CCT Blanc L2SVS MBG
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Examen de MBG (Microbiologie générale) LSV2 (2h) - 15 janvier 2013 1/ Les flagelles bactériens (5 points) : - utilisation pour la classification - structure chez une bactérie à Gram négatif - principe de la mobilité chez Escherichia coli - tactisme : définition et mécanisme Développez les différents points ci-dessus en vous appuyant sur des schémas soignés et clairement légendés 2/ Bioremédiation d’un polluant aquatique, le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), par Mycobacterium Le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE) est un additif de l'essence qui contribue à réduire les émissions de monoxyde de carbone et d'hydrocarbures imbrulés. En raison de sa grande solubilité dans l'eau et de la fréquence élevée des déversements, le MTBE contamine de nombreux environnements aquifères. Des chercheurs en microbiologie environnementale recherchent des bactéries capables d’utiliser et de convertir le MTBE en produits inoffensifs, afin de décontaminer des zones polluées. 2.1/ Isolement de bactéries capables de dégrader le MTBE (1 point) Q1/ Décrivez le milieu de culture permettant d’isoler des souches bactériennes capables de dégrader le MTBE. Proposez différents environnements où vous pourriez prélever des échantillons à tester sur le milieu que vous avez élaboré. 2.2/ Voie de dégradation du MTBE chez Mycobacterium austroafricanum (3 points) Parmi les différentes espèces bactériennes isolées, les chercheurs s’intéressent plus particulièrement à Mycobacterium austroafricanum, bactérie capable de dégrader le MTBE. Afin de connaître la voie de catabolisme de ce composé, les chercheurs réalisent une mutagénèse aléatoire de M. austroafricanum afin d’isoler des mutants incapables de dégrader le MTBE. Ce travail permet d’isoler différents mutants (1 à 6) présentant différents profils de croissance sur les intermédiaires métaboliques de cette voie (Tableau 1). Q2/ Grâce au Tableau 1, ci-dessous, donnez l’ordre de la voie de catabolisme du MTBE et positionnez les étapes affectées dans les différents mutants. Justifiez votre réponse avec un exemple. Tableau 1 Souches MTBE 2-propanol TBA Hydroxyisobutyraldehyde TBF M1,2-PD HIBA Sauvage mutant 1 mutant 2 mutant 3 mutant 4 mutant 5 mutant 6 + - + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + 2.3/ Etude de la fonction des gènes mpdB et mpdC de Mycobacterium austroafricanum dans l’utilisation du MTBE Les auteurs isolent et clonent une région du génome de la bactérie portant les gènes mpdB et mpdC. Afin de comprendre le rôle de ces gènes dans le catabolisme du MTBE, les auteurs disposent de la bactérie modèle Mycobacterium smegmatis, qui ne métabolise pas le MTBE et du vecteur pCL4D portant un gène de résistance à la kanamycine (kanR). Transformation de M. smegmatis (3 points) Les auteurs souhaitent transformer M. smegmatis avec de l’ADN plasmidique. Cette espèce étant difficilement transformable par les techniques habituelles, ils décident d’utiliser la technique d’électroporation. Cette méthode consiste à soumettre une suspension de bactéries à un champ électrique d’intensité et de durée précise. Une culture de M. smegmatis en milieu LB est réalisée jusqu’en phase exponentielle de croissance, puis les cellules sont lavées et resuspendues dans du tampon glycérol (« cellules compétentes »). Puis 100 µL de ces cellules « compétentes » sont mises en contact avec 25 ng de pCL4D vide. Ce mélange est ensuite soumis à un champ électrique. 900 µL de milieu de culture LB sont ensuite ajoutés et l’ensemble est agité à 37°C pendant 2 heures avant étalement de 200 µL sur milieu LB + kanamycine à la dilution indiquée dans le tableau 2 ci-dessous. Les colonies sont ensuite dénombrées. Tableau 2 Condition d’électroporation (intensité et durée du choc électrique) 1000 V – 10 msec Colonies sur LB+Kan : Dilutions Nombre 10-3 168 1000 V – 20 msec 10-2 250 2000 V – 10 msec 10-6 365 2000 V – 20 msec 10-4 110 Nombre de transformants Taux de transformation Q3/ Calculez (détaillez vos calculs) le nombre de transformants et le taux de transformation obtenus, en fonction de la durée et de l’intensité du champ électrique. Complétez le tableau. D’après vos résultats, quelle condition retiendriez-vous pour l’électroporation de M. smegmatis ? Dégradation de M1,2-PD par différentes souches de M. smegmatis transformées par différents plasmides. (3 points) On dispose de 4 souches : - La souche possédant le plasmide pCL4D vide - La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant les gènes mpdB et mpdC - La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant le gène mpdB seul - La souche possédant le plasmide pCL4D avec un fragment portant le gène mpdC seul Ces souches sont cultivées et mises en contact avec du M1,2-PD radioactif. Après incubation pendant 10h, un extrait cellulaire est réalisé et la nature des constituants radioactifs est recherchée. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Nature et proportion des composés radioactifs détectés (en %) 10h après contact cellules – M1,2-PD radioactif M1,2-PD HIBA Hydroxy-isobutyraldehyde pCL4D vide Souches de M. smegmatis pCL4D avec gènes mpdB et mpdC pCL4D avec gène mpdB pCL4D avec gène mpdC 100 0 0 50 20 30 50 100 0 0 50 0 Q4/ Expliquez ces résultats. En vous appuyant sur la voie catabolique que vous avez caractérisée précédemment, précisez la fonction des protéines codées par les gènes mpdB et mpdC.
