A. La plasticité du génome bactérien

Cours n°2
Bactériologie
Professeur Antoine Andremont
Vendredi 3 octobre
8h30
Ronéo typeur : Diana Mourão Balsa
Génétique bactérienne
1
Plan du cours :
Introduction
I. Le génome bactérien, plasticité et stabilité
A. La plasticité du génome bactérien
1. Mise en évidence de la plasticité du génome bactérien par la résistance
bactérienne aux antibiotiques
2. Le monde bactérien, une remarquable adaptation
3. La plasticité du génome bactérien et ses mécanismes
4. Les divers types de bactéries
B. Le génome bactérien
1. Du gène à la protéine chez les bactéries
2. Comparaison schématique de la bactérie et de la cellule eucaryote
3. L’ADN bactérien
C. La stabilité des espèces bactériennes
II. Les mécanismes de plasticité du génome bactérien
A. Les mutations au sein d’un génome
1. Rappel concernant le mécanisme des mutations
2. Expériences démontrant que les mutations surviennent de façon spontanée
3. Un exemple « d’application » des mutations
4. La gravité des mutations en clinique
B. Le transfert de gènes entre les bactéries
1. La transformation
a) Définition
b) Expériences
c) La transformation avec des fragments d’ADN et avec des
plasmides
2
d) Applications et conséquences de la transformation
2. La transduction
a) Définition
b) Rappel : le cycle de vie des bactériophages lytiques
c) La transduction généralisée
d) La transduction spécialisée
e) Une application de la transduction : les cosmides
3. La conjugaison
a) Définition et propriétés
b) Découverte de la conjugaison
c) Les étapes de la conjugaison
d) Le contact cellulaire, rôle du pilus F
e) Conjugaison chez les streptocoques
f) Rôle des plasmides de résistance dans l’évolution de la
résistance
g) Les plasmides et leur application en biotechnologie
C. Les éléments génétiques mobiles à l’intérieur de la bactérie
Conclusion
 Tout d’abord ce qui est en italique correspond à ce qui a été dit en cours : commentaires sur
schémas, explications complémentaires au texte.
 J’ai enlevé certaines diapos dont le prof ne s’est pas servi, en revanche j’ai jugé utile d’en
laisser certaines.
 Bonne année à tous.
3
Introduction : Pourquoi la génétique bactérienne est-elle importante pour
la pratique médicale ?

La résistance des bactéries aux antibiotiques
C’est un problème de santé publique rencontré dans la pratique médicale

La virulence
Du fait que certaines bactéries sont responsables d’infections très dramatiques qui ont
influencé l’évolution, on a l’habitude de voir les bactéries comme étant nos « ennemies ».
En fait la virulence est un moment dans l’évolution des bactéries qui explique que
certaines maladies disparaissent mais aussi que d’autres émergent de façon régulière.

Les biotechnologies
A chaque fois qu’on utilise les produits des biotechnologies on fait appel sans le savoir à
la génétique bactérienne. Aussi le progrès des connaissances dans ce domaine permettent
l’essor des biotechnologies avec l’apparition de nouveaux produits.
I. Le génome bactérien, plasticité et stabilité
A. La plasticité du génome bactérien
1. Mise en évidence de la plasticité du génome bactérien par la résistance
bactérienne aux antibiotiques




La résistance bactérienne aux antibiotiques suit le développement des nouvelles molécules.
Il y a peu (voire pas) d’exemples d’absence de résistance à un antibiotique donné.
Ce qui constitue un apparent paradoxe car de nombreuses molécules sont disponibles.
La réponse est la plasticité du génome bactérien
Ces cinquante dernières années on a observé un développement considérable des antibiotiques, à
chaque fois plus puissants et à spectres plus larges. Mais finalement à chaque fois les bactéries ont su
développer des mécanismes de résistance. L’explication de ce phénomène est la plasticité du génome
bactérien grâce à laquelle ils ont une énorme capacité à s’adapter à l’environnement qui les entoure.
Courbe représentant sur 10 ans l’évolution de la
résistance d’E.Coli à l’amoxicilline.
Constat : cette résistance a augmenté de 15 points
en 10 ans.
