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La sélection du TOP ovule
XIIème journées Liégeoise de Gynécologie
Obstétrique
Nathalie Lédée
Connaitre le potentiel d’implantation de(s)
embryons que l’on va transférer est crucial

Pour augmenter les taux de succès en FIV-ICSI tout en réduisant
les risques de grossesse multiple
- Pour promouvoir la politique du transfert unique d’embryon
-Pour diminuer la mortalité et morbidité maternelle et foetale
associée au technique d’assistance médicale à la procréation
 L’analyse de la morphologie de l’embryon pre-implantatoire est
importante, mais en général insuffisamment informative (Guerif, et al.
2007).
 Il n’EXISTE PAS actuellement de marqueur morphologique de l
qualité ovocytaire individuelle. La fonction ovarienne est explorée en
terme de reserve ovarienne globale
 5% des ovocytes collectés aboutiront à la naissance d’un enfant
De nouvelles perspectives
emergeantes tentent de définir la
qualité ovocytaire et embryonnaire
Granulosa cells
Feuerstein et al, 2007
Assou et al, 2008
Hamel et al, 2008
Katz-Jaffe et al, 2006
Dominguez et al, 2008
Tabiasco et al, 2009
Seli, 2007-2008
Scott, 2008
Embryos conditioned Culture Media
Follicular fluids
Cytokines and chemokines dans le liquide
folliculaire
Randomised population ICSI randomisée
(n=71) puis (112)
Ponction d’ovocyte: follicule par follicule
530 (puis 953) individual follicular fluids with mature oocytes
selection retrospective des liquides folliculaires individuels pour
lesquels un embryon avait été obtenu par fecondation in vitro et
transféré
Echantillons anonymes ont analysés en aveugle
Determiner leur concentration de cytokines/ chemokine contents
EMBIC plaform (bead-based multiplex sandwich immunoassay - MP piccinni, Florence)
Taux d’implantation et de naissance Staging de l’embryon J2
Est-ce que des biomarqueurs
immunologiques seraient informatifs de la
compétence ovocytaire ?
Cytokines /chemokines/ facteurs de croissance
IL-1beta, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-alpha,
TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin,
MIP-1-alpha, and MIP-1-beta, LIF
Methode Luminex
Piccini
(Elisa en multiplex sur microbilles): Université de Florence par MP
Un seul facteur folliculaire est apte à distinguer les embryons
qui aboutiront à une naissance de ceux ayant échoué :
le Granulocyte Colony Stimulating factor (G-CSF ou CSF-3)
AuROC: 0.84 [0.75-0.90] (p=0.0001)
•
Les embryons qui ont abouti à
une naissance avait un taux de
G-CSF
dans
leur
liquide
folliculaire superieur à ceux
n’ayant pas abouti à une
grossesse dans 84% des cas.
Définir la sensibilité et specificité
optimale du test.
Area under curve for FF-G-CSF as a predicting factor of delivery
100
80
Sensitivity
•
60
40
20
0
0
20
40
60
100-Specificity
80
100
L édée et al, Human reprod, 2008
Implantation and delivery rates as a function of the
follicular fluid G-CSF concentrations in individual FF
From the AUC-ROC curve
G-CSF concentrations
Number of embryos
Mean implantation Mean delivery
(Luminex Biorad)
concerned
rate
rate
45
9%
6%
62
18%*
15.6%*
25
44% **
44%**
Low G-CSF
• Le seuil Bas
La specificité la plus haute à (<20 pg/ml)
prévoir l’échec
Intermediate G-CSF
(Between 20 to 24
• Le seuil haut
La sensibilité la plus haute
pour prévoir le succés
pg/ml)
High G-CSF
(>24 pg/m)l
*p=0.0005 and 0.001 between intermediate and low G-CSF for implantation and delivery
rates
** p<0.0001 between high and low G-CSF for both implantation and delivery rates
Lédée et al, HR, 2008
La variation de concentrations de G-CSF
dans une même cohorte
EMBRYO CHOICE
Variation of individual FF-GCSF concentrations in a cohort of embryos
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
A
B
C
D
E
F
G
patient identification
H
I
J
Comparaison de plusieurs méthodes de dosages
Luminex R&D, Luminex Biorad, Elisa R&D
100
Sensitivity
80
G_CSF Luminex Biorad
G_CSF luminex R&D
G-CSF R&D Elisa
60
40
20
0
0
20 40 60 80 100
100-Specificity
Biorad Luminex technology AuROC curve: 0.82 [0.73-0.89] (p=0.0001): Excellent discrimination
R&D System Luminex at 0.73 [0.65-0.79] and significant (p=0.002): Acceptable discrimination
G-CSF ELISA, AuROC=0.60, p=0.19: No discrimination
Comparaison des taux de naissance en fonction du taux
de G-CSF folliculaire évalué par trois méthodes
differentes.
