Utilisation des SNP pour l`identification humaine

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
Christine KEYSER, Elizabet PETKOVSKI*
Utilisation des SNP pour
l’identification humaine
RÉSUMÉ
Les polymorphismes d’un seul nucléotide ou SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) suscitent depuis
peu un engouement grandissant dans le domaine de l’identification génétique humaine. Ces marqueurs
se révèlent intéressants pour l’analyse de prélèvements biologiques dégradés, mais également dans les
tests de paternité. Outre leur utilisation à des fins médico-légales, les SNP constituent également des
marqueurs de choix en anthropologie moléculaire pour distinguer différents groupes (ou haplogroupes)
au niveau des lignées paternelles et maternelles et estimer ainsi l’origine ethnique des individus étudiés.
Les méthodologies de typage des SNP étant en continuel développement, le choix d’une technique
ad hoc peut paraître difficile. Notre équipe, impliquée dans des investigations génétiques, a fait celui
d’une discrimination allélique par extension d’amorces (formation de produits ayant une masse spécifique
pour chaque allèle) suivi d’une détection par spectrométrie de masse MALDI-TOF. L’objectif de cet article
est d’argumenter ce choix mais également de développer l’approche méthodologique utilisée, ainsi que
les avantages et les inconvénients de cette technique.
MOTS-CLÉS
Génétique
qu
SNP, spectrométrie de masse, PCR, identification génétique, contrôle de filiation
Use of SNP in human identification
SUMMARY
Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs arouse a growing interest in the field of human genetic identification.
These markers are interesting for the analysis of degraded biological samples, as well as for paternity testing.
Beside their use in forensic science, SNPs are also of great interest in molecular anthropology. They distinguish
groups (called haplogroups) of paternal and maternal lineage and allow the estimation of the studied individuals’
ethnic affiliation.
The SNP typing methodologies being in continual development, the choice of an appropriate technology
seems difficult. Working in the fields of forensic identification we chose a method based on MALDI-TOF mass
spectrometry detection of allele specific primer extension products. The aim of this paper is to explain this choice
as well as the used methodological approach and to discuss advantages and limits of this technique.
KEYWORDS
SNP, mass spectrometry, PCR, forensic genetic, paternity testing
I - Introduction
Les SNP (pour Single Nucleotide Polymorphisms)
constituent les polymorphismes les plus répandus du génome humain. Il s’agit de variations de
la séquence d’ADN portant sur un seul nucléotide
(figure 1). Ces marqueurs sont répartis sur l’ensemble du génome, toutes les 500 paires de bases
en moyenne, aussi bien au niveau des régions codantes (gènes) que des régions non codantes. Ils
sont le plus souvent phénotypiquement neutres
c’est à dire qu’ils ne modifient pas le phénotype de
celui qui les porte. A l’heure actuelle, plus de 5 millions de SNP ont été caractérisés. Cette abondance
explique l’énorme intérêt qu’ils suscitent dans les
domaines de la médecine et de la pharmacogénétique où ils sont notamment utilisés pour détecter
des prédispositions individuelles à certaines maladies ou pour identifier les gènes impliqués dans
des maladies multifactorielles.
*Institut de Médecine Légale - 11, rue Humann - 67085 Strasbourg cedex - Tél : 03 90 24 33 65 – Fax : 03 90 24 33 62
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Technologie appliquée
Utilisation des SNP pour l’identification humaine
Figure 1
timer l’origine ethnique de l’individu à la source du
prélèvement ou de l’échantillon étudié.
Les SNP sont des
substitutions,
insertions ou
délétions de
nucléotides qui
surviennent à des
positions uniques
dans le génome.
II – SNP et identification génétique,
atouts et difficultés
Dans le domaine de l’identification génétique,
l’engouement pour les SNP ne cesse de croître car
ceux-ci possèdent plusieurs caractéristiques intéressantes pour des applications médico-légales :
1) Les régions d’ADN ciblées pour l’analyse de
SNP sont de petites tailles, ce qui permet l’étude
de molécules d’acides nucléiques fragmentées.
