Article - Journal International de Santé au Travail

Contribution à l’étude des propriétés biologiques des extraits de feuilles de
senecio faujasioïdes (Asteraceae)
Contribution to the survey of the biologic properties of the excerpts of
leaves of senecio faujasioïdes (Asteraceae)
Velomalala Noeliharisoa Mandimbisolofo, Raherimandimby Marson, Ramamonjisoa Daniel
Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie, Département de Biochimie Fondamentale et
Appliquée, Faculté des sciences d’Antananarivo. Ankatso, B-906 Antananarivo Madagascar.
E-mail : [email protected]
Téléphone : 0331452440
Résumé :
L’extrait aqueux à chaud de feuilles de Senecio faujasioïdes. (Asteraceae) noté EB est le plus actif
parmi les extraits préparés et que 5 fractions pures ont été obtenues. Ces extraits présentent des effets
bactéricides. Cet article fait l’objet d’une étude microbiologique d’EB et de ces fractions sur des
bactéries pathogènes Cette étude a pour objectif de chercher les différents caractères des bactéries et
d’observer l’activité de l’extrait aqueux à chaud et ses fractions purifiée vis-à-vis de ces bactéries afin
d’identifier les familles chimiques impliquées dans les activités antimicrobiennes. Des examens
macroscopiques et microscopiques, détermination du type respiratoire en faisant des ensemencements
profonds, identification des bactéries en utilisant des milieux de culture dont la composition permet de
mettre en évidence une enzyme et des tests d’antibiogramme ont été effectuée. Les différents
caractères morphologiques, culturaux, physiologiques et biochimiques des souches étudiées ont été
montrés. Les tests d’antibiogramme révèlent que la fraction éthanolique 50 % (N5) est très active
vis-à-vis de tous les germes tests. L’autre fraction issue du dialysat notée N 3 et celle issue du
traitement par la chaleur (N1) occupent la deuxième place et présentent presque les mêmes activités.
La concentration minimale inhibitrice de la fraction éthanolique 50 %(N5) sont respectivement: 2,61
µg/µl; 3,9 µg/µl ; 1,51 µg /µl ; 0,86 µg/µl ; 2,61 µg /µl ; 1,95 µg/µl ; 3,9 µg /µl ; 1,95 µg/µl pour
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Vibrio fischeri, Vibrio harveyi et Enterococcus faecalis et la concentration minimale bactéricide pour
Bacillus subtilis est de 0,97 µg/µl.
Enfin, l’activité bactéricide de feuilles de Senecio faujasioïdes est attribuée aux leucoanthocyanes
contenues dans la fraction éthanolique 50 % (N5).
Cette plante pourrait donc être utilisé pour traiter des infections impliquant les germes étudiés.
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Abstract :
The aqueous excerpt to hot of leaves of Senecio faujasioïdes. (Asteraceae) noted EB is the most active
among the prepared excerpts and that 5 pure fractions have been gotten. These excerpts present
bactericidal effects. This article is the subject of a biologic survey of EB and these fractions on
pathogenic bacteria to identify the chemical families implied in the activities antibacterial. Of the
macroscopic and microscopic exams, determination of the respiratory type while making deep
sowings, identification of the bacteria while using the culture media whose composition permits to put
in evidence an enzyme and tests of antibiogram have been done. The different morphological
characters, culturaux, physiological and biochemical some studied stumps have been demonstrated.
The tests of antibiogram reveal that the ethanolic fraction 50% (N 5) is very active opposite all germs
tests.
The other fraction descended of dialyzed it noted N 3 and the one exit of the treatment by the heat (N 1)
occupy the second place and present the same activities nearly. The inhibitory minimal concentration
of the ethanolic fraction 50% (N5) are respectively: 2,61 µg/µl; 3,9 µg/µl; 1,51 µg/µl; 0,86 µg/µl; 2,61
µg/µl; 1,95 µg/µl; 3,9 µg/ µl; 1,95 µg/µl for Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi and Enterococcus
faecalis and the bactericidal minimal concentration for Bacillus subtilis are of 0,97 µg/µl.
