Méthylation de l`ADN

Master 2 Biotechnologies des Plantes Tropicales
module Développement Végétatif

Épigénétique:
Intégration des signaux environnementaux
& réponses aux contraintes
Estelle Jaligot
CIRAD, UMR DIADE,
équipe Biologie du Développement des Palmiers
20 septembre 2011
Génotype
Génotype
ADN
ARN
ARN
Réseau
épigénétique
Protéine
Phénotype
Proteine
Phénotype
Environnement
Environnement
ADN
Génotype
Génotype
ADN
ARN
ARN
Réseau
épigénétique
Protéine
Phénotype
Protéine
Phénotype
Environnement
Environnement
ADN
1. Ce qu’on entend par « méchanismes
épigénétiques »
(la plupart du temps et jusqu’à preuve du contraire)
•
•
La méthylation de l’ADN
La condensation de la chromatine
Ce qui fait débat:
•
Les petits ARNs non codants
•
Les modifications des ARN messagers:
coiffe, épissage alternatif, polyadénylation…
1. Définitions: la méthylation de l’ADN
m
m
m
CATGTCGTTCAGAACG
m
GTACAGCAAGTCTTGC
CATGTCGTTCAGAACG
AGTCTTGC
CATGTC
GTACAGCAAGTCTTGC
m
m
m
ADN-méthyltransférases
m
m
SAM
SAH
m
m
m
CATGTCGTTCAGAACG
GTACAGCAAGTCTTGC
m
m
• La méthylation varie en quantité et en répartition, pour une séquence
(codante ou pas), au cours du développement et d’un tissu à l’autre.
• Selon son emplacement dans une séquence, une mC n’a pas la même
influence.
m
1. Définitions: la chromatine
Nucléosome
= 2x (H2a+H2b+H3+H4)
Hétérochromatine
Euchromatine
© CSIRO Plant Industry, Canberra, Australie.
K9Me
K9Me2
K9Me3
K27Me3
H3 H4
H3 H4
K9Ac
K4Me2
K4Me3
K36Me2
Hétérochromatine
H3 H4
H3 H4
Ac (différentes K)
Euchromatine
© CSIRO Plant Industry, Canberra, Australie.
• AA modifiés: K, S, R (méthylation, phosphorylation, ubiquitinylation,
acétylation, SUMOylation…)
• Plusieurs marques peuvent coexister sur la même protéine (différents AA),
elles ont un effet cumulatif sur l’activation ou la répression des gènes.
Miguel et Marum, 2011
L’emboîtement de plusieurs niveaux
d’information qui dialoguent entre eux:
• Niveau site
• Niveau séquence
• Niveau région
• Niveau domaine chromatinien
Notion de paysage épigénétique
Zhang et al 2008
1. Ce qu’on entend par « méchanismes
épigénétiques »
(la plupart du temps et jusqu’à preuve du contraire)
•
•
La méthylation de l’ADN
La condensation de la chromatine
Ce qui fait débat:
•
Les petits ARNs non codants
•
Les modifications des ARN messagers:
coiffe, épissage alternatif, polyadénylation…
2. Les grandes familles de phénomènes
épigénétiques
•
La défense du génome
•
La régulation de l’expression des gènes
•
L’intégration de signaux environnementaux
=> Étude de cas: la vernalisation
La vernalisation
Sung et Amasino, 2004b
Vernalisation
• Définition : déclenchement (ou accélération)
de la floraison d’une plante après son
exposition à une période prolongée de
températures froides et en jours longs.
• Intérêt : la plante ne fleurit que lorsque les
conditions climatiques sont devenues
favorables (à la pollinisation, au développement
des graines) : au printemps.
