2 e

Les Milieux de Croissance et le
Métabolisme
Milieux Complexes
• À base d’ingrédients complexes et riches
–
–
–
–
Extraits de protéines de soja
Extraits de protéines de lait
Produits sanguins
Jus de tomate, etc.
• Composition chimique exacte inconnue
• Peuvent être sélectifs et/ou différentiels
2
Milieux de Composition Définie
• Composition chimique connue
Peut contenir jusqu’à 80 ingrédients différents
– Peut être très simple
– Permets la croissance d’un nombre restreint de
microorganismes
– La composition est très variable en fonction du
microorganisme
–
• Peuvent être sélectifs ou différentiels
3
Milieux Sélectifs
• Contient des composés qui inhibent ou tue les
organismes non désirés
– Ex. Milieu contenant de la pénicilline permet
seulement la croissance des microorganismes
résistants à la pénicilline
4
Milieux Différentiels
• Permets de distinguer visuellement différentes
espèces
• Contiennent souvent des indicateurs de pH
– Permets de distinguer différents métabolismes
Production d’alcalins
change le milieu au
rouge
Production d’acide
change le milieu au
jaune
5
La Nutrition
• Les Macronutriments
– C,H,N,O,P,S
Le Carbone
• Requis pour la synthèse de tous les composés
organiques :
–
–
–
–
Glucides
Lipides
Protéines
Acides nucléiques
Sources de Carbones
• Organique
–
–
–
–
–
–
–
Monosaccharides
Disaccharides
Polysaccharides
Protéines
Lipides
Acides nucléiques
Phénols, Etc.
• Inorganique
– CO2
– CO
Le Phosphore
• Requis pour la synthèse des :
–
–
–
–
Acides nucléiques
Phospholipides
ATP
Utilisé comme tampon; contrôle du pH
• Sources:
– Organiques et inorganiques
• La forme inorganique est la plus utilisée
Azote
• Requis pour la synthèse des:
– Acides aminés
– Acides nucléiques
– Le peptidoglycane
• Sources:
– Organiques: acides aminés
– Inorganiques: NH3, NO3, & N2
Soufre
• Requis pour la synthèse des:
– Acides aminés (Cystéine/Méthionine)
– Vitamines (thiamine et biotine)
• Sources:
– Organiques: acides aminés
• Cystéine et méthionine
– Inorganiques:
• S, SO4
Hydrogène et Oxygène
• Requis pour la synthèse des organiques!!
–
–
–
–
Glucides
Lipides
Protéines
Acides nucléiques
• Sources:
– Organiques:
• Carbone organique
– Inorganiques:
• H2 (Méthanogènes seulement)
Classification Nutritionnelle
• Sources de Carbones
– Hétérotrophes:
• Molécules organiques préformées
– Autotrophes:
• Molécules inorganiques
– CO2 et CO
Classification Nutritionnelle (Suite)
• Sources d’Énergies
– Phototrophes:
• Lumière
– Chimiotrophes:
• Oxydation de composés organiques et inorganiques
• Sources d’e– Organotrophes:
• Molécules organiques réduites
– Lithotrophes:
• Molécules inorganiques réduites
Types Nutritionnels
•
•
•
•
Autotrophes photolithotrophes
Hétérotrophes photoorganotrophes
Autotrophes chimiolithotrophes
Hétérotrophes chimioorganotrophes
Qu’est qu’on doit savoir à propos des
milieux
•
•
•
•
•
Quelles sont les sources de C,H,N,O,P,S?
De quel type de milieu s’agit-il?
Quels sont les indicateurs?
Quels sont les agents sélectifs?
Ils permettent la croissance de quelles
bactéries?
• Quelles sont les réactions possibles?
Ex. Agar MacConkey
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Sources de C,H,N,O,P,S?
•
Type de milieu?
•
Indicateurs?
•
Agents sélectif?
Permet la croissance de quelle •
bactéries?
• Réactions possible?