4
2. Le monde bactérien, une remarquable adaptation
• L’âge des bactéries : 3.5 milliards d’années
• Les premiers hommes : 3.5 millions d’années (Mille fois moins longtemps)
• Bactéries hautement adaptables (« tous terrains »)
– Plasticité du génome (éléments mobiles)
– Nombre (des milliers d’espèces)
– Lieux (elles sont présentes partout à la surface du globe)
L’âge de la Terre est d’environ 4 milliards d’années ; les bactéries ayant un âge de 3,5 milliards
d’années : elles sont apparues très tôt. Elles se sont donc adaptées à tous les changements
d’environnement qu’elles ont connu depuis 3,5 milliards d’années, colonisé toutes formes d’existence
(dont les êtres humains) et se sont répandues partout à la surface de la Terre. Comment cela est-il
possible ? Encore une fois cette remarquable capacité d’adaptation des bactéries est due à la plasticité
du génome bactérien.
Une chose impressionnante : nous avons dans notre corps plus de bactéries que de cellules eucaryotes.
3. La plasticité du génome bactérien et ses mécanismes
→ « C’est l’imagination des bactéries pour trouver des solutions à des pressions de sélection
environnementales. »
Il y a globalement 2 mécanismes de plasticité du génome : les mutations et l’acquisition de
nouveaux gènes.
• Les mutations : survenue constante, simplicité et rapidité pour modifier une fonction mais système
simple (pas de solution complexe), transfert vertical uniquement
• L’acquisition de « nouveaux » gènes : survenue rare, long pour « fabriquer les premiers éléments
», mais permet des solutions complexes et multiples, transfert vertical et horizontal.
Mutations : changements singuliers de paires de base. Effet immédiat mais au même temps ce sont
des choses ponctuelles qui engendrent des réponses « oui/non » comme par exemple la perte d’une
fonction. Ce système ne permet donc pas d’adapter finement la réponse bactérienne à un changement
subtil.
La transmission verticale c’est la transmission de matériel génétique entre une bactérie mère et une
bactérie fille. Finalement le système des mutations ne permet pas à lui seul d’expliquer l’évolution
car la vitesse et la rusticité de ce système ne permettent pas de comprendre comment en un temps
long mais fini on a pu passer de bactéries à des êtres aussi complexes que les hommes.
Acquisition de nouveaux gènes : Les bactéries en plusieurs millions d’années dans un écosystème
particulier finissent par fabriquer une fonction complexe avec tout un système de régulation comme
par exemple le fait de sentir de façon très précise un composé de leur environnement et de réagir en
fonction de la concentration de celui-ci.
Une fois que ce système a été développé par une bactérie d’une niche écologique spécifique ce
système va être mis à la disposition du reste du monde par le mécanisme de transfert entre les
bactéries.
5
→ Transfert vertical et horizontal
Transfert vertical : les bactéries mères transmettent
l’information génétique aux bactéries filles
Transfert horizontal : l’information génétique est
transmise entre bactéries d’espèces différentes.
Système infiniment plus complexe et plus efficace de
dissémination de l’information portée par un fragment
d’ADN entre bactéries d’espèces différentes. Cela existe
dans tous les types de bactéries et c’est en quelque sorte
une « mondialisation de l’information » inventée par les
bactéries.
4. Les divers types de bactéries
→ Il y a :
• les bactéries de l’environnement : les plus nombreuses, les plus anciennes, elles sont partout
• les bactéries commensales : aucun être vivant n’y échappe
• les bactéries pathogènes : en fait très peu nombreuses. Intérêt médiocre pour les bactéries, peut-être
sont-ce des impasses évolutives.
Un très faible nombre d’espèces bactériennes sont pathogènes mais ce sont elles qui ont attiré l’attention
pour l’étude des bactéries.
Pourquoi n’est-ce pas très intéressant pour la bactérie d’être pathogène ?
Une bactérie pathogène c’est une bactérie qui à un moment donné est capable de synthétiser une protéine
qui lorsqu’elle est en contact avec une cellule eucaryote est capable de créer un dysfonctionnement de
celle-ci. Ce dysfonctionnement va être responsable des symptômes des maladies bactériennes (ex :
inflammation des cellules de la vessie, méningite bactérienne).
