Parcours génétique
Cours 10
Jeudi 14 janvier 2016
Marion Delous
Marion.delous@inserm.fr
RT : Philippine Le Barrois d’Orgeval
RL : Julien Messié
Modèles animaux des maladies génétiques (Zebrafish)
Plan :
I.
Généralités
A- Zebrafish : pourquoi un modèle animal ? Pourquoi
utiliser plutôt le zebrafish que la souris ?
B- Génétique du zebrafish
C- Origine et conditions d’hébergement du zebrafish
D- Accouplement du zebrafish
II.
III.
« Forward genetics »
A- Mutagénèse chimique (ex : ENU)
1)
Crible à grande échelle
2)
Crible haploïde
3)
Crible diploïde homozygote
(gynogénèse)
4)
Clonage positionnel
B- Mutagénèse insertionnelle (rétrovirus, transposon)
« Reverse genetics »
A- Morpholino
1)
Structure
2)
Cage morpholinos
B- TILLING (Targeting Induced Local Lesions in
Genomes) project
C- « Genome editing » TALEN/CRISPR
1)
Knock-out: introduction d’une
mutation (aléatoire) dans un site précis du génome
2)
Knock-in : insertion d’une
séquence d’intérêt dans un site précis du génôme
IV.
Limitations du modèle zebrafish
A- Contribution maternelle
B- Duplication du génôme : exemple du gène Sox9
C- Différences entre les études morpholinos et les
TALEN/CRISPR
V.
Modèle zebrafish de la nephronophtise, ciliopathie
rénale
A- Les cils
B- La néphronophtise
Abréviations : AA = acide aminé
Mot du RT
Au début du cours, Michel Vidaud a dit que c’était très probable que les CRISPR
tombent à l’examen, car c’est une avancée majeure.
I.
Généralités
A- Zebrafish : pourquoi un modèle animal ? Pourquoi utiliser plutôt le
zebrafish que la souris ?
-
Développement embryonnaire externe : on peut suivre (sous microscope)
l’embryogenèse pendant les 24 premières heures puis on observe la formation des
organes, l’organogénèse.
-
Embryons optiquement transparents.
-
On peut garder les larves pendant 5 à 7 jours dans des boîtes de petri (à partir de 7 jours
on doit mettre les larves dans l’eau.
-
Temps de génération court : 3 mois, similaire à celui de la souris.
-
Grandes portées : une femelle peut pondre des centaines d’embryons à la fois
-
Les embryons et les adultes sont de petite taille (les adultes font de 2 à 3 cm) :
hébergement peu coûteux, on peut faire du high throughput screening (plaque 96 puits)
-
Modèle vertébré, ayant l’ensemble des tissus et organes de l’Homme (sauf poumons,
glande mammaire et prostate) + conservation majeure des voies de signalisation.
-
Modèles d’études de la régénération.
B- Génétique du zebrafish
-
25 chromosomes : divisé par 2 par rapport à l’homme
70% des gènes humains ont un orthologue chez le zebrafish
84% des gènes humains responsables de maladie sont représentés chez le
zebrafish
Séquençage du génome en cours, quasi complet
Particularité : duplication du génome total : pour un gène humain il peut y avoir 2
gènes (paralogues) chez le zebrafish. La fonction des paralogues peut être redondante
ou complémentaire (expression dans des organes distincts en y assurant une fonction
similaire).
C- Origine et conditions d’hébergement du zebrafish
Origine : Poisson d’eau douce, originaire d’Inde, de la région du Gange : climat tropical de
mousson, eaux calmes des rizières, rivières de basse montagne
Conditions d’hébergement :
- Environnement à 28° (important pour la fécondation)
- Cycle jour/nuit de 14h/10h
- pH = 7.0
- Conductivité 500-800 microsiemens (µS) (une fois que l’animal est adapté à une certaine
conductivité, on la change très peu, ou alors il faut habituer l’animal de façon graduelle à
une nouvelle conductivité)
- Contrôle quotidien de la qualité de l’eau
- Densité des poissons par aquarium (règle éthique de pas plus de 20 poissons par
aquarium de 3.5 L).
