Des microorganismes dans les nuages ?
publicité
Des microorganismes dans les nuages ? Anne-Marie DELORT Marius PARAZOLS Questions : 1) Y a t-il des microorganismes dans les nuages ? Combien ? Lesquels ? 2) Y a t-il une relation entre le nombre de microorganismes et le type de nuage ? 3) Les microorganismes peuvent-ils effectuer des réactions chimiques dans les nuages ? LES NUAGES Photochimie (Gaz / Aqueuse / Surface) Photolyse directe / indirecte Transfert de masse Équilibre Gaz/Liquide Transfert d’espèces très réactives (Oxydants , COV, …) Mise en contact d’espèces qui ne le sont pas en atmosphère sèche CCN Dissolution /Précipitation depuis l’aérosols d’espèces réactives (NO3-, Fer, …) Bilan radiatif / Lessivage des gaz / Lessivage des aérosols LE PUY DE DÔME • • • • Site de prélèvement : pdD en troposphère libre : peu d’influence locale (1465 m) Influence de différents types de masses d’air (Océaniques, Anthropiques) Présence de nuages fréquente Paramètres sensibles à la lumières (Fer, H2O2) sont mesurés directement après échantillonnage • • • Paramètres mesurés: pH, Conductivité, Potentiel Redox Fe(II), Fe(Tot), H2O2, TOC, HCHO, Chromatographie Ionique Paramètres météorologiques et physico-chimiques : vitesse et direction du vent, température, pression, rayonnements, LWC, physico chimie des aérosols … PRELEVEMENTS Impacteurs à gouttelettes actifs (Aspiration) ANALYSES L’ INFLUENCE OCEANIQUE Chromatographie Ionique : Sodium provenant de la solubilisation de l’aérosol marin (cristaux de NaCl) Na+ % du TIC 20% Océanique 15% 10% 5% 0% Sud Ouest Ouest Nord Ouest Nord Nord Est L’ INFLUENCE ANTHROPIQUE Activités humaines : SO2 NOx solubilisés dans le nuage vont acidifier ce milieu pH 7,0 6,0 5,0 4,0 - Sud Ouest Ouest Nord Ouest Nord NO3 % du TIC Nord Est 40% 30% 20% Impact sur la chimie Impact sur la microbiologie 10% 0% Sud Ouest Ouest Nord Ouest Nord Nord Est LES OXYDANTS Les gouttelettes de nuage : H2O2 (20µM) dont la photolyse produit des radicaux OH susceptibles d’oxyder la matière organique (dont les acides carboxyliques) 100% y = -0,0028x + 1 2 R = 0,9176 [H2O2]x/[H2O2]0 80% 60% 40% 20% Moyenné sur 7 irradiations d’eau de nuage 0% 0 50 100 Time (min) 150 200 PROBLEMATIQUE CHIMIE RADICALAIRE Hydrocarbure METABOLISME CENTRAL Carbone organique Alcool Aldéhyde Alcool Aldéhyde Acide carboxylique Acide carboxylique CO2 CO2 Y a t-il des microorganismes dans les nuages ? Combien ? Lesquels ? Les microorganismes Bactéries 2 µm 2 µm 5 µm Champignons 20 µm Levures 10 µm 10 µm Intégration dans le nuage Acidité Rayonnement solaire Dessiccation Froid Osmolarité Oxydants Microorganismes aérosolisées Phénomène de « Bubbling » et aérosolisation mécanique Eau Sol Végétation Manque de nutriments Analyses microbiologiques Echantillon d’eau de nuage ~30 mL/ heure Fixation au formaldéhyde 5% Marquage au DAPI et observation par microscopie à épifluorescence Dénombrement des cellules totales (bactéries et champignons/levures) Mise en