Image utilisée par le prof : les étudiants sont une colonie d’E.Coli, les murs de l’amphi sont les parois
du tube digestif. Une bactérie d’une autre espèce transfère une information aux E.Coli du tube digestif et
celles-ci se mettent à produire une protéine néfaste pour le tube digestif telle des rockets qui détruisent
les murs de l’amphi. L’amphi s’écroule et la colonie d’E.Coli disparaît. Pas intéressant pour bactérie car
elle disparaît au même temps que son hôte.
Aussi il ne faut pas voir les bactéries comme un projet visant à faire du mal à l’humanité : c’est par
hasard qu’elles acquièrent des gènes dont le produit va être délétère pour notre organisme.
→ Dans ce contexte d’évolutivité bactérienne….
• La pression de sélection par les antibiotiques n’est qu’un « avatar » de plus…
• Les solutions de résistance étaient déjà toutes trouvées ou presque… (lorsqu’on a commencé à utiliser
les antibiotiques)
• Les bactéries se sont facilement « adaptées »
• Il n’y a pas une bactérie de plus sur terre (ni probablement une de moins) qu’avant l’utilisation des
antibiotiques…. Mais elles sont souvent plus résistantes.
6
Pourquoi les solutions de résistance étaient déjà toutes trouvées ?
Ex : pénicilline découverte par Fleming, isolé à partir d’un champignon : le pénicillium. Si ce
champignon produit un antibiotique il faut que celui-ci soit lui-même résistant à la pénicilline.
Lorsqu’il y a une pression de sélection pesant sur les bactéries il va y avoir une mobilisation de ces
mécanismes qui vont être disséminés par le transfert horizontal. Ainsi on comprend bien pourquoi les
bactéries se sont facilement adaptées.
B. Le génome bactérien
1. Du gène à la protéine chez les bactéries (procaryotes)
• La machinerie générale qui permet de passer du gène à la protéine est globalement identique à celle des
eucaryotes MAIS
• le matériel génétique a des spécificités.
→ Spécificités génétiques des bactéries
1- HAPLOÏDIE
Une seule copie (allèle) de chaque gène.
Expression facile des mutations.
2- TEMPS de GENERATION COURT
Expérimentation facile.
3- REPRODUCTION ASSEXUEE
• Par division cellulaire.
• Obtention facile de clones.
Remarque sur le temps de génération :
→ dans tube à essai : 1 E.Coli dans une boîte, passé 20min on en a 2, passé 40min on en a 4 et le
lendemain on en a 1million et ce sera visible à l’œil nu.
→ dans la nature : attention les bactéries ne se multiplient pas à cette vitesse !
Exemple : l’écosystème intestinal. Dans le tube digestif on a 1013 -1014 bactéries. Or on
élimine à peu près ce même nombre tous les jours par les matières fécales. Donc si les
bactéries se multipliaient toutes les 20 min le tube digestif se mettrait à gonfler puis
éclaterait. En fait pour maintenir un équilibre on ne peut pas produire plus de bactéries
que ce que l’on excrète. Donc dans le tube digestif les bactéries se multiplient une fois par
jour.
Conclusion : temps de génération court dans le tube à essai est utile pour l’expérimentation mais n’est
pas la physiologie normale des microorganismes.
7
2. Comparaison schématique de la bactérie et de la cellule eucaryote
L’échelle n’est pas bonne, il faut plutôt se représenter la
taille des bactéries comme celle des mitochondries de la
cellule eucaryote. En effet la mitochondrie est issue de
bactéries stabilisées dans le cytoplasme des cellules
eucaryotes et qui leur apporte un certain nombre de fonctions
notamment respiratoires.
L’enveloppe des bactéries beaucoup plus rigide que chez les
cellules eucaryotes. Sur cette enveloppe on retrouve des
molécules spécifiques des bactéries, perdues chez les
eucaryotes. C’est un gros avantage pour les antibiotiques qui
vont pouvoir cibler ces molécules spécifiques et ainsi avoir
peu de toxicité pour les autres cellules.