Finally, the bactericidal activity of leaves of Senecio faujasioïdes is assigned to the leucoanthocyanes
contained in the ethanolic fraction 50% (N5). This plant could be used to treat infections caused by
bacteria studied.
Mots-clés. Asteraceae, Senecio faujasioïdes, leucoanthocyanes, activité bactéricide, fraction
éthanolique.
Keywords. Astéraceae, Senecio faujasioïdes, leucoanthocyanes, bactericidal activity, ethanolic
fraction.
1. Introduction
Les bactéries sont classées à partir des données du génome en grandes familles, en genres et espèces.
Un genre peut comporter plusieurs espèces génétiquement proches. On utilise en pratique pour
désigner les bactéries uniquement le nom des genres et d’espèces.
Diverses études ont fait ressortir que de nombreuses plantes possèdent des propriétés bactéricides,
insecticides, fongicides et rodenticides et sont utilisées pour traiter différentes maladies. [1]
Ainsi, des tests préliminaires sur des bactéries ont révélé que pour l’extrait aqueux à chaud et l’extrait
butanolique des feuilles de Pittosporum senacia (Pittosporaceae), Staphylococcus aureus s’est avéré
être la seule espèce sensible. [2]
Les extraits bruts aqueux à froid de feuilles de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) sont actifs sur
les bactéries à Gram positif et à Gram négatif tels que Staphylococcus aureus et Klebsiella
pneumoniae.
Dans cet article, nous parlerons d’abord les différents caractères de certaines bactéries utilisées,
ensuite l’étude des activités biologiques d’EB et de ces fractions sur des bactéries pathogènes. Et
enfin, nous présenterons les résultats de tests microbiologiques.
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2. Les caracteres des bacteries
•
Les bactéries à Gram positifs :
Staphylococcus aureus ATCC 11632 : Germes non entérobactéries, genre créé par OGSTON en
1881, c’est une bactérie à Gram positif, cocci forme, groupée en amas ressemblant à des grappes
de raisins. C’est un agent de suppuration, d’intoxication intestinale, et de septicémies chez
l’homme et chez les animaux, ils fermentent le glucose sans gaz. [3][4][5][6]
Bacillus subtilis : Germes non enterobacteries, bâtonnets de 2 à 3µ sur 0,7 à 0,8µ ; isolé ; mobile
par cils péritriches. Gram positif. Parfois filaments. Spore de 1,5 µ sur 0,6 à 0,9µ cylindrique ou
ellipsoidale, centre ou paracentrale dont la germination est équatoriale par rupture de la membrane
sporale le long de l’équateur, ils fermentent sans dégagement gazeux le glucose, saccharose,
arabinose, xylose et mannitol.[7]
•
Les bactéries à Gram négatifs :
Escherichia coli : Entérobactérie isolée par Escherich en 1881, C’est un bacille à Gram négatif à
bouts arrondis, isolé ou en courtes chaînettes et parfois sous forme de très long filament. C’est un
saprophyte normal du tube intestinal de l’homme et des animaux. C’est l’un des agents
responsables de septicémies, de suppurations, de diarrhées et même de dysenteries, ils fermentent
le glucose. [3][4][7][8][9]
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 : Ce nom vient de monas signifiant bâtonnet mobile. C’est
un bacille découvert par Gessard en 1882. Cette bactérie à Gram négatif aux
extrémités arrondies peut être groupée par paire ou en courtes chaînettes. C’est un germe
pathogène redoutable, résistant à de nombreux antibiotiques à cause de l’imperméabilité,
l’hyperexpression efflux actif, son capacité de modifier le cible et par la production des enzyme
par hydrolyse. Il est fréquemment retrouvé dans le sol, dans l’eau, dans des cas d’otites, de
méningites, d’endocardites ainsi que de nombreuses infections chez les patients immunodéprimés.
