APR PNRPE 2008 Modèles Intégrés pour déceler la perturbation
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Modèles Intégrés pour déceler la perturbation thyroïdienne à faibles doses. Modèles Intégrés pour déceler la perturbation thyroïdienne à faibles doses. Proposition :Octobre 2008 Proposition révisé: 19 mai 2009 Programme début: fin 2009 Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Point de départ : Le développement récent d’un test multiplaque pour le criblage des perturbateurs thyroïdiens avec des embryons de xénope (Fini et al. 2007), en cours de validation par l’OCDE, est un preuve de concept de l’utilité de ces méthodes exploitant des petits organismes modèles à l’interface in vivo/in vitro. Besoins: Déceler mélanges Doses Faibles Effets épigénétiques… Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Partenaires J.B. Fini, S Lemevel, K Palmier, B. Demeneix, UMR 7221 CNRS/MNHN Paris Equipe de Vincent Laudet, IGFL CNRS UMR 5242, ENS Lyon WatchFrog, Gregory Lemkine, 4 Rue Pierre Fontaine, 91000 Evry Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Thyroid hormone is essential for brain development in humans Without a minimum of thyroid hormone, at the right time, a tadpole fails to become a frog and a human baby becomes a cretin. Jacques Legrand 1976 Metamorphosis in Xenopus T3 55 60 63 66 stades lLeloup and Buscaglia, 197 7 OECD Test - Overview • Exposure of X. laevis tadpoles (stage 51) to 0, 65, 125, 250 and 500 µg perchlorate/L for total 21 days • Sub-sampling of 5 tadpoles after 7 days; comparison of different endpoints • Flow-through system (22°C, pH 6.5 - 8.0, photoperiod 12h:12h) • 6 replicates per test group (4 rep. required) – statistical power 20 tadpoles day 0 day 7 15 tadpoles day 21 Inhibitors of Thyroid Hormone production/ action methimazole Tg IOP: blocks all deiodinases 2 I- 3 lumen MIT,DIT,T3,T4 Sodium perchlorate Follicular cell lyzosome NH3: antagonizes TH MIT, DIT TH TR ITRE 1 T4 T3 Na/I symporter Basolateral T4 T3 membrane AMA ring test perchlorate 0 62.5 125 250 500 Sur critères morphologiques ( histologie de la thyroïde) seulement 2 labos sur 5 peuvent détecter un effet de retard de stade après 21 jours de perchlorate, dont 1 seul à une concentration de <500µg/L Test transcriptionnel in vivo TRH - TSH - Thyroid Hormones T3 T4 PE TBBPA ? Synthèse Transport T4 Protéine sériques Récepteur nucléaire T3 Cellules cibles Regulation de la transcription des gènes cibles TR TH/bZIP THb/ZIP GFP De la physiologie à un test appliqué T3 CTRL TH/bZIP GFP TH/bZIP Lecture automatisée en plaques 96 puits TH/bZIP T3 GFP TH/bZIP TBBP A GFP Rôle des HTs dans embryogenèse précoce Test rapide (3j) et automatisé Détection de Perturbateurs Test en cours de validation par l’OCDE GFP Fini et al., 2007 Env Sci Tech Fini et al., 2009 Env Sci Tech Bondesson et al., 2009 Reproductive toxicology Fini et al., 2009 Ann NY Sci Fini et al., Chemosphere soumis AMA vs test transcriptionnel • Notre test comparé à l’AMA est très performant • Exemple du perchlorate (CCl4): – Perchlorate =goitrogène. – Bloque le symport sodium/iode (NIS = Slc5a5) – Affinité du CCl4 pour le NIS est 30x supérieure à l’iode! • AMA: 2 labos sur 5 seulement ont montré un effet du perchlorate <500mg/L sur critères morphologiques.