culture TSA, Sabouraud et R2A Incubation 15°C et 27°C Dénombrement des cellules cultivées (bactéries et espèces fongiques) Extraction et fixation de l’ATP Dosage enzymatique de l’ATP par bioluminescence (luciférine/luciférase) Concentration en ATP Combien de microorganismes ? Champignons & Levures Bactéries Cellules totales 1,7 x104 – 2,4 x105 mL-1 Microscopie à épifluorescence (x 400) 8,9 x102 – 2,5 x104 mL-1 Combien de microorganismes ? Champignons & Levures Bactéries Cellules totales 1,7 x104 – 2,4 x105 mL-1 8,9 x102 – 2,5 x104 mL-1 Micro-organismes cultivés ~ 100 mL-1 (27°C et 15°C) ~ 600 mL-1 < 1% du nombre total ~ 10% du nombre total 9 9Majorité Majoritéde deviables viables non-cultivables non-cultivables Concentration en ATP [ATP]mesurée [ATP]calculée (27°C et 15°C) 0,40 pmol mL-1 0,13 pmol mL-1 0,24 pmol mL-1 0,37 pmol mL-1 ATP molécule de la vie Quels microorganismes ? micro-organismes isolés Champignons & levures Champignon non identifié (colonie) Cryptococcus albidus (x 600) 9Grande 9Grande diversité diversité Levure non identifiée x 600 Aspergillus fumigatus (x 1500) 42 champignons dont 29 identifiés 15 levures dont 3 identifiées Phytopathogènes Cladosporium spp., Trametes spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Botrytis sp., Fusarium avenaceum, Verticillium nigrescens…. Végétation Saprophytes sol Cryptococcus spp., Pseudozyma sp. FEMS Microbiology Ecology, sous presse Quels microorganismes ? micro-organismes isolés Bactéries Bacillus sp. (colonies) Pseudomonas sp. (x 1000) Streptomyces sp. (x 1000) 71 souches dont 61 identifiées: 9Grande 9Grande diversité diversité - 37 Gram-positifs - 24 Gram négatifs Paenibacillus sp. (x 1000) Beaucoup de pigmentées (aérosolisation, froid, lumière, pression osmotique) FEMS Microbiology Ecology, sous presse Exemples d’isolats de bactéries à Gram-positifs •• 25 25 Actinobacteria Actinobacteria •• 12 12 Firmicutes Firmicutes FEMS Microbiology Ecology, sous presse 12-6 ROOT Micrococcus luteus Exemples d’isolats de bactéries à Gram-positifs RACINE AJ5 12-6 Micrococcus luteus •• 25 25 Actinobacteria Actinobacteria •• 12 12 Firmicutes Firmicutes 3-2Micrococcus sp. 3-2 3-73-7 Arthrobacter rhombi 3-18 Tetrasphaera sp. 3-18 100 98 3-4Actinobacterium indet 3-4 STAPHYLOCOCCUS 5-6Staphylococcus 5-6 69 100 cohnii 5-8Staphylococcus sp. 5-8 100 100 62 99 100 90 5-3 Staphylococcus sp. 6-1 6-1 Staphylococcus sp. 5-1 Bacillus pumilus 5-1 7-11 7-11Bacillus licheniformis BACILLUS 12-7Bacillus sp. 12-7 85 3-6 3-6Bacillus simplex 62 96 7-1 7-1Streptomyces ciscaucasicus 100 100 44 14-12 14-12Streptomyces sp. STREPTOMYCES 12-10 12-10Streptomyces albidoflavus 5-4 5-4 Streptomyces sp. 68 96 6-3 Saccharothrix tangerinus 6-3 5-7 5-7Luteococcus sanguinus 3-20 Leucobacter aridicollis 3-20 76 51 7-2 7-2Agrococcus jenensis 13-4 Curtobacterium flaccumfaciens pv. Beticola 13-4 0.1 FEMS Microbiology Ecology, sous presse Bootstrap (100 arbres générées) et Neighbor Joining Enraciné avec