bacteriologie medicale tropicale

Instituut voor Tropische Geneeskunde
Institut de Médecine Tropicale
Institute of Tropical Medicine
Instituto de Medicina Tropical
Nationalestraat, 155
B – 2000 Antwerpen
Stichting van Openbaar Nut 0410.057.701
POSTGRADUAT EN MEDECINE TROPICALE ET SANTE INTERNATIONALE
Module 1 & Module 2
BACTERIOLOGIE
MEDICALE
TROPICALE
___________
(Notes pratiques)
SEPTEMBRE 2009
Philippe Gillet – Luc Boel - Jan Jacobs
[email protected] , [email protected] , [email protected]
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES....................................................................................................................................................................................................................1
INTRODUCTION....................................................................................................................................................................................................................................5
TECHNIQUES USUELLES EN BACTERIOLOGIE...............................................................................................................................................................6
COLORATION AU BLEU DE METHYLENE : ..............................................................................................6
PRINCIPE :................................................................................................................................................6
MATERIEL :...............................................................................................................................................6
METHODE :...............................................................................................................................................6
REPONSES TYPES ..................................................................................................................................6
COLORATION A l’ENCRE DE CHINE .........................................................................................................7
PRINCIPE ET METHODE : .......................................................................................................................7
MATERIEL :...............................................................................................................................................7
METHODE :...............................................................................................................................................7
REPONSES TYPES : ................................................................................................................................7
COLORATION DE GRAM .............................................................................................................................8
PRINCIPE :................................................................................................................................................8
MATERIEL :...............................................................................................................................................8
METHODE :...............................................................................................................................................8
REPONSES TYPES : ................................................................................................................................9
INTERPRETATION DES RESULTATS :...................................................................................................9
CLASSIFICATION DES BACTERIES SUR BASE DE LEURS MORPHOLOGIES ET DE LEURS COULEURS AU GRAM .....11
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN A CHAUD : .....................................................................................12
PRINCIPE :..............................................................................................................................................12
MATERIEL :.............................................................................................................................................12
METHODE :.............................................................................................................................................12
TUBERCULOSE ...............................................................................................................................................................................................................................13
INTRODUCTION : ...................................................................................................................................13
CARACTERISTIQUES : ..........................................................................................................................13
LOCALISATIONS : ..................................................................................................................................13
PRÉCAUTIONS PARTICULIÈRES: ........................................................................................................13
DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE :........................................13
PRISE D’ÉCHANTILLONS (TUBERCULOSE PULMONAIRE) : ............................................................13
TECHNIQUES DE CONCENTRATIONS : ..............................................................................................13
ETALEMENT DES CRACHATS :............................................................................................................13
DIAGNOSTIC DES TUBERCULOSES EXTRA-PULMONAIRES :.........................................................13
FIXATION DES ÉTALEMENTS :.............................................................................................................13
LA COLORATION DE ZIEHL NEELSEN À CHAUD ...............................................................................13
EXAMEN MICROSCOPIQUE DE LA PRÉPARATION : .........................................................................13
QUANTIFICATION DES RÉSULTATS :..................................................................................................13
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS :.................................................................................................13
CONTRÔLE DE QUALITÉ DES EXAMENS DE CRACHATS POUR BAAR :........................................13
CAUSES D’ERREURS TECHNIQUES : .................................................................................................13
CAUSES D’ERREURS NON TECHNIQUES : ........................................................................................13
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EXAMEN D’UN LIQUIDE DE PONCTION :................................................................................................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
PRELEVEMENT : ....................................................................................................................................13
REACTION DE RIVALTA : .....................................................................................................................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
MATERIEL :.............................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
REPONSES TYPES : ..............................................................................................................................13
DIFFERENTIATION CELLULAIRES :....................................................................................................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
MATERIEL :.............................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
REPONSES TYPES : ..............................................................................................................................13
INTERPRETATIONS DES RESULTATS : ..............................................................................................13
EXEMPLE DE STRATÉGIE DE DIAGNOSTIC POUR LES ASCITES (SELON P.A. REEVE).............13
LEPRE.....................................................................................................................................................................................................................................................13
INTRODUCTION : ...................................................................................................................................13
DIAGNOSTIC DE LA LÈPRE : ................................................................................................................13
QUANTIFICATION DES RÉSULTATS :..................................................................................................13
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS :.................................................................................................13
ULCERE DE BURULI ......................................................................................................................................................................................................................13
INTRODUCTION : ...................................................................................................................................13
MENINGITES........................................................................................................................................................................................................................................13
INTRODUCTION : ...................................................................................................................................13
PRELEVEMENT : ....................................................................................................................................13
EXAMEN MACROSCOPIQUE : ..............................................................................................................13
EXAMEN MICROSCOPIQUE : ...............................................................................................................13
REPONSES TYPES : ..............................................................................................................................13
VALEURS DE REFERENCES : ..............................................................................................................13
DOSAGE DES GLOBULINES PAR LA REACTION DE PANDY ..............................................................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
MATERIEL :.............................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
INTERPRETATION DES RESULTATS :.................................................................................................13
REPONSES TYPES : ..............................................................................................................................13
UTILISATION DU MILIEU TRANS-ISOLATE (TI) :....................................................................................13
MATERIEL :.............................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
METHODE POUR LES TESTS D’AGGLUTINATION DE PARTICULES DE LATEX : .............................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
MATERIEL :.............................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
INTERPRETATION DES RESULTATS...................................................................................................13
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EXAMEN D'UN PRELEVEMENT URETRAL........................................................................................................................................................................13
PRINCIPE :..............................................................................................................................................13
PRELEVEMENT : ....................................................................................................................................13
METHODE :.............................................................................................................................................13
REPONSES TYPES : ..............................................................................................................................13
INTERPRETATIONS DES RESULTATS : ..............................................................................................13
PREPARATION DES SOLUTIONS POUR LA BACTERIOLOGIE.............................................................................................................................13
1.
ALCOOL ACETONE A 90 % (v /v) : .........................................................................................................................................13
2.
ALCOOL ACIDE DE ZIEHL à 3 % v/v :....................................................................................................................................13
3.
ACIDE SULFURIQUE A 20 % (v/v) :........................................................................................................................................13
4.
BLEU DE METHYLENE : ..........................................................................................................................................................13
5.
CRISTAL VIOLET OU VIOLET DE GENTIANE : .....................................................................................................................13
6.
FUCHSINE DE ZIEHL : ............................................................................................................................................................13
7.
FUCHSINE DILUEE : ...............................................................................................................................................................13
8.
LUGOL FAIBLE : .....................................................................................................................................................................13
9.
REACTIF DE PANDY :.............................................................................................................................................................13
10. SAFRANINE :...........................................................................................................................................................................13
MICROPHOTOGRAPHIE DE QUELQUES BACTERIES D’INTERET MEDICAL...............................................................................................13
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INTRODUCTION
L’examen direct d’un étalement biologique contenant des bactéries n’est généralement pas suffisant pour
identifier l’espèce bactérienne en cause; seule la culture associée à une galerie d’identification biochimique
peut garantir une identification précise. Différentes particularités bactériennes expliquent cette limitation :
•
•
Il existe un très grand nombre de germes différents.
Les bactéries ont une taille limite pour la microscopie optique :
Epaisseur entre 0.2 et 2 µm,
Longueur entre 0.8 et 10 µm.
•
•
•
•
Elles sont incolores à frais (et nécessitent donc des colorations particulières).
Elles sont morphologiquement peu différentiables (coques – bâtonnets). Leur morphologie peut
même varier en fonction de certains paramètres (différentes souches, différents milieux de culture,
âge de la culture, patients immunodéprimés, traitement en cours, …).
Il n’existe parfois aucune différence morphologique entre certains germes pathogènes et non
pathogènes (Neisseria meningitidis par exemple et les autres Neisseria).
La virulence d’un germe est variable en fonction :
De sa localisation,
De la souche et de son sérotype,
Du nombre de germes envahissant une personne,
Du niveau de résistance du patient.
•
Les échantillons sont souvent contaminés par des germes commensaux (endroits non stériles ou
contamination vraie).
Comme les cultures bactériennes ne sont pas (ou très peu) faisables au niveau d’un hôpital de district, seul
le prélèvement et l’envoi d’échantillon vers un laboratoire de référence est envisageable pour des cas bien
particuliers.
Ceci dit, l’examen microscopique direct d’un étalement, après coloration adaptée (Gram, Ziehl-Neelsen,
Giemsa, ...), est un moyen efficace pour déterminer la présence de bactéries dans un liquide normalement
stérile ou dans certains prélèvements particuliers.
•
•
•
•
•
Dans les crachats pour identifier les formes infectieuses de tuberculose.
Dans des liquides céphalo-rachidiens (L.C.R.), pour l’identification de la bactérie ou du champignon
responsable de la méningite.
Dans des prélèvements opérés sur des hommes atteints d’urétrite à un stade précoce, les infections
gonococciques peuvent être diagnostiquées avec une certitude relative.
Dans le sang pour identifier les fièvres récurrentes.
…
La microscopie offre alors un diagnostic rapide, parfois [presque] exclusif (certaines tuberculoses, lèpre,
méningites bactériennes, anthrax, certaines borrélioses,…), parfois probable (gonocoque chez l’homme),
parfois partiel (coques Gram + / bâtonnets Gram – sur une urine par exemple), parfois différentiel (viral /
bactérien / autre étiologie).
Dans ces cas, l’examen direct après coloration appropriée peut donner des informations de grandes valeurs
pour le diagnostic, l’instauration immédiate d’un traitement approprié et le contrôle de certaines maladies.
Certains tests sérologiques simples, utilisables au niveau d’un laboratoire de district, peuvent aussi être
d’une grande utilité (syphilis, méningites bactériennes, …).
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TECHNIQUES USUELLES EN BACTERIOLOGIE
COLORATION AU BLEU DE METHYLENE :
PRINCIPE :
La coloration au bleu de méthylène est une technique simple qui colore tout en bleu. Elle ne
donne donc que la forme des bactéries éventuellement présentes, sans permettre de
différentier les bactéries sur base de la résistance de leur paroi à la décoloration
(Gram positif / Gram négatif).
Son utilisation principale est la recherche de diplocoques intra et/ou extra cellulaires dans un L.C.R. ou dans un pus
urétral. Il s’agit d’une technique complémentaire à la coloration de Gram, qui n’utilise qu’un produit simple toujours
disponible dans un hôpital de district. Elle présente en outre le grand avantage d’être techniquement immanquable.
MATERIEL :
Lame, diamant, mélange sable/crésyl, anse de platine, lampe à alcool, (méthanol), papier filtre,
entonnoir, bleu de méthylène, support de coloration des lames, eau de rinçage, support sèche lame,
microscope, huile à immersion.
METHODE :
1. Enregistrer l’échantillon et noter au diamant le numéro du patient sur une lame neuve.
2. Flamber la lame neuve numérotée en la passant 3 x sur la flamme d'une lampe à alcool.
3. Plonger l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl [ou sable/éthanol à 70
%].
4. Flamber l'anse de platine (porter le fil au rouge sur toute sa longueur) puis la laisser refroidir.
5. Etaler à l'anse de platine le prélèvement sur la lame flambée, pour faire un frottis aussi mince que
possible.
6. Plonger de nouveau l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl puis porter le
fil au rouge pour détruire les bactéries.
7. Laisser sécher à l'air, à l'abri des insectes.
8. Fixer l'étalement en recouvrant la lame de méthanol pur [ou en passant la lame 3 fois à travers la
flamme d’une lampe à alcool, le côté sur lequel est étalé l'échantillon dirigé vers le haut].
9. Eliminer le méthanol et laisser sécher [ou laisser refroidir la lame].
10. Couvrir complètement la lame de Bleu de Méthylène pour bactériologie pendant 1 minute et 30
secondes.
11. Rincer la lame à l'eau (propre ou filtrée).
12. Sécher à l'air.
13. Observer la lame au microscope (à l’huile d’immersion, objectif 100 x, oculaire 10 x)
REPONSES TYPES
•
Présence de :
Quantité :
Forme des bactéries :
Disposition des bactéries :
Localisation des bactéries :
Particularités :
Cellules :
•
Rares, quelques, nombreux.
Coques, bacilles.
Par 2 (= diplo-), en chaînettes, en grappes.
Intra ou extracellulaires.
(Capsules).
Présence, nombre et type de cellules (leucocytes, cellules
épithéliales,…).
Recherche négative.
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COLORATION A l’ENCRE DE CHINE
PRINCIPE ET METHODE :
Cette technique permet de mettre en évidence la capsule qui entoure le Cryptococcus neoformans. Le
matériel à examiner (par exemple une goutte du culot de centrifugation d’un L.C.R.) est mélangé avec une
goutte d’encre de Chine. Examiner au microscope. La capsule est visible comme un halo clair autour du
champignon. Le champignon se présente sous forme de spores rondes, bourgeonnantes, contenant des
granulations grisâtres.
Figure 1 Cryptococcus neoformans, LCR,
coloration à l’encre de Chine, 400 x
MATERIEL :
Lame, lamelle, encre de Chine, anse de platine [ou pipette pasteur], lampe à alcool, microscope.
METHODE :
1. Enregistrer l’échantillon et noter au diamant le numéro du patient sur une lame.
2. Déposer une goutte d’encre de Chine sur la lame.
3. Plonger l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl [ou sable/alcool à 70 %].
4. Flamber l'anse de platine (porter le fil au rouge sur toute sa longueur) puis la laisser refroidir.
5. Mélanger avec l’anse de platine une goutte du culot de centrifugation du L.C.R. avec l’encre de
Chine.
6. Plonger de nouveau l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl puis porter le
fil au rouge pour détruire les germes.
7. Recouvrir d’une lamelle.
8. Observer au microscope (objectif 40 x, oculaire 10 x)
REPONSES TYPES :
•
Présence de :
•
Recherche négative.
Quantité :
Rares, quelques, nombreuses.
Levures entourées d’une capsule.
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COLORATION DE GRAM
PRINCIPE :
La coloration de Gram est une coloration différentielle : Elle permet de classer les bactéries en deux groupes
sur base de la perméabilité de leur paroi à l’Alcool (ou à l’Alcool/Acétone). Cette perméabilité dépend de la
composition de la paroi bactérienne (épaisseur de la paroi liée à sa richesse en peptidoglycanes) et n’est
pas absolue. D’où la difficulté technique d’une bonne coloration de Gram. Cette technique garde toute sa
pertinence, même dans un laboratoire plus sophistiqué en raison de sa rapidité et de l’orientation
diagnostique qu’elle donne.
La coloration de Gram utilise 4 réactifs :
•
Le Cristal Violet qui colore tout en violet.
