Laboratoire #3 - Collège Lionel

101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies
Hiver 2015
Bactériologie
L4. IDENTIFICATION BACTÉRIENNE
1. OBJECTIFS
 Identifier une bactérie inconnue à l’aide de tests
microscopiques, bactériologiques et enzymatiques.
 Déterminer sa sensibilité à divers antibiotiques par un antibiogramme.
2. INTRODUCTION
2.1. Diversité des bactéries.
Il existe des milliers d’espèces bactériennes et probablement encore plus qui ne sont pas connues. Ce
labo porte sur l’identification d’espèces fréquemment rencontrées en santé.
 On les trouve dans la flore normale humaine ou dans notre environnement immédiat.
 Elles peuvent causer des infections alimentaires ou nosocomiales (en cours de traitement médical).
2.2. Diversité des tests.
De nombreux tests et milieux de culture servent à leur identification. Cependant,
 L’interprétation d’un test n’est pas toujours très nette et repose en partie sur l’expérience.
 Les résultats ne sont pas toujours constants à 100%; une identification peut nécessiter de nombreux
tests différents (>20) afin de compenser pour certains résultats parfois contradictoires.
 L’identification repose sur un choix judicieux des tests, selon l’infection et les symptômes observés.
2.3. Types de tests.
Dans ce labo, nous utiliserons des techniques classiques répandues en microbiologie :
 Tests microscopiques. La coloration de Gram permet de différencier les parois des bactéries «Gram
+» et «Gram -» et permet d’orienter correctement le choix des autres tests.
 Tests bactériologiques et biochimiques. Ces tests varient
1o Selon leur composition
o Milieu sélectif : favorise ou inhibe la croissance de certaines bactéries.
o Milieu différentiel : distingue les bactéries qui y croissent (ex : par coloration spécifique).
2o Selon les conditions d’incubation : température variable, aérobie ou anaérobie (sans O2).
 Tests enzymatiques. Mise en évidence d’enzymes spécifiques aux bactéries recherchées.
2.4. Antibiogramme.
L’antibiogramme est un test de croissance sur gélose servant à vérifier l’efficacité d’un antibiotique.
Sécurité au laboratoire
Sarrau
Asepsie
Port du sarrau obligatoire.
Bactéries : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo.
En cas de doute, nettoyer soigneusement.
Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo.
Brûleur
Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.
Rappel
Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo.
Contamination
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Hiver 2015
3. MANIPULATIONS. Consignes en démo suivant les Fiches techniques de bactériologie. [1]
3.1. Familiarisation avec les tests enzymatiques catalase et oxydase
Chaque équipe effectue les 2 tests avec chacune des bactéries fournies, de manière à observer des
résultats + et -. Noter les observations à la section des résultats.
Tests enzymatiques
Bactéries
Pseudomonas fluorescens Escherichia coli
Oxydase
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Catalase
3.2. Identification d’une bactérie inconnue et antibiogramme.
Chaque équipe reçoit une culture pure d’une bactérie inconnue et tente de l’identifier en suivant la
démarche proposée à l’Annexe 1. [2]
NB. Tous les tests sont effectués en équipe sauf la coloration de Gram qui est effectuée individuellement et
approuvée par le professeur avant de poursuivre l’identification.
1. Bien noter le numéro de la bactérie inconnue.
2. Effectuer une coloration de Gram (2 lames par élève, au cas où) et observer à immersion (G: 1000X).
Noter le Gram, la morphologie et les types d’arrangements observés. Faire valider par le professeur.
3. À l’aide d’une anse bactériologique stérile, ensemencer par la technique des 4 stries
 Une gélose au sang; identifier, sceller au papier Parafilm et incuber à 37oC pendant 24 hres.
 Une 1ère gélose nutritive; identifier et incuber à 37oC pendant 24 hres en anaérobie (sans Parafilm).
4. À l’aide d’un écouvillon stérile, ensemencer une 2e gélose nutritive pour réaliser un antibiogramme.
5. Selon les résultats obtenus avec la coloration de Gram, effectuer les tests d’identification suggérés à
l’Annexe 1. Faire valider vos choix par le professeur ou la technicienne.
4. MÉDIAGRAPHIE
1. Collège Lionel-Groulx, Hiver 2014. Fiches techniques de bactériologie. Microbiologie et biotechnologies
(101-NE2-LG).
2. Ikram M., (1994), Bacteriology for veterinary technicians, Amer. Vet. Pub., 150 p.
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5. RÉSULTATS
Hiver 2015
NOMS : _________________________
_________________________
5.1. Tests enzymatiques sur bactéries connues.
Tests enzymatiques
Oxydase
Observation : Mauve ou incolore
Pseudomonas fluorescens
Bactéries
Escherichia coli
Interprétation : +/ Catalase
Observation : Avec ou sans bulles
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Interprétation : +/ 5.2. Bactérie inconnue.
No de l’inconnue : _____
Coloration de gram
Morphologie
Arrangements
Couleur
Interprétation (+/ -)
Test enzymatique :
Observation
Interprétation (+/ -)
Gélose sélective et différentielle:
Croissance (+/-)
Observation
Interprétation (+/-)
Gélose au sang
Apparence/colonies
Hémolyse
Gélose anaérobie
Croissance (+/-)
Interprétation
CONCLUSION :
5.3. Antibiogramme.
Antibiotique
Zone d’inhibition
(mm)
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Sensibilité
(résistante, limite, sensible)
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Hiver 2014
Annexe 1. DÉMARCHE D’IDENTIFICATION
BACTÉRIENNE
Hiver 2014
spécimen
P. Masse, modifié de Ikram M. 1994
4 stries
sang
Tapis/écouvillon
4 stries
nutritive
ANTIBIOGRAMME
nutritive
Morphologie
Des colonies
Hémolyse α,β,γ
ANAÉROBIE
GRAM
coques +
arrangement
staph
CATALASE
+
petits bacilles +
grands bacilles +
bacilles --
CATALASE
Bacillus sp
OXYDASE
strep
+
-
Listeria sp.
Corynebacterium sp.
Staphylococcus sp
+
-
croiss+
man lécit +
MANNITOL-SEL
Staphylococcus
aureus
man+
Enterobacteriaceae
Ex: Escherichia coli
Ex: Proteus vulgaris
Pseudomonas sp.
ex: P. fluorescens
TSI
Chartres d’interpretation
ET/OU
Staphylococcus
epidermidis
S. faecalis
ET/OU
man-
man-
hém γ
croiss±
man +
lécit -
MANNITOL-SEL
BSA
man+
BACILLUS
Erysipelothrix sp.
Actinomyces sp.
Streptococcus sp
-
B. cereus
B. subtilis
MacConkey
hém α
S. pneumoniae
hém β
S. agalactiae
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Lac-
Lac+
Pseudomonas
Proteus
E. coli