Rached Hadrien Degrenne Nicolas 10 /03/2010 EC immunodep,la

Rached Hadrien
Degrenne Nicolas
10 /03/2010
EC immunodep,la cellule souche outil en therapie cellulaire
La prof a souligné de bien connaitre les parties GVH, GVL, les différents types de greffon et les indications. Bon
courage
La cellule souche, outil en thérapie
cellulaire
I-Thérapie cellulaire et cellules souches
A-Définition
-Nouvelle approche thérapeutique en expention
-Administration à un patient d’une population cellulaire (préparation cellulaire)
présentant des caractéristiques définies, afin de corriger une pathologie
-Finalité : corriger le tissu déficient ou une fonction biologique
-Utilisation de nombreux type cellulaire : les cellules hématopoïétiques, cellules
du foie, cellules de la peau…
-Les procédés de préparation cellulaires peuvent comprendre une sélection, une
culture, une amplification voir une activation des cellules
-Elle nécessite la réalisation d’un control de qualité du produit cellulaire avant
l’injection au patient
Généralités :
 Des cellules souches capables d’assurer l’homéostasie cellulaire sont
présentes dans les tissus à l’âge adulte
 Les cellules souches hématopoeitique à l’origine des cellules sanguines
sont connues depuis plusieurs décennies et sont utilisées de manière
courante en thérapie cellulaire
Définition : Cellule indifférenciées douées de la capacité d’auto-renouvellement de de
différenciation
II- Greffe de cellules souches hématopoïétiques
A- Généralité
Principe :
-Administrer à un patient atteint de néoplasie un traitement lourd
chimio/radiothérapique à visé de destruction tumorale sans se soucier de sa toxicité
hématologique qui sera contre balancé pas la greffe de CSH
-Notion d’effet dose
Définitions :
-Greffe allogénique : greffon prélevé sur un donneur sain
-Greffe autologue : Greffon prélevé sur le patient lui-même
Interet important des facteurs de croissance, celui qui est actuellement utilisé est le
G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) ayant supplanté son prédécesseur le
GM-CSF
Sources de greffon possibles :
-La moelle osseuse (MO)
-Le sang périphérique
-CSP (cellules souches périphériques circulantes
-Sang placentaire (USP : Unité de sang placentaire)
B-Indication d’allogreffe de CSH
Maladies hématologiques :
-Leucémie aigue (LAM LAL), leucémie myéloïde chronique (LMC)
-Lymphome non Hoggkiniens (NLH graves du sujet jeune)
-Aplasie médullaire
Anomalies génétiques :
-Maladie héréditaires rares affectant la MO
Déficits immunitaires congénitaux sévères
Anémie de Fanconi qui aboutira in fine a une aplasie médullaire
Beta thalassémies
schéma indication actuelle des greffes de CSH)
La réussite d’une greffe de CSH va dépendre de deux facteurs majeurs, d’une part la
compatibilité HLA qui doit être la meilleure possible (10 Ags HLA sont importants,
notamment A, B , C, DR, DQ) et de la quantité de CSH réinjectée qui doit être suffisante par
rapport au poids du patient
C – Autogreffes
Généralités :
- Ne possède pas la toxicité de l’allogreffe
- Mais ne possède pas l’effet immunothérapique de l’allogreffe (GVL)
- Interet : permettre l’effet dose (dose maximale de chimio/radiothérapie) en
reconstituant l’hématopoïèse
- Limites : présence d’une maladie résiduelle soit dans le greffon soit chez le malade
- Réinjection après un traitement lourd en général à la fin du protocole
Type de greffon
-MO
-CSP : utilisé dans la majorité des cas
Indications
-Maladies hématologiques
-Tumeurs solides chimio sensibles
1- Recueil du greffon
Il existe des progéniteurs hématopoïétiques dans le sang circulant mais en toute petite
quantité (<0,1%)
Fin des années 1970
