de production de l’anion superoxyde dans le macrophage est de 500 µM/s (Référence issue du site web EcoSal « Module 5.4.4 »). L’H2O2 peut également être produit en milieu de culture LB au travers de réactions photochimiques. Cette source de stress oxydant est d’ailleurs souvent largement ignorée bien que capable d’influencer directement le résultat d’une expérience (Cuny et al., 2007). 4- Les cibles des formes actives de l’oxygène Chez E. coli, une souche dépourvue de superoxyde dismutase ou de catalase et peroxyrédoxine est incapable de pousser en milieu minimum (Carlioz et al., 1986; Jang et al., 2007). Les mutants correspondants sont incapables d’éliminer l’anion superoxyde ou le peroxyde d’hydrogène et accumulent ces composés dans leur cytoplasme. La conséquence est 31 Introduction Stress oxydant (A) (B) [4Fe-4S]2+ + O2.- + 2H+ → [4Fe-4S]3+ + H2O2 [4Fe-4S]3+ → [3Fe-4S]1+ + Fe2+ Figure 3 : Schéma de l’inactivation d’un centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde (Imlay, 2003) L’anion superoxyde attaque un atome de fer du centre [4Fe-4S] , entrainant son oxydation. Il en résulte la perte de l’atome de fer au sein du centre [Fe-S], puis la déstabilisation et enfin la dégradation du centre [Fe-S]. (A) Schématisation de l’inactivation du centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde (B) Réaction d’oxydation du centre [4Fe-4S] par l’anion superoxyde Introduction Stress oxydant l’oxydation d’enzymes impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés et l’auxotrophie des souches. Par exemple, chez E. coli, dans un mutant dépourvu de catalase et de peroxyrédoxine, une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la leucine, l’IPMI, est inactivée (Jang et al., 2007). Cette enzyme possède un centre Fer/Soufre ([Fe-S]) oxydable par le peroxyde d’hydrogène. Ces phénotypes constituent la meilleure évidence que les bactéries vivant en aérobiose produisent de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène à des concentrations toxiques. a. Les cibles de l’anion superoxyde L’anion superoxyde est capable de détruire les centres [Fe-S] des protéines. E. coli possède plusieurs enzymes qui sont des cibles de l’O2.-, la dihydroxyacide déshydratase, l’aconitase B, la fumarase A et B (Flint et al., 1993; Gardner et al., 1991; Liochev et al., 1993). Dans ces protéines, l’O2.- est électrostatiquement attiré par l’atome de fer catalytique. Lorsque le centre est oxydé, il devient instable et se dégrade en libérant l’atome de fer (Fig. 3). L’oxydation des centres [Fe-S] a deux conséquences : la première est l’inactivation de l’enzyme, la seconde est la libération de l’ion Fe2+, substrat de la réaction de Fenton. Il a également été montré, que l’anion superoxyde pouvait réagir et oxyder les groupements thiols des cystéines (Winterbourn et al., 1999). b. Les cibles de l’H2O2 Chez E. coli, la croissance d’une souche dépourvue de catalase et peroxyrédoxine en milieu minimum est inhibée. Ce phénomène est dû à la production d’H2O2 par le métabolisme endogène du mutant ([H2O2] = 1 µM) (Seaver et al., 2001). Ce résultat illustre parfaitement la nocivité de l’H2O2 dont les cibles directes sont exclusivement protéiques. L’H2O2 est capable d’oxyder le groupement sulfhydrile des cystéines. La conséquence est la production de dérivés acides sulféniques qui peuvent soit former des ponts disulfures avec d’autres cystéines, soit atteindre un degré d’oxydation supérieur et former des acides sulfiniques ou sulfoniques (Fig. 4). L’H2O2 peut également oxyder l’atome de soufre de la méthionine produisant ainsi de la méthionine sulfoxyde puis de la méthionine sulfone. En présence d’H2O2 et de métaux de transition, l’arginine, la lysine, la thréonine, la proline et l’histidine peuvent être carbonylées. La carbonylation est une modification irréversible résultant de la greffe d’un groupement carbonyle sur les chaines latérales des acides aminés. Il 32 Introduction Stress oxydant Cystéine réduite R-S(H) H2O2 H2O Acide sulfénique H2O2 Acide sulfinique R-SO2(H) R-SO(H) R-SO(H) R-S-S-R Pont disulfure Acide sulfonique R-SO3(H) Figure 4 : Les différents états d’oxydation de la cystéine En présence d’une molécule d’H2O2, le groupement thiol de la cystéine est oxydé, la cystéine est alors transformée en acide sulfénique. Celui-ci peut soit former un pont disulfure avec un autre acide sulfénique, soit être tranformé en acide sulfinique en présence d’une seconde molécule d’H2O2. L’état final d’oxydation de la cystéine est l’acide sulfonique. Introduction Stress oxydant semblerait que le radical hydroxyle, dérivé de l’H2O2, soit directement responsable de l’oxydation. Chez E. coli, de faibles doses d’H2O2 sont capables de bloquer le cycle de Krebs ainsi que la biosynthèse de la leucine (Référence issue du site web EcoSal « Module 5.4.4 »). En effet, l’H2O2, au même titre que l’anion superoxyde, est capable d’attaquer les centres [4Fe-4S] de certaines déshydratases. Il semblerait que ces réactions d’oxydations se produisent essentiellement via la réaction de Fenton. c. Les cibles du radical hydroxyle Le radical hydroxyle (.OH) est la FAO la plus réactive et dont les conséquences sont les plus nocives pour la cellule. Il est capable d’endommager toutes les macromolécules biologiques, notamment l’ADN qui est une cible privilégiée du radical hydroxyle. Ce dernier est produit à partir d’H2O2 et d’ion ferrique. Etant donné que les acides nucléiques lient efficacement les atomes de fer, le radical hydroxyle est, ainsi, produit à proximité de la molécule d’ADN. Il est capable de chélater un atome d’hydrogène à une unité désoxyribose et entraîne alors une rupture de la molécule d’ADN entre le phosphate et le désoxyribose (Fig. 5). Ces ruptures monobrins sont aisément réparées par des systèmes enzymatiques spécialisés. Plus de 20 modifications oxydatives ont pu être identifiées suite à l’action du radical hydroxyle sur les bases de l’ADN (Halliwell et al., 1991). Les bases puriques et pyrimidiques sont toutes deux cibles de cette FAO, entraînant des modifications dont les conséquences peuvent être des mutations au niveau de l’ADN, la formation de sites abasiques ou la rupture de la molécule d’ADN (Fig. 6). d. Les lipides bactériens sont-ils ciblés par les FAO ? Chez les mammifères, les lipides sont très sensibles à la peroxydation lors d’un stress oxydant. Cependant, l’existence d’une telle réaction n’a pas été mise en évidence chez les bactéries. Les cibles lipidiques des FAO sont les acides gras polyinsaturés, or la plupart des bactéries ne possèdent que des acides gras monoinsaturés qui sont non réactifs (Bielski et al., 1983). 33 Introduction Stress oxydant Figure 5 : Schéma de la réaction du radical hydroxyle au niveau du désoxyribose de l’ADN Le radical hydroxyle est capable d’arracher un atome d’hydrogène à l’unité désoxyribose au niveau du carbone 4. Il en résulte la formation d’un clivage entre le phosphate et le désoxyribose et la rupture simple brin au niveau de la molécule d’ADN. Figure 6 : Schéma de la réaction du radical hydroxyle au niveau des bases de l’ADN Le radical hydroxyle est capable d’interagir avec les bases puriques et pyrimidiques de l’ADN. L’oxydation de la guanine par le radical hydroxyle aboutit à la formation du résidu 8-hydroxyguanine. Introduction Stress oxydant 5- Les mécanismes de défense bactériens contre les FAO Il existe deux stratégies antioxydantes principales. La première stratégie implique des systèmes d’élimination des FAO et la seconde, des systèmes de réparation des effets liés au stress oxydant. a. Les superoxyde dismutases, système d’élimination de l’anion superoxyde Les superoxyde dismutases (Sod) sont des enzymes qui catalysent la dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène : O2.- + O2.- + 2 H+ → H2O2 + O2 Chez les eubactéries, il existe différentes Sod dont la séquence, la structure, l’activité et la localisation varient. Par exemple, S. typhimurium possède 4 Sod dont 2 Sod cytoplasmiques (SodA et SodB) et 2 Sod périplasmiques (SodCI et SodCII). SodA et SodB possèdent 42% d’identité de séquence. sodA code pour une superoxyde dismutase à manganèse, il est régulé par SoxR/SoxS, un système d’adaptation bactérienne à l’anion superoxyde (Pomposiello et al., 2000). sodB code pour une superoxyde dismutase à fer, il est régulé par le régulateur du trafic de fer, Fur (Dubrac et al., 2002). Ces deux enzymes participent à l’élimination de l’anion superoxyde d’origine endogène. Deux Sod sont également localisées dans le périplasme de S. typhimurium, SodCI et SodCII. Ces deux enzymes sont des superoxyde dismutases à cuivre/zinc. sodCI est régulé par le système à deux composants PhoP/PhoQ et sodCII par RpoS (Golubeva et al., 2006; Fang et al., 1999). En dépit du fait que SodCI et SodCII possédent une forte identité de séquence protéique (60%), leur implication cellulaire est différente. SodCI participe à l’établissement de la virulence alors que SodCII, dont un orthologue est présent chez la plupart des entérobactéries, a été proposée pour lutter contre l’anion superoxyde produit par la chaîne respiratoire (Uzzau et al., 2002). SodCI et SodCII sont également évoquées dans le chapitre consacré aux facteurs de virulence de S. typhimurium. b. Les catalases et les peroxyrédoxines, système d’élimination de l’H2O2 Les catalases et les peroxyrédoxines sont impliquées dans l’élimination du peroxyde d’hydrogène. Elles ont fait l’objet d’une partie de ce travail de thèse, elles seront développées dans un chapitre indépendant. 34 Introduction Stress oxydant (A) (B) Figure 7 : Modèle d’activation de SoxR et induction de la transcription du régulon soxRS (Pomposiello et al., 2001; Demple, 1996) (A) Modèle d’activation de SoxR. En présence d’anion superoxyde, les deux centres [2Fe-2S]2+ de SoxR sont oxydés en [2Fe-2S]3+ . Il en résulte un changement conformationnel de SoxR qui améliore la fixation du régulateur sur sa région cible, le promoteur soxS, permettant sa transcription. (B) L’induction de la transcription du régulon soxRS nécessite deux étapes. Au cours de la première étape, SoxR est soit oxydé par l’anion superoxyde, soit nitrosylé par l’oxyde nitrique. Il en résulte une modification conformationnelle de SoxR qui peut alors activer la transcription de soxS. Au cours de la seconde étape, SoxS est produite et se fixe sur le promoteur des gènes cibles composant son régulon induisant leur transcription. Introduction Stress oxydant c. Les systèmes de réparation protéique : les méthionine sulfoxyde réductases, les thiorédoxines et les glutarédoxines L’oxydation de la plupart des acides aminés est un phénomène irréversible dont l’issue est la dégradation protéolytique. Il existe cependant deux acides aminés pouvant être oxydés puis réduits : la méthionine et la cystéine. Ces acides aminés soufrés sont largement exposés à l’oxydation et peuvent être réparés soit par les méthionine sulfoxyde réductases, soit par les systèmes de résolution des ponts disulfures, thiorédoxine/thiorédoxine réductase ou glutarédoxine/glutarédoxine réductase, respectivement. Les méthionine sulfoxyde réductases ont fait l’objet d’une partie de ce travail de thèse. Elles seront présentées dans une partie indépendante. Le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase est un système ubiquitaire. Il sert de système réducteur à certaines protéines cytoplasmiques telles que les méthionine sulfoxyde réductases ou la ribonucléotide réductase en réduisant les ponts disulfures (Gon et al., 2006; Russel et al., 1986). La thiorédoxine catalyse la réduction des ponts disulfures grâce à une activité thioltransférase, elle possède dans son site actif un motif conservé : Trp-Cys-Gly-Pro-Cys. La thiorédoxine réductase est une flavoprotéine qui catalyse la réduction de la thiorédoxine oxydée à l’aide des électrons du NADPH. Elle contient un domaine de fixation au NADPH dans lequel sont retrouvées deux cystéines, Cys135 et Cys138, impliquées dans l’activité catalytique de l’enzyme (Veine et al., 1998). Le motif C-X-X-C est ubiquitairement retrouvé dans le site actif des enzymes impliquées dans la résolution des ponts disulfures. Les glutarédoxines ont des structures similaires aux thiorédoxines. Elles possèdent également un site actif avec le motif C-X-X-C leur permettant de réduire les ponts disulfures, mais elles sont moins efficaces que les thiorédoxines. Une fois oxydées, les glutarédoxines constituent un substrat du glutathion (γ-glutamyl-cystéinyl-glycine), tripeptide abondant fournissant la cellule en groupements thiols dans le but d’« éponger » le stress oxydant endogène. La glutathion réductase est une flavoprotéine qui catalyse la réduction du glutathion oxydé (Ritz et Beckwith, 2001). 6- La régulation des systèmes d’adaptation au stress oxydant Il existe deux systèmes de régulation majeurs impliqués dans la résistance aux FAO chez S. typhimurium. Le premier est activé par l’anion superoxyde et le second par l’H2O2. 35 Introduction Stress oxydant Figure 8 : Modèle d’activation et de désactivation d’OxyR (Pomposiello et al., 2001) OxyR est un tétramère, il possède deux cystéines par monomère dont l’état d’oxydation détermine l’activité de la protéine. A l’état réduit, OxyR ne peut pas se fixer sur ses gènes cibles. En présence d’H2O2, les groupements sulfhydriles d’OxyR sont oxydés, il en résulte la formation de quatre ponts disulfures. Sous cette conformation, OxyR est actif et peut fixer le promoteur des gènes constituant son régulon. En absence d’H2O2 , la glutarédoxine est capable de réduire les ponts disulfures d’OxyR, elle exerce ainsi un rétrocontrôle négatif sur le régulon oxyR puisqu’elle-même en fait partie. Introduction Stress oxydant a. Le système SoxR/SoxS E. coli est capable de percevoir la présence d’anion superoxyde grâce à son système de régulation, SoxR/SoxS. SoxR est le senseur/régulateur de réponse et SoxS, un deuxième régulateur de réponse. SoxR est un homodimère qui possède un centre [2Fe-2S] 2+ par sousunité. En présence d’anion superoxyde, les centres [2Fe-2S]2+ de SoxR sont oxydés (Hidalgo et al., 1997) (Fig. 7A). Il en résulte un changement de conformation qui va permettre à SoxR d’activer la transcription de soxS (Chander et al., 2004) (Fig. 7B). La production de SoxS mène à l’activation d’un régulon composé d’une vingtaine de gènes dont ceux codant pour SodA qui participe directement à la dismutation de l’anion superoxyde, pour l’endonucléase IV qui participe à la réparation des dommages oxydatifs au niveau de l’ADN ou encore pour Fpr, dont le rôle est de réduire les centres [Fe-S] (Hidalgo et al, 1995). L’oxyde nitrique est également capable de nitrosyler les centres [Fe-S] de SoxR. La forme nitrosylée de SoxR est très stable et peut activer la transcription de soxS (Demple et al, 1999). b. Le régulateur OxyR Le prétraitement d’E. coli ou de S. typhimurium à 60 µM d’H2O2 entraine une augmentation de la résistance bactérienne à des concentrations molaires de peroxyde d’hydrogène (Demple et Halbrook, 1983; Winquist et al., 1984). Cette réponse adaptative nécessite la transcription d’une trentaine de gènes, dont la plupart sont régulés par le facteur de transcription OxyR. OxyR appartient à la famille de régulateur LysR. En présence d’H2O2, OxyR subit une régulation post-traductionnelle qui résulte en la formation d’un pont disulfure entre les cystéines 199 et 208 (Zheng et al., 1998; Tao et al., 1999) (Fig. 8). Dans cette conformation, OxyR se fixe sous forme de tétramère sur les promoteurs d’au moins 20 gènes et active leur transcription. OxyR est très sensible à l’oxydation, la formation du pont disulfure se produit à partir de 100 nM d’H2O2 (Aslund et al., 1999). En absence d’inducteur, la glutarédoxine 1 (Grx1) réduit le pont disulfure afin de régénérer OxyR (Zheng et al., 2001). grx1 fait partie du régulon oxyR, il participe ainsi à la répression du régulon via un rétrocontrôle négatif. Il a également été montré que la thiorédoxine 1 pouvait réduire la forme oxydée d’OxyR. En 2001, l’équipe de Gisela Storz a réalisé un transcriptome dans le but d’identifier, chez E. coli, les gènes dont la transcription était induite en présence d’H2O2 (Zheng et al., 2001). La majorité de ces protéines appartient au régulon oxyR. Ce régulon est constitué, entre autre, du gène codant pour la peroxyrédoxine AhpC, du gène codant pour la catalase KatG, ou encore du gène codant pour la protéine de séquestration du fer et de liaison à l’ADN Dps. Les auteurs 36 Introduction Stress oxydant ont montré qu’après traitement d’E. coli à 1 mM d’H2O2 pendant 10 minutes, les gènes dps, katG et ahpC étaient induits respectivement 180, 44 et 20 fois en comparaison avec une souche non exposée à l’H2O2 (Zheng et al., 2001). En plus de l’oxydation de la Cys199 et de la Cys208, l’hydroxylation, la nitrosylation ou la glutathionylation de la Cys199 augmentent les capacités de fixation d’OxyR sur les promoteurs de ses gènes cibles (Kim et al., 2002). 7- Les formes actives de l’azote A l’instar de l’oxygène, l’oxyde nitrique est une molécule centrale chez de nombreux êtres vivants dont l’importance provient notamment de son rôle de molécule signal. Une dérégulation de sa production peut entraîner des conséquences néfastes pour les cellules, notamment suite à la production d’espèces dérivées de l’oxyde nitrique, les formes actives de l’azote (FAN). a. Les réactions chimiques générées en présence de NO. ou de ses dérivés Réaction d’oxydation . Le NO et ses dérivés sont capables de réagir avec l’oxygène moléculaire, les métaux de transition ainsi que l’anion superoxyde. Les conséquences sont multiples : oxydation des protéines, oxydation des métaux, production de nouvelles FAN… Réaction de nitration La réaction de nitration est une réaction covalente résultant de l’ajout d’un groupement NO2. De nombreux composés, dont la tyrosine, sont sensibles à la nitration au cours de laquelle le groupement NO2 vient se greffer sur un carbone du noyau aromatique. De nombreuses enzymes catalysent la production de NO2. Réaction de nitrosylation Le NO. est capable de nitrosyler certaines protéines au niveau de leurs groupements amine, des noyaux aromatiques, des groupements alcool et thiols. La nitrosylation consiste en l’ajout d’un groupement NO.. L’oxydation des thiols produit des S-nitrosothiols, et l’oxydation des amines produit des nitrosamines. 37 Introduction Stress oxydant b. Présentation du NO. et des FAN Le NO. Le NO. est une petite molécule soluble dans l’eau et diffusible à travers les membranes biologiques. Il s’agit d’une espèce radicalaire possédant un électron non apparié sur son orbitale externe lui conférant une grande réactivité. A faible concentration (< 10-7 M), il agit en tant que molécule médiatrice de l’information, notamment pour les mammifères supérieurs chez qui il contrôle la pression sanguine et où il agit comme un messager du système nerveux central et périphérique. A forte concentration, le NO. peut avoir une activité bactéricide. Il peut directement inhiber la croissance de certains parasites eucaryotes tels que Leishmania ou Trypanosoma (Wanasen et al., 2008 ; Silva et al., 2003), ainsi que plusieurs espèces bactériennes en inactivant des enzymes de la chaîne respiratoire et du cycle de Krebs. En plus de son action directe, le NO. peut réagir avec les FAO. Les espèces résultantes, espèces actives de l’azote (FAN), sont en général beaucoup plus réactives et présentent ainsi un potentiel oxydant plus important. Le dioxyde d’azote Le dioxyde d’azote (NO2) peut résulter de plusieurs réactions : - l’autooxydation du NO. : 2 NO. + O2 → 2NO2 - la décomposition de l’acide péroxynitreux (ONOOH) : NO. + O2 - → ONOOONOO- + H+ → ONOOH ONOOH → NO2 + .OH - la réaction du NO. avec des hydroperoxydes organiques ROO + NO. → ROONO → RO + NO2 Il s’agit d’un oxydant fort capable de nitration sur certaines molécules. Il peut également être nitrosylé en N2O3. Le trioxyde d’azote Le N2O3 est un oxydant relativement faible : NO2 + NO. → N2O3 A pH neutre, il s’agit de l’espèce prédominante formée à partir du NO.. Il peut agir directement et indirectement sur ses cibles soit en oxydant, soit en nitrosylant ses molécules cibles. En terme chimique, le N2O3 est quasi identique à l’acide nitreux. 38 Introduction Stress oxydant Le peroxynitrite Le peroxynitrite résulte de la combinaison entre le NO. et l’anion superoxyde : NO. + O2.- → ONOOIl s’agit d’une réaction très rapide car le NO. et l’anion superoxyde sont des radicaux libres. Le taux de formation du peroxynitrite est 3,5 fois plus important que la réaction de l’anion superoxyde avec la superoxyde dismutase (Squadrito et al., 1995). Cette observation suggère que si le NO. et l’O2.- sont produits simultanément, la réaction de production du peroxynitrite sera majoritaire par rapport à la dismutation enzymatique de l’O2.-. Le pKa du peroxynitrite est de 6,8. En solution acide, il forme de l’acide péroxynitreux, qui à son tour forme du nitrate (NO3-). Le peroxynitrite est extrêmement oxydant, et peut agir via des réactions d’oxydation à un électron ou à 2 électrons ou via des réactions de nitration sur de nombreuses cibles. Les travaux de Lymar et collaborateurs ont montré que les actions du peroxynitrite sont influencées par la présence de CO2 (Lymar et al., 1996). Le CO2 module principalement les réactions de nitration provoquées par ONOO-. Il réagit avec le dioxyde de carbone pour former l’ion nitrosoperoxycarbonate : CO2 + ONOO- → ONOOCO2En l'absence d'un substrat adéquat (une molécule aromatique comme la tyrosine, par exemple), l'adduit se décompose en nitrate et CO2. Sinon, il se forme du NO2• et un radical anionique CO3• (l'anion carbonyle). Le système (NO2• + CO3•) réalise des nitrations monoélectroniques des composés aromatiques (Bonini et al., 1999). c. Production des FAN Les NO. synthases Le NO. peut être produit par les NO. synthases via des réactions séquentielles d’oxydation de l’arginine : L-Arginine + O2 + NADPH → Nw-hydroxyle-L-arginine + H2O + NADP+ Nw-hydroxyle-L-arginine + ½NADPH + O2 → L-citrulline + NO. + H2O + ½NADP+ L’équation peut être résumée de la sorte : O2 + L-arginine → NO. +L-citrulline Les NO. synthases sont des enzymes exclusivement présentes chez les eucaryotes. Il existe trois isoformes : 2 sont constitutives et fonctionnent avec la calmoduline (NO. synthase 39 Introduction Stress oxydant N2O3, NO. Péroxynitrite Guanine fragmentée Guanine oxydée Liaison croisée entre les molécules d’ADN ADN 8-Nitro-dG Désoxyribose oxydé Bases désaminées Sites abasiques Sites abasiques Cassure simple brin Figure 9 : Voies d’endommagement de l’ADN en présence de NO. et de FAN (adapté de Burney et al., 1999) Le N2O3 et le NO. sont capables de désaminer l’ADN entraînant ainsi la production de sites abasiques pouvant aboutir à la formation de cassures simple brin de l’ADN. Le peroxynitrite oxyde l’ADN au niveau des bases et du désoxyribose. Il en résulte également la production de sites abasiques et des cassures simple brin de la molécule d’ADN. Introduction Stress oxydant endothéliale et neuronale), alors que la troisième est inductible et indépendante de la calmoduline (NO. synthase inductible) (Mori et al., 2004). La disponibilité en arginine intracellulaire est le facteur limitant de la réaction de production de NO.. Les NO. synthases sont également abordées dans le chapitre consacré à S. typhimurium. La nitrate réductase L’assimilation du nitrate est une voie majeure pour l’approvisionnement en azote des plantes et de certains microorganismes. Parce que la réduction du nitrate est une étape limitante, la nitrate réductase est considérée comme une enzyme clé dans la voie d’assimilation du nitrate. Chez certains organismes, notamment les plantes, la nitrate réductase a également la capacité de produire du NO. à partir de nitrite (Yamasaki et al., 2000). Le rôle proposé du NO. produit à partir du nitrite serait d’une part de diminuer la concentration en nitrite qui est un composé phytocytotoxique, mais également de participer à des cascades de transduction de signaux (Grace et al., 1998 ; Delledonne et al., 1998). 8- Les cibles des FAN A l’instar des FAO, les FAN sont capables de réagir avec un grand nombre de macromolécules biologiques. L’ADN est une cible du NO., du N2O3 et de l’ONOO- (Fig. 9). In vitro, le NO. et le N2O3 ont la capacité de désaminer les nucléosides ainsi que les nucléotides (Wink et al., 1991). Dans la majorité des cas, la désamination a lieu au niveau d’une cytosine et produit de l’uracile qui est éliminée par une uracile glycosylase. Il en résulte la formation d’un site abasique, lésion fréquemment « réparée » par la mauvaise insertion d’une adénine à la place de la cytosine. Ainsi, on assiste à une transition de G:C→A:T, pouvant être conservée au cours de la réplication. L’exposition au NO. peut également entraîner la formation de clivage simple brin de l’ADN (Tamir et al., 1996). La désamination de la guanine aboutit à la production de xanthine qui selon un mécanisme commun à celui décrit précédemment va être éliminée et non remplacée et ainsi engendrer la création d’un site abasique. Les sites abasiques peuvent, dans certains cas, être clivés par des endonucléases et créer ainsi de l’ADN simple brin. Le peroxynitrite n’entraîne pas de désamination mais une oxydation de la molécule d’ADN. A très faible concentration, il peut causer des cassures au niveau de l’ADN de façon beaucoup plus efficace que le NO.. En effet, des lésions ont été observées sur des plasmides mis en 40 Introduction Stress oxydant présence de 2 à 5 µM d’ONOO- (Kennedy et al., 1997). Il semblerait que l’ONOO- attaque directement le désoxyribose de la molécule d’ADN. Le peroxynitrite a également la capacité de réagir avec les métalloprotéines. Des études ont montré que cette FAN pouvait oxyder des protéines à hème telles que les catalases (Floris et al., 1993). Il a également été montré que l’ONOO- pouvait réagir avec les NO. synthases et les inhiber irréversiblement (Pasquet et al., 1996). Enfin, l’ONOO- est capable d’endommager les centres [Fe-S] des protéines, comme notamment l’aconitase B, avec pour conséquence l’inactivation de l’enzyme (Bouton et al., 1997). La tyrosine est un acide aminé sensible à la nitration. En présence de peroxynitrite, la tyrosine est modifiée en 3-nitrotyrosine (Reiter et al., 2000). De façon générale, la nitration des tyrosines est une réaction longue qui se produit en présence de fortes concentrations en peroxynitrite (Pfeiffer et al., 2000). Cependant, en présence de métaux de transition tels que l’ion ferrique (Fe3+) ou le CO2, l’action du peroxynitrite sur les tyrosines semble plus efficace (Beckman et al., 1992, Lymar et al., 1996). En présence de FAN, les lipides peuvent être soit oxydés, soit nitrés. Le peroxynitrite est l’espèce majoritairement responsable de ces réactions. La réaction d’oxydation du peroxynitrite est fortement dépendante du pH et peut se faire à l’aide d’un ou deux électrons. L’ONOO- réagit soit directement avec les acides gras insaturés, soit en se décomposant en NO2. et .OH (Botti et al., 2004). La conséquence est l’initiation de l’oxydation des lipides. L’ONOO- peut également induire une réaction de nitration. Il en résulte la production d’un intermédiaire alkyl peroxynitrite (LOONO) qui est hautement instable et qui se décompose spontanément pour former une espèce capable de réinitier le processus de nitration (Rubbo et al., 1994). 9- Les mécanismes de défense contre les FAN a. Les enzymes catalysant l’élimination du NO. Il existe de nombreux mécanismes de détoxication du NO. et des FAN. Seuls quelques exemples seront illustrés dans la partie suivante. Les flavohémoglobines La flavohémoglobine d’E.coli (Hmp) est un monomère hémique de 44 KDa. Hmp catalyse la réduction du NO. selon la réaction suivante : 2 NO. + 2O2 + NADPH → 2NO3- + NADP+ + H+ 41 Introduction Stress oxydant La partie C-terminale d’Hmp ressemble fortement aux réductases à ferrédoxine NADP+ car elle possède des sites de fixation conservés pour le FAD et le NADPH. Son domaine réductase est essentiel, il lui confère la capacité de transférer ses électrons du NADPH vers l’hème (Hernandez-Urzua et al., 2003). La transcription d’hmp est directement régulée par le NO. et certaines de ses formes dérivées (Poole et al., 1996). Chez S. typhimurium, Hmp protège également des effets du NO., des S-nitrosothiols et du nitrate acidifié (Crawford et al., 1998 ; Bang et al., 2006). Les flavorubrédoxines Les flavorubrédoxines sont des protéines possédant deux atomes de fer dans leur site actif ainsi qu’un site de fixation au NO. (Wasserfallen et al., 1998). Chez E. coli, le gène codant pour la flavorubrédoxine NorV est retrouvé au sein de l’opéron norRVW (Gardner et al., 2003). Ces enzymes sont impliquées dans la détoxication du NO. en anaérobiose. Au cours de la réduction du NO., 2 molécules de NO. se lient au centre actif (Fe2+-O- Fe2+) et sont réduites en anions nitroxyles (NO-). Les deux molécules de NO- vont ensuite se combiner pour former du N2O et de l’eau. La nitrite oxyde réductase Chez les procaryotes, le NO. peut également jouer un rôle d’intermédiaire du cycle de l’azote, notamment lors du processus de dénitrification. Chez les bactéries dénitrifiantes, le NO. est réduit en NO2 par les nitrite oxyde réductases (NOR) (Zumft, 1997). Les NOR sont des enzymes membranaires contenant un hème dans leur sous-unité catalytique, évolutivement très proches des réductases à oxygène hème/cuivre (Saraste et al., 1994). b. Les enzymes catalysant l’élimination du peroxynitrite Les peroxyrédoxines AhpC et TsaA AhpC et TsaA sont des peroxyrédoxines qui ont été préalablement décrites pour leur capacité à éliminer les hydroperoxydes, parmi lesquels l’H2O2. En 2001, une étude a montré que ces enzymes avaient une activité peroxynitrite réductase in vitro (Bryk et al., 2000). Les auteurs ont purifié la protéine AhpC de S. typhimurium et TsaA d’H. pylori. En présence de fortes concentrations en AhpC, l’ADN est protégé des lésions simples brins causées par le peroxynitrite. AhpCF et TsaA catalysent la réduction du peroxynitrite en nitrite, composé peu nocif pour les macromolécules biologiques. La réaction de réduction est réalisée par la 42 Introduction Stress oxydant NH3+-CH-COOMéthionine NH3+-CH-COO- NH3+-CH-COO- Méthionine sulfoxyde Méthionine sulfone Figure 10 : Formule chimique de l’acide aminé méthionine et de ses formes oxydées MsrA L-Méthionine-(S)-sulfoxyde FAO L-Méthionine L-Méthionine-(R)-sulfoxyde MsrB Figure 11 : Cycle d’oxydoréduction de la méthionine chez E. coli En présence d’H2O2, la L-méthionine est oxydée en L-méthionine-(S)-sulfoxyde ou en Lméthionine-(R)-sulfoxyde . La méthionine-(S)-sulfoxyde est réduite en méthionine par MsrA et la méthionine-(R)-sulfoxyde par MsrB. Introduction Stress oxydant cystéine péroxidatique d’AhpC soit à travers une oxydation, soit à travers une nitrosylation du groupement thiol. AhpF est nécessaire pour la réduction du système. Il semblerait que cette activité soit spécifique du peroxynitrite et non de l’oxyde nitrique ou de formes dérivées. Les autres composés éliminant le peroxynitrite Il existe plusieurs classes de composés impliquées dans l’élimination du peroxynitrite. Parmi ces composés, on peut relever la présence de protéines thiolées, catalyseurs efficaces de la réduction du peroxynitrite. On retrouve également des centres métalthiolates au sein de protéines, des métalloporphyrines, des méthionines, des protéines à sélénium, du glutathion… Les métalloporphyrines à fer ou à manganèse réduisent le peroxynitrite de façon catalytique, elles protègent ainsi la cellule des dommages oxydatifs liés au NO.. II- Les méthionine sulfoxyde réductases 1- La méthionine a. Caractéristiques de la méthionine La méthionine est un acide aminé à caractère hydrophobe contenant une fonction thioéther (Fig. 10). Il s’agit d’un des acides aminés les plus sensibles à l’oxydation qui produit de la méthionine sulfoxyde. La présence de métaux de transition peut entraîner une oxydation supplémentaire en méthionine sulfone (Toennis et Kolb, 1941) (Fig. 10). L’oxydation de la méthionine au sein d’une protéine peut entraîner un changement conformationel dont la conséquence peut être une déstructuration ainsi que la perte de fonction de la protéine. Il existe de nombreux exemples relatant de l’importance des méthionines dans le maintien de l’activité enzymatique des protéines. b. La méthionine, une "éponge" à stress oxydant Une étude réalisée en 1999 et portant sur l’oxydation de la glutamine synthase a montré que sur les 16 résidus méthionines présents dans la protéine, 8 pouvaient être oxydés sans entraîner de conséquences majeures pour l’activité de l’enzyme (Stadtman et al., 1992). Les résidus oxydés étaient exposés en surface de l’enzyme alors que les résidus réduits étaient enfouis dans l’enzyme. Les auteurs ont proposé l’existence d’une différence de sensibilité des résidus méthionines à l’oxydation selon leur localisation dans la protéine, ainsi les résidus méthionines agiraient en tant qu’"éponge" antioxydante avec un rôle protecteur pour la protéine. 43 Introduction Stress oxydant Figure 12 : Schéma de la réaction enzymatique des méthionine sulfoxyde réductases (BoschiMuller et al., 2000) La cystéine 51, Cys51, de la méthionine sulfoxyde réductase attaque l’atome de soufre de la méthionine sulfoxyde (IA). Il en résulte un réarrangement moléculaire aboutissant à la libération de la méthionine réduite et à la formation d’un acide sulfénique (IB). Celui-ci va être attaqué par la Cys198 pour former un pont disulfure entre la Cys51 et la Cys198 (IIB). Ce pont disulfure sera alors échangé entre la Cys198 et la Cys206 puis sera réduit par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (III). Introduction Stress oxydant 2- Les méthionine sulfoxyde réductases Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) sont des enzymes spécifiquement impliquées dans la réparation des méthionines sulfoxydes, qu’elles soient libres ou enchâssées dans un squelette peptidique. La découverte de MsrA remonte à l’année 1979 (Ejiri et al., 1979). La première caractérisation de MsrB a été réalisée dans l’équipe en 2001 (Grimaud et al., 2001). a. Aspects biochimiques Il existe deux diastéréoisomères de méthionines sulfoxydes, la méthionine-S-sulfoxyde et la méthionine-R-sulfoxyde, classification effectuée en fonction de la stéréochimie de l’atome de soufre sur la chaîne latérale. La réduction des méthionines sulfoxydes en méthionines est catalysée par MsrA et MsrB qui sont spécifiques des diastéréoisomères S et R, respectivement (Sharov et al., 1999 ; Grimaud et al., 2001) (Fig. 11). b. Réaction catalytique Toutes les Msr caractérisées à ce jour présentent le même mécanisme de réduction, composé de trois étapes catalytiques (Boschi Muller et al., 2000 ; Olry et al., 2002). La première étape mène à la formation d’un acide sulfénique sur la cystéine catalytique, Cys51. Il en résulte la libération concomitante de méthionine (Fig. 12). Puis, un pont disulfure intramoléculaire est formé suite à l’attaque d’une seconde cystéine, Cys198 (appelée cystéine de recyclage) sur l’intermédiaire acide sulfénique et à la libération d’une molécule d’eau. Le pont disulfure est ensuite transféré entre la Cys198 et la Cys206. Enfin, il est réduit par le système de réduction thiorédoxine/thiorédoxine réductase. L’étape limitante de la réduction des méthionines sulfoxydes par les Msr est associée au recyclage de la thiorédoxine. MsrA et MsrB réalisent la même réaction catalytique en dépit du fait que ces deux protéines soient structuralement très éloignées ( elles ne présentent aucune homologie de séquence ou de structure (Kauffmann et al., 2002)). 