Micrococcus luteus type strain DSM 20030T 12-6 ROOT Micrococcus luteus Exemples d’isolats de bactéries à Gram-positifs RACINE AJ5 12-6 Micrococcus luteus •• 25 25 Actinobacteria Actinobacteria •• 12 12 Firmicutes Firmicutes 3-2Micrococcus sp. 3-2 3-73-7 Arthrobacter rhombi 3-18 Tetrasphaera sp. 3-18 100 98 3-4Actinobacterium indet 3-4 Région froide STAPHYLOCOCCUS 5-6Staphylococcus 5-6 69 100 cohnii 5-8Staphylococcus sp. 5-8 100 Eau douce, eau de mer 100 62 99 100 90 5-3 Staphylococcus sp. 6-1 6-1 Staphylococcus sp. 5-1 Bacillus pumilus 5-1 7-11 7-11Bacillus licheniformis BACILLUS 12-7Bacillus sp. 12-7 85 3-6 3-6Bacillus simplex 62 Sol 96 7-1 7-1Streptomyces ciscaucasicus 100 100 44 14-12 14-12Streptomyces sp. STREPTOMYCES 12-10 12-10Streptomyces albidoflavus 5-4 5-4 Streptomyces sp. 68 Végétation 96 6-3 Saccharothrix tangerinus 6-3 5-7 5-7Luteococcus sanguinus 3-20 Leucobacter aridicollis 3-20 76 51 7-2 7-2Agrococcus jenensis 13-4 Curtobacterium flaccumfaciens pv. Beticola 13-4 0.1 FEMS Microbiology Ecology, sous presse Bootstrap (100 arbres générées) et Neighbor Joining Enraciné avec Micrococcus luteus type strain DSM 20030T Exemples d’isolats de bactéries à Gram-négatifs ••11 11Gamma-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria ••88Alpha-Proteobacteria Alpha-Proteobacteria ••33Bacteroidetes Bacteroidetes ••22Beta-Proteobacteria Beta-Proteobacteria FEMS Microbiology Ecology, sous presse RESULTATS II ROOT coli RACINE Escherichia DQ3 5-17-F8 5-17 Moraxella 100 5-14-F8-Eu 5-14 Moraxella Exemples d’isolats de bactéries à Gram-négatifs phenylpyruvica ••11 11Gamma-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria ••88Alpha-Proteobacteria Alpha-Proteobacteria osloensis 3-19-F8-Eu 3-19 Massilia sp. 65 100 100 ••33Bacteroidetes Bacteroidetes ••22Beta-Proteobacteria Beta-Proteobacteria 3-12 Zoogloea ramigera 3-12-F8-Eu 3-13-F8-Eu 3-13 Zoogloea sp. 14-7 Flavobacterium 14-7-F8 99 sp. 100 100 6-2-F8-Eub 6-2 Pedobacter sp. 14-8 Sphingobacterium sp. 14-8-F8 88 7-14-F8-Eu 7-14 Aurantimonas sp. 7-5-F8-Eub 7-5 Methylobacterium sp. 67 53 SPHINGOMONAS 7-15-F8-Eu 7-15 Sphingomonas sp. 58 3-10 Sphingomonas sp. 3-10-F8-Eu 100 14-6-F8 14-6 Sphingomonas sp. 100 7-13-F8-Eu 7-13 Sphingomonas sp. 100 14-5-F8 14-5 Sphingomonas sp. 14-14-F8 14-14 Pseudomonas viridiflava 74 14-2-F8 14-2 Pseudomonas sp. 3-1 Pseudomonas syringae pv. coryli 3-1-F8-Eub 88 75 100 89 12-8-F8 12-8 Pseudomonas syringae 13-2-F8 13-2 Pseudomonas syringae pv. atropurpurea 13-3-F8 13-3 Pseudomonas 75 50 PSEUDOMONAS graminis 6-4-F8-Eub 6-4 Pseudomonas rhizosphaerae Bootstrap (100 arbres générés) et Neighbor Joining 14-10 Pseudomonas sp. 14-10-F8 0.1 FEMS Microbiology Ecology, sous presse Enraciné avec Escherichia coli strain ATCC 25922 RESULTATS II ROOT coli RACINE Escherichia DQ3 5-17-F8 5-17 Moraxella 100 5-14-F8-Eu 5-14 Moraxella Exemples d’isolats de bactéries à Gram-négatifs phenylpyruvica ••11 11Gamma-Proteobacteria Gamma-Proteobacteria ••88Alpha-Proteobacteria Alpha-Proteobacteria osloensis 3-19-F8-Eu 3-19 Massilia sp. 65 100 100 ••33Bacteroidetes Bacteroidetes ••22Beta-Proteobacteria Beta-Proteobacteria 3-12 Zoogloea ramigera 3-12-F8-Eu 3-13-F8-Eu 3-13 Zoogloea sp. 14-7 Flavobacterium 14-7-F8 99 sp. 100 100 Végétation 6-2-F8-Eub 6-2 Pedobacter Région froide sp. 14-8 Sphingobacterium sp. 14-8-F8 88 7-14-F8-Eu 7-14 Aurantimonas sp. 7-5-F8-Eub 7-5 Methylobacterium sp. 67 53 SPHINGOMONAS 7-15-F8-Eu 7-15 Sphingomonas sp. 58 Eau douce, eau de mer 3-10 Sphingomonas sp. 3-10-F8-Eu 100 14-6-F8 14-6 Sphingomonas sp. 100 7-13-F8-Eu 7-13 Sphingomonas sp. 100 14-5-F8 14-5 Sphingomonas sp. Sol 14-14-F8 14-14 Pseudomonas viridiflava 74 14-2-F8 14-2 Pseudomonas sp. 3-1 Pseudomonas syringae pv. coryli 3-1-F8-Eub 88 75 100 89 12-8-F8 12-8 Pseudomonas syringae 13-2-F8 13-2 Pseudomonas syringae pv. atropurpurea 13-3-F8 13-3 Pseudomonas 75 50 PSEUDOMONAS graminis Bootstrap (100 arbres générés) et Neighbor Joining 6-4-F8-Eub 6-4 Pseudomonas rhizosphaerae 14-10 Pseudomonas sp. 14-10-F8 0.1 FEMS Microbiology Ecology, sous presse Ice Nuclei Enraciné avec Escherichia coli strain ATCC 25922 Y a t-il une relation entre le nombre de microorganismes et le type de nuage ? Relation avec la composition chimique Na+ = influence océanique 10 r² of Pearson = 0.65 Winter point 10 4 Bactéries totales/ [Na+] 1 10 100 + [Na ] (µM) Total cells /mL Champignons totaux/ [Na+] 10 Total bacterial cells /mL Total cells /mL pH acide = influence anthropique 5 5 10 Influence Influenceocéanique océanique++ Influence Influenceanthropique anthropique-- 1000 4 10 0 10 4 Relation nombre de bactéries / pH 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 pH Winter point 10 3 1 10 100 + [Na ] (µM) 1000 9Océanique 9Océanique>>Anthropogénique Anthropogénique Variations spatiales + Océan Atlantique Influence Anthropique (P pH, P Na+) FRANCE + Contenu Microbien Puy de Dôme N Mer Méditerranée Variations temporelles Bacteria Bactéries Fungi & Yeasts Champignons 10 4 5 (a) Total c ell number / mL Tota l cell number / mL 10 10 3 10 0 Cellules totales 4 100 10 600 Spring Summer Autumn Winter At 27° C At 15° C 3500 Summer Autumn Winter 9 9Été Été>>Hiver Hiver At 27°C At 15°C 3000 500 (b) 2500 CFU / mL 400 CFU / mL Spring 300 2000 Cellules cultivées 1500 200 1000 100 500 0 0 Spring Summer Autumn Winter S pr n ig Summer Autumn Winter Les microorganismes peuvent-ils effectuer des réactions chimiques dans les nuages? Biotransformation des composés organiques Acétate Cultures pures Lactate Formiate Tests de biodégradation 20 mM ~1010 cellules mL-1 + Formaldéhyde + Méthanol Succinate maleate Composition moyenne en acides organiques pour les nuages collectés au sommet du puy de Dôme (Marinoni et al., Atmos. Chem. & Phys. 2004) Analyse par RMN 1H ª Doser le composé testé ª Détecter et identifier les métabolites Voies de bioconversion du formaldéhyde, du méthanol et du formiate H 13C O O C H 3 M e th y lfo rm a te III I 13 13 