CORRIGÉ DU DS N°5 Thème 1 1A1) En conditions d’hypoxie, la quantité d’ARNm NOS produits est 2 fois plus grande qu’en conditions de normoxie. une faible concentration en O2 active la transcription du gène NOS. 1A2) Principe : l’expression de la luciférase est facilement quantifiable en évaluant la fluorescence. Si la luciférase est exprimée, cela signifie que la région en amont a activé la transcription. Sans séquence en amont, l’intensité de la luciférase vaut 1. Avec 5039 pb amont, l’expression est à peine plus grande : rapport de 1,3. Avec 5523 ou 6047 pb en amont, l’expression est multipliée par 2,3. => La région située entre 5039 et 5523 pb en amont du gène semble impliquée dans l’activation de la transcription ici de la luciférase, donc de nos in vivo. 1B1) La technique de footprinting permet de localiser la fixation d’une protéine sur une séquence d’ADN. En effet, la liaison à l’ADN protège celui-ci d’une hydrolyse par l’endonucléase : certains fragments d’ADN ne seront donc pas visibles sur le gel d’électrophorèse. Ici, on teste la liaison de HIF1 sur une séquence comprise entre 5515 et 5250 pb en amont du gène nos, c’est-à-dire dans la région identifiée au 2A2. Témoin : dans la colonne 1, on observe les fragments de toutes les tailles, générés par la digestion à l’ADNase1. Colonne 2 : on remarque une zone du gel sans bande : les fragments de 217 pb à 210 pb n’apparaissent pas. L’ADNase1 n’a en fait pas pu digérer cette petite zone car la protéine HIF1 s’y est fixée. On localise ainsi la séquence TGTACGTG de fixation de HIF1. 1B2) Le retard sur gel est une technique permettant de mettre en évidence la liaison d’une protéine, ici HIF1, sur un fragment d’ADN, ici l’oligonucléotide contenant la séquence TGTACGTG située dans la région entre 5000 et 6000 pb en amont du gène nos. Le gel révèle l’oligonucléotide, car il est radioactif. colonne 1 = ce témoin montre jusqu’où migre l’oligonucléotide seul. colonne 2 : en normoxie, l’oligonucléotide migre aussi loin que le témoin : il n’est donc pas retenu par une protéine nucléaire. colonne 3 : en hypoxie, l’oligonucléotide migre moins loin, ce qui suggère sa liaison avec une protéine nucléaire. colonne 4 : en hypoxie, avec un Ac anti-HIF1, l’oligonucléotide migre encore moins loin : on peut alors suggérer que sur l’oligonucléotide s’est lié HIF1 (comme dans la colonne 3) sur lequel est fixé l’anticorps. L’ensemble étant plus lourd migre donc moins. La fine bande conforte notre hypothèse (oligonucléotide + HIF1). colonne 5 : un anticorps non spécifique d’HIF1 ne perturbe pas la migration par rapport à la colonne 3 : il s’agit bien d’HIF1 qui est lié à l’oligonucléotide. Interprétation : en hypoxie, dans le noyau apparaît la protéine HIF1 qui se lie à la région en amont du gène nos. 1C) L’histogramme évalue la quantité de protéine HIF1 dans les cellules. Comme attendu, la protéine HIF1 est absente en normoxie mais abondante (100 unités) en hypoxie. Etant transcrit, l’absence de protéine HIF1 en normoxie peut résulter : - soit d’une absence de traduction de l’ARNm en protéine HIF1 - soit d’une destruction ultérieure de HIF1 en cas de normoxie. Si on tronque la région ODD de HIF1, alors les protéines sont également présentes, en normoxie comme en hypoxie. Il y a donc bien eu traduction. La deuxième hypothèse est plus recevable. La séquence ODD ajoutée à la protéine Gal induit une absence de Gal en cas de normoxie. La séquence ODD est donc responsable de la disparition de