•
Le Lugol faible, qui se complexe au cristal violet, formant un colorant violet
soluble dans l’alcool.
•
L'Alcool ou l’Alcool/Acétone qui décolore certaines bactéries (celles dont la
paroi est perméable à l’alcool), mais pas d'autres (celles dont la paroi est
imperméable à l’alcool).
•
La Safranine (ou la Fuchsine de Ziehl, diluée 10 x v/v), qui colore en
rouge/rose les bactéries décolorées par l'alcool, sans modifier la couleur des
autres bactéries (violet foncé/bleu).
On distingue ainsi les bactéries :
•
Gram positives (paroi épaisse) qui sont colorées en violet foncé/bleu.
•
Gram négatives (paroi mince) qui sont colorées en rouge/rose.
MATERIEL :
Lame, diamant, mélange sable/crésyl, anse de platine, lampe à alcool, méthanol, cristal violet, lugol
faible pour Gram, alcool à 95° (ou alcool acétone), safranine (ou fuchsine de Ziehl diluée 10x v/v),
support de coloration des lames, support sèche lame, microscope, huile à immersion.
METHODE :
1. Enregistrer l’échantillon et noter au diamant le numéro du patient sur une lame neuve.
2. Flamber la lame neuve numérotée en la passant 3 x sur la flamme d'une lampe à alcool.
3. Plonger l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl [ou sable/alcool à 70 %].
4. Flamber l'anse de platine (porter le fil au rouge sur toute sa longueur) puis la laisser refroidir.
5. Etaler à l’aide de l'anse de platine le prélèvement sur la lame flambée, pour faire un frottis aussi
mince que possible.
6. Plonger de nouveau l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable/crésyl puis porter le
fil au rouge pour détruire les bactéries.
7. Laisser sécher à l'air, à l'abri des insectes.
8. Fixer l'étalement en recouvrant la lame de méthanol pur. [ou fixer à la flamme en passant la lame 3
x sur la flamme d'une lampe à alcool, le côté sur lequel est étalé l'échantillon dirigé vers le haut].
9. Eliminer le méthanol et laisser sécher [ou laisser refroidir].
10. Couvrir complètement la lame de Cristal violet ou violet de gentiane pendant 1 minute 30 secondes.
11. Rincer la lame à l'eau (propre ou filtrée).
12. Couvrir complètement la lame de Lugol faible (Lugol pour Gram) pendant 1 minute 30 secondes.
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13. Rincer très soigneusement la lame à l'eau (propre ou filtrée).
14. Décolorer à l'alcool à 96 % [ou à l’alcool acétone] : Effectuer la décoloration en tenant la lame entre
le pouce et l’index. Laisser couler goutte à goutte de l'alcool à 96 % [ou de l’alcool acétone] sur la
lame tout en observant la décoloration. Dès que l'alcool n'entraîne plus de violet, arrêter
immédiatement la décoloration en plongeant la lame dans un bécher contenant de l'eau (propre ou
filtrée). La durée de décoloration dépend du type de prélèvement et de l’épaisseur de l’étalement.
Elle varie de 2 à 30 secondes. Plus la concentration en acétone est élevée, plus rapide et donc
plus délicate sera la décoloration.
15. Rincer à l'eau (propre ou filtrée).
16. Couvrir complètement la lame de Safranine ou Fuchsine de Ziehl diluée pendant 1 minutes 30
secondes (1 ml de Fuchsine de Ziehl + 9 ml d'eau (propre ou filtrée) : Comme la Fuchsine diluée se
conserve mal, il faut la préparer juste avant usage).
17. Rincer à l'eau (propre ou filtrée).
18. Sécher à l'air.
19. Observer la lame au microscope (à l’huile d’immersion, objectif 100 x, oculaire 10 x)
REPONSES TYPES :
•
Présence de :
Quantité :
Forme des bactéries :
Disposition des bactéries :
Coloration :
Localisation des bactéries :
Particularités :
Cellules :
•
Rares, quelques, nombreux.
Coques, bacilles, ...
Par 2 (= diplo-), en chaînettes, en grappes.
Gram positif ou Gram négatif.
Intra ou extracellulaires.
Capsules, ...
Présence, nombre et type de cellules (leucocytes, cellules
épithéliales,…).
Recherche négative.
INTERPRETATION DES RESULTATS :
La coloration de Gram est une technique délicate. L’élément essentiel et critique est la décoloration par l’alcool (ou l’alcool
acétone). Une décoloration trop courte donnera de faux Gram positifs, alors qu’une décoloration trop longue donnera de faux
Gram négatifs.
Pour des examens directs, il est possible de valider la qualité de la coloration de Gram sur base de la coloration des cellules
éventuellement présentes : Les leucocytes présents doivent avoir un cytoplasme uniformément rouge (cytoplasme Gram
négatif) alors que leurs noyaux doit être partiellement bleu et rouge (noyau Gram positif).
Décoloration trop courte : Les cytoplasmes des leucocytes restent violets.
Décoloration trop longue : Les noyaux des leucocytes sont rouges.
L’interprétation du caractère Gram des bactéries se fait donc dans les environs immédiats d’endroits bien colorés (déterminé
sur base de la coloration des leucocytes). En cas de décoloration trop longue, les bactéries qui sont encore colorées en bleu
sont sûrement des bactéries à gram positif.
Faux Gram positifs :
•
•
•
•
Décoloration trop courte.
Etalement trop épais.
Rinçage insuffisant après la solution de Lugol.
…
Faux Gram négatifs :
•
•
•
•
•
•
•
•
Décoloration trop longue.
Action trop courte du Cristal Violet.
Action trop courte du Lugol.
Solution de Lugol périmée (jaune et non brune) ne formant plus de complexes avec le cristal violet.
Destruction de la paroi bactérienne par des antibiotiques
Destruction de la paroi bactérienne par une fixation à la flamme trop longue.
Culture trop âgée ou échantillon trop vieux.
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CLASSIFICATION DES BACTERIES SUR BASE
DE LEURS MORPHOLOGIES ET DE LEURS COULEURS AU GRAM
Bactéries à GRAM POSITIF Bactéries à GRAM NEGATIF
(Violet foncé / Bleu)
(Rose / Rouge)
Coques en grappes
(diplo)Coques
Arrondies,
Par deux ou en amas.
Exemples :
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus
…
Coques en chaînes
Ovoïdes,
Par deux ou en chaînettes.
Exemples :
1
Streptococcus pyogenes (β hémolytique) [A]
Streptococcus agalactiae (β hémolytique) [B]
Enterococcus faecalis (entérocoques) [D]
…
Par deux, avec une capsule
Arrondies,
Par deux ou en amas.
Exemples :
[Lautropia mirabilis],
…
Diplocoques
Diplocoques,
Réniforme (grains de café ou haricot),
intra ou extra cellulaires.
Exemples :
Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrhoeae
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Autres Neisseria
…
Exemples :
Streptococcus pneumoniae (α hémolytique)
1
[ ] Sérogroupes des Streptococcus spp., classification de Lancefield basée sur les antigènes polysaccharidiques C de leur paroi. S.
pneumoniae n’en possède pas.
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CLASSIFICATION DES BACTERIES SUR BASE
DE LEURS MORPHOLOGIES ET DE LEURS COULEURS AU GRAM
Bactéries à GRAM POSITIF
Bactéries à GRAM NEGATIF
(Violet foncé / Bleu)
(Rose / Rouge)
Gros bacilles
Gros bacilles
Gros bacilles,
Formant des spores
Arrondis
Exemples :
Bacillus (Bacillus cereus, Bacillus
subtilis,…)
Clostridium (Clostridium tetani,
Clostridium difficile, Clostridium
botulinum, Clostridium perfringens…)
…
Gros bâtonnets,
Courts ou longs
Parfois bi polaires (E. coli)
Exemples :
Entérobactéries (E. coli, Shigella,
Salmonella, Citrobacter, Klebsiella,
Yersinia, Proteus,…)
Pseudomonas (Pseudomonas
aeruginosa,…)
Borrelia
…
Rectangulaires
Exemples :
Bacillus anthracis
Bacilles moyens
Taille moyenne,
Réguliers,
Formant des chaînes.
Exemples
Lactobacillus acidophilus
Bacilles moyens
Taille moyenne,
En forme de virgules
polymorphes
(Gram labile)
Exemples :
Vibrio cholerae
Petits bacilles
Petits, granulés, irréguliers,
Polymorphes,
« Corynéformes »
Exemples
Listeria monocytogenes
Gardnerella vaginalis
Bacteroïdes
Mycobacterium
Corynebacterium diphteriae
…
Petits bacilles
Coccobacilles,
Fins, polymorphes.
« Haemophilus like »
Exemples :
Haemophilus influenzae,
Haemophilus ducreyi
Brucella
Bordetella
…
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COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN A CHAUD :
PRINCIPE :
La coloration de Ziehl-Neelsen est une coloration assez spécifique pour les mycobactéries. Elle repose sur
une caractéristique fondamentale des mycobactéries : leur alcoolo-acido résistance, liée à la présence
importante de lipides au niveau de leur paroi.
La coloration de Ziehl-Neelsen utilise 3 réactifs :
•
La Fuchsine de Ziehl, colorant rouge associé à un mordant qui colore tout en
rouge.
•
L’alcool-acide [ou acide dilué] qui décolore tout à l’exception des mycobactéries.
•
Le bleu de méthylène qui contrecolore en bleu tout ce qui n’est pas coloré en
rouge. Permettant ainsi d’augmenter le contraste.
On distingue ainsi les Bacilles Alcoolo-Acido Résistant ou BAAR (colorés en rouges) des autres bactéries et du fond (colorés en bleu).
MATERIEL :
Matériel pour la préparation des échantillons + solution de fuchsine de Ziehl, alcool-acide [ou acide
sulfurique à 20 %], solution de bleu de méthylène, pince, coton, papier filtre, entonnoir, support de
coloration des lames, support sèche lames, microscope, huile à immersion, papier doux.
METHODE :
1. Déposer les lames fixées sur des barres en position horizontale. Les lames ne peuvent jamais se
toucher.
2. Recouvrir chaque lame de fuchsine de Ziehl pré filtrée.
3. Chauffer chaque lame individuellement par le dessous (bec bunsen, lampe à
alcool ou pince portant un morceau de coton imbibé d’alcool et enflammé),
jusqu’à émission de vapeurs. Ne pas faire bouillir.
4. Laisser agir le colorant pendant au moins 5 minutes (un temps prolongé intensifie la coloration. Le
colorant ne peut cependant sécher pour éviter la précipitation de la fuchsine)
5. Rincer délicatement à l’eau courante.
6. Recouvrir la lame d’alcool acide. Laisser agir 1 minute. Si après rinçage, la préparation n’est pas
encore incolore, décolorer une seconde fois. (Il est pratiquement impossible de décolorer les
mycobactéries sauf Mycobacterium leprae et éventuellement des mycobactéries altérées par un
traitement tuberculostatique).
7. Rincer délicatement à l’eau courante.
8. Recouvrir la lame de bleu de méthylène.
9. Laisser agir le colorant 2 minutes.
10. Rincer délicatement à l’eau courante.
11. Laisser sécher à l’air libre (pas au soleil ce qui diminuerait l’intensité de la couleur rouge). Ne pas
utiliser de papier pour sécher les lames (risque de transfert de bacilles d’une lame à l’autre).
12. Observer la lame au microscope (à l’huile d’immersion, objectif 100 x, oculaire 10 x). Pour éviter les
contaminations entre lames via l’huile d’immersion, nettoyer l’objectif à immersion entre chaque
lame.
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TUBERCULOSE 2
INTRODUCTION :
Le nombre total de cas de tuberculose est en train d’augmenter dans le monde : s’il y avait
7.5 millions de cas en 1990 et 8.8 millions en 1995, en l’an 2002, on comptait plus de 10
millions de personnes atteintes au niveau mondial. Selon l’OMS entre 2 et 3 millions de
décès annuels sont imputables à la tuberculose.
Les causes de la dispersion de la tuberculose seraient liées à la malnutrition, à la
surpopulation et au manque d’infrastructures de santé.
Il est clair que le VIH joue aussi un rôle important : 40 % des 14 millions de sujets atteints
par le VIH seraient co-infectés par la tuberculose.
CARACTERISTIQUES :
Le groupe des mycobactéries comporte plus de 70 espèces identifiées, mais relativement peu sont
réellement pathogènes pour l’homme ou l’animal. Les agents causals de la tuberculose humaine sont les
mycobactéries du complexe « tuberculosis » Mycobacterium tuberculosis [bacille de Koch] (le plus virulent
pour l’homme), Mycobacterium bovis (dont une souche atténuée est utilisée pour la préparation du vaccin
BCG, [bacille de Calmette-Guérin]), Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti,... Des infections
opportunistes dues à des mycobactéries non tuberculeuses (mycobactéries atypiques : complexe
Mycobacterium avium, …) sont cependant en augmentation, principalement dans les pays développés.
Toutes les mycobactéries sont des germes :
•
•
•
•
•
•
•
•
•
fins, en forme de bâtonnets (bacilles), de 3 – 5 µm de long, légèrement recourbés le plus souvent
par deux, parfois en groupes ou accolés ;
gram positif (mal colorés par le gram) ;
qui ne forment pas de spores ;
Alcoolo-Acido Résistants (
BAAR ou Bacilles Alcoolo-Acido Résistants) ;
identiques morphologiquement (au microscope). Il existe néanmoins des formes particulières
comme par exemple pour la lèpre ou pour certaines mycobactéries opportunistes, mais cette
distinction morphologique exige une très grande expérience.
aérobies ;
immobiles ;
cultivables, mais poussant très lentement sur des milieux de culture spéciaux par exemple sur
Löwenstein-Jensen en 3 à 8 semaines ;
sensibles aux ultra–violets (U.V.), et au Dettol ® mais peu sensibles aux désinfectants chlorés.
LOCALISATIONS :
Tous les organes peuvent être atteints (tuberculose extrapulmonaire), mais la forme la plus rencontrée et la
plus contagieuse est la tuberculose pulmonaire.
PRECAUTIONS PARTICULIERES:
Comme la tuberculose se transmet par voie aérogène par suite de la dispersion dans l’air de microparticules
de 2 à 10 µm, la collecte et la préparation des échantillons de crachat sont des actes potentiellement à
risques. Des mesures de précautions doivent donc être envisagées :
Toutes les mesures doivent être prises pour diminuer tant les contacts avec des aérosols que la production
d’aérosols.
