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Bactériologie des eaux Bactériologie des eaux Plan I. Les méthodes générales de prélèvement et analyses II. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale: II.1 Coliformes totaux II.2 Coliformes fécaux II.3 Streptocoques fécaux II.4 Clostridiums sulfito-réducteurs III. Recherche et dénombrement des germes pathogènes IV. Principaux maladies à transmission hydrique Bactériologie des eaux Introduction : L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas d’effectuer un inventaire de toutes les espèces présentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles d’être pathogènes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fécales. L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes assurant l’absence de contamination et la survie bactérienne. Sont indiquées ensuite les méthodes générales d’examen bactériologique des eaux suivies des recherches de bactéries indicatrices de pollution et d’efficacités de traitement puis des bactéries spécifiques pathogènes. I.méthodes de prélèvement : I.1 Matériel de prélèvement : flacon en verre (borosilicaté de préférence) de 250 à 1000 ml. flacon en plastique à usage unique stérilisés par le fabriquant. Appareils de prélèvement : Plongeur et canne à prélèvement : utilisé en cas de prélèvement d‘ une eau d’un puits, au centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac. I.2 Mode de prélèvement En fonction de la nature des eaux analysées et celle des micro-organismes recherchés, les normes fixent des conditions à respecter (volume de l’échantillon, agent neutralisant, qualité du matériel d’échantillonnage…..) L’objectif est d’obtenir un échantillon aussi représentatif que possible de l’eau à examiner, sans contaminer ni modifié l’échantillon. Des précautions doivent être prises à trois niveaux: Le matériel de prélèvement Le mode de prélèvement Le transport la conservation des échantillons Bactériologie des eaux II. Méthodes générales de dénombrement : II.1 Méthodes de dénombrement en milieu solide II.1.1 Méthode par incorporation : Principe : L’échantillon d’eau à analyser est mélangé au milieu de culture solide préalablement fondu et refroidi à une T proche de la T de solidification. Après incubation, les colonies qui se développent à la surface et à l’intérieur du milieu sont comptées. Mode opératoire : 3) faire un mouvement de rotation 2) Incorporer le milieu en surfusion 1) volume d'eau à ensemencer ( 1ml) Incuber Faire le dénombrement des colonies développées à la surface et à l’intérieur du milieu de culture. II.1.2 Méthode par étalement : Principe: L’échantillon d’eau à analyser est étalé à la surface d’un milieu gélosé sans trace d’humidité: après incubation, les colonies qui se développent à la surface sont dénombrées. Mode opératoire : Etaleur stérile (râteau) Volume d'eau à ensemencer :0.1 ml Bactériologie des eaux Incuber Dénombrer les colonies développées à la surface. II.1.3 Méthode par filtration : Principe : L’échantillon d’eau à analyser est filtré à Travers une membrane qui retient les micro-organismes. La membrane est ensuite placée sur un milieu gélosé. Durant l’incubation, des colonies se forment à la surface de la membrane. II.2 méthodes de dénombrement en milieu liquide Principe générale : Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu liquide conçu Pour permettre la croissance d’un microorganisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré). II.2.1 Méthode du nombre le plus probable : Principe : Cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organisme supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimation de la densité bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilution successives de la suspension bactérienne originelle. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif. Bactériologie des eaux Mode opératoire : On ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution (jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en micro plaque). On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible indiquant la présence d’au moins d’un micro-organisme. Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence de micro-organisme, plus d’un micro-organisme peut être responsable d’une culture positive. Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance). III. Dénombrement des germes témoignant d’une pollution fécale: Notion d’indicateur : Il n’est pas actuellement possible de rechercher systématiquement tous les germes pathogènes susceptibles d’être présents dans l’eau, étant donné leur variété et l’irrégularité de la présence ; ainsi qui la diversité et le cout des analyses qu’il convient de mettre en œuvre pour les détecter. Néanmoins, comme l’origine de la plupart des micro-organismes pathogènes véhiculés par l’eau est fécale, le principe du contrôle de la qualité de l’eau repose sur la démonstration que l’eau distribuée ne contient pas de germes provenant de contamination fécale. Pour cela, on recherche des indicateurs de contamination fécale, appelés aussi germes témoins de contamination fécale. On parle également d’indicateurs de traitement qui permettent d’évaluer l’efficacité des différents traitements de potabilisation mis en œuvre vis-à-vis de différents germes. Ces indicateurs doivent répondre à des exigences de nature : Epidémiologique : il doit exister une relation entre un indicateur et l’apparition d’infection dans une population. Ecologique : il doit être spécifique d’une contamination fécale : systématiquement rencontré lorsqu’il y a présence de fèces d’animaux à sang chaud et toujours absent dans les milieux non pollués. Il doit être sensible : il doit être mis en évidence dans l’eau lorsque des pathogènes sont présents, et ce en grand nombre. Bactériologie des eaux Bactériologique : il ne doit pas se multiplier dans l’eau. Technique : il doit être facile et rapide à détecter, et ce, à moindre cout. III. 1 Dénombrement des micro-organismes revivifiables : Définition : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué selon la méthode spécifiée. Le principe consiste à mettre en évidence les bactéries Qui se développent à 20°C favorisant ainsi les germes spécifiques de l’eau Et celles qui se développent à 37°C favorisant ainsi les germes issus de l’homme et des animaux à sang chaud. Intérêt : Le dénombrement des germes revivifiables est utilisé comme indicateur de pollution : dans les milieux de très bonne qualité microbiologique pour contrôler une possible contamination bactérienne. Ce sont essentiellement des eaux souterraines des nappes profondes qui seront contrôlées. Dans l’usine de potabilisation, il permet de contrôler l’efficacité des différentes étapes du traitement. dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne après la station de traitement peut être le signe d’une multiplication bactérienne dans le réseau ou d’une intrusion de bactéries à l’intérieur de celui-ci. Dans les réservoirs et châteaux d’eau, on suit les effets du stockage et de la stagnation sur la qualité de l’eau et sur la reviviscence des germes III.2 Dénombrement des coliformes totaux et fécaux : Définitions : Les coliformes totaux : correspondent à des bacilles Gram négatif, non sporulé, oxydase négatif, aérobie et anaérobie facultatifs, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de d’acide et de gaz en 48h à une température de 35- 37°C. Bactériologie des eaux Ils se répartissent en fait en deux catégories : Les germes d’origine fécale stricte : Escherichia coli, Citrobacter, Klebsiella, serratia. Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) : Enterobacter intermedium et Amnigenus, klebsiella terrigena. Les coliformes fécaux ou thermotolérants : présentent les mêmes propriétés mais qui ils se développent à 44°C dont l’origine fécale est plus nette. Escherichia coli présumé : correspond à des coliformes thermotolérants qui produisent de l’indole à partir du tryptophane à 44°C.cet indicateur est le plus spécifique d’une contamination fécale. Intérêt : Dans l’eau, ils perdent leur viabilité plus lentement que la majorité des bactéries pathogènes et intestinales et constituent donc un bon indicateur de contamination fécale de l’eau de première importance. De plus, leur résistance aux agents désinfectants, et notamment au chlore, est voisine de la résistance des bactéries pathogènes ; ils vont donc constituer de bons indicateurs d’efficacité de traitement. Recherche et dénombrement des coliformes totaux à 37°C cet examen est intéressant pour juger de l’efficacité de la désinfection d’une eau est d’un intérêt moindre pour déceler une contamination fécale sure La recherche et le dénombrement des coliformes thermotolérants ou fécaux à 44°C : la présence de coliformes thermotolérants signe l’existence quasi certaine de la contamination fécale. La recherche et le dénombrement des seules Escherichia coli ou présumés : parmi les coliformes thermotolérants, Escherichia coli est l’espèce la plus représentée dans la flore intestinale de l’homme et des animaux. III.3 Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux ou Entérocoques • Définition : bactéries Gram positif, sphériques ou ovoïdes, formant des chainettes, non