Pas de noyau chez la bactérie : il baigne dans le cytoplasme.
Chez les bactéries on a une organisation extrêmement simple,
on dit des bactéries qu’elles sont des « sacs à enzymes ».
3. L’ADN bactérien
• Chromosome (indispensable):
–Unique (exceptions)
–Circulaire
–Gros
• Plasmides (facultatifs)
– Multiples (1 à 30 copies)
– Circulaires
– Petits
• Conséquences : différents niveaux d’expression
Remarque : il n’y a pas toujours de plasmides, le fait d’en avoir peut-être très utile pour la bactérie. Si un
gène est utile à la bactérie et qu’il est sur un plasmide présent en plusieurs copies ça va permettre à la
bactérie d’avoir un grand niveau d’expression face à un stress environnemental. Ainsi c’est un système
d’adaptation formidable qui permet aux bactéries d’avoir différents niveaux d’expression face à un stress
environnemental.
• La taille du chromosome très variable
– 6.105 pb (500 gènes) à 109 pb (10000 gènes)
• Pas d’introns (introns = séquences d’ARNm délétées avant la traduction)
• ARN polycistroniques (plusieurs polypeptides peuvent-être traduits à partir d’un même ARN)
• Début de la traduction quand la transcription est encore en cours.
Les nombres concernant la taille du chromosome ne sont pas à retenir, ils sont juste donnés à titre
d’information.
8
La traduction chez les bactéries est un système continu. Pendant que la transcription a lieu, la traduction
débute à l’autre bout de l’ARN. C’est un système beaucoup plus simple que chez les eucaryotes qui
permet aux bactéries de pouvoir synthétiser des protéines de façon continue.
Les expérimentateurs ont fait sortir le chromosome d’E.Coli. Ce chromosome est
normalement enroulé comme une pelote de laine à l’intérieur de la bactérie. Ici il
est déroulé et on voit bien sa grande taille par rapport à la taille de la bactérie.
D. La stabilité des espèces bactériennes
Depuis le début on insiste sur la notion de plasticité du génome bactérien et on a dit que les bactéries
ont des mécanismes qui leur permettent d’échanger des gènes. Si on se limitait à cela les espèces
bactériennes seraient constamment entrain de changer. Or ce n’est pas le cas : les espèces bactériennes
sont relativement stables.
Aussi la stabilité des espèces bactériennes est assurée par :
1- Réplication chromosomique
2- Transfert aux bactéries filles
3- Réparation des erreurs et concept d’ « hypermutateurs »
4- Enzymes de restriction/modification
Un certain nombre des mécanismes vont permettre la stabilité de l’ensemble du monde bactérien.
1- Au cours de la réplication on a un certain nombre d’erreurs qui vont-être limitées par des
mécanismes de réparation.
2- De plus la réplication est le mécanisme qui va permettre de transfert de l’information génétique
des bactéries mères vers les bactéries filles ; mécanisme qui reste quand-même le plus important
dans la stabilité des espèces bactériennes.
3- Concept d’« hypermutateurs » vs réparation des erreurs :
Si au cours de la réplication toutes les erreurs sont corrigées, comment expliquer l’évolution ?
Chez certaines bactéries on observe des taux de mutation beaucoup plus élevé que la normale.
En fait il n’y a pas plus de mutations produites au cours de la réplication que chez les autres
bactéries. Le taux de mutations apparemment plus élevé est dû à une défaillance des mécanismes
de réparation. Les chercheurs qui ont observé ce phénomène trouvaient que ce devait-être une
situation très défavorable pour ces bactéries car les mutations sont en général délétères et donc
que les mutants devraient survivre moins bien.
Dans ce cas pourquoi ce mécanisme a-t-il survécu au cours des milliards d’années d’évolution
des bactéries ? En fait ça peut-être très intéressant pour la bactérie d’être hypermutatrice. Si une
bactérie a affaire à un changement brutal d’environnement, elle va avoir très peu de temps (cad
de générations à sa disposition) pour que les mutants adéquats à ce type d’environnement lui
permettent de survivre. Si dans cette condition elle est hypermutatrice, elle produit plus de
mutants et trouvera donc plus facilement la solution au changement d’environnement. Ainsi on
comprend bien l’utilité de ce type de mécanismes et donc leur persistance au cours de l’évolution
des bactéries.