Luminex R&D
Luminex Biorad
ELISA
FF G-CSF (pg/ml)
<24.9
>24.9
<20.54
>20.54
<149
Number of embryos
143
55
60
138
delivery rates
12%
P value
0.035
22.3%
86
10.6 %
0.008
24.2 %
14.3%
>149
62
19.8%
0.30
Lédée et al, submitted, 2009
Impact of hyperstimulation
variations of follicular G-CSF in function
of the ovarian response to the ovarian stimulation
25
*
20
*
15
CAT RESPONSE
A
B
C
10
5
0
G-CSF Elisa/10
A oestradiol <1500 pg/ml
G-CSF rd luminex
B- 1500<oestradiol<3000
G-CSF biorad
C- oestradiol>3000 pg/ml
Les cycles de FIV/ICSI en cycle natural
modifié comme modèle experimental pour
explorer l’environnement de l’ovocyte
• Tracabilité du follicule à la naissance est parfaite (1 ovocyte- 1 liquide
folliculaire- 1 embryon- 1 enfant)
Etude rétrospective en aveugle des liquides folliculaires des follicules
dominants- Collaboration avec R. Frydman
• Inclusion: les premières 83 tentatives de FIV/ICSI en cycle naturel
modifié
• Méthode: Multiplex bead-based Assay (Biorad)
IL-1beta, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13,
IL-15, IL-17, IFN-alpha, TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF,
FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP-1-alpha, and MIP-1-beta,
LIF
Protocole: cycle naturel modifié
• Monitoring des patientes
• Administration of GnRH antagonist (Cetrotide) 0.5 (0.25x2/day) +
Gonadotrophins 150 IU/day quand la taille du follicule >13 mm
• Administration of hCG 5000 IU pour la maturation finale
Echo
HD
GonadoT150 IU/d
Cetro 0.25/d
HCG 5000IU
OR
≥13mm
T
≥16mm
D1
Rongières-Bertrand C., Frydman R. et al, Hum Reprod, 1999
Castelo Branco A., Frydman R. et al, Fertil Steril, 2005
Mendez-Lozano D., Frydman R. et al, RBM Online 2008
Caractéristiques des patientes
Pregnant group
Birth
No
pregnancy
No oocyte
collected
No embryo
transferred
Abortion
Number of
patients
19
6
29
10
19
Mean Age
(Years)
33
34
33.8
33.7
34.3
Mean number
of previous
conventional
attempt
2.5
2
3
2.4
2.5
58%
-
-
% of TOP
transferred
78%
66%
Trois proteines predictive de l’issue: Naissance par ponction
G-CSF (a), and Interleukin-17 (b) and -7 (c)
IL-17 AuROC: 0.77
G-CSF AuROC: 0.78
A-
B-
Follicular GCSF
Follicular IL_17
100
100
80
Sensitivity
60
60
40
Sensitivity 89.5 %
Specificity 54.3 %
For FF G-CSF >12.08 pg/ml
40
20
Sensitivity 89.5 %
Specificity 60.9 %
For IL-17 > 0 pg/ml
20
0
0
0
0
20
40
60
80
100-Specificity
100
20
40
60
80
100-Specificity
100
IL-7 AuROC: 0.75
C-
Follicular IL_7
100
80
Sensitivity
Sensitivity
80
60
40
Sensitivity 63%
Specificity 84%
For IL-7 >32.3 pg/ml
20
0
0
20
40
60
100-Specificity
80
100
G-CSF, IL-7 et -17 et potentialité de
naissance
Number of
Samples
Pregnancy/OPU
Pregnancy/ET
Birth/OPU
Birth/ET
OPU/ ET
G-CSF
IL-7
IL-17
HIGH
46/33
39% (18/46)
LOW
37/21
18.9%(7/37)
HIGH
23/17
