des cellules souches

Les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH)
- Définition
- Fonctions / développement embryonnaire
- Niche et motilité
- CSH en thérapies
Matthieu ROULEAU, PhD
INSERM U898 (Faculté de Mèdecine)
[email protected]
Qu’est-ce qu’une cellule souche?
Quelle est sa fonction au sein d’un tissu
ou d’un organe ?
Une cellule souche va assurer:
l’homéostasie à long terme du tissus/organe
Maintien tout au long de la vie de l’individu de la
fonction du tissu/organe
la réparation du tissus en cas de lésion
Qu’est-ce qu’une cellule souche?
Une cellule souche possède les caractéristiques
uniques de:
 s’auto-renouveler indéfiniment ou de
manière prolongée
 se différencier c’est à dire produire
différentes cellules spécialisées
(différenciées)
Notion de Plasticité
Différents niveaux de plasticité
Totipotence :
capacité à générer toutes les cellules d’un organisme
(y compris le tissu extra-embryonnaire) pour former un être vivant
structuré multicellulaire = œuf fécondé
Pluripotence :
capacité à générer toutes les cellules d’un organisme
= les cellules souches embryonnaires (ES)
Multipotence :
capacité à générer certaines cellules constitutives
d’un organe = cellules souches adultes tissulaires
Unipotence :
capacité à générer un seul type de cellules =
progéniteurs unipotents (maturation fonctionnelle d’une cellule)
Les différent types de cellules souches
iPS cell (cell. Souches
Pluripotentes induites)
Prolifératives
Lignées
cellulaires
Quiescentes,
Faible nombre
Accès difficile
Culture difficile
Difficiles à étudier
Caractéristiques typiques des cellules souches tissulaires
Auto-renouvellement : division cellulaire qui engendre au moins une cellule fille
qui conserve le potentiel souche
Multipotence : capacité à engendrer des cellules progénitrices de tous les
types cellulaires composant le tissus
Quiecence in vivo,
Caractéristiques clefs pour assurer
l’homéostasie/le renouvellement du
tissu/réparation tissulaire
mais parfois fort taux prolifératif in vitro
Notion de holo-, méro- et para-clones (Barrandon & Green PNAS 1985)
Très faible nombre in vivo
Absence de marqueur spécifique
Cellules difficiles à analyser
Notion de « niche » une structure responsable du maitien de la CS dans un
état de non différenciation
Les différent types de cellules d’origine hématopoiétique
Auto-renouvellement
Cellules
quiescentes
Cellules souches
multipotentes
CSH
(0.003%)
CD34+
Multipotence
CD34+
progéniteur commun
myéloide
Progéniteurs:
Cellules
multipotentes
Cellules
prolifératives
progéniteur
commun
lymphoide
Facteurs de croissance:
EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF,
etc….
myélocytes
granulocyte myélocytes eosinophiliques
monocyte basophiliques
Précurseurs:
cellules engagées
Cellules
différentiées
cellule T
eosinophiles
mégakaryocytes
globules
monocytes/neutrophiles basophiles
CD4+
+
rouges CD41
macrophages
CD8+
CD33+
1011 cellules/jours
plaquettes
CD38+
cellule B
CD19+
1961-63: Till et McCulloch identifient les ”CFU-S”:
1ère évidence de cellules multipotentes
CFU-S: Colony-forming unit-Spleen
(1) Différenciation
Irradiation létale
Nodules (Cellules érythroïdes,
granulocytiques, macrophages…)
8-12 jours
(rate)
Moelle osseuse
(3) Auto-renouvellement (partiel)
(2) Clonogénicité
Cassures ADN
8-12 jours
Moelle osseuse
Irradiée (faible dose)
MAIS CFU-S ≠ CSH car ne donnent pas de lymphocytes
Auto-renouvellement
Cellules
quiescentes
Cellules souches
multipotentes
CSH
CD34+
Multipotence
Progéniteurs:
Cellules
multipotentes
progéniteur commun
myeloïde
Cellules
prolifératives
CD34+
CFU-S
CFU-GEMM
progéniteur
commun
lymphoïde
Facteurs de croissance:
EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF,
etc….
