les cellules souches tissulaires (adultes)

Cellules souches et cellules proliférantes.
Régulation de la différenciation cellulaire
Master Physiopathologie cellulaire et
moléculaire
29 septembre 2010 L.Mauvieux
Concept de la cellule souche
• Cellule à longue durée de vie
• Capable d’auto-renouvellement (duplication sans perte des
capacités de développement)
• Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires
(différenciation)
• Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en
cellules originaires normalement des 3 couches
embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes
• Capables de Prolifération
• De régénérer des tissus après blessure
• De plasticité dans ces différentes options
Hierarchie des
cellules souches
Epiderme
Jargon des cellules souches
Potence
définit la capacité à se différencier en différents types
cellulaires
Pluripotent
pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes
Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes
Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules
spécialisées, mais pas toutes
les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes
Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES
• Dérivées du blastocyste en culture
• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans
un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »
• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4
– Sox2 et Hox4
Dérivation des cellules souches embryonnaires
humaines
J0
J1
J5
J4
blastocyste
compaction
J2
J3
Feeder de fibroblastes murins
Colonie de
cellules ES
Critères pour caractériser le
caractère de cellule souche
(« stemness »)
• Auto-renouvellement:
– Potentiel de renouvellement illimité in vitro
– Expression de facteurs de transcription
caractérisant la cellule souche (nanoG, oct4,
SOX2, TERT…)
• Pluripotence in vitro:
– Formation de tératomes dans la souris
imunocompétente (potentiel tumoral)
– Pluripotence in vitro
Formation de Tératome
• Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois
feuillets embryonnaires
– Ectoderme (peau, poils, dents…)
– Mésoderme (os, cartilage, muscle…)
– Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)
Pluripotence des cellules ES in vitro
Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES
• Dérivées du blastocyste en culture
• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique
dans un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »
• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4
– Sox2 et Hox4
Chez l’homme
Cellules souches « adultes »
Tissus à renouvellement rapide=cellules
souches
cheveux
Moelle osseuse
Épithélium digestif
Cellules souches adultes
• Les cellules souches adultes sont cruciales pour le
renouvellement tissulaire
• Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement
et de différenciation
• L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de
l’équilibre entre:
– l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve)
– et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le
renouvellement tissulaire)
• Modèle des cellules souches hématopoïétiques
(CSH)
Modèle CSH
• Durent toute la vie…
• Hématopoïèse
• À la base des greffes de moelle
allogéniques: thérapie cellulaire de
loin la plus utilisée
CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES
TRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE
Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961
Irradiation sub-léthale
1000Gy
+ Greffe de moelle (IV)
J10: colonies de cellules
hématopoïétiques clonales, multi-linéales,
dans la rate (CFU-S)
CARACTERISATION DES CSH :
reconstitution de l’hématopoïèse à long terme
Traitement par le 5-fluoro-uracile
Anti-métabolite incorporé dans l’ADN et l’ARN
Suda et coll, Trends in immunology Vol.26 August 2005
Tri des cellules par
cytomètre en flux
• Identification d’une fraction cellulaire capable
de reconstituer l’hématopoïèse : contient les
cellules souches
– Cellules quiescentes
– Très rares: ~1/10.000 cellules
– Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-)
– Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst)
par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1
– Expriment (CD34+), CD133, c-kit
• Dans
la M.O , le nombre dedes
CSHCSH
reste
Caractéristiques
relativement constant en l’absence de perte
