Studer

Microfluidic Stickers*
Vincent Studer
Denis Bartolo (PMMH ESPCI)
Maxime Dahan (LKB ENS)
Mathieu Morel (LKB ENS)
*autocollants microfluidique
Plan
• Introduction : microfluidique
et biologie cellulaire
• Technologies microfluidiques
• Physique des écoulements
microfluidiques
• Composants microfluidiques
• Biologie cellulaire
quantitative
Introduction : microfluidique
Microfluidique : science et technologie de la manipulation de fluides dans
des réseaux de canaux de dimension 5-500 µm
100µm
1nL
1pL
10µm
Réduction des dimensions et des
volumes, intégration, parallélisation
Laboratoire sur puce (1990->…)
Lab on a chip
• Diagnostique
(génétique,
protéomique)
• Criblage
• Capteurs
• …
Peu de systèmes commercialisés
investissement technologique important
(Agilent, Motorola, Philips…)
Microfluidique et biologie
cellulaire
~2000 : Développement de méthodes simples de microfabrication : la
microfluidique est à la portée des laboratoires de biologie
Taille adaptée à l’étude de la cellule
(1-10µm)
La compréhension des mécanismes
cellulaire nécessite de nouveaux
outils :
-croissance, adhésion, signalisation
-biologie de la cellule unique
Plan
• Introduction : microfluidique
et biologie cellulaire
• Technologies microfluidiques
• Physique des écoulements
microfluidiques
• Composants microfluidiques
• Biologie cellulaire
quantitative
Techniques de microfabrication
légères.
Techniques de réplication (à partir d’un moule)
1) Fabrication du moule :
-Micro-usinage (100 µm-1mm)
-Lithographie optique (1-100 µm)
-Lithographie électronique (50nm-5µm)
2) Réplication dans un materiau polymère
-Lithographie molle
-autocollant microfluidiques
Lithographie molle
Whitesides, Delamarche (1998)
PDMS (PolyDiMéthylSiloxane),
élastomère transparent.
Moule : lithographie optique (ou
autre)
Le PDMS natif hydrophobe
(groupes méthyl en surface).
Rendu hydrophile par plasma air ou
O2 (-SiOH en surface)
Collage irréversible avec verre ou
PDMS (Si-O-Si).
Simple, rapide mais matériau
unique (ou presque)
µPS : Micropatterned Stickers
Collaboration avec Denis Bartolo (PMMH-ESPCI)
Bartolo D., Degré G., Studer V. (Brevet CNRS)
Bartolo D., Nghe P.,Degré G., Studer V. Microfluidic Stickers soumis à lab on a chip)
µPS : Micropatterned Stickers
ASSEMBLAGE
µPS : Micropatterned Stickers
• Méthode simple et rapide
• Applicable à un grand choix
de matériaux (durs,
élastiques, hydrophiles,
hydrophobes)
• Collage aisé et résistant,
même en milieu aqueux
• Empilables (réseaux 3D)
Plan
• Introduction : microfluidique
et biologie cellulaire
• Technologies microfluidiques
• Physique des écoulements
microfluidiques
• Composants microfluidiques
• Biologie cellulaire
quantitative
Ecoulements laminaires,
nombre de Reynolds
Equation de Navier Stokes
Nombre de Reynolds
ρ=1g/cm3 (eau)
U0 ~1um/s-1cm/s, L0 ~1-100 um
Re= 10-6 à 10
Re<1, Ecoulements laminaires, réversibles
Ecoulements de Stokes
Q : débit volumique
R : résistance hydrodynamique
Resistance hydrodynamique
PDMS
Microfluidic Sticker
Diffusion, advection et mélange
Diffusion, advection et mélange
Issu de Kamholtz et al. 1999
Advection/Diffusion =
nombre de Péclet
L~100 um U~100 um/s
Petite protéine : Pe=250 , Z~2,5mm
Gamme accessible Pe=0.1~1000, mélange ou
structuration des écoulements
Plan
• Introduction : microfluidique
et biologie cellulaire
• Technologies microfluidiques
• Physique des écoulements
microfluidiques
• Composants microfluidiques
• Biologie cellulaire
quantitative
Flow focusing
Ps
H2 O
Pi
FITC
La largeur du jet dépend du
ratio Pi/Ps
Wfmin<50nm
H2 O
Knight et al. Physical Review Letters 80 (17):
3863-3866 apr 27 1998
Focalisation d’une espèce chimique sur des dimensions
submicrométriques
Génération de gradients
Dertinger et al. Analytical Chemistry 2001, 73 1240-1246
C=0
C=50%
C=100%
V=nombres de concentrations différentes ~ B
Gradient stable spatialement et temporellement
µPS: Génération de profils de
concentration complexes
Superposition de 3 autocollants microfluidiques interconnectés.