[10][11]
3. Matériel et Méthodes
3.1. Matériel biologique
-Les Microorganismes : Les microorganismes utilisés au cours de nos manipulations sont des bactéries
typées produites par Microbiologics®, ainsi que des bactéries isolées, purifiées, identifiées, et
conservées. Ils sont composés de bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
-Les matériels pour l’étude microbiologique :
•
Les milieux de culture :
Milieux selectifs12,13[12][13] : milieu E.M.B
(Eosine Methylen Blue), le milieu Lenox-B
Agar, milieu de BAIRD PARKER, milieu King A et King B, milieu HEKTOEN et milieu SS
AGAR.
Milieux electifs[8][12][13][14] : les milieux différentiels sont: le milieu de SIMMONS, le milieu
MANNITOL – MOBILITE NITRATE, le milieu de HAJNA – KLIGLER, le milieu LYSINE
–FER et le milieu UREE- INDOLE. Les milieux d’isolement sont: le milieu gélose nutritive, le
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milieu bouillon nutritif, le milieu viande foie et milieu ASS –AGAR. Le milieu pour les tests anti
–microbiens sont: le milieu de MÜELLER – HINTON et le milieu BOUILLON NUTRITIF.
•
Les disques pour antibiogramme : imprégnés, autoclavables car ce sont des disque en papier
de 6mm de diamètre produit par Biorad®.
•
La stérilisation est effectuée à l’autoclave à 121°C sous une pression de 1 bar pendant 20 min.
Les verreries et les pinces sont stérilisées à l’étuve à 180 °C pendant 30 min.
3.2 Etude des caracteres morphologiques et culturaux
3.2.1. examen macroscopique [6][12][15] :
Chaque souche pure est repiquée et ensemencée sur gélose nutritive en boite de façon à obtenir des
colonies isolées. Une incubation à 37°C durant 24h est entreprise pour tous les germes à l’exception de
Staphylococcus aureus qui nécessite 48h d’incubation. Après ce temps, les caractéristiques des
colonies comme la taille, la forme, le chromogenèse, le relief et la consistance seront analysés.
3.2.2.Examen microscopique [3][6][8][12][13][15] :
Observation à l’état frais : Une goutte d’eau distillée est versée sur une lame porte objet préalablement
stérilisée. Une ansée de la souche microbienne y est ensuite déposée, la suspension bactérienne est
alors obtenue. Après l’avoir recouverte d’une lamelle stérile, la morphologie, le mode de
regroupement ainsi que la mobilité bactérienne sont observés sous microscope optique au fort
grossissement (objectif x 10 et x 40).
Observation après coloration Gram : La méthode de coloration Gram nécessite 5 étapes :
• La réalisation d’une suspension microbienne (préparation du frottis)
• Coloration par le violet de Gentiane
Placer le frottis fixé dans le flacon de violet de gentiane. Laisser agir 1 min. Sortir la lame.
• Mordançage par le lugol
Recouvrir le frottis (placé sur le porte-lame, au dessus de la cuve à coloration) de lugol.
Laisser agir 1 min (ou un temps au moins égal à celui de l’action du violet de gentiane).
Eliminer l’excès de lugol et rincer la lame à l’eau distillée.
• Décoloration par l’alcool
Recouvrir le frottis d’alcool (éthanol) et laisser agir 10 s. laver le frottis à l’eau distillée (les
deux côtés de la lame).
• Recoloration à la fuchsine de Ziehl.
Placer le frottis dans le flacon de fuchsine. Laisser agir 10 s. Sortir la lame et rincer à l’eau
distillée (des 2 cotés).
3.3. Étude des caractères physiologiques
Détermination du type respiratoire: Les milieux stériles, contenus dans des tubes vissés sont d’abord
régénérés par un passage pendant 30 min au bain bouillant, puis refroidi. Un ensemencement profond
en spirale est ensuite effectué puis incubation pendant 24 h à 37 °C.
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Recherche de l’oxydase : Ce test est réalisé en déposant une goutte du réactif A au centre du papier
Wattman n°1 et en y étalant une partie de la colonie bactérienne.
Recherche de la catalase : Ce test est réalisé en versant une ou deux gouttes d’eau oxygénée 30 % sur
une suspension bactérienne déposée sur une lame porte-objet.
