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Institut de Génétique et Microbiologie LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRASPÉCIFIQUE CHEZ LES MICROORGANISMES Ibtissem GRISSA Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM Introduction Résultats Discussion Perspectives PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorer les outils Les metagenomes Les métagénomes 2 Introduction Résultats Discussion Perspectives La découverte des CRISPRs (1) spacers Leader DR dégénéré DR TTAGGGTTACGTCCCCCCCGATTCTTGTGACCCTCTTTTTATCACTATGACTAACGTATTGATTTTTATGCTACTCAGGTATT TCACTAAAAAAAGGGTTTTTACGCATTTTGCGCCATTGCTCATTGATAAACATCGGGTTATCCGTATTATCTTACGTTCAC TGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAGGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTA GAAAATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAAGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAGTCAACGCTTCAC TCCCTGCGCGGGGTATAACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA Yersinia pestis CO92 (NC_003143_2 ) 1ère observation : Escherichia coli (Ishino 1987) succession de séquences répétées de 29pb espacées de séquences uniques de 32-33pb. 2 locus séparés de 24 kb (14 et 7 répétitions) 3 Introduction Résultats Discussion Perspectives La découverte des CRISPRs (2) 1991 : découverte d’un CRISPR dans le complexe Mycobacterium tuberculosis Structure présente chez tous les membres du complexe M. tuberculosis Marqueur génétique assez polymorphe pour différencier les souches 1996 : Le spoligotypage pour le typage épidémiologique de M. tuberculosis (Membrane d’oligonuclétides composée de 43 spacers) Obeservations chez les archées : 2 Haloferax volcanii et H. mediterranei (Mojica et col. 1993, 1995) Sulfolobus (She 1994) 4 Introduction Résultats Discussion Perspectives L’acronyme CRISPR TREP Tandem Repeat SRSR Short Regularly Spaced Repeats DVR Direct Variable Repeat LCTR Long Cluster of Tandem Repeat SPIDR Spacers Interspaced Direct Repeats CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Jansen 2002 E. coli DR : 29bp, spacer : 32-33pb CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC H. mediterranei et H. volcanii DR : 30bp, spacer : 33-39pb GTTACAGACGAACCCTAGTTGGGTTGAAGC M. tuberculosis DR : 36pb spacer : 35-41pb GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC 5 Introduction Résultats Discussion Perspectives Un groupe de gènes associés Le système CASS : CRISPR + cas gènes cas spacers Leader DR Jansen 2002 cas1 : réparation de l’ADN cas2 : transposase cas3 : hélicase cas4 : recB exonuclease Makarova 2002 20 gènes impliqués dans la réparation de l’ADN Etude phylogénétique des gènes cas Présence du même DR chez des espèces éloignées Transfert horizontal 6 DR dégénéré Introduction Résultats Discussion Perspectives Transcription du locus CRISPR Tang et col. PNAS 2002 Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archeon Archaeoglobus fulgidus. 7 Introduction Résultats Discussion Perspectives Origine des spacers 2005 : origine des spacers et suggestions sur le rôle du CRISPR Mojica 2005 Pourcel 2005 Bolotin 2005 67 procaryotes Yersinia pestis Y. pseudotuberculosis Streptococcus pyogenes Streptococcus thermophilus S. vestibularis Acquisition du spacer à partir d’éléments génétiques préexistants d’origine extrachromosomique (phages, plasmides) ou chromosomique Génomes analysés Spacers analysés Spacers reconnus phages 67 4500 88 (2%) 47 (54%) plasmides chromosome (Mojica 2005) 10 (11%) 31 (35%) Corrélation avec la résistance aux phages Hypothèse : Le CRISPR est un système immunitaire chez les procaryotes utilisant l’interférence ARN 8 Introduction Résultats Discussion Perspectives Un système de résistance par interférence ARN Modèle d’action du CRISPR Leader sp4 sp3 DR sp2 sp1 DR’ Transcription ARN Cas Cas sRNA Protéines Cas phage Cas sRNA ADN invasif Dégradation du phage 9 Introduction Résultats Discussion Perspectives Evolution de la structure CRISPR Acquisition polarisée adjacente à la séquence leader Perte interstitielle de spacers Les spacers communs renseignent sur un ancêtre commun ADN invasif + + = Cas Cas