- La façon d’euthanasier et de manipuler les poissons est aussi contrôlée.
D- Accouplement du zebrafish
L’accouplement du zebrafish se fait dans des aquariums d’accouplement, en dehors du système.
Comment reconnaître le mâle de la femelle ? La femelle est la plus bombée (à cause des
œufs). Il y a aussi une différence au niveau de la couleur des nageoires : la femelle a une nageoire
dorsale jaune et une nageoire ventrale transparente alors que la mâle va avoir des nageoires
orangées.
Les aquariums possèdent une séparation (séparation du mâle et de la femelle) et un « grillage »
permettant de séparer les adultes des embryons (pour protéger ces embryons qui pourraient
être mangés par leurs propres parents).
Le stimulus de l’accouplement est la lumière.
A partir du moment où ils peuvent s’accoupler, le mâle et la femelle vont commencer à rentrer en
contact : le mâle va chasser la femelle et presser sur son ventre pour qu’elle relargue ses œufs, et
lui va relarguer en même temps son sperme, ce qui va faire une fertilisation externe.
Comme on fait des injections dans les œufs de zebrafish, on veut vraiment pouvoir
contrôler le moment de la ponte. En effet, on fait les injections au stade 1 cellule, stade qui
ne dure que 30 à 40 minutes après la ponte.
Ensuite les œufs sont collectés et triés. Ils sont placés en incubateur jusqu’à 5 jours et demi
II.
« Forward genetics »
A- Mutagénèse chimique (ex : ENU)
1) Crible à grande échelle
On traite à l’ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) des mâles. Ça induit des mutations ponctuelles
dans le génome, de façon complètement aléatoire.
- On croise ce mâle avec une femelle WT.
- On obtient une génération F1 qui porte des mutations.
- On croise F1 avec un animal WT et ainsi on établit plusieurs familles, dont certains
poissons vont être hétérozygotes pour une mutation.
- Ensuite, au sein de chaque famille, on va croiser de façon aléatoire chaque membre de la
famille et on va analyser en F3 s’il y a un phénotype intéressant ou pas (en tout ça prend
6 mois).
 Si on a par chance croisé 2 hétérozygotes, on va avoir dans 25% des cas un phénotype
particulier qui serait le phénotype mutant.
-
1996 : 1er grands cribles génétiques ENU (300 mâles ENU, >5000 analysées)
 Près de 2000 gènes identifiés indispensables au développement
2) Crible haploïde
On gagne une génération car on va analyser des animaux à l’état haploïde, comme ça on n’a
pas besoin d’être homozygote pour des mutations.
-
On traite à l’ENU des mâles. Ça induit des mutations ponctuelles dans le génome, de
façon complètement aléatoire.
On croise ce mâle avec une femelle WT.
On récupère les femelles F1 qui seraient hétérozygotes des mutations.
On va appuyer sur le ventre de ces femelles pour récupérer leurs ovules.
On va induire le développement de ces embryons en faisant une FIV avec du sperme
traité aux UV, qui détruit l’ADN parental du mâle. Mais ce sperme garde quand
même la capacité d’activer la division cellulaire des embryons.
On va avoir le développement d’animaux ayant uniquement l’ADN génomique de la
mère : 50% sauvages et 50% avec la mutation. On peut analyser en une seule
génération le phénotype de ces animaux mutants.
Les animaux haploïdes ont une morphologie différente : malformation au niveau de l’œil, de la
vésicule otique (sert de balance pour l’animal), embryons plus courts.
3) Crible diploïde homozygote (gynogénèse)
-
On traite à l’ENU des mâles. Ça induit des mutations ponctuelles dans le génome, de
façon complètement aléatoire.
On croise ce mâle avec une femelle WT.
On récupère les femelles F1 qui seraient hétérozygotes des mutations.
On va appuyer sur le ventre de ces femelles pour récupérer leurs ovules, qui ont déjà
effectué leur première méiose.