L’usage de masques de protection respiratoire anti-inhalation peut être envisagé : il s’agit de masques
classés P2 (Filtering Face piece Particles 2 or FFP2) selon les normes européennes (ou N95 selon les
normes américaines) qui permettent un filtrage des gouttelettes supérieure à 0,6 µm avec une efficacité de
l’ordre de 94 % en prenant en compte l’adhérence au visage variable et les éventuelles fuites (exemple filtre
2
Ressources internet utiles : http://www.who.int/gtb/publications/TBCatalogue.htm
http://www.iuatld.org/full_picture/en/frameset/frameset.phtml [entre autres disponible auprès de ce site en format pdf : TECHNICAL
GUIDE Sputum Examination for Tuberculosis by Direct Microscopy in Low Income Countries]
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3 M N°8810). L’application correcte du masque est indispensable pour une bonne efficacité : une
explication doit être dispensée à toute personne susceptible d’avoir à le porter. Il a une efficacité limitée à 3
heures (à vérifier pour chaque producteur !) et est inefficace en cas de fuites plus importantes (personnes
avec une barbe, même d’un jour,…). Compte tenu de son prix élevé (au minimum 0.50 € pièce, le plus
souvent plus de 1 € en 2005), on pourrait limiter sont utilisation : par exemple 1 masque par personne et par
jour car il est rare de rester plus de 3 heures par jour dans un zone contagieuse. Dans les zones à faible
risque de résistance et où la ventilation est plus aisée (Afrique, Asie), le port de masque ne serait
éventuellement recommandable que pour les laborantins lors des prélèvements des crachats (et de la
préparation des étalements). Le port du masque anti-inhalation ne protège pas à 100% et n’est qu’un
complément, très onéreux, d’autres mesures (collecte des crachats à l’extérieur en plein air avec une
prise en compte du sens du vent, ventilation, décontamination, larges fenêtres permettant la pénétration des
UV, diminution du temps passé dans les zones à risques, sectorisation des zones et des patients,
incinération correcte des crachoirs, lampes à UVC, etc.). Une mauvaise utilisation de ces masques peut
avoir un effet pervers en offrant uniquement un sentiment de protection.
Les masques de protection respiratoire (FFP : Filtering
Facepiece Particles) : Limitent l’inhalation d’aérosols de
particules et gouttelettes en suspension dans l’air.
Protection de la personne qui porte le masque contre
les risques d’inhalation d’agents infectieux.
Les masques médicaux : Piègent les gouttelettes émises
lors de l’expiration par le soignant (masques de soins,
masques chirurgicaux).
Protection des personnes entourant celui qui porte le
masque contre les aérosols qu’il émet.
Performances des masques de protection respiratoire. Essais effectués avec un aérosol de 0,6 µm de diamètre médian (particules de
0,01 à 1 µm)
Type
P1 ou FFP1
P2 ou FFP2
P3 ou FFP3
Pénétration du filtre
< 20 %
<6%
< 0.05 %
3
Fuite totale
< 22 %
<8%
<2%
4
L’usage d’un flux laminaire (hotte de sécurité ou biosafety cabinet) n’est recommandable que si son
fonctionnement peut être contrôlé complètement et très régulièrement.
Durant toutes les manipulations potentiellement dangereuses qui doivent se faire à l’intérieur (étalement des
crachats), l’usage d’un extracteur d’air (du type « hotte de cuisine ») peut diminuer les risques. Au cas où
un extracteur n’est pas envisageable, tenir compte du sens des courants d’air pour positionner la table de
travail ou le patient. L’usage d’un petit local judicieusement choisi pour y réaliser les tâches à risque
permettra aussi de diminuer les risques. Durant les manipulations à risque, le moins de personnel possible
doit être présent.
Le désinfectant habituellement utilisé pour les micro-organismes (solution diluée d’hypochlorite [eau de
Javel]) n’est que peu efficace sur les mycobactéries. Une solution de Dettol® à 10 % est une alternative
envisageable.
3
Il faut retenir que les demi-masques jetables de type FP1 à FP3 protègent contre les aérosols c’est-à-dire des suspensions de
particules solides ou liquides, mais ne protègent en aucun cas contre les vapeurs ou les gaz.
4
L’efficacité globale d’un appareil de protection respiratoire ne dépend pas uniquement de l’efficacité du filtre. Elle dépend également
des fuites au niveau du visage. Il faut souligner que l’étanchéité d’une pièce faciale peut-être considérablement réduite par une barbe
(même de quelques jours). Ce type de masques est donc déconseillé aux barbus. L’inconfort lié à l’utilisation du masque, surtout s’il
fait très chaud va aussi limiter son usage par le personnel.
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DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE :
La particularité de l‘Alcoolo-Acido Résistance des mycobactéries (BK, Mycobacterium leprae,
Mycobacterium ulcerans,…mais aussi des mycobactéries non pathogènes, peu pathogènes ou
saprophytes) donne la possibilité de colorer les mycobactéries, sans que ce colorant ne puisse être éliminé
par un alcool ou un acide. Les mycobactéries qui sont appelés par conséquence des Bacilles AlcooloAcido Résistants (BAAR). L’Alcoolo-Acido résistance est liée à la présence importante de lipides au niveau
de la paroi de ces bactéries.
Deux systèmes microscopiques sont utilisables pour détecter la présence de BAAR :
•
La microscopie à fluorescence après coloration non immunologique à l’auramine : On
recherche des bacilles fluorescents sur un fond foncé. Cette technique est principalement utilisée
dans les pays industrialisés en raison de la diminution du temps de lecture microscopique requis
(utilisation d’un objectif 40x ou 25x). Sa sensibilité serait un peu plus haute en raison d’un meilleur
contraste. Cette technique est cependant beaucoup plus chère et beaucoup plus difficile
techniquement que la microscopie « normale ». Elle nécessite de plus obligatoirement l’utilisation
d’un microscope fonctionnant à l’électricité. En raison d’une spécificité assez faible, les
échantillons positifs devraient être confirmés en lumière transmise (re-coloration de Ziehl possible
sur la même lame)[au moins dans un premier temps]. Cette technique n’est donc envisageable
que pour des laboratoires qui gèrent beaucoup d’échantillons (plus de 50 [30 ?] échantillons par
jours), avec du personnel très compétent.
•
La microscopie en lumière transmise (« optique ») après coloration au Ziehl ou une de ces
variantes : Cette technique reste le meilleur examen pour le terrain. Elle a une sensibilité
convenable tout en ne nécessitant qu’un équipement restreint. Cette technique est simple et
robuste, mais nécessite cependant un temps d’observation microscopique plus long (utilisation d’un
objectif 100 x).
PRISE D’ÉCHANTILLONS (TUBERCULOSE PULMONAIRE) :
Des instructions précises doivent être données à chaque patient sur la manière de produire un bon
échantillon. Une bonne procédure de prise d’échantillon est en effet indispensable pour obtenir des
résultats de laboratoire fiables à moindre risques pour le personnel (cf. précautions particulières page 13) :
•
Le risque d’infection du personnel de santé (mais aussi d’autres personnes) est important lorsqu’un
patient suspect de tuberculose tousse. Pour cette raison, la prise d’échantillon doit se faire à
l’extérieur, le plus loin possible d’autres personnes, en tenant compte de l’orientation du vent. En
cas d’impossibilité, une pièce spéciale, séparée et très bien ventilée, peut être utilisée (attention à
la position du patient par rapport aux ventilations et au sens des courants d’air provenant de portes
ou de fenêtres ouvertes).
•
Chaque crachoir doit être identifié (date, nom du patient, numéro de patient, n° de l’échantillon).
Pour éviter tout risque d’inversion, ces données doivent figurées sur le pot et non sur le couvercle
du crachoir.
•
Des crachoirs en plastique dur, à usage unique avec couvercle à vis étanche et avec un diamètre
d’ouverture de 2 à 3 cm sont vivement recommandés. En cas d’impossibilité, des crachoirs
réutilisables en verres, avec les mêmes caractéristiques peuvent être utilisés (ils doivent alors bien
évidemment être décontaminés, lavés et stérilisés avant toute réutilisation). Les crachoirs doivent
être transparents pour permettre un contrôle visuel de la qualité du prélèvement sans devoir les
ouvrir.
•
Le crachat doit provenir du plus profond possible du poumon. Ceci peut le plus souvent être
obtenu après plusieurs profondes inspirations suivies d’une expiration forcée. Le volume de
l’échantillon doit être suffisant (3 à 5 ml) et doit contenir des particules solides ou purulentes. (la
salive n’est pas un bon échantillon en raison du faible nombre de bacilles pulmonaires que l’on peut
y trouver et de la présence possible de mycobactéries commensales. Il en est de même pour les
sécrétions nasales). Le crachat n’est cependant pas toujours purulent, surtout en cours de
traitement.
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•
On récolte 2 ou 3 crachats : le premier sur place lors de la consultation (on the spot sputum), le
deuxième à la maison (crachat du saut du lit ou early morning sputum) et éventuellement le
troisième sur place à l’occasion de la consultation suivante. (le processus nécessite donc 2 jours).
Le meilleur échantillon sera le prélèvement matinal qui concentre les sécrétions de toute une nuit.
Pour cette raison, dans certains programmes, deux crachats matinaux et un crachat sur place sont
utilisés.
Comment juger de la qualité d’un crachat : Un bon prélèvement ne doit pas ressembler à de l’eau.
Sa couleur peut varier : du blanchâtre au jaunâtre purulent, avec parfois un peu de sang. (Du sang pur
n’est pas cependant pas adéquat). Un échantillon ressemblant à de la salive devrait être refusé, et le
patient devrait être encouragé à produire un nouvel échantillon valable. Au cas où rien de mieux ne
peut être obtenu (surtout en cours de traitement), un échantillon aqueux pourrait cependant être
analysé.
La qualité du crachat peut aussi être évaluée après étalement et coloration : Un échantillon salivaire
sera très peu épais et souvent avec des « bulles ». Sous le microscope, un vrai crachat doit contenir
des filaments muqueux et des globules blancs, tandis qu’un prélèvement salivaire contiendra
principalement des cellules épithéliales. Un vrai crachat devrait contenir 20 x plus de globules blancs
que de cellules épithéliales.
Un crachat peut être conservé assez longtemps avant analyse microscopique (plus d’une semaine à
température ambiante). Ceci n’est bien évidemment pas vrai pour des cultures. Les crachats peuvent
donc être collectés dans un centre de santé périphérique puis envoyés au laboratoire pour analyse. Cette
conservation avant analyse augmente même légèrement la sensibilité de l’examen en raison de la
liquéfaction du crachat (homogénéisation de l’échantillon). Pour diminuer la fermentation (attention au
risque de production d’aérosols lors de l’ouverture du crachoir), le crachat sera cependant conservé si
possible au frigo.
REMARQUES :
1. Il existe une méthode d’induction des crachats en laissant inhaler au patient une solution saline
hypertonique (3 à 5 %) à l’aide d’un nébuliseur. (Ce procédé est potentiellement dangereux
puisqu’il se fait à l’intérieur et nécessite une décontamination de l’appareil, pour un gain de
sensibilité discuté. Comme les mycobactéries sont plus résistantes que la majorité des
bactéries, le matériel nécessite une stérilisation plus longue).
2. Un tubage gastrique (qui a pour but de recueillir les mucosités dégluties pendant le sommeil)
ou un lavage broncho alvéolaire sont parfois utilisés (avec tous les risques liés à une technique
plus invasive, et un risque de faux positif lié aux mycobactéries de l’environnement).
TECHNIQUES DE CONCENTRATIONS :
Il existe plusieurs méthodes pour concentrer les mycobactéries dans un prélèvement : liquéfaction du
crachat suivi de centrifugation, sédimentation, flottation, etc. Leurs rôles sont discutables, elles exigent
beaucoup de temps, une prise de risque accrue pour le personnel, pour un gain de sensibilité peu certain.
ETALEMENT DES CRACHATS :
Le risque de contamination du personnel de laboratoire durant la préparation de l’étalement est faible mais
réel (cf. précautions particulières page Error! Bookmark not defined.). Il est donc recommandé de
réaliser cette partie de l’examen dans une pièce spéciale bien ventilée (si possible, usage d’extracteur d’air
du type hotte de cuisine, ou tenir compte du sens des courants d’airs), et d’utiliser une procédure diminuant
le risque de production d’aérosols. L’usage d’un flux laminaire n’est recommandable que si son
fonctionnement peut être contrôlé complètement et très régulièrement. Le port d’un masque de type FFP2
durant cette procédure pourra être envisagé. La manipulation des crachoirs et des lames peut se faire sur
une feuille de papier absorbant imbibé de Dettol à 10 % (diminution du risque de production d’aérosols).
L’usage de lames porte-objet neuves, propres, dégraissées et non griffées est vivement recommandé.
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L’identification et la numérotation des lames sont capitales (code du laboratoire, numéro du patient et
numéro de crachat)! Pour ce faire, on peut utiliser soit un crayon gras soit mieux un stylo diamant. (Ces
inscriptions ne s’effaceront pas au contact des réactifs de coloration).
1.
2.
3.
4.
Vérifier la correspondance entre le crachoir et la lame.
Casser un applicateur en bois.
Ouvrir délicatement le crachoir pour éviter la formation d’aérosols.
Avec la partie dentelée de l’applicateur cassé, sélectionner une particule jaune et purulente du
crachat (utiliser l’autre partie de l’applicateur pour casser éventuellement des particules trop
grandes).
5. Etaler cette particule sur la partie centrale de la lame avec un mouvement de rotation continu.
6. L’étalement doit être mince et homogène (de telle façon que l’on puisse encore lire un texte à
travers l’étalement). La taille recommandée pour un étalement est de 1 cm de large sur 2 cm de
long (soit plus ou moins 100 champs microscopiques de long à l’objectif 100 x).
A12
3-3
7. Refermer le crachoir (qui devra être conservé jusqu’au moment ou tous les résultats auront été
enregistrés et répondus).
8. Laisser sécher la lame pendant 30 minutes à l’air et à l’abri des mouches.
NB : Une anse de platine peut aussi être utilisée à la place d’applicateurs en bois pour réaliser l’étalement.
Elle doit alors être flambée entre chaque patient. Pour diminuer le risque de production d’aérosol
dangereux, elle sera décontaminée mécaniquement, avant flambage, par immersion profonde dans un lit
de sable contenant un désinfectant actif sur les mycobactéries).
DIAGNOSTIC DES TUBERCULOSES EXTRA-PULMONAIRES :
Le diagnostic des autres formes de tuberculose est plus difficile et repose sur la culture, sur l’analyse
histologique du matériel pathologique et sur d’autres techniques sophistiquées.