Augmentation des progéniteurs dans le sang après chimiothérapies
Le pic est :
 comptemporain de la sortie d’applasie
 transitoire
 d’amplitude variable
Nécessité +++ de mobilisation pour pouvoir prélever des CSH dans le sang périphérique
Déroulement
-mobilisation de MO vers le sang périphérique des progéniteurs par traitement G-CSF
(autrefois GM-CSF) seul ou associé avec chimiothérapie
-Cytaphérèse : receuil de progéniteurs hématopoietiques sanguins
 abord veineux périphérique
 séance de 3 à 4 heures
 greffons 1à à 100 fois plus riche que greffon médullaire
 1, 2 ou 3 séances
 Cellules du greffon cryopréservées en DMSO 10% (agent protecteur des cellules
contre le refroidissement progressif) et stocké en azote liquide à -196°C
- Ultérieurement : conditionnement à la greffe (chimiothérapie plus ICT)
- Injection du greffon : décongélation rapide dans Bain Marie à 37°C. Transfusion
immédiate de la suspension cellulaire
Evaluation de la qualitée du greffon
-Hématopoietique :
 Numération des cellule CD34+
 Numération des CFU-GM
-Maladie résiduelle
 Recherche de cellules tumorales
2- Numération des cellule CD34
Intérêt ?
-Déterminer le moment optimal pour réaliser la cytaphérèse, numération en cytométrie des
cellules CD34 le matin sur sang total
-Déterminer la qualité hématopoiétique du greffon
Technique ?
-Les cellule CD34+ sont des évènements rares, nécessitant donc une standardisation
importante par cytométrie de flux
3-numération des CFU-GM
Culture clonogénique à court terme
-Lecture au microscope des colonies à J14
-On a réalisé des standardisation de l’examun
-Seuil : CSP>10*10^4/kg du receveur
Moelle > 4*10^4 du receveur
4- Critères de validation d’un produit de CSH
On effectue une numération des CFU-GM
Le greffon est considéré comme satisfaisant si le nombre de CFU-GM est :
10*10^4/kg pour les CSP
4*10^4/kg pour la moelle
On effectue aussi une numération des cellule CD34, le greffon étant considéré comme
satisfaisant si le nombre de cellule CD34 est supérieur à 3*10^6/kg du receveur
Notion de seuil de CD34
Seuil de receuil dans le sang chez le donneur : >10 par mm3
Seuil de réinjection : il va différé selon l’age du receveur
Pour les adulte il faut que ce seuil soit supérieur à 10*10^6 CD34 /kg selon les auteurs, les
protocoles et les pathologies
Pour les enfants il faut que ce seuil soit supérieur à 3*10^6/kg
D-La greffe allogénique
C’est la « vraie » greffe
Elle possède une action curative
Elle nécessite l’existence d’un donneur HLA identique qu’il soit familiale (30% des cas) ou
non apparenté (gestion par l’association France Greffe de Moelle)
Type de greffon
MO ou Sang périphérique prélevé à la demande ou sang placentaire stocké et congelé
Il y aura réinjection après le traitement myéloablatif (chimio/radiothérapie)
1- Définition de l’allogreffe
L’origine du greffon est un donneur sain, provenant de la MO, du sang périphérique ou du
sang de cordon
L’intérêt de l’allogreffe est l’effet dose du traitement myéloablatif et immunosupresseur
réalisé avant greffe, en cela cet intérêt est le même que celui de l’autogreffe
L’intérêt tient aussi du fait du remplacement du système hématopoïétique malade et de
l’effet immunothérapique c’est-à-dire remplacé le système immunitaire du receveur par
celui du donneur
Cet effet immunothérapique va avoir deux conséquences majeures, l’effet GVH toxique et
l’effet GVL bénéfique.
2- Modalité de l’allogreffe
-choix du donneur :
 Famililiale (fraterie) la situation HLA doit etre strictment identique, c’est-àdire les meme Ags HLA classe I (HLA A et B) et de classe II (DR, DP, DQ) . Il y a
25% de chance d’avoir un frère ou une sœur de génotype identique.