de sang ou d’autres traumatismes
• L’état de quiescence corrèle avec leur
caractère multipotent
• 2 modèles pour expliquer l’homéostasie de
l’hématopoïèse
Modèle A:
• Dans des conditions normales, ces CSH sont
quiescentes (G0 du cycle cellulaire), mais se
divisent régulièrement,
– pour assurer la maintenance du pool de CSH
– Permet d’éviter d’acquérir des mutations conduisant à
leur transformation maligne
– Division asymétrique:
• 1CSH => 1CSH + 1 cellule qui va s’engager dans la
différencation
Linheng
Modèle B:
– 1 pool de CSH
« dormantes », qui gardent
la capacité de d’activité de
cellule souche
multipotentes
– réagissant aux besoins
suscités par l’organisme
– revenant à l’état dormant
une fois les lésions
réparées
Linheng
Population capable de reconstituer
l’hématopoïèse: Différents sous types,
plus ou moins en cycle
Wilson cell 2008
-Injection de BrdU dans les souris à un instant donné
-Le BrdU s’intercale dans l’ADN qui devient fluorescent
-Suivi du contenu en BrdU par cytométrie en flux
Wilson, Cell décembre 2008
Modèle B: synthèse
Linheng
Organisation de la moelle hématopoïétique
Niche ostéoblastique
À l’interface os/moelle: Les ostéoblastes:
-fabriquent la trame osseuse
-supportent le développement des CSH:
*Un déficit ostéoblastique entraîne une
diminution importante de l’hématopoïèse
(Visnjic, 2004)
*La co-transplantation de d’ostéoblastes avec
les cellules souches augmente la prise de
greffe (Tachman, Hematology 2000)
Cellules souches Lin- :
-marquées à la fluorescéine
- Injectée à une souris témoin
-analyse 15h après
Localisation des cellules souches au
niveau de l’endostéum, au contact des
ostéoblastes
=> Interactions préférentielles
Nilsson, S. K. et al. Blood 2001
La niche hématopoiétique « adulte »
-contacts physiques-
La niche hématopoiétique « adulte »
-contacts physiques-
La niche hématopoiétique « adulte »
Ang1
La niche hématopoiétique « adulte »
La niche hématopoiétique « adulte »
La niche hématopoiétique « adulte »
CXCL12
Noradrénaline
CXCL12
pleraxifor
SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE
« Synapse » ostéoblaste - CSH
Synthèse
• Les CSH intègrent des signaux qui
proviennent de l’interaction avec:
– les ostéoblastes, les cellules réticulaires
(mésenchymateuses)
– mais aussi du micro-environnement médullaire
qui est ouvert notamment en raison de la riche
vascularisation de la moelle osseuse
– Les cellules en cours de différenciation
• comment peut s’opérer la différenciation et
l’expansion des cellules hématopoïétiques?
Etapes de la régulation de l’hématopoïèse
CSH indifférenciée
multipotente
Quiescence
Auto-renouvellement
Engagement
Différenciation
Maturation
Cellules hématopoïétiques différenciées
Hierarchie de l’hématopoïèse
Le système hématopoïétique
SCID-RC
Cellules souches
Reconstitution lympho-myéloïde.
in vivo
0,0001%
CD34+
≥ (4 mois)
0,01%
Cultures à long terme*
in vitro
Progéniteurs
immatures
LTC-IC
Progéniteurs déterminés
(5 semaines)
Formation de colonies*
in vitro
0,5 à 1%
CFC
(10-21 jours)
99%
Cellules identifiables
morphologiquement
Myéloïdes
Lymphoïdes
*: Facteurs de
croissance
Le système hématopoïétique
SCID-RC
Cellules souches
Reconstitution lympho-myéloïde.
in vivo
0,0001%
CD34+
≥ (4 mois)
0,01%
Cultures à long terme*
in vitro
Progéniteurs
immatures
LTC-IC
Progéniteurs déterminés
(5 semaines)
Formation de colonies*
in vitro
0,5 à 1%
CFC
(10-21 jours)
99%
Cellules identifiables
morphologiquement
Myéloïdes
Lymphoïdes
*: Facteurs de
croissance
Le système hématopoïétique
SCID-RC
Cellules souches
Reconstitution lympho-myéloïde.
in vivo
0,0001%
CD34+
≥ (4 mois)
0,01%
Cultures à long terme*
in vitro
Progéniteurs
immatures
LTC-IC
Progéniteurs déterminés
0,5 à 1%
(5 semaines)
Formation de colonies*
in vitro
CFC
(10-21 jours)
99%
Cellules identifiables
morphologiquement
Myéloïdes
Lymphoïdes
*: Facteurs de
croissance
Le système hématopoïétique
SCID-RC
Cellules souches
Reconstitution lympho-myéloïde.
in vivo
0,0001%
CD34+
≥ (4 mois)
0,01%
Cultures à long terme*
in vitro
Progéniteurs
immatures
LTC-IC
Progéniteurs déterminés
(5 semaines)
Formation de colonies*
in vitro
0,5 à 1%
CFC
(10-21 jours)
99%
Cellules identifiables
morphologiquement
Myéloïdes
Lymphoïdes
*: Facteurs de
croissance
Comment ces mécanismes se
mettent-ils en place?