Pour la méningite tuberculeuse : (cf. les méningites) La concentration bacillaire est souvent très faible. Si la
sensibilité d’une recherche de BAAR sur le culot de centrifugation du LCR (à haute vitesse pendant 20
minutes) est base (< 20 %), sa spécificité est très haute.
Pour les pleurésies tuberculeuses, les péricardites tuberculeuses et les péritonites tuberculeuses, le test de
Rivalta, associé à la différentiation des leucocytes présents peuvent être utiles pour orienter le diagnostic.
La sensibilité de la mise en évidence de BAAR dans ces liquides est de l’ordre de 5 %, mais avec une très
bonne spécificité.
Pour la tuberculose ganglionnaire : ne jamais ponctionner le ganglion en raison du risque de fistulisation,
mais l’exciser. Après excision, couper le ganglion en deux et avec un des côtés intérieurs, réaliser des
empreintes sur une lame (= préparation de Deps). La sensibilité de la microscopie est de l’ordre de 35 %.
Au cas où des techniques plus sophistiquées ne sont pas disponibles, il est donc possible d’utiliser la
microscopie pour aider au diagnostic de ces infections. Si un résultat négatif n’aidera en rien le clinicien, il
n’en est pas de même pour un résultat positif.
Pour la tuberculose rénale: il est envisageable de rechercher les BAAR sur une urine matinale après
centrifugation à haute vitesse pendant 20 minutes. La sensibilité et la spécificité (présence de
mycobactéries banales dans le tractus génito-urinaire) très basses de cette recherche limitent fortement
son utilité.
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FIXATION DES ÉTALEMENTS :
Après séchage total (pour diminuer le risque de production d’aérosols, mais aussi pour éviter
la dégradation des mycobactéries ou la perte de l’étalement), les étalements sont fixés (soit à
la flamme, soit à l’éthanol ou au méthanol qui conserve mieux la morphologie des germes).
Après fixation, les étalements peuvent être conservés des mois avant coloration. Il est ainsi
possible de conserver des lames fixées comme contrôles positifs ou négatifs.
LA COLORATION DE ZIEHL NEELSEN À CHAUD
La particularité de l‘Alcoolo-Acido Résistance des mycobactéries (BK, Mycobacterium leprae,
Mycobacterium ulcerans,…mais aussi des mycobactéries non pathogènes, peu pathogènes
ou saprophytes) donne la possibilité de faire une coloration spécifique qui colore en rouge
les mycobactéries qui sont appelés par conséquence des Bacilles Alcoolo-Acido Résistants
(BAAR).
Remarque : D’autres germes sont cependant aussi Alcoolo-Acido Résistants : les
Corynébactéries, les Actinomyces, les Nocardia spp., les oocystes de Cryptosporidium …
On distingue différentes variantes de cette coloration, toutes basées sur la qualité « BAAR » :
Ziehl à chaud Ziehl à froid, Kinyoun, Tan Thiam Hok, Gabbet,... Toutes utilisent les mêmes
réactifs, mais à des concentrations différentes, avec des temps de coloration différents ou
une température de coloration différente. [Il existe même une variante pour daltonien, la
technique de Tison qui utilise d’autres produits et colore les BAAR en bleu sur un fond jaune].
La coloration de Ziehl Neelsen à chaud serait la plus robuste (la fuchsine est effectivement
en solution) et donne une couleur plus intense. Elle serait donc la plus fiable. Elle nécessite
cependant un peu plus de travail et produit plus de vapeurs de phénol toxiques. Comme
toutes ces variantes sont assez équivalentes, il est préférable de suivre la technique
préconisée par le Programme National de Lutte contre la Tuberculose du pays. Nous ne
décrirons cependant que la coloration de Ziehl Neelsen à chaud.
EXAMEN MICROSCOPIQUE DE LA PRÉPARATION :
Cet examen exige un bon microscope (de préférence binoculaire, avec une luminosité
suffisante et bon chariot) et beaucoup de minutie. ATTENTION : Maximum 25 préparations
par jour et par microscopiste. Pour obtenir des résultats fiables, il faut en plus avoir
régulièrement des échantillons positifs (au moins 1 échantillon positif par semaine).
Rechercher les BAAR à l’objectif à immersion 100 x (oculaire 10 x).
Examiner
systématiquement la préparation pendant 5 - 10 minutes ou 100 champs microscopiques
contigus. (Soit une longueur de 2 cm environ). Il est important de micrométrer chaque
champ microscopique pour observer la présence des BAAR éventuels dans toute l’épaisseur
de la préparation). En examinant plus de champs microscopiques on gagne très peu en
sensibilité. On estime qu’il faut entre 50.000 à 100.000 BAAR/ml de crachat pour trouver un
étalement positif (de l’ordre de 10.000 BAAR/ml pour un laboratoire de référence). Les
mycobactéries se retrouvent principalement dans les parties cellulaires et muqueuses de la
préparation. Les BAAR typiques apparaissent comme de minces bâtonnets souvent
incurvés, colorés en rouge intense. Ils sont soit isolés, ou groupés en amas ou en cordes.
Toutes les autres bactéries ne doivent pas être considérées ni rapportées.
.
QUANTIFICATION DES RÉSULTATS :
Nombre de BAAR par
champ microscopique
(grossissement 1.000x)
Absents
Moins de 1 BAAR par 100 champs
De 1 à 9 BAAR par 100 champs
De 1 à 9 BAAR par 10 champs
De 1 à 9 BAAR par champ
10 BAAR ou plus par champ
Echelle
5
OMS/UICTMR
Echelle
6
ATS
Négatif
+ / - (rare)
+ / - (rare)
1+
2+
3+
négatif
+ / - (rare)
1+
2+
3+
4+
Nombre minimal de
champs microscopiques
à observer
100
200-300
200-300
100
50
20
La différence entre ces deux échelles de résultats est le choix du seuil de positivité : 1 BAAR/
10 champs ou moins. On joue donc sur la spécificité, mais ceci se fait bien évidemment au
détriment de la sensibilité. Il est préférable d’utiliser l’échelle de quantification recommandée
par le Programme National de Lutte contre la Tuberculose du pays.
Le microscopiste doit rapporter ce qu’il a vu, sans interprétation. Ceci signifie qu’il va
rapporter des BAAR et non diagnostiquer la tuberculose. Si le nombre de BAAR observés se
retrouve au niveau de la valeur seuil de l’échelle (+ /-), le résultat final doit rester un nombre
de BAAR et non être transformé en positif ou négatif
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS :
•
•
La sensibilité de la microscopie est déterminée par différents facteurs : phase de la
maladie, immunodépression associée, gravité des symptômes, qualité des
expectorations, qualité du frottis, qualité de la coloration, qualité des colorants, état et
qualité du microscope, motivation et expérience du microscopiste,… La sensibilité de
la microscopie pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire serait de l’ordre de 75
%. La sensibilité est cependant moins bonne pour les petits enfants (en raison de la
difficulté d’obtenir un crachat) et pour les immunodéprimés (de l’ordre de 60 % ou
même moins).
Le pourcentage de détection varie en fonction du nombre de crachats examinés
7
(pour la tuberculose pulmonaire à microscopie positive)
Sur :
1 crachat :
2 crachats :
3 crachats :
gain de
gain de
77 – 95 %
4 - 18 %
1- 3 %
•
Si une première série de 3 (2 ?) examens est négative, on répète la procédure deux
semaines plus tard (après un traitement pour autres causes), et éventuellement une
ième
3
fois après un mois. Des examens plus nombreux n’augmenteraient que très peu
la sensibilité de l’examen.
•
La spécificité est l’ordre de 97 %. Les 3 % de faux positifs correspondraient à des
mycobactéries saprophytes (contamination par l’eau, etc.), etc.
•
Pour pouvoir instaurer un traitement, il faut avoir au moins deux échantillons positifs
(échantillons + /- ?).
•
La coloration de Ziehl-Neelsen sur des crachats permet aussi de suivre l’évolution en
ième
cours de traitement : en fin de la phase intensive de traitement, 5
mois et fin de
traitement par exemple. La lecture de ces lames est plus difficiles (bactéries
« mortes » granuleuses). La technique idéale serait la culture, qui n’est pas
cependant pas réalisable dans les petits laboratoires.
5
UICTMR : l'Union Internationale Contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires.
ATS : American Thoracic Society.
7
Taux de détection minimum et maximum publiés dans différentes études.
6
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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CONTRÔLE DE QUALITÉ DES EXAMENS DE CRACHATS POUR BAAR 8:
L’examen microscopique des crachats pour la recherche de BAAR est habituellement réalisé
par des techniciens généraux, souvent après un entraînement minimal. Dès lors le contrôle
de la qualité de leurs résultats est indispensable. Quelques points importants pour ce
contrôle seront brièvement listés :
Si possible effectuer un contrôle de qualité interne au quotidien (ceci n’est bien évidemment
envisageable que si plusieurs laborantins travaillent dans le laboratoire).
Méthodes :
•
Visite de supervision régulière (par du personnel expérimenté [en laboratoire] du niveau
intermédiaire ou central !).
AVANTAGES :
- Contact direct motivant.
- Défauts de procédures mis en évidence suivi d’une correction immédiate.
- Vérification de l’état des stocks et de l’équipement.
MAIS : Méthode onéreuse (déplacement, per diem, temps, personnel compétent et
expérimenté disponible,…)
Complémentaire d’un contrôle continu de la qualité.
•
Contrôle continu de la qualité.
Soit « panel tests » : Lames connues, envoyées sans résultats dans tous les
laboratoires. Considéré comme le moins bon système, mais peut être utile dans des
endroits où la prévalence est basse et/ou les salaires sont assez élevés (charge de
travail limitée). Ce système permet d’apprécier la CAPACITE.
Soit relecture des lames de routine : Meilleur système. Reflète la réalité du terrain,
prend en compte tous les aspects du travail (prélèvement, étalement, coloration,
lecture, motivation, compétence,…). Augmente aussi la qualité de par son existence
(on travaille autrement si on se sait contrôlé), mais représente une charge de travail
importante. Ce système permet d’apprécier la PERFORMANCE.
Objectif de la relecture des lames de routine :
Améliorer le plus possible la qualité, et non :
- Corriger des diagnostics.
- Evaluer individuellement les techniciens (danger de non collaboration, trop
imprécis, taux exact d’erreurs ?)
Ceci permet d’identifier les centres où il peut y avoir des problèmes, et de
déclencher une action corrective.
Principes :
Le moins de lames possible (charge de travail).
Fiabilité statistique par rapport à la fiabilité technique.
¿ Lames positives ? : pas d’erreurs ou bien erreurs systématiques.
¿ Lames négatives ? : erreurs inévitables, valeur critique dépassée ?
8
Exemple de procédure : Limites et exigences du contrôle de qualité de l’examen microscopique des expectorations
pour la recherche de bacilles acido-résistants. A. Van Deun, F. Portaels . Int. J. Tuberc. Lung. Dis. (1998) 2 (9) :
756-765.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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Points d’attention :
Echantillon aléatoire et représentatif :
- Toutes les lames doivent être conservées !
- Positives, négatives et pauci bacillaires (proportion de la routine, choix fait
par le superviseur ou une personne extérieure au laboratoire).
- 60 lames négatives et 60 lames positives par an et par laboratoire seraient
suffisantes pour exclure avec une certitude de 95 % les erreurs graves de
classement et permettre d’envisager des actions correctives ciblées.
Première lecture de contrôle en aveugle : Evite les biais et permet de détecter les
erreurs du premier contrôleur
Deuxième lecture uniquement pour les lames discordantes (résoudre les erreurs des
contrôleurs).
Recolorer les lames ? :
Le mieux avant toute re-lecture :
ème
Au moins avant 2
lecture :
Dépistage d’une mauvaise coloration.
Décoloration de la fuchsine (fading).
[influencée par le temps, lumière et climat
extrême]
Valider les résultats :
Pourcentage d’erreur du premier contrôleur par rapport aux contrôlés.
Retourner les lames à erreurs graves.
Rétro information (attitude positive), identification des causes d’erreurs et corrections
(visite de supervision).
CAUSES D’ERREURS TECHNIQUES :
FAUX POSITIFS :
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
FAUX NÉGATIFS :
Limite de la technique (pas vraiment un
problème en raison de la bonne spécificité
de la technique).
Erreurs administratives : inversion
d’échantillons, de numérotation ou erreurs
de recopiage.
Eraflures
Artéfacts
Particules alimentaires
Dépôts de colorants
Spores, fibres, pollen
Autres bactéries ou mycobactéries (rare)
Récupération des lames
Récupération des crachoirs
Contaminations à partir :
d’un autre crachat
de cuve de coloration,
des papiers filtres,
de l’huile d’immersion,
d’un objectif sale, …
…
Généralement lié à une décentralisation trop
poussée, un manque d’expertise, un manque
d’expérience, un manque de moyens, ….
•
•
•
•
•
•
•
•
Limite de la technique (sensibilité pour
patients pauci bacillaires)
Erreurs administratives : inversion
d’échantillons, de numérotation ou erreurs
de recopiage.
Mauvais échantillon (salive)
Qualité de l’étalement (épaisseur)
Qualité des colorants et des réactifs
Microscope (illumination insuffisante)
Microscopie peu approfondie, (surcharge
ou motivation)
…
Généralement lié à une surcharge de
travail, un manque de motivation, une faible
qualité du microscope,…
RESULTATS ABERANTS :
•
•
•
Manque de connaissance (rare).
Problème de vision.
Microscope inutilisable.
CAUSES D’ERREURS NON TECHNIQUES :
MOTIVATION
Manque de temps.
Tricherie (sortie de médicament, faire plaisir [traitement gratuit],…).
Peur d’un résultat positif.
…
Notes pratiques de bactériologie tropicale
ver pg 22/02/2010
22 / 46
EXAMEN D’UN LIQUIDE DE PONCTION :
PRINCIPE :
La ponction d'une séreuse ne ramène pas de liquide chez une personne normale. Dans
certaines pathologies, on y retrouve des liquides. L'analyse de cet épanchement (évaluation
des protéines et différenciation des cellules) permet une bonne orientation diagnostic.
PRELEVEMENT :
Liquide de ponction (liquide d'ascite ou liquide pleural), récolté dans une seringue ou tube
propre et sec.
LA RÉACTION DE RIVALTA EST ININTERPRÉTABLE EN PRÉSENCE DE SANG,
EN RAISON DE LA CONTAMINATION EN PROTÉINES SANGUINES
(HÉMOGLOBINE ET PLASMA)
REACTION DE RIVALTA :
PRINCIPE :
La réaction de Rivalta met en évidence la présence de protéines dans un liquide par
précipitation en milieu acide. Ce test permet de différencier un liquide riche en protéines (>
30 g/l) d'un liquide pauvre (< 20 g/l). Il n’est utilisable que sur des liquides de ponction
(positivité en fonction de la concentration en protéines attendue).