 Il peut etre non apparenté aussi, le choix se fait alors sur un fichier de
donneurs volontaires non apparentés. Le phénotype HLA doit toujours être
identique, on va alors rechercher le donneur ayant la plus grande
compatibilité (typage en biologie moléculaire) moléculaire car les différences
HLA et la sévérité de la GVH sont liées
3- Le prélèvement de MO côté donneur
Dans les mois précédents le prélèvement on va avoir une visite médicale assurée par un
médecin hématologiste et un médecin anesthésiste. Il va y avoir de plus un bilan biologique
(NFS, bilan de coagulation, bilan hépatique, électrophorèse des protides, sérologie virales).
Enfin on aura pour finir un ou deux prélèvement de sang autologue.
Le prélèvement va se faire ensuite, il sera suivi de 48 heures d’hospitalisation. Il peut avoir
de nombreuses conséquences et risques : arrêts de travail, douleurs au crêtes iliaques, le
risque intrinsèque de l’anesthésie.
Explication du prélèvement :
Il va se faire au bloc opératoire donc dans un environnement chirurgicale, sous anesthésie
générale bien que des péridurales soient possibles. Le prélèvement se réalise à l’air de
trocarts au niveau des crêtes iliaques postérieures. Il va y avoir utilisation de seringues
héparinées, le recueil de la moelle épinière se fera dans des poches stériles contenant de
l’anti coagulant. La quantité prélevée va être fonction du poids du receveur, pouvant aller
ainsi de 100ml à plus de 1.5 litre
4- Allogreffe, modalités
Conditionnement du receveur :
Il va dépendre de l’indication et des protocoles, le but étant d’avoir une activité anti
tumorale, un effet myéloablatif et enfin une activité immunosuppressive pour prévenir le
rejet du greffon !
Apres greffe :
Il va y avoir des mesures d’isolement et de prévention de l’infection :
-Chambre à flux d’air laminaire ou a pression positive
-asepsie rigoureuse
-décontamination digestive (ATB, antifongique per os ou aérosols)
-culots globulaires si HB<8.5g/dL
-Concentré plaquettaire si plaq<10 ou 20 G/L
Reconstitution hématologique et immunologique post-greffe
La sortie d’aplasie est au premier deux jours consécutifs avec PN>0.5G/L, et se situe souvent
a J12-J15. La reconstitution plaquettaire se fait par la suite entre J15 et J60. La reconstitution
immunitaire est elle bien plus tardive.
5- Allogreffe, indications
Maladie hématologique :
-Leucémie aigüe et LMC
-Lymphome grave du sujet jeune
-Aplasie médullaire
Anomalies génétiques :
Toute maladie génétique affectant la MO.
6- Les complications de l’allogreffe :
Elles peuvent être liées à la greffe elle-même, c’est surtout la GVH, qui est par ailleurs la
complication la plus grave responsable de 20 à 40% de mortalité et survenant dans 30 à 50%
des greffes.
L’autre complication majeure est la maladie veino-occlusive du foie, c’est-à-dire l’occlusion
des veine entéro-hépatique survenant dans 10 à 15% des cas. Il existe par ailleurs des
complications liée au déficit immunitaire persistant.
Les complications peuvent être liées aussi à la maladie, c’est-à-dire la rechutte d’où
l’efficacité parfois d’injection des cellule mononuclées du donneur (LT) ces cellules ayant un
effet GVL et GVH donc des effets délétères.
Complication post-greffe : GVH
Les cellules immunocompétentes du donneur (LT) reconnaissent les cellules somatiques du
receveur et les détruise. L’effet GVL est le versant bénéfique de la GVH, dans ce cas il va y
avoir reconnaissance par les lymphocytes des cellules tumorales résiduelles. Il n’existe
aujourd’hui pas de méthode pour différencier ces deux effets.