3- Organisation génétique et régulation de msrA et msrB a. Organisation génétique msrA et msrB comptent parmi les gènes les plus conservés dans le règne du vivant, suggérant une origine ancestrale commune et une grande importance dans la physiologie cellulaire. Ainsi, des orthologues de msrA et msrB sont présents dans la plupart des génomes. Pourtant, 44 Introduction Stress oxydant leur organisation génétique ainsi que le nombre de copies varie d’une espèce à l’autre (Ezraty et al., 2005). Chez de nombreux procaryotes, dont E. coli et S. typhimurium, msrA et msrB constituent deux unités de transcription indépendantes avec une localisation chromosomique opposée. Chez Bacillus subtilis, msrA et msrB forment un opéron. Enfin, chez Neisseria, msrA et msrB sont fusionnés au sein d’un même gène et codent deux domaines d’une protéine qui contient également un domaine thiorédoxine (Olry et al., 2002). E. coli possède une copie de chaque gène alors que Staphylococcus possède trois copies de msrA et une copie de msrB (Singh et al., 2003). b. Régulation de msrA et msrB Chez E. coli et S. typhimurium, les régulateurs de l’adaptation au stress oxydant sont OxyR et SoxR. Pourtant, ni msrA ni msrB n’appartiennent à leurs régulons. Des travaux portant sur la régulation de msrA d’E. coli ont révélé que l’activité méthionine sulfoxyde réductase de MsrA augmentait d’un facteur 3 entre le milieu de phase exponentielle et la phase stationnaire de croissance indiquant que la transcription de msrA semblait dépendante de la phase de croissance (Moskovitz et al., 1995). L’étude de la régulation de msrB a, en partie, était réalisée au laboratoire. Des travaux non publiés réalisés par Julia Bos ont montré que la régulation de la transcription de msrB était dépendante de l’ARN non codant, RhyB. Cette régulation est directement liée à la biodisponibilité du fer chez E. coli puisque RhyB est luimême régulé par le régulateur de trafic ferrique, Fur. 4- Les substrats des Msr a. La protéine ribosomale L12 La protéine ribosomale L12 est impliquée dans la synthèse protéique. Elle possède trois résidus méthionines sensibles à l’oxydation (Caldwell et al., 1978). L’oxydation des méthionines en méthionines sulfoxydes entraîne des perturbations fonctionnelles qui empêchent la protéine L12 de se lier à ses ribosomes et d’assurer sa fonction. Il a été montré in vitro que l’activité de la protéine L12 pouvait être restaurée après réduction des méthionines sulfoxydes par MsrA d’E. coli. La protéine L12 a été le premier substrat de MsrA caractérisé in vitro (Brot et al., 1981). b. La protéine chaperon GroEL 45 Introduction Stress oxydant La protéine chaperon GroEL d’E. coli assure le repliement des protéines nouvellement synthétisées. GroEL est insensible à certaines espèces actives telles que l’oxyde nitrique ou le peroxyde d’hydrogène mais peut être oxydée par le peroxynitrite ou l’HOCl. L’activité de GroEL est alors abolie. MsrA et MsrB peuvent réduire les méthionines sulfoxydes de GroEL et ainsi réactiver l’enzyme in vitro (Khor et al., 2004). c. Le complexe SRP Chez E. coli, le complexe SRP (Signal Recognition Particule) reconnait la séquence signal des protéines en cours de synthèse et les adresse vers la membrane plasmique. Chez les procaryotes, SRP est une ribonucléoprotéine constituée de l’ARN 4,5S fixant une protéine Ffh au niveau de son domaine M (car riche en méthionines). Dans l’équipe, il a été montré que l’oxydation du domaine M de Ffh entraînait la perte de fixation à l’ARN 4,5S et que la conséquence était un défaut d’exportation des protéines extracytoplasmiques (Ezraty et al., 2004). L’étude a également montré que Ffh oxydée était un substrat de MsrA et MsrB, et que ces deux enzymes pouvaient restaurer l’activité de Ffh oxydée. Il s’agit de la première étude pour laquelle l’implication de MsrA et MsrB a été montrée in vivo. 5- Rôle de MsrA et MsrB dans la pathogénicité a. Erwinia chrysanthemi E. chrysanthemi est un pathogène de plantes dont les facteurs de virulence sont essentiellement des enzymes digestives de la paroi cellulaire des végétaux. MsrA est un autre exemple de facteur de virulence chez ce phytopathogène exposé à la réponse oxydante des plantes (Hassouni et al., 1999). Un mutant msrA d’E. chrysanthemi est incapable d’envahir les feuilles des végétaux ou d’établir une infection systémique. b. Mycoplasma genitalium M. genitalium est l’organisme possédant le plus petit génome doué de réplication autonome. Il est impliqué dans des pathologies humaines telles que des infections respiratoires et urogénitales. La capacité d’adhérence de M. genitalium sur sa cellule hôte est indispensable pour le succès de l’infection. MsrA participe à l’établissement de la virulence de M. genitalium en affectant la capacité d’adhérence de ce dernier, en effet, un mutant msrA est incapable d’adhérer à des érythrocytes de mouton (Dhandayuthapani et al., 2001). 46 Introduction Stress oxydant c. Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae est un autre exemple de pathogène pour qui MsrA est importante pour les capacités d’adhérence du pathogène à sa cellule hôte. Chez S. pneumoniae, un mutant msrA perd près de 75 % de sa capacité d’adhérence (Wizemann et al., 1996). MsrA participe également à l’adhérence sur des cellules hôtes chez E. coli et chez Neisseria gonhorrae (Wizemann et al., 1996). III- Les catalases Les catalases sont des enzymes clés du système antioxydant et sont présentes chez la plupart des organismes vivants. La réaction catalysée par les catalases est la dégradation de deux molécules de peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène : 2H2O2 → H2O + O2 Les catalases constituent une grande famille enzymatique dont une première classification a été réalisée en 1989 par Goldberg et Hochman, les critères de classification étaient basés sur les propriétés physicochimiques (Vitesse maximale (Vm), constante catalytique (Kcat)…) de catalases isolées. L’existence de 3 groupes de catalases avait alors été proposée : les catalases typiques, les catalases atypiques et les catalases-peroxydases (Goldberg et Hochman, 1989). Cette classification souleva de nombreux problèmes, notamment dus au fait que les propriétés des catalases avaient été établies à partir d’enzymes non purifiées à homogénéité, ce qui engendra de nombreux artefacts. De plus, avec l’apport constant de nouvelles séquences de catalases, la classification sur les critères physicochimiques fut abandonnée pour une classification basée sur des critères phylogénétiques (Von Ossowski et al., 1993 ; Mayfield et Duval, 1996). A ce jour, plus de 300 séquences de catalases sont disponibles dans les banques de données classifiées soit parmi les catalases monofonctionnelles, soit parmi les catalasesperoxydases, soit parmi les catalases à manganèse. Dans son génome, S. typhimurium possède une catalase monofonctionnelle, KatE, une catalase-peroxydase KatG et une catalase à manganèse, KatN (Robbe-Saule et al., 2001). 1- Les caractéristiques des trois groupes de catalases a. Les catalases monofonctionnelles La plupart des catalases présentes chez les eucaryotes et chez les procaryotes font parties de ce groupe. Il s’agit d’enzyme à hème possédant une grande sous-unité (> 75 KDa) et une 47 Introduction Stress oxydant Figure 13 : Représentation du noyau hémique présent dans le site actif des catalases monofonctionnelles Le noyau hémique présent dans le site actif des catalases est constitué d’un atome d’ion ferreux (Fe2+) qui est coordonné avec un noyau tetrapyrolle de protoporphyrine IX. Les porphyrines sont des molécules cycliques formées de 4 noyaux pyrolles unies par des liens methenyl. Introduction Stress oxydant petite sous-unité (< 60 KDa), structurée en homotétramère. Dans la majorité des cas, la protoprophyrine IX constitue l’hème (Fig. 13). Ces catalases dégradent l’H2O2 par une réaction biphasique. Dans la première étape, une molécule d’H2O2 oxyde l’hème de la protoporphyrine IX en une espèce oxo-férryle (FeIV=O). La seconde molécule d’H2O2 est utilisée en tant que réductant de l’espèce oxo-férryle pour régénérer l’enzyme en produisant de l’eau et de l’oxygène : .+ Por FeIII + H2O2 → Por FeIV=O + H2O .+ Por FeIV=O+ H2O2 → Por FeIII + H2O + O2 2 H2O2 → 2H2O + O2 Les catalases monofonctionnelles sont divisées en trois clades : le clade 1 est composé presqu’exclusivement de catalases de plantes et d’un sous-groupe de catalases bactériennes, le clade 2 est constitué de la grande sous-unité des catalases bactériennes et fongiques et le clade 3, de la petite sous-unité des catalases bactériennes, fongiques, eucaryotes et d’archaebactéries (Klotz et al., 1997). La large sous-unité des catalases du clade 2 comprenant des enzymes telles que KatE de S. typhimurium, est extrêmement résistante à la dénaturation thermique, au pH et à la protéolyse (Switala et al., 1999). L’activité de KatE augmente jusqu’à 60°C et commence à diminuer à 80°C (Température de melting : 83°C). De plus, KatE possède toujours une activité très forte en présence de protéinase K à un ratio 1:1 pendant 16 heures à 37°C (Chelikani et al., 2003). Cette stabilité thermique et la résistance à la dénaturation peuvent être expliquées par la structure stable et rigide des catalases. La résistance à la protéolyse est un avantage pour KatE qui est produite en phase stationnaire de croissance, une période où le recyclage des protéines est rapide et le niveau de protéases élevé. Les catalases monofonctionnelles n’obéissent pas à la cinétique de Michaelis-Menten (la vitesse de la réaction n’est pas proportionnelle à la concentration en substrat). La petite-sous unité est inactivée en présence de 300 à 500 mM d’H2O2 et la grande sous unité à 3 M (Chelikani et al., 2003). La caractéristique structurale des catalases monofonctionnelles est un site actif comprenant un hème profondément enfoui dans une structure en tonneau β. Trois canaux connectent l’hème avec la surface de l’enzyme. Un des trois canaux semble être considéré comme la principale route d’acheminement de l’H2O2 vers l’hème. Quatre résidus sont conservés chez les catalases 48 Introduction Stress oxydant Figure 14 : Structure du site actif impliqué dans l’activité catalase chez les catalases-peroxydases (Chelikani et al., 2004) Les catalases-peroxydases possèdent une structure commune localisée dans le site actif et constituée de la triade Trp111-Tyr238-Met264. Il s’agit d’une structure constituée de liaisons covalentes entre le noyau indol du tryptophane 111 du site actif, le soufre de la méthionine 264 et le noyau de la tyrosine 238. Cette triade d’acides aminés est indispensable à l’activité catalase des catalases-peroxydases. Introduction Stress oxydant monofonctionnelles, His128, Asn201, Ser167, Tyr415. Ces résidus clés ainsi que l’atome de fer sont combinés pour réagir avec l’H2O2 (Fita et Rossmann, 1985). b. Les catalases-peroxydases Le second groupe de la classification des catalases est le groupe des catalases-peroxydases ou catalases bifonctionnelles. On trouve des représentants de ces catalases dans les trois règnes du vivant bien que chez les eucaryotes, elles aient été seulement détectées chez les champignons. Ces catalases semblent être apparues aprés les catalases fonctionnelles. Leur poids moléculaire varie de 120 à 340 KDa et en général, ce sont des homodimères bien que des cas d’homotétramères aient été reportés. Les catalases-peroxydases possèdent une plus forte identité de séquence avec les peroxydases à hème qu’avec les catalases monofonctionnelles. En dépit d’une séquence tertiaire et quaternaire très différente, la réaction catalytique des catalases-peroxydases est la même que celle des catalases monofonctionnelles : .+ Por-FeIII + AH2 → Por-FeIV=O + •AH .+ Por-FeIV=O + AH2 → Por-FeIII + H2O + •AH 2 AH2 + → H2O + 2 •AH Les catalases-peroxydases sont également capables de catalyser des réactions péroxidatiques. Malheureusement, le substrat péroxidatique de ces enzymes n’a jamais pu être identifié in vivo. Le site actif contenant l’hème est profondément enfoui dans l’enzyme. Le canal acheminant les substrats approche l’hème latéralement plutôt que perpendiculairement, comme c’est le cas pour les catalases monofonctionnelles. Une caractéristique de ces enzymes est la présence d’une structure covalente constituée d’une triade d’acides aminés : le tryptophane présent dan le site actif (Trp111), la méthionine 264 et la tyrosine 238 (Fig. 14). Le rôle de cette structure est encore à l’étude même si de nombreuses études semblent indiquer qu’elle est importante pour l’activité catalase et non pour l’activité peroxydase de l’enzyme. Ainsi, les peroxydases auraient évolué des catalases-peroxydases suite à l’interruption de la liaison entre les trois acides aminés, la conséquence aurait été la perte de l’activité catalase (Klotz et al., 2003). 49 Introduction Stress oxydant c. Les catalases à manganèse Les catalases à manganèse ont d’abord été classées en tant que pseudo-catalases car elles ne possédaient pas d’hème dans leur site actif (Kono et al., 1983). A ce jour, les catalases à manganèse n’ont été identifiées que chez les bactéries. D’après l’arbre phylogénétique des catalases, elles semblent être apparues après les catalases monofonctionnelles et avant les catalases-peroxydases (Klotz et al., 2003). Des expériences de cristallographie effectuées à partir de cristaux des catalases à manganèse de Thermus thermophilus et de Lactobacillus plantarum ont révélé que le centre catalytique de l’enzyme est un groupement constitué de deux atomes de manganèse (Allgood et al., 1986 ; Barynin et al., 2001). Ces enzymes contiennent quatre ou six sous-unités identiques de 30 KDa avec un domaine extrêmement conservé constitué de 4 hélices (Allgood et al, 1986). Chacune des sous-unités contient un centre à manganèse binucléaire. Les ligands des atomes de manganèse sont également conservés. Un canal central permet l’accès au centre binucléaire. Il traverse chacune des sous-unités et possède des branches dans chacune des sous-unités. La réaction catalysée par les catalases à manganèse est un processus en deux étapes qui consiste à l’oxydation des deux atomes de manganèse par l’H2O2, puis à la régénération des atomes de manganèse par une seconde molécule d’H2O2. Cette réaction produit également de l’oxygène et de l’eau. H2O2 + Mn2+- Mn2+ (2H+) → Mn3+- Mn3+ + 2 H2O H2O2 + Mn3+- Mn3+ → Mn2+- Mn2+ (2H+) + O2 2H2O2 → 2 H2O + O2 Le taux d’élimination de l’H2O2 par ces catalases est inférieur à celui des deux premiers groupes de catalases car l’efficacité catalytique des catalases à manganèse est beaucoup plus faible, notamment pour les concentrations en H2O2 très basses. 2- Rôle des catalases dans la physiologie de bactéries pathogènes a. Helicobacter pylori H. pylori est une bactérie pathogène qui colonise la muqueuse de l’intestin. Cette bactérie a l’extraordinaire capacité de survivre à des pH extrêmement acides (1∼2). Suite à l’infection déclenchée par la bactérie, des cellules immunitaires sont recrutées dans l’estomac. Ces cellules détruisent les éléments étrangers selon différentes stratégies dont une est la production de grandes quantités de FAO. H. pylori possède une catalase KatA qui appartient 50 Introduction Stress oxydant au groupe des catalases monofonctionnelles. KatA est absolument requise pour la survie de la bactérie en présence de FAO extracellulaires produites par les macrophages ou pour la survie d’H. pylori dans le phagosome (Wang et al., 2006). b. Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens est une bactérie phytopathogène qui déclenche des tumeurs en transférant de l’ADN (ADN-T) d’un plasmide directement dans le cytosol de la plante à l’aide d’un système de sécrétion de type IV. Lors d’une interaction entre la plante et A. tumefaciens, une des premières réponses mises en place par l’hôte est la production et l’accumulation de FAO. A. tumefaciens possède une catalase KatA dont l’absence résulte en une diminution du pouvoir pathogène de la bactérie. En effet, un mutant katA est très altéré dans sa capacité à provoquer des tumeurs sur les feuilles des végétaux (Xu et al., 2000). c. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui peut être retrouvée dans les poumons des personnes contaminées. Etant donnée sa localisation, elle est exposée à de fortes concentrations en oxygène. Elle possède trois catalases, KatA, KatB et KatE qui appartiennent au groupe des catalases monofonctionnelles (Lee et al., 2005). Ces trois catalases ont des implications différentes dans la cellule, parmi elles, KatA contribue à la résistance à l’H2O2, à l’osmoprotection et a un rôle essentiel chez P. aeruginosa lors d’une infection systémique dans la souris. KatB et KatE ne participent à la virulence mais à la résistance et à l’adaptation à l’H2O2. d. Salmonella typhimurium Une étude réalisée sur les catalases de S. typhimurium a révélé que le mutant ∆katG ∆katE n’était affecté ni dans la capacité à proliférer dans les macrophages, ni dans la capacité à survivre dans la souris (Buchmeier et al., 1995) suggérant que ces enzymes n’avaient pas de rôle dans la pathogénicité de la bactérie. S. typhimurium possède une troisième catalase, KatN et jusqu’alors aucune étude n’a été réalisée sur l’implication dans la virulence des trois catalases de S. typhimurium, KatG, KatE et KatN (Robbe-Saule et al., 2001). L’étude de KatG, KatE et KatN a fait l’objet d’une partie de cette thèse. 51 Introduction Stress oxydant (A) (B) Figure 15 : Réactions enzymatiques catalysées par les 3 familles de peroxyrédoxines présentes chez les entérobactéries (Wood et al., 2003) (A) La décomposition du peroxyde (ROOH) nécessite une base B: pour déprotoner la cystéine péroxidatique (CysSp), la réactivité de cette cystéine catalytique étant supérieure sous la forme thiolate qui est plus nucléophile que la forme protonée. Un acide B:H est également nécessaire pour reprotoner le groupement RO et former ainsi un alcool ou une molécule d’eau. Toutes les peroxyrédoxines possèdent une arginine conservée dans leur site actif qui permet la diminution du pKa de la cystéine peroxydatique favorisant ainsi la forme thiolate. (B) Description complète des réactions de réduction réalisée par les trois familles de peroxyrédoxines. Chacune des trois réactions est décrite en détail dans le texte. Introduction Stress oxydant IV- Les peroxyrédoxines En plus des catalases, il existe une seconde classe d’enzyme capable d’éliminer l’H2O2, les peroxyrédoxines. Cette famille d’enzymes porte des noms aussi divers, que peroxydase, thiorédoxine peroxydase, alkyl hydroperoxyde réductase…. Le terme peroxyrédoxine sera utilisé pour nommer cette famille. Comme les catalases, ces enzymes sont retrouvées dans les trois règnes du vivant et dans la quasi-totalité des organismes. Seule, l’espèce Borrelia semble dépourvue de peroxyrédoxines. Chez les eucaryotes, les peroxyrédoxines peuvent également avoir un rôle dans la régulation du signalement d’un stress peroxyde. Les peroxyrédoxines catalysent la réaction suivante : ROOH + 2e- + 2H+→ ROH + H2O Dans cette réaction, ROOH peut être du peroxyde d’hydrogène, du peroxynitrite ainsi que tous les hydroperoxydes organiques existants. Il existe 6 classes de peroxyrédoxines, dont uniquement 3 sont présentes chez les procaryotes. La classification des peroxyrédoxines a été effectuée selon le nombre de résidus cystéine impliqués dans l’action catalytique et selon leur localisation cellulaire. Chez S. typhimurium, on peut identifier des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines, AhpCF et TsaA, une peroxyrédoxine atypique à 2 cystéines, Tpx qui est également retrouvée dans la classe des peroxyrédoxines à 1 cystéine (Fig. 15A et B). 1- Les peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines a. La réaction catalytique des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines, l’exemple d’AhpC La réaction est composée de deux étapes centrées autour d’une cystéine catalytique, nommée cystéine péroxidatique (Wood et al., 2003). Dans la première étape, la cystéine péroxidatique (Cys-SpH) attaque le peroxyde et est oxydée en acide sulfénique (Cys-SOH). Cette cystéine est conservée parmi les peroxyrédoxines de cette famille et est située aux alentours du résidu 50. La seconde étape consiste en la résolution de l’acide sulfénique par une seconde cystéine, nommée cystéine de résolution. Cette cystéine est également conservée et se situe aux alentours du résidu 170. Les peroxyrédoxines typiques sont des homodimères contenant donc deux sites actifs. Dans la seconde étape de la réaction, l’acide sulfénique de la cystéine péroxidatique de la première sous-unité est attaqué par la cystéine de résolution (Cys-SrH) localisée dans la partie C-terminale de l’autre sous unité. Cette réaction résulte en la formation 52 Introduction Stress oxydant AhpF AhpC Figure 16 : Voie d’acheminement des électrons à travers AhpF et AhpC (adapté de Jönsson et al., 2007) Les électrons transitent du NADH vers l’hydroperoxyde en passant par : 1- Le FAD d’AhpF 2- Les cystéines 345 et 348 d’AhpF 3- Les cystéines 129 et 132 d’AhpF 4- Les cystéines 46 et 165 d’AhpC Introduction Stress oxydant d’un pont disulfure stable inter-unité. Ce pont est ultérieurement réduit par des oxydoréductases spécifiques ou non de la peroxyrédoxine. Ainsi, AhpC est réduit par sa réductase dédiée AhpF, alors que TsaA est réduit par le système général thiorédoxine/thiorédoxine réductase. b. Les caractéristiques générales d’AhpC AhpF, l’oxydoréductase dédiée d’AhpC ahpC se situe en opéron avec un autre gène, ahpF. Dans les systèmes bactériens où un homologue d’AhpC existe et possède plus de 55% d’identité de séquence protéique, il y a invariablement un homologue d’AhpF codé juste après ahpC. AhpC fonctionne avec un partenaire d’oxydoréduction, AhpF qui est une réductase disulphide (Fig. 16). AhpF réduit le pont disulfure inter-unité formé par les cystéines péroxidatiques (Cys46) et de résolution d’AhpC (Cys165). La partie C-terminale d’AhpF (320 résidus) est homologue avec la thiorédoxine réductase (35 % d’identité de séquence) et contient le motif C-X-X-C nécessaire à la réduction des ponts disulfures. De plus, AhpF possède un domaine N-terminal d’environ 200 acides aminés, absent de la thiorédoxine réductase, dans lequel est retrouvé une seconde fois le motif C-X-X-C. Il semblerait donc qu’AhpF possède un second site catalytique impliqué dans la réduction des ponts disulfures. Le coenzyme NADH constitue un autre partenaire du système. Il fournit ses électrons à AhpF pour que celui-ci retrouve sa forme réduite. Sensibilité d’AhpC envers l’H2O2 Les peroxyrédoxines ne présentent pas toutes le même comportement de sensibilité en présence d’H2O2. Il semblerait que les peroxyrédoxines bactériennes soient beaucoup plus résistantes que les peroxyrédoxines eucaryotes (Yang et al., 2002). AhpC de S. typhimurium est très robuste face à de l’H2O2. L’inactivation de l’enzyme ne survient qu’en présence de concentrations de l’ordre de plusieurs molaires d’H2O2. Cette différence serait en partie expliquée par l’existence de plusieurs motifs sensibles à l’oxydation présents dans la séquence protéique des enzymes eucaryotes. Oligomérisation d’AhpC 53 Introduction Stress oxydant Figure 17 : Structure d’un décamère d’AhpC (Wood et al., 2002) Lorsqu’AhpC est oxydée, elle forme un pont disulfure inter-unité avec une autre molécule d’AhpC, elle est alors sous forme dimérique (α2). Les dimères sont A-B, C-D, A’-B’, C’-D’ et E-E’. Chaque dimère peut également s’associer à 4 autres dimères d’AhpC pour former une structure (α2)5 décamérique. La structure ainsi formée porte le nom de « doughnut ». Le décamère a un diamètre externe de 115 Å et un diamètre interne de 60 Å. Chaque molécule d’AhpC est colorée différemment. Introduction Stress oxydant Des structures cristallographiques d’AhpC réalisées en 1998 ont montré que cette enzyme était un homodimère antiparallèle qui pouvait s’oligomériser en décamère (Fig. 17). La décamérisation est une propriété de l’état réduit de la protéine, alors que l’état oxydé peut être retrouvé sous toutes les formes oligomériques (Wood et al., 2002). L’oligomérisation aurait un rôle sur l’activité de l’enzyme, en effet, il semblerait que les décamères soient plus actifs que les dimères parce que plus stables. Chez les eucaryotes, Tsa1 et Tsa2 sont deux peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines dont l’oligomérisation leur confère une activité de chaperon moléculaire. Elles protègent les protéines non repliées de l’agrégation, suite à un choc thermique (Jang et al., 2004). c. Régulation d’ahpC La régulation d’ahpC a été étudiée à l’aide d’un mutant d’oxyR constitutif, OxyR1 (Storz et al., 1989). OxyR1 a une résistance supérieure à l’H2O2 et surproduit plusieurs protéines. Parmi ces protéines, AhpC et AhpF ont été identifiées en tant qu’alkyl hydroperoxyde réductase. Par la suite, des expériences de fusions transcriptionnelles et de footprint ont validé l’existence de la régulation et des sites de fixation d’OxyR sur la région promotrice d’ahpC (Tartaglia et al., 1989). d. Rôle d’AhpC dans la physiologie de bactéries pathogènes Vibrio vulnificus V. vulnificus est un pathogène marin pouvant être contracté après ingestion d’aliments contaminés, responsable de gastroentérites et de septicémies. Chez V. vulnificus, le système AhpC/AhpF est indispensable pour l’établissement de la virulence (Baek et al., 2009). Un mutant ∆ahpC est moins cytotoxique envers les cellules hôtes de V. vulnificus et est altéré dans sa capacité à établir la maladie systémique. Il semblerait qu’AhpC participe à la virulence de cette bactérie en contrôlant son taux de croissance pendant l’infection. Staphylococcus aureus S. aureus est une bactérie pathogène opportuniste souvent associée aux maladies nosocomiales. Dans son génome, elle possède la catalase KatA et la peroxyrédoxine AhpC. Il a été montré qu’AhpC participait à la colonisation nasale, étape précédant l’infection systémique, ainsi qu’à la persistance de S. aureus dans l’organisme (Cosgrove et al., 2007). En présence de FAO, l’activité enzymatique des deux enzymes peut se compenser 54 Introduction Stress oxydant mutuellement dans le cas de la perte de l’une d’entre elles, par exemple en l’absence d’AhpC, KatA est capable d’assurer la protection de S. aureus. Cette compensation fonctionnelle n’est pas vérifiée dans le modèle d’infection nasale où la présence des deux protéines est requise. S. typhimurium Une étude réalisée en 1998 par Taylor et collaborateurs a montré qu’AhpC n’était pas impliquée dans la virulence de S. typhimurium (Taylor et al., 1998). Dans leurs travaux, les auteurs ont infecté des souris avec un mutant ∆ahpC par voie intrapéritonéale et ont observé que la dose létale 50 (DL50) de ce mutant était identique à celle de la souche sauvage. Le mutant ∆oxyR a également été analysé, de la même façon que pour le mutant ∆ahpC, la DL 50 de ce mutant est identique à celle de la souche sauvage. Dans son génome, S. typhimurium possède une seconde peroxyrédoxine qui présente des identités de séquence avec TsaA. TsaA est une peroxyrédoxine typique à deux cystéines qui a été identifiée dans le génome d’H. pylori (Slonczewski et al., 2000). TsaA constitue une unité de transcription indépendante. Une étude réalisée en 2001 sur la protéine purifiée a montré qu’elle pouvait fonctionner in vitro avec le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (Baker et al., 2001). Aucun partenaire physiologique n’a encore été identifié. Chez H. pylori, TsaA subit un changement conformationnel en présence d’H2O2 aboutissant à l’oligomérisation de la protéine (Chuang et al., 2005). A l’état d’oligomère, la protéine n’a plus fonction de peroxyrédoxine mais de chaperon. A l’instar d’AhpC chez S. typhimurium, TsaA possède également une activité peroxynitrite réductase (Bryk et al., 2000). Il existe donc deux peroxyrédoxines dans le génome de S. typhimurium. L’étude de l’implication d’AhpCF et TsaA dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium a fait l’objet d’une partie de ce travail de thèse. 2- Les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines a. La réaction catalysée par les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines, l’exemple de Tpx La première étape de la réaction catalysée par les peroxyrédoxines atypiques à 2 cystéines est strictement identique à celle décrite pour les peroxyrédoxines typiques. La seconde étape est par contre différente car ces enzymes sont monomériques (Fig. 15B). Ainsi, la cystéine péroxidatique et la cystéine de résolution font partie de la même protéine. Il en résulte la 55 Introduction Stress oxydant formation d’un pont disulfure intra-unité. La position de la cystéine catalytique des peroxyrédoxines typiques et atypiques n’est pas conservée en terme d’identité de séquence. La réduction du pont disulfure est réalisée par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase. Tpx est une thiol peroxydase de 20 KDa, dimérique, qui a été caractérisée chez E. coli en 1995 au cours d’une étude dont le but était l’identification d’enzymes antioxydantes thioldépendantes (Cha et al., 1995). Tpx possède trois cystéines, Cys95, Cys82, Cys61. La Cys61 est la cystéine péroxidatique capable de former un pont disulfure avec la Cys95 de la même sousunité au cours de la réduction de peroxydes (Baker et al., 2003). Tpx oxydée est réduite par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase. La cinétique de réduction de Tpx montre que Tpx hydrolyse plus rapidement ses substrats qu’AhpC (environ deux fois plus vite) (Baker et al., 2003). Par contre, Tpx semble montrer une préférence de substrats pour les alkylhydroperoxydes. b. Localisation cellulaire de Tpx La localisation de Tpx a fait débat pendant plusieurs années. Tpx ne possède ni séquence signal Sec-dépendante ni motif twin-arginine (RR) dans son segment N-terminal, mais a pourtant été décrite comme étant localisée dans le périplasme (Cha et al, 1995). Au cours de cette étude, les auteurs ont réalisé des expériences de fractionnement cellulaire suivies d’un marquage protéique à l’aide d’anticorps dirigés contre Tpx et ont montré que cette dernière était localisée dans le périplasme de S. typhimurium. En 2008, une autre étude (Tao, 2008) a été publiée sur la localisation cytoplasmique de Tpx. In vitro, la thiorédoxine 1 et la thiorédoxine réductase (TrxC), protéines cytoplasmiques, servent de systèmes réducteurs pour recycler Tpx (Baker et al, 2003). L’auteur de l’étude a utilisé cette propriété pour montrer que Tpx était également cytoplasmique. Au cours de cette étude, un variant de la thiorédoxine 1 a été utilisé dans lequel la cystéine péroxidatique a été mutée en sérine. Ainsi, le pont disulfure formé entre la cystéine de Tpx et la cystéine péroxidatique de Trx1 ne pouvait pas être résolu. Il en a résulté la formation de complexes Trx1-S-S-Tpx visualisables sur gel SDS-PAGE en conditions non réductrices suivi d’un marquage protéique avec des anticorps dirigés contre Tpx. L’auteur a ainsi conclu que, chez S. typhimurium, Tpx était localisée dans le cytoplasme. c. Régulation de tpx La régulation de tpx a lieu à un niveau transcriptionnel ainsi que post-transcriptionnel et semble reliée à l’oxygène. A l’aide d’une fusion transcriptionnelle tpx-lacZ, il a été montré 56 Introduction Stress oxydant que la transcription de tpx était réprimée en anaérobiose par les régulateurs transcriptionnels ArcA et Fnr (Kim et al., 1999). Enfin, dans une étude récente, il a été montré que tpx subissait une régulation post-transcriptionnelle via un ARN non codant, ArcZ (Papenfort et al., 2000). ArcZ reconnait et s’apparie à une région inclue dans la partie codante de tpx, entraînant ainsi la répression de l’ARNm tpx. d. Rôle de Tpx dans la physiologie des bactéries pathogènes Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis est un pathogène intracellulaire qui s’établit au sein des macrophages durant son cycle infectieux. Il est alors exposé aux FAO et FAN produites par la NADPH phagocyte oxydase et la NO. synthase inductible. Pour lutter contre les effets du stress oxydant, M. tuberculosis possède 22 protéines possédant des activités antioxydantes. Parmi ces protéines, il a été montré que Tpx était importante pour la survie de M. tuberculosis dans la souris, au cours de l’infection systémique, ainsi que pour la prolifération dans les macrophages (Hu et al., 2009). Enterococcus faecalis E. faecalis fait partie du microbiote intestinal retrouvé chez les humains et chez beaucoup d’autres animaux. Dans certaines conditions, E. faecalis peut devenir un pathogène opportuniste. Au cours de son trajet infectieux, ce microorganisme se retrouve dans les macrophages. Pour lutter contre les FAO produites dans le macrophage, E. faecalis posséde Tpx qui est primordiale pour l’établissement de l’infection (La Carbona et al., 2007). Chez cette bactérie, tpx appartient au régulon hypR qui est un homologue d’OxyR. 3- Les peroxyrédoxines à 1 cystéine Dans cette classe de peroxyrédoxines, seule la cystéine péroxidatique est conservée (Fig. 15B). L’acide sulfénique généré par la réaction avec les peroxydes est réduit par un donneur d’électrons possédant un groupement thiol, mais l’identité de ce partenaire d’oxydoréduction n’a pas encore été découverte. Il a été proposé que le glutathion puisse jouer ce rôle (Wood et al., 2003). Ainsi, par analogie, ce donneur thiolé doit former un pont disulfure avec l’enzyme, qui doit être réduit par un second donneur d’électron thiolé, recyclant ainsi l’enzyme. Chez Mycobacterium, il a été montré que la cystéine de résolution, qui forme le pont disulfure avec la cystéine péroxidatique, n’est pas indispensable pour l’activité de Tpx (Trujillo et al., 57 Introduction Stress oxydant 2006). Dans cette étude, la cystéine de résolution a été mutée en sérine, et les auteurs ont montré que cette substitution n’affectait ni l’état d’oxydation de Tpx, ni sa réduction par des partenaires tels que le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase. 58 RESULTATS Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant Hpx° Résultats Partie 1 (A) (B) 10 1 1 0,1 0,1 DO 600 nm 10 wt wt Hpx° Hpx° 0,01 0,01 0 100 200 300 400 0 500 100 200 300 400 500 Temps (min) Temps (min) (C) DO 600 nm 1 0,1 wt Hpx° wt + H H202 2O2 Hpx° + H H2O2 2O2 0,01 0 200 400 600 Temps (min) Figure 1 : Croissance en milieu riche et en milieu minimum de la souche sauvage et du mutant Hpx° (A) Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en milieu LB, à 37°C et en aérobie. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,01 en LB et la croissance a été suivie. (B) Même protocole que (A). Les souches ont poussé en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1%. (C) Même protocole que (A). Les souches ont été diluées à DO600 = 0,05 en milieu minimum glucose 0,2%. De l’ H2O2 a été ajouté dans certaines cultures bactériennes à une concentration finale de 25 µM. Résultats Partie 1 Les catalases et les peroxyrédoxines sont des enzymes impliquées dans l’élimination de l’H2O2 produit par le métabolisme aérobie (Seaver et al., 2001), ou rencontré dans l’environnement. Une étude réalisée chez E. coli a montré qu’un mutant dépourvu des catalases KatG et KatE et de la peroxyrédoxine AhpCF, appelé Hpx, n’est plus capable d’éliminer l’H2O2 (Seaver et al., 2001). C’est pourquoi, nous avons construit un mutant Hpx équivalent à celui d’E. coli dont nous avons testé la virulence ainsi que d’autres propriétés phénotypiques. Les résultats obtenus ont montré que les propriétés phénotypiques du mutant Hpx de S. typhimurium étaient proches de celles de la souche sauvage. Les résultats de ces expériences sont présentés dans le chapitre des méthionine sulfoxyde réductases (voir chapitre « Methionine sulfoxyde réductases » p. 74). Ils démontrent que l’inactivation des gènes katG, katE et ahpCF n’a pas les mêmes conséquences chez E. coli et chez S. typhimurium. Chez cette dernière, une troisième catalase, KatN, a été identifiée (Robbe-Saule et al., 2001). Nous avons alors construit le mutant Hpx° dépourvu des trois gènes codant pour les catalases KatG, KatE et KatN ainsi que du gène codant pour la peroxyrédoxine, AhpCF. La caractérisation du mutant Hpx° fait l’objet de ce chapitre. I- Construction du mutant 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE katN::cat (Hpx°) Le gène katE a été inactivé dans la souche 12023 (ATCC 14028) de S. typhimurium selon la technique de Wanner et Datsenko (Datsenko et Wanner, 2000). Il s’agit d’une double recombinaison homologue entre le plasmide pKD4, codant pour un gène impliqué dans la résistance à la kanamycine et katE. Un lysat a ensuite été obtenu à partir de la souche 12023 katE::kan à l’aide du phage P22, spécifique de S. typhimurium. Ce lysat a permis de transduire l’allèle muté katE::kan dans une souche sauvage. Les gènes katG, katN et ahpCF ont été inactivés et les mutations correspondantes transduites selon les mêmes méthodes. Deux mutants ont été construits, 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan (Hpx) et 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE katN::cat (Hpx°). II- Caractérisation phénotypique du mutant Hpx° Dans le but d’étudier la contribution d’AhpCF, de KatG, de KatE et de KatN dans la physiologie de S. typhimurium, la croissance du mutant Hpx° a été comparée à celle de la souche sauvage en milieu LB et milieu minimum (Fig. 1A et 1B). En milieu LB, à 37°C et en aérobie (Fig. 1A), les deux souches ont un temps de génération de 25 minutes. En milieu 59 Résultats Partie 1 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 cfu/ml 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 wt 1,00E+03 Hpx° 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0 24 48 72 Temps (heures) Figure 2 : Dénombrement de la souche sauvage et du mutant Hpx° après 72 heures de croissance en milieu LB Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en LB et en aérobiose. Ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,05. A t0h, t24h, t48h et t72h après ensemencement, des aliquots de culture ont été prélevés et les cfu dénombrées 24 h après incubation à 37°C. Résultats Partie 1 minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1%, les deux souches ont un temps de génération de 35 minutes (Fig. 1B). Ainsi, les croissances de la souche sauvage et du mutant Hpx° sont identiques en milieu riche et en milieu minimum. L’absence d’AhpCF, KatG, KatE et KatN n’affecte donc pas la croissance de S. typhimurium. Chez E. coli, il a été montré que le mutant ∆ahpCF ∆katG ∆katE (Hpx) est auxotrophe pour la leucine (Jang et al, 2006). Dans ce mutant, une enzyme à centre Fer/Soufre impliquée dans la voie de biosynthèse de la leucine, l’isopropylmalate isomérase (IPMI), est non fonctionnelle. Afin d’analyser si les catalases et les peroxyrédoxines de S. typhimurium protègent également l’IPMI de l’oxydation et de l’inactivation, la croissance de la souche sauvage de S. typhimurium a été comparée à celle du mutant Hpx° en milieu minimum glucose 0,2 % (Fig. 1C). Dans le but d’accentuer les effets du stress oxydant sur la physiologie de S. typhimurium, la croissance a également été analysée en présence d’H2O2 à une concentration finale de 25µM (Fig. 1C). En milieu minimum glucose 0,2% avec ou sans ajout d’H2O2, la croissance du mutant Hpx° est faiblement altérée par rapport à celle de la souche sauvage. Ces résultats démontrent que le mutant Hpx° ne présente pas d’auxotrophie. Il semblerait ainsi que l’IPMI soit fonctionnelle dans le mutant Hpx° suggérant que le système enzymatique impliqué dans la dégradation de l’H2O2 est différent chez E. coli et chez S. typhimurium. Afin d’étudier l’implication de katG, katE, katN et ahpCF dans l’adaptation de S. typhimurium à la phase stationnaire de croissance, nous avons comparé la croissance de la souche sauvage et du mutant Hpx° sur des périodes d’incubation allant de 24 à 72 heures. Dans cette expérience, la souche sauvage et le mutant Hpx° ont été ensemencées à DO600 = 0,05 en LB. Des aliquots de culture ont été prélevés à t0h, t24h, t48h et t72h après ensemencement, dilués de façon appropriée, étalés sur boîte LB et enfin dénombrés (Fig. 2). Le nombre de cfu (colony forming unit) de la souche sauvage et du mutant Hpx° augmente d’environ deux logarithmes 24 heures après ensemencement (2.107 cfu/ml à t0h et environ 4.109 cfu/ml à t24h), il est de 4,4.109 cfu/ml pour la souche sauvage et de 2.109 cfu/ml pour le mutant Hpx° à t48h et de 1,4.109cfu/ml à t72h pour les deux souches. La souche sauvage et le mutant Hpx° présentent un comportement similaire, suggérant qu’AhpCF, KatG, KatE et KatN ne jouent pas de rôle majeur dans l’adaptation de S. typhimurium à la phase stationnaire de croissance. 60 Résultats Partie 1 10 wt DO 600 nm Hpx° 1 0,1 0 100 200 300 400 500 600 Temps (min) wt 1,00E+10 Hpx° 1,00E+09 1,00E+08 cfu/ml 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0 45 90 Temps aprés ajout de l’H2O2 (min) Figure 3 : Croissance et dénombrement de la souche sauvage et du mutant Hpx° après exposition à 2,5 mM d’H2O2 Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été rajouté dans le milieu de croissance. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été prélevés, puis étalés après dilution sur boîte LB. 24 heures après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées. La croissance est représentée en haut et le dénombrement sur boîte LB en bas. Résultats Partie 1 III- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° au peroxyde d’hydrogène Dans le but de caractériser l’implication de KatG, KatE, KatN et TsaA dans la protection de S. typhimurium face au stress oxydant, nous avons, d’une part, analysé le comportement du mutant Hpx° en présence d’H2O2 et nous avons, d’autre part, analysé son aptitude à dégrader l’H2O2. Pour évaluer l’impact de KatG, KatE, KatN et TsaA sur la croissance de Salmonella, nous avons entrepris la caractérisation d’Hpx° en testant sa capacité à pousser en milieu LB et en présence d’H2O2. Pour cela, des bactéries en phase exponentielle de croissance (DO600 = 0,3) en milieu LB ont été exposées à de l’H2O2 à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 3). Des aliquots de culture ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout de l’H2O2 et dénombrés 24 heures après étalement sur boîte LB. L’ajout d’H2O2 ne semble pas affecter la croissance de la souche sauvage. Ce résultat est confirmé par le fait que le nombre de cfu augmente d’un demi-logarithme 90 minutes après ajout de l’H2O2 (5.108 cfu/ml à t0’ et 2.109 cfu/ml à t90’). Par contre, la croissance du mutant Hpx° est immédiatement arrêtée après ajout de l’H2O2. Le nombre de cfu de ce mutant chute d’environ un logarithme 90 minutes après ajout de l’H2O2 (9.108 cfu/ml à t0’ et 2.108 cfu/ml à t90’). Ainsi, la croissance du mutant Hpx° est affectée par l’H2O2 dans les conditions testées. Les catalases KatG, KatE, KatN et la peroxyrédoxine AhpCF permettent donc à S. typhimurium de pousser en présence d’H2O2 exogène. Pour préciser la contribution des catalases et de la peroxyrédoxine dans la dégradation du peroxyde d’hydrogène, nous avons testé les capacités du mutant Hpx° à éliminer l’H2O2 en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1% (Fig. 4). Pour réaliser ce test, nous avons utilisé une propriété de l’H2O2 qui est sa capacité à diffuser librement à travers les membranes. Ainsi, la concentration en H2O2 intracellulaire est équivalente à la concentration en H2O2 extracellulaire. La concentration en H2O2 dans le milieu de culture a été mesurée par un test utilisant l’Amplex Red et l’« Horseradish » peroxydase (HRP) (Fig. 4A). En présence d’H2O2 et d’HRP, l’Amplex Red est oxydé en un composé fluorescent, la résorufine, dosable à 587 nm. Nous avons observé que la souche sauvage éliminait rapidement (15 minutes) la totalité de l’H2O2 présent dans le milieu de culture (Fig. 4B). Sa vitesse de dégradation est de 1,07 µM d’H2O2/minute (Fig. 4C). La courbe d’élimination d’H2O2 du mutant Hpx° présente deux phases. Une première phase très rapide (15 minutes) pendant laquelle la quasi-totalité de 61 Résultats Partie 1 (A) (B) 25 wt Amplex Red 20 Résorufine Hpx° [H2O2] µM Horse Radish Peroxydase 15 10 5 0 0 1ère phase 50 2ème phase 100 Temps (min) (C) Vitesse de disparition de l'H2O2 (µM/min) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 wt Hpx° 1ère phase Hpx° 2nde phase Figure 4 : Capacité d’élimination de l’H2O2 de la souche sauvage et du mutant Hpx° La souche sauvage et le mutant Hpx° ont été cultivés en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1% jusqu’à DO600 = 0, 3 puis dilués à DO600 = 0,1. De l’ H2O2 a été rajouté à une concentration finale de 20 µM. Des aliquots ont été prélevés toutes les 15 minutes pour mesurer la concentration en H2O2 restante dans le milieu. (A) Réaction d’oxydation de l’Amplex Red en résorufine, composé dosable à 587 nm. (B) Courbe de vitesse de disparition de l’H2O2. (C) Vitesse de disparition de l’H2O2 de la souche sauvage et du mutant Hpx°. La 1ère phase et la 2nde phase sont représentées sur le graphique (B), la 1ère phase correspond au premier quart d’heure de l’expérience, la 2nde phase correspond aux deux heures suivantes. Résultats Partie 1 l’H2O2 a été dégradée, puis une seconde phase (2 heures) pendant laquelle l’élimination de l’H2O2 restant est beaucoup plus lente. La vitesse d’élimination de l’H2O2 du mutant Hpx° pendant la première phase est de 0,8 µM d’H2O2/min et de 0,016 µM d’H2O2/min durant la seconde phase (Fig. 4C). KatG, KatE, KatN et AhpCF participent, ainsi, à l’élimination de l’H2O2. De plus, ces travaux suggèrent que S. typhimurium possède encore une enzyme impliquée dans l’élimination de l’H2O2. IV- Etude de la sensibilité du mutant Hpx° à l’anion superoxyde et l’ion carbonate Dans le but de contrôler la spécificité des catalases et d‘AhpCF envers l’H2O2, la sensibilité du mutant Hpx° a été testée en présence de paraquat, un générateur d’anion superoxyde, et de bicarbonate, générateur d’ion carbonate, au cours de deux expériences différentes. Afin de tester la sensibilité du mutant Hpx° au paraquat, une expérience de concentration minimale inhibitrice (CMI) a été effectuée (Fig. 5A). Trois concentrations en paraquat ont été utilisées : 20 mM, 50 mM et 100 mM. Le diamètre d’inhibition de croissance de la souche sauvage et du mutant Hpx° est le même quelle que soit la concentration en paraquat (Fig. 5A). L’ion carbonate constitue un oxydant puissant, capable de diffuser librement sous la forme HCO3-. Nous avons donc testé la sensibilité du mutant Hpx° au bicarbonate, un générateur d’ion carbonate. Des expériences de numération de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été effectuées en présence de 10 mM de carbonate (Fig. 5B). Aucune différence de sensibilité n’a été observée puisque le nombre de cfu de la souche sauvage et du mutant Hpx° est de 3.108 cfu/ml sur boîte LB et sur boîte LB/HCO3-. Les catalases KatG, KatE, KatN et la peroxyrédoxine AhpCF ne semblent donc impliquées ni dans l’élimination de l’anion superoxyde, ni dans l’élimination du carbonate. Ces résultats suggèrent une spécificité de ces enzymes pour l’H2O2. V- Etude du profil d’oxydation protéique du mutant Hpx° chez S. typhimurium A l’exception des résidus cystéines et méthionines, l’oxydation des acides aminés est un processus irréversible qui peut aboutir à la dégradation de la protéine. Nous avons voulu savoir si le défaut d’élimination d’H2O2 du mutant Hpx° pouvait entraîner l’oxydation et la dégradation des protéines de S. typhimurium. Pour cela, nous avons comparé les contenus protéiques de la souche sauvage et du mutant Hpx° par des électrophorèses en deux dimensions. Après comparaison des profils protéiques obtenus à partir de gels SDS-PAGE 62 Résultats Partie 1 (A) 18 Diamètre d'inhibition (mm) 16 14 wt Hpx° 12 10 8 6 4 2 0 20 mM 50 mM 100 mM (B) 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 wt 1,00E+05 Hpx° 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 LB LB + HCO3- Figure 5 : Numération de la souche sauvage et du mutant d’Hpx° en présence d’O2.- et d’HCO3Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été réalisées en milieu LB et en aérobiose. (A) Une surcouche bactérienne a été réalisée sur une boîte LB en mélangeant 150 µl de préculture bactérienne et 3 ml d’agar mou, pour chacune des deux souches. A la surface de la surcouche, un disque d’ouate imbibé de paraquat à différentes concentrations a été déposé. Le diamètre d’inhibition de croissance a été mesuré après 24 heures de croissance. (B) A DO600 = 0,5, des aliquots ont été prélevés et étalés soit sur boîte LB, soit sur boîte LB contenant 10 mM d’HCO3- . Les colonies ont été dénombrées 24 h après incubation à 37°C. Résultats Partie 1 (Fig. 6), nous avons observé la disparition de 5 spots sur le gel du mutant Hpx° (spots 1, 2, 3, 4 et 5 sur les gels) et d’un spot sur le gel de la souche sauvage (spot 6). Des bandes de gel correspondants aux spots disparus ont été découpées et traitées sur microplaque dans le but d’identifier les protéines correspondantes par spectrométrie de masse après digestion par la trypsine. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Les 5 spots absents dans le mutant Hpx° sont respectivement (1) la protéine flagellaire FliC, le facteur d’élongation Ts, un mélange entre le facteur d’élongation Ts et une déshydrogénase, une protéine de dégradation des acides gras FadH et une protéine de fixation aux nucléotides. Le spot absent dans la souche sauvage correspond à une protéine de fixation aux nucléotides. Ainsi, l’absence des 3 catalases et d’AhpCF entraîne des modifications du contenu protéique Hpx°. Dans le but d’étudier si les protéines précédemment identifiées par spectrométrie de masse sont oxydées et dégradées dans le mutant Hpx°, nous avons entrepris l’étude de la fonctionnalité de FadH dans ce mutant. FadH (spot 4), ou la 2,4-dineoyl-CoA-réductase, est une enzyme impliquée dans la dégradation des acides gras. Elle catalyse la réaction NADHdépendante du 2,4-dineoyl-CoA en 2-trans-enoyl-CoA (Fig. 7A). Il a été proposé que FadH soit indispensable pour la croissance d’E. coli en présence d’acides gras insaturés à nombre pair de carbone (You et al., 1989). Des croissances en milieu minimum ont donc été réalisées avec comme source de carbone soit des acides gras insaturés à nombre impair de carbone (acide oléique, acide 9-cis-octadénoïque), soit à nombre pair de carbone (acide pétrosélinique, acide 6-cis-octadénoïque) (Fig. 7B). Les résultats obtenus montrent que le mutant Hpx° est capable de pousser en présence d’acides gras insaturés à nombre de carbone. Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat : soit une partie du pool de FadH produit par le mutant Hpx° n’est pas oxydée et est donc encore fonctionnelle, soit la contribution de FadH à la croissance de S. typhimurium en présence d’acides gras insaturés à nombre pair de carbone n’est pas indispensable. Dans le but de tester cette seconde hypothèse, nous avons entrepris une nouvelle approche qui a consisté à utiliser une souche d’E. coli dépourvue du gène fadH. La croissance du mutant ∆fadH a été suivie en milieu minimum contenant soit des acides gras insaturés à nombre pair de carbone, soit à nombre impair de carbone (Fig. 7C). Nous avons observé que le mutant ∆fadH est capable de pousser en présence d’acides gras insaturés à nombre pair de carbone suggérant que FadH n’est pas indispensable à la croissance d’E. coli. Ainsi, nos expériences n’ont pas reproduit les résultats précédemment publiés par You et 63 Résultats Partie 1 (B) (A) KDa 1 1 175 83 2 62 47,5 2 3 3 32,5 25 6 6 5 5 4 4 16,5 6,5 Figure 6 : Analyse par electrophorèse en deux dimensions d’extraits protéiques de la souche sauvage et du mutant Hpx°. Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 1, des aliquots de cultures bactériennes ont été prélevés puis lysés par la presse de French afin d’obtenir des extraits protéiques. Ces extraits protéiques ont été centrifugés 30 minutes à 13000 rpm. Un gel SDS-PAGE en deux dimensions a été réalisé à l’aide des surnageants des deux souches. Le gel a été révélé au bleu colloïdal. Les protéines cibles ont été identifiées par spectrométrie de masse. (A) Profil de séparation des protéines cytoplasmiques de la souche sauvage (B) Profil de séparation des protéines cytoplasmiques du mutant Hpx° Les flèches rouges indiquent les protéines présentes, les flèches bleues indiquent les protéines absentes. 1: FliC; 2: Facteur d’élongation Ts; 3: Mélange de deux protéines (Facteur d’élongation Ts et une déshydrogénase); 4: FadH; 5: protéine putative de fixation à l’ADN; 6: protéine de fixation aux Nucléotides. L’échelle de poids moléculaire est représentée à gauche, elle est exprimée en kilodalton. Résultats Partie 1 collaborateur (1989), et la caractérisation de la fonctionnalité de FadH dans le mutant Hpx° n’a pas été poursuivie. VI- Etude de la virulence du mutant Hpx° 1- Indice de prolifération du mutant Hpx° dans des macrophages murins Afin de savoir si KatG, KatE, KatN et AhpCF étaient importantes pour la survie et la prolifération de S. typhimurium en condition d’infection, des expériences d’infection de macrophages murins ont été réalisées avec la souche sauvage et le mutant Hpx°. Les capacités de prolifération de la souche sauvage et du mutant Hpx° ont été testées dans des macrophages issus d’une lignée cellulaire, les RAW 264.7. Les lysats cellulaires obtenus après passage des bactéries dans les macrophages, afin de dénombrer les bactéries ayant survécu à l’infection, ont été étalés soit sur boîte LB, soit sur boîte LB contenant de la catalase. En effet, plusieurs études ont montré que la gélose LB constituait un environnement oxydant pour les bactéries (James Imlay, EcoSal Module « 5.4.4 » ; Cuny et al., 2007). Le mutant Hpx° est dépourvu de 4 gènes impliqués dans la détoxication de l’H2O2 et présente une forte sensibilité à l’H2O2 (Voir Section III de ce chapitre). Afin de diminuer les effets du stress oxydant pouvant être subis par le mutant Hpx° lors de l’étalement, une partie des boîtes LB utilisées a été additionnée de 2000 unités de catalase purifiée. Des expériences de prolifération dans des RAW 264.7 ont été effectuées. Dans chacune des expériences réalisées, les indices de prolifération obtenus à partir des dénombrements effectués sur les boîtes LB variaient d’une expérience à l’autre (Fig. 8A). Par contre, sur boîtes LB additionnées de catalases, les indices de prolifération du mutant Hpx° étaient toujours supérieurs à celui de la souche sauvage (Fig. 8B). Ainsi, l’ajout de catalase sur la boîte LB stabilise la capacité du mutant Hpx° à former des colonies après passage dans les macrophages. Le fait que la variation de l’indice de prolifération du mutant Hpx° soit abolit lorsqu’on ajoute de la catalase sur la boîte LB laisse supposer que ce mutant a accumulé des dommages oxydatifs au cours de l’infection. Ainsi, S. typhimurium percevrait du stress oxydant en condition d’infection dans le macrophage. Cependant, au cours de l’expérience préparant les bactéries à l’infection, ces dernières subissent différents traitements « stressants ». Ainsi, fin de nous assurer que l’accumulation de dommages oxydatifs du mutant Hpx° était dûe à l’environnement du macrophage et non aux stress liés au protocole utilisé, des contrôles de viabilité ont été effectués. Nous avons 64 Résultats Partie 1 (A) (B) 1 1 3 4 DO 600 nm 2 ∗ ∗ 0,1 wt A.O. Hpx° A.O wt A.P. 5 Hpx° A.P. 0,01 0 100 200 300 400 Temps (min) (C) DO 600 nm 1 wt A.O. 0,1 fadH- A.O. wt A.P. fadH- A.P. 0,01 0 100 200 300 400 Temps (min) Figure 7 : Etude de l’état d’oxydation de FadH dans la souche Hpx° (A) Produits de dégradation de l’acide linoléique (1), 4-cis-decenoyl CoA (2), 2-trans-4-cis-decadienoyl CoA (3), 2-trans-decenoyl CoA (4); decenoyl CoA (5). FadH catalyse la réaction marquée d’une astérisque. (B) Des précultures des deux souches en milieu minimum glucose 0,2 % ont été utilisées pour ensemencer soit un milieu minimum avec 0,05 % d’acide oléique (A.O.), soit avec 0,05 % d’acide pétrosélinique (A.P.). La croissance de la souche sauvage et du mutant Hpx° a été suivie à DO 600 nm. (C) Même expérience que (B) , la souche sauvage d’E. coli MG1655 et le mutant ∆fadH ont été testés. Résultats Partie 1 réalisé une expérience d’infection en soumettant la souche aux différents traitements subis au cours de l’infection : carence nutritionnelle, stress thermique et détergent (Fig. 8C). Les résultats obtenus montrent qu’il n’y a pas de différence de viabilité entre les deux souches quelles que soient les conditions testées (Fig. 8D). Au cours de ces expériences, nous avons, donc, observé que l’indice de prolifération du mutant Hpx° fluctuait lorsqu’il était calculé à partir des dénombrements effectués sur boîte LB. Ce phénomène est abolit lorsque de la catalase est ajouté sur les boîtes LB. Ainsi, S. typhimurium semble accumuler du stress oxydant en condition d’infection, qui l’altère dans sa capacité à former des colonies lorsqu’elle est étalée sur une boîte LB. Par contre, lorsque la bactérie est étalée sur boite dont le niveau de stress oxydant est moindre, S. typhimurium restaure sa capacité à former des colonies. En conclusion, S. typhimurium perçoit du stress au cours de l’infection, mais ce stress n’est pas suffisant pour tuer la bactérie. 2- Survie du mutant Hpx° en condition d’infection dans les souris Dans le but d’analyser le rôle des catalases et des peroxyrédoxines dans l’établissement de la virulence chez la souris, une expérience de compétition entre la souche sauvage et le mutant Hpx° a été entreprise. Au préalable, les capacités du mutant Hpx° à entrer en compétition avec la souche sauvage ont été contrôlées en milieu LB additionné de catalase. Pour cela, les deux souches ont été ensemencées simultanément en milieu LB. Trois aliquots de culture ont été prélevés 0, 24h et 48h après ensemencement du milieu, puis étalés sur boîte appropriée (voir Chapitre « Matériel et Méthodes »). A t0h, « l’input » a été calculé : il s’agit du rapport entre le nombre de cfu du mutant Hpx° et le nombre de cfu de la souche sauvage à t0h. A t24h ou t48 h, « l’output » a été calculé : il s’agit du rapport entre le nombre de cfu du mutant Hpx° et le nombre de cfu de la souche sauvage à t24h ou t48h. Enfin, l’index de compétition 24 heures et 48 heures a été déterminé : il est défini comme étant le rapport entre output et input. L’index de compétition du mélange Hpx° et souche sauvage est de 0,6, 24 heures après ensemencement et de 1,3, 48 heures après ensemencement (Fig. 9A). Ce résultat signifie que le mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage 24 heures après ensemencement. Cette différence n’est plus visible 48 heures après ensemencement. Ce résultat suggère que les mutations n’entraînent pas de défaut dans la compétitivité de S. typhimurium en milieu LB pendant 48 heures. 65 Résultats Partie 1 (B) Indice de prolifération (cfu 16h/ cfu 2h) Indice de prolifération (cfu 16h/ cfu 2h) (A) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 wt 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Hpx° (C) wt Hpx° (D) Préculture en LB Préculture à 4°C Carence et stress oxydant 1,00E+09 wt 1,00E+08 Hpx° 1,00E+07 Stress thermique Opsonisation à 4°C Azide de sodium Infection cfu/ml 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 Lyse des macrophages Triton 0,1% 1,00E+01 1,00E+00 Ensemencement des bactéries intracellulaires Stress oxydant sur gélose LB Culture de nuit 4°C Azide de sodium Triton 0,1% Figure 8 : Indice de prolifération de la souche sauvage et du mutant Hpx° dans différentes lignées de macrophages (A) Des macrophages RAW 264.7 ont été infectés par des cultures bactériennes à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées au triton 0,1% et les bactéries intracellulaires ont été étalées sur boîte LB. 24 heures après, les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé (cfu 16h/ cfu 2h). (B) Même expérience que (A). Les bactéries intracellulaires ont été étalées sur boîtes LB additionnées de 2000 unités de catalase. (C) Diagramme des différentes étapes du protocole utilisé pour l’infection de macrophages. A chacune de ces étapes, S. typhimurium est soumise à des stress de différente nature. (D) Expérience de viabilité du mutant Hpx° face aux stress rencontrés durant le protocole d’infection Résultats Partie 1 Le même inoculum bactérien composé de la souche sauvage et du mutant Hpx° a été injecté à des souris BALB/c par voie intra-péritonéale. Les deux souches ont été inoculées à 105 bactéries/ml dans un ratio 1:1. L’index de compétition obtenu après 48 heures d’infection est de 0,6 indiquant que ce mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage dans la souris (Fig. 9B). En LB, l’index de compétition obtenu était également de 0,6 (Fig. 9A). Ainsi, le défaut de compétitivité du mutant Hpx° en milieu LB se traduit également par un défaut de compétitivité en condition d’infection. Ce résultat montre qu’une altération métabolique de S. typhimurium peut influencer sa capacité à être virulente. Les mutations des gènes codant pour KatG, KatE, KatN et AhpCF affectent donc pas la capacités de virulence de S. typhimurium en condition d’infection dans la souris. VII- Etude de la contribution individuelle des catalases KatG et KatE Dans le but d’évaluer la contribution individuelle des catalases dans la résistance à l’H2O2, katG et katE ont été clonés sur le plasmide pACYC 184. Les plasmides pACYC 184, pACYC 184 katG+ (pkatG) et pACYC 184 katE+ (pkatE) ont ensuite été transformés dans le mutant Hpx°. Les souches sauvage, Hpx°, Hpx° pACYC 184, Hpx°pkatG et Hpx°pkatE ont été cultivées en milieu LB, à 37°C et en aérobiose. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été ajouté directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 10). Dans le but de différencier la contribution physiologique de KatG et de KatE, la croissance des souches a également été testée en présence d’H2O2 à une concentration finale de 10 mM, concentration critique pour la survie de S. typhimurium (Fig. 11). Des aliquots de culture bactérienne ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout de l’H2O2, étalés sur boîte LB et dénombrés 24 heures après incubation à 37°C. En présence de 2,5 mM d’H2O2, la croissance de la souche sauvage, du mutant Hpx° pkatG et du mutant Hpx° pkatE n’est pas affectée. Par contre, il entraine l’arrêt de la croissance du mutant Hpx° (Fig. 10A). La croissance du mutant Hpx°pACYC 184 est également arrêtée après ajout de l’H2O2, suggérant que le plasmide n’induit pas d’effet sur la viabilité de la souche. Le nombre de cfu des mutants Hpx°pkatG et Hpx°pkatE augmente d’un demi-logarithme, 90 minutes après ajout d’H2O2 (Fig. 10B). L’apport de KatG ou de KatE dans la souche Hpx° permet donc de restaurer la croissance de ce mutant. Ainsi, l’apport de KatG ou KatE permet de supprimer un phénotype lié à l’inactivation de quatre gènes. Ce résultat souligne l’importance de KatG et de KatE dans l’élimination du peroxyde d’hydrogène. 66 Résultats Partie 1 (A) 2,5 Index de compétition 2 1,5 1 0,5 0 24h 48h (B) Souche A Souche B Index de compétition wt ∆ahpCF ∆katG ∆katE 0,58 wt ∆ahpCF ∆katG ∆katE ∆katN 0,6 Figure 9 : Index de compétition en milieu LB entre la souche sauvage et le mutant Hpx° (A) Une préculture de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisée en LB et en aérobiose, a été diluée à DO600 = 0,025 puis mélangée à un ratio 1:1. A t0h, t24h et t48 h, des aliquots de culture ont été prélevés et étalés soit sur boîte LB pour dénombrer la population totale, soit sur boîte LB avec antibiotique pour dénombrer les cfu du mutant. L’input a été calculé (cfu Hpx° à t0h/cfu souche sauvage à t0h ), ainsi que l’output (cfu Hpx° à t24h ou t48 h / cfu souche sauvage à t24h ou t48 h). Enfin, l’indice de compétition a été déterminé (Output (24h ou 48h)/ Input). (B) Des souris BALB/c agées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec un mélange bactérien composé de la souche sauvage et d’un des mutants à un ratio 1:1 et à 105 cfu/ml. En parallèle de l’infection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches inoculées ont été contrôlées sur boîte LB (Input). 2 jours après, les souris ont été sacrifiées, les rates collectées et les bactéries intracellulaires étalées sur boîte LB et dénombrées (Output). Au final, l’index de compétition a été déterminé (Output/Input). Résultats Partie 1 En présence de 10 mM d’H2O2, la concentration bactérienne de la souche sauvage et du mutant Hpx° pkatE chute très légèrement 90 minutes après stress (Fig. 11). Le nombre de cfu du mutant Hpx° chute d’environ 5 logarithmes (1.109 cfu/ml à t0’ et 2,6.104 cfu/ml à t90’) et celui du mutant Hpx° pACYC chute d’un logarithme et demi (5,5.108 cfu/ml à t0’ et 1,7.107 cfu/ml à t90’). Ce résultat suggère que le plasmide pACYC184 a un effet sur la croissance du mutant Hpx°. L’effet de l’ajout d’H2O2 est moins drastique sur la croissance du mutant Hpx° pkatG. En effet, le nombre de cfu de ce mutant augmente 90 minutes après l’ajout d’H2O2 (8.108 cfu/ml à 3.109 cfu/ml). L’apport de katE sur un plasmide multicopie confère au mutant Hpx° le même phénotype que celui de la souche sauvage. L’apport de katG sur un plasmide multicopie permet au mutant Hpx° de continuer à pousser après ajout de l’H2O2. Ces résultats indiquent que KatE et KatG suppriment le phénotype observé dans le mutant Hpx°. VIII- Conclusion et discussion Le but de cette étude était d’évaluer l’implication des catalases et des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium. Pour cela, une souche dépourvue de katG, katE, katN et ahpCF (Hpx°) a été construite et analysée pour sa sensibilité à l’H2O2, sa capacité à éliminer l’H2O2, et enfin sa capacité à établir la virulence. Cette étude a montré que les catalases et les peroxyrédoxines de S. typhimurium participaient à l’élimination de l’H2O2 protégeant ainsi la bactérie de ses effets toxiques. Nous avons également observé que le mutant Hpx° était en partie capable d’éliminer l’H2O2 indiquant que S. typhimurium était dotée d’une autre réductase d’H2O2. Nous avons, de plus, identifié des conditions pour lesquelles la virulence d’Hpx° était altérée. En effet, nous avons observé une altération de la capacité à former des colonies pour le mutant Hpx° après passage dans les macrophages et étalement sur boîte LB. Une possibilité est que la bactérie soit exposée au stress oxydant dans les conditions d’infection et qu’elle accumule des dommages oxydatifs. Cependant, le défaut observé n’est pas corrélé avec une forte diminution de la survie de S. typhimurium suggérant que la bactérie est en partie capable de lutter contre le stress oxydant produit dans le macrophage. Cette propriété semble lui être conférée par la présence d’une autre enzyme impliquée dans la dégradation de l’H2O2. 67 Résultats Partie 1 (A) wt DO 600 nm 10 Hpx° 1 Hpx° pACYC184 0,1 Hpx° pkatG Hpx° pkatE 0,01 0 100 200 300 400 500 Temps (min) cfu/ml (B) 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt Hpx° Hpx° pACYC184 Hpx° pkatG Hpx° pkatE 0 45 90 Temps après ajout de l'H2O2 (min) Figure 10 : Croissance et survie des souches en présence de 2,5 mM d’H2O2 Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été rajouté dans le milieu de croissance à une concentration finale de 2,5 mM. La croissance a été suivie (A) et 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été prélevés puis dénombrées après 24 h d’incubation à 37°C (5B). Résultats Partie 1 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 cfu/ml 1,00E+07 1,00E+06 wt 1,00E+05 Hpx° 1,00E+04 Hpx° pACYC184 1,00E+03 Hpx° pkatG 1,00E+02 Hpx° pkatE 1,00E+01 1,00E+00 0 45 90 Temps aprés ajout de l’H2O2 (min) Figure 11 : Survie des souches en présence de 10 mM d’H2O2 Des précultures de la souche sauvage et du mutant Hpx°, réalisées en milieu LB et en aérobiose, ont été diluées dans les mêmes conditions. A DO600 = 0,3, de l’H2O2 a été ajouté dans le milieu de croissance à une concentration finale de 10 mM. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été prélevés. 24 heures après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées. Caractérisation d’un biosenseur vivant du peroxyde d’hydrogène Résultats Partie 2 Au cours de notre précédente étude, le mutant Hpx°, dépourvu des catalases KatG, KatE, KatN et de la peroxyrédoxine AhpCF a été construit. Nous avons analysé ce mutant pour sa capacité à proliférer dans les macrophages murins et à survivre dans les souris. Malgré le fait que la viabilité de ce mutant ne soit pas fortement affectée, nous avons identifié des conditions pour lesquelles le mutant Hpx° accumulait des dommages oxydatifs après passage dans les macrophages. Ce résultat suggère que S. typhimurium perçoit du stress oxydant au cours de l’infection. Plusieurs études ont montré que la NAPDH phagocyte oxydase synthétise de l’anion superoxyde, 30 minutes après activation du macrophage et durant 6 heures (Vazquez-Torres et al., 2000 ; Vanderven et al., 2009). Ces études ont été réalisées avec des sondes chimiques qui, lorsqu’elles sont oxydées par les FAO, émettent des signaux facilement dosables. Ces sondes ont comme principaux défauts d’être invasives et assez peu spécifiques des FAO. Au LCB, une plateforme a été créée dont le but est de développer des biosenseurs vivants afin de détecter d’éventuelles pollutions de l’environnement humain par des substances chimiques et/ou biologiques (comme des bactéries dont certaines peuvent être pathogènes). Ces biocapteurs vivants spécifiques sont construits à partir de « gène-signature » d’un polluant donné fusionné à un gène rapporteur (Fantino et al., 2009). Nous avons exploité la même stratégie dans le but de sonder et d’identifier spécifiquement la composition de l’environnement cytoplasmique de S. typhimurium. Pour cela, un biosenseur vivant capable de détecter l’H2O2 a été construit. Cet outil est constitué du promoteur du gène ahpC, dont la transcription est activée par OxyR en présence d’H2O2, fusionné à la séquence codante d’une protéine rapportrice, la GFP, émettrice d’un signal facilement mesurable. Le biosenseur vivant a, d’abord, été caractérisé en milieu de culture. Pour cela, plusieurs questions ont été posées : Le biosenseur vivant répond-il à la présence d’H2O2 ? Cette réponse est-elle sous le contrôle d’OxyR ? Quelle est la gamme de linéarité de réponse du biosenseur vivant ? Nous avons, par la suite, réalisé des infections de macrophages à l’aide de biosenseurs vivants pour sonder l’environnement de S. typhimurium tel qu’elle le perçoit. I- Construction du plasmide PahpC-GFP Chez E. coli et chez S. typhimurium, il existe un régulon spécifiquement induit par le peroxyde d’hydrogène, le régulon oxyR (Zheng et al., 2001). D’après des études transcriptomiques réalisées chez E. coli en 2001 par l’équipe de Gisela Storz, le régulon oxyR se compose de plusieurs dizaines de gènes dont dps, katG et ahpC, dont les expressions sont 68 Résultats Partie 2 (B) GFP/DO (UA) (A) Temps (min) GFP/DO (UA) (C) Temps (min) Figure 1 : Caractérisation du biosenseur vivant en milieu minimum glycérol 0,2% et en présence d’H2O2 La souche sauvage (A) le mutant Hpx° (B) et le mutant ∆oxyR (C) ont été cultivés en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, des concentrations croissantes d’H2O2 ont été rajoutées directement dans le milieu de culture. La fluorescence a été suivie à 530 nm par un fluorimètre. Le bruit de fond correspondant à la fluorescence des bactéries sauvages a été retranché. Le rapport entre la fluorescence et la DO600 est représenté sur les graphiques. Résultats Partie 2 induites 184, 44 et 20 fois, respectivement en présence d’1 mM d’H2O2. Parmi ces trois gènes, seul ahpC est uniquement régulé par OxyR. Ce gène semblait donc être un bon candidat afin de savoir si dans le macrophage S. typhimurium était exposée à de l’H2O2. Nous avons choisi la protéine GFP (Green Fluorescence Protein) comme rapporteur pour sa facilité d’usage et sa rapidité de détection. La GFP est une protéine fluorescente facilement dosable par fluorimétrie. Nous avons utilisé un variant de la GFP, la GFP mut3a (Cormack et al., 1996) qui offre un signal plus stable et plus intense (de 20 à 35 fois) que la protéine sauvage. Le promoteur du gène ahpC a donc été cloné puis fusionné au gène codant pour la GFP mut3a sur le plasmide pFPV25. Il existe entre 10 et 15 copies du plasmide pFPV25 par bactérie. Le plasmide recombinant obtenu a été transformé dans la bactérie sauvage et dans des bactéries de fonds génétiques variés. La bactérie transformée par le plasmide PahpC-GFP sera appelée biosenseur vivant dans le reste du chapitre. II- Caractérisation du biosenseur vivant en milieu de culture Dans le but de savoir si le biosenseur vivant percevait de l’H2O2, la croissance de la souche a été réalisée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, de l’H2O2 a été ajouté directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 10 µM et la fluorescence a été suivie au cours du temps à 530 nm (Fig. 1A). L’intensité de GFP mesurée au cours du temps a été rapportée à la concentration bactérienne. Les résultats ont montré qu’immédiatement après ajout de l’H2O2, le niveau de fluorescence augmente pour atteindre un pic 25 minutes après le début de l’expérience. En absence d’H2O2, le niveau de fluorescence mesuré (Fig. 1A) reste nul au cours du temps. Ce résultat montre que le biosenseur est capable de percevoir la présence d’H2O2. Afin de vérifier que la réponse du biosenseur est dépendant d’OxyR, l’expérience a été renouvelée en utilisant un mutant ∆oxyR transformé avec le plasmide PahpC-GFP. Ce biosenseur vivant a été exposé à 0, 10 et 20 µM finaux d’H2O2, le niveau de fluorescence mesuré reste nul dans chacun des cas. Ce résultat confirme que la perception d’H2O2 par le biosenseur est dépendante de la présence d’OxyR. Afin d’étudier la gamme de sensibilité du biosenseur vivant en fonction de la concentration en H2O2 perçu, l’intensité de fluorescence du biosenseur vivant a été mesurée en présence de différentes concentrations en H2O2 (2, 4, 6 et 8 µM) (Fig. 2). Dans chacune des quatre conditions, le niveau de fluorescence augmente immédiatement après l’ajout d’H2O2. Le niveau de fluorescence maximum atteint dépend de la concentration en H2O2 utilisée. Plus la 69 Résultats Partie 2 µM Figure 2 : Caractérisation du biosenseur vivant en milieu minimum glycérol 0,2% et soumis à des doses répétées d’H2O2. La souche sauvage a été cultivée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. Toutes les 20 minutes, de l’H2O2 a été rajouté directement dans le milieu de culture. Quatre concentrations d'H2O2 ont été testées : 2, 4, 6 et 8 µM. La fluorescence a été suivie à 530 nm. Le bruit de fond correspondant à la fluorescence des bactéries sauvages a été retranché. Le rapport entre la fluorescence et la DO600 est représentée sur le graphique. Résultats Partie 2 concentration en H2O2 est élevée, plus le niveau maximum de fluorescence atteint est élevé. Ce résultat montre que la réponse du biosenseur vivant est proportionnelle à la concentration en H2O2 détectée par celui-ci dans la gamme des concentrations testée. Cette caractéristique pourra être utilisée pour déterminer la concentration en H2O2 perçue dans les macrophages. Nous nous sommes ensuite demandés si le biosenseur pouvait être saturé lorsqu’il était soumis à un flux constant d’H2O2. Pour cela, de l’H2O2 a été ajouté toutes les 20 minutes dans le milieu de culture. Nous avons observé que le niveau de fluorescence du biosenseur vivant augmentait après chaque ajout d’H2O2 indépendamment de la concentration en H2O2 testée (2, 4, 6 ou 8 µM). Ainsi, dans les conditions testées, nous ne sommes pas parvenus à saturer le biosenseur vivant. Ce résultat montre que le biosenseur vivant est apte à détecter des concentrations constantes d’H2O2. Dans le but d’augmenter l’intensité de fluorescence, le plasmide PahpC-GFP a été transformé dans le mutant Hpx°, dépourvu de KatG, KatE, KatN et AhpCF. Ce mutant est altéré dans sa capacité à éliminer l’H2O2 et la prédiction est alors que ce mutant produirait plus de GFP que la souche sauvage. Dans le but d’éprouver cette prédiction, la croissance de la souche a été réalisée en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1%. A DO600 = 0,4, de l’H2O2 a été ajouté directement dans le milieu de culture à une concentration finale de 0, 2, 4, 6, 8 ou 10 µM. La fluorescence a été suivie au cours du temps par fluorimétrie (Fig. 1B). Le niveau de fluorescence augmente immédiatement après ajout d’H2O2. Le pic de fluorescence est atteint 25 minutes après le début de l’expérience et l’intensité de fluorescence dépend de la concentration en H2O2 utilisée. Ainsi, le profil des courbes de fluorescence du biosenseur Hpx° est superposable à celui du biosenseur sauvage. Le niveau de fluorescence atteint par le biosenseur Hpx° est, par contre différent, de celui du biosenseur sauvage. Par exemple, après ajout de 10 µM d’H2O2, le niveau de fluorescence du biosenseur Hpx° est environ 2 fois plus élevé que celui de la souche sauvage. Ce résultat indique que le niveau de GFP produit par le biosenseur vivant Hpx° est plus important que celui produit par la souche sauvage. Ainsi, cet outil nous permet d’augmenter le niveau du signal produit par le biosenseur vivant sauvage. Cet aspect pourrait être important dans la cas où le niveau d’H2O2 perçut par la souche sauvage soit trop faible pour être détectée. 