MATERIEL :
Cylindre gradué de 100 ml, eau distillée (ou propre ou filtrée), pipettes Pasteur, acide
acétique glacial, carton noir.
METHODE :
1. Mesurer 100 ml d'eau (distillée ou filtrée) dans un cylindre gradué en verre de 100
ml.
2. Ajouter, à l'aide d'une pipette pasteur, 3 gouttes d'Acide Acétique Glacial (100 %).
3. Mélanger la solution ainsi préparée.
4. Déposer délicatement, avec une autre pipette pasteur, une goutte de l'épanchement
sur la surface de la solution.
5. Observer la diffusion de la goutte de l'épanchement dans le liquide.
•
La goutte se dissout complètement et instantanément dans la solution. La
réaction est dite négative. Il s'agit d'un TRANSSUDAT, liquide pauvre en
protéines.
•
La goutte forme un précipité qui ressemble à de la fumée de cigarette (ou la
goutte se coagule en masse). La réaction est dite positive. Il s'agit d'un
EXSUDAT, liquide riche en protéines.
REPONSES TYPES :
♦ Aspect macroscopique du liquide de ponction :
♦ Rivalta Positif : EXSUDAT.
♦ Rivalta Négatif : TRANSSUDAT.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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DIFFERENTIATION CELLULAIRES :
PRINCIPE :
Le culot de centrifugation du liquide d'épanchement est coloré et examiné au microscope. La
différenciation des leucocytes éventuellement présents permet une orientation diagnostique.
MATERIEL :
Centrifugeuse, tubes à centrifuger, lames, diamant, mélange sable/crésyl, Giemsa, eau
tamponnée, [May-Grünwald], minuterie, anse de platine, lampe à alcool, (méthanol), support
de coloration des lames, support sèche lame, microscope, huile à immersion.
METHODE :
1. Le liquide d'épanchement est mis dans un tube à centrifuger conique et centrifugé
pendant 10 minutes à 1.000 g.
2. Eliminer délicatement le surnageant. Etaler une goutte du culot sur une lame.
3. Après séchage, la lame est fixée au Méthanol puis colorée au Giemsa comme pour
une goutte épaisse.
4. Lire la lame au microscope à l'objectif 100 x. Evaluer le nombre de leucocytes, puis
les différencier comme pour une formule leucocytaire. Attention, les leucocytes
sont souvent altérés. Ils ne doivent pas être confondus avec des cellules
endothéliales ou des cellules néoplasiques.
REPONSES TYPES :
Estimation du nombre de leucocytes : Rares, peu nombreux, nombreux, très
nombreux.
♦ Pourcentage des Neutrophiles :
___ %
Pourcentage des Eosinophiles :
___ %
Pourcentage des Lymphocytes :
___ %
♦
INTERPRETATIONS DES RESULTATS :
ASPECT MACROSCOPIQUE DU
LIQUIDE DE PONCTION
Séreux : clair, opalescent.
Séro-fibrineux : Jaune citron, ambré.
Purulent : épais, jaune verdâtre ou brun.
Hémorragique : rouge ou rosé.
Chyleux : lactescent, blanchâtre.
Eau de roche : limpide et clair.
9
CE QU'IL EVOQUE
Transsudat
Exsudat
Abcès de la plèvre
Piqûre accidentelle d'un vaisseau,
Traumatisme,
Tuberculose ou Néoplasie
Filariose lymphatique
9
Hydatidose (rare)
La ponction d’un kyste hydatique est vivement déconseillée en raison du risque important d’essaimage.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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LIQUIDE DE PONCTION PLEURALE
ORIGINE
APPARENCE
TRANSSUDATS (Rivalta négatif)
Cardiaque ou rénale
Claire
EXSUDATS (Rivalta positif)
Pleurésie bactérienne
Purulent
Tuberculose
Clair
10
Cancer
Hémorragique
TYPE DE CELLULES
Peu de cellules, lymphocytes
Neutrophiles très nombreux
Lymphocytes nombreux
Hématies
LIQUIDE DE PONCTION D'ASCITE
ORIGINE
APPARENCE
TRANSSUDATS (Rivalta négatif)
Cirrhose
Jaune
Cardiaque
Jaune
Rénale
Jaune ou Blanchâtre
EXSUDATS (Rivalta positif)
Tuberculose
Claire, trouble, ou blanchâtre,
9
parfois hémorragique
Cancer
jaune ou blanchâtre, parfois
hémorragique 9
11
TYPE DE CELLULES
Neutrophiles peu nombreux
Mononuclées, nombreux
Absentes
Nombreuses, lymphocytes à
12
plus de 70 %
Variable, nombreuses
EXEMPLE DE STRATÉGIE DE DIAGNOSTIC POUR LES ASCITES (SELON P.A. REEVE)
13
ASCITE

Turgescentes
veines jugulaires
Insuffisance cardiaque
Non turgescentes

++ à ++++
Protéines urinaires (tigette)
Syndrome Néphrotique
0 à +
Régime pauvre en sel
et diurétique
Ponction d'ascite
Rivalta négatif
Transsudat
Rivalta positif
Exsudat
Cause hépatique
Probable
Probablement TBC
ou Malignité
Continuer
diurétique
Réponse
Problème
hépatique
Ictère
Insuffisance
hépatique
Ictère
Persistance de l'ascite
Pas d'ictère
TBC ou Malignité
Pas d'ictère
TBC possible
Malignité probable
Biopsie péritonéale
Le Rivalta est toujours positif sur un liquide hémorragique, puisqu'il contient de l'hémoglobine qui est une protéine
et du plasma sanguin.
Ce tableau concerne environ 90 % des origines des ascites.
12
La coloration de Ziehl est positive dans moins de 5 % des cas.
13
Ascites : a guide to diagnosis in the district hospital. P.A. Reeve. Tropical Doctor (1992), 22, 52 – 56.
10
11
Notes pratiques de bactériologie tropicale
ver pg 22/02/2010
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LEPRE
INTRODUCTION :
La lèpre est une maladie infectieuse transmissible, due à Mycobacterium leprae ou bacille de Hansen (1873).
Mycobacterium leprae qui fait partie des mycobactéries est un bacille alcoolo-acido résistant de 1 à 8 µm de long et
0.3 – 0.5 µm de large. Il s’agit d’une bactérie intracellulaire, non cultivable in vitro mais inoculable à la souris et au
tatou. Depuis 1985, la prévalence mondiale a diminué de plus de 90 % et plus de 13 millions de personnes ont été
guéries par la polychimiothérapie. En 2004, l’OMS ne considère la lèpre comme un problème de santé publique
(taux de prévalence supérieur à 1 cas sur 10.000) que pour 10 des 122 pays initialement touchés : Angola, Brésil,
Congo, Inde, Libéria, Madagascar, Mozambique, Népal, République centrafricaine et Tanzanie. Début 2003, ces
pays contribuaient à plus de 86 % de la prévalence mondiale et à 88.5 % des nouveaux cas détectés en 2002. Au
début de 2002, 650.000 cas enregistrés étaient sous traitement.
DIAGNOSTIC DE LA LÈPRE :
La définition de l’OMS d’un cas de lèpre est « un malade qui présente des signes évocateurs de lèpre, avec ou sans
confirmation bactériologique et qui a besoin de suivre un traitement spécifique ». On parle de lèpre Pauci Bacillaire
(PB) lorsque le sujet présente de 1 à 5 lésions cutanées et de lèpre Multi Bacillaire (MB) si le sujet présente plus de 5
lésions cutanées (1998). Pour le traitement, la lèpre Pauci Bacillaire est encore subdivisée en lèpre à lésion unique
et lèpre avec 2 à 5 lésions. La bacilloscopie n’est plus indispensable à la mise en œuvre de la prise en charge
thérapeutique. Elle est de plus en plus abandonnée sur le terrain. L’évaluation de l’infection lépreuse et des
modalités de la réponse immunitaire n’est plus réalisée (classification selon Ridley et Jopling en lèpre indéterminée,
tuberculoïde, borderline, lépromateuse,…), l’IntraDermoRéaction utilisant la lépromine (réaction de Mitsuda) n’est
plus utilisée en routine. La classification clinique en PB à lésion unique ou multiple et MB est suffisante pour
instaurer une polychimiothérapie (PCT) adaptée.
Un sérodiagnostic permet aussi de détecter les antigènes de surface spécifiques (PGL1) du bacille de Hansen avant
même l’apparition des signes cliniques. Son coût le réserve malheureusement aux pays industrialisés.
La recherche d’anticorps spécifiques (anti-PGL1) peut aussi être utilisée. Le titre est proportionnel à la charge
bacillaire. La sensibilité de ce test pour des patients en stade tuberculoïde n’est cependant que de l’ordre de 50 %.
La PCR réalisée sur les sécrétions nasales donne des résultats assez décevants (faux positifs : porteurs
asymptomatiques ?).
La recherche bactériologique de Mycobacterium leprae se fait sur des scarifications exsangues des lobes des
oreilles (le bacille de Hansen se multiplie mieux à une température de 33°C) et des lésions cutanées (à cheval sur la
zone de croissance extérieure à la lésion). Les lames sont fixées au formol ou au méthanol puis colorées au ZiehlNeelsen [la décoloration se fera de préférence avec de l’alcool-acide à 1 %] et examinées au microscope à
l’immersion. Cet examen permet d’évaluer l’indice bactériologique et l’indice morphologique.
L’indice bactériologique (IB) exprime par une échelle de 1 à 6 (échelle de Ridley) la quantité de bacilles présents
dans la lésion.
L’indice morphologique (IM) de détermination délicate, exprime le pourcentage de bacilles uniformément colorés et
morphologiquement intacts (bacilles vivants).
QUANTIFICATION DES RÉSULTATS :
Nombre de BAAR par
x champs microscopiques
Absents
1 à 9 BAAR par 100 champs
1 à 9 BAAR par 10 champs
De 1 à 9 BAAR par champs
De 10 à 99 BAAR par champ
100 à 999 BAAR par champ
Plus de 1.000 BAAR par champ
Echelle de
Ridley
0
1+
2+
3+
4+
5+
6+
Classification de
Ridley et Jopling
14
Nombre minimal de champs
microscopiques à observer
TT / BT (PB)
BT (MB)
BT / BB (MB)
BB (MB)
BB / BL (MB)
BL / LL (MB)
LL (MB)
100
100
100
50
50
20
20
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS :
La stratégie préconisée par l’OMS dans la lutte contre la lèpre est une stratégie de lutte de masse, d’où l’intérêt d’un
diagnostic simplifié. Le choix de traitement dépend de la classification des cas en formes pauci ou multi bacillaires.
Elle offre des avantages stratégiques certains. La classification sur base du nombre de lésions donne cependant lieu
à des erreurs de traitement de l’ordre de 2 % pour des malades multi bacillaires qui seront traités comme pauci
bacillaires et de l’ordre de 20 % pour les malades PB traités à tort comme MB. Le premier groupe des MB risque
une rechute après un traitement PB, alors que l’autre groupe ne souffre d’aucun inconvénient majeur d’un sur
traitement dans le temps.
14
TT : lèpre tuberculoïde, BT : lèpre borderline tuberculoïde, BB : lèpre borderline, BL : lèpre borderline
lépromateuse, LL : lèpre lépromateuse.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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26 / 46
ULCERE DE BURULI
15
INTRODUCTION :
Maladie émergente en pleine expansion,
l'ulcère de Buruli est la troisième infection
mycobactérienne la plus répandue après la
tuberculose et la lèpre. Provoquée par
Mycobacterium ulcerans, cette maladie se
manifeste par de graves ulcérations de la
peau, des muscles et des os. Elle laisse ses
victimes
gravement
défigurées,
voire
invalides.
L'Organisation Mondiale de la Santé
considère l'ulcère de Buruli comme une
menace émergente pour la santé publique.
Cette maladie sévit dans une trentaine de
pays : les zones marécageuses des régions
tropicales
et
subtropicales
d'Afrique,
d'Amérique latine, d'Asie et du Pacifique occidental. Elle est particulièrement répandue en Afrique de l'Ouest, où la
dissémination de l'agent infectieux semble s'accélérer depuis les années 80. Au Ghana, par exemple, 22% des
villageois sont touchés dans certaines régions; 16% de la population de certains villages de Côte d'Ivoire sont
affectés.
En zones endémiques, le diagnostic est principalement clinique. Dans un petit laboratoire, il est cependant possible
de réaliser une coloration de Ziehl-Neelsen sur un écouvillonnage du bord décollé d’un ulcère non (peu) douloureux.
La sensibilité de cette technique n’est cependant pas très élevée (entre 40 et 80 %). Les autres techniques (cultures,
histologie, P.C.R.) ne sont pas envisageables.
15
Manuel “Buruli ulcer, diagnosis of mycobacterium ulcerans disease” disponible en format pdf :
http://www.who.int/gtb-buruli/publications/PDF/BURULI-diagnosis.pdf
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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MENINGITES
INTRODUCTION :
En dehors des épidémies, l’OMS estime le nombre de cas annuel de méningites bactériennes
dans le monde à plus de 1.2 million. Ces méningites seraient responsables de plus de
135.000 décès, et d’une morbidité très importante.
En dehors des épidémies, le diagnostic clinique d’une méningite bactérienne est difficile. Il
faut faire un diagnostic différentiel entre une origine bactérienne (méningocoque,
pneumocoque, haemophilus, mycobactérie,…), fongique (cryptococcose, candidose), virale
(entérovirus, virus des oreillons, arbovirus, …), ou parasitaire (malaria, trypanosomiase,
toxoplasmose, origine amibienne,…). L’analyse du liquide céphalo-rachidien (L.C.R.) est une
étape essentielle du diagnostic. Cette analyse repose sur l’aspect macroscopique, la mise en
évidence d’une augmentation éventuelle du nombre de leucocytes et des globulines, et la
mise en évidence éventuelle du germe ou du parasite qui est à l’origine de la méningite. La
culture bactérienne est bien évidemment un plus (standard d’or).
En début d’une épidémie à méningocoque, il est essentiel de confirmer le diagnostic de
l’agent causal, permettant de mettre en œuvre les mesures appropriées de prévention et de
traitement.