Ceci est particulièrement important en criminalistique, domaine dans lequel les preuves biologiques laissées sur les scènes de crimes sont souvent
présentes à l’état de traces et/ou sont dégradées
par des facteurs environnementaux tels que la lumière, la chaleur ou l’humidité. Avec les techniques classiquement utilisées dans les laboratoires
d’identification génétique, l’ADN extrait de ces
traces peut ne fournir qu’une empreinte (ou profil)
génétique partielle, difficilement exploitable ; il en
est de même pour les catastrophes de masses (e.g.
attentat du World Trade Center, Tsunami du Sud
Est Asiatique…) où les restes humains à identifier
sont souvent fortement altérés.
2) Les SNP sont considérés comme des marqueurs
génétiques stables : ils présentent un taux de mutation bien inférieur à celui des microsatellites ou
STR (Short Tandem Repeats), marqueurs actuellement utilisés pour établir le profil génétique d’un
individu. Ce taux moindre de mutations (de l’ordre
de 10-8 contre 10-3) peut constituer un réel avantage dans les tests de parenté où des mutations qui
surviennent sur quelques générations peuvent être
sources de confusions.
3) A la différence des STR, l’analyse des SNP n’est
pas fondée sur l’étude du polymorphisme de longueur de régions de répétitions ce qui la préserve
d’artéfacts liés à des problèmes de « bégaiement »
rencontrés par l’ADN polymérase, l’enzyme impliqué dans le processus d’amplification de l’ADN.
4) Les SNP peuvent être étudiés par des techniques d’analyse à haut-débit, ce qui facilite la constitution rapide de base de données intéressant un
très grand nombre d’individus (d’où une grande
fiabilité dans le calcul des fréquences alléliques par
exemple).
5) Lorsque étudiés au niveau du chromosome Y ou
de l’ADN mitochondrial, les SNP permettent d’es-
Toutefois, ces marqueurs présentent également
des inconvénients qui complexifient leur utilisation à des fins judiciaires :
1) Pour chaque SNP, il y a logiquement 4 allèles
(ou variants nucléotidiques) possibles, mais le plus
souvent seuls 2 des ces 4 allèles existent réellement. Leur polymorphisme limité constitue donc
le principal défaut des SNP ; par exemple si l’on appelle A et B les deux allèles possibles à un site polymorphe donné, les individus peuvent être de type
AA, AB ou BB. Ces 3 types ou génotypes peuvent
paraître faibles en comparaison des 20 à 50 génotypes possibles avec la plupart des STR. Ce polymorphisme réduit peut néanmoins être compensé
par l’analyse de nombreux SNP. Il a été démontré
que l’analyse combinée d’une cinquantaine de SNP
doit permettre d’atteindre un pouvoir informatif
équivalent à celui obtenu à l’heure actuelle grâce
aux STR (1).
2) Du fait de la nature biallélique de la majorité des
SNP, il est difficile de détecter la présence de deux
ou plusieurs ADN dans un échantillon ; l’analyse
de mélanges d’ADN est donc difficile, or ces derniers sont très nombreux dans les affaires criminelles (e.g. viol : mélange de cellules de l’agresseur
et de la victime ; trace de contact : mélange de plusieurs individus…).
Au cours des dernières années un grand nombre
de techniques de typage des SNP ont été développées, chacune possédant ses propres caractéristiques (pour des revues voir : 2 et 3). Certaines permettent l’analyse d’un petit nombre de marqueurs
sur un grand nombre d’échantillons, d’autres autorisent l’analyse d’un grand nombre de marqueurs
sur un petit nombre d’échantillons, un dernier ensemble s’applique à l’analyse d’un grand nombre de
SNP sur un grand nombre d’échantillons. L’expert
judiciaire travaillant le plus souvent à partir d’un
nombre restreint de prélèvements, l’étude d’un
nombre élevé de marqueurs avec un débit d’analyse moyen est suffisante (excepté dans le cadre de
la constitution de bases de données ou de catastrophe de masse).
Autre facteur important à considérer : la quantité
d’ADN nécessaire pour établir un génotype. Certaines techniques s’appliquent directement sur
l’ADN génomique, sans réaction d’amplification
préalable, ce qui nécessite une quantité minimum
d’ADN matrice relativement importante. Compte
tenu des faibles quantités d’ADN extraites à partir d’un nombre non négligeable de prélèvements
médico-légaux, le choix d’une technique faisant
intervenir une étape préalable d’amplification par
PCR (Polymerase Chain Reaction) est indispensable. La possibilité de développer des réactions PCR
multiplexes (permettant l’amplification simultanée de plusieurs sites polymorphes) est également
primordiale, non seulement pour des questions de
quantité d’ADN mais également pour augmenter
le pouvoir discriminant de l’analyse.