Profile complexe avec seulement deux entrées et une sortie.
µPS ->Réseaux microfluidiques 3D
Plan
• Introduction : microfluidique
et biologie cellulaire
• Technologies microfluidiques
• Physique des écoulements
microfluidiques
• Composants microfluidiques
• Biologie cellulaire
quantitative
Approche systémique
Mesure quantitative de la réponse d’une cellule à une
stimulation chimique contrôlée spatialement et/ou
temporellement.
- sur un grand nombre de cellules individuelles
(données statistiques) en parallèle.
-avec un nombre important de conditions
-Mesure reproductible et robuste
-La réponse peut être chimique, phénotypique,
mécanique…
Chimiotaxie des neutrophiles
Jeon et al. Nature Biotechnology 20, 826-830 (2002)
Méchanisme peu ou mal
compris.
Hypothèse : ils sentent la
concentration en
chimioattractant à différents
endroits de la cellule
->gradient à l ’échelle de la
cellule (10µm)
Microfluidique : gradient à
l’échelle subcellulaire / stable
dans le temps
Position µm
Chimiotaxie des neutrophiles
Hertzmark et al. PNAS 104, 33, 13349-13354 (2007)
Hypothèse :
Réponse~∆C/C
Stimulation : gradient
exponentiel de
chimioattractant
Mesure CI=déplacement
dans le sens du gradient
/ déplacement total
Conclusions :
Prise de décision ~ ∆C
CI ~ ∆C/C
Guidage Axonal
Etudier la réponse du cône de croissance d’un neurone à
un gradient de chimioattractant avec une très grande
sensibilité.
Problème : culture de neurones délicate et longue.
->difficile à réaliser dans un système microfluidique
Collaboration avec Maxime Dahan et
Mathieu Morel (LKB ENS)
µPS pour la biologie cellulaire
M. Morel, D. Bartolo, M. Dahan and V. Studer (2007) Microfluidic Stickers
for quantitative studies of cultured cells Proceedings Micro Total Analysis
Systems 2007, Paris.
Cellular and multicellular samples
To demonstrate the feasibility of this technique we have sealed simple co-flow
device onto different cellular and multicellular systems, from model HeLa cells
to primary neurons, explants or drosophilae pupae tissues.
50µm
Confluent HeLa cells in a
200µm channel.
Selective detachment in a trypsin
co-flow.
100µm
8 DIV interneurons in a 1 mm
channel.
Drosophila pupa dorsal tissue near a
channel border with Sensory Organ
Precursor expressing GFP (green)
Hydrodynamic subcellular focusing
Reconstructed 60X fluorescence and phase contrast
microscopy (white dashed box).
Using a three inlets
microcircuit we have
focused a subcellular
flow of FM 4-64 (red)
on cultured HeLa
cells
transfected
with eGFP (green) .
Fluorescein was
added at the FM 464 inlet to visualize
the focusing flow.
Membrane and
intracellular vesicles
are labeled in red by
the lipidic dye.
Guidage Axonal
Génération de gradients stables et controlés d’espèces chimiques sur
des neurones en culture
µPS pour la biologie cellulaire
•
•
•
•
culture, marquage, transfection (plasmide, RNAi) : peuvent
être utilisés avant de rajouter le circuit
La qualité optique est excellente, très faible
autofluorescence : détection optique ultrasensible jusqu’à
la limite de la molécule individuelle
Circuits microfluidiques 3D : profils de concentration
complexes
autocollants microfluidiques peuvent être déposés sur des
cultures de neurones ou sur des systèmes multicellulaires
(tissus, tranches, explants,…) très difficiles à manipuler
dans les circuits microfluidiques traditionnels.
Conclusion
Microfluidique : outil simple et efficace pour
• Stimuler chimiquement à l’échelle cellulaire et
subcellulaire et de façon quantitative des cellules
en culture .
• Observer la réponse de chaque cellule/neurone
de façon quantitative à l’échelle cellulaire ou
subcellulaire
• Effectuer en grand nombre de mesure en
parallèle
Ouvre de nouvelles perspectives en biologie
cellulaire