Leader Leader sp4 sp3 DR sp2 sp1 DR’ sp3 DR sp2 sp1 DR’ Le polymorphisme des spacers est un indicateur phylogénétique 10 Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome Outils informatiques pour faciliter l’exploration, la compréhension et l’utilisation des CRISPRs 11 Introduction Résultats Discussion Perspectives PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Les metagenomes 12 Introduction Résultats Discussion Perspectives Outils informatiques créés Analyse systématique de tous les CRISPRs des génomes séquencés Données Gold Oct. 2005 Utilisation du CRISPR pour 315 génomes complets la phylogénie intra-espèce 804 procaryotes en cours • Créer une base de données • Analyse de la microévolution Analyser les séquences flanquantes Comparaison des CRISPRs Identifier les spacers Construire un catalogue par espèce Stocker les DR Stocker les spacers (tronçons de virus) Effectuer des BLAST CRISPRdb CRISPRcompar Identifier les CRISPRs 13 Introduction Résultats Discussion Perspectives Les programmes utilisés Patscan p1=24...47 15...70 p1 Programmes non spécifiques aux CRISPRs Besoin de traitement manuel supplémentaire Repeat size TRF Consensus pattern (60 bp): Besoin d’automatisation GTGTTCCCCGCGCATCGCGGGGGTTGAAGGGTCAGGTCTGCATCAACGATCGCCCACTCC Définition des limites du DR 14 REPuter Start position Introduction Résultats Discussion Perspectives a A b Création de CRISPRFinder c A d Utilisation de Vmatch (Reputer) -Liste des répétitions maximales ayant une taille bien définie, séparées par des séquences de taille prédéfinie 15 CRISPRFinder Introduction Résultats Discussion Perspectives CRISPRFinder : difficultés (1) ! Y. pestis C092 Positions : 1773655-1773862 Les bornes du DR: DR consensus 29 pb GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAG GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAA GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA GTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAAC GTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA La taille des spacers Clostridium botulinum A3 Positions : 131045- 131754 16 30 pb Entre 21 et 37 pb Introduction Résultats Discussion Perspectives CRISPRFinder : difficultés (2) (4626121) 1 2 3 4 5 6 Shewanella sp. ANA-3 (CRISPR_2) AGGTTTTGCTGCCTTTTCGGCGGGTATC ** ** * * ** ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC TCAAAGTCAACTTGTAAATGACGATTTTCACG 32 AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAT GATGAAGCAGACCACCTCGATTACCCCACGCT ACTATTTATCAAGACCTTCTTTAAAATCAAAC AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAC (4626448) 32 32 32 32 Yersinia pestis KIM (CRISPR_4) (2875721) 1 TTATTGGGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC ** ** 2 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC 3 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC 4 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC Le DR dégénéré (32702) 7 8 9 10 17 GTTATACCCCGCGCAGGGAGTGAAGCGTTGAC 32 TTAAGTTCTTTTTGTCAGCATCTTTAATAAAT CTGAAATACAAATAAAATAAATCGTCGAACAT (2875928) 32 32 Sulfolobus tokodaii str. 7 (CRISPR_2) GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGATTGATCACAATGAGAAGACTGTAAAGCTGATAAAC TGTTGAGGCATAAATTAATCTATCCTTAATGAAAAAT TTCTTCCTCAGCCTCCATTTTGTTTATGATTTGTAGTGCC TTCAATAATCTCTATCTTTCCAAAATCTGTAAATGAAGAC 38 37 40 40 109 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG AAAGCACAGTCAATAACGTTATCTGGTATCATATTATCAAA 41 110 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG CTTTCTCCTTCCCTCTGATCTCTCGCTGAATTGAAAAGA 39 111 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GTAAGTATTGATGCTAACATTGACTTCGCTGTCCCAGGGGC 41 112 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAGG AAGTATAATAACGATAGTACTAAAATTAATTGATCC 36 * * *** 113 GATGATTCTCAAAAGGAATTGATAA (39896) Introduction Résultats Discussion Perspectives CRISPRFinder : difficultés (3) Les petits CRISPRs Aquifex aeolicus VF5 NC_000818_6, positions : 988518-988611 GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC TTTTCGTAAGCTCTTGAAGCGCTTGTTTAAGTTCCT GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC Alignement des leader 18 Introduction Résultats Discussion Perspectives