4- Enzymes de restriction : Enzymes qui coupent l’ADN sur des séquences spécifiques. Elles
reconnaissent les séquences d’ADN étranger, coupent cet ADN en morceaux qui va ensuite être
digéré.
9
II. Les mécanismes de plasticité du génome bactérien
→ Les mécanismes de plasticité du génome bactérien sont
• Mutations au sein d’un génome.
• Transfert horizontal de gènes entre bactéries:
– Conjugaison
– Transduction
– Transformation
• Eléments génétiques mobiles à l’intérieur d’une bactérie.
– Transposons
– Intégrons
A. Les mutations au sein d’un génome
1. Rappel concernant le mécanisme des mutations
• C’est un phénomène spontané (U.V.) ou provoqué (agents chimiques)
• Le mécanisme est le suivant :
– une base changée peut entraîner un changement d’acide aminé
– la mutation
o s’exprime si le nouveau codon correspond à un nouvel aa et si elle touche le site actif
(qui donnera la future protéine)
o sinon elle restera silencieuse (le plus fréquent)
– il y a possibilité de réversion (mutant revient vers forme sauvage)
2. Expériences démontrant que les mutations surviennent de façon spontanée
Les mutations surviennent de façon spontanée, c’est-à dire de façon indépendante de l’agent sélecteur
(antibiotique ou autre).
A : on a une culture d’E.Coli sensible à la
streptomycine (un antibiotique). On étale un
prélèvement de cette culture sur une boîte de
→ Expérience1 :
pétri dans laquelle on ajoute de la
streptomycine. On incube.
Résultat : pas de pousse
B : toujours la même culture de départ. Cette
fois on ajoute un peu de streptomycine dans le
flacon et on incube. Ensuite on effectue un
prélèvement et on étale sur une boîte de pétri
toujours avec l’antibiotique. On incube.
Résultat : on a des bactéries résistantes qui ont
poussé.
Conclusion : en apparence, la présence de
l’antibiotique est suivie de l’apparition de
mutants résistants. (conclusion erronée)
10
→ Pré-requis pour l’expérience 2:
Les mutations surviennent au hasard. La
mutation qui va conférer la résistance aux
antibiotiques peut avoir lieu à 2 moments
différents.
Culture1 : la mutation survient lors de la 1ère
génération, au final on aura la moitié des
bactéries qui seront résistantes.
Culture2 : la mutation survient à la 2ème et 3ème
génération, au final on aura plus de bactéries
sensibles que de bactéries résistantes.
Conclusion : Plus la mutation survient
précocement au cours de la culture, plus le
nombre de mutants est important.
→ Expérience 2 :
Démonstration de la pré-existance de mutations : on prend une culture d’E.Coli
1- 1ère manip
On divise cette culture en 50 petits tubes de 0,2mL chacun. On les met en culture pendant 18heures.
Donc dans ces tubes la mutation conférant la résistance à la streptomycine va apparaître à des
moments différents. Après 18heures le nombre de bactéries résistantes sera différent d’un tube à
l’autre. Si on compte dans chacun de ces tubes le nombre de bactéries résistantes on observe une
grande variation d’un tube à l’autre.
2- 2ème manip
Cette fois on a les 10mL mais on va les mettre en culture dans un seul tube pendant 18heures. La
mutation se produit à un moment quelconque mais toute la population va être affectée de la même
11
façon. Si au bout de 18 heures on divise la culture en 50 tubes et on les étale sur 50 boîtes on va
mettre environ le même nombre de bactéries résistantes sur chacune des boîtes. Ainsi on observe de
faibles variations car la séparation s’est faite après le développement de mutants résistants
contrairement à la 1ère manip.
Tableau consignant les résultats d’une expérience similaire à celle décrite ci-dessus :
Ici exp1= séparation après et exp2= séparation avant.
Ce n’est pas l’antibiotique qui induit la présence de
mutants : la présence de l’antibiotique révèle la
présence de mutants.