E-La GVH
1- Condition pour la survenue d’une GVH
Le greffon doit bien entendu contenir des cellules immunocompétentes, le receveur doit
posséder des allo-Ags absents chez le donneur et qui vont apparaitre étrangers, capables
donc d’engendrer des réactions immunitaires. Enfin le receveur doit être incapable de
produire lui-même une réaction immunitaire contre le greffon.
2- Physiopathologie
Les Ags reconnus sont des molécules du CMH, des Ags mineurs d’histocompatibilité, et
possiblement des Ags viraux.
3- Facteurs de risques d’une GVH
-Disparité HLA
-Différence de sexe receveur/donneur
-Allo-immunisation antérieure du donneur -> Risque augmenté si le donneur est multipart
ou multi transfusé
-Age du receveur -> Risque augmenté avec l’âge du receveur : inférieur à 20ans -> 20% ;
supérieur à 50ans -> 80%
-Statut du CMV -> Risque augmenté si le receveur est séropositif pour CMV ou si il reçoit un
greffon de donneur séropositif
-Influence du traitement -> Conditionnement ICT versus chimio augmente le risque
4- GVH aigue
Elle survient avant 100 jours
Les manifestations cliniques sont multiples :
-Signes cutanés -> erythème maculopapuloprurigineux avec ou sans décollement
-Digestifs -> diarrhée aqueuses
-Signes hépatiques -> cholestase, voir IHC
-Signes associés : fièvre, pancytopénie
Il existe une classification suivant la sévérité de l’atteinte des organes cibles (+, ++, +++,
++++) permettant ainsi d’établir des grades de sévérité.
5- GVH chronique
Elle survient après 100 jours, elle va mimer une maladie auto immune, l’atteinte est comme
la GVH aigue, pluri viscérale mais de manière plus large (cutané, hépatique…)
Peut survenir de novo ou à la suite d’une GVH aigue. Le traitement de la GVH expose aux
infections. L’incidence de la GvH chronique est de 30% dans les greffes géno-identique et de
50% dans les greffes phéno-identique.
F-Autre greffons d’allogreffe
1- Cellules souches périphériques (CSP)
L’aplasie est plus courte qu’avec une greffe de MO, la mobilisation cellulaire se fait par FC
seuls. Cette technique ne nécessite pas d’anesthésie générale, l’intérêt est un miniconditionnement et obtention d’un effet GVL mais :
Effets à long terme de l’administration d’un FC chez un sujet sain est inconnu. Il y a par
ailleurs une réinjection chez le receveur d’une plus grande quantité de LT (10 fois supérieure
à celle de la moelle) -> augmentation de GVH aigue? Le risque accru de GV aigue est avéré.
III- Sang de cordon
= « sang placentaire » : sang contenu dans le placenta et le cordon ombilical
Le sang de cordon contient des cellules souches, leur nombre est suffisant pour faire une
greffe de façon similaire ç une greffe de moelle osseuse. Il n’y a pas de difficulté à le
prélever, le congeler sans pour autant altérer les cellules souches hématopoïétiques.
A- Avantages du sang de cordon
La disponibilité est immédiate et durable. Peu de réaction à la transfusion type DMSO, facile
d’utilisation, volume faible avec peu de perte cellulaire.
Deux autres avantage importants sont d’une part l’absence de risque pour le donneur, et
d’autre part un risque moindre te transmission virale (EBV, CMV).
Immaturité immunologique -> Faible risque de GVH et tolérance d’une incompatibilité HLA.
B- Limite de la greffe de sang de cordon
Nombre fixe de cellules disponibles :
Nombre médian de 1*10^9 cellules, or il est nécessaire d’injecter 3*10^7 cellules/kg de
poids corporel du receveur -> une USP correspond donc à moins de 40kg.
