09 Polymorphisme
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UE Génétique médicale Cours n° 9 – Pr Rochette – 29.01.2014 Typeur : LEGRAND Renaud– ARTUS Arnaud Correcteur : JAAFAR Ali LE POLYMORPHISME I. Généralités A. Définition Polymorphisme plusieurs formes Toute variation de séquence de l’ADN, qu’elle soit ponctuelle ou qu’elle intéresse une répétition de séquences (mini-microsatellites), est un polymorphisme si sa séquence a une fréquence ≥ 1% dans une population donnée. L’ADN n’est pas un élément statique : - Il est sujet à des modifications (variations transmissibles) intra ou interindividuelles. Les variations de séquences sont appelées polymorphisme lorsqu’elles surviennent à une fréquence > 0,01. Si une séquence a une fréquence < 1% : on parle de mutation (privée). En fait, les polymorphismes sont arrivés par mutation ! Les polymorphismes sont soit : neutres, avantageux ou désavantageux. L’hétérozygotie moyenne de l’ADN humain est environ 0,004 : 1 base différente pour 250 à 300 bases entre 2 allèles ou 2 séquences entre 2 individus (vient des recombinaisons). Le polymorphisme affecte toutes les régions de l’ADN : - séquences codantes - introns - ADN répété (mini – microsatellites) Les polymorphismes de l’ADN servent à son analyse : La séquence d’un locus peut varier d’un individu à un autre. Le polymorphisme (de restriction ou de répétition) n’est pas nécessairement la cause de la maladie. - Il peut s’agir d’un polymorphisme marqueur d’une maladie sans qu’il en soit la cause - Le fait qu’un polymorphisme soit près d’un gène muté (par exemple) est utilisé comme marqueur de la maladie. Domaine du diagnostic indirect Le polymorphisme peut modifier : - Un site de restriction Polymorphisme de restriction - La longueur d’un motif répété Polymorphisme de répétition 1 B. Types de polymorphismes Donc deux types de polymorphismes : - Polymorphisme SNP / de restriction o Single Nucleotide Polymorphism o polymorphisme de taille (de longueur) o Sur un profil analysé par la méthode de Southern o Peut induire une différence de longueur détectable par une enzyme de restriction o Ce sont des outils qui vont servir au diagnostic des maladies, et à reconnaître les individus - Polymorphisme de répétition : variation de taille o Microsatellite (2 ou 3 nucléotides répétés, ex : CACACACACACA…) o Minisatellite (15 nucléotides répétés) C. Nomenclature : La séquence d’un locus peut varier d’un individu à l’autre. - RFPL : Restriction Fragment Lenght Polymorphism o Variation ponctuelle de séquence affectant un site de restriction o utile pour faire les diagnostiques de maladies (détection de présence ou absence d’un acide a un endroit donné) o mis en évidence par : Méthode de Southern, PCR - VNTR : Variable Number Tandem Repeat o Répétition en tandem pour des séquences assez longues o = Minisatellite (nombre de copies différentes d’une séquence répétée > 10 pb X n) o polymorphisme de répétition - STR : Simple Tandem Repeat o Microsatellite (1 à 5 pb X n) Exemple : pilule et mutation homozygote pour certains gènes : du risque de thrombose. II. RFLP A. Définition Un RFLP est défini: - par un couple Sonde / Enzyme (Southern) - ou par un couple taille / enzyme (PCR). Ils sont mis en évidence par la méthode de Southern (Sonde / Enzyme) ou PCR (taille / enzyme). Sa localisation précise, sa variabilité (présence ou absence du site de restriction) et sa transmission mendélienne lui confèrent un caractère de marqueur génétique codominant (un chromosome peut être porteur du site de restriction et pas l’autre) Le couple sonde/enzyme : - se caractérise par : +/- (coupe : + / ne coupe pas : -) - correspond à des allèles (Bi-allélisme). 2 Pour être informatif, le RFLP (=polymorphisme de taille) doit être reconnu par une sonde unique. Le nombre de sites de restriction pour une enzyme donnée reconnaissant un motif hexa-nucléotidique: 46 = 4096 séquences possibles. - - Mais seules 64 combinaisons ont la symétrie palindromique réclamée par les enzymes de restriction (Une séquence palindromique se lie de la même façon de 5’ vers 3’ et de 3’ vers 5’ - ex : RADAR). et 41 combinaisons sont reconnues seulement par les enzymes déjà caractérisées. Donc 1% seulement des polymorphismes par mutation ponctuelle sont détectés par les enzymes de restriction et constituent des RFLP. B. Exemple: L’enzyme EcoR1 reconnaît puis hydrolyse : 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Si cette séquence est mutée, l’enzyme EcoR1 ne peut plus hydrolyser l’ADN à cet endroit. Mutation Si par exemple l’enzyme doit couper 3 sites, elle libèrera 2 morceaux A et B. Si le site EcoR1 est muté, l’enzyme ne coupera pas il y aura alors 1 morceau AB non coupé. Dans une maladie, où il y a une mutation qui « annule » un site de restriction : cette méthode permet d’inventer une méthode de diagnostic. 