Important pour la pratique médicale : ce n’est pas
parce que le médecin prescrit un antibiotique qu’il va
induire la présence de mutants résistants.
3. Un exemple « d’application » des mutations
→ Les mutations peuvent-être utilisées pour classer le vivant : La fréquence constante des mutations
permet de classer les organismes les uns par rapport aux autres en comparant les séquences d’un gène
présent chez tout le monde. Le gène utilisé est le gène de l’ARN ribosomal 16S.
1- Woese a préparé le gène de l’ARNr 16S de chaque microorganisme à étudier = le séquençage
2- Ensuite il a comparé la séquence nucléotidique de chacun des microorganismes étudiés en identifiant
les parties communes et les parties différentes.
3- Ensuite les séquences sont ordonnées des parties les plus communes vers les moins communes
4- Puis les lignes sont séparées et on obtient un arbre phylogénétique
12
Remarques :
- Le prof a dit qu’il ne faut pas retenir que c’est le gène de l’ADN ribosomal 16S qui a été utilisé
par Woese pour déterminer si 2 bactéries appartenaient à la même espèce. En revanche il faut
savoir que c’est un gène commun à toutes les bactéries et spécifique de celles-ci.
-
Plus les lignes sont éloignées plus les « cousins » sont éloignés et donc par rapport à la séquence
du gène 16S : la bactérie A est plus proche de la bactérie B qu’elle ne l’est de la bactérie C ou D
ect. Et comme on connaît la vitesse d’apparition des mutations si on calcule la distance génétique
qu’il faut par exemple pour passer de A à H on peut alors déterminer depuis combien de temps les
bactéries A et H ont divergé.
-
La notion précédente est très intéressante d’un point de vue théorique mais aussi en médecine :
les bactéries pathogènes ont divergé de bactéries qui ne l’étaient pas du tout depuis très peu de
temps. Certaines ne sont différenciées que depuis 10 000 à 30 000 ans ce qui est très court à
l’échelle de l’évolution. C’est une des raisons qui supporte l’idée déjà énoncée que les bactéries
pathogènes et donc les maladies qu’elles entraînent émergent de façon régulière.
4. La gravité des mutations en clinique (non traité en cours)
→ La gravité des mutations en clinique: l’exemple de la tuberculose
• La streptomycine, médicament miracle de la méningite tuberculeuse.
• Mais administration en monothérapie.
• Survenue de rechute à mutants résistants.
• Par la suite toujours multi-thérapie dès que des autres antituberculeux ont été découverts.
B. L’acquisition de nouveaux gènes par le transfert de gènes entre les bactéries
→ L’acquisition de nouveaux gènes sont
• Mécanismes naturels complexes,
• Découverts par hasard
• Mais qui ont une importance majeure :
– Dans l’évolution en général
– Dans l’évolution de la résistance bactérienne en particulier
– Dans les biotechnologies.
13
→ Mécanismes de transfert d’ADN entre bactéries
Seulement 3 mécanismes sont connus :
•Transformation
•Transduction
•Conjugaison
1. La transformation
a) Définition
→ TRANSFORMATION = TRANSFERT HORIZONTAL D’ADN LIBRE
b) Expériences
A l’origine de la démonstration que l’ADN est le support des gènes.
En 1928, Frederick Griffith démontre qu’il existe chez S. pneumoniae un « principe transformant » qui
modifie la pathogénicité des pneumocoques.
L’expérience est la suivante :
1- Injection pneumocoque (encapsulé) à la souris
 la souris meurt
2- On chauffe le pneumocoque, le pneumocoque est donc
mort, et on l’injecte à la souris
 la souris survit
3- Bactérie sans capsule injectée
 la souris survit
Conclusion : c’est le fait d’avoir une capsule qui fait que la
souris meurt.
4- Bactérie sans capsule + pneumocoque chauffé ; on
injecte le mélange à la souris
 la souris meurt
Explication : Les gènes codant pour la synthèse de la
capsule (responsables de la virulence) résistent à la chaleur.
=>Ils transforment la bactérie non capsulée vivante.
14
→16 ans plus tard ….