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Autre considération importante dans le contexte
médico-légal : l’analyse de mélanges d’ADN. La
possibilité de quantifier chaque allèle dans un
échantillon peut aider à l’analyse de ces mélanges.
Enfin, derniers impératifs : la sensibilité, la reproductibilité, et la précision de la technique doivent
être élevées tandis que la durée ainsi que le coût de
l’analyse doivent être au plus bas.
par des analyses à visée judiciaire, la combinaison
technologique employée à l’Institut de Médecine
Légale de Strasbourg correspond à une extension
d’amorce, qui répond aux besoins qualitatifs d’une
analyse d’identification génétique, suivie d’une
analyse pas spectrométrie de masse MALDI-TOF
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
Time-Of-Flight) qui répond notamment aux critères de sensibilité, précision et rapidité.
III - Méthodes d’analyse des SNP
1. Discrimination allélique
par extension d’amorce
Les méthodes de typage des SNP font intervenir
deux étapes : une étape de discrimination allélique, correspondant à la formation de produits
réactionnels spécifiques à chaque allèle, suivie
d’une étape de détection des produits issus de la
discrimination allélique.
La plupart des techniques de discrimination allélique comprennent une étape de pré-amplification
par PCR de la région contenant le SNP. Une analyse post-PCR est ensuite effectuée pour déterminer
le variant allélique au site polymorphe considéré.
Les analyses post-PCR sont fondées soit sur l’hybridation d’une sonde sur le produit amplifié, soit
sur une ligation des amorces, soit sur un clivage
de sonde, soit encore sur une extension des amorces. Il existe également différents systèmes de détection des produits de la discrimination allélique
parmi lesquels les puces à ADN, l’électrophorèse,
la PCR en temps réel, le pyroséquençage, la spectrométrie de masse. Au vu des impératifs exigés
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Cette étape, également appelée miniséquençage,
est précédée par une étape d’amplification de la région d’ADN contenant le SNP d’intérêt au moyen
d’un couple d’amorces. Les produits PCR obtenus
sont purifiés au moyen de billes magnétiques puis
soumis à la réaction d’extension d’amorce ou PEX
(pour Primer EXtension). Cette réaction repose
sur l’extension d’une amorce de 1 ou 2 nucléotides,
en fonction de la séquence du fragment d’ADN cible. Cette extension se fait grâce à une ADN polymérase qui incorpore de manière indifférente les
désoxyNucléotides TriPhosphates (dNTPs) et les
didéoxyNucléotide TriPhosphate (ddNTPs, voir
Note 1). Dans l’exemple de la Figure 2, une amorce
a été conçue pour se fixer à l’extrémité 3’ du SNP
d’intérêt, un polymorphisme de type T/A. L’un des
quatre dNTP du milieu réactionnel (le dATP) est
remplacé par un ddNTP (le ddATP) qui bloque la
réaction d’élongation lorsqu’elle rencontre un T.
NOTE 1
Les ddNTP
bloquent la
synthèse de
l’ADN par les
ADN polymérases après
leur incorporation. Ce
blocage est dû
à l’impossibilité qu’ont ces
nucléotides
de former une
liaison phosphodiester
avec un autre
nucléotide
en raison de
l’absence du
groupement
hydroxyle sur
le carbone 3’.
Figure 2
Principe de la réaction
d’extension d’amorce.
L’utilisation combinée de
ddNTP avec des dNTP
permet d’augmenter
les différences de masse
entre les allèles d’un SNP.
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Utilisation des SNP pour l’identification humaine
Figure 3
Les produits de l’extension d’amorce, mélangés à une matrice, sont co-cristallisés sur une plaque métallique. Le mélange
ADN/matrice est frappé par le faisceau d’un laser. Cette énergie est transférée à la matrice qui est vaporisée ce qui permet
à une petite partie de l’ADN d’être expulsée dans un analyseur en temps de vol. Le produit ADN chargé est ensuite accéléré
avant de pénétrer dans le tube de vol libre de champ où il va voler vers le détecteur. Les molécules chargées volent d’autant
plus vite qu’elles sont plus légères. Le temps écoulé, entre l’entrée dans le tube de vol et la collision avec le détecteur, constitue
le temps de vol (Time Of Flight).