Les grandes étapes de CRISPRFinder Sequence(s) Localisations possibles 25bp - 60bp DR DR 23bp - 55bp Répétition maximale ? Identification des DR candidats CRISPRs confirmés CRISPRs putatifs Vérification de la structure [0.6DR - 2.5DR] DR’ [ 19 2 3 DR , DR ] DR 23bp - 55bp DR Vérification des DR aux extrémités Elimination des Répétitions en tandem Introduction Résultats Discussion Perspectives Création de la base CRISPRdb Filtres ajoutés pour la base Télécharger les génomes complets sur le site NCBI ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria Appliquer CRISPRFinder Filtres sur les CRISPRs putatifs Blast des DR et vérification de la terminaison Vérification de la taille des DR et spacers Vérification manuelle Validation 20 Introduction Résultats Discussion Perspectives Bilan CRISPRdb Mise à jour du 05/06/2008 Des CRISPRs de un à presque 300 motifs de long (moyenne : 23) (22 pour les bactéries et 27 pour les archées) Une espèce peut posséder jusqu’à 20 CRISPRs (Methanocaldococcus jannaschii) 2 ou plusieurs CRISPRs de DR identiques ou différents Les CRISPRs constituent presque 1% du génome qui les portent (1,1% chez Sulfolobus tokodaii) Les souches d’une même espèce ne partagent pas toujours les mêmes CRISPRs 21 Introduction Résultats Discussion Perspectives PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorer les outils Les metagenomes Les métagénomes 22 Introduction Résultats Discussion Perspectives Le CRISPR pour la phylogénie intra-espèce Mécanisme d’évolution par délétion ou par insertion polarisée Analyse de multiples allèles de différentes souches pour un locus CRISPR donné Lorsque l’espèce contient un ou plusieurs CRISPRs Lorsque le CRISPR présente un polymorphisme intraespèce important Espèces jeunes (Y. pestis, M. tuberculosis) ou complexes clonaux (Pseudomonas aeruginosa) contrairement aux espèces plus anciennes (Y. pseudotuberculosis, M. canetti) 23 Introduction Résultats Discussion Perspectives Investigations (1) Identification d’un (plusieurs) CRISPRs Consultation de la base CRISPRdb Utilisation de CRISPRFinder Quantifier le polymorphisme du CRISPR Utilisation de CRISPRcomparison MyCRISPRdb 24 Introduction Résultats Discussion Perspectives Investigations (3) Choisir les amorces PCR : 20-30pb à 40 pb du CRISPR Flankalign CRISPRcomparison Leader F1 sp4 sp3 DR sp2 R1 Manipulations techniques sur une collection représentative d’une espèce (amplification PCR et séquençage) 25 sp1 DR’ R2 Introduction Résultats Discussion Perspectives 26 Analyse des données (1) Constituer un catalogue de spacers http://crispr.u-psud.fr/crispr/Dict/Dict.php Introduction Résultats Discussion Perspectives Analyse des données (2) Fichiers de sortie TableCodedAlleles Organisation des locus CRISPR dans six souches Y. pestis Strain Microtus CO92 KIM Antiqua Nepal516 Pestoides-F Ref-Seq NC_005810 NC_003143 NC_004088 NC_008150 NC_008149 NC_009381 Fichier binaire 27 1 1 1 1 1 1 1 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 Spacers 5 6 1 1 1 1 1 1 7 8 1 1 9 10 1 1 11 1 Introduction Résultats Discussion Perspectives PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorations Les metagenomes des outils Les métagénomes 28 Introduction Résultats Discussion Perspectives Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder CRT PILER-CR Rapidité Rapidité Peu de faux positifs Trouver le DR dégénéré Définition du DR consensus Mais DR dégénéré DR consensus Petits CRISPRs 29 Faux positifs Chevauchement de CRISPRs Plusieurs propositions Petits CRISPRs Introduction Résultats Discussion Perspectives Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder Streptococcus sanguinis SK36, 30 TTTGCAGTCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGATTGGGG ATTTCTGTCCTCTTTAGAGGTGAATTGGG GTTTCCGTCCCCTTTCGAGGTAACTGGGG GTTTCCGCCCCCTTTCGAGGTGACTGGGG GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG GTTTCCGTTCCCTCTCGAGGTGAATGGGG GTTTCAGTACCCTCCCGAGGTCACTGGGG GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGAATGGGA GTTTTCGTCCCCTCCCGAGGTGAATGGGG GTTTCCGTACCCTCTCGAAGTGAATGGGG GTTTCCGTACCCTCGCGAGATGAATGGAG GTTCCCGTACCCTATCGAGCTGACTGGGG