Préanalytique - Swiss Medical Forum

C U R R I C U LU M
Forum Med Suisse No 6 6 février 2002
113
Préanalytique
G. Togni, C. Volken, G. Sabo
Correspondance:
Dr phil. II Giovanni Togni
Institut Dr. Viollier
Spalenring 145/147
CH-4002 Basel
[email protected]
Figure 1.
Différences en fonction du
sexe et de l’âge pour la phosphatase alcaline (PA) et le
cholestérol (total, LDL et
HDL) (modifié d’après [1]).
Bien préparé et c’est
à moitié gagné
La préanalytique commence
chez le patient
La fiabilité des résultats de laboratoire ne dépend pas uniquement d’une technique d’analyse correcte, une préparation dans les règles
de l’art doit précéder la phase analytique. Cette
phase est appelée préanalytique. Elle comporte
la préparation du patient, le choix du bon moment du prélèvement de l’échantillon, son identification irréprochable, les coordonnées du patient et le formulaire de demande d’examens,
le choix du bon tube (avec stabilisateur ou
autres additifs), le prélèvement lui-même, la
conservation adéquate jusqu’au moment de
l’analyse, sans oublier le transport, la stabilité
des échantillons pour les analyses demandées
ultérieurement, l’examen de la qualité des prélèvements à la recherche d’éléments particuliers, et la préparation à l’analyse.
Le médecin et son assistante doivent connaître
les facteurs d’influence et d’erreur les plus importants de la préanalytique, pour garantir un
diagnostic de laboratoire optimal. Voici quelques points importants de la préanalytique,
surtout pour les analyses clinico-chimiques et
hématologiques.
La pré-analyse débute chez le patient.
On distingue entre des paramètres influents se
manifestant in vivo et les artefacts se manifestant in vitro.
Les paramètres influents peuvent être classifiés
entre:
– données (non modifiables) comme sexe, race,
âge, grossesse et facteurs génétiques et
– variables (modifiables) comme variations
d’horaire, alimentation, poids, activité corporelle, produits stimulants, médicaments, la
position corporelle lors de la prise de sang, etc.
Il faut tenir compte de ces paramètres lors de
l’interprétation des résultats (fig. 1).
Les artéfacts comprennent la contamination
des échantillons, l’hémolyse in vitro due aux secousses de l’échantillon, la contamination des
échantillons par les solutions de perfusion, la
centrifugation trop rapide ou trop lente des
échantillons, l’emploi de tubes inadéquats, la
non-observance de la période de jeûne avant la
prise de sang, etc. Une instruction précise des
patients et du personnel infirmier est essentiel
pour éviter ces artéfacts.
L’influence des aliments se manifeste souvent
par une lipémie, capable de perturber certaines
réactions in vitro. D’autres paramètres sont directement influencés par la prise de nourriture.
L’importance de cette perturbation dépend de
la composition de la nourriture et du délai avant
la prise de sang. Une nourriture riche en
graisses fait augmenter la concentration de triglycérides. La consommation d’aliments riches
en protéines et en nucléotides fait augmenter les
concentrations d’urée et d’acide urique (fig. 2).
D’autre part, des concentrations abaissées de
préalbumine et de protéine vectrice du rétinol
se voient dans l’alimentation insuffisante ou le
jeûne.
La consommation de café ou d’alcool, et fumer,
peuvent avoir une influence à plus ou moins
long terme sur les résultats de laboratoire. La
fumée de 1 à 5 cigarettes augmente après un
temps de latence d’une heure la concentration
d’acides gras libres, d’adrénaline, d’aldostérone et de cortisol. Le tabagisme augmente le
nombre de leucocytes, les lipoprotéines, l’activité de certains enzymes, d’hormones, de vitamines, de marqueurs tumoraux et de métaux
lourds (oligo-éléments). D’autres paramètres,
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Figure 2.
Variations (en %) de la concentration sérique de certains
paramètres après absorption
d’un repas standard (700 kcal)
(modifié d’après [1]).
Figure 3.
Effets aigus et chroniques de
l’absorption d’alcool sur certains
paramètres de laboratoire.