CFU-Meg
Précurseurs:
cellules engagées
Cellules
différentiées
CFU-E
myélocytes
granulocyte myélocytes eosinophiliques
monocyte basophiliques
CFU-GM
CD38+
eosinophiles cellule T
globules megakaryocytesmonocytes/
neutrophiles basophiles
+
CD4+
rouges CD41
macrophages
CD33+
1011 cellules/jours
plaquettes
CD8+
cellule B
CD19+
Méthodes expérimentales de caractérisation des CSH
Difficultés:
1) Absence de marqueurs spécifiques > combinaison de marqueurs
CSH souris
CSH homme
CD34low/Sca-1+
Thy1+/low
CD38+
c-kit (CD117)+
Lignage-
CD34+
Thy1+ (CD90)
CD38low/c-kit-/low
Lignage(14 marqueurs de diff.)
(14 marqueurs de diff.)
2) Différenciation spontanée et faible expansion des CSH in vitro
3) Identification fonctionnelle a posteriori
Detection des CFU:
Colony forming unit
Test de reconstitution in vivo
 Capacité à régénérer un système hématopoïétique complet à long-terme chez
une souris irradiée
Irradiation létale
2)
1) Survie (progéniteurs),
Prise de greffe (% chimérisme)
2-5 mois
3) Transplantation en serie
Seul test des CSH les plus
pluripotentes!!
Moelle osseuse/CSH
Seule 1 sur 10 000 cellules de moelle osseuse
possède cette capacité de reconstitution à long terme
Dévelopment embryonnaire des CSH
Succession de sites pour l’hématopoïèse:
1) Le sac vitellin (extra-embryonnaire)
Hémangioblastes
(Cellules souches endo/hémato)
- pas de CSH pluripotentes,
- érythrocytes primitifs,
- ne participent pas à l’hématopoïèse adulte
Ilôts sanguins
2) La région aorte-gonade-mésonephros (AGM): 1er site des CSH
- CSH pluripotentes (faible nombre),
- Progéniteurs multipotents,
- pas de différenciation in situ
- participent à l’hématopoïèse adulte
3) Le foie fetal: 1er site d’une hématopoïèse complete
- Colonization des CSH pluripotentes de l’AGM
- expansion des CSH (nombre définitif)
- différenciation importante
Migration des cellules du foie vers:
4) Le thymus fétal
5) La rate fétale
6) La moelle osseuse fétale et adulte
LT-HSC = long term HSC
ST-HSC = short term HSC
CMP =
Common
Myeloid
CLP =
Common
Lymphoid
Progenitor
Differentiated cells
Caractéristiques marquantes
Choix possible
entre autorenouvellement
et
differenciation
Multipotence
Auto-renouvellement
Peuvent s’expandre
temporairement mais
continuent à se
différencier
Cellules
matures
différenciées
fonctionnelles
Unipotence
Pas d’auto-renouvellement
Notion d’Auto-renouvellement
Homéostasie tissulaire :
division symétrique vs asymétrique
Division cellulaire symétrique
2 SC
Auto-renouvellement
symétrique
2 cellules
engagées
Division cellulaire asymétrique
SC
Cellule engagée
Différenciation
symétrique
La division d’une cellule souche est asymétrique :
les cellules filles ne sont pas identiques, et
seule une des deux est identique à la cellule mère
Maintien d’un nombre constant de cellules souches (SC)
Notion d’Auto-renouvellement
Homéostasie tissulaire :
division symétrique vs asymétrique
Division cellulaire symétrique
2 SC
Division cellulaire asymétrique
SC
Cellule engagée
Auto-renouvellement
symétrique
Expansion des CSH dans le foie fœtal;
Reconstitution hématopoiétique après déplétion (chimiothérapie, …)
Les “niches” des cellules souches: des environnements ultra-spécialisés
Follicule pileux
Moelle osseuse
Crypte intestinale
Shofield (1978):
1) Site anatomiquement défini
2) Maintien des fonctions des CSH
3) Inhibition de la différenciation
4) Contrôle nombre de CSH
5) Capacité de réversion (?)