On va faire une FIV avec du sperme traité aux UV, ce qui va induire la deuxième méiose.
Puis on va jouer avec différentes techniques pour maintenir l’état diploïde de ces ovules :
 On peut bloquer la méiose 2 en faisant une pression au niveau des ovules. Ça
bloque la séparation des chromatides sœurs. Donc lors de la première mitose on va
conserver les 2 chromatides sœurs, ça fait comme si les embryons étaient diploïdes.
Pour certains loci, ça va être homozygote pour une certaine mutation, tandis que
pour d’autres loci dépendant du crossing over qui a été fait en méiose 1, on va
avoir des hétérozygoties. On va pouvoir analyser une partie des gènes mutés.
 L’autre alternative c’est de laisser faire la méiose 2 de façon normale. On va essayer de
bloquer la première mitose, afin de maintenir 2 copies dans les ovules. Pour cela on
applique un choc thermique. Chaque chromatide sœur est dupliquée.
On a une homozygotie parfaite de tous les loci dans chaque ovule. On gagne aussi
une génération. Par contre, le taux de survie des embryons est de 10 à 20%.
4) Clonage positionnel
Une fois qu’on a identifié un phénotype qui nous intéresse, il faut identifier le gène qui est muté.
On fait du clonage positionnel par analyses de liaisons avec différents marqueurs : CA-repeats,
SNPs…
On croise les hétérozygotes pour la mutation avec des lignées WT polymorphiques (portent des
identifier le chromosome qui porte la mutation et la région du chromosome qui porte la
mutation.
 Depuis 1996, près de 9900 mutants ont été identifiés mais 62% restent non clonés.
B- Mutagénèse insertionnelle (rétrovirus, transposon)
-
On injecte des rétrovirus ou des transposons dans des embryons.
Ensuite, on élève ces embryons injectés et on établit des familles de poissons qui
auraient eu intégration de ces éléments rétrovirus ou transposons dans leur génôme, et
on les croise entre eux pour essayer d’identifier un phénotype mutant.
« Gene trap » avec transposon Tol2.
Tol2 contient :
 Des sites accepteurs d’épissage
 ADNc de la GFP qui est placée sous un promoteur ubiquitaire
 Un poly-A : arrêt de la transcription
Ce transposon, qu’on injecte avec l’ARN de la transposase, va se transposer de façon
complètement aléatoire dans le génome du zebrafish.
Le transposon s’intègre dans des introns de gènes, grâce au site accepteur d’épissage.
On va avoir début de transcription du gène, puis comme il y a un site accepteur d’épissage, la
transcription s’arrête et on a la queue poly-A. A côté de ça, le promoteur ubiquitaire va
s’exprimer et on va avoir la transcription du gène codant pour la GFP.
Lignées « gene trap » :
au lieu d’utiliser le promoteur ubiquitaire, on va essayer de placer
la GFP sous le contrôle du promoteur endogène du gène.
On obtient des librairies de poissons qui ont des fluorescences GFP particulières, ce qui permet
d’analyser différents organes.
On peut étudier à la fois le pattern d’expression d’un gène et la perte de fonction de ce
gène.
III.
« Reverse genetics »
A- Morpholino
1) Structure
Définition : Un morpholino est un oligonucléotide de 25 nt, dont la séquence est
spécifique d’un gène qu’on veut targeter.
Sa structure est différente de l’ADN : groupements morphine et liaisons phosphodiaminates :
résistant aux nucléases.
On va injecter ces oligomorpholinos au stade une cellule dans l’embryon.
On peut designer :
- Des morpholinos qui vont targeter l’ATG du gène d’intérêt, ce qui bloque la
traduction (fonctionnent par encombrement stérique en empêchant l’assemblage des
sous unités ribosomales)
- Des morpholinos qui vont cibler des sites accepteurs d’épissage (empêchent
l’assemblage du site accepteur d’épissage).