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comme l’ECA (enzyme de conversion de l’angiotensine), la prolactine et le sélénium sont
abaissés sous l’effet de la fumée.
En l’espace de 2 à 4 heures après l’absorption
d’alcool, la glycémie chute, le lactate et l’acétate
augmentent, les bicarbonates diminuent et il
peut y avoir une acidose métabolique. Les effets
à long terme se manifestent par une augmentation progressive des tests hépatiques et des modifications de la formule sanguine (fig. 3).
L’activité physique du patient avant la prise de
sang peut également modifier les résultats de
certaines analyses.
Des variations aiguës des analyses sont surtout
le fait du déplacement des liquides entre les
compartiments interstitiel et intravasculaire,
de la perte de volume par la transpiration et de
variations de l’équilibre hormonal (p.ex. ascension de l’adrénaline, de la noradrénaline,
du glucagon, de l’hormone de croissance, du
cortisol et de l’ACTH, et diminution de l’insuline). Ces variations hormonales peuvent provoquer une leucocytose et une augmentation de
la glycémie.
Les personnes non entraînées présentent après
une activité musculaire minime déjà une augmentation nette de la concentration de créatine(-phospho)-kinase. Celles qui sont bien
entraînées présenteront après une activité
semblable des concentrations plus basses de
CPK et une augmentation de la fraction CK-MB
(fig. 4). Un effort physique intense provoque
une élimination urinaire d’érythrocytes et de
leucocytes.
Dans l’interprétation des résultats, il faut toujours penser à l’influence de certains médicaments que prend le patient. De nombreux médicaments peuvent provoquer des augmentations enzymatiques par induction ou effet pathologique (tabl. 1).
Lors de la préparation du patient à la prise de
sang, la position corporelle joue un rôle important, car la position debout, assise ou couchée
peut influencer de nombreux paramètres. Le
passage de la position couchée à la position debout abaisse le volume plasmatique d’environ
12%. L’influence de plusieurs analyses par la
position du corps est présentée à la figure 5.
Quel est le meilleur moment
pour une prise de sang?
Plusieurs paramètres de laboratoire, surtout
clinico-chimiques, passent par des variations
circadiennes dont il s’agit de tenir compte dans
l’interprétation de leurs résultats (tabl. 2).
Comme les valeurs de référence sont souvent
données dans les études pour lesquelles les prélèvements se font à des heures standardisées,
les examens diagnostics doivent se faire dans
des conditions semblables (p.ex. le matin entre
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7 et 9 heures). En plus de ces variations circadiennes, il en existe aussi des saisonnières et
périodiques. La tri-iodothyronine (T3) est environ 20% plus basse en été qu’en hiver, le 25OH-colécalciférol (25-OH-vitamine D3) est plus
élevé en été qu’en hiver. La concentration d’aldostérone est deux fois plus élevée à la phase
préovulatoire qu’à la phase postovulatoire du
cycle menstruel. La concentration de rénine
suit des variations semblables.
L’identification pour le matériel à examiner, et
surtout pour les biopsies, ponctions ou frottis
du lieu de prélèvement, est indispensable surtout pour le diagnostic microbiologique. Le
choix de la bonne technique de culture et l’interprétation en dépendent.
Identification méticuleuse
du patient, de l’échantillon
et de la demande d’examen
Le choix du bon récipient est très critique, car
des interférences peuvent survenir en fonction
de l’additif. Tous les récipients ne sont pas bons
pour toutes les analyses. De nombreux tubes
pour le sang contiennent des stabilisateurs, des
substances coagulantes ou des gels de séparation, et sont ainsi optimisés pour certaines analyses. Les anticoagulants souvent utilisés dans
cette intention peuvent se répartir dans deux
classes:
1. substances captant le calcium, dont EDTA,
citrate, oxalate;
2. substances inhibant des enzymes, comme
l’héparine.
Les erreurs administratives, d’organisation, sont
l’un des facteurs d’erreur les plus importants
concernant les résultats de laboratoire. L’indication complète du nom, du prénom, de la date de
naissance sur la demande d’examen et le tube
est la condition sine qua non d’une attribution
sans erreur possible au patient, de valeurs de référence spécifiques et d’anciens résultats le
concernant. D’autres précisions, comme le sexe
ou les traitements en cours, contribuent souvent
à une bonne interprétation des résultats.