Peptone - 17 g
Proteose peptone - 3 g
Lactose - 10 g
Bile salts - 1.5 g
Sodium chloride - 5 g
Neutral red - 0.03 g
Crystal Violet - 0.001 g
Agar - 13.5 g
Paramètres Environnementaux
• Disponibilité d’oxygène
• pH
• Température
18
Exigence en Oxygène
• Aérobie:
– Besoin absolu d’oxygène pour survivre
– Utilisé comme capteur final d’électron
– Utilisé par les bactéries qui utilisent un
métabolisme d’oxydation ou de respiration
aérobie
• Microaérophilie:
– Besoin absolu d’oxygène à de faibles
concentrations
– Concentrations élevées sont nocives
19
Exigence en Oxygène (Suite)
• Anaérobie/Aérotolérant:
– L’oxygène est toléré, mais n’est pas requis
• Anaérobies facultatifs :
– Besoin d’oxygène facultatif
– Peut utiliser l’oxygène ou non
– Possède un métabolisme oxygène dépendant et un
métabolisme oxygène indépendant
• Anaérobies stricts ou obligatoires :
– L’oxygène n’est pas utilisé ni toléré; ne peu pas
survivre en présence d’oxygène
20
Métabolisme Bactérien
• La majorité des microorganismes
métabolisent leur source de carbone au
travers du sentier glycolytique → pyruvate
• Différents sentiers sont utilisés pour le
métabolisme du pyruvate
– Respiration/Oxydation
– Fermentation
Métabolism Bactérien (Suite)
• Respiration
– Peut avoir lieu en aérobie ou anaérobie
– Les deux utilisent un capteur final d’électron
inorganique
• La respiration aérobie utilise O2
• La respiration anaerobie utilise un composé
inorganique autre que O2 (Ex. NO3-)
– Produit final est H2O
Métabolism Bactérien (Suite)
• Fermentation
– Le pyruvate est métabolisé de façon anaérobique
– Utilse un capteur final d’électon organique
– Divers capteurs d’électrons sont utilisés par
différents microorganismes
• Divers produits finaux sont générés en fonction du
capteur final d’électron utilisé
– Très utile pour l’identification microbienne
Fermentations
• Sous produits:
– La majorité génèrent de l’acide + gaz (CO2)
– Quelque uns génèrent seulement de l’acide ou du gaz
Identification: Tests Métaboliques
• Bouillon de phénol rouge
– Métabolisme de sources de carbones simples
– Source de carbone:
• Peptone (protéine  acides aminés)
• Sucre désiré ajouté
– Indicateur de pH
• Phénol rouge
– Jaune - pH acide - fermentation
– Orange - pH neutre - oxydation
– Rouge - pH alcalin - oxydation
Bouillons Phénols Rouges Interpretation
A.
B.
C.
D.
E.
Jaune (acide) + gaz = Fermentation du sucre
Jaune(acide) pas de gaz = Fermentaion du sucre
Orange (neutre) pas de gaz = Oxidation du sucre
Rouge (alcalin) pas de gaz = Oxydation des protéines
Non inoculé
Discrimination de la Fermentation du
Glucose
• Fermentation avec accumulation d’acide:
– Glucose  pyruvate  acide lactique et/ou acétique + CO2
• Fermentation avec accumulation de produits
neutres
– Glucose  pyruvate  acétoine  2 butanediol + CO2
Test de Méthyl Rouge
• Test pour l’accumulation d’acide
– Sources de carbones: Glucose et protéines
– Indicateur -méthyl rouge; Ajouté après
• MR +: rouge (pH < 5.2)
• MR - : jaune (pH > 5.2)
Neutre
Acide
Test de Voges-Proskauer
Réactifs VP:
butanediol + -naphthol + KOH + O2  acétoine
VP + = rouge
VP - = jaune
Résultats habituelle de MR/VP:
MR+/VP-; MR-/VP+ MR-/VPAcide
produite
Pas
Neutre
d`acétoine
Acétoine
- +
Tests IMViC
• Tests d’Indole, Methyl
Prosakaur, Citrate (IMViC) :
Rouge,
Voges-
– Ces quatre tests incluent une importante série de
déterminations qui sont collectivement appelés la
série de réactions IMViC
– Les réactions IMViC permetent la discrimination
des différents membres de la famille des
