TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L`immunité adaptative, prolongement de l
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TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L'immunité adaptative, prolongement de l'immunité innée Objectif : comprendre l'immunité adaptative à médiation humorale - caractériser les molécules de l'immunité adaptative. Observation : l'immunité innée mise en place rapidement prépare d'autres réactions du système immunitaire. Problème : comment se met en place l'immunité adaptative ? Matériel : blouse, livre p. 298, TS-tp-p3A-20-grippe + test d’immunodiffusion. Rastop : TS-tp-p3A-20-P Ac-SIDA, TS-tp-p3A-20-P Ac1-SIDA-p24, TS-tp-p3A-20-P Ac2-SIDA-p24, TS-tp-p3A-20-P Ac-Ag grippe.pdb. GéniGen : TS-tp-p3A-20-P Ac-SIDA et TS-tp-p3A-20-P Ac-Ag grippe.edi. Capacités et attitudes Extraire et organiser des informations Activités expérimentales 1 - La grippe À partir des docs p. 298 et 299 et doc TS-tp-p3A-20-grippe (p. 1 et 2 uniquement, expliquer ce qu'est la grippe. Exo 5 p. 298. Réaliser une manipulation d'après un protocole 2 - L'interaction antigène (Ag) anticorps (Ac) Mise en évidence des anticorps, le test d’immunodiffusion ou d'Ouchterlony, réaliser le protocole p. 2. Voir livre p. 300 si besoin. Utiliser un logiciel de données 3 - La structure des anticorps Établir l’organisation générale d’une molécule d’Ac avec Rastop et GéniGen, protocole p. 4. Bilan Exo 5 p. 300. Comprendre une application, le test de grossesse p. 320. Rédaction d’un compte-rendu sur feuille double faisant apparaître la démarche expérimentale. Réaliser une synthèse Compétences Recenser, extraire et exploiter des informations, y compris expérimentales, sur les cellules et les molécules intervenant dans l'immunité adaptative. Concevoir et réaliser une expérience permettant de caractériser la spécificité des molécules intervenant dans l'immunité adaptative. Concevoir et réaliser des expériences permettant de mettre en évidence les immunoglobulines lors de la réaction immunitaire. 1 TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L'immunité adaptative, prolongement de l'immunité innée 2 - L'interaction antigène anticorps Le test d’immunodiffusion ou test d’Ouchterlony : recherche d’un antigène Le 20 juin 2012, les autorités de la région autonome du Xinjiang (nord-ouest de la Chine) ont dû faire face à une épidémie de grippe touchant près de 1600 poulets. Ce virus est caractérisé par la présence à sa surface d’une protéine : l’hémagglutinine. Le type de grippe dépend du type d’hémagglutinine (H1, H3, ou H5…) présent : grippe aviaire si H5, grippe A si H1 ou la dernière forme de grippe apparue en 2012 si H3. Avant de prendre la décision d’abattre les 5500 autres poulets de l’élevage, des tests rapides, basés sur le principe de l’immunodiffusion, ont dû être effectués pour déterminer le type de grippe affectant les poulets. Dans ce TP, on cherche à savoir en quoi les tests d’immunodiffusion réalisés nous permettent de déterminer le type de souche grippale affectant les poulets chinois. PARTIE A - Concevoir une stratégie pour résoudre une situation. Toute molécule introduite dans un organisme et provoquant une réponse immunitaire est qualifiée d’antigène. Par exemple, on peut injecter de l’hémagglutinine de type 5 (H5), une protéine localisée au niveau de la membrane du virus de la grippe aviaire, à un poulet sain. Quelques jours après l’injection, le sérum (partie liquide du sang dépourvue de cellules) de poulet est récupéré et montre une augmentation notable de la concentration en anticorps (protéine produite par les lymphocytes B et participant à la réponse immunitaire adaptative). Principe de la méthode d’Ouchterlony C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s’il n’y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l’œil nu. Celui-ci est dû à l’interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation de complexes immuns. Matériel à disposition : Boîte de pétri avec un gel (à préparer), un emporte-pièce, une micropipette avec embouts ou un compte-gouttes pour chaque produit. Solution 1 : sérum de poulet sain immunisé avec de l’hémagglutinine H1. Solution 2 : sérum de poulet sain immunisé avec de l’hémagglutinine H5. Solution 3 : sérum de poulet sain immunisé avec de l’hémagglutinine H3. Solution 4 : sérum de poulet malade. Solution 5 : eau distillée. Remarque : il s’agit de produits de substitution. En utilisant les informations ci-dessus, choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri et l’indiquer sur le schéma de la boîte de Pétri ci-dessous. Justifier ce choix. Gabarit de perçage dans le gel d’agar 2 TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L'immunité adaptative, prolongement de l'immunité innée PARTIE B - Mettre en œuvre un protocole de résolution. Protocole : I- Préparation d’un gel d’agar (=gélose) à couler dans une boîte de Pétri pour test d’Ouchterlony 1. Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement en suivant les consignes de sécurité ; 2. Peser dans la coupelle 0,2 g d’Agar prélevé à l’aide de la spatule ; 3. Verser 14 mL d’eau distillée puis l’agar dans le bêcher et dissoudre soigneusement l’agar avec l’agitateur en verre ; 4. Chauffer le mélange en remuant avec l’agitateur en verre jusqu’à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l’ébullition ; 5. Retirer à l’aide de la pince en bois, attendre quelques secondes que le bêcher refroidisse afin de pouvoir saisir le flacon sans se brûler ; 6. Verser 5 ml d’agar chaud dans la boîte de Pétri ; 7. Égaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles ; 8. Laisser la boîte refroidir sans mettre le couvercle ; 9. Rincer le matériel ; 10. Ne pas remuer les boîtes avant prise du gel d’Agar : environ 5 -10 min ; II- Préparation du test 1. Utiliser le gabarit de perçage pour creuser à l’aide du tube emporte-pièce les puits nécessaires dans le gel d’agar ; 2. Éliminer les disques de gélose avec le cure-dent si nécessaire. III- Réalisation des dépôts 1. Marquer sur la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l’anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. (Utiliser le même ordre que celui que vous avez proposé à la question A) ; 2. Remplir les différents puits avec 1 goutte : chaque produit devra être prélevé avec un compte goutte propre, puis être déposé dans les puits sans débordement ni bulle et sans endommager le gel d’agar ; 3. Fermer la boîte ; 4. Observer les résultats fournis. Les réactifs déposés dans les puits diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc rentrer en contact. Cette zone de contact reste invisible s’il n’y a pas de réaction entre les deux réactifs. Par contre, elle se traduit par un arc de précipitation visible à l’œil nu lorsque les deux réactifs interagissent. Schéma d’une observation possible PARTIE C - Présenter les résultats pour les communiquer. Indiquer sur le schéma complété en partie A le résultat du test. Réaliser un schéma d’interprétation à l’échelle moléculaire, en utilisant les symboles de votre choix parmi ceux proposés : - Dans le cas de la formation de l’arc de précipitation. - Dans le cas d’une absence d’arc. PARTIE D - Exploiter les résultats obtenus. Expliquer la propriété des anticorps mis en évidence par ce test et répondre au problème posé. 3 TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L'immunité adaptative, prolongement de l'immunité innée 3 - La structure des anticorps - Un anticorps complet (Ac anti GP120 protéine du virus du SIDA) Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel Ressource complémentaire : fiches méthodes sur le site Pour sélectionner la chaine L : faire *L dans l'outil de recherche puis choisir une couleur dans la palette. Afin de visualiser l'Ac, ouvrir le logiciel puis la molécule (pdb) Colorer les 4 chaînes L, M - H, K de l'Ac. (L en rouge - M violet - H bleu - K jaune) Matériel logiciel : Repérer les chaînes C et D qui stabilisent la molécule Logiciel Rastop Repérer le tryptophane 103 des chaînes H et K, site du déterminant antigénique Logiciel GéniGen Appeler l’examinateur pour vérifier les résultats Matériel molécule : TS-tp-p3A-20-P Ac-SIDA.pdb TS-tp-p3A-20-P Ac-SIDA.edi Afin de comparer les molécules, ouvrir le logiciel puis le fichier (edi) Comparer les chaînes lourdes (entre elles), légères (entre elles) et une légère avec une lourde Réaliser un schéma et conclure Appeler l’examinateur pour vérifier les résultats - Deux anticorps partiels liés à un Ag (protéine p24 du virus du sida) Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel Matériel logiciel : Afin de visualiser les deux complexes Ag-Ac, ouvrir le logiciel et afficher les molécules dans deux Logiciel Rastop fenêtres (pdb) Matériel molécule : Colorer les chaînes de l'Ac en rouge et bleu et l'Ag (chaine P) en vert TS-tp-p3A-20-P Ac1-SIDA-p24.pdb Réaliser un schéma et conclure Appeler l’examinateur pour vérifier les résultats TS-tp-p3A-20-P Ac2-SIDA-p24.pdb - Un anticorps partiel lié à son Ag (protéine du virus de la grippe) Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel Afin de visualiser le complexe Ag-Ac, ouvrir le logiciel puis la molécule (pdb) Matériel logiciel : Colorer les 3 chaînes (A en rouge, B en bleu, C en vert) repérer leur origine Logiciel Rastop Appeler l’examinateur pour vérifier les résultats Logiciel GéniGen Matériel molécule : TS-tp-p3A-20-P Ac-Ag grippe.pdb TS-tp-p3A-20-P Ac-Ag grippe.edi Afin de comparer les molécules, Ouvrir le logiciel GéniGen puis le fichier (edi), comparer les deux fragments de l'AC Réaliser un schéma et conclure Appeler l’examinateur pour vérifier les résultats 4 TS-tp-p3A-20 Chapitre 2 : L'immunité adaptative, prolongement de l'immunité innée Les immunoglobulines sont des protéines chargées de la reconnaissance spécifique des antigènes dans l'organisme. Leur structure extrêmement flexible rend leur cristallisation difficile et par conséquent l'obtention d'un modèle expérimental complet est exceptionnelle. Le modèle présenté ici est le premier modèle d'une immunoglobuline G humaine obtenu expérimentalement. Il correspond à une classe d'IGG appelée b12 qui présente une forte affinité à large spectre avec la molécule GP120 du VIH. La zone de liaison de cet anticorps avec GP120 (épitote) recouvre la partie fonctionnelle du GP120, celle chargée de la reconnaissance du récepteur CD4 des lymphocytes T4. Les propriétés de cet anticorps en font un bon matériau d'étude pour l'élaboration d'un vaccin anti-VIH. L'immunoglobuline est formée de 4 chaînes différentes : - H et K : chaînes lourdes (457 acides aminés) - L et M : chaînes légères (215 acides aminés) Des chaînes polysaccharidiques sont associées aux chaînes lourdes. Le site de liaison à l'antigène est inclus dans les parties Fab (association de la chaîne lourde et de la chaîne légère). Le tryptophane en position 103 sur les chaînes H et K du modèle aurait la propriété de s'insérer au niveau d'une poche hydrophobe dans la protéine GP120, de la même façon que le fait le récepteur CD4 des lymphocytes T4. Extraire et organiser des informations 5