Choix du récipient:
l’embarras du choix
Tableau 1. Médicaments pouvant influencer les activités enzymatiques.
Enzyme
Effet du médicament
Phosphatase alcaline (PA)
Augmentation
Allopurinol, stéroïdes anabolisants, carbamazépine, cotrimoxazole, cyclophosphamide, disopyramide, érythromycine, isoniazide, kétoconazole, mercaptopurine, méthotrexate, α-méthyldopa,
oxacilline, papavérine, pénicillamine, phénobarbital, phénylbutazone, phénytoïne, propylthiouracil, triméthoprime/
sulfaméthoxazole, sulfasalazine, acide valproïque
Diminution
Clofibrate, contraceptifs oraux
Transaminases (ALT, AST)
Augmentation
Amiodarone, carbamazépine, disopyramide, oxacilline, papavérine,
paracétamol (acétaminophène), pénicillamine, phénylbutazone,
phénytoïne, acide salicylique, streptokinase, acide valproïque
Diminution
Allopurinol
Créatine(-phospho)-kinase
(CK ou CPK)
Augmentation
Clofibrate, digoxine, phénothiazine, succinylcholine
(suxaméthonium), théophylline
γ-Glutamyltransférase (γ-GT)
Augmentation
Carbamazépine, érythromycine, contraceptifs oraux
(sauf micropilule), phénytoïne
Diminution
Clofibrate
Lactate-déshydrogénase (LDH)
Augmentation
Stéroïdes anabolisants, acide acétylsalicylique/salicylés,
chlorpromazine, kétoconazole, pénicillamine, propylthiouracil,
acide valproïque
Diminution
Antiépileptiques
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Figure 4.
Augmentation de différents
paramètres après un marathon.
Le sang a été prélevé avant et
45 minutes après la course
(modifié d’après [1]).
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Les substances captant le calcium ne sont pas
indiquées pour le dosage du calcium, des électrolytes, ni des enzymes dont le calcium est cofacteur (p.ex. phosphatase alcaline, α-amylase). L’héparine comme anticoagulant peut se
trouver sous plusieurs formes, comme sel
d’ammonium, de lithium ou de sodium. Le sel
d’ammonium n’est pas indiqué pour le dosage
de l’urée, le sel de lithium pour celui du lithium
et le sel de sodium pour celui du sodium. Toutes
les forme d’héparine inhibent la «polymerase
chain reaction» (PCR) et ne sont donc pas indiquées pour de telles analyses; il faut alors utiliser du sang ou du plasma EDTA. Les récipients
les plus courants sont présentés dans le tableau
3. Le code-couleur uniformisé de ces récipients
n’est pas garanti par tous les fabricants sur le
marché.
Prélèvement
Figure 5.
Augmentation en pourcentage
de certains paramètres plasmatiques après passage de la position couchée à la position debout
(modifié d’après [1]).
Lors d’une prise de sang, il faut veiller à ce que
le garrot ne reste pas trop longtemps en place,
et ne soit pas trop serré, vu qu’une stase peut
fausser les résultats d’analyses (fig. 6). Pour
l’urine, l’agent de conservation approprié doit
se trouver dans le récipient avant de recevoir
l’urine.
La collecte d’urine sur 24 heures commence
d’habitude le matin. La 1re urine du matin est
jetée, ensuite toutes les mictions sont recueillies
jusqu’à et y compris la 1re urine du matin suivant. La durée de la collecte et son volume doivent être précisés. Si l’analyse ne se fait pas sur
place, 10–20 mL sont généralement suffisants,
mais il faut bien mélanger toute l’urine collectée.
Qu’est-ce qui peut encore
fausser les choses après
le prélèvement?
Une bonne conservation joue un très grand
rôle, surtout pour l’envoi d’échantillons ou les
analyses demandées après coup. En général, le
sang total pour formule sanguine sans répartition leucocytaire automatisée doit être examiné
dans les 24 heures. Pour la répartition automatisée, la fiabilité des résultats dépend généralement du principe de travail de l’appareil.