La “niche” des CSH dans la moelle osseuse
Endosteum
(Ostéoblastes
Ostéoclastes)
Les constituants de la “niche” des CSH
1) Les cellules
Ostéoblastes (sécretent SDF-1, contrôlent le nombre de CSH…)
Cellules stromales (ex: cellules réticulaires)
Cellules endothéliales
2) Facteurs solubles: Cytokines, hormones
etc…..
3) Matrice extracellulaire : interface
avec la matrice osseuse
SDF-1/CXCR4
Différentes niches des CSH?
Niche de quiescence
Niche d’auto-renouvellement
Niches fonctionnelles:
Niche de quiescence,
niche d’auto-renouvellement,
niche de prolifération/différentiation?
Niches anatomiques:
Niche ostéoblastique et
niche vasculaire?
Niche d’auto-renouvellement
Les CSH et thérapies cellulaires
1- les transplantations
1) Restorer une fonction chez des patients avec mutations génétiques:
Cancers du système hématopoïétique (leucémies)
Maladies génétiques (immunologiques, métaboliques)
>
Allogreffe
2) Conserver et re-injecter les CSH saines après traitement:
Tumeurs solides,
Lymphomes ou certaines leucémies
>
Autogreffe
Autogreffe
Allogreffe
Maladies non-malignes
• Aplasies médullaires (Fanconi)
• Déficits immunitaires combinés
sévères
• Hémoglobinopathies
• Déficit enzymatique (Gaucher)
• Autres (ostéopétrose)
• Maladies auto-immunes
• Maladies génétiques+
thérapie génique
Maladies malignes
• Leucémies aiguës myeloïdes et
lymphoblastiques
• Leucémies myéloïdes chroniques
• Syndromes myélodisplasiques
• Lymphomes, Myélomes,
• Leucémie lymphoïde chronique
• Syndromes myéloprolifératifs
• Tumeurs solides
• Myélomes
• Lymphomes non-hodgkiniens
• Maladie de Hodgkin
• Tumeurs solides (cancer du
sein, neuroblastomes...)
3 propriétés fondamentales des CSH/progéniteurs
pour la réussite de la greffe:
1) La multipotence:
Obtention de tous les types cellulaires hématopoiétiques
2) L’auto-renouvellement:
Assure le maintien du système hématopoïétique reconstitué à long terme
3) La capacité de “homing” (domiciliation):
Permet aux CSH de retourner dans la moelle osseuse après injection I.V.
La présence des progéniteurs est importante pour la reconstitution à court-terme!
1961: Till et McCulloch:
1ère évidence de
cellules multipotentes
CSH mobilisées par G-CSF
Eliane Gluckman,
Paris
E Donnall Thomas
Modèles
expérimentaux
Cellule souche
leucémique
Alain Fisher, Paris
CSH et thérapie
génique
Sources de CSH en transplantation
1- Moelle osseuse (ponction sous
anesthésie générale: 500-1200ml)
2- Sang périphérique par cytaphérèse
(Cellules CD34+ mobilisées avec G-CSF: 0.05%  5%)
3- Sang de cordon ombilical
Registre France Greffe de Moelle
http://www.dondemoelleosseuse.fr
Etapes de la transplantation de CSH
Collecte des CSH du donneur
(allogreffe)
1- Conditionnement
(irradiation, chimiothérapie)
2- Transfusion veineuse des CSH
“Homing” vers la moelle osseuse
3- Traitement adjuvant
Stockage des CSH du donneur
“purge” éventuelle
(autogreffe)
Transfusion globules rouges, plaquettes
Immunosuppression
Antibiotiques, G-CSF
4- Reconstitutions hématologique
(12 à 30 jours) et immunologique (1 an)
Migration/Trafficking des cellules CSH
Mécanismes moléculaires
Homing / prise de greffe
sang
moelle
osseuse
Mobilisation
Situations
physiologiques
Très faible
recirculation
permanente
à l’état
normal
( 0.01%
CD34+ dans
le sang)
Mais ??