(tous sur histologie de la glande thyroïde) Perchlorate de sodium * 200 RFU Test Muséum: Détection d’un effet antithyroïdien à 125mg/L. Paradoxe car pas de thyroïde mais …présence du NIS dès le stade œuf! ns 150 ns 100 50 0 Perchlorate 3,56 3.56 10 -6M - + - + - + T3 5.10 -9M - - + + - - T4 10 -8M - - - - + + AMA NF51 (21 j de développement) Test transcriptionnel XETA NF45 (4 j de développement) 3 cm Temps de traitement (retard de développement) 21 jours Temps de traitement 3 jours Détection du perchlorate 75% Détection du perchlorate 2 labos / 5 (5/5 pour la T4) 40% Sensibilité perchlorate Sensibilité perchlorate 500µg/L(125µg/L) 125µg/L Automatisation : NON Automatisation : OUI Objectifs d’utiliser le test in vivo/in vitro pour explorer les effets des mélanges et des faibles doses d’adapter le test sur les embryons de zebrafish (le poisson zèbre), Danio rerio d’affiner le test sur les embryons de xénope, avec des gènes rapporteurs optimisés de rechercher chez le xénope et chez le zebrafish des gènes cibles des HT potentiellement sujet à des modifications épigénétiques induits par des perturbateurs endocriniens (PE). Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes La première annéé nous avons les objectifs suivants : d’utiliser la lignée de Xénope transgénique TH/bZIPGFP (Fini et al. 2007) pour explorer les effets des mélanges et les faibles doses (Equipe 3) de produire une lignée de poisson Zebrafish, Danio rerio, transgénique pourtant le gène TH/bZIP-GFP (Equipe 2) d’améliorer et affiner le test sur les embryons de xénope, par l’emploi des génes rapporteur optimisé, notamment faire les fondateurs d’une lignée NIS-YFP (Equipe 1) Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Recherche de gènes candidats par qPCR sur thyroide de xénope slc5a5 (NIS) 70 *** 5 60 *** 30 tshr *** *** 4 50 40 tpo 10 0 C PER ETU 4 *** *** 3 3 3 1 1 1 0 0 0 C PER ETU *** *** 2 2 2 20 4 tg C PER ETU C INDUCTION très forte de NIS From Opitz et al., 2009 PER ETU NIS = excellent candidat NIS est régulée par les taux circulants d’hormones (détection des inhibiteurs agissant à différents niveaux de l’axe) Nouvelle construction en cours NIS YFP Avantages de la nouvelle stratégie: Promoteur NIS est régulé négativement par les HTs et positivement par les goitrogènes Très sensible pour les goitrogènes (gros problème pour le test AMA) Divise par deux le nombre d’animaux utilisés (plus de test en compétition) Utilisation d’un rapporteur Jaune (moins d’autofluorescence des intestins) Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Clonage Promoteur du NIS xénope : non étudié Chez l’humain promoteur décrit . Présence de 2 DR4 Site type Sequence Start End log (Viterbi probabily) log (Forward probaility) log (Background state probability) ForwardBackground DR4 TGACCCCGCCTGCACT 5 6 9 5 8 4 -2 3 .6 4 8 6 -2 3 .4 3 9 9 -2 5 .1 2 2 4 1 .6 8 2 5 IR1 GGGGCACTGTCTA 24 -2 1 .1 0 3 7 -2 0 .3 4 7 9 -2 0 .9 3 3 7 0 .5 8 5 8 IR1 CGGTGAGTGGCCT 4 1 2 4 2 4 -2 0 .6 9 4 5 -2 0 .0 6 1 9 -2 0 .9 3 3 7 0 .8 7 1 8 ER8 TGGACCAGTCCTCCAGGTCC 1 3 5 1 5 4 -3 0 .5 7 4 9 -2 9 .8 3 8 1 -3 0 .7 0 7 4 0 .8 6 9 3 36 Deux constructions ave promoteurs humain ou xénope sont effectuées en parallèle Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Expériences en cours Clonage du promoteur dans un plasmide rapporteur YFP ISH pour NIS sur différents stades de développement Etude des variations du NIS endogène Programme National de recherche sur les Perturbateurs Endocriniens – Séminaire de lancement APR 2008, le 13 avril 2010 - Rennes Etat d’avancement: 1° année (4 mois) Pas de problème pratique pour le moment…...