3 C. Sites de restriction On distingue : - - des sites de restriction obligatoires (toujours présents chez tous le monde, ex : MST2 coupe en 1, 2, 3, 4, 5) des sites de restriction variables : Chez un individu, sur 100, il y a un site de restriction en plus = Polymorphisme Ce polymorphisme peut être la cause d’une maladie : on peut faire le diagnostic de la maladie. N = n’importe quel nucléotide D. Application indirecte pour faire un diagnostic : marqueur (à savoir +++) Le site de restriction peut être utilisé comme un marqueur La mutation sur le chromosome est du au hasard dans une région où il y a un site de restriction aboli. Explication : - - Pour cette mutation on en déduira que : si le morceau d’ADN est de 5kb au lieu de 4kb il y a alors une abolition du site de restriction. C’est un diagnostic indirect, qui se fait de moins en moins aujourd’hui au profit du séquençage. Lorsqu’il y a une mutation dans le gène qui génère une maladie génétique, on s’aperçoit que l’enzyme EcoR1 n’a pas de site Le morceau sera plus grand. Ceci est valable dans une famille donnée : une particularité génétique d’une famille ne se retrouve pas forcément chez une autre. Plus un polymorphisme est loin du gène muté, moins c’est utilisable, notamment à cause des recombinaisons. PS : Plus un polymorphisme est loin du gène muté, moins c’est utilisable, notamment à cause des recombinaisons. 4 III. Les polymorphismes de variation de longueur A. Les minisatellites Hypervariables (VNTR) - Ce sont des séquences répétitives, dispersées et très polymorphes. Il s’ajoute à cette variabilité un taux élevé de mutation. Ce sont donc des marqueurs polyalléliques sur tous les chromosomes sauf X et Y. La séquence est de type : GGAGGTGGGCAGGA(A/G)G, et varie de 11 à 16pb, répétée et en tandem. Ils permettent d’étudier la ségrégation de nombreux loci. La probabilité de rencontrer deux individus non apparentés avec un profil identique de VNTR est < 10-20 Deux individus n’auront jamais les mêmes séquences répétées excepté les jumeaux homozygotes : c’est la signature génétique (intérêt en médecine légale). B. Les minisatellites - - 20-100 pb répétées en tandem (c’est la séquence de 16 qui répétée plusieurs fois) o L’inverse de tandem = dispersé : plusieurs nucléotides entre les répétitions o tandem = répétitions à la suite Polymorphisme de variation de longueur. Longueur des répétitions peut varier d’un individu à l’autre (test de paternité et maternité, un individu aura la moitié similaire à sa mère et l’autre à son père). C. Exemple A et B sont deux marqueurs polymorphes encadrant le gène d’une maladie liée à l’X. Hypothèse : - le gène, dont on veut suivre la ségrégation, est « lié » à deux marqueurs. - Si on sait repérer A et B, on en déduit la transmission du gène puisqu’à chaque fois qu’on hérite du gène, on hérite des marqueurs dans une famille donnée. Le polymorphisme de restriction ou de répétition n’est pas nécessairement la cause de la maladie. Il peut s’agir d’un polymorphisme marqueur dune maladie sans qu’il en soit la cause. Le fait qu’un polymorphisme soit près d’un gène muté par exemple est utilisé comme marqueur de la maladie. Difficile dans la génétique médicale sans étudier la famille (pour les maladies rares +++) 5 Imaginons qu’au cours de l’évolution chez les individus qui ont le gène muté, il apparaisse incidemment une variation de séquence dans le marqueur A, cela permet de repérer la mutation. Cette variation de séquence peut générer un site de restriction (mais pourrait aussi bien en supprimer une) Avant l’apparition du site de restriction la séquence était : CCNAGG GGNTCC Au cours de l’évolution, on a une addition : CCTNAGG GGANTCC Nouveau site Mst II Ceci est un hasard : le site de restriction Mst II devient le marqueur de la maladie sans en être la cause directe. IV. Le spectre des variations de séquence A. Mutations des gènes codants La majorité des mutations sont silencieuses (= neutres) ou sont synonymes (= ont le même sens). Le plus souvent, il n’y a pas de modification du message si la mutation survient sur la troisième base du codon (Sauf méthionine et tryptophane qui n’ont qu’un seul codon possible) Les mutations non synonymes sont imprédictibles ! (exemple : arginine => valine) : - Change la nature d’un aa - Exemple : remplacement d’un aa basique par un aa acide Le taux final de mutation de l’ADN codant << aux mutations de l’ADN non codant car 95-99% de l’ADN est non codant. Un polymorphisme de restriction peut accompagner une maladie sans en être responsable. B. Mise en évidence des polymorphismes de répétition Sur 200 pb, que des CA : CACACA répété N fois Quand les répétitions débutent et se terminent : 2 sites de restriction pour l’enzyme EcoR1. Chez d’autres individus ou sur l’autre chromosome du même individu, il y a toujours la région de l’ADN encadrée par 2 sites Eco R1 mais entre ces deux sites il y a plus de répétition de CA. Quand on coupe l’ADN avec EchoR1 et qu’on peut repérer la région, on trouve 3 possibilités: - soit l’individu est homozygote et sur ses 2 chromosomes il a des CA qui s’étendent sur 300pb il est BB homozygote soit il est homozygote pour 200 pb il est AA homozygote soit il est 200 + 300 il sera AB PS : Il faut savoir identifier si c’est homozygote ou hétérozygote à l’exam ! 6 A/B =Hétérozygote A/A = Homozygote à 4 blocs de CA B/B = Homozygote à 6 blocs de CA 7