Retard dans la prise de greffe :
Risque d’infections sévères et précoces, durée d’hospitalisation++ et enfin transfusion
globulaire/plaquettaire
« Non prises » plus importante par rapport aux greffes par CSP et MO
Risque de transmission de maladies génétiques, cancéreuses :
Ecarter du don toute possibilité de maladies transmissibles par contrôle clinique de l’enfant
C- Fonctionnement d’une banque de sang
placentaire
A la maternité :
-Sélection de la donneuse potentielle
-Informations pré-don et conscentement
-prélèvement de tubes de sang maternel pour sérologies virales et le groupage HLA
-Sélection médicale de la donneuse
-Prélèvement de sang de cordon
NB : Uniquement 20 à 30% des femmes peuvent être prélevées et seulement 30% des
greffons seront banqués.
Contre-indication au prélèvement :
-liées à la mère
 Pathologique gynéco-obstétricales
 Pathologies infectieuses
 Maladies génétiques ou anomalies génétiques constitutionnelles
 Pathologies malignes.
 Pathologies endocriniennes/cardiaques/hémato/neuro
 Socio-culturelles (mineure, conduites addictives…)
-liées au père
 Père inconnu
 Maladies génétiques ou anomalies génétiques constitutionnelles
-liées au nouveau-né
 Problème de développement intra utérin
 Maladies génétiques (hémoglobinopathie…)
-liées à la fraterie
 Pathologies hémato, tumeurs solides
 Maladies génétiques ou anomalies génétiques constitutionnelles
-Au moment de l’accouchement
 Prématuré
 Température maternelle supérieur à 38.5°C
 LA méconial
 Ruptures des membranes supérieur à 33 heures
 Souffrances fœtales aigues
Prélèvement
Il n’est pas douloureux, il ne présente aucun dangers, il se fait par clampage du cordon, le
placenta reste in-utéro à ce moment. On fait la ponction dans la veine, et on a la possibilité
de ponctionner deux fois pour augmenter le volume.
70ml est le volume minimal prélevé susceptible de contenir une dose cellulaire suffisante
pour un usage thérapeutique du greffon. Si le volume est inférieur, on détruit ou on donne le
prélèvement en vue d’une utilisation scientifique en conformité avec le consentement de la
donneuse.
Stockage et transport :
Prélèvement laissé à température ambiante pendant 1 heure, puis stockage à 4-8°C puis
transport à la même température dans les 24 heures.
Contrôle de qualité du sang de cordon
-Sang de cordon initial, numération au DXH800 plus formule hématoflow
-Sang de cordon final : numération au DXH800, viabilité et compte de CD34 en cytométrie de
flux.
IV - Greffe de cellules matures
A – Obtention de cellules à visée transfusionnelle
Ce sont les plaquettes, les polynucléaires, mais également des cellules matures obtenues par
culture de CSP autologues en présence de cocktail de cytokines in vitro, puis réinfusion au
patient.
B – Injection de cellules dendritiques
Ce sont des CPA professionnelles
A partir de monocytes (GM-CSF + IL-4) ou de cellules CD34+ ou de cellules leucémiques, puis
sensibilisation avec un antigène tumoral.
Il y a eu des essais thérapeutiques à visée antitumorale, en particulier dans les mélanomes,
lymphomes folliculaires et cancer du rein.
V – Perspective : plasticité des cellules souches
dérivées de la MO
A – ES
Qu’est-ce qu’une cellule souche embryonnaire (ES) ?
C’est une cellule développée à partir de la masse interne du blastocyste qui est pluripotente.
Elle est capable de multiplication infinie à un stade indifférencié, et elle a la capacité de se
différencier dans toutes les lignées et dans de nombreux types cellulaires.
B – CS
En revanche, une cellule souche (CS) a une capacité moindre d’auto-renouvellement et elle
est non pluripotente ; elle a +/- de spécificité tissulaire. Elle a par contre une possibilité de
différenciation dans des tissus de spécificité différents de son tissu d’origine : c’est ce qu’on
appelle la plasticité.
