M2 THERV 2013 Module Xénobiotiques Examen du 8 janvier 2014 Lisez l’ensemble du sujet avant de répondre. Pas de délayage svp. Partie métabolisme : Le candidat médicament modulateur du récepteur du peptide 1, glucagon-like, a été étudié : La structure du produit 1 deutéré est la suivante : R2 O N O microsomes NADPH, O2 S H N D N HO + D N CF3 CF3 R1 H 2 1 H O R2 S Hydrolyse H H O CYP2B1/2 ou CYP3A1 O R2 H+ D D 3 1) On étudie le métabolisme par des microsomes de foie de rat prétraités au phénobarbital en présence de NADPH. On trouve deux métabolites 2 et 3, l’aldéhyde et le phénol. Quels sont les enzymes impliqués? Ecrivez le mécanisme de réaction. Les P450s induits par le phénobarbital chez le rat sont les CYP2B1 ou 2B2 et le CYP3A1 Il s’agit d’une déalkylation oxydative avec oxydation d’un CH (2ième ligne de la figure). Vous pouviez aussi écrire l’oxydation par le FeIV-O radical c’était bon ! D/H O R2 O D HO HO H/D 4 OH 5 R2 O D HO SG R2 6 2) On utilise des microsomes de rats prétraités par la béta-naphtoflavone. On trouve deux nouveaux métabolites 4 et 5. Le composé 4 est un phénol dont les hydrogènes ortho sont deutérés à 40%, et 5 est un dihydrodiol. Expliquer la formation de 4 et 5. Ecrivez les réactions. Quel est l’intermédiaire réactif ? Quels sont les enzymes impliqués ? On avait oxydation du noyau aromatique par un des P450 inductibles à la BNF, donc CYP1A1 et CYP1A2. La réaction formait un oxyde d’arène qui soit se réarrangeait avec NIH shift, donnant 4 (le D migre et à cause de la libre rotation il y a réparition statistique en 3 et 5). Soit il était substrat de l’époxyde hydrolase microsomale et donnait le trans-dihydrodiol 5, soit en présence de GSH il réagissait avec le GSH avec catalyse par les Glutathion-Stransférases (microsomale ou cytosoliques) pour donner 6. H H H R2 O O D D H H O H+ O R2 H GSH GST mic ou cyt EHm D H effet isotopique H part plus facilement que D R2 O R2 D HO HO H/D R2 D O NIH Shift H (sorte de transposition pinacolique) H2O O O R2 O D/H H H H OH 4 O D HO 6 SG 5 R2 3) La même incubation est effectuée en présence de 5 mM glutathion (GSH). On trouve un nouveau métabolite plus polaire dont la masse et la RMN montre la structure 6. Expliquer sa formation et quels sont les enzymes impliqués sachant que la quantité de 6 augmente quand on ajoute du cytosol. Réponse au dessus R1 N S microsomes N CF3 1 R1 O S N N ou CYP3A4 NADPH, O2 CF3 7 O S N R1 N CF3 7 N R1 GSH 5mM H Cytosol ou microsomes N R1 SG O N S N H CF3 SG GSH + X' GS-S-CH2-CH3 CF3 9 8 X 4) En incubant 1 avec des enzymes de foie humain ou du CYP3A4 recombinant, on obtient le métabolite 7. Par contre la même incubation en présence de 5 mM GSH conduit à deux métabolites 8 et 9. On obtient les mêmes produits 8 et 9 en incubant le composé 7 (obtenu par synthèse) avec du glutathion. La transformation en 8 et 9 est catalysée en présence de cytosol. Le premier intermédiaire X est un complexe de Mesenheimer et le deuxième X’ est un métabolite réactif dans la transformation de 7 en 8 + 9. Donner la structure de X’. Quels sont les enzymes impliqués dans la formation de X , X’, 8 et 9? R1 N H SG O S N H H+ R1 N H R1 N SG GSH S N N H CF3 SG OH CF3 X + CH3-CH2-S-OH GS-S-CH2-CH3 CF3 9 H2O 8 X On vous donnait le complexe de Mesenheimer dont la formation est catalysée par une GST, mais la suite est acido-catalysée (protonation du S-oxyde et prototropie pour donner l’acide sulfénique qui est attaqué par GS- sur le soufre pour donner le disulfure mixte 9. 5) Donnez un inhibiteur de l’époxyde hydrolase microsomale et un inducteur de l’époxyde hydrolase cytosolique. Par exemple inhibiteur de EHm : TCPO ou valpromide ou cyclohexene oxyde Inducteur de sEH : proliférateur de peroxysomes (fibrates, clofibrate, phtalates …) SO2CH3 SO2CH3 GSH 5mM P450 N S N 10 NADPH, O2 Y GS H H N S H O N 11 6) Un candidat agoniste du récepteur de la Ghreline est le dérivé imidazo-thiazole suivant 10 : Par incubation de ce composé in vitro avec des microsomes humains il donne de la fixation covalente sur les protéines, indice de la formtion d’un métabolite réactif. Par contre en présence de 5mM GSH cette fixation covalente diminue de 90% et on observe un nouveau produit de structure 11 établie par RMN et spectrométrie de masse. Donner l’intermédiaire réactif Y SO2CH3 SO2CH3 SO2CH3 GSH 5mM P450 N S N 10 NADPH, O2 GS H N S O N X = S-oxyde H N S H O N 11 Le produit 11 résulte simplement d’une addition de Michael sur la double liaison activée d’un S-oxyde. Il n’y a pas de changement du degré d’oxydation. Si on met un époxyde, on attend un adduit contenant un oxygène (un CHOH) ici on a un CH2 .