2) Cage morpholinos
Au moment où on l’injecte, le morpholino est tout de suite actif, à la fois sur les transcrits
maternels et les transcrits zygotiques. Ainsi, on peut utiliser des cage morpholinos : ils sont
injectés sous forme inactive et ils sont activables par un laser à 360 nm.
 Knock down conditionnels.
Avantages
Rapides à utiliser
Inconvénients
Effet toxique (ne pas se mettre à une dose trop toxique)
Très faciles à designer
Contrôles solides :
- Morpholinos contrôles qui ont la même séquence que le
Largement utilisés dans la
morpholino, mis à part 5 mismatchs.
communauté zebrafish
Ils ne doivent pas avoir d’effet dans l’embryon après
injection. Sinon, cela veut dire qu’il y a une toxicité du
morpholino en lui-même.
-
rescue mRNA : essayer de restaurer le phénotype mutant
dû au MO. Pour prouver la spécificité de l’oligomorpholino,
si on coinjecte l’oligomorpholino avec l’ARN qui code pour
la version sauvage du gène qu’on essaye d’éteindre, on
devrait restaurer un phénotype sauvage.
L’effet du morpholino est dilué après 4 à 5 jours : étude restreinte
aux stades de développement embryonnaire.
Donc si le gène n’est exprimé qu’à partir de 4 jours, ce n’est pas la
bonne technique à utiliser.
B- TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) project
-
On traite à l’ENU des mâles. Ça induit des mutations ponctuelles dans le génôme, de
façon complètement aléatoire.
On croise ce mâle avec une femelle WT.
On récupère les mâles F1.
On congèle le sperme des F1.
On séquence chacun des gènes du génome des mâles F1. Si une mutation nous intéresse
dans un gène particulier, on peut récupérer le sperme qui a été congelé, faire une FIV et
regénérer la lignée mutante.
C- « Genome editing » TALEN/CRISPR
L’idée c’est d’induire des coupures double brin au niveau du génome, qui vont être
reconnues et réparées par la cellule :
- Soit de façon non fidèle par le non homologous end joining (NHEJ) : peut créer des
frameshifts (=décalages du cadre de lecture) et donc un codon stop prématuré et donc
une protéine tronquée non fonctionnelle.
- Soit de façon fidèle par le homologous recombination (HR). Il faut une matrice.
1) Knock-out: introduction d’une mutation (aléatoire) dans un site
précis du génome
TALENs
Ce sont des protéines qui vont se lier à l’ADN.
- Il y a deux protéines.
-
Une partie de chaque protéine fonctionne avec des monomères qui sont assemblés les
uns après les autres.
o Chaque monomère est une petite protéine de 34 AA, au sein de laquelle deux AA
sont essentiels (on les appelle RVD = Repeat-Variable Di-Residues) et permettent
de reconnaître une base particulière sur la séquence d’ADN.
 Par exemple les 2 AA HD reconnaissent la cytosine.
o Les monomères vont être assemblés dans un ordre précis pour pouvoir
reconnaître de façon très spécifique une région donnée du génome, qu’on aura
définie nous-même.
-
A côté de ça on a la nucléase Fok1, qui fonctionne en dimère. La Fok1, en dimère, va
induire la coupure double brin de l’ADN, qui sera réparée par la suite.
Les TALENs reconnaissent 18 à 20 nucléotides x2 : on est sûr que les cassures sont
uniquement dans le site qu’on avait choisi.
Système CRISPR/Cas9 : partiel +++
A l’état naturel, le système CRISPR/Cas9 est à 3 composants : crRNA (CRISPR RNA) qui
reconnaît de façon spécifique l’ADN cible.
Ce crRNA est hybridé à un deuxième ARN, tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA), qui
permet le couplage avec la protéine Cas9, qui joue le rôle de la Fok1. C’est donc une
nucléase qui va couper l’ADN en double brin.
On a donc un peu modifié ce système pour n’avoir plus qu’une seule molécule. Le gRNA (guide
RNA) est une chimère entre le crRNA et le tracrRNA. Les gRNA sont très faciles à designer.
