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La Lettre de la Tumorothèque de Midi-Pyrénées
Octobre 2011
Biologie moléculaire
Un facteur prédictif pour le traitement des gliomes malins de haut
grade : l’étude de la méthylation du promoteur de MGMT
Karine Gordien, Emmanuelle Uro-Coste
Le gène O6-méthylguanine-ADN méthyltransferase (MGMT) code pour une enzyme de réparation de
l’ADN qui protégerait les cellules de la toxicité des agents alkylants. Le promoteur de ce gène peut
être méthylé ou non. Rappelons que la méthylation (altération épigénétique) d’un gène inhibe son
expression. De nombreuses études se sont donc intéressées à la relation entre la méthylation du
gène MGMT et la réponse aux thérapies alkylantes.
La méthylation du gène MGMT est corrélée à la réponse à la chimiothérapie
Selon Heigi et coll.*, l’inhibition de l’expression du gène MGMT par l’hyperméthylation du promoteur
entrainerait une meilleure réponse à la chimiothérapie avec régression de la tumeur et une meilleure
survie globale (cf. Figure 1).
Figure 1 : courbe de survie globale de patients
atteints d’un glioblastome de haut grade en fonction
du statut de méthylation du promoteur du gène
MGMT*
*Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T, et al. MGMT gene
silencing and benefit from temozolomide in
glioblastoma. N Engl J Med 2005; 352: 997-1003.
L’étude de la méthylation de MGMT est utilisée comme facteur pronostique des glioblastomes.
Actuellement, ce marqueur est essentiellement utilisé dans le cadre d’essais cliniques.
A noter : une étude récente réalisée sur une sous catégorie de gliomes malins (oligodendrogliome
anaplasique), indique que le niveau global de méthylation de la cellule conditionne la réponse à la
chimiothérapie : le niveau de méthylation de MGMT serait donc un indicateur de l’état global de
méthylation de la cellule. (Ref. Martin J van den Bent, et al: A hypermethylated phenotype in
anaplastic oligodendroglial brain tumors is a better predictor of survival than MGMT methylation in
anaplastic oligodendroglioma: a report from EORTC study 26951. Clin Cancer Res Published
OnlineFirst September 13, 2011).
Le test d’hyperméthylation du gène MGMT accessible sur la plateforme de
biologie moléculaire de Midi-Pyrénées
L’étude de la méthylation du promoteur de MGMT nécessite au préalable plusieurs étapes : une
extraction d’ADN à partir du tissu tumoral congelé obtenu au moment de la chirurgie puis un
traitement au bisulfite de sodium. Ce procédé permet, dans les conditions de réaction choisies, le
désamination des seules cytosines non méthylées en uraciles. Ce changement de séquence d’ADN
est alors facilement accessible par de nombreuses techniques de biologie moléculaire (MS-PCR, MSHRM, Pyroséquençage…).
La Lettre de la Tumorothèque de Midi-Pyrénées
Octobre 2011
Deux techniques d’analyse de la méthylation du promoteur MGMT sont disponibles sur la plateforme de pathologie moléculaire de Midi-Pyrénées :
La Méthyl Spécifique HRM (Higt Resolution Melting), pour détecter différents profil de
méthylation en une seule étape
Cette technique à la fois qualitative et quantitative, permet de détecter des profils de méthylation
différents en une seule étape (Cf. figure 2). La quantification est un point intéressant car il a été
montré que plus le pourcentage de méthylation était élevé et meilleur était le pronostic (Ref. J Dunn
et al : Extent of MGMT promoteur methylation correlates with outcome in glioblastomas given
temozolomide and radiotherapy- British journal of cancer 2009).On considère que le pronostic est
significativement meilleur à partir de 10% de méthylation.
Après extraction à partir du tissu tumoral et traitement au bisulfite, l’ADN est amplifié par PCR avec
l’utilisation d’un fluoro-chrome intercalant. Les produits de PCR sont alors soumis à une
augmentation progressive de la température (étape de fusion) permettant ainsi une dénaturation
plus ou moins rapide des brins d’ADN. Ceci est représenté par une courbe de fusion spécifique. Ainsi,
on peut obtenir différents profils de méthylation identifiant des sous types de tumeurs et proposer
des traitements spécifiques.
100%
M
50%
M
30%
M
10%
M
Patient
1
Figure 2 : Profils de méthylation par HRM (High
Resolution Melting) obtenus sur la plate-forme de
génetique moléculaire des cancers de MidiPyrénées.
eau
La technique de détection des profils de mutations par MS-HRM est maintenant utilisée en routine
au sein du laboratoire d’anatomie pathologique du CHU de Rangueil :
44 examens ont été réalisés représentant 7% des analyses effectuées en 2010 et l’activité annuelle
est estimée à 120 examens pour 2011.
La Méthyl Spécifique PCR
Après traitement au bisulfite, l’ADN ainsi modifié est amplifié par des amorces spécifiques marquées
de la cible non méthylée ou méthylée (Cf. figure 3).
La Lettre de la Tumorothèque de Midi-Pyrénées
Octobre 2011
Figure 3 : Représentation schématique de la MS PCR par F. De Fraipont et MJ.Richard, L’hyperméthylation des gènes
suppresseurs de tumeur comme marqueur en cancérologie. Immuno-analyse et biologie spécialisée (2009) 24, 9-15.
Les amplicons des 2 PCR sont alors analysés par électrophorèse sur gel d’agarose 4% (Cf. figure 4)
permettant de déterminer rapidement le statut de méthylation du promoteur de MGMT.
Figure 4 : Gel d’électrophorèse d’une MS-PCR pour l’étude de la méthylation du gène MGMT. Profils obtenus sur la plateforme de biologie de Midi-Pyrénées. Les prélèvements 639, 640 et 642 ont un gène MGMT non méthylé par contre 638 et
396 ont un profil méthylé.
Cette technique qualitative a longtemps été la technique de référence et est décrite dans la
publication d’Herman et al : Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of
CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6. Son inconvénient reste l’analyse d’un
nombre limité d’ilots CPG et l’absence de quantification.
Demande de test
Indications : glioblastomes
Modalités de préparation des échantillons : fragment tumoral congelé
La fiche de prescription est accessible sur le site d’Oncomip (Cliquez ici).
Elle doit être adressée au Pr Emmanuelle Uro-Coste (Service d’Anatomie Pathologique, CHU
Toulouse-Rangueil) :
Par fax : 05.61.32.21.27
Par mail : [email protected], [email protected]
Le délai de réponse est de 15 jours en moyenne, avec un maximum de 1 mois.