Gal. Interprétation : En normoxie, les protéines HIF1 présentes sont détruites par un système qui reconnaît spécifiquement la séquence ODD. En hypoxie, HIF1 persiste. Il y a donc en hypoxie quelque chose qui empêche la destruction d’HIF1. SCHEMA BILAN THÈME 2 2.1 – Le mutant apetala2 (sans protéine AP2) présente des fleurs n’ayant que des carpelles mais ni sépale ni pétale, et 2 étamines probables. La protéine AP2 semble nécessaire à la formation des pièces stériles (pétales et sépales). Le mutant agamous (sans protéine AG) présente des fleurs constituées uniquement de sépales et pétales. La protéine AG semble impliquée dans la formation des pièces fertiles (étamines et carpelles). Dans une fleur sauvage, AG ne s’exprime que dans les pièces fertiles alors que AP2 seulement dans les pièces stériles. Quand on inactive AP2, alors AG est retrouvée partout. Quand on inactive AG, alors AP2 s’exprime partout. Interprétation : ag et ap2 sont deux gènes qui s’inhibent l’un l’autre. AG empêche l’expression de ap2 dans les pièces fertiles et AP2 empêche l’expression de ag dans les pièces stériles. Chacun de ces gènes donne l’identité des pièces florales : il s’agit de gènes du développement. 2.2 – Quand on surexprime mir, cela induit une fleur de type apetala2, c’est-à-dire sans AP2. L’idée est que mir inhibe ap2. A vérifier ! Plante sauvage = témoin : ARN et protéines sont tous retrouvés Pistes UBQ5 et PEPC = pistes validant les expressions, extractions et révélations des différents essais. Analyse Plante surexprimant mir : la présence de l’ARN MIR172 est bien supérieure au témoin (cela valide l’expérience) mais les ARN totaux ne sont pas augmentés : seul mir est donc surexprimé. La quantité d’ARNm d’AP2 semble inchangée par rapport au témoin mais la protéine AP2 est absente. Interprétation : le gène mir est transcrit en ARN MIR172 qui empêche la traduction de l’ARN d’AP2 en protéine AP2. Analyse Plante agamous : sans la protéine AG exprimée dans la plante, l’ARN MIR172 est quasiment absent (mais pas les autres ARN). L’ARNm AP2 est de quantité identique au témoin mais la protéine AP2 est fortement présente, plus que sur le témoin. Interprétation : cela conforte notre hypothèse car sans ARN MIR172, la protéine AP2 semble davantage traduite. De plus, on peut aussi postuler que la protéine AG active la transcription du gène mir. 2.3 – Le promoteur fort permet d’augmenter la transcription des ARN d’AP2 normal ou muté. Analyse des phénotypes P-AP2 : fleurs de type sauvage : la quantité d’AP2 n’influence pas la mise en place des pièces florales. P-AP2m : la fleur est de type agamous : c’est-à-dire comme si l’ARN MIR172 était absent. MIR172 ne s’exprime que dans les pièces fertiles des plantes sauvages, c’est-à-dire là où est exprimé AG mais pas AP2. Analyse des gels Les résultats sont validés grâce aux pistes d’ARNm UBQ5 et de protéine PEPC. Une plante sauvage exprime peu (voire pas) le gène AP2. Si on surexprime AP2, le taux d’ARNm AP2 est multiplié par 4 mais il y a peu d’effet visible sur la protéine AP2 (+ 10%). Si on surexprime la protéine AP2 mutée, le taux d’ARNm P-AP2 est multiplié par 6,1 et la quantité de protéine AP2 est triplée. La forme mutée de ap2 donne un ARNm AP2m qui n’est pas complémentaire de l’ARN MIR172 présent dans la cellule. Interprétation : pour que MIR172 interfère dans la traduction de l’ARNm d’AP2, il faut une complémentarité des séquences entre l’ARN MIR172 et l’ARNm d’AP2. Il s’agit d’interférence.