Procédures médicales
Greffe de CSH
Collecte de CSH
(G-CSF)
CXCR4
cellule
Mouvement
SDF-1
La chimiokine SDF-1 régule le homing
des CSH
(Chimiokines: cytokines chimioattractantes)
Gradient de chimiokine
Anti-SDF-1
Souris NOD/SCID
Cellules CD34+
CFU-GM
CFU-E
CFU-GEMM
Cellules CD34+
Anti-CD34 (CTL)
Cellules CD34+
Anti-CXCR4
CXCR4
CD34
moelle
Test de détection des colonies
humaines in vitro
Mécanisme de mobilisation
des CSH??
G-CSF induit une réduction de SDF-1 dans la moelle osseuse
Moelle osseuse (homme)
Moelle osseuse (Souris)
SDF-1 (ng/ml) (
)
SDF-1
G-CSF
20
4
15
10
3
*
2
5
1
**
0
CTL 1 jr
5 jrs
G-CSF
0
CFC-C dans le sang
(x103/ml) ( )
CTL
G-CSF
Système nerveux
Activation des
ostéoclastes
Protéases neutrophiliques
ARNm
SDF-1
Inhibition des
ostéoblastes
protéine
SDF-1
Diminution de SDF-1
dans la moelle osseuse
Mobilisation des CSH/progéniteurs
Protéases
protéine
SDF-1
Stratégies actuelles pour améliorer les transplantations
Expansion du greffon
Cytokines,
Facteurs de croissance
Sang
Homing
Expression de CXCR4
Inhibition de CD26 (qui
Moelle
osseuse
Mobilisation
GM-CSF
AMD3100 (inhibiteur de CXCR4)
dégrade SDF-1)
Retention,
Auto-renouvellement
Activer signaux de la niche:
parathormone (augmente
ostéoblastes)
Niche des CSH
Les CSH et thérapies cellulaires
Réparation cardiaque (essais cliniques 2005- )
• Injectées au niveau de la lésion cardiaque après infarctus
• Les CSH agissent en activant l’angiogénèse
• Efficacité non encore démontrée
CSH et thérapies géniques (essais cliniques 2000- )
 Culture des CSH in vitro (cytokines) et transfert de gène (virus)
Immunodéficiences (ADA-SCID, X linked-SCID, X linked-CGD)
Maladies métaboliques
Résultats: Bonne correction, Cellules T fonctionnelles
MAIS: 4/10 enfants (Fisher, Paris) et 1/10 (Londres) ont développé des
leucémies (LMO2)
Les CSH et induction de tolérance
 expériences limitées actuellement à des modèles animaux
• utilisation de CSH “purifiées” (élimination des lymphoT contaminant
pour éviter les problèmes de GVHD) allogéniques
• transplantation de ces CSH (sans compatibilité de MHC et/ou de mHC)
 Reconstitution d’un système hématopoiétique équivalent à celui du
donneur
• transplantation d’un organe solide issus du même donneur que les CSH
Absence de rejet de ce greffon.
Il y a eu induction de tolérance spécifique :
Un greffon obtenu d’un donneur tierce sera rejeté.
Les CSH et induction de
tolérance (suite)
> 3000 CSH (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet
> 6x106 cell de MO (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet
Transplantations contrôles :
> 3000 CSH (H-2b) + cœur “tierce”(H-2k) = rejet à 100%
> cœur (H-2d) tpl ds souris C57BL/Ka (H-2b) = rejet à 100%
Gandy et al
Transplantaion 1998
Les cellules souches pluripotentes iPS
Reprogrammation
Induced pluripotent
stem cells
Avantages:
Cellules différentiées
évite pb éthique hES
autologues
Problèmes à résoudre pour la thérapie:
Utilisation de virus
Protocoles de différenciation
Thérapie génique à partir de cellules iPS
HbSS
HbA
2/2
A/T
2/2S
Science, nov 2007
(4) Transplantation
des cellules CSH
(1) Obtention de cellules
iPS autologues
LoxP c-myc LoxP
Gène muté
Gène sain
(3) Différenciation en cellules CSH
(2) Correction du gène muté
(recombinaison homologue)