Dans le cas du premier allèle, le ddATP est incorporé immédiatement, ce qui génère un amplicon
de 24 nucléotides. Dans le cas du second allèle, le
premier nucléotide (dTTP) est incorporé et l’extension se poursuit jusqu’au T ou un ddATP est incorporé, conduisant à l’obtention d’un produit de
25 nucléotides. Ces deux produits d’amplification
ou amplicons présentent des masses différentes et
peuvent, après une étape de purification, être distingués notamment par leur masse.
2. Détection allélique par spectrométrie
de masse MALDI-TOF
La spectrométrie de masse (SM) est devenue une
technique de choix pour l’étude des biopolymères,
notamment depuis le développement de nouvelles
méthodes d’ionisation, qui permettent aujourd’hui
de vaporiser des molécules aussi grosses que des
protéines ou des acides nucléiques. L’une de ces
méthodes est la technique d’ionisation par dé-
sorption laser assistée par matrice ou MALDI,
méthode d’ionisation couramment associée à un
analyseur en temps de vol (TOF).
La technique MALDI utilise un faisceau laser pour
désorber et ioniser un mélange matrice/échantillon co-cristallisé sur une plaque métallique. L’irradiation laser provoque l’ionisation des molécules
d’échantillon et de matrice en phase gazeuse. La
matrice (un mélange d’acide 3-hydroxypicolinique
et de citrate hydrogenodiammonium) permet de
minimiser la dégradation de l’échantillon (produits de la réaction PEX) provoquée par l’absorption de l’énergie du faisceau laser incident. Une
fois les ions formés, ils sont accélérés par application d’un champ électrostatique et envoyés dans
un tube sous vide dans lequel ils sont séparés en
fonction de leur vitesse ou temps de vol. Les ions
ayant une masse élevée volent plus lentement que
les ions ayant une masse plus faible. Leur arrivée
au bout du tube est détectée par un multiplicateur
et visualisée sous forme d’un spectre (figure 3). Le
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Mère
Enfant
Père présumé
Figure 4
Spectres obtenus dans le cadre d’une analyse de paternité. La mère est homozygote, elle possède deux allèles portant une
guanine à la position polymorphe et n’a pu transmettre qu’un allèle G à l’enfant. Ce dernier n’a pu hériter de l’allèle A que
de son père. Le père présumé étant homozygote A/A, il a pu transmettre l’allèle A et peut être le père biologique dans le cas
présent. Bien entendu, ce résultat, obtenu pour un seul locus, n’est pas significatif et il faut tester une cinquantaine d’autres
loci pour pouvoir affirmer que le père présumé est bien le père biologique. Le pic non coloré correspond à l’amorce non
étendue utilisée dans la réaction PEX.
temps de vol est proportionnel à la masse.
Cette technique nous a permis de sélectionner,
dans un premier temps, une quarantaine de SNP
susceptibles d’être utilisés dans le cadre d’identifications génétiques d’individus et de contrôles de
filiation (4). La Figure 4 illustre le type de résultats
obtenus dans le cadre d’une recherche en paternité. Les allèles se distinguent par leur différence de
masse, mesurée sur la base de leur temps de vol et
interprétée automatiquement par ordinateur. Cette technique permet, selon l’individu étudié, de déterminer s’il est homozygote ou hétérozygote pour
un SNP donné. Bien entendu, l’analyse d’un seul
SNP est insuffisante et seule l’analyse simultanée
de plusieurs d’entre eux présente un intérêt pour
des investigations d’identifications génétiques.
Des réactions PEX incluant plusieurs amorces
susceptibles de s’hybrider au niveau de différents
SNP (réactions multiPEX) ont donc été mises en
œuvre dans un second temps. Les résultats de ces
travaux, qui intéressent une cinquantaine de SNP
devraient être prochainement publiés (5). Ils démontrent clairement l’intérêt d’une approche de
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typage des SNP fondée sur une discrimination allélique par extension d’amorce suivie d’une détection par SM MALDI-TOF.