• Avery et coll. Montrent que le « principe transformant » est l’ADN et non des protéines ni des
carbohydrates.
La capsule étant constituée de sucres et de protéines on aurait pu penser que c’étaient les composants du
« principe transformant » de Griffith. Ainsi Avery a pris ce « principe transformant » (bactéries
virulentes à capsule mortes) et il a séparé la partie protéique, sucre, acide nucléique de celui-ci. A
chaque fois ces différents composants on été mélangés avec la bactérie vivante non capsulée et le tout
injecté à la souris. La souris qui meurt est celle à qui on a injecté bactérie non virulente+acide nucléique.
 l’ADN est le support des gènes
Ce qui est confirmé par la dernière expérience où la souris ne meurt pas puisque l’ADN a été détruit par
les nucléases.
Remarque : c’est comme ça que la génétique a commencé.
c) La transformation avec des fragments d’ADN et avec des
plasmides
Transformation avec des fragments d’ADN
1- de temps en temps un fragment va s’intégrer au
chromosome, la transformation réussie.
2- Sinon les fragments d’ADN vont être découpés par les
enzymes de restriction et la transformation sera alors
inefficace.
Transformation avec les plasmides
Mécanisme très exploité en biotechnologie. On insère un gène
d’intérêt dans un plasmide. Ce plasmide on le fait rentrer dans
un E.Coli. De temps en temps ce plasmide va persister dans la
bactérie. Ainsi la bactérie va se mettre à produire une molécule
d’intérêt.
15
d) Applications et conséquences de la transformation
→ TRANSFORMATION
– Une conséquence «maléfique »
Résistance PENI chez S. PNEUMONIAE
A PARTIR DE PLP D’AUTRES BACTERIES
– Une application « bénéfique »
Nombreuses utilisations en biotechnologies.
En outre de l’application positive dont on a parlé pour la production de molécules d’intérêt il faut savoir
que la transformation peu avoir des effets négatifs. On peut prendre l’exemple de fragments d’ADN qui
passent d’une bactérie à une autre codant pour des systèmes de résistance aux antibiotiques. Ainsi un
pneumocoque virulent (il a une capsule) peut en plus récupérer des gènes qui codent pour des protéines
conférant la résistance à la pénicilline.
Decreased suceptibility of Streptococcus
pneumoniae to penicillin in Europe (EARSS, 2002)
Penicillin
→Ce phénomène est extrêmement fréquent dans les différents
pays d’Europe. Ça peut aller de très peu dans certains pays du
Nord de l’Europe jusqu’à des taux de prévalence de résistance
des pneumocoques très élevés ; c’est le cas en France où la
prévalence du pneumocoque résistant à la pénicilline est
supérieur à 50%.
Si en France on observe autant de résistance c’est parce que la
France est aussi un des pays qui consomme le plus
d’antibiotiques.
→Graphique représentant la consommation d’antibiotiques par
habitant dans différents pays d’Europe. La consommation en
Hollande est 3 fois plus faible qu’en France. Or en Hollande
les infections bactériennes ne sont pas une cause plus
importante de mortalité que dans les autres pays. Un certain
nombre de mesures sanitaires expliquent en partie cette
différence.
Lorsque cette courbe a été publiée elle a été à l’origine de la
campagne : « les antibiotiques c’est pas automatique ».
→ Utilisation de la transformation en biotechnologies=
L’utilisation dans le clonage
16
2. La transduction
a) Définition
TRANSDUCTION=
TRANSFERT de GENE par l’INTERMEDIAIRE d’UN PHAGE
(Virus spécifique des bactéries).
b) Rappel : le cycle de vie des bactériophages lytiques
Cycle de vie des bactériophages lytiques
Bactériophage insère son acide nucléique dans le
cytoplasme de la bactérie. Il va y avoir
transcription de l’ADN phagique et ainsi
production de protéines phagiques qui vont
ensuite être assemblées pour former de nouveaux
phages. A un certain moment il y en aura
tellement que la bactérie va éclater, les phages se
retrouvent à l’extérieur et le cycle recommence.
c) La transduction généralisée
Transduction généralisée.