Dans ce cadre, des tests rapides de détection d’antigènes peuvent être utiles
(permettant aussi une détermination minimale du sérogroupe). Cependant, pour obtenir une
identification fiable du (des) sérogroupe(s), du (des) sous-type(s), et du (des) clone(s), il faut
collecter environ 25 échantillons de L.C.R. et les acheminer vers un laboratoire de référence
spécialisé (exemple Statens Institute for Folkehelse [SIF], Geitmyrsveien 75, 0462 Oslo 4,
Norvège Fax : + 47 22.04.25.18). Chaque laboratoire de référence exige un milieu de
transport différent (Trans-Isolate [TI] pour le SIF). Ces 25 échantillons permettront aussi de
déterminer la sensibilité des germes aux antibiotiques.
PRELEVEMENT :
Le L.C.R. est normalement un liquide stérile. Tout germe retrouvé dans l’analyse a une
importance capitale dans le cadre des méningites. Il importe donc de travailler dans des
conditions d’asepsie et de stérilité maximale. On recueillera entre 5 et 10 ml de L.C.R. dans
deux tubes stériles.
Conservation maximale du LCR en fonction des analyses à réaliser (Comme les cellules, les
trypanosomes et le glucose se dégradent rapidement Il est toujours préférable d’examiner le L.C.R. dès
son prélèvement) :
Cytologie
(Giemsa)
et coloration
(Gram et Bleu)
Détection des
antigènes
(latex)
Culture
ou
Inoculation TI
PCR
Durée
Maximum
8 heures
48 heures
[quelques
semaines]
1 heure
Quelques
semaines
Température
Ambiante
2°C – 8° C
[congelé]
Ambiante
Ne jamais
réfrigérer
Congelé
Conservation
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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EXAMEN MACROSCOPIQUE :
L’aspect macroscopique du liquide est important pour déterminer les analyses à effectuer sur
le prélèvement :
L’aspect peut être
•
•
•
•
•
Purulent
Trouble
Clair et incolore
Rougeâtre et éventuellement légèrement trouble
Jaune (Xanthochrome)
Tableau récapitulatif des examens à réaliser en fonction de l’aspect macroscopique du L.C.R.
EXAMENS A REALISER EN FONCTION DE L'ASPECT
MACROSCOPIQUE DU L.C.R.
ROUGE
PURULENT
TROUBLE
1 Centrifugation
1. Bleu de méthylène
2. Gram
1. Numération
2. Centrifugation
3. Giemsa
1. Numération
2. Pandy
Surnageant
rosé
+ culot de G.R.
non coagulés :
Hémorragie
méningée
Surnageant
incolore :
CLAIR
Neutrophiles
Lymphocytes
≥ 5 G.B.
< 5 G.B.
4. Bleu de
Méthylène
5. Gram
6. Examen à
frais
Si aucun germe n’est 7. Encre de
Chine
retrouvé, traiter le
liquide comme s’il était 8. (Sérologie
trouble
syphilis :
VDRL)
4. (Ziehl)
5. Examen à
frais
6. Encre de
Chine
7. Bleu de
Méthylène
8. Gram
3. Centrifugation
4. Examen à
frais
5. Encre de
Chine
6. Giemsa
7. Bleu de
méthylène
8. Gram
9. (Ziehl)
3. Centrifugation
4. (Encre de
Chine ?)
5. (Examen à
frais ?)
Contamination
sanguine
Re-prélever si
possible
Un liquide jaunâtre indique soit une hémorragie ancienne, soit un ictère grave, soit une
compression rachidienne. En cas de compression rachidienne, le liquide se coagulera en
une seule masse en moins de 10 minutes.
Un liquide trouble rose ou rougeâtre indique généralement soit une hémorragie
subarachnoïdale (les deux tubes de liquide ont la même coloration, et après centrifugation, le
surnageant est rose), soit la ponction accidentelle d’un vaisseau sanguin (le deuxième tube
de liquide est moins coloré, et après centrifugation, le surnageant est incolore). Il est très
difficile d’avoir des résultats corrects sur ce genre de liquide (la numération des globules
blancs par exemple est impossible). Il est préférable de réaliser un nouveau prélèvement.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
ver pg 22/02/2010
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EXAMEN MICROSCOPIQUE :
Un liquide purulent indique généralement une méningite bactérienne aigue. Une coloration
de Gram et une coloration au bleu de méthylène seront réalisées pour identifier les bactéries.
Lorsque l’origine bactérienne a été démontrée, il n’est pas nécessaire d’effectuer des
analyses cytologiques ou biochimiques. Au cas où aucun germe n’est retrouvé, traiter
l’échantillon comme s’il était trouble.
Un liquide trouble peut avoir différentes origines. Réaliser une numération des éléments
16
cellulaires [dilution du LCR ½ avec du liquide de Türk , comptage des cellules dans les 9
grands carrés de 0.1 mm² de la cellule de Neubaeur, en comptant en double les leucocytes
17
trouvés dans le dernier carré . Le nombre de globules blancs comptés doit être multiplié par
2 (dilution) pour obtenir le nombre de cellules par mm³ de L.C.R. Un liquide est trouble à
partir de 200 cellules par mm³ de L.C.R.], puis centrifuger le liquide [10 minutes à 1.000 g].
Une coloration au Giemsa sera réalisée sur le culot de centrifugation pour déterminer le type
cellulaire (lymphocytes, monocytes, polynucléaires).
En fonction du type de cellules
retrouvées, réaliser sur le culot de centrifugation une coloration au bleu de méthylène et une
coloration de Gram (neutrophiles) ou une coloration de Ziehl-Neelsen (lymphocytes). Le test
de Pandy et la détermination de la glycorachie peuvent être utiles (a réaliser sur le
surnageant du L.C.R.). Envisager aussi la trypanosomiase (examen à frais) ou une origine
fungique (examen à l’encre de Chine).
Un liquide clair, est plus difficile : Il faut d’abord déterminer si on est en présence de
méningite ou non : La numération cellulaire [numération sans dilution du L.C.R.] permet de
répondre à cette question. En cas de méningite (numération supérieure à 5 globules blancs
par mm³), il s’agit le plus souvent de méningo-encéphalite virale. Mais au début ou dans
certaines formes décapitées de méningites bactériennes, le liquide peut être parfaitement
clair. Une méningite bactérienne débutante ou décapitée, une trypanosomiase ou une origine
fungique doivent donc aussi être envisagées. Le test de Pandy et la détermination de la
glycorachie peuvent être utiles.
D’autres maladies infectieuses peuvent aussi se manifester par une méningite à liquide clair à
prédominance lymphocytaire : Les spirochètes : syphilis, leptospirose, borréliose ; la
brucellose ; la trypanosomiase , …). La sérologie pour la syphilis et la leptospirose peut aussi
être utile.
N.B. : L’utilisation de bandelettes urinaires (du type Multistix 8SG de Bayer et ECUR de
18
Boehringer) sur du L.C.R. a été étudiée pour diagnostiquer des méningites sur base du taux
de glucose, de protéines et du nombre de leucocytes. Si les résultats étaient relativement
bons pour des liquides troubles (mais qui peuvent déjà macroscopiquement définir une
méningite), Ils montraient une sensibilité de l’ordre de 25 % pour les liquides clairs… Une
autre tentative a été menée en utilisant des tigettes urinaires pour le dosage des nitrites
19
urinaires avec des résultats similaires.
Elles ne peuvent donc pas remplacer les
techniques de laboratoire. Dans des conditions rudimentaires sans laboratoire, la clinique
doit être la base du diagnostic : En effet, 75 % des méningites bactériennes prouvées (par
culture et d’autres tests) dans des liquides limpides ne sont pas défini comme méningites par
les tigettes urinaires.
16
Dans le cadre d’une suspicion de trypanosomiase, la dilution du LCR par du liquide de Türck n’est pas
recommandée (lyse des trypanosomes par le liquide de Türck).
17
Il serait plus correct de compter toutes les cellules présentes dans les 9 grands carrés, puis de multiplier par 10/9
pour obtenir le nombre de cellules comptées dans 1 mm ³. Dans un petit laboratoire, les risques liés à l’erreur de
calcul rendent cette procédure plus aléatoire.
18
Does the use of urinary reagent strip tests improve the bedside diagnosis of meningitis? E.M. Molyneux, A.L.
Walsh, A.J. Phiri, D. Soko, M. Tembo, I. HowarthI. Trans. R.Soc. Trop. Med. Hyg. (1999) 93, 409 – 410.
19
Rapid diagnosis of bacterial meningitis using nitrile patch testing. C. Maclennan, E. Banda, E.M. Molyneux, D.A.
Green. Tropical Doctor (2004) 34, 231 – 232.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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30 / 46
GERMES POUVANT ÊTRE RETROUVES DANS UN L.C.R.
Forme
1
Coques
2
Bacilles
3
Coques
4
Grands
éléments
ronds
5
Coques
6
Bacilles
7
Coques
8
Bacilles
9
Bacilles
Morphologie,
Disposition et
Localisation
Souvent rares, par 2, en grains
de café, intra ou extracellulaires.
Souvent rares,
fins bâtonnets, coccoïdes,
chaîne courte,
intra ou extra-cellulaires,
souvent entourés d'une capsule.
souvent abondants, en forme de
lance, par 2 ou en courtes
chaînes, souvent entourés d'une
capsule, toujours extracellulaires
Coloration
Dessin
Agent causal
Probable
Gram
Négatif
Neisseria
meningitidis
Gram
Négatif
Haemophilus
influenzae
Gram
Positif
Streptococcus
pneumoniae
grands éléments ronds de la
taille d'un G.R., souvent avec
des bourgeonnements, parfois
avec un pseudomycélium
[Avec capsule pour
Cryptococcus neoformans]
Encre de
chine
Cryptococcus
neoformans
coques réguliers en amas,
extra-cellulaires
Gram
Positif
Staphylocoques
(S. aureus, S.
epidermidis,…)
Gram
Positif
Listeria
monocytogenes
Gram
Positif
Streptococcus
agalactiae
petits bâtonnets isolés ou
couplés, en forme de V,
parfois en palissade, intra ou
extra-cellulaires
coques par 2 ou en chaîne
assez longue
Gram
Positif
Levure
Entérobactéries
gros bâtonnets, parfois
bipolaires
Gram
Négatif
fins bâtonnets
Ziehl
BAAR
(Escherichia
coli)
Mycobacterium
tuberculosis
GRAM POSITIF = VIOLET FONCE / BLEU
GRAM NEGATIF = ROUGE / ROSE
Les germes 1 à 3 représentent 80 à 90 % des méningites bactériennes. Toute classe d’âge.
Les Neisseria sont responsable de la plupart des épidémies.
Le germe 2 se retrouve principalement chez des enfants de 3 mois à 3 ans.
Les germes 4 et 5 ne se retrouvent que chez les immunodéprimés ou en cas de corps étrangers (drains).
Le germe 5 se retrouve aussi chez des personnes de plus de 50 ans.
Les germes 6 à 8 se retrouvent principalement chez des enfants de moins de 6 mois.
Le germe 9 est mis en évidence par microscopie dans moins de 5 % méningites des tuberculoses.
Occasionnellement, tout autre germe peut être retrouvé (Pseudomonas spp., Klebsiella spp., …)
Notes pratiques de bactériologie tropicale
ver pg 22/02/2010
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REPONSES TYPES :
Aspect du L.C.R. :
Numération des G.B. :
Différentiation des G.B. :
_ _ _ _ _ _ /mm3 de L.C.R.
_ _ _ % de Lymphocytes
_ _ _ % de Neutrophiles
Pandy :
Résultat de la coloration de Gram :
Résultat de la coloration au Bleu de Méthylène :
Résultat de la coloration de Ziehl :
Résultat de l’examen à frais :
Résultat de la coloration à l’encre de Chine :
VALEURS DE REFERENCES :
Un L.C.R. Normal :
•
•
•
•
•
•
•
a une pression normale (coule goutte à goutte de l’aiguille).
est clair et limpide.
a une protéinorachie comprise entre 10 et 45 mg% (valeurs différentes en fonction de
la technique de dosage utilisée).
est Pandy (globulines) négatif.
3
a moins de 5 cellules / mm .
a une glycorachie comprise entre 50 et 85 mg% (60 à 80 % de la glycémie).
ne contient aucun germe.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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Tableau récapitulatif des principales caractéristiques des différentes méningites.
Méningite
Bactérienne
Méningite
Virale20
Méningite
Tuberculeuse
Cryptococcose
Trypanosomiase
(Stade 2)
++++
Nà+
+++
++++
+++
Trouble ou
Purulent
Clair
Clair ou
Jaunâtre
Clair ou
légèrement
trouble
Clair ou trouble
Pandy
(globulines)
+
-
+
Variable
+
Numération
Des GB
200 à
20.000/mm3
10 à 700/mm3
30 à 400/mm3
Variable
5 à 1.000/mm3
Variable
Lymphocytes
M. tuberculosis
(exceptionnelle19
ment retrouvé)
Cryptococcus
neoformans
Trypanosomes
Augmentée
>100 mg%
Variable
Augmentée
Abaissée
Normale
Abaissée
Caractères
Pression
Aspect
Type de
cellules
Neutrophiles
Germes
Méningocoque
Pneumocoque
H. influenzae
…
21
Lymphocytes
22
Non trouvés
N ou légèrement
Très augmentée
Protéinorachie 100 – 1000 mg% Augmentée
40 – 100 mg%
Glycorachie
24
Abaissée
Normale
Lymphocytes
23
Les investigations se font souvent en début de syndrome méningé. Dans ce cas, il
n'existe pas de règles absolues sur le nombre et le type de cellules rencontrées en
fonction de l'origine de la méningite.
N.B. : Dans le paludisme cérébral, l'examen du L.C.R. est souvent normal, avec
exceptionnellement une légère lymphocytose. La protéinorachie est augmentée et la
glycorachie est diminuée. On peut aussi retrouver un L.C.R légèrement trouble avec une
légère augmentation des granulocytes.
Exceptionnellement, une amibe (Naegleria fowleri) peut provoquer une méningite
foudroyante. La porte d’entrée est nasale lors d’une baignade dans de l’eau contaminée. Le
liquide céphalo-rachidien est purulent avec présence de polynucléaires et examens
bactériologiques négatifs. Un examen à frais montre des formes végétatives : de 8 à 30 µm,
déplacements par pseudopodes « explosifs » cytoplasme avec nombreuses vacuoles.
20
Certains spirochètes (syphilis, leptospirose, borréliose) et la brucellose peuvent aussi se manifester par une
méningite à liquide clair avec les mêmes caractéristiques qu’une méningite virale.
21
Dans 30 % des cas, il y a prédominance de Lymphocytes. Dans les méningites partiellement traitées on observe
souvent une prédominance de cellules monomorphonuclées (lymphocytes).
22
Au début d'une méningite virale, on observe une prédominance de Neutrophiles. La prédominance des
Lymphocytes ne se retrouve que dans des méningites virales installées.