3.4. Etude des caractères biochimiques
Elle se fait sur 5 milieux de cultures spécifiques : milieu de hajna – kligler, milieu Citrate de simmons,
milieu mannitol-mobilite-nitrate, milieu lysine-fer, milieu urée-indole. Deux à trois ansées de la
souche bactérienne sont ensemencées dans les milieux par une piqûre, une striation en zig–zag et une
strie centrale. Après 24h d’incubation à 37°C, le virage de la coloration est noté. Pour le test a l’
O.N.P.G, le microorganisme à tester est mis en culture dans du bouillon nutritif contenant de
l’O.N.P.G. Après 24 h d’incubation à 37°C, l’apparition de l’O- nitrophénol de couleur jaune indique
l’existence d’une b-D-galactosidase.
3.5. Etude des caractères culturaux des germes sur milieux sélectifs [6][7][9][10][14][16][17]:
Cette étude se fait sur différents milieux de cultures tels que les milieux EMB, BAIRD PARKER,
SS-AGAR, HEKTOEN, KING A ET KING B. Après ensemencement par la méthode des stries, la
culture est mise à incuber à 37°C pendant 24 h. Ensuite, l’aspect des colonies est noté.
3.6. Spectre d’activité antimicrobienne des extrait.
Vingt μl d’extrait, déposé sur le disque à la surface d’une gélose uniformément ensemencée d’1ml
d’inoculum diffuse dans le milieu en créant une zone circulaire. Dans cette zone, la concentration de
l’antibiotique décroît du centre vers la périphérie. La concentration minimale inhibitrice ou CMI est
déterminée par cette méthode qui résulte la concentration minimale bactéricide ou CMB. Pour cela,
une oëse calibrée à 10 μl est ensemencée sur l’agar de Mueller Hinton. Après incubation à 37°C
pendant 24 h, les boites sont observées.
4. Résultats et Discussions
Les résultats des études microbiologiques ont permis l’identification des germes étudiés. L’extrait
aqueux à chaud (EB) et la fraction éthanolique 50 % (N5) sont des extraits dits à large spectre. En
effet, ils sont très actifs sur le groupe des entérobactéries telle que : Pseudomonas aeruginosa et
quelques bactéries à Gram positif comme le Bacillus cereus et Bacillus subtilis avec un diamètre du
halo d’inhibition respectivement 14 et 12 mm pour EB et N 5 ; 12, 32 mm et 14, 28 mm pour EB et N 5
(Tableau 1) par rapport à l’extrait d’acétate d’éthyle de feuilles de Chassalia bojeriana (Rubiaceae)
avec un diamètre d’inhibition entre 7 mm et 9 mm pour Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus et à
l’extrait aqueux à chaud de feuilles de cette plante sur Staphylococcus aureus et Bacillus subtils qui ne
présente pas d’activité.
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Tableau 1: Diamètres des halos d’inhibitions lors des tests d’antibiogramme de l’extrait brut EB et de
ses fractions purifiées- Diameters of the inhibition halos at the time of the tests of antibiogram of the
raw excerpt EB and of its purified fractions.
Extraits
Germes
EB
6
N1
12
N3
12
N5
13
Escherichia coli
6
12
10
14
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9037
14
14
13
12
Bacillus subtilis
32
31
30
28
Bacillus cereus
12
13
15
14
Vibrio fischeri
9
10
12
18
Vibrio harveyi
Enterococcus faecalis
8
10
8
12
10
14
14
13
Staphylococcus aureus ATCC 11632
EB=Extrait brut; N1=Fraction de EB obtenue par traitement à la chaleur ; N3= la fraction issue du
dialysat ; N5 = la fraction issue du culot de la précipitation par l’éthanol 50 %.
EB= raw excerpt.; E1= Fraction of EB gotten by treatment to the heat; E2= the fraction descended of
dialyzed; E3 = the fraction descended of the cheek of the precipitation by the ethanol 50%.
Ainsi, notre fraction éthanolique 50 % (N 5) est en général beaucoup plus performante. Elle réagisse
presque de la même façon que l’extrait butanolique de feuilles de Vernonia pectoralis (Pb) vis-à-vis de
Staphylococcus aureus mais très active par rapport à cet extrait pour Escherichia coli et Pseudomonas
aeruginosa dont le diamètre du halo d’inhibition est le même et égale à 6 mm. Ceci expliquerait
l’utilisation de l’espèce faujasioïdes par les tradi-praticiens pour traiter différentes maladies.