Orge (annuelle)
Betterave (bisannuelle)
Campanule
Thlaspi arvense (annuelle)
Burn et al., 1993
Dosage global de la méthylation génomique
par HPLC
échantillon
m
m
Nucléase P1
Phosphatase alcaline
G
G
T
A mC
C GA
A
T mC T
T C
G
G A
mC
G
T A T
AG
C
mC
G
mC
A
A T
T
CATGTCGTTCAGAACG
GTACAGCAAGTCTTGC
m
m
m
dC
désoxynucléosides
%m dC = [m dC] /
([dC] + [m dC])
dG
mdC
dT
dA
• Avantage: ne nécessite aucune
information de séquence
• Inconvénient: concluant
uniquement à l’échelle du génome
Arabidopsis thaliana (annuelle)
Finnegan et al., 1998
Arabidopsis thaliana (annuelle)
Finnegan et al., 1998
Finnegan et al., 1998
Sheldon et al., 1999
Sheldon et al., 1999
Sheldon et al., 1999
Michaels et Amasino, 2000
or 5-azacytidine
or 5-azacytidine
Finnegan et al., 2000
Sheldon et al., 2002
Sheldon et al., 2002
Méthylation de l’ADN: utilisation de McrBC
Digestion McrBC
Rabinowicz et al., 2003
Finnegan et al., 2005
La conversion des cytosines
par le bisulfite de sodium
•
•
•
Repose sur la conversion différentielle des cytosines en fonction de leur
statut de méthylation: C devient U, mC reste C
Conséquence: la méthylation devient « lisible » par la Taq-polymérase
lors de la PCR, possibilité de dessiner des amorces spécifiques du profil
de méthylation
Atout majeur: profilage de la méthylation base à base, différencie les
deux brins
Exploitation des données
du bisulfite sequencing
•
•
Risque non négligeable de
faux positifs: il est
indispensable de confirmer
les résultats par une
méthode indépendante
Extrême variabilité des
profils de méthylation en
fonction du stade de
développement, de l’état
physiologique et du tissu
(voire de la cellule):
nécessité de réaliser des
statistiques (répétitions
biologiques + répétitions
techniques)
Bagus Andika et al 2006
Gendall et al., 2001
Les protéines Polycomb (PcG)
Agissent sous forme de complexe comme le PRC2.
Les gènes codant pour E(Z) et Su(Z)12 forment des familles multigéniques
=> plusieurs complexes possibles
Drosophila
melanogaster
PRC2-type
P55
ESC
SU(Z)12
E(Z)
Vernalisation
Développement gamétophyte
et albumen
Transitions phase reproductrice
FIS 2
MS1
FIE
MEA/
CLF
MS1
FIE
Arabidopsis thaliana
MS1
VRN 2
VIN3
FIE
CLF/
SWN
EMF 2
CLF/
SWN
Stage M1 BFP Sophie Adler, 2010
Conformation de la chromatine:
la ChIP (Chromatin Immuno Precipitation)
lyse
Tissus fixés au
formaldéhyde
G
sonication
précipitation avec
complexes billes / Ac
• Avantage: identification fine des
modifications de la chromatine
• Inconvénient: très dépendant de
la qualité des Ac, nombreuses
précipitations parallèles à réaliser
G
G
G
PCR:
amplification
gène-cible G
purification ADN
Massie et Mills, 2008
élution
Bastow et al., 2004
Bastow et al., 2004
Sung et Amasino, 2004a
Sung et Amasino, 2004b
Sheldon et al. (2008): dilution
passive des marques de la
chromatine suite à extinction
VRN2?
L’expression de FLC dans les
phases tardives de
l’embryogenèse est nécessaire
pour retarder la floraison de la
plante adulte.
Henderson et Jacobsen, 2007
Tamada et al., 2009
Levure
Arabidopsis
Seo et al., 2009
Bond et al. (2009):
VIN3 est aussi impliqué dans la réponse au stress hypoxique
=> la voie de régulation de la floraison est à la croisée de plusieurs voies de
régulation liées aux conditions environnementales.
Floraison chez les céréales:
Pas d’équivalent de FLC et
pas toujours de rôle du froid
=> mécanismes probablement
très différents
Oliver et al. (2009): chez l’orge
des marques de chromatine
activatrices
(+H3K4me3, -H3K27me3) au
niveau de VRN1 sont liées à
l’induction de la floraison par
la vernalisation.
Greenup et al., 2009
Swiezewski et al., 2007
Homology-Dependent Gene Silencing (HDGS)
Matzke et Matzke, 2004
ARN antisens COOLAIR
Swiezewski et al., 2009
MS1
VRN 2
VIN3
FIE
PRC2 (Vernalisation)
CLF
Heo et Sung (2011):
L’ARN non codant long COLDAIR
est produit à partir d’un site
localisé dans le 1er intron de FLC
et interagit physiquement avec la
protéine CLF, responsable de la
triméthylation de H3K27 dans le
PRC2.
Arabidopsis hallieri (pérenne)
Aikawa et al., 2010
Delker et Quint, 2011
Rapp et Wendel, 2005