70 Résultats Partie 2 Expression GFP (UA) Expression GFP (UA) A Expression GFP (UA) Expression GFP (UA) B Figure 3 : Caractérisation du biosenseur vivant dans la souche sauvage ou dans le mutant Hpx° en condition d’infection dans des macrophages murins. Des macrophages issus de lignée cellulaire, les RAW 264.7 (A) non activés (panneau de gauche) ou activés à l’IFNγ 10 U/ml et au PMA 0,2 µM (panneau de droite), et des macrophages primaires (B), issus de moelle osseuse, non activés (panneau de gauche) ou activés dans les mêmes conditions (panneau de droite) ont été infectés par la souche sauvage et le mutant Hpx° portant le plasmide PahpCGFP pendant 10h. A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et lysés afin d’isoler les bactéries intracellulaires. Les bactéries ont ensuite été fixées au paraformaldéhyde et analysées pour leur niveau de fluorescence par cytométrie de flux Résultats Partie 2 III- Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages murins Nous avons, ensuite, analysé le comportement du biosenseur vivant directement en condition d’infection dans des macrophages dans le but de savoir si S. typhimurium percevait de l’H2O2 en condition d’infection. Deux types cellulaires ont été testés, soit des macrophages murins issus de lignée cellulaire, soit des macrophages murins primaires issus de moelle osseuse et fraîchement différenciés. Pour augmenter leur activité oxydante, une partie des macrophages des deux types cellulaires a été traitée avec de l’IFNγ et du PMA. L’infection a été réalisée sur 10 heures et 6 prélèvements à différents temps après infection ont été effectués. Les bactéries intracellulaires ont été isolées, analysées au cytomètre de flux pour leur niveau de fluorescence. Lorsque le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages RAW 264.7 non activés, nous avons observé une augmentation du niveau de fluorescence dès le début de l’infection. La fluorescence a atteint son niveau maximal après 120 minutes d’infection (Fig. 3A), puis a diminué immédiatement après et pendant les 8 heures d’infection restantes. Ce résultat montre que le biosenseur vivant perçoit de l’H2O2 pendant les 120 premières minutes de l’infection, puis que l’inducteur semble disparaître progressivement pendant le reste de l’infection. Lorsque le biosenseur sauvage a été utilisé pour infecter des macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ et au PMA, nous avons observé que le profil de la courbe de fluorescence était strictement superposable à celui obtenu dans des macrophages non activés. Par contre, le niveau maximum de fluorescence produit par le biosenseur vivant dans des macrophages activés (60 UA) est supérieur à celui produit dans des macrophages non activés (30 UA). Ces résultats montrent que S. typhimurium perçoit de l’H2O2 en condition d’infection et que cette perception diffère en fonction de l’état d’activation des cellules infectées. Lorsque le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de moelle osseuse, les résultats obtenus ont présenté un profil légèrement différent de celui obtenu dans des RAW 264.7 (Fig. 3B). Nous avons observé une augmentation du niveau de fluorescence pendant les 240 premières minutes de l’infection, et contrairement au biosenseur vivant dans des RAW 264.7, le niveau de fluorescence a très légèrement diminué pendant toute la durée restante de l’infection. Ces résultats montrent que le niveau d’H2O2 perçu par Salmonella dans des macrophages primaire est plus élevé et se produit sur une durée plus longue que l’inducteur semble être présent pendant toute la durée de l’infection dans ces macrophages. 71 Résultats Partie 2 ° Figure 4 : Caractérisation du biosenseur vivant dans différente souches en condition d’infection dans des macrophages murins Des macrophages primaires, issus de moelle osseuse, activés à l’IFNγ 10 U/ml et au PMA 0,2 µM ont été infectés par soit la souche sauvage de S. typhimurium, soit le mutant Hpx°, soit le mutant ∆oxyR portant le plasmide PahpC-GFP pendant 8h. A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et lysés dans le but d’isoler les bactéries intracellulaires. Par la suite, les bactéries ont été fixées au paraformaldéhyde et leur niveau de fluorescence quantifié par cytométrie de flux. Résultats Partie 2 Enfin, le biosenseur vivant a été utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de moelle osseuse activés à l’IFNγ et au PMA. Nous avons observé que le profil de la courbe de fluorescence était strictement superposable à celui obtenu dans des macrophages primaires non activés. Par contre, le niveau maximum de fluorescence produit par le biosenseur vivant dans des macrophages activés (100 UA) est supérieur à celui produit dans des macrophages non activés (70 UA). Ainsi, les infections de macrophages réalisées avec le biosenseur vivant ont permis de montrer que S. typhimurium était exposée à de l’H2O2 en condition d’infection et que la cinétique de production de l’H2O2 perçue par la bactérie dépendait du type de macrophages et de l’état d’activation de ces derniers. Nous nous sommes assurés que la réponse du biosenseur observée dans les macrophages était dépendante du régulateur transcriptionnel OxyR. Pour cela, le biosenseur vivant ∆oxyR a été utilisé pour infecter des macrophages primaires issus de moelle osseuse activés à l’IFNγ et au PMA. Nous avons observé que le niveau de fluorescence du biosenseur vivant ∆oxyR restait nul pendant toute la durée de l’infection. Enfin, nous avons testé le biosenseur vivant dans le mutant Hpx° (Fig. 3). Les résultats obtenus sont directement corrélables avec ceux obtenus avec le biosenseur vivant sauvage dans les quatre conditions testées (RAW 264.7 ou macrophages primaires, non activés ou activés). Par contre, le niveau de fluorescence maximum atteint est dans chaque cas supérieur à celui obtenu avec le biosenseur vivant sauvage. IV- Implication de la NADPH phagocyte oxydase dans la production des FAO par le macrophage La NADPH phagocyte oxydase est supposée être responsable de la production des FAO dans le macrophage. Ainsi, une prédiction est qu’en l’absence de cette enzyme eucaryote, il n’y ait plus de production de FAO dans le macrophage et ainsi que le biosenseur vivant ne perçoive plus d’H2O2. Dans le but de tester cette prédiction, des macrophages primaires ont été infectés par le biosenseur vivant. Ces macrophages ont été extraits de moelle osseuse de souris sauvages et de souris dont le gène codant pour une des sous–unités de la NADPH phagocyte oxydase, la sous-unité gp91-Phox, a été inactivé. Ces souris ne sont donc plus capables de produire de l’anion superoxyde via la NADPH phagocyte oxydase. Une proportion des macrophages a été activée par un traitement IFNγ et PMA (Fig. 5A). Nous avons observé 72 Résultats Partie 2 (A) (B) WT gp91-/- Figure 5 : Caractérisation du biosenseur vivant dans des macrophages primaires sauvages ou dépourvus de la sous-unité gp91-Phox. Des macrophages primaires (sauvages ou dépourvus de la sous-unité gp91-Phox) issus de moelle osseuse soit ont été infectés par la souche sauvage de S. typhimurium portant le plasmide PahpCGFP pendant 7h. (A) A différents temps d’infection, des aliquots de culture ont été prélevés et lysés afin d’isoler les bactéries intracellulaires. Les bactéries ont ensuite été fixées au paraformaldéhyde et leur niveau de fluorescence quantifié par cytométrie de flux. (B) Trois heures après infection, les bactéries intracellulaires isolées de macrophages sauvages (panneaux du haut) ou gp91-/- (panneaux du bas) ont été isolées et observées par microscopie. Le LPS bactérien a été marqué par un anticorps spécifique (1ère colonne), la fluorescence de la sonde PahpC-GFP analysée (2èmecolonne), et une superposition des deux signaux effectuée (3ème colonne). Cette expérience a été réalisée par Stéphane Méresse au Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy. Résultats Partie 2 qu’en l’absence de la NADPH phagocyte oxydase, le niveau de fluorescence de la sonde PahpC-GFP reste nul, indépendamment de l’état d’activation des macrophages. Des clichés de microscopie ont été réalisés 3h après infection de macrophages sauvages et de macrophages dépourvus de la NADPH oxydase (gp91-/-) infectés par la souche sauvage portant la sonde PahpC-GFP (Fig. 5B). Les signaux de marquage des LPS étaient équivalents dans les cellules sauvages et les cellules gp91-/- signifiant que la concentration bactérienne était la même dans les deux types de cellules. Le niveau de GFP est, par contre, beaucoup plus intense dans des biosenseurs vivants infectant des cellules sauvages. Ce résultat confirme que les macrophages gp91-/- sont moins oxydants. Ainsi, on peut conclure que dans les macrophages sauvages, l’H2O2, responsable de l’activation transcriptionnelle du promoteur ahpC-gfp, est produit par la NADPH phagocyte oxydase. V- Conclusion et discussion Dans le but de caractériser la réponse oxydante perçue par S. typhimurium au cours de l’infection, nous avons créé un outil génétique capable de détecter l’H2O2 dans le cytoplasme de S. typhimurium. Le promoteur du gène ahpC a donc été choisi pour sa capacité de réponse transcriptionelle en présence d’H2O2, et ce, de façon exclusivement OxyR dépendante. Nous avons fusionné le promoteur ahpC et le gène codant pour la protéine rapportrice GFP, l’outil construit est capable de signaler la présence d’H2O2 dans le cytoplasme de la bactérie et de répondre de façon dose. Dans des macrophages RAW 264.7, nous avons observé que S. typhimurium était très rapidement exposée à de l’H2O2 (dans les premières minutes de l’infection). Cette phase dure approximativement 120 minutes, puis le niveau de GFP chute assez vite indiquant que le niveau d’H2O2 perçu par la bactérie diminue. Ce résultat est en accord avec différentes études réalisées sur la cinétique du burst oxydatif dans des macrophages murins (Vazquez-Torres et al., 2000 ; Vanderven et al., 2009). Dans des macrophages issus de moelle osseuse, la bactérie perçoit un niveau de stress plus long et plus intense. 73 Implication des enzymes éliminant le peroxyde d’hydrogène dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium : caractérisation du mutant HpxF- Article Redundant hydrogen peroxide scavengers contribute to Salmonella virulence and oxidative stress resistance Journal of Bacteriology (2009) 191: 4605-14 Résultats Partie 3 Contexte de l’étude Les deux précédentes études ont montré qu’en condition d’infection dans des macrophages murins, S. typhimurium percevait de l’H2O2 et que le mutant Hpx° dépourvu des 3 catalases KatG, KatE et KatN et de la peroxyrédoxine AhpCF était toujours capable de proliférer. Ces résultats suggèrent que le mutant Hpx° possède encore une enzyme qui détoxifie l’environnement oxydant du macrophage permettant à la bactérie de se répliquer. Une analyse bioinformatique du génome de S. typhimurium nous a permis d’identifier une seconde peroxyrédoxine TsaA. Cette enzyme possède plus de 34% d’identité de séquence protéique avec AhpC de S. typhimurium et plus de 58,5% avec AhpC d’Helicobacter pylori (Voir résultats complémentaires). Afin d’évaluer la contribution de TsaA dans le phénotype du mutant Hpx° en condition d’infection, nous avons inactivé tsaA dans la souche Hpx° pour créer le mutant HpxF-. La caractérisation phénotypique ainsi que les tests de virulence du mutant HpxF- ont fait l’objet de la publication qui suit. 74 JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 2009, p. 4605–4614 0021-9193/09/$08.00⫹0 doi:10.1128/JB.00144-09 Copyright © 2009, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Vol. 191, No. 14 Redundant Hydrogen Peroxide Scavengers Contribute to Salmonella Virulence and Oxidative Stress Resistance䌤† Magali Hébrard,1,3 Julie P. M. Viala,1,3 Stéphane Méresse,2,3 Frédéric Barras,1,3 and Laurent Aussel1,3* CNRS, Laboratoire de Chimie Bactérienne (UPR 9043), Institut de Microbiologie de la Méditerranée, IFR 88, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France1; Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, CNRS-INSERM-Univ. Méditerranée, Parc Scientifique de Luminy, Case 906, 13288 Marseille Cedex 9, France2; and Aix-Marseille University, Marseille, France3 Received 3 February 2009/Accepted 9 May 2009 mechanisms. The KatE and KatG catalases are involved in H2O2 degradation, with katE being described as a member of the RpoS regulon (17, 22) and katG being OxyR dependent (26, 39). Both enzymes share the ability to reduce hydrogen peroxide to water and molecular oxygen, and their role was shown to be predominant at millimolar concentrations of H2O2 since they do not require any reductant (32). This observation is of particular importance, since these enzymes are not limited by the availability of a reductant, such as NADH, which cannot be generated fast enough to face a burst of H2O2. However, the katG and katE simple mutants, as well as the katE katG double mutant, did not show any increased susceptibility in macrophage or virulence attenuation in mice (5, 27). A possible reason could be the presence of a third nonheme and manganese-dependent catalase called KatN (30). This enzyme may contribute to hydrogen peroxide resistance under certain environmental conditions, but its involvement in virulence remains unknown. Moreover, katE, katG, and katN single mutants did not show any susceptibility to exogenous millimolar H2O2, essentially due to the compensatory function of the remaining catalases (5, 30). Another family of enzymes was shown to play an alternative role in H2O2 scavenging: the alkyl hydroperoxide reductases. These proteins directly convert organic hydroperoxides to alcohols, e.g., hydrogen peroxide to water. The alkyl hydroperoxide reductase AhpC belongs to the two-cysteine peroxiredoxin family, and the gene encoding this enzyme was identified as a member of the OxyR regulon (26, 39). The redox system consists of two proteins, AhpC and AhpF, with the latter being a thioredoxin reductase-like protein that contains two disulfide centers and transfers electrons from NADH to AhpC (13). Salmonella is a facultative intracellular pathogen that is associated with gastroenteritis, septicemia, and typhoid fever. This gram-negative bacterium survives and replicates in macrophages during the course of infection and can be exposed to a number of stressful environments during its life cycle (16). One of the host defense mechanisms that Salmonella encounters upon infection is the production of superoxide anion O 䡠⫺ 2 by the phagocyte NADPH oxidase (1, 25). This radical can pass the outer membrane of the bacteria and represents one of the major weapons used by the macrophage to kill engulfed pathogens (18). Evidence that phagocyte-produced superoxide is a key mechanism for avoiding Salmonella infection is clear: mice and humans who are genetically defective in superoxide production are significantly more susceptible to infection (36, 38). Superoxide dismutases, located in the bacterial periplasm and in the cytoplasm, dismutate superoxide O2䡠⫺ to hydrogen peroxide H2O2 and molecular oxygen. Unlike superoxide, hydrogen peroxide can diffuse readily across bacterial membranes and form HO䡠 hydroxyl radicals in the presence of Fe(II) (18). These reactive oxygen species (ROS) can oxidize and damage proteins, nucleic acids, and cell membranes. To scavenge and degrade H2O2 molecules generated either as a by-product of aerobic metabolism or by the phagocyte NADPH oxidase, Salmonella has evolved numerous defense * Corresponding author. Mailing address: Laboratoire de Chimie Bactérienne, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France. Phone: 33 4 91 16 46 59. Fax: 33 4 91 71 89 14. E-mail: [email protected]. † Supplemental material for this article may be found at http://jb .asm.org/. 䌤 Published ahead of print on 15 May 2009. 4605 Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 Salmonella enterica serovar Typhimurium is an intracellular pathogen that can survive and replicate within macrophages. One of the host defense mechanisms that Salmonella encounters during infection is the production of reactive oxygen species by the phagocyte NADPH oxidase. Among them, hydrogen peroxide (H2O2) can diffuse across bacterial membranes and damage biomolecules. Genome analysis allowed us to identify five genes encoding H2O2 degrading enzymes: three catalases (KatE, KatG, and KatN) and two alkyl hydroperoxide reductases (AhpC and TsaA). Inactivation of the five cognate structural genes yielded the HpxFⴚ mutant, which exhibited a high sensitivity to exogenous H2O2 and a severe survival defect within macrophages. When the phagocyte NADPH oxidase was inhibited, its proliferation index increased 3.7-fold. Moreover, the overexpression of katG or tsaA in the HpxFⴚ background was sufficient to confer a proliferation index similar to that of the wild type in macrophages and a resistance to millimolar H2O2 in rich medium. The HpxFⴚ mutant also showed an attenuated virulence in a mouse model. These data indicate that Salmonella catalases and alkyl hydroperoxide reductases are required to degrade H2O2 and contribute to the virulence. This enzymatic redundancy highlights the evolutionary strategies developed by bacterial pathogens to survive within hostile environments. 4606 J. BACTERIOL. HÉBRARD ET AL. MATERIALS AND METHODS Bacterial strains and growth conditions. The bacterial strains used in this study are listed in Table 1. Strains were routinely grown in Luria-Bertani (LB) medium at 37°C. Minimal medium (M9) contained MgSO4 (1 mM), CaCl2 (200 M), and thiamine (1 g/ml). As a carbon source, glucose was added at a final concentration of 0.2%. Ampicillin (50 g/ml), kanamycin (25 g/ml), and chloramphenicol (25 g/ml) were added when necessary. Deletions of various genes and concomitant insertion of an antibiotic resistance cassette were carried out using lambda-Red-mediated recombination (11). Mutations were moved to the wild-type strain 12023 by P22 transductions. To avoid the outgrowth of suppressed strains, katE, katG, katN, ahpCF and tsaA mutations were selected anaerobically on LB agar supplemented with bovine liver catalase (2,000 U/plate; Sigma-Aldrich). In some cases, antibiotic resistance cassettes were removed by using the temperature-sensitive plasmid pCP20 carrying the FLP recombinase (11). In silico genome analysis. The genome analyzed was that of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 (23) (www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind?S .typhimurium). STM4106, STM1318, and STM0608 correspond to the catalases KatG and KatE and the alkyl hydroperoxide reductase AhpC, respectively. STM1731 was characterized as a third catalase, KatN (30). STM0402 was annotated as a putative thiol-alkyl hydroperoxide reductase, and we renamed it TsaA (thiol-specific antioxidant) for homology with Helicobacter hepaticus TsaA (58.5% identity) (24). TABLE 1. Bacteria and plasmids used in this study Bacterium/plasmid S. Typhimurium strains 12023 Ahp⫺ mutant Kat⫺ mutant HpxT⫺ mutant HpxF⫺ mutant E. coli strains MG1655 Hpx⫺ mutant Plasmids pACYC184 pkatG ptsaA pKD3 pKD4 pCP20 pKD46 Source or reference Relevant characteristic(s) Wild type ⌬ahpCF::kan ⌬tsaA::cat ⌬katE ⌬katG ⌬katN::kan ⌬katE ⌬katG ⌬ahpCF::kan ⌬katE ⌬katG ⌬katN ⌬ahpCF ⌬tsaA Laboratory stock This study This study This study This study F⫺; wild type ⌬katE::tet ⌬katG::cat ⌬ahpCF::kan Laboratory stock This study cat (Cmr) tet (Tcr), p15A, ori pACYC184 derivative carrying katG and its promoter (Cmr) pACYC184 derivative carrying tsaA and its promoter (Cmr) Template plasmid; contains an FLP recombination targetflanked chloramphenicol resistance gene (Cmr) Template plasmid; contains an FRT-flanked kanamycin resistance gene (Kmr) Thermal induction of FLP synthesis Red recombinase expression plasmid 7 This study This study 11 11 11 11 Measurement of hydrogen peroxide accumulation in cell culture. Cells were grown overnight in M9 minimal medium containing 0.2% glucose and supplemented with Casamino Acids (1 mg/ml), diluted to an optical density at 600 nm (OD600) of 0.05, and grown for four generations. These cells were then washed in fresh minimal medium containing 0.05% glucose and incubated with shaking at 37°C for 25 min. Aliquots were removed every 5 min, and hydrogen peroxide levels were determined using the Amplex red/horseradish peroxidase method (Invitrogen). The low glucose concentration was used in order to minimize H2O2 production by catalyzed glucose autooxidation. Hydrogen peroxide scavenging by whole cells. Bacterial cultures were grown overnight aerobically in M9 minimal medium supplemented with Casamino Acids, diluted to an OD600 of 0.01, and grown to an OD600 of 0.3. Cells were diluted in fresh prepared minimal medium at an OD600 of 0.1. H2O2 was added at a final concentration of 10 M. Each 90 s, aliquots were removed and assayed immediately for H2O2 content by the Amplex red/horseradish peroxidase method (Invitrogen). Hydrogen peroxide sensitivity assay. Bacterial cultures were grown overnight in LB, diluted to an OD600 of 0.05, grown to an OD600 of 0.3 in LB, and treated with 1 mM hydrogen peroxide. To determine viability, aliquots were taken immediately before treatment and 1 h and 2 h after treatment, serially diluted, and plated onto LB supplemented with catalase. Bacterial infection of macrophages and survival assays. RAW 264.7 macrophages were seeded at a density of 4 ⫻ 105 cells per well in six-well tissue culture plates containing Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) with 10% fetal calf serum (FCS) (HyClone) and supplemented with gamma interferon (IFN-␥) (10 U/ml; ImmunoTools) 24 h before use. Bone marrow cells were isolated from femurs of 8- to 10-week-old C57BL/6 female mice and differentiated into macrophages as described previously (12). Bacteria were cultured overnight at 37°C with shaking and opsonized in DMEM containing FCS and normal mouse serum (10%; Perbio) for 30 min. The macrophages were activated with 0.2 M phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma Aldrich) before infection. Where indicated, diphenyleneiodonium (DPI) (Sigma Aldrich) was added at various concentrations to inhibit NADPH oxidase. Bacteria were added to the monolayers at a MOI of ⬇70:1, centrifuged at 400 ⫻ g for 5 min at 4°C, and incubated for 30 min at 37°C in 5% CO2. The macrophages were washed three times and Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 AhpC was shown to be a predominant scavenger at low concentrations of H2O2, mainly because its catalytic efficiency was better than those of catalases (32). Recently the alkyl hydroperoxide reductase from Helicobacter hepaticus, TsaA (Thiol-Specific Antioxidant), was characterized (24). The tsaA mutant was found to be more sensitive to oxidizing agents like superoxide anion or t-butyl hydroperoxide. Surprisingly, this mutant was more resistant than the wild-type to H2O2, essentially because the level of catalase was increased in this background (24). In gastric pathogens, TsaA plays a critical role in the defense against oxygen toxicity that is essential for survival and growth (2). Interestingly, Salmonella contains two genes encoding alkyl hydroperoxide reductases, ahpC and tsaA, whereas a single copy was found in Escherichia coli (ahpC) or in Helicobacter pylori (tsaA). The redundancy of these antioxidant proteins could explain the extremely high resistance of Salmonella to hydrogen peroxide. It has been shown by Imlay and coworkers that in E. coli, three genes were involved in H2O2 scavenging: two catalase genes (katE and katG) and an alkyl hydroperoxide reductase gene (ahpC) (32). Simultaneous inactivation of the katE, katG, and ahpCF genes negated H2O2 degradation. As a consequence, this triple mutant, called the Hpx⫺ mutant, accumulates intracellular H2O2 (32). Moreover, H2O2 generated by aerobic metabolism was found to be sufficient to create toxic levels of DNA damage in such a background (28). In the present study, we deleted the Salmonella katE, katG, and ahpCF genes and two more genes absent in E. coli, katN and tsaA, to obtain the HpxF⫺ mutant, which lacks three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases. HpxF⫺ cells exhibited the incapacity to degrade micromolar concentrations of H2O2, whereas this phenotype was not observed for the Kat⫺ (katE katG katN) and Ahp⫺ (ahpCF tsaA) mutants. Therefore, the HpxF⫺ mutant exhibited a high sensitivity to this compound. Moreover, this mutant did not show any proliferation within macrophages and presented reduced virulence in mice, suggesting that Salmonella catalases and alkyl hydroperoxide reductases form a redundant antioxidant arsenal essential for survival and replication within host cells. VOL. 191, 2009 OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA RESULTS Three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases allow Salmonella to tolerate an anaerobic/aerobic shift. To assay the importance of Salmonella catalases and alkyl hydroperoxide reductases during aerobic metabolism, two mutants were built: a katE katG ahpCF mutant (HpxT⫺, for Hpxthree⫺) and a katE katG katN ahpCF tsaA mutant (HpxF⫺, for Hpxfive⫺). These strains were precultured in LB anaerobically and then diluted in aerobic medium, and their phenotypes were compared to that of the E. coli katE katG ahpCF mutant (Hpx⫺). Salmonella HpxT⫺ cells did not present any growth defect, whereas the HpxF⫺ mutant initially grew and then stalled for 2 to 3 h, finally catching up at the end of the stationary phase (Fig. 1A). At OD600s of 0.1, 0.5, and 1, aliquots of each culture were removed and observed under a microscope. Whereas Salmonella wild-type and HpxT⫺ cells appeared rod shaped, HpxF⫺ cells formed long filaments (Fig. 1C). This trend was emphasized at an OD600 of 0.5 and correlated with the lag observed during growth but decreased at an OD600 of 1 when the cells escaped from the lag and resumed growing. Similar observations were made with the E. coli Hpx⫺ mutant, which presented a growth defect and filamentation when the cells were submitted to an anaerobic/aerobic shift (Fig. 1B and C). Presumably, upon the switch to aerobiosis, cells experience a sudden burst in ROS that catalases and alkyl hydroperoxide reductases are able to scavenge. These results are consistent with the characterization of the E. coli Hpx⫺ strain already reported (28). Taken together, these data indicated that inactivation of three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases led to a growth lag and filamentation of Salmonella under an aerobic shift. Viability of the HpxFⴚ mutant is not affected by endogenous hydrogen peroxide. To establish the impact of endogenous H2O2 on Salmonella fitness, we built two supplementary mutants, which we referred to as the Kat⫺ mutant, which lacks three catalases (katE, katG, and katN), and the Ahp⫺ mutant, which lacks two alkyl hydroperoxide reductases (ahpCF and tsaA). Then, we evaluated their ability to eliminate endogenously produced H2O2. In order to monitor H2O2 accumulation generated during aerobic growth, the strains were grown in minimal medium supplemented with Casamino Acids for at least four generations and immediately resuspended in fresh medium. H2O2 was then quantified every 5 min over a period of 25 min. In wild-type and Kat⫺ strains, the H2O2 levels remained constant, accumulating at a rate of 1.2 nM/min (Fig. 2A). The Ahp⫺ mutant also showed only a minor accumulation of H2O2 (2 nM/min), reaching a final concentration of 0.14 M. Within HpxF⫺ cells, the H2O2 concentration increased 2.6-fold in 25 min to reach 0.36 M, with a rate of 8.8 nM/min (Fig. 2A). Thus, a HpxF⫺ mutant accumulated much more endogenous H2O2 than Kat⫺ or Ahp⫺ mutants, underlying the synergistic action of both type of enzymes on H2O2 degradation. Then, to estimate the impact of endogenous H2O2 accumulation on their fitness, the four bacterial strains were grown aerobically in LB and viability was assayed at various times. Growth was monitored at 600 nm, and the growth curves of the four strains were found to be identical (data not shown). Then, aliquots from each culture were removed at OD600s of 0.5 and 2 and plated on LB agar medium supplemented with catalase. The results showed that the wild type and the three mutants shared identical plating recovery, indicating that none of the mutants presented any viability defect in comparison to its wild-type parent (Fig. 2B). Thus, the HpxF⫺ mutant clearly accumulated H2O2 during growth, but the concentrations reached in LB medium were not high enough to compromise viability. Finally, the wild-type strain and the three mutants (the Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺ mutants) were grown in minimal medium under aerated conditions. The growth of all the mutants was slowed down, with HpxF⫺ being slightly more affected (Fig. 2C). Thereby, the nutrient limitation led to a growth rate reduction for the Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺ mutants. Surprisingly, addition of Casamino Acids did not signif- Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 incubated with DMEM containing FCS and 100 g/ml gentamicin for 90 min, after which the gentamicin concentration was decreased to 10 g/ml for the remainder of the experiment. For enumeration of intracellular bacteria, macrophages were washed two times with phosphate-buffered saline and lysed with 0.1% Triton X-100, and a dilution series was plated on LB agar supplemented with catalase. Competition assays. Eight- to 10-week-old C57/B6 mice were inoculated intraperitoneally with equal amounts of two bacterial strains for a total of 105 bacteria per mouse. The spleens were harvested 48 h after inoculation and homogenized. Bacteria were recovered and enumerated after plating a dilution series onto LB agar and LB agar with the appropriate antibiotics, both supplemented with catalase. Competitive indexes (CIs) were determined for each mouse (3). The CI is defined as the ratio between the mutant and wild-type strains within the output (bacteria recovered from the mouse after infection) divided by their ratios within the input (initial inoculum). A one-sample t test was used to determine whether the CI was significantly different from 1. All statistical analyses were performed by using the Prism software program (GraphPad, San Diego, CA). The two-tailed P value was calculated. Competition assays in LB medium were performed as described previously (10). Briefly, bacterial mixtures were incubated with equal amounts at 37°C for 24 h under shaking. Cells were diluted and plated on LB agar supplemented with catalase, and the resulting colonies were plated on the selective medium to determine the relative percentage of each strain recovered. The CI was calculated as described above. RNA extraction and quantitative PCR. RNA extraction from intracellular bacteria was adapted from a previously described method (14). In brief, activated RAW 264.7 macrophages were seeded in 10 tissue-culture-treated plates (128 by 86 mm). The infection was carried out as described above with few modifications: bacteria were added to the monolayers at a MOI of 50:1, and supplemented DMEM containing 66 g/ml gentamicin was added for 45 min following the three washes. Six hours postinfection, cells were washed twice with phosphatebuffered saline and lysed, and RNA was stabilized with a solution of 0.3% sodium dodecyl sulfate, 1% acidic phenol, and 19% ethanol for 30 min on ice. RNA extraction was performed with the SV Total RNA isolation system (Promega). cDNAs were synthesized from 1 g RNA with the Superscript II reverse transcriptase and random primers (Invitrogen). Real-time PCR was performed on a Mastercycler ep realplex instrument (Eppendorf) by using the SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) PCR kit (Takara Bio Group, Japan). Specific primers are described in Table S1 in the supplemental material. Melting curves were analyzed to control for the specificities of the PCRs. Copy numbers were calculated from a standard curve plotting four different dilutions of genomic DNA against the PCR cycle number at which the measured fluorescence intensity reached the threshold, specified so that it was significantly above the noise band of the baseline (10 times the standard deviation). Plasmid construction. The cloning vector used was pACYC184. The insert carrying the 200-bp-upstream katG start codon and the katG gene was PCR amplified from S. Typhimurium 12023 by using the forward primer 5⬘-CCCAA GCTTCCGGGAGCTTTATTACAACTC-3⬘ and the reverse primer 5⬘-GGGG GATCCCTGGTTGTGCATAACATAGGC-3⬘. PCR products were digested using BamHI and HindIII and cloned into the pACYC184 vector to generate pkatG, and the insert was verified by sequencing. The insert carrying the 200bp-upstream tsaA start codon, and the tsaA gene was PCR amplified by using the forward primer 5⬘-CCCTCTAGAAGCGAGGGCGTGCGTCAGATC-3⬘ and the reverse primer 5⬘-GGGGGATCCGAAGTGGCGCTGGAAGCGTTG-3⬘. PCR products were digested using BamHI and XbaI and cloned into the pACYC184 vector to generate ptsaA, and the insert was verified by sequencing. 4607 4608 HÉBRARD ET AL. J. BACTERIOL. icantly change the growth rate of the HpxF⫺ mutant (data not shown). This last observation ruled out the possibility that this mutation led to amino acid auxotrophy as described for the E. coli sodA sodB mutant (6). The HpxFⴚ mutant is highly sensitive to exogenous hydrogen peroxide. To evaluate the role of catalases and alkyl hydroperoxide reductases when Salmonella is submitted to exogenous stress, the wild-type strain and the three mutants were exposed to various exogenous H2O2 levels. The bacterial strains were first assayed for their ability to scavenge micromolar concentrations of H2O2. Bacterial cultures were grown to an OD600 of 0.3 and diluted in minimal medium, and H2O2 was added at the final concentration of 10 M. The wild-type, Ahp⫺, and Kat⫺ strains scavenged H2O2 in less than 7 min, whereas the HpxF⫺ mutant failed to do so (Fig. 3A). A wildtype strain heat killed at 80°C displayed a degradation profile similar to that of the HpxF⫺ mutant (Fig. 3A). These data demonstrated that the combination of mutations in catalaseand alkyl hydroperoxide reductase-encoding genes prevented scavenging of exogenous H2O2 at micromolar concentrations. They also highlighted the catalytic efficiency of catalases and alkyl hydroperoxide reductases, since the Ahp⫺ and Kat⫺ mutants could completely degrade 10 M H2O2 in a few minutes. Next, to evaluate the impact of millimolar concentrations of H2O2 on Salmonella fitness, strains were grown to an OD600 of 0.3 in LB medium and treated with 1 mM H2O2, and growth was monitored at 600 nm over time. The Kat⫺ and HpxF⫺ mutant growth was abolished following the addition of exogenous H2O2 (Fig. 3B). In contrast, growth of the wild type and the Ahp⫺ strain was not affected, reflecting the poor efficiency of AhpC and TsaA in scavenging millimolar concentrations of H2O2. Finally, we examined cell viability after exposure to 1 mM H2O2. Bacterial cells were collected just before and 1 and 2 h after H2O2 treatment. We observed that 2 h after stress, plating recovery of the HpxF⫺ mutant exhibited a 25-fold drop, from ⬇108 to 4 ⫻ 106 CFU/ml, whereas plating recovery of the wild-type strain showed a 10-fold increase (Fig. 3C). Viability of the Kat⫺ strain was also affected, since its plating recovery showed a threefold decrease 2 h after stress, whereas the Ahp⫺ mutant survived as well as its wild-type parent. Differences in plating recovery between the Kat⫺ and HpxF⫺ mutants also assigned a scavenging effect to the Ahp enzymes, observed only Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 FIG. 1. E. coli Hpx⫺ and Salmonella HpxF⫺ strains share the same growth defect linked to filamentation. S. Typhimurium 12023 (wild type; filled squares), E. coli MG1655 (wild type; filled circles), S. Typhimurium HpxF⫺ (katE katG katN aphCF tsaA; open triangles), S. Typhimurium HpxT⫺ (katE katG aphCF; open squares), and E. coli Hpx⫺ (katE katG aphCF; open circles) cells were grown in LB medium anaerobically until early log phase. The cells were then diluted in aerobic LB medium to an OD600 of 0.05, and aerobic growth was monitored at 600 nm (A and B). At OD600s of 0.1, 0.5, and 1, cells from the five strains were removed for microscopic observations (C) (magnification, ⫻100). VOL. 191, 2009 when the catalases were inactivated (Fig. 3C). All together, these experiments highlighted the sensitivity of the HpxF⫺ mutant when subjected to exogenous stress and the importance of the catalases in degrading millimolar concentrations of exogenous hydrogen peroxide. The HpxFⴚ mutant is defective for proliferation within macrophages. To investigate the involvement of catalases and alkyl hydroperoxide reductases in intracellular proliferation, we in- 4609 FIG. 3. The HpxF⫺ mutant is highly sensitive to exogenous hydrogen peroxide. (A) Wild-type (filled squares), Ahp⫺ (filled circles), Kat⫺ (open squares), HpxF⫺ (open circles), and heat-killed wild-type (filled triangles) cells were grown in minimal medium to an OD600 of 0.3 and then diluted at an OD600 of 0.1. H2O2 was added at a final concentration of 10 M. Aliquots were removed every 90 s to assay H2O2 levels as described in Materials and Methods. (B) Bacterial cultures (wild type, Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺) grown to an OD600 of 0.3 in LB medium were treated with 1 mM hydrogen peroxide (arrow). The growth was then monitored at 600 nm. (C) Viability was assayed, respectively, before (white bars) and 1 h (gray bars) and 2 h (black bars) after H2O2 treatment by plating the bacterial cells on LB agar supplemented with catalase. Results are the means ⫾ standard deviations for three independent experiments, each in triplicate. fected two kind of cells: macrophages freshly prepared from murine bone marrow and considered highly oxidant and RAW 264.7 mouse macrophages. Both kind of cells were activated with IFN-␥ and PMA and infected with the wild-type, Ahp⫺, Kat⫺, and HpxF⫺ Salmonella strains. Bacterial proliferation was assayed by calculating the proliferation index as a ratio of Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 FIG. 2. Endogenous H2O2 does not affect HpxF⫺ mutant viability. (A) Cultures of Salmonella Typhimurium 12023 (wild type; filled squares), the Ahp⫺ mutant (aphCF tsaA; filled circles), Kat⫺ (katE katG katN, open squares), and the HpxF⫺ mutant (katE katG katN aphCF tsaA; open circles) were grown overnight aerobically in minimal medium supplemented with Casamino Acids, diluted to an OD of 0.05, and grown for four generations. The cells were then washed in fresh medium and incubated, and aliquots were removed every 5 min to measure H2O2 concentrations as described in Materials and Methods. (B) Wild-type, Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ strains were grown in LB medium. At OD600s of 0.5 (white bars) and 2 (gray bars), aliquots were removed from each culture and plated on LB agar supplemented with catalase to determine cell viability. Results are the means ⫾ standard deviations for three independent experiments, each in triplicate. (C) Wild-type, Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ cells were grown in minimal medium overnight. The cells were then diluted to an OD600 of 0.1, and aerobic growth was monitored at 600 nm. OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA 4610 J. BACTERIOL. HÉBRARD ET AL. the intracellular bacteria between 16 and 2 h postinfection. Within murine bone marrow, the proliferation indexes of the wild-type and Kat⫺ cells were found to be nearly similar (2.38 ⫾ 0.21 and 2.76 ⫾ 0.10, respectively), whereas the Ahp⫺ and HpxF⫺ mutants were defective for proliferation (0.92 ⫾ 0.07 and 0.64 ⫾ 0.01, respectively) (Fig. 4A). Within RAW cells, the proliferation index was also very near for the wild- TABLE 2. Competition assays with micea Strain description Median CI No. of mice P valueb Fold attenuation Kat⫺ Ahp⫺ HpxF⫺ 1.11 1.20 0.07 4 4 5 NSc NS ⬍0.0001 NS NS 14 a Mice were inoculated intraperitoneally with a mixture of two strains. At day 2 after injection, spleens were harvested for bacterial counts. CIs of wild-type versus Kat⫺, wild-type versus Ahp⫺, and wild-type versus HpxF⫺ strains were determined. b A one-sample t test was used to determine whether the CI was significantly different from 1. c NS, not significant. Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 FIG. 4. HpxF⫺ mutations led to a drastic attenuation of intracellular proliferation within bone marrow-derived and RAW 264.7 macrophages. Opsonized bacteria (Wild type or Kat⫺, Ahp⫺, or HpxF⫺ mutant) were phagocytosed by freshly prepared bone marrow-derived macrophages (A) or RAW 264.7 cells (B), both activated with IFN-␥ and PMA. Two and sixteen hours postinfection, mouse macrophages were lysed for enumeration of intracellular bacteria (gentamicin protected), determined by CFU counts. The values shown represent the proliferation index, calculated as a ratio of the intracellular bacteria between 16 and 2 h postinfection. (C) The HpxF⫺ mutant and the wild-type strain were tested for infection of activated RAW 267.4 cells without or with 1 M DPI, which inhibits the phagocyte NADPH oxidase. The proliferation index was calculated as described above. The inset represents the proliferation index ratio (wild type/HpxF⫺) without or with 1 M DPI. Results presented in the three panels are the means ⫾ standard deviations for at least three independent experiments, each in triplicate. type and Kat⫺ cells (11.9 ⫾ 0.6 and 11.5 ⫾ 1.9, respectively) whereas the Ahp⫺ and HpxF⫺ mutants exhibited proliferation indexes of 5.5 ⫾ 2.1 and 0.5 ⫾ 0.1, respectively (Fig. 4B). These results indicated that the HpxF⫺ mutant was unable to proliferate within bone marrow or RAW 264.7 macrophages. Moreover, they highlighted the contribution of Ahp enzymes to intracellular replication within macrophages. Next, to test if the lack of proliferation of the HpxF⫺ mutant was due to exogenous oxidative stress generated by the phagocyte NADPH oxidase, we infected macrophages in the presence of various concentrations of DPI, an inhibitor of this enzymatic complex. The proliferation index of the HpxF⫺ strain increased 3.7-fold in the presence of 1 M DPI (Fig. 4C). Conversely, the proliferation index of the wild-type strain decreased from 10.4 ⫾ 2.4 to 3.9 ⫾ 2.1 when DPI was added, indicating that this molecule had an undesirable effect on the bacterial proliferation (Fig. 4C). Thus, we calculated the comparative wild type/HpxF⫺ proliferation index ratio, which dropped from 28.8 to 2.9 in the presence of the NADPH oxidase inhibitor (Fig. 4C). These results showed that despite the nonspecific effect of DPI, the oxidative stress generated by the NADPH oxidase was partially responsible for the proliferation defect of the HpxF⫺ mutant. The HpxFⴚ mutant exhibited attenuated virulence in mice. Finally, we tested whether mutation of catalase- and alkyl hydroperoxide reductase-encoding genes contributed to virulence in the animal. To address this issue, we used mixed infections of wild-type and mutant strains in mice to determine the CI, a very sensitive technique to compare the virulence levels of different strains (3). The lack of three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases significantly decreased Salmonella virulence, since the CI of the HpxF⫺ mutant was found to be 0.07 (Table 2). In contrast, the CIs of the Kat⫺ and Ahp⫺ mutants did not show any significant alteration in virulence (Table 2). These results indicate that deletion of all catalase- and Ahp-encoding genes strongly affects Salmonella virulence in the mouse model. As a control, a competition assay was performed in LB, in which the mutant and wild-type strains were mixed one to one and grown under aerated conditions. The CIs of the Kat⫺, Ahp⫺, and HpxF⫺ mutants were found to be 1.10, 0.86, and 0.69, respectively (Table 3). Thus, the three mutants tested could compete with the wild-type strain in rich culture medium. All in all, these data provided evidence for a contribution of catalases and alkyl hydroperoxide reductases in allowing resistance against oxidative stress generated during the infection process. VOL. 191, 2009 OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA 4611 TABLE 3. Competition assays with LB aerated culturesa Strain description Median CI No. of samples P valueb Fold attenuation Kat⫺ Ahp⫺ HpxF⫺ 1.10 0.86 0.69 3 3 3 NSc NS NS NS NS NS a Bacterial mixtures were incubated with equal amounts for 24 h with shaking. Cells were then diluted and plated to determine the relative percentage of each strain recovered. CI of wild-type versus Kat⫺, wild-type versus Ahp⫺, and wildtype versus HpxF⫺ strains were determined. b A one-sample t test was used to determine whether the CI was significantly different from 1. c NS, not significant. FIG. 5. Expression pattern of catalase- and alkyl hydroperoxide reductase-encoding genes in LB and RAW 264.7 macrophages. RNA was extracted from the Salmonella wild-type strain grown either in LB medium to an OD600 of 2 or within activated RAW 264.7 cells during 6 h. cDNA were synthesized from 1 g RNA, and real-time PCR was performed to amplify the katE, katG, katN, ahpC, tsaA genes. A noncoding (n.c.) DNA domain located between STM0413 and STM0414 was used as a control to monitor the basal level of expression due to residual genomic DNA. The results are the means ⫾ standard deviations for three independent experiments. Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 Gene expression pattern in LB and macrophages. To monitor the expression of Salmonella catalase- and Ahp-encoding genes, we performed quantitative reverse transcription-PCR using a wild-type strain grown either within RAW 264.7 macrophages for 6 h or in LB to an OD600 of 2. Within macrophages, ahpC and tsaA were strongly transcribed (3 ⫻ 1010 and 4.7 ⫻ 1010 copies/g RNA, respectively) (Fig. 5). In comparison, the three catalase-encoding genes presented much lower expression levels (4.3 ⫻ 109, 4.7 ⫻ 108, and 4.5 ⫻ 108 copies/g RNA for katG, katE, and katN, respectively) (Fig. 5). These data highlight the efficient transcription of ahpC and tsaA, both being strongly expressed in LB and within macrophages. The katG and tsaA genes can complement the HpxFⴚ mutant. To evaluate the contributions of individual genes in H2O2 scavenging, we cloned katG and tsaA into the low-copy-number plasmid pACYC184. Wild-type and HpxF⫺ strains were transformed with the pkatG and ptsaA plasmids, and these strains were grown in LB. When submitted to 1 mM H2O2, the HpxF⫺ strain carrying pkatG grew as well as its wild-type parent (Fig. 6A). In contrast, the HpxF⫺ strain carrying ptsaA showed a growth defect similar to that of the HpxF⫺ strain carrying pACYC184 (Fig. 6A). Thus, the presence of katG carried on a low-copy-number plasmid (10 to 15 copies/cell) FIG. 6. pkatG and ptsaA complement the HpxF⫺ mutant with different efficiencies. Bacterial cultures (wild type, filled symbols; HpxF⫺, open symbols) were transformed with empty vector (squares), the pkatG plasmid (circles), or the ptsaA plasmid (triangles). The cells grown to an OD600 of 0.3 and were treated with 1 mM H2O2 (arrow). Growth was monitored at an OD of 600 nm (A), and the viability was assayed before (white bars) and 1 h (gray bars) and 2 h (black bars) after H2O2 treatment (B). Wild-type and HpxF⫺ strains were transformed with empty vector, pkatG, and ptsaA and were tested for infection within activated RAW 264.7 cells. Bacterial cells were plated and counted on LB agar supplemented with chloramphenicol and catalase. The values shown represent the proliferation index, calculated as a ratio of the intracellular bacteria between 16 and 2 h postinfection (C). Results presented in panels B and C are the means ⫾ standard deviations for at least three independent experiments, each in triplicate. 4612 HÉBRARD ET AL. DISCUSSION Resistance to oxidative stress is one of the key processes that allow pathogens to survive within macrophages. Hence, pathogenic bacteria have developed a series of antioxidative defenses which either eliminate ROS or repair their damages (18, 31). In recent years, several attempts have been made to assess the contribution of these defenses to the overall virulence of bacteria. Surprisingly, the outcome was not as straightforward as one would have anticipated. Thus, in several cases, inactivation of genes encoding ROS-eliminating enzymes failed to cause a significant defect in bacterial virulence. For instance, inactivation of catalase-encoding genes had little if any effect on pathogenicity-associated traits of Salmonella Typhimurium (5), Yersinia pestis (15), Francisella tularensis (21), Staphylococcus aureus (9), and Neisseria gonorrhoeae (34). In the present study, we addressed the question of the involvement of cytoplasmic H2O2-degrading enzymes in Salmonella virulence. Our study revealed that efficient proliferation of this bacterium in macrophages relies on the activities of three catalases and two alkyl hydroperoxide reductases. It illustrates how Salmonella has evolved numerous and redundant defense mechanisms to survive within such hostile and oxidative environments. Analysis of the S. Typhimurium genome allowed us to identify five genes encoding H2O2 degrading enzymes: two alkyl hydroperoxide reductases, AhpC and TsaA, and three catalases, KatE, KatG, and KatN. Alkyl hydroperoxide reductase activity was found to contribute to macrophage infection, since the proliferation index of a strain lacking both ahpC and tsaA was decreased by twofold. This observation could be linked to the oxidative microenvironment present within a Salmonellacontaining vacuole (SCV), where ROS and reactive nitrogen species are massively synthesized after macrophage phagocytosis (18, 36). Stimulation of NADPH oxidase and NO synthase, both located on the SCV membrane of the macrophages, leads to the production of O2䡠⫺ and NO䡠, respectively. Both molecules (i) are used directly as a reactive species against Salmonella, (ii) are enzymatically transformed into another reactive species (H2O2 or NO2䡠), or (iii) react with each other to generate a peroxynitrite anion, ONOO⫺. In contrast, a Kat⫺ mutant strain, lacking all three catalases, exhibited a wild-type-like proliferation index within macrophages and mice. This is consistent with previous results in which a Salmonella katE katG mutant retained full murine virulence (5). Alternatively, the wild-type phenotype of the Kat⫺ mutant could be related to the low expression levels of katE, katG, and katN under infection conditions. However, this possibility can be discarded on the basis that a Kat⫺ mutant failed to resist to millimolar exogenous H2O2. This implies that the level of expression recorded was sufficient for participation in H2O2 scavenging. Moreover, one can anticipate that the presence of catalases was the very thing accounting for the resistance of the Ahp⫺ mutant to millimolar concentrations of H2O2. These observations fit with the E. coli model, wherein AhpC was proposed to be of primary importance in scavenging micromolar concentrations of H2O2 whereas the role of catalases was dominant at millimolar concentrations of H2O2 (32). An HpxF⫺ mutant lacking the three catalases and the two alkyl hydroperoxide reductases was unable to proliferate or even survive within macrophages. These mutations also contributed to the attenuation of Salmonella virulence, since the HpxF⫺ cells exhibited a reduced proliferation in mice. Exogenous ROS were found to be partially responsible for the proliferation defect of the HpxF⫺ mutant, since its intracellular replication increased when NADPH oxidase was inhibited. But the DPI did not allow this mutant to reach a wild-type replication efficiency, and its effects appeared quite difficult to sort out since it altered proliferation of the wild-type strain as well. Still, the fact that DPI increased the replication of the HpxF⫺ mutant is fully consistent with the “exogenous ROS” hypothesis. Other causes could account for the reduced proliferation of the HpxF⫺ cells. For instance, this mutant was found to accumulate H2O2 during aerobic growth much faster than its wild-type parent. Thus, endogenous ROS generated during aerobic metabolism in the bacterial cytoplasm might contribute to cumulative oxidative damages. Moreover, the HpxF⫺ mutant was found to grow poorly in minimal medium, and nutrient limitation within the SCV could amplify this trend. Finally, the two detrimental effects could act synergistically and explain the drastic attenuation of proliferation of the HpxF⫺ mutant within macrophages and mice. Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 was sufficient to allow wild-type resistance to exogenously added H2O2. On the other hand, the tsaA-encoded enzyme did not support a catalytic efficiency strong enough to allow the HpxF⫺ mutant to be resistant to 1 mM H2O2. We also investigated cell viability after exposure to 1 mM H2O2. HpxF⫺ cells carrying pkatG exhibited a wild-type plating recovery (⬇108 to ⬇2 ⫻ 109 CFU/ml 2 h after stress), compared to a 10-fold decrease in viability of the HpxF⫺, pACYC184-carrying control (Fig. 6B). Moreover, in a wildtype background, the presence of pkatG yielded an increased plating recovery of ⬇2 ⫻ 109 CFU/ml 2 h after stress, compared to ⬇7 ⫻ 108 CFU/ml obtained with pACYC184. The contribution of tsaA was less pronounced but increased 4.5fold the bacterial cell survival level: 54% of the HpxF⫺ cells carrying ptsaA survived for 2 h after the stress, compared to 12% for the HpxF⫺ cells carrying pACYC184 (Fig. 6B). Thus, katG was found to restore the viability of the HpxF⫺ cells, whereas a slight contribution was attributed to tsaA. The contribution of katG and tsaA was also assayed under infection conditions. All proliferation indexes were found to decrease in the presence of the pACYC184 plasmid and its derivatives, as described previously (19). Transformation of the wild-type strain with pkatG or ptsaA did not significantly change the intracellular proliferation compared to results with the empty vector (1.6-fold and 0.73-fold, respectively) (Fig. 6C). In contrast, the presence of katG or tsaA noticeably increased the proliferation index of the HpxF⫺ mutant (9.6-fold or 6.7-fold, respectively). Moreover, the proliferation indexes of the HpxF⫺ strain carrying pkatG and wild-type strain carrying pACYC184 were found to be quite similar (2.21 ⫾ 0.95 versus 2.47 ⫾ 0.31) (Fig. 6C). This observation suggested that an overexpressed single gene suppressed a phenotype generated by the mutation of five different genes. Thus, these experiments assigned a direct role for both the tsaA and katG genes in intracellular bacterial growth, showing a link between resistance to oxidative stress and proliferation within macrophages. J. BACTERIOL. VOL. 191, 2009 4613 (37). Their data suggested that the NADPH phagocyte oxidase could be excluded from SCV in a Salmonella pathogenicity island 2-dependent manner. Thus, an emerging comprehensive picture would be that Salmonella relies on two alternative ways of coping with oxidative stress: excluding the NADPH phagocyte oxidase and metabolizing ROS produced by the host. Investigation of the interplay between the two strategies represents a major challenge for the future. ACKNOWLEDGMENTS Thanks are due to the members of the F.B. group, A. Latifi and P. Moreau (LCB, Marseille, France), for fruitful discussions and to R. Stevens (GAFL, Avignon, France) for critical reading of the manuscript. This work was funded by the ANR (Programme Blanc “Stress Oxydant” and Programme M.I.E. “Salmo-sensor”), the CNRS, and the Université de la Méditerranée. M.H. was supported by the Ministère de la Recherche and J.P.M.V. by the Fondation pour la Recherche Médicale (FRM). REFERENCES 1. Babior, B. M. 1999. NADPH oxidase: an update. Blood 93:1464–1476. 2. Baker, L. M., A. Raudonikiene, P. S. Hoffman, and L. B. Poole. 2001. 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Identification of RpoS (S)-regulated genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium. J. Bacteriol. 182:5749–5756. 18. Janssen, R., T. van der Straaten, A. van Diepen, and J. T. van Dissel. 2003. Responses to reactive oxygen intermediates and virulence of Salmonella typhimurium. Microbes Infect. 5:527–534. 19. Knodler, L. A., A. Bestor, C. Ma, I. Hansen-Wester, M. Hensel, B. A. Vallance, and O. Steele-Mortimer. 2005. Cloning vectors and fluorescent Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 The HpxF⫺ mutant exhibited much stronger deficiencies than the Ahp⫺ or Kat⫺ mutant. The additive effect of the ahpC tsaA and katE katG katN mutations opened the possibility that both types of scavenging systems contribute in a specific way to the replication process. For instance, H2O2 concentrations were found to vary during infection, increasing massively just after phagocytosis and decreasing during the next 6 h (36). Then, both type of activity would be exploited at different time points during the whole process. An alternative possibility is that the substrate repertoire of alkyl hydroperoxide reductases is much more expanded than that of catalases: ethyl, t-butyl, cumene, and linoleic acid hydroperoxides, among others, were efficiently reduced by Salmonella AhpC (29). Also, this enzyme was shown to protect Salmonella against reactive nitrogen intermediates and to detoxify peroxynitrite (ONOO⫺) to nitrite fast enough to forestall DNA oxidation (4, 8). Hence, catalases could act as an H2O2 scavenger while alkyl hydroperoxide reductases could intervene in eliminating micromolar concentrations of H2O2 and other hydroperoxides. The redundancy of Salmonella enzymes is striking even in a comparison with the closely related E. coli, which requires only three genes, ahpC, katE, and katG, to scavenge H2O2. It is a classic hypothesis that occurrence of redundancy can be rationalized by genetic regulation. In the present work, the expression levels of Salmonella tsaA and ahpC, quantified 6 h after macrophage infection, were found to be high. Conversely, the three catalase-encoding genes were poorly transcribed. The importance of fine-tuning gene expression was also illustrated by the fact that a moderate increase in gene dosage (15 copies per cell) allowed either katG or tsaA to confer a proliferation index similar to that of the wild type. This demonstrated that increased synthesis of only one type of H2O2-degrading activity is sufficient to restore a wild-type replication level within macrophages. However, a certain degree of redundancy also arises at the regulatory level, with OxyR being the transcriptional activator of katG and ahpC whereas katE and katN transcription is RpoS dependent. Our ongoing work aims at assessing a link between redundancy and genetic regulation by carrying out a thorough gene regulation study with Salmonella-infected macrophages. Previous studies had revealed that an important aspect of Salmonella survival within macrophages was the production of two periplasmic Cu/Zn superoxide dismutases, SodCI and SodCII. These enzymes combat phagocytic superoxide O2䡠⫺ by dismutation to H2O2 and O2. SodCI but not SodCII was found to play a role during infection of mice by Salmonella (10, 20, 35). In this context, SodCI and SodCII were considered the front line for combating NADPH-oxidase-generated superoxide. A remaining question was the management of H2O2 produced by dismutation of superoxide. The H2O2 flux into the bacterial cytoplasm was shown to be rapid, with a high permeability coefficient of the membrane (33). Here we showed that cytoplasmic catalases and alkyl hydroperoxide reductases constitute a second line for combating H2O2 produced by SodCI and SodCII in the periplasm. Hence, together with these previous studies, the present work contributes to a better understanding of the strategies used by Salmonella to resist host-produced ROS. It will now be extremely important to bring into the picture the proposal by Fang and coworkers that Salmonella pathogenicity island 2 allows bacteria to avoid NADPH oxidase-dependent killing by macrophages OXIDATIVE STRESS RESISTANCE BY SALMONELLA 4614 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 28. 29. proteins can significantly inhibit Salmonella enterica virulence in both epithelial cells and macrophages: implications for bacterial pathogenesis studies. Infect. Immun. 73:7027–7031. Krishnakumar, R., M. Craig, J. A. Imlay, and J. M. Slauch. 2004. Differences in enzymatic properties allow SodCI but not SodCII to contribute to virulence in Salmonella enterica serovar Typhimurium strain 14028. J. Bacteriol. 186:5230–5238. Lindgren, H., H. Shen, C. Zingmark, I. Golovliov, W. Conlan, and A. Sjöstedt. 2007. 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Jones-Carson, P. Mastroeni, H. Ischiropoulos, and F. C. Fang. 2000. Antimicrobial actions of the NADPH phagocyte oxidase and inducible nitric oxide synthase in experimental salmonellosis. I. Effects on microbial killing by activated peritoneal macrophages in vitro. J. Exp. Med. 192:227–236. 37. Vazquez-Torres, A., Y. Xu, J. Jones-Carson, D. W. Holden, S. M. Lucia, M. C. Dinauer, P. Mastroeni, and F. C. Fang. 2000. Salmonella pathogenicity island 2-dependent evasion of the phagocyte NADPH oxidase. Science 287: 1655–1658. 38. Winkelstein, J. A., M. C. Marino, R. B. Johnston, J. Boyle, J. Curnutte, J. I. Gallin, et al. 2000. Chronic granulomatous disease. Report on a national registry of 368 patients. Medicine (Baltimore) 79:155–169. 39. Zheng, M., X. Wang, L. J. Templeton, D. R. Smulski, R. A. LaRossa, and G. Storz. 2001. DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide. J. Bacteriol. 183:4562–4570. Downloaded from jb.asm.org at INIST-CNRS BiblioVie on January 7, 2010 27. HÉBRARD ET AL. Supplemental Material Proliferation index (16 h/2 h) 5 4 3 2 1 0 WT Kat- Ahp- HpxF- Figure 7: Non-opsonized bacteria (Wild-type, Kat-, Ahp-, and HpxF- mutants) were phagocytosed by activated RAW 264.7 cells. 2 and 16 hours post-infection, mouse macrophages were lysed for enumeration of intracellular bacteria (gentamicinprotected) determined by colony-forming unit counts. The values shown represent the proliferation index calculated as a ratio of the intracellular bacteria between 16 and 2 hours post-infection. These results are the means of one experiment performed in triplicate. Table S1 List of the primers used for quantitative RT-PCR. Target gene n.c. DNA R : CCGTCATTTATGACATGGATTG F : AATCGATTGCGTTCACGTTT katE R : CTTAAAAGCGCCCGAGACC F : ATTGGTGGTCAGCGCATAAT katG R : TGGAAAATGTCCTTTCCATCA F : AAGATCCACGCGAAGCTG katN R : TTTCGACACGTAAAACAACTTCA F : ACTGTTCCAGCAGCAGGTTC ahpC R : CTTTCAAAAACCAGGCGTTC F : GGTAGAAGAAGAAGACGCTCCA tsaA R : TGGTACTGGTTACTCGTCAGG F : CCATTGGTGTGCTGTTTGAA Proliferation index (16 h/2 h) 5 4 3 2 1 0 WT katE- katG- katE- katGkatN- ahpCF- katN- tsaA- HpxF- Figure 8: Opsonized bacteria (Wild-type, katE katG katN ahpCF, katE katG katN tsaA, and HpxF- mutants) were phagocytosed by activated RAW 264.7 cells. 2 and 16 hours post-infection, mouse macrophages were lysed for enumeration of intracellular bacteria (gentamicin-protected) determined by colony-forming unit counts. The values shown represent the proliferation index calculated as a ratio of the intracellular bacteria between 16 and 2 hours post-infection. These results are the means of one experiment performed in triplicate. Note that activation of macrophages was performed using IFN-γ at 25 U/ml, whereas 10 U/ml were used in the experiments presented in the figures 4A, 4B, 4C, and 6C. Résultats complémentaires non publiés Résultats complémentaires Partie 3 AhpC AhpC TsaA TsaA AhpC AhpC TsaA TsaA AhpC AhpC TsaA TsaA AhpC AhpC TsaA TsaA S. E. S. H. S. E. S. H. S. E. S. H. S. E. S. H. typhimurium coli typhimurium pylori typhimurium coli typhimurium pylori typhimurium coli typhimurium pylori typhimurium coli typhimurium pylori 10 20 30 40 50 60 | | | | | | MSLINTKIKPFKNQAFK-NGEFIEVT--EKDTEGRWSVFFFYPADFTFVCPTELGDVADH MSLINTKIKPFKNQAFK-NGEFIEIT--EKDTEGRWSVFFFYPADFTFVCPTELGDVADH MVLVTRQAPDFTAAAVLGSGEIVDKFNFKQHTNGKTTVLFFWPMDFTFVCPSELIAFDKR -MLVTKLAPDFKAPAVLGNNEVDEHFELSKNLGKNGAILFFWPKDFTFVCPTEIIAFDKR *:. *. *. ..*. : .:. . :::**:* *******:*: . .: 70 80 90 100 110 120 | | | | | | YEELQKLGVDVYSVSTDTHFTHKAWHSSSE---TIAKIKYAMIGDPTGALTRNFDNMRED YEELQKLGVDVYAVSTDTHFTHKAWHSSSE---TIAKIKYAMIGDPTGALTRNFDNMRED YEEFQKRGVEVVGVSFDSEFVHNAWRNTPVDKGGIGPVKYAMVADVKREIQKAYGIEHPD VKDFQEKGFNVIGVSIDSEQVHFAWKNTPVEKGGIGQVTFPMVADITKSISRDYDVLF-E :::*: *.:* .** *:. .* **:.:. *. :.:.*:.* . : : :. : 130 140 150 160 170 180 | | | | | | EGLADRATFVVDPQGIIQAIEVTAEGIGRDASDLLRKIKAAQYVAAHPGEVCPAKWKEGE EGLADRATFVVDPQGIIQAIEVTAEGIGRDASDLLRKIKAAQYVASHPGEVCPAKWKEGE EGVALRGSFLIDANGIVRHQVVNDLPLGRNIDEMLRMVDALQFHEEH-GDVCPAQWEKGK EAIALRGAFLIDKNMKVRHAVINDLPLGRNADEMLRMVDALLHFEEH-GEVCPAGWRKGD *.:* *.:*::* : :: :. :**: .::** :.* . * *:**** *.:*. 190 200 | | ATLAPSLDLVGKI-------ATLAPSLDLVGKI-------EGMNASPDGVAKYLAENISSL KGMKATHQGVAEYLKENSIKL : .: : *.: Figure 1 : Alignement des séquences protéiques d’AhpC et de TsaA Les séquences protéiques d ’AhpC de S. typhimurium et d’E. coli ont été alignées, ainsi que celles de TsaA de S. typhimurium et d’E. coli. AhpC et TsaA portent des motifs catalytiques conservés (boites grises). La cystéine péroxidatique est localisée dans le premier motif catalytique, Cys50; la cystéine de résolution est localisée dans le second motif catalytique, Cys172. Ces deux cystéines sont représentées en rouge. Résultats complémentaires Partie 3 Comparaison de séquences protéiques entre les peroxyrédoxines AhpC et TsaA AhpC appartient à la famille des peroxyrédoxines typiques à 2 cystéines, TsaA fait également partie de cette famille. Cette protéine a été caractérisée chez Helicobacter pylori et a été appelée AhpC (Baker at al., 2001). AhpC et TsaA sont toutes deux présentes chez S. typhimurium. Ces deux peroxyrédoxines possèdent les deux cystéines catalytiques : Cys46 et Cys165. Cys46 est la cystéine péroxidatique, elle forme un acide sulfénique Cys-S-OH après avoir réduit un hydroperoxyde, Cys165 est la cystéine de résolution, elle forme un pont disulfure avec Cys46. Le pont disulfure formé est réduit par une réductase disulfure, AhpF est le réductant spécifique d’AhpC. Le système réducteur de TsaA n’a pas été identifié in vivo. Une étude réalisée en 2001 chez H. pylori a montré que TsaA pouvait être réduite in vitro par le système thiorédoxine/thiorédoxine réductase d’E. coli. Contrairement à AhpF, ce système réducteur a une large spécificité de substrats (Baker et al., 2001). AhpF et le système thiorédoxine/ thiorédoxine réductase sont eux-mêmes réduits par le cofacteur NADH. L’alignement de séquence entre AhpC d’E. coli et de S. typhimurium et TsaA de S. typhimurium et d’H. pylori a révélé deux domaines parfaitement alignés (Fig. 1). Le premier domaine présentant une identité de séquence est constitué de sept acides aminés et inclus Cys46, le second domaine est constitué de quatre acides aminés et inclus Cys165. Le pourcentage d’identité de séquence protéique entre AhpC et TsaA de S. typhimurium est de 34,8% alors que celui effectué entre TsaA de S. typhimurium et d’H. pylori et de 58,5% (Fig. 1). Ces résultats soulignent les sites catalytiques conservés de AhpC et de TsaA de S. typhimurium et suggèrent ainsi des activité enzymatiques identiques ainsi qu’un répertoire de substrat commun. 