Par exemple, la CSH ou cellule de moelle peut donner des myéloblastes cardiaques ou
squelettiques, de l’endothélium, des cellules hépatiques, du poumon, de l’épithélium
cutané, du neurectoderme.
Cette plasticité s’oppose à l’ancien dogme : on pensait auparavant que le destin des CS était
déterminé depuis le développement embryonnaire.
En 1999, un papier est publié, montrant ce concept de plasticité.
Expérience : Le receveur (rat femelle) a été préalablement irradié afin de provoquer une
cytolyse hépatique fulminante. De la moelle est prélevée chez le donneur (rat mâle afin de
pouvoir différencier les cellules, par présence du chromosome Y), puis greffée au receveur.
On a alors observé d’une part la reconstitution hématologique, et d’autre part la formation
d’un chimérisme au niveau du foie, puisque 0,14% d’hépatocytes sont porteurs du
chromosome Y : les cellules de la moelle du rat mâle sont donc allées dans le foie du rat
femelle, ce qui démontre la composante hépatocytaire de la plasticité.
2AAF : inhibe la prolifération hépatocytaire
CCL4: tétrachlorure de carbone : destruction hépatique chimique
C – CSM
Définition :
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) appartiennent aux cellules stromales
médullaires.
Ce sont des cellules adhérentes de la moelle osseuse, d’aspect fibroblastique.
Elles ont comme marqueurs phénotypiques : CD45-, CD34-, Thy1+, SH2+, SH3+.
Propriétés :
- Soutien de l’hématopoïèse : production de facteurs de croissance et d’interleukines (IL), car
elles appartiennent au micro-environnement médullaire.
- Plasticité : capacité de se différencier en plusieurs lignées : fibroblastes, ostéoblastes,
adipocytes, chondrocytes
- Immunosuppresseurs : ce sont des cellules immunomodulatrices qui inhibent la
prolifération lymphocytaire T dans des MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) : induction de
tolérance.
Application clinique potentielle des CSM :
- Greffe de CSM et CSH autologues et allogéniques : accélère la reconstitution
hématopoïétique et diminue le risque de GVH aiguë
 Réparation tissulaire : reconstitution osseuse et cartilagineuse, mais aussi des tissus
adipocytaire, musculaire myocardique, cérébral (implication dans les maladies neurovégétatives).
D - MAPs : Progéniteurs adultes multipotents
Ce progéniteur a été isolé dans la MO de rat, de souris et d’homme en post-natal.
In vivo, il est capable de donner des lignées embryonnaires.
In vitro, il est capable de donner du mésoderme : ostéoblates, chondroblastes, adipocytes,
myoblastes, endothélium), du neurectoderme, et de l’endoderme (hépatocyte like).
Ce sont souvent des cellules pluripotentes induites à partir de fibroblastes humains.
E – IPS : Cellule pluripotente induite
2 équipes de chercheurs différentes ont montré qu’en insérant des gènes avec des antiviraux, on pouvait induire des cellules pluripotentes.
Obtention de cellules pluripotentes induites à partir de fibroblastes humains du derme,
capables de donner naissance aux 3 feuillets embryonnaires : capacité de se transformer en
nimporte quel type de tissu, en particulier : neurones, cellules musculaires cardiaques
battantes, tératomes.
Avancées :
- permet la reprogrammation de cellules somatiques humaines en CS pluripotentes,
possédant les caractéristiques des CS embryonnaires.
- compréhension des mécanismes de pathologies
- screening des médicament, etc.
Problèmes à résoudre :
- le rendement de la transduction est faible : on obtient 10 colonies d’IPS pour 5.10^4
fibroblastes humains transduits.
- risque de développement de tumeurs (prolifération de tumeurs chez la souris transplantée
avec des IPS du à l’utilisation de rétrovirus et à la réactivation de c-myc
- remplacer rétrovirus par adénovirus