La séquence reconnue par le CRISPR est de 18 à 20 nucléotides. Mais c’est surtout les 11
premiers nucléotides qui sont très importants.
-
Il y a possibilité de sites off-targets.
Et le système est dépendant au PAM (séquence nécessaire au système CRISPR pour
fonctionner).
Pour contourner ces problèmes de spécificité, on s’est mis dans la configuration des TALENs :
-
On va prendre des guides qui reconnaissent chacun 18 à 20 nucléotides de l’ADN
génomique et qui sont très proches l’un de l’autre.
On va utiliser des Cas9 nickase, qui ont une mutation qui réduit leur fonction. La Cas9
va alors uniquement couper simple brin.
 On va choisir des guides qui vont se positionner sur chacun des 2 brins de l’ADN. On va
avoir une coupure simple brin sur un brin et une coupure simple brin sur l’autre brin.
Donc au final on a bien une coupure double brin, qui va induire les phénomènes de réparation de
l’ADN. On s’affranchit ici des possibles off-targets du système CRISPR/Cas9.
-
On peut aussi utiliser une Cas9 dead. C’est une Cas9 qui a 2 mutations et ne va pas
couper l’ADN. Elle est couplée à la Fok1, en dimère, qui va couper l’ADN double
brin. On est dans la configuration des TALENs et on va encore gagner en spécificité.
2) Knock-in : insertion d’une séquence d’intérêt dans un site précis du
génome
On va favoriser les événements de recombinaison homologue (HR) plutôt que de NHEJ.
Il faut donner une matrice au système de réparation, un ADN donneur qui va porter la mutation
ou la séquence qu’on veut intégrer dans le génôme.
 On peut faire ça en coinjectant un oligonucléotide de 80-100 pb contenant des bras
d’homologie plus la séquence à intégrer.
Avec la recombinaison homologue on a intégration parfaite de l’ADN donneur. Mais la
recombinaison homologue est peu fréquente comparé à la NHEJ : seulement 8%.
 On peut aussi utiliser un plasmide contenant des bras d’homologie + la séquence à
intégrer (GFP, Gal4) :
 On peut aussi utiliser un plasmide contenant une région « appât » : site de coupure
du
gRNA/TALEN
+
la
séquence
à
intégrer
(GFP,
Gal4) :
IV.
Limitations du modèle zebrafish
A- Contribution maternelle
L’embryon vient avec le sac vitellin dans lequel on retrouve des ARN maternels. Les ARN
maternels permettent le développement des embryons pendant les premières heures.
A partir de 2h, les ARN zygotiques commencent à être synthétisés et prennent le relais sur les
ARN maternels.
Un phénotype qui apparaît tôt dans le développement de l’embryon pourrait être masqué
par les ARN maternels, qui pourraient sauver le phénotype du mutant.
1) Tester par hybridation in situ l’expression du gène d’intérêt :
expression au stade 1 cellule ?
2) Perte de fonction maternelle
 Approche morpholino : on va privilégier les morpholinos qui ciblent l’ATG : ciblent
aussi bien les transcrits maternels et les transcrits zygotiques.
 Approche lignée mutante : génération de mutants maternel-zygotiques par
croisement d’adultes mutants. Les femelles mutantes ne pourront pas donner d’ARN
qui sauveraient le phénotype. Mais souvent les mutants ne sont pas viables jusqu’à l’âge
adulte donc on ne peut pas les croiser entre eux.
L’autre technique est le remplacement de la lignée germinale. On va créer des poissons
chimères. Chez des poissons WT, on peut modifier la lignée germinale pour qu'elle, soit
mutante. Pour cela on utilise la transplantation.
-
On prélève des cellules sur un embryon mutant (pour pouvoir les repérer, on injecte
l’embryon avec de la rhodamine (fluoreochrome) ou des ARN codant pour la GFP).
On transplante ces cellules dans un autre embryon, dans lequel on aura préalablement
tué les cellules qui pourraient donner la lignée germinale.