La conservation de sang total pour le dosage de
la glycémie donne des résultats faux, vu que des
cellules continuent à métaboliser le glucose. Les
échantillons pour les paramètres clinico-chimiques et de la coagulation doivent être centrifugés dans les 45 minutes. Pour le potassium,
le phosphate, la LDH, l’AST (GOT), l’homocystéine, il est recommandé de séparer le sérum.
Pour les analyses de paramètres photosensibles comme la bilirubine, les vitamines, les
porphyrines et la créatinekinase (CK), les tubes
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doivent être à l’abri de la lumière sitôt après la
prise de sang.
Les récipients doivent rester bien fermés. Tous
les prélèvements biologiques représentent
d’une part un risque de contamination, et il faut
d’autre part éviter toute contamination des
échantillons par d’autres échantillons, ou par
des micro-organismes extérieurs. Les composants sanguins peuvent être oxydés par la présence d’oxygène, et l’évaporation de l’eau en
provoque la concentration. Le sang total ne doit
pas être conservé au réfrigérateur, car les éléments cellulaires peuvent être lysés à basses
températures.
Si l’urine est conservée au réfrigérateur, des
sels peuvent cristalliser (phosphate de calcium
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et de magnésium, acide urique). Le froid complique également les examens morphologiques,
car il lyse les cellules.
Le tableau 4 présente les recommandations générales sur la stabilité et les conditions de
conservation des échantillons pour analyses.
Appréciation de la qualité
des échantillons: le résultat
des efforts passés
Une hémolyse in vitro entraîne la libération
d’éléments intraérythrocytaires. Cela se reconnaît à une coloration rougeâtre du plasma
ou du sérum après centrifugation du sang. L’ab-
Tableau 2. Rythme circadien de quelques paramètres de laboratoire
(S = sérum; U = urine) (modifié d’après [1]).
Paramètre
Maximum
(heure)
Minimum
(heure)
Amplitude
(% de la moyenne journalière)
ACTH
6–10
0–4
150–200
Cortisol
5–8
21–3
180–200
Testostérone
2–4
20–24
30–50
TSH
20–2
7–13
5–15
T4
8–12
23–3
10–20
Somatotropine
21–23
1–21
300–400
Prolactine
5–7
10–12
80–100
Aldostérone
2–4
12–14
60–80
Rénine
0–6
10–12
120–140
Adrénaline (S)
9–12
2–5
30–50
Noradrénaline (S, U)
9–12
2–5
50–120
Hémoglobine
6–18
22–24
8–15
Eosinophiles
4–6
18–20
30–40
Fer
14–18
2–4
50–70
Potassium (S)
14–16
23–1
5–10
Phosphate (S)
2–4
8–12
30–40
Sodium (U)
4–6
12–16
60–80
Phosphate (U)
18–24
4–8
60–80
Volume (U)
2–6
12–16
60–80
Température corporelle
18–20
5–7
0,8–1,0 °C
S = sérum, U = urine
Tableau 3. Prises de sang pour examens de laboratoire de routine.
Paramètre
Technique de prise de sang/Matériel à examiner
Chimie clinique, sérologie
sang veineux sans additif
Couleur du bouchon
rouge
Chimie clinique dans le plasma
plasma hépariné
vert
Glucose (à jeun)
sang veineux avec fluorure de sodium (NaF)
comme inhibiteur de la glycolyse
gris
Hématologie
sang veineux ou capillaire EDTA
lilas
Coagulation
sang citraté (non capillaire)
bleu clair
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Figure 6.
Variation en pourcentage de la
concentration sérique de
certains paramètres après
6 minutes de garrot (modifié
d’après [1]).
118
sence de coloration n’exclut pas une hémolyse,
car l’œil ne perçoit que des concentrations d’hémoglobine supérieures à 0,3 g/L environ (0,03
g/dL). Et une hémolyse ne s’accompagne pas
que d’une libération d’hémoglobine. Si le sang
est conservé à des températures trop basses,
des éléments intracellulaires peuvent également être libérés (potassium, phosphate, LDH,
etc.). Il peut également y avoir des interférences
suite à la lyse des thrombocytes ou des granulocytes.