75 Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium Résultats Partie 4 (B) 10 10 1 1 DO 600 nm DO 600 nm (A) wt 0,1 wt 0,1 ahpCF- tsaA- tpx- ahpCF- tsaA- tpx- 0,01 0,01 0 100 200 300 400 500 0 100 Temps (min) 200 300 400 500 Temps (min) (C) DO 600 1 0,1 wt ahpCF- tsaA- tpx- 0,01 0 100 200 300 400 500 600 Temps (min) Figure 1 : Croissance de la souche sauvage et du triple mutant en milieu LB, en milieu minimum et en milieu LPM (A) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en LB, à 37°C ont été réalisées puis diluées dans les mêmes conditions. La croissance a été suivie à 600 nm. (B) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en milieu minimum glucose 0,2% et amino acides 0,1%, à 37°C ont été réalisées, puis diluée dans les mêmes conditions. La croissance a été suivie à 600 nm. (C) Une préculture de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en LPM, à 37°C ont été réalisées puis diluées dans les mêmes conditions. La croissance a été suivie à 600nm Résultats Partie 4 S. typhimurium possède 9 gènes codant pour des peroxyrédoxines. Trois d’entre elles, AhpC, TsaA et Tpx, ont déjà été impliquées dans l’établissement de la virulence bactérienne, (Baek et al., 2009 ; Hu et al., 2009, Hebrard et al., 2009). Au cours de notre précédente étude, nous avons montré qu’un mutant ∆ahpCF ∆tsaA était altéré dans sa capacité à proliférer dans le macrophage. Ce résultat a soulevé la question du rôle des peroxyrédoxines dans le contexte de l’infection chez S. typhimurium. Afin d’étudier l’importance des peroxyrédoxines dans la virulence de S. typhimurium, nous avons entrepris une nouvelle approche génétique qui a consisté à construire les doubles mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx, ∆tsaA ∆tpx ainsi que le triple mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. La caractérisation phénotypique des doubles mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx, ∆tsaA ∆tpx ainsi que du triple mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx fait l’objet de cette étude. I- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx Dans le but d’évaluer la contribution des peroxyrédoxines dans la physiologie bactérienne, la croissance de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ont été analysées en milieu LB, en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1% et en milieu LPM (fig.1A, 1B et 1C). Le milieu LPM (low phosphate low magnésium) est un milieu « pauvre » dans lequel les concentrations en phosphate (337µM) et en magnésium (8µM) sont faibles et le pH est à 5,8 (Coombes et al., 2004). Ce milieu mime les conditions environnementales rencontrées dans le macrophage. En milieu LB (Fig. 1A), la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ont un temps de génération de 24 minutes. En milieu minimum (Fig. 1B), la souche sauvage a un temps de génération de 50 minutes et le triple mutant de 55 minutes. En milieu LPM (Fig. 1C), la souche sauvage a un temps de génération de 72 minutes et le triple mutant de 90 minutes. L’inactivation d’ahpCF, de tsaA et de tpx n’entraine donc pas d’altération majeure dans la croissance de S. typhimurium en milieu riche et en milieu minimum M9. Par contre, en milieu carencé en magnésium et phosphate et à pH acide, ce mutant pousse légèrement moins vite laissant supposer que la mutation d’ahpCF, de tsaA et de tpx entraîne une altération du métabolisme de S. typhimurium. II- Etude de la virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx 1- Etude de la virulence dans des macrophages murins 76 Résultats Partie 4 (B) 2h pi 1,00E+07 16h pi 1,00E+06 cfu/ml 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt Indice de proliferation 16h/2h (A) 12 10 8 6 4 2 0 ahpCF- tsaA- tpx- wt ahpCF- tsaA- tpx- Figure 2 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγγ par la souche sauvage et le triple mutant. Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 activés par l’IFNγ ont été infectées soit par la souche sauvage, soit par le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par avec triton à 0,1%, les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé. (A) Dénombrement des bactéries 2h et 16h après infection (pi). (B) Indices de prolifération (cfu 16h/cfu2h). (A) (B) 1,00E+08 2h pi 25 16h pi Indice de proliferation 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 20 15 10 5 0 wt ahpCFtsaA- ahpCFtpx- tsaA- tpx- wt ahpCFtsaA- ahpCF- tsaA- tpxtpx- Figure 3 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγγ par les trois doubles mutants. Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ ont été infectées soit par la souche sauvage, soit par les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées avec du triton à 0,1%, les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé. (A) Dénombrement des bactéries 2h et 16h après infection (pi) (B) Indices de prolifération (cfu 16h/cfu2h) Résultats Partie 4 Dans le but d’étudier l’implication des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans la virulence, un test de prolifération bactérienne dans des macrophages a été réalisé. Des macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ 10 U/ml ont été infectés par la souche sauvage ou le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. L’indice de prolifération a été calculé. Un résultat expérimental typique est représenté (Fig. 2). Dans cette expérience, le nombre de cfu de la souche sauvage augmente d’un logarithme entre 2 heures et 16 heures alors que celui du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx reste quasiment identique (Fig. 2A). L’indice de prolifération de la souche sauvage est de 10 et celui du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx de 1,4 (Fig. 2B). Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est très altéré dans sa capacité à proliférer dans les macrophages, et son indice de prolifération chute d’un facteur 7 par rapport à celui de la souche sauvage. Ce résultat indique que la capacité réplicative du mutant est affectée par rapport à celle de la souche sauvage et que les peroxyrédoxines de S. typhimurium sont requises pour l’étape de prolifération dans les macrophages. Nous avons ensuite voulu comparer l’implication des trois peroxyrédoxines dans la capacité proliférative de S. typhimurium dans les macrophages. Pour cela, nous avons infecté des macrophages avec les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx. Ces trois mutants ont été analysés dans des macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ 10 U/ml (Fig. 3). La valeur moyenne de l’indice de prolifération des mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx est présentée sur la figure 3B. L’indice de prolifération de la souche sauvage est de 15 et celui du mutant ∆tsaA ∆tpx est de 18. Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA a un indice de prolifération atteignant 10. Enfin, le double mutant ∆ahpCF ∆tpx a un indice de prolifération de 7. Ces résultats confirment l’importance des peroxyrédoxines pour la survie de S. typhimurium dans le macrophage puisque pour les mutants ∆ahpCF ∆tsaA et ∆ahpCF ∆tpx, l’indice de prolifération obtenu est significativement inférieur à celui de la souche sauvage. Néanmoins, la contribution physiologique des peroxyrédoxines n’est pas équivalente en condition d’infection. En effet, seule l’absence d’AhpCF chez S. typhimurium en combinaison avec la mutation de TsaA ou de Tpx altère la capacité à proliférer de S. typhimurium. Ce résultat suggère que l’apport d’AhpCF en condition d’infection est supérieur à celui de TsaA ou Tpx. 77 Résultats Partie 4 Souche A wt Souche B Index de compétition en LB Index de compétition dans les souris ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx 0,7 0,5 Tableau 1 : Index de compétition en LB et dans les souris entre la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Une préparation constitué de la souche sauvage et le triple mutant à un ratio 1:1 a été utilisé pour être ensemencé en milieu LB (DO600 = 0,025), ou inoculé par voie intrapéritonéale dans des souris (5.105 cfu/ml). Des aliquots de cultures bactériennes ont été prélevés dans le but de contrôler la concentration de chacune des deux populations présentes (Input). 24 heures après ensemencement en milieu LB, un aliquot de culture a été prélevé dans le but de déterminer les concentrations bactériennes finales (Output LB). Deux jours après l’inoculation, les souris ont été sacrifiées, les rates prélevées et les bactéries intracellulaires étalées sur boîte et dénombrées (Output souris). Au final, l’index de compétition a été déterminé. 0,4 Index de competition 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Macrophages sauvages Macrophages gp91-/- Figure 4 : Infection de macrophages primaires gp91-/- issus de moelle osseuse activés à l’IFNγ. Des macrophages sauvages et des macrophages dépourvus de la sous-unité gp91-Phox de la NADPH phagocyte oxydase ont été infectés avec un inoculum composé de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à un ratio 1:1 et à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2 heures après infection, l’input a été calculé (cfu mutant/cfu sauvage). 16 heures après infection, l’output a été calculé (cfu mutant/cfu sauvage). Au final, l’indice de prolifération a été déterminé (Output/Input) Résultats Partie 4 2- Etude de la virulence en condition d’infection dans des souris Dans le but de confirmer l’importance d’AhpCF, de TsaA et de Tpx dans la virulence de S. typhimurium, des expériences de compétition dans les souris ont été entreprises. Avant de réaliser l’infection, une expérience contrôlant les capacités du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à entrer en compétition avec la souche sauvage a été réalisée en milieu LB. La souche sauvage et le triple mutant ont été simultanément ensemencés dans un milieu LB à concentration égale (DO600 = 0,025) et à un ratio 1:1. L’index de compétition, calculé 24 heures après infection est de 0,7 (Tableau 1), signifiant que le mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage pendant 24h, en milieu LB et à 37°C. Un nouvel inoculum bactérien composé de la souche sauvage et du triple mutant a été injecté aux souris par voie intra-péritonéale. L’index de compétition obtenu 48 heures après infection dans la souris est de 0,5 (Tableau 2), indiquant que le triple mutant est légèrement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage lors d’une infection systémique. III- Etude du rôle des peroxyrédoxines de S. typhimurium dans les macrophages Afin de comprendre pourquoi le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était affecté dans sa capacité à proliférer dans le macrophage, nous avons formulé l’hypothèse selon laquelle le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était sensible aux FAO et aux FAN produites par le macrophage. Afin de tester notre hypothèse, deux types d’expérience ont été effectuées : nous avons infecté des macrophages soit dépourvus de NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-), soit altérés dans leur capacité à produire des FAN, puis nous avons observé si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumulait dans son cytoplasme les FAO ou FAN produites par des macrophages sauvages. 1- Infection de macrophages gp91-/- ou de macrophages NO. déficients Une expérience de compétition entre la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a été réalisée soit dans des macrophages sauvages activés à l’IFNγ, soit dans des macrophages dépourvus de la sous-unité gp91-Phox de la NADPH phagocyte oxydase (gp91-/-) également activés à l’IFNγ. Des macrophages ont été infectés par un mélange des deux souches bactériennes dans un ratio 1:1 et à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant 16h. L’input et l’output ont été calculés 2h et 16h après infection, respectivement. L’index de compétition a, finalement, été déterminé. Les macrophages dépourvus de NADPH phagocyte 78 Résultats Partie 4 (A) 300000 GFP/DO (UA) 250000 200000 150000 wt 100000 ahpCF- tsaA- tpx- 50000 ahpCF- tsaA- tpx- oxyR- 0 0 100 200 300 400 500 600 700 Temps (min) (B) 300000 GFP/DO (UA) 250000 200000 150000 wt ahpCF- tsaA- 100000 ahpCF- tpxtsaA- tpx- 50000 ahpCF- tsaA- tpx0 0 100 200 300 400 500 600 700 Temps (min) Figure 5 : Expression du biosenseur vivant en milieu de culture. Les souches transformées avec la sonde PahpC-GFP ont été cultivées en milieu minimum glycérol 0,2% et acides aminés 0,1%. La fluorescence a été suivie au cours du temps à 530 nm. (A) La souche sauvage aunsi que les mutants ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx et ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ∆oxyR ont été testés. (B) La souche sauvage et les doubles mutants des peroxyrédoxines ont été testés. Résultats Partie 4 oxydase sont des cellules contraignantes à obtenir et à cultiver, ainsi que très facilement contaminables. Cette expérience n’a pu être réalisée qu’une fois. Dans les macrophages primaires sauvages (Fig. 4), l’index de compétition obtenu est de 0,22. Dans les macrophages gp91-/-, l’index de compétition obtenu est de 0,35. Ce résultat indique que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a toujours un défaut de prolifération dans des macrophages dépourvus de NADPH phagocyte oxydase en comparaison avec la souche sauvage. Ainsi, les FAO produites par la NADPH phagocyte oxydase ne sont pas responsables du défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Nous avons poursuivi en infectant des RAW 264.7 traités avec un inhibiteur de la NO. synthase inductible, le 1400W. Le 1400W est un inhibiteur sélectif et réversible de la NO. synthase inductible. Il agit comme un compétiteur de la L-arginine pour le site actif de l’enzyme. Les macrophages RAW 264.7 ont été traités avec 2µM de 1400W pendant toute la durée de l’infection. Les macrophages ont également été traités avec de l’IFNγ 10 U/ml. Par la suite, la prolifération bactérienne de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a été analysée dans les macrophages pendant 16h. Les résultats sont présentés sur la figure 6. L’indice de prolifération de la souche sauvage passe de 4 dans des macrophages non traités à 12 dans des macrophages traités au 1400W (Fig. 5). Pour le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, l’indice de prolifération passe de 0,8 à 1,6. L’indice de prolifération de la souche sauvage est multiplié par 3 et celui du mutant par 2. En conclusion, bien qu’améliorant ses capacités prolifératives, le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est toujours altéré dans sa capacité à proliférer dans les macrophages en comparaison avec la souche sauvage. Ce résultat montre que les FAN produites par la NO. synthase inductible ne sont pas responsables du défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Afin de diminuer les effets non spécifiques liés à l’utilisation de molécules artificielles, nous avons reproduit l’expérience sur des macrophages simplement traités à l’IFNγ, cytokine naturellement produite par le macrophage et importante pour la réponse immunitaire innée de l’organisme et notamment pour activer la NO. synthase inductible. L’effet de l’IFNγ sur l’activité de la NO. synthase inductible a été contrôlé par la mesure de nitrite dans des lysats cellulaires de macrophages infectés, le nitrite étant un produit de dégradation du NO.. La prolifération bactérienne de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a donc été analysée dans les macrophages traités ou non à l’IFNγ. Les résultats sont présentés sur la 79 Résultats Partie 4 (A) 1,00E+07 2h pi 1,00E+06 16h pi cfu/ml 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt wt + 1400W ahpCF- tsaA- tpx- ahpCF- tsaA- tpx-+ 1400W (B) 16 Indice de prolifération 14 12 10 8 6 4 2 0 wt wt + 1400W ahpCF- tsaA- tpx- ahpCF- tsaA- tpx-+ 1400W Figure 6 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’INFγ et traités avec un inhibiteur de la NO. synthase inductible Deux heures avant infection, les macrophages RAW 264.7, préalablement activés à l’IFNγ, ont été traités avec 2 µM de 1400W. Les macrophages ont ensuite été infectés par des précultures de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant 16 heures. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par du triton à 0,1%, les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées (A) et l’indice de prolifération déterminé (B). Résultats Partie 4 figure 6. L’indice de prolifération de la souche sauvage chute de 30 dans des cellules non traitées à 2,8 dans des cellules traitées (Fig. 6B). Celui du mutant chute de 7 à 0,6. Les indices de prolifération des deux souches ont chuté environ d’un facteur 11 après traitement des macrophages par l’IFNγ illustrant l’importance des cytokines pour l’activation du macrophage et de ses fonctions bactéricides. Ainsi, le rapport des indices de prolifération pour la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est identique. Ce résultat indique que l’absence de traitement des macrophages à l’IFNγ n’améliore pas significativement la prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Comme dans les deux expériences précédentes, les peroxyrédoxines ne semblent pas essentielles pour l’élimination des FAN produites par la NO. synthase inductible. La concentration en NO. produit pendant l’expérience a, ensuite, été mesurée.Le nitrite étant facilement dosable grâce au réactif de Griess, nous avons dosé sa concentration dans des lysats cellulaires (Fig. 6C). Dans des macrophages non traités, la concentration en nitrite passe de 2 µM à 8 µM en présence de la souche sauvage et de 2 µM à 6 µM en présence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx entre 2 heures et 16 heures d’infection. La concentration en nitrite augmente donc d’un facteur 3. Dans des macrophages traités à l’IFNγ, la production de nitrite passe de 2 µM à 15 µM pour la souche sauvage et de 2 µM à 18 µM pour le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. La concentration en nitrite augmente d’un facteur 8 dans des cellules traitées à l’IFNγ. Ce résultat confirme la présence de nitrite dans nos expériences d’infection de macrophages activés à l’IFNγ et donc l’activité de la NO. synthase inductible. Ces expériences montrent que les FAN ne sont pas responsable du phénotype du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx dans les macrophages. En conclusion, ces expériences suggèrent que le mutant n’est pas sensible soit aux FAO seulement, soit aux FAN seulement. Ces résultats suggèrent plutôt une implication des peroxyrédoxines dans l’élimination simultanée des FAO et des FAN. 2- Accumulation des FAO et FAN produites par des macrophages sauvages par le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx Afin de tester l’accumulation de FAO ou FAN dans le cytoplasme du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, nous avons utilisé deux biosenseurs vivants : un biosenseur de l’H2O2 et un biosenseur du NO.. Pour cela, le plasmide PahpC-GFP précédemment construite a été transformé dans le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Nous avons, dans un premier temps, testé l’activité 80 Résultats Partie 4 (A) (B) 2h pi 16h pi 35 1,00E+06 30 Indice de prolifération 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 25 20 15 10 5 0 1,00E+00 wt wt + IFNg ahpCFahpCFtsaA- tpx- tsaA- tpx- + IFNg wt wt + IFNg ahpCFahpCFtsaA- tpx- tsaA- tpx-+ IFNg [NaNO2] µM (C) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 2h pi 16h pi wt wt + IFNg ahpCF- tsaAtpx- ahpCF- tsaAtpx-+ IFNg Figure 7 : Infection de macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ et dosage de la production de nitrite par les macrophages RAW 264.7 Des macrophages RAW 264.7, traités avec de l’IFNγ à 15 U/ml pendant 24 h, ont été infectés par la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées par 0,1% de triton, les bactéries intracellulaires ont été isolées et étalées sur boîte LB. 24h après incubation à 37°C, les colonies ont été dénombrées (A) et l’indice de prolifération a été déterminé (B). (C) 2h et 16h après infection, 1ml de surnageant de culture de macrophage a été prélevé, afin de déterminer la concentration en nitrites produits par le macrophage au cours de l’infection. La concentration en nitrite a été déterminée à l’aide du réactif de Griess qui permet une détection colorimétrique du NO2. Résultats Partie 4 transcriptionnelle du promoteur ahpC-gfp en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1% sans ajout d’H2O2 exogène. Le résultat est présenté sur la figure 7A. Nous avons observé une augmentation du niveau de fluorescence durant tout le temps de la croissance. Ces résultats indiquent une forte activité transcriptionnelle du promoteur ahpC en l’absence d’H2O2 exogène. Afin de nous assurer que l’augmentation de fluorescence observée était dépendante d’OxyR, la mutation oxyR a été introduite dans la souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, la souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ∆oxyR a été construite et l’expérience a été reproduite. Dans cette souche, le niveau de fluorescence reste nul durant tout le temps de la croissance (Fig. 7A). L’augmentation du niveau de fluorescence suggère que l’H2O2 perçu par la souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est produit par son propre métabolisme, et que ce phénomène est dépendant de la présence d’OxyR. Ce résultat nous a conduit à reproduire l’expérience avec les mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx afin d’identifier l’enzyme responsable de ce phénotype (Fig. 7B). Dans les mutants ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx, l’activité transcriptionnelle du promoteur ahpC n’est pas induite. Par contre, le niveau de fluorescence du biosenseur ∆ahpCF ∆tsaA augmente fortement au cours de la croissance et à un niveau équivalent à celui obtenu pour la souche ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Ce résultat indique que l’absence des gènes ahpCF et tsaA est la cause de l’accumulation d’H2O2 et de l’activation transcriptionelle du promoteur ahpC. De la même façon que dans le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, l’activation transcriptionnelle d’ahpC dans le mutant ∆ahpCF ∆tsaA est dépendante d’OxyR (résultat non présenté). Le niveau de fluorescence du biosenseur vivant dans le contexte génétique ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx étant élevé, nous n’avons pas pu utiliser notre outil en condition d’infection dans les macrophages pour savoir si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumulait de l’H2O2 produit par la NADPH phagocyte oxydase. Dans le but de savoir si le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumulait du NO. produit par le macrophage, un nouveau biosenseur a été construit à l’aide du promoteur du gène ytfE . Le gène ytfE a été choisi car son activité transcriptionnelle est induite en présence de nitrite acidifié, qui est un composé mimant les formes actives de l’azote produites dans le macrophage (Kim et al., 2003). Le promoteur du gène ytfE a été fusionné à une séquence codant pour la GFP-mut3a sur le plasmide pFPV25. Le plasmide construit a été transformé dans la souche sauvage. Afin de valider l’outil construit, des croissances en milieu minimum glycérol 0,2% et casamino acides 0,1% ont été réalisées avec le biosenseur vivant. En début 81 Résultats Partie 4 10000 wt pytfE-GFP 9000 wt pytfE-GFP + NO. GFP/DO (UA) 8000 wt pytfE-GFP + H202 7000 wt pytfE-GFP + ONOO- 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 100 200 300 Temps (min) 400 500 600 Figure 8 : Expression de la fluoresence du biosenseur NO.-dépendant en réponse à différents stress. La souche sauvage portant plasmide PytfE-GFP a été cultivée en milieu minimum glycérol 0,2% et acides aminés 0,1%. En début de croissance, 10 µM de Noc5-Noc7, générateurs d’oxyde nitrique, 20 µM d’H2O2, ou 20 µM de SIN-1, générateur de peroxynitrite, ont été rajoutés directement dans le milieu de culture. La fluorescence de la GFP a été suivie au cours du temps à 530 nm. 600 wt GFP/DO (UA) 500 ahpCF- tsaA- tpx400 300 200 100 0 0 2 4 Temps (h) 6 8 10 Figure 9 : Expression de la fluorescence du biosenseur NO.-dépendant en condition d'infection. Des macrophages issus de lignée cellulaire, les RAW 264,7, activés à l’IFNγ ont été infectés par la souche sauvage et le triple mutant tranformé par le plasmide PytfE-GFP. 1h, 2h, 4h, 7h et 10h après infection, des aliquots de culture ont été prélevés, les cellules lysées, les bactéries intracellulaires isolées, et leur niveau de fluorescence déterminé par cytométrie de flux. Résultats Partie 4 de croissance, 10 µM d’oxyde nitrique, 20 µM de péroxyde d’hydrogène ou 20 µM de peroxynitrite ont été ajoutés directement dans le milieu de culture et la fluorescence a été suivie pendant 10 heures. Les résultats sont représentés sur la figure 8. En présence de peroxyde d’hydrogène, de peroxynitrite ou en absence de tout composé, le niveau de fluorescence reste à un niveau faible et constant. Par contre en présence de NO., une forte augmentation du niveau de fluorescence est observable, reflétant l’activité transcriptionnelle du promoteur ytfE. Cette expérience montre que l’activation de la transcription d’ytfE est spécifique de l’oxyde nitrique. L’outil construit permet donc la détection de NO. présent dans l’environnement et dans le cytoplasme de S. typhimurium. Le biosenseur vivant de NO. a ensuite été analysé dans des macrophages RAW 264.7 activés à l’IFNγ pendant 10 heures d’infection. Des aliquots de culture ont été prélevés 0, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 7 heures et 10 heures après infection. Les cellules infectées ont été lysées avec du triton, les bactéries intracellulaires isolées puis analysées en cytométrie de flux pour leur niveau de fluorescence. Les résultats sont présentés sur la figure 9. Le niveau de GFP mesuré est quasi-nul durant les quatre premières heures d’infection, puis il augmente brutalement jusqu’à 7 heures d’infection. Enfin, entre 7 heures et 10 heures d’infection, le niveau de fluorescence est stable et reste élevé. Ce résultat montre que le biosenseur vivant perçoit du NO. 4 heures après le début de l’infection, et que le niveau augmente durant tout le reste de l’infection. Le biosenseur vivant a ensuite était analysé dans le contexte génétique ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx dans les mêmes conditions d’infection. Le profil de la courbe de fluorescence obtenu pour le biosenseur vivant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est strictement superposable à celui obtenu pour le biosenseur vivant sauvage suggérant que ces deux biosenseurs vivants accumulent le NO. de la même façon durant l’infection. Les peroxyrédoxines ne semblent donc pas éliminer le NO. en condition d’infection. IV- Caractérisation phénotypique du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence de FAO ou FAN Le macrophage est un environnement complexe et mal défini, ce qui rend ardue la compréhension des expériences d’infection. Dans le but de travailler dans un environnement plus « simple », nous avons poursuivi en milieu de culture. Jusqu’alors, nous testions l’effet de l’absence d’une enzyme génératrice soit de FAN, soit de FAO sur la prolifération du 82 Résultats Partie 4 (A) (B) DO 600 nm 10 1 wt 0,1 ahpCF- tsaA- tpx- 0,01 0 100 200 300 Temps (min) (D) (C) 10 1 DO 600 nm DO 600 nm 10 wt 0,1 1 wt 0,1 ahpCF- tsaA- tpx- 0,01 ahpCF- tsaA- tpx0,01 0 100 200 300 400 Temps (min) 500 600 0 100 200 300 400 500 600 Temps (min) Figure 10 : Croissance de la souche sauvage et du triple mutant en présence de formes actives de l’oxygène. (A) Equation d’oxydation du paraquat avec production d’anion superoxyde. Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant ont été réalisées en milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en LB jusqu’à DO600 = 0,3. Puis, 1 mM de paraquat (B), 1 mM d’H2O2 (C) ou 50 µM d’hydroperoxyde de cumène (D) ont été ajoutés directement dans le milieu de culture. La croissance a été suivie à DO 600 nm. Résultats Partie 4 mutant. Nous avons, ensuite, adopté une stratégie qui a consisté à tester la présence d’un composé défini sur la croissance ou sur la viabilité du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. Pour cela, deux types d’expériences ont été réalisées : nous avons, d’abord, testé le croissance du mutant en présence de FAO ou de FAN, puis nous avons testé la sensibilité du mutant en présence de FAO, de FAN ou des deux espèces. 1- Croissance du mutant en présence de FAO ou de FAN Trois composés générateurs de FAO ont été testés sur le mutant, l’H2O2, le paraquat qui est un générateur de superoxyde (Fig. 10A) et l’hydroperoxyde de cumène. L’expérience a consisté à faire pousser les souches en milieu LB, à 37°C et en aérobiose. A DO600 = 0,3, les différents composés ont été rajoutés dans le milieu de culture. En présence de 1 mM final de paraquat, la croissance de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est ralentie par rapport à une croissance en LB sans ajout de paraquat (Fig. 10B). La courbe de croissance du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est superposable à celle de la souche sauvage indiquant que les peroxyrédoxines ne sont pas impliquées dans l’élimination du superoxyde. Une concentration finale de 10 mM de paraquat a également été analysée. Nous n’avons également pas vu de différence entre la croissance de la souche sauvage et du mutant des peroxyrédoxines. L’expérience a été renouvelée en présence de 1 mM final d’H2O2 (Fig. 10C) et de 50 µM finaux d’hydroperoxyde de cumène (Fig. 10D). Dans chacun des cas, les courbes de croissance des de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx sont identiques. Les peroxyrédoxines de S. typhimurium ne semblent donc pas être impliquées dans l’élimination de l’anion superoxyde, de l’H2O2 et des alkyl hydroperoxydes. Nous avons suivi des croissances avec la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en milieu LB, en présence de deux formes actives de l’azote, l’oxyde nitrique et le peroxynitrite. A DO600 = 0,3, les différents composés générateurs de FAN ont été rajoutés dans le milieu de culture, la croissance a été suivie. L’expérience a été réalisée avec du NOC5/NOC7 à une concentration finale de 50 µM. Le résultat est présenté sur la figure 11A. Le temps de génération des deux souches est de 40 minutes. L’expérience a été renouvelée avec 250 µM de NOC5/NOC7. Aucune différence significative n’est visible. L’expérience a finalement été reproduite avec du SIN-1 à une concentration finale de 50 µM. Le résultat est présenté sur la figure 11B. Le temps de génération de la souche sauvage et du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est 83 Résultats Partie 4 (A) DO 600 nm 10 1 wt ahpCF- tsaA- tpx0,1 0,01 0 100 200 300 400 500 Temps (min) (B) DO 600 nm 10 1 wt ahpCF- tsaA- tpx- 0,1 0 100 200 300 400 500 600 Temps (min) Figure 11 : Croissance des souches en présence de formes actives de l’azote. Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des peroxyrédoxines ont été réalisées en milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en LB jusqu’à DO600 = 0,3. Puis, 50 µM de NOC5/NOC7 (A) ou 50 µM de SIN-1 (B) ont été ajoutés directement dans le milieu de culture. La croissance a été suivie à DO 600 nm. Résultats Partie 4 de 40 minutes. Les peroxyrédoxines ne semblent donc pas contribuer à l’élimination du NO. et du peroxynitrite. 2- Sensibilité de mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en présence de FAO ou de FAN La viabilité du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a ensuite été testée en présence d’H2O2, de SIN-1, un générateur de peroxynitrite et des deux composés en même temps. Pour cela, les souches ont été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. Les bactéries ont été prélevées, lavées et reprises dans du tampon phosphate puis exposées à de l’H2O2 à une concentration finale de 10 mM pendant trente minutes. Puis à 0, 120 et 240 minutes après les trente minutes d’incubation avec l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement bactérien. Les résultats sont présentés sur la figure 12A. Le nombre de cfu chute de 1,5.108 cfu/ml à 3.107 cfu/ml pour la souche sauvage et de 1.108 cfu/ml à 1.107 cfu/ml pour le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx, 200 minutes après ajout de l’H2O2. La survie des deux souches est, donc, affectée de la même façon. En parallèle, les deux souches ont été exposées à 1 mM final de SIN-1. Les résultats sont présentés sur la figure 12B. Directement après ajout du composé, 120 et 240 minutes après traitement, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB. Le nombre de cfu est le même (3. 108 cfu/ml) pour la souche sauvage et pour le mutant 240 minutes après ajout du SIN-1. Ainsi, l’ajout de 1mM de SIN-1 n’affecte pas la viabilité des souches. Enfin, les souches ont été exposées à un prétraitement d’H2O2 à une concentration finale de 10 mM pendant 30 minutes, puis 1 mM final de SIN-1 a été ajouté dans les mêmes cultures. Les résultats sont présentés sur la figure 12C. A 0, 60, 120, 180 et 240 minutes, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB. Le nombre de cfu de la souche sauvage reste proche de 1.108 cfu/ml, 240 minutes après ajout des deux composés. Le nombre de cfu du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx chute de 1.108 cfu/ml à 2.106 cfu/ml, 240 minutes après ajout des deux composés. Ce résultat indique que ce mutant est affecté par le traitement simultané d’H2O2 et de peroxynitrite. La même expérience a été reproduite avec de l’oxyde nitrique à la place du peroxynitrite. Les deux souches ne sont pas affectée par les conditions testées. Ce résultat suggère que le triple mutant est spécifiquement altéré par le peroxynitrite et non pour toutes formes dérivés de l’oxyde nitrique ou de l’oxyde nitrique lui même. 84 Résultats Partie 4 (A) (B) wt 1,00E+09 wt ahpCF- tsaA- tpx1,00E+09 1,00E+08 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 cfu/ml ahpCF- tsaA- tpx- 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+01 1,00E+00 1,00E+00 0 120 240 0 120 Temps (min) 240 Temps (min) (C) wt 1,00E+09 ahpCF- tsaA- tpx- 1,00E+08 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0 60 120 180 240 Temps (min) Figure 12 : Survie de la souche sauvage et du triple mutant en présence de formes actives de l’oxygène et de l’azote Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des peroxyrédoxines ont été réalisées en milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. La croissance a été arrêtée, les bactéries ont été lavées et reprises dans du tampon phosphate. (A) 10 mM d’H2O2 ont été ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30 minutes. 0, 120 et 240 minutes après ajout de l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement des bactéries. (B) 1 mM de SIN-1 a été ajouté directement dans le tampon phosphate. 0, 120 et 240 minutes après ajout du SIN-1, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement des bactéries. (C) 10 mM d’H2O2 ont été ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30 minutes, puis 1 mM de SIN-1 a également été ajouté dans le tampon phosphate. 0, 60, 120, 180 et 240 minutes après ajout de l’H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués, et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement des bactéries. Résultats Partie 4 Dans le but de savoir si chacune des peroxyrédoxines de S. typhimurium pouvait contribuer individuellement à la protection face au double traitement peroxyde d’hydrogène et peroxynitrite, la survie des mutants ∆ahpCF ∆tsaA, ∆ahpCF ∆tpx et ∆tsaA ∆tpx a été testée dans les mêmes conditions. Les résultats sont présentés sur la figure 13. Le nombre de cfu de chacun des trois doubles mutants reste proche de 1.108 cfu/ml, 240 minutes après l’ajout des deux composés. Les trois mutants ne sont pas affectés par le traitement simultané H2O2/ SIN1. Seule une souche dépourvue de AhpCF, TsaA et Tpx est sensible à un tel traitement. Ainsi, la présence d’une seule peroxyrédoxine est suffisante pour assurer la protection de S. typhimurium. V- Conclusion et discussion Le but de cette étude était d’évaluer l’implication des peroxyrédoxines dans la virulence de S. typhimurium. Pour cela, nous avons construit un mutant dans lequel les gènes ahpCF, tsaA et tpx ont été inactivés et nous l’avons analysé par des tests de virulence. Nous avons observé que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était très affecté dans sa capacité à proliférer dans le macrophage, son indice de prolifération dans des macrophages murins étant proche de celui d’un mutant du système de sécrétion de type 3, contrôle négatif souvent utilisé dans ce genre d’expérience. Ce résultat a suggéré que les peroxyrédoxines étaient importantes pour S. typhimurium en condition d’infection dans le macrophage. Dans le but de comprendre ce phénotype, une question a été posée : le phénotype du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx peut-il être expliqué par sa sensibilité aux FAO et aux FAN produites par le macrophage? Afin de répondre à cette question, nous avons effectué des expériences d’infection dans des macrophages soit incapables de produire des FAO, soit altérés dans leur capacité à produire des FAN. Les résultats de cette étude ont montré que les peroxyrédoxines AhpCF, TsaA et Tpx n’étaient pas requises pour éliminer soit les FAO, soit les FAN produits par le macrophage. Nous avons poursuivi la caractérisation du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en l’exposant directement à des FAO ou FAN en milieu de culture. Nous avons pu ainsi identifier des conditions dans lesquelles la survie du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx était très affectée en comparaison avec la souche sauvage. En effet, le traitement simultané H2O2/SIN-1 a un effet drastique sur la viabilité de la souche. Une explication pourrait provenir du fait que, le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx accumule de l’H2O2, comme l’ont montré les expériences du biosenseur 85 Résultats Partie 4 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 1,00E+05 0 1,00E+04 60 120 1,00E+03 240 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt wt ahpCF- tpx- tsaA- tpx- ahpCF- tsaA- ahpCF- tsaAtpx- Figure 13 : Survie de la souche sauvage et des doubles mutants des péroxyrédoxines en présence de formes actives de l’oxygène et de l’azote Des précultures de la souche sauvage et du triple mutant des péroxyrédoxines ont été réalisées en milieu LB à 37°C. Les précultures ont ensuite été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3. La croissance a été arrêtée, les bactéries ont été lavées et solubilisées dans du tampon phosphate. 