23
Dans 30 % des cas, on observe une prédominance de neutrophiles. Si la sensibilité de la coloration de Ziehl sur
un L.C.R. est faible (< 20 %), sa spécificité est très haute.
24
Le glucose est très rapidement dégradé une fois le liquide prélevé. Il est donc important d’estimer la concentration
en glucose le plus rapidement possible.
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DOSAGE DES GLOBULINES PAR LA REACTION DE PANDY
PRINCIPE :
Précipitation des globulines en présence de phénol. En raison de son seuil de positivité, ce
test n’est utilisable que sur du L.C.R.
MATERIEL :
Matériel pour ponction lombaire + tubes stériles, tubes à hémolyse, réactif de Pandy, pipette
pasteur, carton noir.
METHODE :
1.
2.
3.
4.
Mesurer dans un petit tube à essais 1 ml de réactif de Pandy.
Placer le tube devant un morceau de carton noir.
Ajouter goutte-à-goutte 3 gouttes du L.C.R.
Examiner le tube après chaque goutte.
INTERPRETATION DES RESULTATS :
Lorsqu’un précipité blanc se forme quand les gouttes de L.C.R entrent en contact avec le
réactif, le test est positif (présence d’une quantité importante de globulines).
Le test est négatif si aucun précipité blanc ne se forme, si le mélange reste limpide ou si un
léger trouble apparaît mais se redissout.
REPONSES TYPES :
Test de Pandy négatif.
Test de Pandy positif.
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UTILISATION DU MILIEU TRANS-ISOLATE (TI) :
Il s’agit d’un milieu diphasique (liquide et
solide) qui est utilisé pour l’isolation de N.
meningitidis, S. pneumoniae, et H.
influenzae. Il peut être utilisé comme milieu
de croissance, de conservation et de
transport.
Des flacons prêts à l’emploi de ce milieu
peuvent être obtenus gratuitement auprès du
Statens Institute for Folkehelse [SIF],
Geitmyrsveien 75, 0462 Oslo 4, Norvège
Fax : + 47 22.04.25.18.
Il se conserve de préférence entre 2°C et 8°C. Il peut être utilisé dans les 6 mois qui suivent
la date de fabrication indiquée sur le flacon. Avant utilisation, vérifier l’aspect macroscopique
du milieu : il doit contenir un liquide clair et aucune colonie ne doit être visible sur la gélose
noire. Détruire tout milieu présentant des signes de contamination : liquide trouble et/ou
présence de colonies sur la gélose.
MATERIEL :
Matériel pour ponction lombaire + tubes stériles, seringue de 2 ml, aiguille 21 G, aiguille 19 G,
coton, sparadrap, système de transport de matériel biologique.
METHODE :
1. Recueillir le L.C.R. dans un tube stérile. L’ensemencement du milieu doit être réalisé
dans l’heure qui suit le prélèvement. Ne pas ensemencé si le patient a commencé un
traitement antibiotique dans les 24 heures qui précèdent la ponction lombaire.
2. Préchauffer (à température ambiante) le milieu TI.
3. Désinfecter le bouchon en caoutchouc du flacon de TI et laisser sécher.
4. Aspirer du tube stérile 0.1 à 0.5 ml de L.C.R. en utilisant une aiguille verte 21 G.
5. Injecter le L.C.R. à travers le bouchon du flacon de TI.
6. Après injection, ventiler le flacon en introduisant une grosse aiguille 19 G dans le
bouchon.
7. Boucher l’embout de l’aiguille avec un coton hydrophile pour éviter les contaminations.
Fixer le coton avec un sparadrap.
8. Conserver le milieu ventilé avec l’aiguille jusqu’au jour de l’envoi (maximum 3 semaines).
Les milieux ventilés sont conservé à température ambiante (éviter les températures
supérieures à 40°C) à l’abri de la lumière directe jusqu’au moment de l’envoi. Ne jamais
réfrigérer. Il est important de conserver les milieux aérés 2 à 3 jours minimum avant
envoi pour permettre la croissance des bactéries.
Avant envoi, retirer l’aiguille de ventilation, emballer les flacons selon les règles en vigueur
pour le transport des échantillons biologiques et joindre toutes les informations
administratives (nom, date, lieu de prélèvement, pays,…) et cliniques nécessaires. Le
transport se fait à température ambiante et peut durer 1 semaine sans problème.
Conservation du milieu Trans-Isolate (TI) inoculé avec du L.C.R. :
Conservation
Durée
Température
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Avant expédition
Milieu ventilé par une
aiguille
Pendant l’expédition
Milieu non ventilé
(aiguille enlevée)
3 semaines
1 semaine
Ambiante
Ne jamais réfrigérer
Ambiante
Ne jamais réfrigérer
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METHODE POUR LES TESTS D’AGGLUTINATION DE PARTICULES DE LATEX :
PRINCIPE :
Au cours d’une infection, certaines bactéries
libèrent dans les liquides biologiques des
antigènes de nature polyosidique qui
peuvent être reconnus par des techniques
immunologiques. Les réactifs sont constitués de particules de latex sensibilisées par
des anticorps spécifiques. Ils permettent par
une réaction d’agglutination rapide sur carte,
la détection de l’antigène correspondant
dans le LCR.
On retrouve dans le commerce plusieurs
coffrets de réactif prêt à l’emploi. Suivre toujours exactement les instructions du
fabriquant du kit utilisé. La péremption des kits est de 3 à 9 mois après leur fabrication,
selon les types de réactifs (3 mois pour le pneumocoque). Quelques recommandations
générales sont à prendre en considérations :
Pour obtenir des résultats fiables, il faut
examiner dès que possible le L.C.R. Si l’analyse doit être différée de quelques heures,
l’échantillon peut être conservé entre 2°C et 8°C. Pour un délai plus long, l’échantillon doit
être congelé. Une culture bactérienne sera alors bien évidemment impossible. Réaliser
préalablement au chauffage du L.C.R. tous les autres tests bactériologiques
nécessaires.
Les réactifs doivent être conservés au frigo (entre 2°C et 8 °C) quand ils ne sont pas utilisés.
La détérioration des réactifs survient à des températures plus hautes, surtout dans les climats
tropicaux, et les tests peuvent devenir non fiables avant la date d’expiration du kit. Les
suspensions de latex ne doivent jamais être congelées.
Le chauffage du L.C.R. à 100 °C permet d’augmenter la sensibilité du test en libérant
d’avantage d’antigènes. La centrifugation du L.C.R. augmente la spécificité de la réaction en
séparant les antigènes solubles d’autres particules qui pourraient interférer avec la réaction.
La spécificité globale est assez bonne (de l’ordre de 98 %). Les sensibilités sont de l’ordre de
75 % pour Neisseria meningitidis, 90 % pour Streptococcus pneumoniae, et 85 % pour
Haemophilus influenzae. Le gain en sensibilité par rapport au gram est très faible.
Sur base du même principe, on retrouve un test sérologique d’agglutination au latex pour la
recherche d’antigène de cryptocoque tant dans le sérum que dans le L.C.R. (exemple CryptoLA de Fumouze, 17 € pour 70 tests en 2004).
MATERIEL :
Matériel pour ponction lombaire + kit latex, centrifugeuse, tubes à centrifuger à fond conique
stériles, bain-marie bouillant, [agitateur rotatif], pipettes pasteur, distributeur de gouttes de 30
µl [ou pipette automatique de 30 µl avec tips], minuterie.
METHODE :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Chauffer le L.C.R. dans un bain d’eau bouillante pendant 5 minutes.
Centrifuger le L.C.R. pendant 10 minutes à 2.000 tours par minutes (RPM).
Récupérer le surnageant.
Amener les réactifs à température ambiante.
Homogénéiser doucement la (les) suspension(s) de latex et chasser les gouttes retenues
dans le compte-gouttes.
Déposer une goutte de chaque suspension de latex sur une carte jetable.
Déposer 30 µl de L.C.R. à côté de chaque suspension de latex.
Mélanger le réactif avec le L.C.R. avec un agitateur plastique. Utiliser toute la zone de
réaction.
Balancer la carte pendant 2 minutes [ou utiliser un rotateur].
Lire la réaction sous une forte lumière, sans agrandissement.
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Réactifs commercialisés pour l’agglutination de particules de latex de Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, Streptocoques du groupe B, Escherichia coli K1 et Haemophilus influenzae. (Source O.M.S.) A titre
d’exemple, le prix en 2004 pour un kit de 25 tests d’identification 5 germes Slidex est de l’ordre de 120 €.
INTERPRETATION DES RESULTATS
Réaction négative :
•
Absence d’agglutination après 2 minutes.
légèrement laiteuse.
La suspension reste homogène et
Réaction positive :
•
Apparition d’une agglutination avec un seul réactif en 2 minutes. Ceci témoigne de la
présence dans le L.C.R. de l’antigène correspondant.
Résultats ininterprétables :
•
•
•
•
Réaction en plus de deux minutes.
Absence d’agglutination des réactifs latex pour le contrôle positif.
Présence d’agglutination avec un des réactifs latex pour le contrôle négatif.
Présence d’agglutination avec 2 réactifs latex ou plus (infection mixte ?).
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EXAMEN D'UN PRELEVEMENT URETRAL
PRINCIPE :
Le diagnostic des urétrites chez l'homme repose de plus en plus sur des algorithmes
cliniques. Une analyse microscopique après coloration au Bleu de Méthylène d'un
prélèvement urétral peut s’avérer utile. Cette technique permet de différencier les urétrites
gonococciques (U.G., causées par Neisseria gonorrhoeae), des urétrites non gonococciques
25
(U.N.G., causées par Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis , ...). L’intérêt annexe
(ou principal ?) de cet examen est de maintenir, dans le laboratoire, une compétence dans la
recherche de Neisseria, utile dans le cadre des méningites.
PRELEVEMENT :
L'examen se fait sur un prélèvement de pus urétral. Effectuer si possible le prélèvement tôt
le matin, avant que le malade n'ait uriné. Si le méat urinaire est souillé, il faut le nettoyer avec
une compresse imbibée d'eau physiologique.
METHODE :
1. Noter le numéro du patient sur une lame neuve.
2. Flamber une lame neuve en la passant 3 x sur la flamme d'une lampe à alcool.
3. Vérifier que l'anse de platine est bien plane, pour éviter de blesser lors du
prélèvement.
4. Plonger l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable / crésyl.
5.
Flamber l'anse de platine (porter le fil au rouge sur toute sa longueur) puis la laisser
refroidir.
6.
Presser légèrement le pénis pour faire apparaître une goutte de pus au niveau du
méat urinaire.
7.
Prélever le pus avec l'anse de platine stérile. Si le pus n'apparaît pas, faire pénétrer
l'anse de platine sur environ 2,5 cm dans le canal urétral pour obtenir le prélèvement.
8. Etaler le pus sur la lame flambée, en faisant un étalement aussi mince que possible
et en couvrant la plus grande partie possible de la lame.
9. Plonger l'anse de platine dans le flacon contenant le mélange sable / crésyl.
10. Flamber l'anse de platine (porter le fil au rouge sur toute sa longueur) puis la laisser
refroidir.
11. Noter l'aspect et l'abondance de la sécrétion urétrale sur le bulletin de demande
d'examen.
12. Fixer la lame au méthanol et colorer la au Bleu de Méthylène.
13. Observer la lame au microscope à immersion (objectif 100 x, oculaire 10x) pour
rechercher des Neutrophiles. Estimer le nombre de Neutrophiles par champ sur 5
champs [Compter le nombre de Neutrophiles dans 5 champs, puis diviser le résultat
par 5]. Rechercher ensuite les diplocoques intra ou extracellulaires.
25
La technique au bleu de méthylène n’est cependant pas utilisable pour la recherché de Trichomonas vaginalis.
Elle devrait alors être remplacée par un examen à frais entre lame et lamelle.
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REPONSES TYPES :
♦ Aspect et abondance de l'écoulement urétral :
♦ Abondance en neutrophiles : _ _ _ leucocytes par champ.
♦ Recherche négative.
ou présence de diplocoques intracellulaires (ou intra et extracellulaires).
ou présence de diplocoques extracellulaires.
INTERPRETATIONS DES RESULTATS :
Une urétrite gonococcique (U.G.) se caractérise le plus souvent par une sécrétion purulente,
tandis qu'une sécrétion mucoïde est souvent associée à une urétrite non gonococcique
(U.N.G.).
On considère qu'il y a une infection aiguë lorsqu'il y a plus de 4 neutrophiles en moyenne par
champ microscopique.
Chez l'homme, la présence de diplocoques intracellulaires donne un diagnostic de certitude,
tandis que la présence de diplocoques extracellulaires donne un diagnostic de quasicertitude.
Sur un prélèvement vaginal ou pour un prélèvement urinaire, la sensibilité et la
spécificité de cette technique sont proches de 50 %
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PREPARATION DES SOLUTIONS POUR LA BACTERIOLOGIE
1. ALCOOL ACETONE A 90 % (v /v) [solution de décoloration pour Gram] :
Ce réactif peut être remplacé par de l'alcool à 96 %. Pour information, la composition du
décolorant de Gram varie d’un livre à l’autre, allant de l’acétone tout pur à l’éthanol tout pur.
Plus la concentration en acétone est élevée, plus rapide et donc plus délicate sera la
décoloration. Les réactifs de bases peuvent être de qualité technique.
ATTENTION :
L'Ethanol est inflammable, manipuler ce produit loin d’une flamme.
L'Acétone est nocif et extrêmement inflammable. Les vapeurs d’Acétone sont irritantes.
Manipuler ce produit fenêtres ouverte.
Ethanol 96 %..............................................................
Acétone.......................................................................
900 ml
100 ml
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun ou blanc de 250 ml.
Etiqueter : ALCOOL ACETONE et inscrire la date de préparation.
2. ALCOOL ACIDE DE ZIEHL à 3 % v/v (solution de décoloration des mycobactéries,
technique de Ziehl Neelsen à chaud) :
Réactif de premier choix. Ce réactif peut être remplacé par l'Acide Sulfurique à 20 % (réactif
3)
ATTENTION :
L'éthanol est inflammable, manipuler ce produit loin d’une flamme.
L'Acide Chlorhydrique est extrêmement corrosif. Les vapeurs d’Acide Chlorhydrique sont
toxiques. Ce produit est à manipuler avec une extrême prudence fenêtres ouvertes.
Ethanol 96 %..............................................................
Acide Chlorhydrique...................................................
970 ml
30 ml
Dans un flacon d'un litre, verser 970 ml d'Ethanol à 96 %. Ajouter lentement 30 ml d'Acide
Chlorhydrique en le laissant couler le long de la paroi. Mélanger. Le contenu s'échauffera.