TTTTCCGTACCCTTCCGAGGTGAATGGGG GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGTTTGAGG GTTTCCGTACCCTTGCGAGATAACCGAGA GTTTCCGCCCCCTCGCGAGGTGATTGGGG GTTCCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGGGG GTTTCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGAGG TTTTCCGTCCCCTCTCAAGGAGACTGGGA GTTTCCGCCCCCTCCCGAGGTGAATGGGA TTTCTGACATAATCAGGATGGTGTTTATAGTTATGCAGAAAAAGG GTTCTAAATGTTTTGAAGATGTTTCTATGAATCCATCTAGTAT GTTGTTACAAACCTATTTACATATAAGTTTCTAGGTAGTAAGTA TGAATTACTGATTACATTGTATTTAAAAATCATTGGTCTAGCGGA GTTCTAACAGACTAGAGTATTACAGTTACCGAGAACAAACAGACAT GGTCTTACCTATCTTGCTGCTGTTCTTATACACGCTAATGCCGTCTA GTTCTTACAAAATATACTACCGAAGTAAAAGTAGGTAACATTTCATA GTTCTTACTGAAGCGCTCACATCTAACTCCAAATTAAAGCAA GGTCTTACGAAAGCCAGGAAGACCTAAAGGAAGGACAAAATTTCC GGTCTTACATCGCTTGAAACTAAAAGATAGTTATTTTGGAGAAGAA ATTCTTACGCTAGAAAATTGAAACAACAACGTAAAACCTCC TTCTTACACAAAGACGAACACGGCGTATCTCAATTAGGACTTA TTTCTTACAAAGACGTTGCTGTTCCTGTCCTTATTGGCGTTACTAG GTTCTGACCGATTGAGAGTAAAGAGGGCGAAGAAAACTGCTAG TTTCTTACTCAAACTGTACCTAACCTTTATACAGAAGAGAATAT GCTCTCACATAAAGTAGAGATTGTCAAGACTTAAATGAGCAAG TGTCTTACATTCAGGCATTGGAATTTTAGAACTTGATGATTT GTTCTAACCTTTTGACAAAAAACTAGATACTGAATATCTGGAACT GTTCTTACCAAGACAAAGTTGAAGTGTCTGAAGACTTCCTGGC GGTCTTACAAGCTTGCTCACTATGTCTATGAGACTAAGACCTATTT PILER-CR CRT NON NON Oui, mais Oui, mais NON NON Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 31 Introduction Résultats Discussion Perspectives Organisation du CRISPR (1) DR Le DR : DR Taille : 23-47pb, terminaison particulière : (C/G)AA(A)(G/C) Espèce Bacteroides fragilis Streptococcus pyogenes Escherichia coli Yersinia pestis Pyrobaculum aerophilum taille 47 36 36 29 28 25 DR GCTGTTTCCAATGGTTCAAAGATACTAATTTGAAAGCAAATCACAAC GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA CCAGAAATCAAAAGATAGTTGAAAC Thermotoga petrophila 30 GTTTCAATAGTTCCTTAGAGGTATGGAAAC Mycobacterium tuberculosis Structure secondaire (kunin 2008) Clustering des DR (12 groupes) (kunin 2008, Horvath 2008) Diversité d’un CRISPR à l’autre (533 DR distincts pour 873 CRISPRs) Conservation presque parfaite au sein d’un même CRISPR 32 Introduction Résultats Discussion Perspectives Organisation du CRISPR (1) DR Thermoproteus neutrophilus GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGATCAGCTTGACGATCGTGGAGTGTATTACCGACTTCTGCTCCTCGG GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTAGTGGTAATCTCTAATCTCTCTAATGATGTCCTCATTCTCCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTTCATGACCGCATTAAATATATCGGGGTCTTGCATTGCTAC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CCTCGAGGAAGGCGTGGGGATCCCTGGCCAGCAGCTCAGCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTTAACCGCAGAAACTTGTCGATAACTGAAAAAACGGGGTTG Verminephrobacter eiseniae : 294 DRs exactement identiques GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTGTACTCTTATAGAAACGTATTGTGGCCACCTTACGGCGGAGTG GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CAGTCTCCGCGGATGCTTGTGCATCGTTCGGCGCCGACAACTCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG ATCTTCACAGCGTAGTACACCTGCGTGTGGCTGAGGGAGAG GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTCTAGGACGAGGGGCACTATCATTATGCGCCTGTCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCAGCTTGTAGACGTTCTCCATGTATTCATCGATATAGTACA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCCACCAACGTCCTTATCTCTTTTAGGCATATTTCCATGTATTGG GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG CAAATACATGTAATACGTTGCAGTATTCTTATACAGCCTACTCTTTAC GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG AATTGCCCCACGACTTGGGGGAGAGAAACGGCGGCGTGGGGGT GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG AGGAGAGCGGCGTCGACGACGTCCGCCCTTCCGGGGAACTTGGGA GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG ATAACATCCATAAGGTTTATTGGTCGTGCGAATGGCACCTCTTCATTGGGCAGA GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG TCCACCACAGAGCCCGTAATTGTATACCACCGCGAATACCT GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG ATCTGTATATGCGCCAACCTGTCAATAAGCGGGTCTGCGTTTT GAATCTCGAAGAGAGGATTGAAAG TGCACCGGAATGCACCGGAAAACCTACACTGTGCCCCTGA GAATCTTAAGTTGAGGATTGAAAG 33 Un système de maintenance de l’intégrité du DR? Introduction Résultats Discussion Perspectives Organisation du CRISPR (2) DR Les spacers : Taille constante ou variable Signature particulière sur le génome d’origine (protospacer) (Deveau 2008) Identification de virus à partir des spacers (Andersson, science 2008) Le même spacer sur deux CRISPRs différents du même génome ou chez des souches voisines Duplication ou acquisition indépendante d’un spacer sur le même CRISPR (Horvath 2008) 417 spacers présents en deux copies parmi 21497 (< 2%) 89 souches parmi 712 (~13%) 34 Methanothermobacter thermautotrophicusus Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 35 Introduction Résultats Discussion Perspectives Démonstration du rôle du CRISPR Implication dans l’acquisition d’une résistance contre les phages (Barrangou et col., Science 2007), (Horvath 2008), (Devau 2008) -Autre rôle? - Régulation de certains gènes? Modèle interférence ARN chez les procaryotes (Makarova 2006) 36 Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 37 Introduction Résultats Discussion Perspectives Confirmation de l’acquisition polarisée Acquisition polarisée : (lillestol 2006), (Barrangou 2007), (Horvath 2008), (Tyson& Banfield 2008), (Andersson 2008) Leader 38 Le CRISPR NC_007503_3 de Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. Le DR jaune + le leader chez NC_007503_3 et NC_007503_4 Introduction Résultats Discussion Perspectives Acquisition de nouveaux motifs Comment le dernier motif est-il ajouté? ADN invasif Leader DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ DR3 copie sp4 Leader DR3 copie DR3 DR3 copie sp4 Leader DR3 Le DR adjacent au leader est le dernier DR acquis ou le premier DR acquis? sp4 Leader 39 Leader DR3 sp4 DR3 sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ sp3 DR2 sp2 DR1 sp1 DR’ Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 40 Introduction Résultats Discussion Perspectives Le CRISPR comme marqueur phylogénétique Avantages: Facilité technique (PCR ou spoligotypage) Rapidité Importation et échangeabilité inter-laboratoires Limites: 60% des bactéries n’ont pas de CRISPR Acquisition indépendante du même spacer CRISPR non polymorphes ou absents (Lactobacillus casei ) CRISPR très polymorphe (Y. pseudotuberculosis, M. canettii) Bon outil de différenciation de souches + outil complémentaire pour étudier la micro-évolution 41 Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 42 Introduction Résultats Discussion Perspectives Transfert horizontal du CRISPR Transport à travers les plasmides (Godde 2007) Legionella pneumophila Lens Même leader et même DR Le même DR chez des espèces éloignées %GC différent du reste du génome (Horvath 2008) 43 Introduction Résultats Discussion Perspectives Problématique Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences adjacentes sur le même génome 44 Introduction Résultats Discussion Perspectives Création d’un nouveau CRISPR Les essaimages de CRISPRs Un seul groupe de gènes associés Le même DR (quelques déviations parfois) Spacers différents Hypothèse : structure minimale transposée formée d’un leader et un DR DR DR 45 Introduction Résultats Discussion Perspectives PLAN Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie Perspectives Améliorations des outils Les métagénomes 46 Introduction Résultats Discussion Perspectives Perspectives (1) Investigations des petits CRISPRs Confirmation des CRISPRs putatifs (blast DR, …) Vérifications manuelles? Recherche des gènes cas Recherche de proto spacer Epidémiologie, phylogénie (Projets en cours) Exploitation des données de métagénomes Explorer des génomes de l’environnement (communautés multi-espèces) Nature des CRISPRs, statistiques, transfert horizontal… Exploration des phages pour chercher les proto-spacer et identifier leurs sites de reconnaissance Stockage des DR et des spacers avec possibilité de BLAST 47 Introduction Résultats Discussion Perspectives Perspectives (2) Diversité des DR : 24-43 pb Nombre de motifs : jusqu’à plus de 250 motifs 48 Institut de Génétique et Microbiologie LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRASPÉCIFIQUE CHEZ LES MICROORGANISMES Ibtissem GRISSA Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM
