Croisement 3 : 5621 x 1988

TP 1 de génétique appliquée :
Recombinaison mitotique
La recombinaison mitotique ne concerne que les cellules somatiques. Elle est proche de la
recombinaison méiotique. Ce phénomène permet la création d’individus mosaïques.
Elle a lieu pendant la mitose, où des segments de chromosomes homologues peuvent
accidentellement s’appareiller dans des cellules somatiques. Ceci est spécifique des diploïdes.
Chez un hétérozygote pour un gène donné, on va alors retrouver des cellules homozygotes pour ce
gène. Ce phénomène extrêmement rare, qui est à notamment à l’origine de cancers, peut être
induit.
Exemple chez la drosophile :
Cellule somatique hétérozygote :
Y+
Y = mutant corps jaune ; Y+ = sauvage.
Y
Cette cellule va se multiplier. On a préalablement une phase de réplication. Puis on a ensuite mitose
et séparation des chromatides sœurs. On retrouve ensuite 2 cellule filles génotypiquement
identiques à la cellule mère.
Dans le cas de recombinaison mitotiques pendant la métaphase, on va avoir échange de
chromatides : on se retrouve avec deux paires identiques de chromatides sœurs (avec une
chromatide sauvage, et l’autre mutée). A la mitose, les chromatides se séparent et on va avoir
apparition de cellules homozygotes.
Y
Y
Y
CO
Y+
Y+
Y
Y+
Y+
MITOSE
Y
Y
Y+
Y+
Chez les cellules filles, la plus grande partie est hétérozygote. On trouve quelques cellules
homozygotes issues de la recombinaison mitotique.
On va alors observer des colonies de clones sur un individu, ayant toute le même génotype, mais
différent de celui de l’individu.
Ces Phénomènes sont rares mais on peut les induire, notamment par des rayons X ; Ceci nécessite un
appareillage spécial. Le risque de mortalité est grand.
Pour pallier à ce problème de mortalité, il existe un système différent : le système FRT-FLP
FRT : Flippase regulation target : cible où la flippase va intervenir : lieu de recombinaison ; FLP : gène
qui code pour la flippase.
Contrôle des recombinaisons mitotiques : en termes quantitatif, dépend de la localisation de FPL.
Expression de la FPL : on peut contrôler son expression en la plaçant derrière un promoteur
inductible par un choc thermique. On peut aussi le placer derrière un promoteur d’orientation : elle
ne sera exprimée que dans un tissu spécifique (par exemple le promoteur eyeless permet une
expression exclusive dans les yeux.)
Grâce à cette expérience, on va obtenir des populations de clones cellulaires issus de recombinaison
mitotique.
Différence entre les cellules normales et les clones mitotiques : soit elles ont un phénotype
particulier, soit on s’arrange pour pouvoir les marquer.
Premier croisement : 4410 x 5618
On utilise le système GAL4 et le gène lacZ précédé par un promoteur de type AUS (induit par GAL4).
Gal 4 est sur le chromosome qui contient les séquences FPS, et ne se verra transcrit que s’il y a
recombinaison mitotique au niveau de ces séquences. S’il est transcrit, Gal4 ira activer la
transcription de lacZ grâce au promoteur AUS, situé sur un autre chromosome.
Flippase
Eyeless
Facteur de
terminaison
P(actine)
Gal4
FRT
FRT
Chromosome 2
LacZ
AUS
Sur le chromosome 2, le promoteur de l’actine est un promoteur constitutif. La transcription a lieu
continuellement. La transcription est cependant stoppée très rapidement au niveau du terminateur
situé entre les deux séquences FRT. Dans les yeux, la flippase va s’exprimer, grâce au promoteur
eyeless, et va agir au niveau des séquences FRT, situées sur le chromosome 2, en effectuant des
crossing-over. La partie du génome situé entre les 2 FRT est alors remplacé par un fragment sans
séquence terminatrice (fragment correspondant de l’autre chromosome 2). La transcription n’est
alors pas stoppée et on va alors avoir transcription du gène Gal4. GalA va alors activer sur le
chromosome le portant, la transcription du gène lacZ : on va alors avoir production de la
βgalactosidase. On aura production de Bgal exclusivement dans les cellules où il y aura eu
recombinaison mitotique, donc dans les cellules des yeux. Dans les autres cellules, la Bgal ne sera pas
synthétisée.
Souche 4410 : Chromosome X : (w, P {ey-Gal4})
Chromosome 2 : (P {UAS-lacZ) / Cyo (balanceur))
Souche 5618 : Chromosome X : (w, P {ey-FLP3})
Chromosome 2 : +
CROISEMENT 1a:
Femelle 4410 : (w // w ; gal4, UAS-lacZ // CyO)
F1 :
x
Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; + // +)
mâles : (w/Y ; gal4, UAS-LacZ // +)
et
Femelles : (w/w, ey-FLP ; gal4, UAS-LacZ / +)*
(w / Y ; + // CyO)
et
(w/w, ey-FLP ; CyO/+)
5618
4410
CROISEMENT 1b :
Mâle 4410 : (w // Y ; gal4, UAS-lacZ // CyO)
F1 :
x
femelle 5618 (w, ey-FLP // w, ey-FLP ; + // +)
(w, ey-FLP / Y ; gal 4, UAS-LacZ // +)*
Femelles : (w // w, ey-FLP ; Gal4, UAS-lacZ // +)* et
(w // w, ey-FLP ; + // CyO)
mâles : (w, ey-FLP / Y, + // CyO)
et
Seule * nous intéresse : on a le gène FLP, précédé par eyeless, qui permettra des recombinaisons
mitotique seulement dans l’œil. On a le gène gal4 qui va pouvoir être transcrit grâce aux
recombinaisons mitotiques, qui vont supprimer les terminateurs de transcription. Gal4 pourra
induire la transcription du promoteur UAS, ce qui permettra la transcription de LacZ et donc de
repérer l’emplacement des clones cellulaires concernée par la recombinaison mitotique, en ajoutant
du Xgal.
On observe les larves issues de ces croisements. On va révélée la présence de recombinaisons
mitotiques en révélant la présence de βgalactosidase, en « colorant » au Xgal.
Voici le protocole à suivre :
-
-
On prélève 4 ou 5 larves mobiles puis on les place dans du PBS (un tampon).
On les coupe au niveau du deuxième tiers avec une lame de rasoir.
On pince l’extrémité coupée, puis on va effectuer un mouvement de retournement de la
larve (on fait passer l’extérieur à l’intérieur) en appuyant avec une aiguille depuis la tête vers
l’extrémité coupée. La larve est retournée sur l’aiguille. On la remet dans le PBS.
Une fois les larves retournées, on évacue le PBS, puis on met du fixateur (glutaraldéhyde)
pour figer les structures.
On rince ensuite 2 fois au PBS, pour évacuer le fixateur
On réalise ensuite une pré-coloration, qui consiste à imbiber les larves avec la solution de
colorant
On colore ensuite avec une solution contenant un tampon et du Xgal. Le Xgal est métabolisé
par la βgalactosidase ce qui donne un composé bleu.
On constate une coloration au niveau des disques imaginaux des yeux. Seulement les yeux sont
colorés car on a orienté les recombinaisons dans l’œil grâce au promoteur eyeless : FLP est activée, la
recombinaison entre les deux FRT a lieu, ce qui permet la transcription de Gal4. Gal4 va induire la
transcription de LacZ.
Remarque : on utilise un balanceur pour inhiber les recombinaisons (méiotiques) au niveau du
chromosome portant la mutation, pour éviter de retrouver des individus homozygotes : on est sûr de
conserver des individus hétérozygotes. A revoir
Deuxième croisement : 5618 x 2296
Souche 5618 : Chromosome X : w, P (ey-FLP)
Chromosome 2 : P(FRT en 80B)
Souche 2296 : Chromosome X : w
Chromosome 2 : P(white) 70C (= mini white w+), P{FRT}80B / Tm6 (Balanceur)
Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; FRT80 / FRT80)
[œil blanc]
x
F1 :
et
Mâles :
(w / Y ; FRT80 / TM)
[œil blanc]
Femelle : (w / eyFLP ; FRT80 / TM)
[œil blanc]
FRT
w+
Chr 2
FRT
Chr 2
et
femelle 2296 (w / w ; w+, FRT80 / Tm6)
[œil rouge]
(w / Y ; FRT80 / FRT80, w+)
[œil rouge]
(w / w, eyFLT ; w+, FRT80 / FRT80)
[œil rouge]*
Après recombinaison voici le génotype de la
cellule de l’œil. Chaque chromosome s’est
répliqué, on a alors 2 chromatides
appareillées avec w+ et é autres sans w+.
La cellules exprime la flippase.
Pendant la mitose, les centromères se retrouvent sur la plaque équatoriale et chaque chromatides
ira dans l’une ou l’autre des cellules. On aura donc formation de cellules filles hétérozygotes comme
la cellule mère.
Dans le cas de CO mitotique, on va avoir un échange au niveau des séquences FRT, entre les
chromatides sœurs. Ceci conduit alors à des chromatides sœurs différentes.
FRT
w+
FRT
w+
Lors de l’anaphase, on aura alors 1 chance sur 2 d’avoir formation de 2 cellules filles différentes et
homozygotes : une sera w+ et l’autre ne portera pas l’allèle w+. On a alors, dans le cas de CO
mitotiques, formation d’une cellule rouge (qui ne redonnera que des rouges par la suite) et d’une
cellule blanche (qui en redonnera que des blanches par la suite) après la mitose. On s’attend à
trouver la moitié de cellules rouge et la moitié de cellules blanches. La séparation des chromatides à
l’anaphase peut redonner des hétérozygotes mais lors de la mitose suivante on pourra encore avoir
un CO : les hétérozygotes sont ainsi contre sélectionner car quand une cellule homozygote est
formée, il pourra y avoir des CO mais ceci ne changera pas le phénotype couleur.
Observation des mouches : Quand on observe les yeux des drosophiles femelles, on constate alors
que l’œil est principalement rouge, mais que certaines zones (notamment sur les bords) sont
blanches. Le résultat n’est pas celui attendu, les clones blancs semblent contre sélectionnés.
Croisement 3 : 5621 x 1988
On veut ici contre-sélectionner les clones rouges issus de la recombinaison mitotique. On associe à
l’allèle w+, un allèle létal à l’état homozygote. Lors d’un CO mitotique, on aura alors formation
d’homozygote sans w+ et d’homozygote w+/w+. w+ étant associé de très près au gène létal, il n’y
aura pas de clone rouge visible, les cellules mourant. Le gène létal est le gène rps.
F1
Les seuls qui nous intéressent sont marqués d’un point rouge. Il présente le promoteur eyeless qui
permet l’expression dans les yeux, le gène white à l’état homozygote qui va donc s’exprimer, frt80 à
l’état homozygote qui permet la recombinaison par la flippase. Il contient aussi le gène rps, associé à
w+ (miniwhite). Les clones cellulaires issus de la recombinaison mitotique ayant l’allèle rps
homozygote et donc de phénotype [rouge] (car homozygote W) moment. On ne les observera donc
pas, au profit des clones mitotiques [blancs].
Cellule somatique
des disques
imaginaux qui
donneront les yeux
Recombinaisons
mitotiques possibles
grâce aux 2
séquences frt et à la
flp qui s’exprime
Meurt car
homozygote rps
[rouge]
[blanc]
On retrouve les
génotypes
parentaux
On contre-sélectionne les individus
obtenus après recombinaison mitotique,
homozygotes pour rps et présentant un
phénotype rouge