Les réactifs de bases peuvent être de qualité technique.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun ou blanc de 1000 ml.
Etiqueter : ALCOOL ACIDE DE ZIEHL et inscrire la date de préparation.
Notes pratiques de bactériologie tropicale
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3. ACIDE SULFURIQUE A 20 % (v/v) (solution de décoloration des mycobactéries
Technique de Ziehl à chaud) :
Réactif de deuxième choix. Ce réactif n'est à utiliser qu'en cas de rupture de stock en Alcool
Acide (réactif 2)
ATTENTION
: L'Acide Sulfurique est extrêmement corrosif, les vapeurs
d’Acide Sulfurique sont toxiques.
Eau Distillée................................................................
Acide Sulfurique..........................................................
800 ml
200 ml
Ne jamais verser de l'eau dans l'Acide Sulfurique. L'addition d'une faible quantité d'eau
dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille !
Verser 800 ml d'eau distillée dans un flacon d’un litre. Mesurer 200 ml d’acide sulfurique
dans un cylindre de 250 ml. Ajouter lentement les 200 ml d'Acide Sulfurique, par quantité de
50 ml à la fois en laissant couler l'Acide le long de la paroi. Mélanger. Le contenu
s'échauffera. Les réactifs de bases peuvent être de qualité technique.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun ou blanc de 1000 ml.
Etiqueter : ACIDE SULFURIQUE A 20 % et inscrire la date de préparation.
4. BLEU DE METHYLENE (pour mycobactéries et bactériologie) :
ATTENTION
:
L'Ethanol est inflammable, manipuler ce produit loin d’une
flamme.
♦ Bleu de Méthylène, solution mère saturée :
Bleu de Méthylène..........................................
Ethanol 96 %..................................................
25 g
250 ml
Le contenu d'un flacon de 25 g de Bleu de Méthylène (de qualité analytique) est
introduit dans une bouteille brune de 250 ml qui est ensuite remplie d'Ethanol à 96 %.
La bouteille est vigoureusement agitée à trois reprises dans la même journée. On
laisse déposer. La solution est prête à l'emploi dès le lendemain. On peut ajouter de
l'Ethanol tant qu'il reste un dépôt de Bleu de Méthylène.
N.B. Le Bleu de Méthylène peut être dissous dans du Méthanol à la place de l'Ethanol.
Il ne faut pas laver ou rincer les flacons contenant des solutions saturées. Il faut
seulement ajouter de temps en temps un peu de colorant et un peu d'alcool. Tant qu'il
reste un peu de poudre au fond du flacon, on peut considérer que le surnageant est
saturé.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon brun hermétiquement
CONDITIONNEMENT : Flacon brun de 250 ml.
Etiqueter les flacons : BLEU DE METHYLENE SATURE et inscrire la date
de préparation.
BLEU DE METHYLENE (solution de travail pour bactériologie et mycobactériologie) :
Solution saturée de Bleu de Méthylène filtrée.............
Eau Distillée.................................................................
100 ml
900 ml
CONSERVATION : Au moins 1 an dans un flacon brun hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun de 1000 ml.
Etiqueter : BLEU DE METHYLENE et inscrire la date de préparation.
Filtrer avant emploi.
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5. CRISTAL VIOLET OU VIOLET DE GENTIANE (pour coloration de Gram) :
ATTENTION :
L'Ethanol est inflammable, manipuler ce produit loin d’une flamme.
♦ Solution mère A :
Cristal Violet ou Violet de Gentiane............….
Ethanol à 96 %................................................
25 g
250 ml
Le contenu d'un flacon de 25 g de Violet de Gentiane est introduit dans une bouteille
brune de 250 ml qui est ensuite remplie d'Ethanol à 96 %. La bouteille est
vigoureusement agitée à trois reprises dans la même journée. On laisse déposer. La
solution est prête à l'emploi dès le lendemain.
N.B. Le Cristal violet peut être dissous dans du Méthanol à la place de l'Ethanol. Il ne
faut pas laver ou rincer les flacons contenant des solutions saturées. Il faut seulement
ajouter de temps en temps un peu de colorant et un peu d'alcool. Tant qu'il reste un
peu de poudre au fond du flacon, on peut considérer que le surnageant est saturé.
CONSERVATION
:
Quelques
années
en
flacon
brun
hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun de 500 ml
Etiqueter : CRISTAL VIOLET SOLUTION A et inscrire la date de
préparation.
♦ Solution mère B :
Oxalate d'Ammonium (NH4)2C2O4.H2O..........
5g
Eau Distillée....................................................
500 ml
CONSERVATION : 2 à 3 mois dans un flacon hermétiquement
bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun ou blanc de 500 ml
Etiqueter : CRISTAL VIOLET SOLUTION B et inscrire la date de
préparation.
CRISTAL VIOLET OU VIOLET DE GENTIANE (solution de travail pour coloration de
Gram) :
Mélanger 100 ml de solution A avec 400 ml de solution B. Conserver dans un flacon BRUN.
Laisser reposer 24 heures. Filtrer sur un papier filtre avant de mettre dans un flacon BRUN à
l'abri de la lumière.
CONSERVATION : Stable plusieurs mois dans un flacon brun hermétiquement
bouché. Filtrer avant usage.
CONDITIONNEMENT : Flacon brun de 500 ml.
Etiqueter : CRISTAL VIOLET et inscrire la date de préparation.
N.B. Ce réactif est également commercialisé sous forme prête à l’emploi [exemple
Bio Mérieux 55545]
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6. FUCHSINE DE ZIEHL (pour coloration des mycobactéries, Technique de Ziehl
Neelsen à chaud) :
ATTENTION :
Le Phénol est extrêmement corrosif et toxique. Manipuler ce produit
avec grande précaution.
♦ Fuchsine mère saturée :
Fuchsine Basique.................................... 25 g
Ethanol à 96 %..................................... 250 ml
Le contenu d'un flacon de 25 g de Fuchsine Basique (exemple Fluka 602) est introduit
dans une bouteille brune de 250 ml qui est ensuite remplie d'éthanol à 96 %. La
bouteille est vigoureusement agitée à trois reprises dans la même journée. On laisse
déposer. La solution est prête à l'emploi dès le lendemain. On peut ajouter de
l'éthanol tant qu'il reste un dépôt de rouge. De meilleurs résultats sont obtenus en
utilisant de la néofuchsine (exemple new fuchsin Merck 1.04041.0025), mais pour un
prix beaucoup plus élevé. La Fuchsine doit être de qualité analytique.
P.S. La Fuchsine Basique peut être dissoute dans du Méthanol à la place de l'Ethanol.
Il ne faut pas laver ou rincer les flacons contenant des solutions saturées. Il faut
seulement ajouter de temps en temps un peu de colorant et un peu d'alcool. Tant qu'il
reste un peu de poudre au fond du flacon, on peut considérer que le surnageant est
saturé.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon brun hermétiquement
bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 250 ml.
Etiqueter : SOLUTION SATUREE DE FUCHSINE BASIQUE et inscrire la
date de préparation.
♦ Solution mère aqueuse de Phénol à 5 % (v/v) :
Phénol Cristallisé fondu …………………….... 50 ml
Eau Distillée................................................... 950 ml
L’eau doit être de l’eau distillée ou filtrée. L’eau de robinet contient souvent des
mycobactéries saprophytes qui ne se distinguent pas microscopiquement des
mycobactéries pathogènes !
Le Phénol Cristallisé est normalement incolore. Il est périmé, et ne doit pas être utilisé
s'il est de couleur rose violet. Le phénol doit être de qualité analytique.
La solution aqueuse de Phénol à 5 % est préparée en ajoutant 50 ml de Phénol
Cristallisé fondu à 45 °C (bain-marie ou soleil, ou flacon de 50 g de phénol [exemple :
Fluka 77610]) à 950 ml d'eau distillée. Le cylindre qui sert à mesurer le volume de
Phénol doit être préchauffé dans le bain marie ou au soleil (sinon, le Phénol
cristallisera immédiatement dans le cylindre).
CONSERVATION : Quelques mois dans un flacon hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 1000 ml
Etiqueter : SOLUTION AQUEUSE DE PHENOL A 5 % et inscrire la date de
préparation.
FUCHSINE DE ZIEHL (solution de travail) :
Solution saturée de Fuchsine Basique, filtrée............
Solution aqueuse de Phénol à 5 %............................
100 ml
900 ml
CONSERVATION : Au moins 2 ans.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 1000 ml.
Etiqueter les flacons : FUCHSINE DE ZIEHL et inscrire la date de préparation.
Filtrer avant emploi. Effectuer un contrôle de qualité avec des échantillons positifs
et négatifs pour les BAAR.
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7. FUCHSINE DILUEE (pour coloration de Gram) :
La Fuchsine diluée pour Gram peut être remplacée par la Safranine pour Gram (réactif 10).
La Safranine est supérieure à la fuchsine car elle donne une meilleure coloration de contraste
avec le cristal violet.
ATTENTION :
Le Phénol est extrêmement corrosif et toxique. Manipuler ce
produit avec grande précaution.
Fuchsine Phéniquée de ZIEHL (réactif 6)....................
Eau Distillée..................................................................
1 ml
9 ml
1 mois tout au plus.
Faire la dilution avant chaque coloration.
CONDITIONNEMENT : Préparation extemporanée.
CONSERVATION :
8. LUGOL FAIBLE (pour coloration de Gram) :
ATTENTION :
L'Iode Sublimée est nocive par inhalation ou contact.
Iodure de Potassium (KI)............................................
Iode en Cristaux ou Iode Sublimée.............................
Eau Distillée..................................................................
2,34 g
1,66 g
500 ml
Dissoudre l'Iodure de Potassium dans 10 ml d'eau distillée. Ajouter l'Iode en Cristaux
(préalablement pulvérisé dans un mortier). Mélanger jusqu'à dissolution. Ajouter le reste de
l'Eau Distillée (490 ml). N.B. : L’iode ne se dissout pas dans l’eau et mal dans l’iodure de
potassium. La dissolution de l’iode est d’autant plus difficile si elle contient des impuretés.
Utiliser donc toujours de l’iode bi sublimée ou très purifiée (suprapur).
Conserver dans un flacon BRUN à l'abri de la lumière.
CONSERVATION : non filtré : 3 mois. Le Lugol doit avoir une coloration brunrouge. S'il est jaune, il ne fonctionnera plus et doit être jeté.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 500 ml.
Etiqueter : LUGOL FAIBLE POUR GRAM et inscrire la date de préparation.
Filtrer avant emploi.
N.B. Ce réactif est également commercialisé sous forme prête à l’emploi [exemple
Bio Mérieux 55546]
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9. REACTIF DE PANDY (pour mise en évidence des globulines dans un L.C.R.) :
ATTENTION :
Le Phénol est extrêmement corrosif et toxique. Manipuler ce
produit avec grande précaution.
Phénol .......................................................................
Eau distillée................................................................
50 g
500 ml
Le Phénol Cristallisé est normalement incolore. Il est périmé, et ne doit plus être utilisé
s'il est de couleur rose violet. Il existe des conditionnements de 50 g [exemple : Fluka
77610]
Le réactif de Pandy est une solution saturée de phénol. Mettre le Phénol dans un flacon brun
de 1000 ml. Ajouter l’eau distillée. Agiter énergiquement. Laisser reposer 1 jour. Vérifier
qu’il reste bien du phénol non dissous. Si oui, filtrer et conserver dans un flacon brun. Si tout
le Phénol est dissous, ajouter 10 g de Phénol et attendre encore 1 jour avant de filtrer.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon brun hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 1000 ml.
Etiqueter : REACTIF DE PANDY et inscrire la date de préparation.
10. SAFRANINE (pour coloration de Gram) :
La Safranine pour Gram peut être remplacée par la Fuchsine diluée pour Gram (réactif 15).
La Safranine est supérieure à la fuchsine car elle donne une meilleure coloration de contraste
avec le cristal violet.
ATTENTION
:
L'éthanol est inflammable.
Manipuler ce produit loin d’une
flamme
♦ Safranine mère à saturation :
Safranine O......................................
Ethanol 96 % ..................................
25 g
500 ml
Le contenu d'un flacon de 25 g de Safranine O est introduit dans une bouteille brune de
500 ml qui est ensuite remplie d'Ethanol à 96 %. La bouteille est vigoureusement
agitée à trois reprises dans la même journée. On laisse déposer. La solution est prête
à l'emploi dès le lendemain. On peut ajouter de l'Ethanol tant qu'il reste un dépôt de
Safranine.
P.S. La Safranine peut être dissoute dans du Méthanol à la place de l'Ethanol. Il ne
faut pas laver ou rincer les flacons contenant des solutions saturées. Il faut seulement
ajouter de temps en temps un peu de colorant et un peu d'alcool. Tant qu'il reste un
peu de poudre au fond du flacon, on peut considérer que le surnageant est saturé.
CONSERVATION : Quelques années dans un flacon brun
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 500 ml.
Etiqueter : SAFRANINE A SATURATION et inscrire la date de
préparation.
SAFRANINE POUR GRAM (solution de travail) :
Safranine à saturation (surnageant)...........................
Eau Distillée................................................................
200 ml
800 ml
CONSERVATION : Quelques mois dans un flacon brun hermétiquement bouché.
CONDITIONNEMENT : Flacon en verre brun de 500 ml.
Etiqueter : SAFRANINE POUR GRAM et inscrire la date de préparation.
N.B. Ce réactif est également commercialisé sous forme prête à l’emploi [exemple
Bio Mérieux 55548]
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MICROPHOTOGRAPHIE DE QUELQUES BACTERIES D’INTERET
MEDICAL
Staphylococcus spp., pus, Gram.
Staphylococcus spp., pus, bleu de méthylène.
Streptococcus pneumoniae, crachat, Gram.
Streptococcus mutans, pus, bleu de méthylène.
Bacilles Gram négatif, urine, fuchsine.
Neisseria meningitidis, LCR, fuchsine.
Haemophilus influenzae, LCR, fuchsine.
Neisseria gonorrhoeae, écoulement urétral, safranine.
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Corynebacterium diphteriae, culture, coloration d’Albert.
Lactobacillus acidophilus, sécrétion vaginale,
bleu de méthylène
Bacillus subtilis, bactéries sporulées, culture,
cristal violet.
Bacillus anthracis, Deps, foie de souris, Giemsa.
Candida spp. (levures) et bactéries vaginales,
Ziehl.
Sécrétion vaginale, Bleu de méthylène.
Mycobacterium tuberculosis, cordes, crachat,
Mycobacterium leprae, globie, peau, Ziehl.
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Mycobacterium tuberculosis, crachat, Ziehl.
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