 L’animal femelle sera donc WT et ses ovocytes seront mutants.
B- Duplication du génôme : exemple du gène Sox9
C- Différences entre les études morpholinos et les TALEN/CRISPR
Raisons possibles :
- Non-spécificité du MO
- Non expression de la mutation (exon skipping)
- Phénomène de compensation (gène paralogue) : un gène compense la perte du gène
qu’on aurait muté
V.
Modèle zebrafish de la nephronophtise, ciliopathie rénale
A- Les cils
La plupart des cellules de vertébrés possèdent des cils.
Motiles
Primaires
9 doublets de microtubules en 9 doublets de microtubules
périphérie, ainsi qu’un doublet
central.
Les bras de dynéine sont associés
aux 9 doublets de microtubules
périphériques, et permettent la
motilité.
Pour générer un flux (épithélium Il y en a dans les cellules épithéliales rénales, les cellules des canaux
respiratoire, cellules épendymaires, biliaires … : presque sur toutes les cellules.
cellules tubaires)
Ces cils ont une fonction de capteur vis à vis du monde extérieur. Ils
ou pour générer la motilité d’une vont capter différents signaux, notamment des molécules importantes
cellule (flagelle du spermatozoïde).
pour le développement comme la voie Hedgehog ou la voie Wnt.
Il va y avoir une transduction du signal pour avoir une réponse cellulaire
adéquate.
Les molécules IFT permettent d’assurer le transport de molécules
de la base du cil vers la pointe, et vice versa (de façon rétrograde et
antérograde). Cela permet un certain turnover des protéines. Cela
existe car la synthèse de protéines se fait dans le corps cellulaire et non
dans le cil.
B- La néphronophtise
La néphronophtise est une ciliopathie. Elle s’exprime sous la forme de rein kystique. Il peut y
avoir différentes anomalies associées comme une fibrose hépatique, une hypoplasie
cérebelleuse, une polydactylie, une dégénérescence rétinienne… Un même gène est muté dans
la néphronophtise ou dans le syndrome de Meckel. Ce qui change c’est le type de mutation
retrouvée.
 Des mutations de type faux sens modérées vont donner plutôt une néphronophtise alors
que des mutations tronquantes vont donner des syndromes beaucoup plus sévères de
type Meckel.
La néphronophtise est une néphropathie tubulo-interstitielle dont les premiers symptômes sont
une polyurie et une polydipsie. L’insuffisance rénale terminale apparaît au cours de l’enfance ou
de l’adolescence, généralement vers 12-13 ans. Parfois ça arrive aux alentours de 20 voire 30
ans. Le premier signe histologique va être un épaississement de la membrane basale tubulaire
rénale, qui va s’associer à une fibrose interstitielle massive et l’apparition de kystes au niveau de
la jonction cortico-médullaire.
Génétique : autosomique récessif, hétérogénéité génétique (environ 18 gènes NPHP).
FICHE RECAPITULATIVE
Avantages de l'utilisation du zebra fish :
- Développement embryonnaire externe
- Embryons optiquement transparent
- Grandes portées (centaines d'embryons par semaine)
- Temps de génération court
- Petite taille
- Modèle vertébré
- Conservation des principales voies de signalisation
- Bon modèle pour étudier la régénération
- 84 % des gènes humains responsable de maladie sont retrouvés
Limitations de l'utilisation du zebra fish :
- Contribution maternelle (ARN maternelle dans le sac vitellin)
- Duplication du génome du zebra fish
- Différence entre les morpholinos et les mutants
Forward Genetics = Induction de mutation aléatoire dans le génome du zebrafish :
- Mutagénèse chimique
- Mutagénèse insertionnelle (rétrovirus, rétrotransposons)
Caractérisation du phénotype des zebra fish :
- Morphologie
- Processus physiologique (métabolisme et fonction d'organe)
- Comportement
- Lignées transgéniques (marquage fluorescent)
Reverse genetics :
- Morpholino
- TILLING
- « Genome editing » (stratégie knock out, knock in, large délétion) : ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9