IV - Avantages de la SM MALDI-TOF
pour des investigations médicolégales
L’analyse de polymorphismes ponctuels de l’ADN
par extension d’amorces et spectrométrie de
masse MALDI-TOF s’avère précise, fiable, sensible, spécifique, rapide, et peu coûteuse. En effet,
contrairement à d’autres méthodes de typage des
SNP, qui identifient les produits de la discrimination allélique en mesurant la fluorescence émise
par des molécules marquées, la spectrométrie de
masse MALDI-TOF mesure la masse moléculaire
des produits de la réaction d’extension d’amorces.
Il s’agit donc d’une méthode de détection directe
d’une propriété intrinsèque des molécules analysées : le rapport de leur masse sur leur charge.
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NOTE 2
Notons qu’en
France cette
application
n’est pas
possible pour
des raisons
éthiques.
Cette caractéristique fiabilise les résultats, moins
sujets à des variations liées aux conditions réactionnelles, et abaisse le coût de l’analyse du fait de
l’absence de fluorochromes. L’analyse est rapide :
la génération actuelle des instruments MALDI
est susceptible d’enregistrer un spectre en moins
d’une seconde. La capacité de multiplexage est
plus élevée que celle offerte par la plupart des
autres méthodes d’analyse et ce grâce à une fenêtre
de détection de masses très large.
V - Limites de la SM MALDI-TOF pour
des investigations médico-légales
Pour autant, cette technique présente également
des limites, la première étant liée à son implantation peu aisée dans les laboratoires d’identification
génétique. En effet, le coût d’une analyse inclut
l’investissement consacré à l’équipement qui reste
très élevé. La plupart des laboratoires d’investigation génétique sont équipés de séquenceurs automatiques et privilégient des techniques de typage
des SNP utilisant cet appareillage (e.g. SNaPshot).
Une deuxième limite des SNP concerne l’analyse de
mélanges d’ADN. Même si la technique MALDITOF est une technique a priori quantitative, notre
expérience démontre qu’il est très difficile d’établir
le nombre ainsi que les génotypes des individus à
l’origine d’un mélange. La troisième limitation intéresse le multiplexage : plus il est important, plus
la sensibilité de la technique diminue. Autre limitation et non des moindres : les contaminations
par de l’ADN exogène à l’échantillon à analyser
ne peuvent être détectés ce qui réduit considérablement la fiabilité de l’analyse. Notons également
que l’approche statistique utilisée pour interpréter
les résultats d’un typage SNP est loin d’être validée,
notamment dans les tests de paternité (6). Enfin, il
faut bien remarquer que la conversion d’un système bien en place (empreintes ou profils génétiques
par l’analyse de STR) vers un système peu standardisé (celui des SNP) n’est pas sans impliquer
d’importants écueils, parmi lesquels l’abandon de
fichiers d’empreintes génétiques laborieusement
constitués depuis quelques années (e.g ; Fichier
National Automatisé des Empreintes Génétiques
ou FNAEG) et leur reconstruction de novo.
VI- Conclusion
La combinaison technologique retenue par notre
équipe pour améliorer les possibilités d’étude du
polymorphisme génétique des individus concurrence la majorité des autres méthodes en termes
de robustesse, précision, reproductibilité, sensibilité et rapidité. Cela étant, il apparaît clairement
aujourd’hui que le remplacement des STR par des
SNP pour l’identification génétique n’est pas envisageable dans un futur proche et ce compte tenu
des limites apparues lors de la mise en place de
stratégies d’analyse basée sur les SNP.
Si les SNP sont loin de supplanter les STR dans
le domaine de l’investigation génétique, il ne fait
aucun doute néanmoins de leur utilité pour compléter les systèmes actuellement utilisés pour des
identifications dans le cadre de catastrophe de
masse (7) ou pour estimer l’origine ethnique d’un
individu à l’origine d’une trace biologique (domaine criminalistique) (Note 2) ou retrouvé dans
une sépulture ancienne (domaine anthropologique). Ces dernières applications intéressent l’ADN
mitochondrial et le chromosome Y et se révèlent
extrêmement prometteuses (8, 9).
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