• Régulation simultanée:
–
–
–
–
Auto-renouvellement de la CSH
Engagement dans la différenciation
Spécification de la lignée
Homéostasie
• Mécanismes:
– Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque)
– Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de
croissance
INDUCTION ET MISE EN
ROUTE DU PROGRAMME
DE DIFFERENTIATION
Engagement cellulaire
microRNAs
Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcription
Contrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines
Régulation transcriptionnelle au cours des premiers
stades de l’hématopoïèse.
NOTCH-1, Bmi-1
GATA-2, HOX-B4
CSH
PU-1, GATA-1
CMP
Progéniteur myéloide
commun
CLP
Progéniteur lymphoïde
commun
Facteurs de transcription et cytokines
•
PU.1: facteur de
transcription myéloïde
• PU.1 réprimé par MafB
• La fixation de M-CSF
induit l’expression de PU1, sous l’influence de
nombreux événements:
– Intinsèques
– Épigénétiques
– externes
Sarrazin et al., Cell, 2009
Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription
De la cellule souche
à la cellule différenciée
Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance
De la cellule
souche
D
e
l
a
c
e
l
l
u
l
e
s
à la cellule
s
différenciée
o
Kaushansky,
u NEJM, 2006, 2034-45
Facteurs de croissance hématopoïétiques
•
glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères)
•
synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO,
qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes,
cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines »
•
Redondance
•
Synergies :
– Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des
progéniteurs
– Réponses prolifératives additives
– Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires
différentes.
•
action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine.
•
Agissent sur un récepteur spécifique:
– Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -).
– dimérisation du récepteur
– transduction d ’un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines
associées vers le noyau
– activation de la transcription de gènes donnés
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1)
• Facteurs de promotion et de survie
cellulaire, ex:
– Stem cell factor (SCF) = kit ligand:
– Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes
– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et erythroblastiques avec d’autres cytokines
– Indispensable à l’erythropoièse fœtale (foie)
– FLT-3 ligand:
– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et mégacaryocytaires
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2)
• Facteurs de prolifération et de différenciation, ex:
– Non spécifiques de lignée:
– Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse
– Interleukine 6 sur tous les progéniteurs
– Spécifiques de lignée:
– Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF
–
–
–
–
lignée éosinophile : IL-5
lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo)
lignée méga : thrombopoïétine (Tpo)
lignée lymphocytaire :
– maturation : IL-2, IL-4,
– croissance : IL-7
– différenciation plasmocytaire : IL-6
Modèle de l’hématopoïèse
DeDla cellule souche
Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45
e
l
a
c
e
l
l
u
l
e
s cellule différenciée
à la
s
o
u
Régulation négative de l’hématopoièse
• TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée
en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs
• TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière
différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de
croissance
• MIP 1a (Macrophage-Inflammatory Protein 1a ) ne limite pas
son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de
nombreux processus inflammatoires.
• Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS
1-3, CIS)
– La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro
(apparition de mRNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles
par les cytokines comme IL2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-g, EPO, GCSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.
Mode d’action des protéines SOCS
Synthèse de la différenciation
des CSH
• CSPH médullaires qui vont se différentier vers
–
–
–
–
polynucléaires PNN ou PNE ou PNB,
Globules rouges (GR)
Mégacaryocytes (plaquettes)
Lymphocytes (B,T, NK)
• action intriquée de nombreux facteurs
– Facteurs de croissance, interleukines
– Molécules d’adhésion
– Facteurs de transcription
• 2 modèles d’étude:
– Par les gènes spécifiques de la lignée
– Par les déficits
• Pathologies
• Souris KO