Les conséquences d’une hémolyse sont:
– augmentation des éléments intracellulaires
dans le liquide extracellulaire (potassium,
phosphate, AST, LDH, etc.);
– interférences optiques de l’hémoglobine
avec des méthodes travaillant aux mêmes
longueurs d’ondes;
– interférence des éléments intracellulaires
avec les réactions chimiques.
L’examen des échantillons à la recherche d’une
lipémie, d’une hémolyse ou d’autres dyscolorations doit être signalé dans le protocole de laboratoire, et mentionné sur le résultat, pour que
l’interprétation des résultats en soit facilitée.
après une pose de 6 minutes
Tableau 4. Conservation des échantillons pour examens de laboratoire courants.
Recommandations générales.
Analyse
Matériel
Durée de conservation
1
Température
Groupes sanguins
sang total EDTA
1 semaine
frigo
Coagulation
sang citraté
jusqu’à 1 jour2
température ambiante
Hématologie
sang total EDTA
1 jour3
température ambiante
Chimie clinique
plasma hépariné, sérum
1 semaine
frigo
Sérologie
sérum
6 semaines
frigo
Toxicologie
sérum
6 semaines
frigo
1
2
3
Valable pour détermination automatique des groupes sanguins. Pour la détermination manuelle,
possibilité d’utiliser un tube sans additif (même sans gel de séparation).
Valable pour examens de dépistage tels que Quick, TPT et fibrinogène dans tube citraté non ouvert
et non centrifugé.
Valable pour la formule sanguine sans répartition leucocytaine.
Tableau 5. Conditions de centrifugation.
Matériel
Force centrifuge (x g)
Temps (minutes)
Sérum ou plasma
1000–1300
10–15
Coagulation
2000
15
Urine
400
5
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Préparation des échantillons:
quels travaux sont urgents?
Figure 7.
Nomogramme et formule de
calcul de la vitesse de rotation
en rpm à partir du rayon de la
centrifugeuse (cm) et de la force
centrifuge relative (x g).
La préparation des échantillons est la dernière
étape avant l’analyse. Le sang total pour formule sanguine doit être incliné plusieurs fois
immédiatement après avoir été transféré dans
le tube, pour que l’anticoagulant empêche toute
coagulation. Les mélangeurs mécaniques sont
faits pour cela, ils balancent constamment les
tubes sur leur axe ou les font tourner jusqu’à
l’analyse.
L’inclinaison est également indiquée pour d’autres analyses; et ensuite la centrifugation. Pour
le plasma, les tubes peuvent être centrifugés
sitôt après la prise de sang et le mélange. Pour
le sérum, il faut attendre entre 20 et 45 minutes
avant que la coagulation soit terminée. Chez les
patients sous anticoagulants, cela peut prendre
plus longtemps. Il est alors recommandé de
prendre du plasma hépariné (exception: électrophorèse des protéines) au lieu de sérum. La
vitesse de centrifugation des échantillons est
très importante pour obtenir un surnageant
sans cellules (tabl. 5).
Si la vitesse de rotation est insuffisante, des cellules (érythrocytes ou thrombocytes) peuvent
rester dans la phase liquide et s’y lyser. Les
thrombocytes non séparés après une centrifugation insuffisante libèrent du potassium, du
phosphate, la LDH, la phosphatase acide, etc.).
Et une centrifugation trop énergique ou prolongée peut lyser les cellules.
Comme les centrifugeuses n’ont pas un rayon
de centrifugation uniforme, il faut indiquer la
force centrifuge relative (x g) en rotations par
minute (rpm). Des nomogrammes basés sur des
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formules facilitent cette conversion de la bonne
rotation en rpm. Il faut pour cela le rayon de la
centrifugeuse, mesuré par la distance entre
l’axe de rotation et le fond du tube dans sa position de centrifugation (fig. 7).
Points importants spécifiques
Hématologie
Pour les examens hématologiques tels que numération érythrocytaire, hémoglobine, hématocrite, leucocytes (avec répartition), thrombocytes, l’EDTA (K2-EDTA; sel dipotassique) est
l’anticoagulant qui convient le mieux. Le K3EDTA (sel tripotassique) n’est plus recommandé,
car il a un effet sur le volume cellulaire (et donc
l’hématocrite). Les tubes de sang total doivent
être inclinés plusieurs fois après leur remplissage, mais pas secoués. Une bulle d’air permet
un mélange optimal (remplir le tube à 80% environ). L’agitation trop frénétique provoque une
hémolyse pouvant fausser les résultats.
Le sang total doit être analysé dans les 6 heures
suivant la prise de sang (mieux dans les 1–2
heures). Si cela n’est pas possible, il faut faire
un frottis dans les 2 heures suivant la prise de
sang pour la répartition, car après ce délai des
altérations morphologiques apparaissent.
Chimie clinique
Sang
Pour la plupart des paramètres de routine, le
sérum est valable. Le transfert du sang dans un
tube avec gel de séparation est autorisé si le
sérum est entièrement séparé des éléments cellulaires après coagulation complète. L’analyse
sur plasma hépariné est certes plus chère, mais
elle présente l’avantage sur le sérum que:
– la centrifugation des tubes peut se faire immédiatement après la prise de sang;
– les résultats sont plus fiables que dans le
sérum;
– il n’y a pas d’hémolyse in vitro.
Coagulation
Pour les examens de la coagulation, les tubes
citratés sont parfaitement indiqués. La bonne
concentration de citrate est de 3,8% (0,129
mmol/L). Il faut respecter la proportion idéale
entre anticoagulant et sang (1:9). Il faut donc
remplir les tubes jusqu’à la marque. Incliner
plusieurs fois les tubes, sans les secouer.
S’il faut plusieurs tubes, il ne faut prélever le
sang dans les tubes citratés qu’après avoir rempli les tubes sans additif. Faute de quoi la cascade de la coagulation est activée par la thromboplastine tissulaire, ce qui fausse le TCA.
Chez des patients connus pour avoir un hématocrite bas ou élevé (<20% ou >50%), il faut
adapter la quantité de citrate pour obtenir une
proportion optimale.
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Urine
Quintessence
Le respect consciencieux des conditions préanalytiques diminue le nombre
des résultats ininterprétables, à refaire, et la perte inutile de temps.
Conditions importantes pour une prise de sang optimale: à jeun (aucune
nourriture depuis au moins 12–14 heures), tôt le matin (entre 7 et
9 heures), atraumatique, si possible toujours dans la même position,
jamais sur un bras porteur d’une perfusion.
Pour éviter toute confusion des échantillons et des patients: inscrire le
nom, le prénom et la date de naissance du patient sur la demande
d’examen et sur l’échantillon.
Autres remarques importantes: bonne vitesse et bonne durée de centrifugation, ne pas secouer les tubes, choisir les bons agents de conservation
et de stabilisation, protéger de la lumière, surveiller les températures.
L’examen d’urine peut donner plusieurs informations selon la technique de récolte.
– Les urines spontanées donnent des résultats
qualitatifs. L’examen du sédiment doit se
faire au plus tard 1 heure après la récolte.
– Pour les examens bactériologiques, il faut
l’urine du milieu du jet, prélevée par sonde
ou par ponction. Le patient doit parfaitement connaître la technique de récolte du
milieu du jet.
– Pour les examens qualitatifs, il faut une
simple collecte d’urine (résultat rapporté au
taux de créatinine).
– Pour les examens quantitatifs, la préférence
est donnée aux urines de 24 heures. Le patient doit être parfaitement instruit en la
matière.
Références
1 WG Guder, S Narayanan, H Wisser, B
Zawta. Samples: from the patient to
the laboratory. Darmstadt: GIT Verlag; 2001.
2 DS Young. Effects of drugs on clinical
laboratory tests. Washington DC:
AACC Press. 5th edition; 1999.
3 Beck EA, Mertz E, Gianella M,
Dall’Acqua A, Vallet V, Sabo G,
Knecht H (Lugano, Basel). Stability of
coagulation factors VIII an V in a one
day public transportation system:
whole citrate blood is superior to
plasma. Schweiz Med Wochenschr
2000;130(Suppl 115).