L’extrait aqueux à chaud est actif sur Enterococcus faecalis avec un diamètre du halo d’inhibition
égale à 10 mm. Cette plante pourrait être utilisée pour le traitement des infections urinaires dues à ce
germe. Avec ce même germe, il est beaucoup plus actif par rapport aux extraits méthanolique de
Santolina chamaecyparissus (Composées) dont le diamètre du halo d’inhibition est de 8mm et aux
extrait aqueux de ce même plante avec un diamètre du halo d’inhibition égal à 6 mm.
Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont très sensibles à la fraction N 3 ce qui expliquerait
l’utilisation de cette plante pour le traitement de la diarrhée, la dysenterie et autres maladies. Par
rapport aux autres familles, ces deux germes sont assez sensibles à l’extrait d’acétate d’éthyle
contenant l’acide diméthoxycinnamique des graines de Mascarocoffea chev.
Les leucoanthocyanes contenues dans la fraction éthanolique 50 % (N 5) est à spectre étroit, car elle
est très active sur les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. Ils agiraient sur la paroi
bactérienne. Ce qui explique l’utilisation de cette plante pour traiter les plaies, les brûlures, la
septicémie, la suppuration, la diarrhée et même la dysenterie les infections nosocomiales,
l’intoxication intestinale, la septicémie chez l’homme et chez les animaux, l’otite, la méningite,
l’endocardite et la fièvre. Les opérations de congélation et de décongélation n’ont aucun effet sur leur
performance.
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Quant à la performance de la fraction éthanolique 50 % (N 5), elle est beaucoup plus active que l’extrait
aqueux à chaud EB c'est-à-dire, plus la purification est poussée, plus la fraction est active. Nous
pourrions alors affirmer que cette fraction possède les principes actifs antibactériens contenus dans les
feuilles de l’espèce faujasioïdes.
La valeur de la CMI de notre fraction issue du culot de la précipitation par l’éthanol 50 % (N5) est de
0,86 µg.µl-1 pour Bacillus subtilis. Par rapport à d’autre germe comme Enterococcus faecalis, notre
fraction purifiée E3 est très performante avec une valeur de CMI égale à 1,95 µg.µl -1 par rapport à
l’extrait butanolique de feuilles de Xerosicyos danguyi (Cucurbitaceae) dont la CMI est estimée à 40
µg.µl-1.
Le résultat de la CMB obtenu sur Bacillus subtilis avec une valeur de 0,97 µg.µl-1 confirme que la
fraction éthanolique 50 % (N5) est bactéricide. Le rapport CMI/CMB pour ce germe est de 0,88 qui
signifie que la fraction éthanolique 50 % (N5) inhibe bien la croissance des bactéries.
5. Conclusions
Il en résulte que les propriétés bactéricides de Senecio faujasioïdes sont vraisemblablement liées à
l’occurrence de leucoanthocyanes qui agiraient sur la paroi bactérienne. Les données bibliographies
(H. Hubert en 1960, R. Lavergne et R. Vera en 1989, E. Rakotobe et al en 1993) ont montré que cette
plante est endémique de Madagascar, et concentrée au centre de l’île, appartenant à la famille des
astéracées.
Des microorganismes dont les caractères morphologiques et culturaux, les caractères physiologiques,
les caractères biochimiques et les caractères culturaux sur milieux sélectifs ont été démontrés et sont
utilisés pour tester l’activité de ces constituants. L’évaluation des tests d’antibiogramme des extraits
nous a conduits à la détermination de la CMI et la CMB de la fraction issue du culot de la précipitation
par l’éthanol 50 % notée N5 qui est très performant pour Bacillus subtilis.
Ces travaux ont permis de conclure que Senecio faujasioïdes et surtout l’extrait purifié qui est
bactéricide pourrait être utilisé pour traiter des infections impliquant les germes étudiés.
Pas de conflits d’intérêts.
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