C H 3O H II C H 2 (O H ) 2 H 13C O O H or H 13C H O M e th a n o l F o rm a te F o rm a ld e h y d e R ib u lo s e 5 -P h o sp h a te VI A s sim ila tio n (se rin e c y c le ) 13 13 CO2 6 -p h o sp h o - 1 3 C 1 -g lu c o n a te 13 C 1 - H e x u lo se -6 -P IV 13 13 C 1 - F ru c to s e -6 -P 13 C 1 - F ru c to s e -1 ,6 -d iP V A s sim ila tio n C 1 - G lu c o se -6 -P CO2 Biodégradation du méthanol Spectres RMN1H Water Formate Methanol TSPd4 Biodégradation du 13C-formaldéhyde Time of incubation 13C 13 C formaldehyde 13C formate 13C methanol NMR spectra CO2 METHANOL FORMALDEHYDE FORMATE CH3OH HCHO HCOOH 2 s n= s 3 mo nas 6 1 sts 5 Biodégradation des composés en C1 5 Compound Le Yeas vu n A7ts re = 6 s nna =s 8 =4 PPssee uuddo ommo A o na6s mmo A on na5 a s ns Sphphn inggo o S 6 loloc co oc A cc cu4s nu=s StSatap phhyy Formaldéhyde BBa a ci cilAlu3 l nlu=s s 0 3 20 oocco oc ccAu2 c n u=s s 40 =r 3 60 MMii ccrr 80 % degraded after 24 hours of incubation 100 AArhr thtr roob ba actA1 c e nte r n= Y ea n= udo mo nas ing o 1 c cu n= loc o n= Ba cill us 2 ccu n= oco n= Compound Pse Sph St a phy Mi cr Arh tro bac ter Propriétés métaboliques Méthanol 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 Biodégradation des Acides carboxyliques Bactéries Gram + Acétate > Formiate > L-lactate > Succinate > D-lactate % degraded after 24 hours of incubation 100 % de composé dégradé après 24 h Propriétés métaboliques 90 80 70 60 50 60 souches testées Conditions optimales (17°C ou 27°C) 40 30 20 10 ••Gram Gram(-) (-)>>Gram Gram(+) (+) 0 -10 -20 Formate Acetate n = 30 L-lactate Compound n = 30 n = 30 D-lactate Succinate n = 30 n = 17 Bactéries Gram - composés composésmajoritaires majoritairesde del’eau l’eau du dunuage nuage 90 80 70 Acétate > Formiate > Succinate > L-lactate > D-lactate 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 n = 20 Compound D-lactate Succinate n = 20 Su cc in ate L-lactate DL ac tat e n = 20 LL ac tat e n = 20 Ac eta te Formate Acetate Fo rm ate % degraded after 24 hours of incubation 100 % de composé dégradé après 24 h 9 9Grande Grandeefficacité efficacitéenvers enversles les n = 13 Propriétés métaboliques CHIMIE RADICALAIRE Monod et al., 2002 Méthanol Acides Formaldéhyde carboxyliques Formiate CO2 VOIES METABOLIQUES observées C1 Méthanol Acides carboxyliques Acétate Formaldéhyde Lactate Succinate Pyruvate Fumarate Formiate CO2 Voies biochimiques similaires aux voies radicalaires (photochimie) Forte dégradation de l’acétate et du formiate Efficacité variable selon les souches Microorganismes sources et puits Capacité Capacité de de développement développement et et de de biodégradation biodégradation àà basse basse température température Croissance à basse température 17°C 5°C 27°C ••20 20souches souchessur sur37 37sont sontcapables capablesde dese sedévelopper développeràà5°C 5°C 9 9Développement Développementcompatible compatibleavec avecles lesconditions conditionsdu dunuage nuage FEMS Microbiology