56%(13/23)
LOW
60/36
20%(12/60)
HIGH
39/27
LOW
44/27
*
56%(18/33)
*
33%(7/21)
37%(17/46)
**
51.5(17/33) %
**
5.4%(2/37)
9.5%(2/21)
52%(12/23) ***
70.6%(12/17)***
33%(12/36)
11.6%(7/60)
19%(7/36)
41%(16/39)*
59%(16/27)
38.4%(15/39)***
55%(15/27)
20%(9/44)
33%(9/26)
9%(4/44)
14.8%(4/27)
***
76%(13/17)
**
***
1
2
*** p<0.001, ** 0.01<p<0.001,* 0.05<p<0.01
Lédée et al, submitted
Combinaison du G-CSF et de l’interleukine-7 pour predire la naissance
G-CSF and IL-7 combinaison
Pregnancy
Pregnancy
Birth/OPU
G-CSF
/OPU
/ET
IL-7 HIGH
54%(12/22)*
75%(12/21)*
50% (11/22) ***
IL-7 LOW
25% (6/24)
35% (6/17)
25% (6/24)
IL-7 HIGH
50% (1/2)
100% (1/1)
50% (1/2)
IL-7 LOW
17% (6/35)
30% (6/20)
Birth/ET
68% (11/16)***
HIGH
G-CSF
35.3% (6/17)
100%(1/1)
LOW
1
2.8% (1/36)
5% (1/20)
Correlation between
G-CSF, interleukin -7 and -17
Cytokines, facteurs de croissance et les chemokines
dans le fluide folliculair et la morphologie de
l’embryon correspondant
Aucun des facteurs n’étaient apte a discriminer les
embryons TOP des non TOP
TOP quality
embryo, D2
TOP quality
embryo, D3
no TOP Embryos, D2
Le mécanisme par lequel le G-CSF agit est inconnu
• La proteine et le recepteur sont présent dans l’ ovaire - granulosa
cells (Salmassi, et al. 2004) / secretion en phase folliculaire préovulatoire
• Après la sécretion devient active dans l’endomètre en phase
lutéale/placenta avec une augmentation dans le serum si une
grossesse survient (Yanagi, 2002- Salmassi et al, 2005)
• Le G-CSF est connu comme une molecule augmentant la
tolérance immunitaire avant greffe
(T reg cells and dendritic cells recruitment, IL-10 secretion, regulation of complement, control of Th-1
cytokines)
Isi l’on considère la grossesse comme une semi-allogreffe, la question d’une tolerance
maternelle locale et programmée devient essentielle
• G-CSF en injection SC a été montré comme une veritable alternative de
traitement dans le cadre des fausses couches à répétition dans un essai
randomisée placebo versus G-CSF en simple aveugle (Scarpellini, 2009)
Pour Conclure
• Témoins non invasif de la compétence
ovocytaire dans le liquide folliculaire existent
• Ces résultats ont besoin d’être confirmé par
des études prospectives, multicentriques,
randomisées.
• Si tel est le cas: outil formidable non invasif
pour définir la compétence ovocytaire, définir
quel femme requiert une hyperstimulation et
appliquer une politique de transfert guidée et
adaptée a chaque patiente
EMBIC
Collaborative Study supported by the European network
EMBIC (Embryo Implantation Control)
Nathalie Lédée
Gérard Chaouat
Marie Petit Barat
Sylvie dubanchet
Marie pierre Piccinni
Letizia Lombardelli
Sophie Perrier d’hauterive
Carine munaut
Francis Frankennes
Jean Michel Foidart
René Frydman
Agnessia Osipova
Joelle Taieb