10 mM d’H2O2 ont été ajoutés directement dans le tampon phosphate. Le traitement a duré 30 minutes puis 1 mM de SIN-1 a également été ajouté dans le tampon phosphate. 0, 60, 120, 180 et 240 minutes après ajout de l’ H2O2, des aliquots de culture ont été prélevés, dilués, et étalés sur boîte LB pour effectuer un dénombrement des bactéries. Résultats Partie 4 vivant. L’H2O2 appauvrit la bactérie en molécules antioxydantes non enzymatiques telles que le glutathion. Or, ces « éponges » à stress contribuent à l’élimination du peroxynitrite, ainsi en leur absence, les effets du peroxynitrite seraient exacerbés. Ce modèle correspond parfaitement à la double activité d’élimination des peroxyrédoxines face aux FAO et aux FAN. Dans la littérature, il existe de nombreux exemples de microorganismes bactériens pour qui les peroxyrédoxines sont impliquées dans l’élimination des FAO et des FAN (Baek et al., 2009 ; Cosgrove et al., 2007 ; Hu et al., 2009 ; La Carbona et al., 2007). Nos résultats confirment la contribution de ces enzymes du métabolisme au capacité de virulence des pathogènes. Enfin, les peroxyrédoxines illustrent une nouvelle fois l’importance de la stratégie de redondance fonctionnelle mis en place par S. typhimurium pour éliminer les FAO et FAN, puisque la présence d’une seule des trois enzymes est suffisante pour protéger S. typhimurium. 86 Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium Résultats Partie 5 Nom du mutant Génotype msrAB- 12023 msrA::kan msrB::cat Hpx- 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan msrAB- Hpx- 12023 ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF katG::cat katE::kan Tableau 1 : Tableau des souches utilisées dans cette étude Les mutants ont été réalisés par double recombinaison homologue entre des cassettes de résistances au chloramphénicol (cat) et à la kanamycine (kan) et les gènes à inactiver msrA, msrB, katG, katE et ahpCF (Datsenko et al., 2000). Résultats Partie 5 Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr) sont des enzymes impliquées dans la réparation des dommages dûs au stress oxydant. Elles permettent de réduire les méthionines oxydées, libres dans la cellule ou enchâssées dans des protéines. Il existe deux types de Msr, MsrA et MsrB, spécifiques d’un diastéréoisomère de méthionine : MsrA réduit la méthionine-Ssulfoxyde et MsrB la méthionine-R-sulfoxyde. Ces deux enzymes sont présentes dans la quasi-totalité des organismes vivants. L’organisation génétique de msrA et msrB varie selon les organismes. Dans de nombreux cas, msrA et msrB constituent deux unités séparées de transcription. Chez certains microorganismes, ils sont organisés en opéron voire fusionnés au sein d’un même gène. S. typhimurium possède deux gènes codant pour les protéines MsrA et MsrB qui présentent de fortes identités de séquence protéique avec MsrA et MsrB d’Escherichia coli (respectivement 83% et 85%). Aucune étude du rôle des méthionine sulfoxyde réductases n’a été réalisée chez S. typhimurium. Dans le macrophage, S. typhimurium est soumise à la production d’anion superoxyde par la NADPH phagocyte oxydase (Segal et al., 1981; Babior, 1999; Babior et al., 2002). Elle se retrouve ainsi confrontée à une forte production de FAO et doit mettre en place des systèmes de protection contre ce stress. La question de l’implication de MsrA et MsrB dans la pathogénicité de S. typhimurium se pose donc. Nous avons entrepris l’étude de ces enzymes afin d’évaluer leur contribution dans la physiologie de la bactérie ainsi que leur rôle dans la pathogénicité. Au cours de cette étude, le mutant ∆msrA ∆msrB a été construit. Ces deux mutations ont également été introduites dans la souche Hpx- altérée dans sa capacité à éliminer les formes actives de l’oxygène (Voir « Section Résultats, Chapitre : Hpx° et HpxF- de S. typhimurium), afin d’augmenter les dommages du stress oxydant (Seaver et al., 2001). I- Construction de mutants des gènes msrA et msrB de S. typhimurium Le gène msrA a été inactivé dans la souche 12023 (ATCC 14028) de S. typhimurium selon la technique de Wanner et Datsenko (Datsenko et Wanner, 2000). Un lysat a ensuite été obtenu à partir de la souche 12023 msrA::kan à l’aide du phage P22, spécifique de S. typhimurium. Ce lysat a permis de transduire le gène inactivé msrA::kan dans une souche sauvage. Les gènes msrB, ahpCF, katG et katE ont été inactivés et les mutations correspondantes transduites selon les mêmes méthodes. Trois mutants ont été construits, 12023 msrA::kan msrB::cat (msrAB-), 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan (Hpx) et 12023 msrA msrB ahpCF katG::cat 87 Résultats Partie 5 (A) 1 DO 600 nm wt msrAB0,1 HpxmsrAB- Hpx- 0,01 0 100 200 300 400 500 Temps (min) (B) DO 600 nm 10 1 wt msrAB- 0,1 HpxmsrAB- Hpx0,01 0 100 200 300 400 Temps (min) Figure 1 : Croissance en milieu riche et en milieu minimum des quatre souches (A) Des précultures ont été réalisées en LB, à 37°C et en aérobie avec la souche sauvage et les mutants msrAB-, Ηpx- et msrAB- Ηpx-. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,01 en LB et la croissance a été suivie. (B) Des précultures ont été réalisées en milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides à 0,1%, à 37°C et en aérobie avec la souche sauvage, le mutant msrAB- , le mutant Ηpx- et le mutant msrAB- Ηpx-. Le lendemain, ces précultures ont été diluées à DO600 = 0,01 dans le même milieu et la croissance a été suivie. Résultats Partie 5 katE::kan (msrAB- Hpx). Le tableau 1 récapitule le nom et le génotype des mutants utilisés dans cette étude. II- Caractérisation phénotypique des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- HpxDans le but de caractériser l’implication de msrA et msrB dans la physiologie de S. typhimurium, la croissance de la souche sauvage a été comparée à celles du mutant msrAB-, du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx- en milieu LB et en milieu minimum (fig. 1A et 1B). En milieu LB, à 37°C et en aérobie (Fig. 1A), le temps de génération de la souche sauvage et du mutant msrAB- est de 22 minutes, le temps de génération du mutant Hpx- et msrAB- Hpx- est de 25 minutes. En milieu minimum glucose 0,2% et casamino acides 0,1%, le temps de génération des quatre souches est de 37 minutes. En condition de croissance en milieu riche ou en milieu minimum, l’absence de MsrA et MsrB n’affecte donc pas la croissance de S. typhimurium. III- Etude de la sensibilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx- en présence d’H2O2 Dans le but de caractériser l’implication de MsrA et MsrB dans la lutte contre le stress oxydant, nous avons réalisé deux types d’expériences au cours desquelles nous avons analysé le comportement des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx- en présence d’H2O2. Dans un premier temps, nous avons analysé la capacité des souches en former des colonies sur milieu LB en présence de peroxyde d’hydrogène dans la gélose. Pour cela, la souche sauvage, le mutant msrAB-, le mutant Hpx- et le mutant msrAB- Hpx- ont été cultivés en milieu LB, à 37°C et en condition aérobie. A DO600 = 1, des aliquots de cultures bactériennes ont été prélevés et étalés sur boîte LB en présence ou absence d’H2O2 0,2 mM (Fig. 2A). Le nombre de cfu de la souche sauvage et des trois mutants est de 1,5.109cfu/ml sur gélose LB. Sur gélose LB/H2O2 0,2 mM, le nombre de cfu de la souche sauvage, du mutant msrAB- et du mutant Hpx- est le même (1,2.109 cfu/ml). Celui du mutant msrAB- Hpx- est légèrement inférieur (8,5.108 cfu/ml). Ces résultats indiquent que la souche sauvage, le mutant msrAB- et le mutant Hpx- ne sont pas sensibles à 0,2 mM d’H2O2 tandis que le mutant msrAB- Hpx- est légèrement plus sensible. Ainsi, l’absence de msrA et msrB affecte peu la croissance de S. typhimurium en présence d’H2O2 0,2 mM. 88 Résultats Partie 5 LB (A) LB/H2O2 LB / H2O2 0,2 mM 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 cfu/ml 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt msrAB- Hpx- msrAB- Hpx- wt (B) Hpx- msrAB- Hpx- 1,00E+09 WT msrAB- 1,00E+08 Hpx- 1,00E+07 msrAB- Hpx- 1,00E+06 cfu/ml 10 DO 600nm msrAB- 1 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 0,1 0 92 184 276 368 460 1,00E+00 0' Temps (min) 45' 90' Temps après ajout de l’H2O2 (min) Figure 2 : Croissance des quatre souches en présence de peroxyde d’hydrogène (A) Une préculture des 4 souches ,réalisée en LB et en aérobiose, a ensuite été diluée dans les mêmes conditions. A DO600 = 1, des aliquots de culture ont été prélevés puis étalés soit sur boîte LB, soit sur boîte LB contenant 0,2 mM d’H2O2. Les colonies ont été dénombrées. (B) Les souches ont été cultivées en milieu LB jusqu’à DO600 = 0,3, puis 2,5 mM d’H2O2 a été rajouté dans le milieu de croissance. 0, 45 et 90 minutes après stress, des aliquots de culture ont été prélevés puis étalés sur boîte LB. Les colonies ont été dénombrées. La croissance est représentée à gauche et le dénombrement à droite. Résultats Partie 5 Dans un second temps, de l’H2O2 a été ajouté au cours de la croissance des souches. Pour cela, des cultures bactériennes en phase exponentielle de croissance (DO600 = 0,3) ont été exposées à de l’H2O2 en LB à une concentration finale de 2,5 mM (Fig. 2B). Des aliquots de culture ont été prélevés 0, 45 et 90 minutes après ajout d’H2O2, et dénombrés 24h après étalement sur boîte LB. Les résultats montrent que l’ajout d’H2O2 n’affecte pas la croissance de la souche sauvage et du mutant msrAB-. « A l’opposé », la croissance des mutants Hpx- et msrAB- Hpx- est immédiatement arrêtée après ajout d’H2O2. Le dénombrement effectué sur boîte LB montre que le nombre de cfu de la souche sauvage et du mutant msrAB- est le même 0, 45 et 90 minutes après ajout d’H2O2 (2,5.108 cfu/ml). Le nombre de cfu du mutant Hpx- chute d’environ un demi-logarithme (2,5.108 cfu/ml à 1,6.108 cfu/ml, 90 minutes après ajout de l’H2O2) et celui du mutant msrAB- Hpx- d’un logarithme (2,5.108 cfu/ml à 4,5.107 cfu/ml, 90 minutes après ajout de l’H2O2). Ce résultat indique que, dans une souche accumulant du stress endogène, MsrA et MsrB sont requises pour la réparation des protéines endommagées en présence de 2,5 mM d’H2O2. IV- Evaluation du niveau d’oxydation protéique des mutants msrAB-, Hpx- et msrABHpx-au cours de la croissance bactérienne En l’absence de MsrA et MsrB, les méthionines oxydées ne sont plus réparées. La présence de méthionines sulfoxydes, au sein des protéines, entraîne le démasquage d’autres résidus sensibles à l’oxydation. En particulier, si les résidus arginine, lysine, proline et thréonine se retrouvent exposés à des FAO, ils subissent des réactions de carbonylation au niveau de leur chaîne latérale. Ainsi, la présence de groupements carbonyles peut renseigner sur l’état d’oxydation des protéines d’une souche (Maisonneuve et al., 2009). Nous avons donc analysé la présence de groupements carbonyles dans des extraits cellulaires provenant de la souche sauvage, du mutant msrAB-, du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx-. Après dépôt d’un extrait cellulaire sur une membrane, les échantillons ont été dérivatisés au 2,4dinitrophénylhydrazine (DNPH) qui reconnait les groupements carbonyles. Ensuite, la membrane a été incubée en présence d’un anticorps secondaire conjugué avec la « Horseradish » peroxydase. Les bactéries ont été cultivées en LB jusqu’en milieu de phase exponentielle (DO600 = 0,5), puis lysées. Pour chacune des souches, une partie des extraits totaux obtenus a été centrifugée afin d’isoler une fraction soluble dépourvue de fragments membranaires. Cette fraction est appelée extrait cytoplasmique dans le reste du chapitre (Fig. 3A). Dans les extraits cytoplasmiques de la souche sauvage, du mutant msrAB- et du mutant 89 Résultats Partie 5 (A) (B) DO600 = 0,5 Presse de French culture bactérienne Centrifugation Extraits cytoplasmiques (C) Figure 3 : Mesure du taux de carbonylation dans des extraits cellulaires des quatre souches Des précultures des 4 souches ont été réalisées en LB et à 37°C. Les souches ont, ensuite, été cultivées jusqu’à DO600 = 0,5 en milieu LB, à 37°C et en aérobie puis lysées par presse de French. Une centrifugation de 30 minutes à 13000 rpm a été effectuée pour isoler une fraction cytoplasmique (A). La fraction cytoplasmique a ensuite été traitée au DNPH (voir section « matériels et méthodes ») pour être dérivatisée. Les groupements carbonyles ont alors été révélés grâce à un anticorps secondaire conjugué avec la HRP soit par Dot Blot (deux dépôts ont été réalisés) (B) soit par Western Blot (C) Résultats Partie 5 Hpx-, la présence de groupements carbonyles n’a pas été détectée (Fig. 3B). Dans les extraits cytoplasmiques du mutant msrAB- Hpx-, un signal intense a été détecté, indiquant la présence de groupements carbonyles. La présence de groupements carbonyle a également été analysée après migration sur gel SDS-PAGE d’extraits cellulaires de la souche sauvage, du mutant msrAB-, du mutant Hpx- et du mutant msrAB- Hpx-traités comme précédemment (Fig. 3C). La présence de bandes de carbonylation semble plus marquée pour le mutant msrAB- Hpx-. Ce résultat montre que les protéines de ce mutant sont plus exposées à l’oxydation que dans les autres souches. L’ensemble des résultats semble donc indiquer que le mutant msrAB- Hpxaccumule des dommages oxydatifs au cours de la phase exponentielle de croissance. Ainsi, l’absence de MsrA et MsrB entraîne une augmentation du taux de carbonylation des protéines cytoplasmiques dans une souche accumulant du stress endogène (c'est-à-dire, contexte génétique Hpx-). V- Etude de la mobilité des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- HpxUne étude réalisée en 1999, dans l’équipe (Hassouni et al., 1999), a montré que le mutant msrA d’Erwinia chrysanthemi, était moins mobile que la souche parentale sauvage. Dans le but d’étudier l’implication des méthionine sulfoxyde réductases dans la mobilité de S. typhimurium, des expériences de « swimming » ont été réalisées. Le swimming est un mode de déplacement bactérien produit par l’action des flagelles. Ce déplacement est observable lorsqu’on inocule une souche bactérienne à l’intérieur d’une gélose d’agar « molle », c'est-àdire contenant un faible pourcentage en agar (0,2 %). Les bactéries se déplacent en fonction du gradient de nutriment, ce qui a pour conséquence la formation d’un halo bactérien dans la gélose. Les capacités de « swimming » ont été étudiées chez la souche sauvage, le mutant Hpx- et le mutant msrAB- Hpx-. Les expériences ont été réalisées à 37°C et à 30°C pendant 5h (Fig. 4A et 4B). Nous avons observé que la mobilité des trois souches était identique. Nous avons reproduit l’expérience en ajoutant du peroxyde d’hydrogène dans les géloses. (Fig. 4C). Deux concentrations ont été testées, 0,1 mM, et 0,2 mM. En présence de 0,1 mM, d’H2O2, la souche sauvage et le mutant msrAB- se déplacent de la même façon. Le mutant Hpx-, quant à lui, est légèrement affecté dans sa mobilité. Enfin, le mutant msrAB- Hpx- perd environ 15% de sa mobilité en comparaison avec la souche sauvage. En présence de 0,2 mM d’H2O2, la souche sauvage et le mutant msrAB- se déplacent toujours de la même façon. Le mutant Hpxperd 40% de sa mobilité et le mutant msrAB- Hpx- plus de 60% en comparaison avec la 90 Résultats Partie 5 (A) (B) 3 Diamètre de croissance (cm) Diamètre de croissance (cm) 6 5 4 3 2 1 0 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Hpx- wt msrAB- Hpx- wt Hpx- msrAB- Hpx- 3,5 Diamètre de croissance (cm) (C) 3 2,5 WT 2 msrAB msrAmsrB- 1,5 Hpx- katE- katGahpCF1 - HpxmsrAB msrA- msrBahpCF- katEkatG- 0,5 0 0 0,1 mM 0,2 mM Concentration en H2O2 Figure 4 : Mobilité des quatre souches sur gélose nutritive avec ou sans peroxyde d’hydrogène (A) et (B) Une préculture a été inoculée dans une gélose molle (0,2% d’agar). La mobilité a été étudiée par mesure du diamètre d’un halo bactérien après 5 heures à 37°C (A) et à 30°C (B) et en aérobie. (C) Même expérience que (A) mais les inoculi ont été déposés sur des géloses dans lesquelles des concentrations croissantes d’H2O2 ont été rajoutées. Résultats Partie 5 souche sauvage. Ainsi, ce résultat souligne qu’en présence de péroxyde d’hydrogène, l’absence de MsrA et de MsrB altère la capacité de mobilité de S. typhimurium. VI- Etude de la virulence des mutants msrAB-, Hpx- et msrAB- Hpx1- Prolifération des mutants dans des macrophages murins Dans le but d’étudier l’effet de l’absence de MsrA et de MsrB sur la virulence de S. typhimurium, les capacités de prolifération de S. typhimurium dans des macrophages ont été étudiées. Les expériences d’indice de prolifération ont été effectuées dans des macrophages murins issus de lignée cellulaire, les RAW 264.7. Les RAW 264.7 ont été infectés soit par la souche sauvage, soit par l’un des trois mutants pendant 16h à une dose infectieuse d’environ 50 bactéries par cellule. Deux points de dénombrement ont été effectués, 2 heures après infection et 16 heures après infection. L’indice de prolifération a été calculé. Les rapports des indices de prolifération sont représentés. Le rapport des indices de prolifération entre le mutant msrAB- et la souche sauvage obtenu est de 1, indiquant que ces deux souches présentent les mêmes capacités prolifératives dans le macrophage (Fig. 5). Le rapport des indices de prolifération entre le mutant Hpx- et la souche sauvage obtenu est de 1,7. Celui obtenu entre le mutant msrAB- Hpx- et la souche sauvage est de 2,7. Ainsi, de façon surprenante, Hpx- et msrAB- Hpx- prolifèrent plus que la souche sauvage en condition d’infection. Dans le but d’augmenter les effets liés au stress oxydant, nous avons inactivé katN dans la souche msrAB- Hpx-. Le mutant obtenu, msrAB- Hpx° a été analysé pour sa capacité de prolifération dans des macrophages RAW 264.7 (Fig. 6). L’indice de prolifération obtenu pour le mutant msrAB- Hpx° est de 8,5, très proche de celui de la souche sauvage (10). Les conditions testées n’ont pas permis de mettre en évidence un rôle de MsrA et de MsrB dans la capacité proliférative de S. typhimurium dans le macrophage. 2- Survie des mutants dans la souris Afin de poursuivre l’étude de l’implication de MsrA et MsrB dans la virulence de S. typhimurium, des expériences de compétition dans la souris ont été réalisées. Un mélange de deux cultures bactériennes a été injecté aux souris par voie intra-péritonéale dans un ratio 1:1. La souche sauvage et un des trois mutants étudiés ont été inoculés intrapéritonéalement à concentration équivalente (105 bactéries/ml). En parallèle de l’injection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches ont été determinées 91 Résultats Partie 5 Rapport des indices de prolifération 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 msrAB-/wt Hpx-/wt msrAB- Hpx-/wt Figure 5 : Rapport des indices de prolifération dans les macrophages RAW 264.7 Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 ont été infectées par les quatre souches à une dose infectieuse de 50 bactéries par cellule pendant 16 heures. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées au triton à 0,1% et les bactéries intracellulaires ont été récoltées et étalées sur boîte LB. 24h après, les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé (cfu 16h/cfu 2h). Les expériences ont été réalisées en triplicat. Le rapport des indices de prolifération entre la souche sauvage et le mutant msrAB-, la souche sauvage et le mutant Ηpx- et enfin la souche sauvage et le mutant msrAB- Ηpx- sont représentés. Résultats Partie 5 et l’input a été déterminé. Deux jours après infection, les souris ont été sacrifiées, les rates prélevées et les bactéries intracellulaires isolées. Après dénombrement, l’output a été déterminé. Enfin, l’index de compétition a été calculé. Dans chacune des trois expériences testées, les index de compétition obtenus (2,4 pour le mutant msrAB-, 0,6 pour le mutant Hpxet 0,9 pour le mutant msrAB- Hpx-) ont indiqué qu’aucun des mutants n’était altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage lors de l’infection de la souris (Fig. 7). Ainsi, dans les conditions testées, nous n’avons pas pu mettre en évidence de défaut de virulence des mutants. Au contraire, il semblerait que l’absence de msrA et msrB dans le contexte génétique Hpx- confère un avantage à S. typhimurium en condition d’infection. VII- Conclusion et discussion Cette étude avait pour but d’évaluer l’implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la pathogénicité de S. typhimurium. Pour cela, nous avons construit les souches ∆msrA ∆msrB (msrAB-) et ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF ∆katG ∆katE (msrAB Hpx-). Ces souches ont été caractérisées lors de croissance en présence d’H2O2, pour l’état d’oxydation de leur protéines cytoplasmiques, pour leur mobilité et enfin pour leur virulence. Les résultats obtenus ont montré que les caractéristiques phénotypiques du mutant msrAB- étaient proches de celles de la souche sauvage. Les résultats obtenus avec le mutant msrAB- Hpx- ont, par contre, révélé l’implication de MsrA et de MsrB dans la résistance de S. typhimurium face à un stress H2O2, dans la mobilité bactérienne et enfin dans la protection de l’oxydation des protéines cytoplasmiques. Nous avons montré que MsrA et MsrB étaient impliquées dans la mobilité de S. typhimurium dans un environnement oxydant. Il s’agit du deuxième exemple bactérien pour lequel l’absence de MsrA et de MsrB diminue les capacités de mobilité d’une bactérie. Toutefois, ce résultat est préliminaire et nécessite d’autres contrôles, étant donné la sensibilité du mutant msrAB- Hpx- dans les conditions testées. Il sera important de caractériser la protéine oxydée responsable du phénotype de diminution de mobilité afin de conclure sur l’impact de MsrA et de MsrB dans la mobilité. Nous avons observé que le niveau de carbonylation dans des extraits protéiques issus du cytoplasme de S. typhimurium était plus important dans le mutant msrAB- Hpx- que dans la souche sauvage. Ainsi, MsrA et MsrB participent au maintien de l’état d’oxydoréduction cellulaire de S. typhimurium. 92 Résultats Partie 5 (A) 1,00E+07 1,00E+06 cfu/ml 1,00E+05 1,00E+04 2h pi 1,00E+03 16h pi 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 wt (B) msrAB- Hpx° 12 Indice de proliération 10 8 6 4 2 0 wt msrAB- Hpx° Figure 6 : Indice de prolifération de la souche sauvage et du mutant msrAB Hpx° dans des macrophages RAW 264.7 Des lignées cellulaires de macrophages RAW 264.7 ont été infectées à l’aide de cultures de la souche sauvage et du mutant msrAB Hpx° à une dose infectieuse de 50 bactéries pour une cellule pendant 16 heures. 2h et 16h après infection, les cellules infectées ont été lysées au triton à 0,1% et les bactéries intracellulaires ont été prélevées et étalées sur boîte LB. 24h après, les colonies ont été dénombrées et l’indice de prolifération a été déterminé (cfu 16h/cfu 2h). (A) Numération 2 heures et 16 heures après infection (pi) (B) Indice de prolifération Résultats Partie 5 Nous n’avons pas pu mettre en évidence l’implication de MsrA et de MsrB dans l’établissement de la virulence chez S. typhimurium. Au contraire, nous avons observé des phénotypes d’hyperprolifération du mutant msrAB- Hpx- en condition d’infection dans des macrophages murins. Ce résultat suggère que le mutant msrAB- Hpx- est adapté à l’environnement rencontré dans le macrophage. Comment expliquer ce résultat ? Le mutant msrAB- Hpx- est altéré dans sa capacité à éliminer l’H2O2. Or, nous savons qu’en présence de 1 µM d’H2O2 (Seaver et al., 2001), OxyR est activé et déclenche la mise en place des systèmes d’adaptation à l’H2O2. Ainsi, une hypothèse est que le mutant msrAB- Hpx- est préadapté aux conditions rencontrées dans le macrophage, son niveau endogène d’H2O2 « activant « le régulon oxyR de façon constitutive (Ritz et al., 2000). 93 Résultats Partie 5 Souche A wt wt wt Souche B msrABΗpxmsrAB- Ηpx- Index de compétition 2,4 0,58 0,88 Figure 7 : Index de compétition dans la souris. Des souris BALB/c agées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec un mélange bactérien à un ratio 1:1 composé de la souche sauvage et d’un des mutants. En parallèle de l’infection, les concentrations bactériennes de chacune des deux souches inoculées ont été déterminées et l’input a été calculé. 2 jours après, les souris ont été sacrifiées, les rates collectées et les bactéries intracellulaires étalées sur boîte LB et dénombrées, l’output a été calculé. Au final, l’index de compétition a été déterminé (output/input) DISCUSSION ET PERSPECTIVES Discussion Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux mécanismes moléculaires développés par S. typhimurium pour lutter contre le stress oxydant. En condition d’infection, S. typhimurium est phagocytée par les macrophages dans lesquels elle forme une vacuole (la SCV) pour se protéger de l’activité bactéricide du macrophage. Toutefois, elle est exposée au stress oxydant produit par la NADPH phagocyte oxydase. Ce complexe enzymatique est enchâssé dans la membrane de la SCV, et produit de l’anion superoxyde dans la lumière de la vésicule. La question de la gestion du stress oxydant par S. typhimurium en condition d’infection se pose donc. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à trois aspects : - caractériser le stress oxydant perçu par S. typhimurium à l’intérieur de la SCV,. - identifier les enzymes impliquées dans l’élimination des FAO et étudier leur contribution dans le métabolisme et la virulence de la bactérie. - étudier l’implication d’un système de réparation protéique des dommages liés aux FAO, les méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium. I- La réponse oxydante produite par la NADPH phagocyte oxydase au cours de l’infection par S. typhimurium Le phénomène de "burst" oxydatif dans la relation hôte/pathogène est étudié depuis près d’un siècle (Baldridge et Gerard, 1933). Cependant, aucune étude ne renseigne sur la façon dont S. typhimurium perçoit les FAO dans sa vacuole. Par exemple, quelles FAO (O2.-, H2O2…) sont perçues par cette bactérie ? Quelle est la cinétique de production de ces FAO par l’hôte ? En quelle quantité sont-elles présentes ? Afin de proposer des éléments de réponse, nous avons construit un outil génétique constitué du promoteur du gène ahpC fusionné au gène codant pour la GFP. La bactérie transformée par ce plasmide a été nommée biosenseur vivant. A l’aide de cet outil, nous avons observé que dans des macrophages murins RAW 264.7, le biosenseur percevait de l’H2O2 très tôt au cours de l’infection, le pic de production ayant lieu 1h30 après le début de l’infection et le niveau d’H2O2 diminuant progressivement jusqu’à 10 heures après infection. Il serait intéressant d’employer la même stratégie afin de sonder l’environnement de S. typhimurium telle qu’elle le perçoit en condition d’infection afin de savoir si elle est exposée à d’autres types de stress et si elle subit certaines carences. 94 Discussion II- L’arsenal enzymatique impliqué dans l’élimination de l’H2O2 de S.typhimurium Au début de nos travaux, le rôle des catalases et des peroxyrédoxines avait été analysé au cours de deux études. Le mutant ∆katG ∆katE et le mutant ∆ahpC avaient été analysés en condition d’infection et la conclusion fut que ces enzymes ne semblaient pas être impliquées dans la virulence de la bactérie (Buchmeier et al., 1995 ; Taylor et al., 1998). Notre étude a montré que cette conclusion était erronée et incomplète car S. typhimurium possède d’autres enzymes impliquées dans l’élimination de l’H2O2. En effet, nous avons caractérisé le mutant HpxF-, dans lequel KatG, KatE, KatN, AhpCF et TsaA ont été inactivées. Le phénotype résultant est un phénotype de non virulence qui peut être expliqué par une incapacité totale à dégrader l’H2O2. S. typhimurium a donc adopté une stratégie de redondance fonctionnelle pour éliminer l’H2O2 où l’absence des cinq enzymes peut être compensée par l’apport d’une seule enzyme. Ce résultat a été constaté plusieurs fois : - le mutant Hpx° (dans lequel seule la peroxyrédoxine TsaA est présente) est toujours capable d’éliminer des concentrations micromolaires d’H2O2, - le mutant Hpx° ou le mutant HpxF- dans lequel les gènes katG ou tsaA sont sur un plasmide multicopie sont capables de proliférer dans les macrophages. Toutefois, il semble que la contribution physiologique des catalases et des peroxyrédoxines ne soit pas équivalente. KatG et KatE protègent la bactérie en présence de fortes concentrations en H2O2 (jusqu’à 10 mM) alors que le rôle de protection par les peroxyrédoxines AhpCF et TsaA n’a pas pu être mis en évidence dans ces conditions. Le rôle physiologique des catalases et des peroxyrédoxines avait déjà été constatée pour E. coli, chez qui AhpC élimine des concentrations micromolaires d’H2O2 alors que les catalases éliminent de plus fortes concentrations (Seaver et al., 2001). Dans nos expériences, nous avons vu qu’un biosenseur vivant de l’H2O2 émet de la fluorescence dans un mutant ∆ahpCF ∆tsaA. Ce résultat indique que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA accumule de l’H2O2 dans son cytoplasme. La conséquence est l’activation du régulateur transcriptionnel OxyR et ainsi la transcription d’ahpC-gfp. Un tel résultat n’avait pas été observé pour le mutant ∆katG ∆katE ∆katN. Ainsi, chez S. typhimurium, il semblerait que les peroxyrédoxines éliminent également les concentrations micromolaires d’H2O2. D’après les résultats du biosenseur vivant, dans des macrophages, S. typhimurium perçoit différentes concentration en H2O2 : elle perçoit de l’H2O2 dès le début de l’infection, puis la 95 Discussion concentration semble diminuer au cours de l’infection. Ainsi, dans ce cas de figure, la différence de contribution entre catalase et peroxyrédoxine peut être utile : les catalases détoxifieraient l’H2O2 produit au début de l’infection et les peroxyrédoxine l’H2O2 produit en fin d’infection. III- Implication des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium La contribution des peroxyrédoxines à la virulence a été mise en évidence dans plusieurs types bactériens (Baek et al., 2009 ; Cosgrove et al., 2007 ; Hu et al., 2009 ; La Carbona et al., 2007). De plus, chez M. tuberculosis, le mutant ∆tpx, très affecté dans des macrophages sauvages, prolifère normalement dans des macrophages dépourvus de NO. synthase inductible (Hu et al., 2001). Enfin, il a été montré in vitro, que AhpC et TsaA de S. typhimurium possèdent une activité péroxynitrite réductase (Bryk et al., 2000). Au cours de notre étude, nous avons montré qu’un mutant dépourvu des gènes ahpCF, tsaA et tpx était très affecté dans sa capacité à proliférer dans les macrophages murins. Les peroxyrédoxines étant biochimiquement capables d’éliminer les FAO et FAN, nous avons fait l’hypothèse que la bactérie était exposée à ces deux espèces en condition d’infection. Ainsi, nous avons exposé le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx à un traitement successif H2O2/ONOO- et dans ces conditions, la viabilité de ce mutant est très affectée. Le peroxynitrite est éliminé notamment par les composés thiolés présents dans le cytoplasme bactérien tels que le glutathion. Or, l’H2O2 est capable d’oxyder le glutathion, ce qui permet au pool intracellulaire de peroxynitrite de rester stable. Ainsi, une possibilité pour expliquer le défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx en condition d’infection est que les peroxyrédoxines sont impliquées dans la détoxication de l’H2O2 et également du peroxynitrite. Leur absence résulterait en l’oxydation ou la nitration des cibles du peroxynitrite (Voir Introduction chapitre « Stress oxydant ») et entraînerait la mort de la bactérie. Toutefois, les résultats obtenus lors d’infections dans des macrophages dépourvus de NADPH phagocyte oxydase ou altérés dans la capacité à produire des FAN indiquent que l’hypothèse du peroxynitrite doit être considérée prudemment. En effet, dans ces expériences, la contribution individuelle des deux enzymes eucaryotes a été testée et conclue pour être faible. Le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx est toujours affecté dans son développement en l’absence de NADPH phagocyte oxydase et de la NO. synthase inductible, donc de peroxynitrite. 96 Discussion Toutefois, il existe dans le macrophage d’autres enzymes produisant de l’anion superoxyde : la myeloperoxydase ainsi que la xanthine oxydase. De plus, dans les expériences de prolifération dans des macrophages altérés dans leur capacité à produire des FAN, la synthèse de NO. se poursuit faiblement. Ainsi, à ce jour, on ne peut conclure de façon définitive sur la raison du défaut de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx dans des macrophages murins. Deux expériences pourraient permettre d’évaluer l’impact du peroxynitrite en tant qu’espèce responsable de la diminution de la prolifération intracellulaire du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx : - l’infection des macrophages dépourvus de NADPH phagocyte oxydase et de NO. synthase inductible (donc incapables de produire de l’H2O2 et de l’ONOO-), où l’indice de prolifération du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx devrait être le même que celui de la souche sauvage, - l’analyse du contenu cytoplasmique de S. typhimurium en 3-nitro-tyrosines après passage dans des macrophages sauvages. Les résidus 3-nitro-tyrosines constituent un indicateur de la présence de peroxynitrite et sont détectables par immunodétection. IV- Le macrophage murin est il un « bon » modèle cellulaire permettant l’étude de la virulence de S. typhimurium ? Au cours de ce travail, la virulence de S. typhimurium a été évaluée selon deux indicateurs : la prolifération dans des macrophages et l’infection de souris. Nous avons observé que les résultats obtenus n’étaient pas toujours superposables. Par exemple, lorsque la souche sauvage et le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx ont été inoculés dans la souris, l’index de compétition obtenu a été de 0,5. Ce résultat indique que le mutant est faiblement altéré dans sa capacité à entrer en compétition avec la souche sauvage. Or dans les macrophages, nous avons observé que le mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx n’est plus capable de proliférer. Alors comment expliquer qu’un défaut de prolifération aussi marqué dans les macrophages ne se traduise pas par un défaut de survie plus grand dans la souris ? Lors des expériences de compétition dans la souris, nous calculons la prolifération intracellulaire de la bactérie à partir de cellules de rate qui est constituée de plusieurs types cellulaires. De plus, il n’existe aucune étude montrant qu’au cours de l’infection systémique, dans les organes lymphoïdes secondaires, S. typhimurium se niche exclusivement dans le macrophage. Au contraire, une étude réalisée en 97 Discussion 2007 a montré que dans la rate, S. typhimurium s’établit dans les lymphocytes B et T, les monocytes, les cellules dendritiques et les macrophages et semblait préférentiellement cibler les neutrophiles (Geddes et al., 2007). Ce résultat pose ainsi la question du modèle cellulaire adéquat permettant l’étude des capacités de virulence de S. typhimurium. De plus, la coinoculation des bactéries au moment de l’infection dans la souris peut entraîner un biais dans les résultats. En effet, on peut imaginer que la bactérie sauvage protège le mutant en détoxifiant l’environnement. Afin de tester cette hypothèse, il serait intéressant d’effectuer des expériences de dose létale 50. Ces expériences qui consistent à estimer le pouvoir de virulence d’une souche permettrait de répondre à nos interrogations puisque nous testerions directement les capacités de virulence du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx. V- Implication des méthionine sulfoxyde réductases dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium L’importance des méthionine sulfoxyde réductases dans la pathogénicité bactérienne a été illustrée chez plusieurs microorganismes (Hassouni et al., 1999 ; Dhandayutapani et al., 2001 ; Wizemann et al., 1996). Concernant S. typhimurium, une étude transcriptomique comparant le profil d’ARNm isolés de bactéries intracellulaires et de bactéries en milieu de culture a révélé que la transcription de msrA était activée après 4h et 12h d’infection d’un facteur 5 et 6 respectivement dans des macrophages murins (Eriksson et al., 2003). De façon surprenante, nous avons observé qu’en condition d’infection dans les macrophages, le mutant msrAB- avait le même indice de prolifération que la souche sauvage. Ainsi, l’absence de MsrA et MsrB n’altère pas la virulence de S. typhimurium. Par contre, dans le contexte génétique Hpx-, le mutant msrAB- semble mieux adapté à l’environnement rencontré dans le macrophage que la souche sauvage puisque son indice de prolifération est supérieur à celui de la souche sauvage. Une hypothèse est que le mutant msrAB- Hpx- n’élimine pas le stress endogène produit par la chaîne respiratoire et pourrait donc avoir un niveau d’expression de base du régulon oxyR élevé. Ceci permettrait la mise en place des systèmes de défense antioxydants. Ainsi, cette souche serait présensibilisée à l’H2O2 et prolifèrerait mieux que la souche sauvage. Au cours de cette étude, nous avons également constaté que le mutant msrAB- Hpx- présentait un défaut de mobilité. Dans ce contexte, il est néanmoins curieux que les effets des mutations de msrA et de msrB sur la mobilité ne se reflètent pas dans la virulence étant donné le rôle 98 H2O2 Cytosol eucaryote O2.O2 O2.