Ecology, 2007 Biodégradation du formiate et du formaldéhyde à 5°C vs 17°C par Pseudomonas syringae 20 Formiate 5°C Formiate 17°C co ncentra tio n (m M) 16 14 12 10 8 6 4 2 co ncentra tio n (m M ) 18 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Formaldéhyde 5°C Formaldéhyde 17°C -1 0 0 5 10 15 20 25 temps d'expérience (heures) 30 35 Formate ~ At 5°C: V5 = 2,03 µmoles/h/mg of proteins ~ At 17°C: V17 = 11,68 µmoles/h/mgof proteins 40 0 1 2 3 temps d'expérience (heures) Formaldehyde ~ At 5°C: V5 = 0,93 µmoles/h/mg of proteins ~ At 17°C: V17 = 1,52 µmoles/h/mg of proteins 4 Estimation Estimation de de l’implication l’implication dans dans la la chimie chimie du du nuage nuage Biodégradation à basse température Souches « modèles » : 4 Pseudomonas, 1 Sphingomonas, 1 Frigoribacterium, 1 levure Tests de biodégradation à basse température pour chaque composé Vitesses de biotransformation Extrapolation Extrapolationdes desvitesses vitessesààun unnuage nuagemodèle modèle 1,0 Relative concentration 0,8 Microbiologie 5 x104 bactéries mL-1 5 x102 levures mL-1 0,6 0,4 Chimie 0,2 Formiate 6 µM Acétate 5 µM Lactate 1 µM Succinate 0,5 µM Méthanol 0,1 µM Formaldéhyde 0,5 µM 0,0 0 10 20 30 Time of incubation (h) 40 50 5°C et 17°C Implication dans la chimie du nuage 5°C For miate5 Temps pour dégrader 50 % du contenu du nuage 15,8 jours 3,2 % 5 x104 bactéries mL-1 5 x102 levures mL-1 24 heures 2,6 % 7,0 % 10,0 % 6,1 jours Acétate17 Acétate (5 µM) 9,6 % 5,2 jours Lactate17 Lactate (1 µM) 17,0 % 2,9 jours Succinate17 Succinate5 5,0 jours Temps pour dégrader 50 % du contenu du nuage 8,2 % Lactate5 7,1 jours Formiate17 Formiate (6 µM) Acétate5 19,2 jours 17°C Succinate (0,5 µM) 78,0 % 0,6 jours Implication dans la chimie du nuage 5°C 5 x104 bactéries mL-1 5 x102 levures mL-1 24 heures 17°C Temps pour dégrader 50 % du contenu du nuage > 50 jours 1,8 jours Temps pour dégrader 50 % du contenu du nuage < 0,1 % 28,0 % Méthanol (0,1 µM) Formaldéhyde (0,5 µM) 10 % 48,0 % 5,0 jours 1,0 jour Conclusion 9 8 x104 bactéries et 5 x103 champignons et levures mL-1 9 Majorité de viables 9 Grande diversité 9 Sources variées 9 Variabilité saisonnière du contenu microbien 9 Corrélations entre le contenu microbien et la composition chimique 9 Aptitude à se développer rapidement à basse température 9 Pigmentation 9 Activité métabolique significative dans les conditions physico-chimique du nuage 9 Transformations similaires aux voies connues Perspectives ? Conditions du nuage Dépôt sec Micro-organismes aérosolisées Cinétiques Cinétiques Constantes cinétiques ? Comparaison Comparaison avec avecles les constantes constantes photochimiques photochimiques ? Long Longterme: terme: modélisation modélisation Paolo Laj Anne-Marie Delort Martine Sancelme Matthieu Ménager Florence Demeer Amina Melaouhi Stéphane Fontanella Anne-Sophie Martin-Biesse Pierre Amato Gilles Mailhot Marius Parazols Jean-Marc Pichon Pierre Chausse Christophe Gourbeyre Angela Marinoni