sporulées, catalase négative, possédant l’antigène D, Bactériologie des eaux cultivant en anaérobiose à 44°C, et à pH 9.6, et capables d’hydrolyser l’esculine en présence de bile. • Ils se répartissent en deux genres streptococcus et enterococcus. Intérêt : L’apport des entéroques par rapport aux coliformes consiste en leur plus grande résistance dans les eaux naturelles ; leur présence serait donc le signe d’une contamination fécale de l’eau plus ancienne. La résistance des entérocoques aux agents désinfectant est également plus importante, probablement du fait de leur mode groupement en chainettes, et est comparable à celle des entérovirus. cette propriété pourrait permettre aux entérocoques de mieux représenter la contamination virale d’une eau. Par contre une partie des espèces est peu spécifiques des contaminations fécales. On retrouve par exemple Streptococcus feacalis var liquefaciens dans l’environnement, sur les végétaux ou sur des sols non contaminés. III.4 Recherche et dénombrement des spores de bactéries des anaérobies sulfitoréductrice et de clostridium sulfitoréducteurs Définitions : Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices : formes de résistance de micro-organismes se développant en anaérobiose à 37°C ± 1 en 24h et ou 48h en gélose viande foie et donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium. Spores de clostridium sulfitoréducteurs : même définition que la précédente pour des bacilles à Gram positif, ne possédant pas de catalase et ayant l’aspect morphologique des clostridium. Bactériologie des eaux INTERET : Les bactéries anaérobies sulfito-réductrices ou les clostridium sulfito-réducteur voire encore Clostridium perfringens ne sont pas tous des indicateurs de contamination fécale. Clostridium perfringens bien qu’effectivement présent dans les matières fécales, est un germe assez ubiquiste. L’intérêt de la recherche de tels indicateurs réside dans la propriété qu'ils sporuler, ce qui les rend particulièrement résistant aux traitements de désinfection. Ils sont actuellement considérés comme de bons indicateurs de l’efficacité des traitements vis-à-vis des parasites et en particulier de Cryptosporidium. Méthode de dénombrement des germes de contamination fécale et d’efficacité de traitement : (voire tableau) analyse technique Volume de Milieu PE utilisé µ-organismes Incorporation 1ml Gélose à revivifiables en milieu l’extrait de solide levure Coliformes filtration 100ml Gélose totaux lactosée au TTC Coliformes filtration 100 ml Gélose fécaux lactosée au TTC Streptocoques filtration 100 ml Gélose fécaux Slanertz et Bartely Colstridium Incorporation 20 ml Gélose sulfitoréducteurs en milieu tryptone solide sulfite au cyclosérine IV. recherche des germes pathogènes : IV.1 Recherche de salmonella Définition : Les Salmonelles sont: Des bacilles Gram négatifs T° d’incubation 37°C ET 20°C confirmation 37°C Colonies typique OX- 44°C Colonies typiques 37°C Colonies typiques +Litsky Colonies typiques 37°C - Bactériologie des eaux (x) à la température de 36 ± 2°C en 24 à 48 h, sur milieu Hektoen, formant de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. • Les Salmonelles se divisent en deux grands groupes : les typhoidiques (Hautement pathogènes) et les non typhoidiques. (voir cours). Méthode de recherche : (voir schémas) Pré-enrichissement Enrichissement primaire Enrichissement secondaire Lecture et interprétation : • Repérer les colonies caractéristiques. • Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC… • Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser au laboratoire de référence. IV.2 Recherche de Vibrion cholirérique : Définition : • Les Vibrionacae sont : Bacille Gram négatif droits ou incurvés, Très mobiles, Bactériologie des eaux Oxydase (+), AAF, Fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, Hautement pathogènes. Méthode recherche :(voir schémas) IV.3 Recherche de Staphylocoques à coagulase positive : Définition : On entend par Staphylocoques à coagulase (+): Cocci à Gram (+) Isolées ou en grappes de raisin, Catalase (+) et coagulase (+) (x) en 24 à 48 h à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus. Elle est pathogène et très redoutée. Bactériologie des eaux Méthode de recherche : (voir schémas) IV. 4 Recherche de Pseudomonas aeruginosa Définition : Pseudomonas aeruginosa est: Un bacille Gram négatif Oxydase (+) Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques. Bactériologie des eaux Méthode de recherche : ( voir schémas) V. Critères microbiologiques d’une eau potable Bactériologie des eaux VI .Principaux maladies à transmission hydrique :
