Equipe FA

Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle
UMR 8576 CNRS/Université de Lille
Diversité des héparanes sulfates et
réponse inflammatoire
Thématiques :
- Spécificité des interactions héparanes sulfates / protéines inflammatoires
- Régulation de l’expression et de l’activité des enzymes de biosynthèse des
héparanes sulfates
- Rôle des héparanes sulfates dans les réponses inflammatoires et immunes
Université Lille 1, Sciences et Technologies - Bâtiment C9
59655 Villeneuve d’Ascq cedex – France
Tel. : 33(0)3 20 43 48 83 - Fax : 33(0)3 20 43 65 55
Email : [email protected] - site : http://ugsf-umr-glycobiologie.univ-lille1.fr/
Diversité structurale des héparanes sulfates
Régulation de l’expression et de l’activité des héparanes sulfotransférases :
approches expérimentales
Stimulus
Héparanes
sulfates
1
Réponses
3
2
Enzymes
Réponses cellulaires
Régulation de l’expression des
enzymes de maturation des HS
- RT-qPCR, immuno-détection.
- régulation transcriptionnelle et posttranscriptionnelle (signalisation,,
gène reporter, miRNA…)
3-OST2
3-OST3B
- signalisation
- migration, prolifération; apoptose …
- production de cytokines (Q-PCR, ELISA)
- cytotoxicité
Remodelage structural des HS
- composition en disaccharides
- cytofluorimétrie en flux
- spectrométrie de masse
Corrélation entre remodelage des HS
et réponses cellulaires
- inhibition par ARN interférence
- surexpression de formes actives
HS4C3
80
M2
M1
M2
si-3-OST3
control
100
M1
0
5
15
0
5
15 (min)
60
40
20
Activation de p44/p42 MAPK (CyPB)
0
10
20
Elution (min)
30
40
1
10
102
10 3
10 4
Remodelage des héparanes sulfates : l’exemple du macrophage
1
1
0,1
0,1
0,01
0,01
0,001
0,001
100
10
1
0,1
0,01
0,001
HS3ST1
HS3ST2
HS3ST3A
HS3ST3B
HS3ST4
HS3ST5
HS3ST6
In vitro differentiation
(5-days)
10
HS2ST
HS6ST1
HS6ST2
HS6ST3
Monocytes primaires
10
NDST1
NDST2
NDST3
NDST4
Expression of mRNA
(gene/HPRT)
Polarisation des macrophages
 Expression de 11 HS sulfotransférases dans les macrophages
non polarisés
NDST1
Macrophages (M0)
LPS /
IFN-γ
(2-days)
10
NDST2
5
IL-4 /
IL-13
0
0
M1 M2
200
Macrophages
M1
2-OST
Macrophages
M2
3-OST2
0
5
M1 M2
3-OST3B
0
M1 M2
M1 M2
 L’expression des NDST1, NDST2, 2-OST, 3-OST2 and 3-OST3B
est modifiée en réponse à la polarisation des macrophages.
Remodelage des héparanes sulfates : l’exemple du macrophage
Analyse disaccharidique des héparanes sulfates par RP-HPLC (dérivation AMAC)
Analyse disaccharidique des HS par RP-HPLC
90
4. ΔUA-GlcNS
5. ΔUA-GlcNAc6S
6. ΔUA2S-GlcNAc
7. ΔUA-GlcNAc
70
Fréquence (%)
1. ΔUA2S-GlcNS6S
2. ΔUA-GlcNS6S
3. ΔUA2S-GlcNS
M1
M2
50
20
15
10
5
0
Les HS des macrophages M2 présentent le FGF-2 aux
cellules cancéreuses (MDA-MB-231)
4. ΔUA-GlcNS
5. ΔUA-GlcNAc6S
6. ΔUA2S-GlcNAc
7. ΔUA-GlcNAc
10
Proliferation Index
1. ΔUA2S-GlcNS6S
2. ΔUA-GlcNS6S
3. ΔUA2S-GlcNS
8
*
6
*
4
2
0
Serum (10%)
FGF-2
Lyases
Fixed-M2
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
Régulation et fonctions de la 3-O-sulfatation
Sept isoenzymes : 3-OST1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6
(HS3ST1, HS3ST2, HS3ST3A, HS3ST3B, HS3ST4, HS3ST5, HS3ST6)
1. Implication des héparanes 3-O-sulfatés dans les réponses des macrophages à la
protéine gD du virus HSV-1
- Importance de la 3-O-sulfatation des HS sur la signalisation des macrophages.
- Rôle des HS 3-sulfatés dans la susceptiblité des macrophages au HSV-1
Fixation de HSV-1 gD à la surface des macrophages
Contrôle
HSV-1 gD
Rôle de la 3-OST2 dans les réponses induites
par HSV-1 gD
Régulation et fonctions de la 3-O-sulfatation
2. Implication des héparanes 3-O-sulfatés dans l’échappement des cellules cancéreuses
au système immunitaire
- Impact de la 3-O-sulfatation des HS sur la prolifération et la survie des cellules cancéreuses.
- Rôle des HS 3-sulfatés dans la communication entre cellules cancéreuses et système immunitaire.
Thèse de Charles HELLEC
4
3
2
1
50
40
B
30
20
* 10
*
0
1:1
Activité caspase
% cellules apoptotiques
A
Pourcentage de cytotoxicité
Surexpression des 3-OST2, 3-OST3B et 3-OST4 en cellules cancéreuses
Analyse de la résistance des cellules 60
transfectées à des agents pro-apoptotiques
contrôle
contrôle
5
p-3ST2-kZ
3-OST2
4
p-3ST3B
3-OST3B
3
p-3ST4-Kz
3-OST4
*
2
*
1 1:5
1:10
Ratio cellules cancéreuses : cellules NK
0
0
Staurosporine
Fas/TNF-α
Staurosprine
Fas/TNF-α
La surexpression des 3-OSTs de type gD favorise la mise en
place de mécanismes anti-apoptotiques
Régulation et fonctions de la 3-O-sulfatation
3. Localisation subcellulaire des 3-OSTs
- Surexpression de formes taggées fluorescentes des 3-OST2, 3-OST3A et 3-OST3B.
Thèse de Maxime DELOS (collaboration avec François FOULQUIER, UGSF)
4. Analyse structurale des motifs héparanes 3-O-sulfatés
- Production de 3-OST3B recombinante et sulfatation in vitro :
3-OST3B
CH2-O-X
O
COO -
O
OH
O
COO
O-H
O-X
NH-SO3-
O
O
n
PAPS
O
-
OH
O
O
CH2-O-X
O
O-X
O-SO3-
O
NH-SO3-
n
X : H ou SO3-
- Analyse par spectrométrie de masse et spectrométrie vibrationnelle
Collaboration avec Régis DANIEL (LAMBE, CNRS-Université d’Evry) et Isabelle COMPAGNON (Institut
Lumière/Matière, CNRS-Université Lyon I)