- O2.- O2.- H2O2 SodCI H2O2 H 2O 2 H2O2 AhpCF, TsaA, Tpx ONOO- + Cys SH SH NO2- +Cys S H2O2 S H2O H2O ONOO- KatG, KatE, KatN, AhpCF , TsaA H2O2 SodA, SodB O2.- ONOO- S. typhimurium O2 SodCII O2 O2.- H2O2 Salmonella Containing vacuole O2.- NO. H2O2 Légende iNOs Canal spécifique des solutés anioniques Arginine NO. Chaine respiratoire aérobie NADPH phagocyte oxydase Figure 1 : Perception et prise en charge des FAO par S. typhimurium dans le macrophage S. typhimurium perçoit des FAO et des FAN en condition d’infection dans le macrophage. Les catalases et les peroxyrédoxines participent à leur élimination (voir texte). Les enzymes figurées en orange appartiennent au métabolisme de S. typhimurium, les enzymes figurées en vert sont des facteurs de virulence. Dans le cas de l’élimination du peroxynitrite, les cystéines catalytiques d’AhpCF et de TsaA participent à sa réduction. Discussion bien établi de la mobilité dans la virulence bactérienne. Il est donc, à nouveau, légitime de se poser la question du macrophage comme modèle cellulaire. Une étude réalisée en 2009 a montré que lorsque E. coli ou S. aureus étaient internalisées pendant 1 heure dans des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN), seuls 15% de la population bactérienne avait survécu et 50 % de leur contenu en résidus méthionine étaient oxydés (Rosen et al., 2009). L’activité bactéricide des neutrophiles est améliorée en l’absence de MsrA et MsrB. Ces résultats suggèrent qu’il existe une relation entre l’environnement oxydant des cellules hôtes et l’implication de MsrA et MsrB pour la survie d’E. coli en condition d’infection. Ainsi, il serait intéressant de tester le mutant msrAB- de S. typhimurium en condition d’infection dans des neutrophiles. VI- Modèle proposé pour la perception et l’élimination des FAO et FAN produites dans le macrophage L’ensemble de nos résultats ainsi que des informations disponibles dans la littérature nous conduisent à proposer le modèle suivant pour la perception et la prise en charge des FAO et des FAN par S. typhimurium dans le macrophage (Fig. 1) : l’anion superoxyde produit par la NADPH phagocyte oxydase peut être dismuté spontanément en H2O2 dans la lumière du SCV ou peut pénétrer directement dans le périplasme bactérien par des canaux spécifiques des solutés anioniques. L’H2O2 est alors capable de traverser librement les barrières membranaires en empruntant les aquaporines pour atteindre le cytoplasme bactérien. L’anion superoxyde situé dans le périplasme est dismuté en H2O2 par SodCI puis traverse la membrane cytoplasmique afin d’atteindre le cytoplasme. Dans le cytoplasme, KatG, KatE, KatN, AhpCF et TsaA transforment l’H2O2 en H2O. En parallèle, la NO. synthase inductible produit du NO. dans le cytosol du macrophage. Ce composé diffuse librement à travers les membranes. Dans la lumière de la SCV, il peut interagir avec l’O2.- pour former du peroxynitrite. Le peroxynitrite formé diffuse sous forme HOONO à l’intérieur du cytoplasme de S. typhimurium. AhpCF, TsaA et Tpx transforme le peroxynitrite en nitrite et en H2O. Enfin, la chaîne respiratoire aérobie produit de l’anion superoxyde qui est dismuté par SodA et SodB dans le cytoplasme et SodCII dans le périplasme. Notre modèle donne une plus large place aux défenses cytoplasmiques dans la protection des stress produits par l’hôte. Ainsi, outre les facteurs de virulence spécifiques, les enzymes 99 Discussion métaboliques de S. typhimurium garantissent également le succès de l’infection. Cette étude a ainsi démontré que la frontière entre métabolisme et virulence pouvait être mince. 100 Matériels et Méthodes Techniques de microbiologie cellulaire 1- Milieux et réactifs Les macrophages RAW 264.7 ont été cultivés en milieu Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FCS) (HyClone). Les macrophages dérivés de moelle osseuse ont été isolés à partir du fémur de souris C57BL/6 de 8 à 10 semaines et différenciés selon la méthode de De Chastellier et al (1993) ou de souris C57BL/6 dépourvues de NADPH phagocyte oxydase. 2- Infection de macrophages La capacité de prolifération des souches testées a été testée en triplicat au sein de la même expérience (3 puits ont été infectés avec la même souche bactérienne). Deux temps ont été testés, 2h et 16 h après le début de l’infection. Pour cela, 24 heures avant le début de l’infection, une suspension de macrophages à 250000 cellules/ml est réalisée en milieu de culture cellulaire (DMEMc). 2 ml par puits ont été distribués dans les 24 puits. Les plaques sont incubées à 37°C, en présence de 5% de CO2. En parallèle, des cultures bactériennes à tester ont été réalisées. Pour cela, une colonie de chacune des souches a été ensemencée dans 5 ml de milieu LB. La préculture a ensuite été placée à 4°C pendant 6 à 8 heures. Trente minutes avant le début de l’infection, 30 µl de la souche bactérienne ont été opsonisés en présence de 300 µl d’un mélange de DMEMc et de sérum de souris à 10 % (Perbio). Les mélanges ont été placés à 4°C. Après les 30 minutes d’incubation, le mélange bactérien/DMEMc/sérum de souris a été ajouté à 12 ml de DMEMc et réparti à raison de 2 ml/ puit dans les plaques 6 puits préparées la veille. Chacune des souches a été répartie dans 6 puits. Les plaques ont été centrifugées à 400 g pendant 5 minutes, puis elles ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C et à 5% CO2. Après les 30 minutes d’incubation, les puits ont été lavées 3 fois avec un tampon phosphate (PBS) puis le milieu DMEMc comprenant 100 mg/ml de gentamycine pour tuer les bactéries extracellulaires a été rajouté. L’infection s’est poursuivie pendant 2 h, les puits ont, à nouveau, été lavés 2 fois avec du PBS. Pour l’une des deux plaques, nous avons rajouté du DMEMc comprenant 10 mg/ml. Cette plaque a ensuite été incubée pendant 16 heures à 37°C et à 5% CO2. La plaque restante a été traitée comme suit : dans chacun des 6 puits, 500 µl de DMEMc/Triton 0,1 % ont été rajoutés. Les 500 µl ont été collectés dans des tubes Eppendorf, 101 puis les puits ont été nettoyés avec 500 µl de DMEMc/Triton 0,1 % qui ont également été collectés. Au final, 1 ml de suspension cellulaire a été obtenu pour chacun des 6 puits. Cette suspension a été diluée de façon appropriée en milieu PBS. 20 µl de chacune des dilutions a été déposé trois fois soit sur boite LB, soit sur boite LB additionnée de catalase à 2000 U/ml. Les boites ont ensuite été incubées à 37 °C. La deuxième plaque est traitée de la même façon, 16 heures après infection. Au final, les dénombrements 2 heures ou 16 heures après infection ont été obtenus. Ils permettent de calculer l’indice de prolifération qui est défini comme étant le rapport entre le dénombrement à 16 heures et le dénombrement à 2 heures après infection. Les variantes 1- L’utilisation de l’interféron gamma (IFN γ) De l’IFNγ à une concentration finale de 10 U/ml (ImmunoTools) finale a été parfois rajouté directement dans la suspension de macrophages. 2- L’utilisation de PMA Dans certaines expériences, du phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma Aldrich) été rajouté dans les macrophages afin de stimuler l’activité de la NADPH phagocyte oxydase. Pour cela, 30 minutes avant le début de l’infection, 0,2 µM final de PMA ont été rajoutés dans les puits contenant les cellules. Le PMA est présent durant les 16 heures d’infection. 3- L’utilisation du DPI Le protocole utilisé pour le DPI est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009. 4- L’utilisation du 1400W Dans certaines expériences, du 1400W a été rajouté dans les macrophages afin d’inhiber la NO synthase inductible. Pour cela, 2 heures avant le début de l’infection, 2 µM de 1400W ont été rajoutés dans les puits contenant les cellules. Ils sont présents durant les 16 heures d’infection 3- Dosage des nitrites 102 Le dosage de nitrites a étét effectué avec le réactif de Griess. Des aliquots de culture d’1 ml ont été prélevés à partir de macrophages infectés comme précédemment expliqués, 2 heures et 16 heures après infection. En parallèle, le réactif de Griess a été préparé. Il est composé de la solution S (1% de sulfanilamide, 30% acide acétique et eau milliQ qsp 100 ml) et de la solution N (0,1% de 1-naphtylethyl-enediamide, 60 % d’acide acétique et eau milliQ qsp 100 ml). 200 µl d’aliquot de culture ont été ajouté à 400 µl de solution S et 400 µl de solution N. La présence de nitrite se caractérise par l’apparition d’une coloration rose dosable au spectrophotomètre à 543 nm. Pour déterminer les concentrations en nitrites présents dans les surnageants de culture, une gamme étalon a été réalisée à partir de nitrite de sodium (0 à 150 µM). 4- Infection de souris Des souris BALB/c âgées de 6 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 2,5.105 ml d’un mélange bactérien (la souche sauvage et un mutant portant une cassette de résistance à un antibiotique). La concentration bactérienne de chacune des deux souches a été contrôlée par dénombrement soit sur boite LB, soit sur boite LB et antibiotique. Les boites LB permettent de dénombrer la population totale, les boites avec antibiotiques, le nombre de cfu du mutant. L’input a été calculé, il est défini comme le rapport entre le dénombrement du mutant et le dénombrement de la souche sauvage avant infection. Les souris ont été euthanasiées 48 heures après infection par dislocation des vertèbres. La rate a été prélevée, placée dans 2 ml d’eau stérile et homogénéisée mécaniquement. La suspension cellulaire a été ensuite placée dans de la glace pendant 5 minutes pour permettre aux débris de tissus de sédimenter. Un aliquot de suspension a ensuite été prélevé, dilué de façon approprié et étalé soit sur boite LB, soit sur boite LB avec antibiotique. L’output a été calculé, il est défini comme le rapport entre le dénombrement du mutant et le dénombrement de la souche sauvage, 48 heures après infection. Au final, l’index de compétition a été déterminé, il est défini comme étant le rapport entre l’output et l’input. 5- Extraction d’ARN à partir de bactéries intracellulaires Le protocole utilisé pour l’étape d’extraction d’ARN à partir de bactéries intracellulaires est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009. . 103 Techniques de microbiologie moléculaire 1- Milieux de culture Le milieu de culture LB (Luria Bertoni) a été préparé selon la méthode décrite par Miller (Miller, 1972). Il contient 10 g/L de bactotryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 5 g/L de NaCl. Le pH final du milieu est de 7,4. Le milieu gélosé correspondant contient 15 g d’agar par litre de milieu. Le milieu M9 est composé de 6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl et de 1g/L de NH4Cl. Ce milieu de base est complété extemporanément par 1mM final de MgSO4, 0,2 mM final de CaCl2, 50 µg/ml de vitamine B1 et d’une source de carbone (0,2 % pour le glycérol et le glucose et 0,05% pour l’acide pétrosélinique et l’acide oléique). Des casamino acides sont rajoutés si nécessaire (0,1%). Le milieu LPM est composé de 5 mM final de KCl, 7.5 mM final de (NH4)2SO4, 0.5 mM final de K2SO4, 38 mM final de glycérol (0.3% v/v), 0.1% final de casamino acides, 8 µM MgCl2, 337 µM de PO43- et 80 mM de MES. Le pH final du milieu est de 5,8. Le milieu de transduction du phage P22 est composé d’un volume de LB, 1 volume de E Salts et 0,2 % final de glucose. Le E Salts est composé de 50 g/l d’acide citrique, 5 g/l de MgSO4, 250 g/L K2HPO4, 90 g/L NaNH4HPO4. Les boites LB agar avec indicateur de pH sont composées de 25 ml de base LB-agar précédemment décrite, de 250 µl de stock colorant et de 1,05 ml de glucose 20%. Le stock colorant est composé de 6,5 mg/ml d’Aniline Blue, 62,2 mg/ml d’Alizarin Yellow, et d’eau (qsp 200ml). Les antibiotiques sont rajoutés aux concentrations finales suivantes : ampicilline 50 µg/ml, kanamycine 25 µg/ml, chloramphénicol 25 µg/ml, tétracycline 25 µg/ml. L’arabinose 0,2% est ajouté pour induire l’expression du gène codant pour la recombinase sur le plasmide pKD46. 2- Conditions de conservation des souches Les souches bactériennes sont conservées dans leur milieu de culture additionné de glycérol 20% final à -80°C. 3- Méthodes de transfert d’information génétique a. Transformation d’E. coli 104 i. Electroperméabilisation Des bactéries de la souche DH5α ont été cultivées en milieu LB. En milieu de phase exponentielle (DO600 = 0,4-0,6), les bactéries ont été centrifugées. Les culots sont lavés 3 fois avec de l’eau à 4°C puis concentrés 100 fois. 50 µl de cellules compétentes et 100 ng d’ADN sont mélangés. Le transfert se fait par électroperméabilisation selon la méthode décrite par Sambrook (Sambrook et al., 1989 issu de « Molecular Cloning : a laboratory manual. Cold Sping Harbor) à 400 Ω et 25 V, immédiatement suivi de l’ajout de 1 ml de LB. Les bactéries sont incubées pendant 1 h à 37°C pour l’étape d’expression, avant d’être étalées sur milieu gélosé sélectif. ii. Perméabilisation au chlorure de calcium Des bactéries de la souche DH5α ont été cultivées en milieu LB. En milieu de phase exponentielle (DO600 = 0,4-0,6), les bactéries ont été incubées à 4°C pendant 2 minutes. Ensuite, les bactéries ont été centrifugées. Les culots ont été lavés deux fois dans une solution de CaCl2 50 mM. Une dernière centrifugation est effectuée, le culot bactérien est alors solubilisé dans une solution de CaCl2 50 mM et de glycérol 15%. Les bactéries ainsi traitées sont appelées bactéries compétentes. 1 µl de plasmide a été mélangé à 50 µl de bactéries compétentes. Le mélange a été placé 30 minutes à 4°C, puis 45 secondes à 42°C et enfin 2 minutes à 4°C. Puis, 0,5 ml de LB ont été ajoutés et les bactéries ont été incubées 1 h à 37°C pour l’étape d’expression, avant d’être étalées sur milieu gélosé sélectif. b. Transformation chez S. typhimurium Le protocole d’électroperméabilisation précédemment décrit pour E. coli a été reproduit chez S. typhimurium. c. Transduction de S. typhimurium i. Préparation du lysat 100 µl d’une préculture ont été mélangés dans 1 ml de milieu de transduction et 20 µl de phage P22 à 5.1011 pfu/ml (unités formant des plages de lyse). Le mélange a été incubé sur la nuit à 37°C. 20 µl de chloroforme ont été ensuite ajoutés, le mélange a été centrifugé à 13000 rotations par minute, le surnageant a été prélevé et 20 µl de chloroforme ont été encore ajouté. 105 ii. Transduction Des bactéries ont été cultivées en milieu LB. A DO600 = 0,3, 500µl de culture bactérienne ont été mélangés à 100 µl de lysat (titre : 109 à 1011 plages formant des unités) pendant 30 minutes à 37°C. Le mélange a été étalé sur boite LB-EGTA (10 mM) additionné de l’antibiotique correspondant. Les clones obtenus ont été purifiés 2 fois sur LB-EGTA. La présence de phages persistants a été testée sur boite avec indicateur de pH. 106 Techniques de biologie moléculaire 1- Réaction de polymérisation en chaine (PCR) La matrice d’ADN (0,1 µg-0,75µg), les 4 dNTPs (200 µM final), un couple d’amorce oligonucléotidiques (500 nM final), l’enzyme (DyNAzyme EXT DNA polymerase de Finnzymes), son tampon contenant des ions MgCl2 sont mélangés dan un volume final de 50 µl. L’ADN est, dans un premier temps, dénaturé à 94°C pendant 2’30’’. L’amplification est réalisée par une succession de trente cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 1’, puis une étape d’hybridation à 55°C pendant 1’, puis une étape d’élongation à 72°C pendant 1’/kb. Enfin, la PCR se termine par 10’ d’élongation à 72°C. L’ADN ainsi amplifié est purifié par fixation spécifique à une résine puis élution à l’aide du kit « QIAquick PCR putification » (QIAGEN) ou après migration sur gel d’agarose, à l’aide du kit « QIAquick Gel extraction » (QIAGEN). 2- Coupure, ligature Les enzymes de restriction et la T4 DNA ligase utilisées proviennent principalement de la société Biolabs. 3- Construction des plasmides La construction des plasmides pACYC katG et pACYC tsaA est détaillée dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009. 4- Construction des plasmides PahpC-GFP et PytfE-GFP Le promoteur du gène ahpC a été amplifié par PCR partir de l’ADN chromosomique de la souche 12023 et avec les oligonucléotides ahpC5’ et ahpC3’, qui s’hybrident respectivement sur la région débutant au niveau de la 300ème paire de base en amont de l’ATG et au niveau de la 3ème paire de base en amont de l’ATG. Les oligonucléotides ahpC5’ et ahpC3’ possèdent, au niveau de leur extrémité 5’ des sites de restriction reconnues par les enzymes XbaI et NdeI respectivement. Ces sites de restriction permettent le clonage du promoteur ahpC sur le plasmide pFPV25 en amont du gène codant pour la GFP mut3a et dans le cadre de lecture de celui-ci afin d’obtenir une fusion transcriptionnelle. Pour cela, le fragment PCR est digéré par XbaI et NdeI ainsi que le plasmide pFPV25. Le fragment digéré et le plasmide linéarisé sont ensuite purifiés sur gel d’agarose. L’étape de ligation entre le vecteur et l’insert se fait 107 pendant 16 heures à 15°C. Puis, on introduit le produit de ligation dans des DH5α compétentes au CaCl2. Les bactéries ainsi transformées sont étalées sur boite contenant une résistance à la pénicilline afin de sélectionner les bactéries portant le plasmide pFPV25. Le plasmide transformant sont extraits. 5- Extraction d’ARN Le protocole d’extraction d’ARN est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009. 6- PCR quantitative en temps réel Le protocole de PCR quantitative en temps réel est détaillé dans la partie « matériel et méthode » de l’article Hébrard et al., 2009. 108 Tests phénotypiques 1- Croissance en milieu LB et milieu minimum Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit soit en milieu LB, soit en milieu minimum. Le lendemain, les cultures bactériennes sont diluées entre DO600 = 0,05 ou DO600 = 0,1. La croissance est suivie par spectrophotométrie à 600 nm au cours du temps. Le milieu minimum de base est dépourvu de casamino acides. La présence de casamino acides et de la source de carbone est précisé en fonction des expériences. 2- Stress H2O2 sur boite LB Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. Les croissances sont arrêtées soit à DO600 = 0,2, soit à DO600 = 1. Des aliquots de cultures bactériennes sont dilués en milieu PBS puis étalées sur boite LB contenant 0,2 ou 0,3 mM d’H2O2. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé. 3- Croissance en présence d’H2O2 Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, de l’H2O2 est ajoutée, soit à 2,5 mM, soit à 1 mM final. La croissance est suivie par spectrophotométrie à 600 nm au cours du temps et des aliquots de cultures bactériennes sont prélevés à différents temps, dilués de façon appropriée en milieu PBS puis étalés sur boite LB. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé. Dans certaines expériences, 1 mM de paraquat ou 50 µM d’hydroperoxyde de cumène ou 50 µM de Noc5/Noc7sont ajoutés à la place de l’H2O2. 4- Survie en présence d’H2O2 Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis repris dans du tampon PBS. Les bactéries sont prétraitées pendant 30 minutes avec 10 mM d’H2O2. Puis 0, 120 et 240 minutes après le prétraitement, les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis 109 étalés sur boite LB. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé. 5- Survie en présence de SIN-1 Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis repris dans du tampon PBS. 1 mM de SIN1 est ajouté à la culture bactérienne. Puis 0, 120 et 240 minutes après le prétraitement, les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis étalés sur boite LB. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé. 6- Survie en présence d’H2O2 et de SIN-1 Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, les cultures sont diluées en milieu LB à DO600 = 0,1. En milieu de phase exponentielle, la croissance est arrêtée, 1 ml de culture bactérienne est centrifugée 5’ à 5000 rpm puis solubilisé dans du tampon PBS. Les bactéries sont prétraitées pendant 30 minutes avec 10 mM d’H2O2, puis 1 mM de SIN1 est ajouté à la culture bactérienne. 0, 120 et 240 minutes après le prétraitement, les bactéries sont diluées de façon appropriée en PBS puis étalés sur boite LB. Les boites sont incubées à 37°C sur la nuit. Le lendemain, le nombre de cfu est déterminé. 7- Expérience de mobilité bactérienne Les boites de « swimming » sont constituées d’agar « mou » (0,3% final) préparé dans du milieu LB. Les boites sont inoculées par pénétration de 2µl d’une préculture bactérienne au centre de la gélose à l’aide d’un cône. Les boites sont incubées soit à 30°C, soit à 37°C pendant 5 heures en aérobiose. 110 Expériences avec les sondes PahpC-GFP et PytfE-GFP 1- Croissance en milieu minimum et activation par l’H2O2 Les souches portant le plasmide sont cultivées en milieu minimum, casamino acides 0,1% et glycérol 0,2% jusqu’à DO600 = 0,4. Ensuite, différentes concentrations en H2O2 sont ajoutés dans le milieu minimum : 0, 2, 4, 6, 8 et 10 µM. La croissance est suivie à DO 600 nm et la fluorescence à 530 nm (longueur d’excitation 485 nm) pendant 180 minutes. L’autofluorescence générée par la souche sauvage a été soustraite à la fluorescence mesurée De même, la fluorescence a été divisée par la DO 600 nm pour obtenir une valeur de GFP par bactérie. Dans l’expérience d’ajout consécutif d’H2O2, la souche sauvage portant le plasmide est cultivée de la même façon. Puis, de l’H2O2 est ajouté dans le milieu de culture à différentes concentrations (2, 4, 6 et 8 µM d’H2O2) toutes les 20 minutes. La fluorescence est suivie pendant 180 minutes à 530 nm. 2- Suivie de la fluorescence dans les bactéries intracellulaires Des bactéries opsonisées, portant le biosenseur PahpC-GFP ou PytfE-GFP, sont phagocytées dans des macrophages RAW 264.7 ou dans des macrophages dérivés de moelle osseuse fraichement différenciés. A différents temps après infection, les macrophages sont lysés et les bactéries intracellulaires sont isolées puis resuspendues en PBS/10 mM NH4Cl. Les bactéries sont ensuite marquées avec des anticorps anti-LPS de Salmonella. L’intensité de fluorescence relative est déterminée par FACS. 111 Techniques de biochimie 1- Dérivatisation des groupements carbonyles a. Préparation des extraits protéiques Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, la préculture est diluée à DO600 = 0,1 dans 50 ml de LB. A DO600 = 0,5, la culture bactérienne est centrifugée à 5500 rpm pendant 10 minutes. Le culot est repris dans 2 ml de PBS. Les bactéries sont lysées par plusieurs passages à la presse de French. L’extrait cellulaire est traité à la DNase SI puis une partie est centrifugée à 13000 rpm pendant 30 minutes. Le surnageant est récolté (S1). b. Dosage des échantillons cellulaires Seules les protéines du surnageant S1 sont dosées. Le dosage est réalisé à l’aide d’un kit « BCA Protein Assay Kit ». Il s’agit d’une détection colorimétrique basée sur la reconnaissance de certains acides aminés par l’acide bicinchoninique. En présence de protéines, la solution vire du vert au pourpre. Le dosage est effectué à une DO de 562 nm. c. Dérivatisation des groupements carbonyles. La dérivatisation des groupements carbonyles est effectuée à l’aide du kit de détection « OxyBlot protein oxidation » ( Chemicon International). Les échantillons sont dilués pour obtenir 1,25 µg de protéine dans 5 µl. Ils sont dénaturés par ajout de 5µl de SDS à 12% puis dérivatisés par ajout de 10 µl de DNPH 1X. Ils sont ensuite incubés à 25°C pendant 15 minutes. Enfin, 7,5 µl de solution de neutralisation est ajouté au mélange protéique. 2- Dot blot a. Transfert des protéines sur membrane Des membranes PVDF sont pré-humectées avec de l’éthanol ou tout solvant polaire. Elles sont ensuite rincées dans de l’eau et enfin dans un tampon Tris 25 mM, Glycine 192 mM et éthanol 20%. Les échantillons sont déposés sur une membrane PVDF par aspiration sous vide. Après le transfert, la membrane est saturée avec un tampon Tris-glycine-ethanol/ régilait 5%. b. Immunodétection 112 La membrane est incubée avec l’anticorps primaire dilué au 1/100ème dans du tampon TrisGlycine/ régilait 5% 1 heure à 25°C et sous agitation. Les membranes sont ensuite rincées 2 fois avec du tampon Tris-Glycine-éthanol, puis lavées pendant 15’ avec du tampon TrisGlycine-éthanol. Puis, l’anticorps secondaire dilué au 300ème est ajouté. Il reconnait l’anticorps primaire et est conjugué avec la « Horseradish Peroxydase ». L’incubation dure 1 heure à 25 °C sous agitation, puis la membrane est rincée avec du tampon Tris-Glycine. L’immunodétection est réalisée à l’aide du kit « ECL » (Amersham) qui consiste à une réaction de chimioluminescence en présence de la « Horseradish péroxydase ». 3- Immunodétection des groupements carbonyles après migration sur gel SDS-PAGE. a. Migration des échantillons protéiques sur gel SDS-PAGE 10 %. Un gel SDS-PAGE à 10 % en acrylamide/bisacrylamide est réalisé. 20 µg de protéines sont dérivatisés au DNPH comme précédemment décrit puis chauffés à 95°C et enfin déposés dans chaque puits du gel. Les échantillons migrent dans un tampon Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 20%. b. Transfert sur membrane PVDF Une membrane de PVDF ainsi que deux morceaux de papier Wattman sont découpés à la taille du gel SDS-page, puis humidifiés avec le tampon Tris-glycine-Ethanol. Le gel est déposé en « sandwich » sur la membrane PVDF et entre les papiers Wattman. Les protéines sont transférées du gel SDS-page vers la membrane pendant 15 minutes à 15 volts. L’étape de révélation est la même que celle réalisée pour le Dot Blot. 4- Immunodétection des protéines après migration sur gel SDS-PAGE en deux dimensions a. Préparation des extraits protéiques Une préculture bactérienne est réalisée sur la nuit en milieu LB. Le lendemain, la préculture est diluée à DO600 = 0,1 dans 800 ml de LB. A DO600 = 1, la culture bactérienne est centrifugée à 7500 rpm pendant 30 minutes. Le culot est solubilisé dans 10 ml de PBS. Les bactéries sont lysées par plusieurs passages à la presse de French. L’extrait cellulaire est traité à la DNase SI puis est centrifugée à 13000 rpm pendant 30 minutes. Le surnageant est conservé. 113 b. Dosage des échantillons cellulaires Le dosage est réalisé comme précédemment indiqué avec le « BCA Protein Assay Kit ». 200 µg de protéines sont déposés sur les gels SDS-PAGE. c. Focalisation électrique Des bandes sur lesquelles est établi un gradient de pH sont réhydratées dans un tampon de réhydratation. Le tampon de réhydratation contient 21 g d’urée, 7,6 g de thio-urée, 2 g de CHAPS, 100 mg de DTT, 1% de bleu de bromophénol pour un volume final de 50 ml. 110 µl de ce tampon de réhydratation est ajouté à 2,5 µl d’IPG buffer et de DTT 1M. 200 µg de protéine sont distribuées dans le tampon de réhydratation afin d’obtenir un volume final de 350 µl. Ce mélange est déposé sur la bande réhydratée et incube pendant la nuit. Le lendemain, la bande est déposée sur un cycle électrique suivi est 10’ à 200 v puits 1h 30 à 3500 v et enfin 2h à 3500 v. d. Electrophorèse en gel SDS-page Des gels SDS-PAGE 10 % sont réalisés. Les bandes sont déposées au dessus des gels puis recouverts de tampon Tris-Glycine-SDS. Le gel migre pendant 3 heures à 70 v. Les protéines sont révélées au bleu colloïdal. 114 Espèce E.coli S. typhimurium Souche description Référence ou origine Collection du laboratoire MG1655 E. coli souche sauvage fadH MG1655 ∆fadH E. coli Hpx MG1655 ∆ahpCF ∆katG ∆katE Collection du laboratoire 12023 S. typhimurium NTCC 14028 Collection du laboratoire msrAB 12023 msrA::kan msrB::cat cette étude msrAB curée 12023 ∆msrA ∆msrB cette étude Hpx 12023 ∆ahpCF katG::cat katE::kan cette étude msrAB Hpx 12023 ∆msrA ∆msrB ∆ahpCF katG::cat katE::kan cette étude msrAB Hpx° 12023 msrA::kan ∆msrB ∆ahpCF ∆katG ∆katE cette étude Hpx° 12023 ahpCF::kan ∆katG ∆katE ∆katN cette étude HpxF 12023 ahpCF::kan ∆katG ∆katE ∆katN tsaA::cat cette étude HpxF curée 12023 ∆ahpCF ∆katG ∆katE ∆katN ∆tsaA cette étude Px 12023 ∆ahpCF ∆tsaA tpx::cat cette étude Kat 12023 ∆katG ∆katE katN::kan cette étude oxyR- 12023 oxyR::Tn10 (TetR) Collection du laboratoire ahpCF- tsaA- 12023 ∆ahpCF tsaA::kan cette étude ahpCF- tpx- 12023 ahpCF::kan tpx::cat cette étude tsaA- tpx- 12023 tsaA::kan tpx::cat cette étude Tableau 1 : Liste des souches utilisées dans cette étude 1/2 cette étude Souches, plasmides et oligonucléotides utilisées dans cette étude. 1. Souches La liste des souches utilisées dans cette étude est reportée ci-contre (Tableau 1). 2. Liste des plasmides Nom du plasmide pKD46 Description Red recombinase λ-ApR pCP20 Recombinase FLP ApR et CmR pKD3 Plasmide matrice, kanR et ApR pKD4 Plasmide matrice, CmR et ApR pACYC 184 CmR et TcR, origine de réplication p15A pkatG pkatE pFPV25 Région codante de katG clonée aux sites BamHI et HindIII clonée dans pACYC184 Région codante de katE clonée aux sites BamHI et HindIII clonée dans pFPV25 clonée dans pACYC184 gfp mut3a, ApR pahpC-GFP Région promotrice d'ahpC fusionnée à la séquence codante de la gfp mut3a dans pFPV25 pytfE-GFP Région promotrice d'ytfE fusionnée à la séquence codante de la gfp mut3a Dans pFPV25 Référence Wanner et Datsenko, 2000 Wanner et Datsenko, 2000 Wanner et Datsenko, 2000 Wanner et Datsenko, 2000 Wanner et Datsenko, 2000 cette étude cette étude Collection du laboratoire cette étude cette étude 3. Liste des oligonucléotides Oligonucléotide katG 5' katG 3' katE 5' katE 3' ahpC 5' ahpC 3' ytfE 5' ytfE 3' pFPV25 NdeI Fw Séquence CCCAAGCTTCCGGGAGCTTTATTACAACTC GGGGGATCCCTGGTTGTGCATAACATAGGC CCCAAGCTTTCCCGCTCTCCCCCAGCATAA GGGGGATCCCTCAAGGCAGCGATTGCGGAA CCCTCTAGAGTAATGTAGAGCGCAACACTT CCCCATATGTACTTCCTCCGTGTTTTCGTT CCCTCTAGACAAAAATTGCCAACCGTTATT CCCCATATGCGTTACCTCATTTGCAATAAT ATATACATATGAGTAAAGGAGAAGAA pFPV25 NdeI Rv TGTTTCATATGATCTGGGTATCTCGC Origine Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude Cette étude 115 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Références bibliographiques Aguirre,A., Cabeza,M.L., Spinelli,S.V., McClelland,M., Garcia,V.E., and Soncini,F.C. (2006) PhoP-induced genes within Salmonella pathogenicity island 1. J Bacteriol 188: 6889-6898. Allgood,G.S., and Perry,J.J. (1986) Characterization of a manganese-containing catalase from the obligate thermophile Thermoleophilum album. J Bacteriol 168: 563-567. 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(1997) Enzyme diversity and mosaic gene organization in denitrification. Antonie Van Leeuwenhoek 71: 43-58. 130 Résumé Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO), molécules dérivées de l’oxygène, sont capables d’oxyder et d’endommager les macromolécules biologiques. Au cours de son cycle de vie, Salmonella typhimurium est exposée à des FAO provenant de deux sources : soit de son métabolisme aérobie, soit du macrophage, sa cellule hôte au cours de l’infection. Parmi les FAO existantes, l’H2O2 est l’une des plus néfastes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la contribution des catalases et des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S. typhimurium. Cinq enzymes ont ainsi été identifiées pour leur capacité à éliminer l’H2O2 : les catalases KatG, KatE, KatN et les peroxyrédoxines AhpCF et TsaA. Des tests de virulence ont également permis de montrer que ces enzymes participaient à l’établissement de la virulence. A l’aide d’une sonde moléculaire capable de détecter et de signaler l’H2O2, nous avons montré que S. typhimurium percevait cette FAO au cours de l’infection dans des macrophages murins. Ces résultats ont souligné l’importance des catalases et des peroxyrédoxines au cours de la vie intracellulaire de S. typhimurium. L’analyse du mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx a également révélé que les peroxyrédoxines AhpCF, TsaA et Tpx contribuaient à la capacité de prolifération de la bactérie dans le macrophage. Enfin, l’étude des méthionine sulfoxyde réductases a montré que les caractéristiques d’un mutant ∆msrA ∆msrB étaient proches de celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été inactivés dans une souche dépourvue de katG, katE et ahpCF. Dans cette souche accumulant de l’H2O2 endogène, la contribution de MsrA et MsrB devient évidente pour lutter contre les effets liés au stress oxydant. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier et de caractériser l’implication de systèmes antioxydants dans la virulence et le métabolisme de S. typhimurium. Contribution of antioxidant systems in Salmonella virulence and oxidative stress resistance Abstract Reactive Oxygen Species (ROS), produced from molecular oxygen, can oxidize and damage biological macromolecules. During its lifestyle, Salmonella typhimurium is submitted to ROS coming from two sources: its aerobic metabolism and its host cell upon infection, the macrophage. Among the ROS, H2O2 is one of the most toxic. In this work, the contribution of catalases and peroxiredoxins in the metabolism and the virulence of S. typhimurium was studied. Five enzymes are implied in H2O2 degradation, the catalases KatG, KatE, KatN and the peroxiredoxins, AhpCF and TsaA. Virulence tests showed that these enzymes were involved in virulence. Using a molecular probe able to detect and quantify H2O2, we showed that S. typhimurium sensed H2O2 during infection in murine macrophages. These results underlined the importance of catalases and peroxoxyredoxines for the intracellular life of S. typhimurium. Analysis of the mutant ∆ahpCF ∆tsaA ∆tpx revealed that the peroxiredoxins AhpCF, TsaA and Tpx contributed to the bacterial proliferation inside macrophage. Finally, the study of the methionine sulfoxyde reductases showed that the phenotype of the mutant ∆msrA ∆msrB was related to the wild type strain. Then, msrA and msrB were inactivated in a strain deleted of katG, katE and ahpCF. In this strain impaired in H2O2 degradation, the contribution of MsrA and MsrB to fight against oxidative stress effect is stronger. Altogether, these results allowed the identification and the contribution of antioxidant systems in S. typhimurium virulence and metabolism.