Enterobacteriaceae
IMViC: Test d’Indole
• Principe
– Certain microorganismes peuvent faire le
métabolisme du tryptophane par la
tryptophanase
Tryptophane
Tryptophanase
Indole + acide Pyurvic + NH3
Réactif de Kovac
Couleur rouge
Test IMViC
Methyl Rouge-Voges Proskauer
• Test de Méthyl Rouge:
– Fermentation avec accumulation d’acide:
• Glucose  pyruvate  acide lactique et/ou acétique + CO2
-
+
-
+
• Test de Voges Proskauer
– Fermentation avec accumulation butanediol
– Glucose  pyruvate  acétoine  2 butanediol + CO2
Test IMViC : Utilisation du Citrate
• Source de carbone unique:
– Citrate
• Indicateur
– Bromthymol bleu
• Utilisation du citrate génère des
produits alcalins
– Change du vert au bleu
Positif
Klebsiella, Enterobacter
Negatif
E. coli
TSI — Trois Sucres et Fer (I)
– Trois sucres
• Glucose (limitant)
• Sucrose
• Lactose
– Protéines
• Cystéine
– Indicateur
• Phénol rouge
SIM — H2S, Indole et Motilité
• Milieu semi-solide
– Permet de visualiser la motilité
• Métabolisme de la cystéine
– CystéineH2S; H2S+ FeSO4 Précipité noir
• Métabolisme du tryptophane
(A) TryptophaneIndole+NH4 + Pyruvate
(B) Indole+Réactif de Kovac Rouge
Non-motile
Non-inoculé
+
H2S et motile
Indole
-
Utilisation d’Urée
• Carbone:
– Urée + protéin sur la plaque
Négatif
Positif
• Enzyme
– Uréase
• Indicateur de pH
H2 N
H2 N
– Phénol rouge (rose)
C O + 2 H2O  CO2 + H2O + 2 NH3  (NH4)2CO3
urée
ammonium
carbonate
Acides aminés
(alcalin)
Utilisation du Carbone Complexe
• Trop gros pour le transport à l’intérieur
• Nécessite enzymes exocellulaires pour la
dégradation externe en petites unités
– Polysaccharides
• Amidon (amylase)
– Lipides (lipase)
• Tributyrine
– Protéines (protéase)
• Caséine (caséinase)
Amylase
Avant l’ajout d’iode
Après l’ajout d’iode
Caséinase
Lipase – Spirit Blue
La Respiration Aérobie
La Chaîne de Transport d’e2 H+
2 e-
Fe-S
2 H+
extérieur
Fp
intérieur
2 e-
Q
NADH + H+
FADH2
2 e-
Cyt b
3 H+ + 3 OH-
2 e-
H+
2 H+
Cyt o
3 H+ + 1/2 O2
H2O
3 H2O
Test d’Oxydase
phenylenediamine
• Cytochrome oxydase catalyse la réduction du capteur
final d’e-, l’oxygène
• Un donneur artificiel d’e-, la phenylenediamine, est
utilisé pour réduire le cytochrome oxydase
• Si l’enzyme est présente, le réactif incolore (état réduit)
deviendra bleu (état oxydé)
Catalase
Bactéries fait-il cela?
On ajoute ça.
2H2O2
catalase
Détecter les bulles.
2H2O + O2 
Produit de la respiration
dommageable pour l’ADN
Ajout de 3% H2O2 à la
croissance bactérienne
Bulles
(O2)
Métabolisme d’aérobie requière la catalase
Respiration Anaérobie
2 H+
2 e-
Extérieur
Fp
Fe-S
2 H+
Intérieur
2 e-
Q
NADH + H+
FADH2
2 e-
Cyt
b
2 H+
3 H+ + 3 OH -
2 e-
Nitrate
réductase
3 H2O
NO3- + 2 H+ (N = +5) nitrate
Capteur final d’eNO2- + H2O (N = +3) nitrite
Nitrate Réductase
NO3- + 2 H+ + 2 e-  H2O +
nitrate
NO2-
nitrite

NO, N2O,
NH2OH,
NH3, N2
Étape 1: Test pour nitrite
NO2- + acide sulfanilique et alpha naphthylamine  HNO2
Nitrate est réduit
Production de Nitrite
Rouge
Nitrate est réduit au nitrite
Nitrite est réduit
Absence de Nitrite
Jaune
Nitrate n’est pas
réduit
Absence de Nitrite
Jaune
Nitrate Réductase (suite)
NO3- + 2 H+ + 2 e-  H2O +
nitrate
NO2-
nitrite

NO, N2O,
NH2OH,
NH3, N2
Étape 2: Test pour présence du nitrate
NO3- + Zn (s)  NO2-
Nitrate est présent
Réduction au Nitrite
Rouge
Nitrate est absent
Nitrite a été réduit
Jaune
Multi Test: Enteropluri-test
• Tubes de tests métaboliques multiples
–
–
–
–
Utilisation d’un inoculum constant
Rapide
Lecture peut être automatisé
Préparations et inconsistances normalisé