De temps en temps au moment où la particule
phagique va se reconstituer dans la bactérie elle
va par hasard et par erreur englober un peu
d’ADN de la bactérie.
On appelle ce mécanisme la transduction
généralisée car c’est n’importe quel fragment
d’ADN bactérien qui va être emporté.
Au prochain cycle le phage va aller infecter une
autre bactérie et il emmène avec lui un peu de
l’ADN de la bactérie précédente. La transduction
est un formidable outil pour l’évolution : le phage
est capable d’apporter l’ADN d’une espèce
bactérienne beaucoup plus lointaine alors que
dans la transformation les bactéries doivent-être
très proches.
17
d) La transduction spécialisée
Transduction spécialisée.
De temps en temps, au lieu de se multiplier
immédiatement l’ADN phagique va s’intégrer dans le
chromosome de la bactérie et y rester un certain temps
= la latence virale. Pendant cette période la cellule hôte
ne souffre pas de la présence phagique et produit un
petit nombre de phages. La présence de ce phage peut
même conférer à l’hôte une propriété particulière
comme la production d’une toxine par exemple. (ex :
Vibrio Cholerae lorsqu’elle récupère gène d’autres
bactéries elle synthétise protéine qui va faire que les
entérocytes excrètent l’eau au lieu de l’absorber et les
cholériques meurent ainsi en quelques heures d’une
diarrhée profuse)
De temps en temps pour des raisons que l’on connaît
mal, le cycle lytique reprend. Excision ADN phagique et
parfois excision un peu fragment adjacent de l’ADN de
l’hôte. Le phage va donc emmener un peu de l’ADN
bactérien. Cette fois le fragment emporté dépend du site
d’insertion de l’ADN phagique dans le chromosome
bactérien. Parfois ce qu’il emmène peut-être très
intéressant (ex : système de régulation). D’une fonction
simple au départ on passe à un système plus complexe.
On comprend comment au cours de l’évolution des
systèmes complexes se sont construits.
e) Une application de la transduction : les cosmides
En fait c’est une application des phages et des plasmides, juste cité en cours et normalement après la
conjugaison, j’ai jugé utile de le placer ici.
18
3. La conjugaison
a) Définition et propriétés
• Définition : Transfert de gènes par contact cellulaire
• Propriétés
– Permet le transfert de gènes chromosomiques ou plasmidiques
– Existe chez les bactéries à Gram positif et à Gram négatif
– Importance majeure dans la dissémination des gènes de résistance.
b) Découverte de la conjugaison
• En 1946, Lederberg démontre la possibilité de recombinaison entre deux populations bactériennes
auxotrophes (bactéries ne poussant pas sur milieux minimum carboné mais ayant besoin de l’apport
extérieur d’un acide aminé préformé).
Expérience de Lederberg pour montrer que 2 bactéries peuvent
échanger de l’information par contact.
o Il dispose de bactéries A+B+C-D- : elles n’ont pas besoin
de A et B pour pousser mais elles ont besoin de C et D ; et
de bactéries A-B-C+D+.
o Lorsque l’on met ces bactéries sur un milieu minimal (A-BC-D-) aucune ne pousse.
o En revanche il observe que s’il les met en contact pendant
un certain temps et qu’il met ce mélange sur ce même
milieu minimal, des bactéries poussent.
 cela prouve bien qu’elles se sont échangé des gènes
o De plus il fallait que les bactéries soient vivantes sinon ça
ne marchait pas.
o S’il mettait une membrane poreuse entre les 2 colonies les
empêchant de passer ça ne marchait pas non plus, le
contact est donc indispensable.
=> Lederberg vient de mettre en évidence une autre méthode
de transfert horizontal des gènes entre les bactéries.
c) Les étapes de la conjugaison
→Physiologie de la conjugaison chez les bactéries à gram négatif : 4 étapes
1. Contact cellulaire
2. Préparation du DNA (mobilisation)
3. Transfert d’un brin unique d’ADN
4. Reconstitution du brin manquant à la fois dans la cellule donatrice et dans la réceptrice : le
transfert est conservatif.
19
Si plasmide : processus rapide
Si chromosome : processus long débutant toujours au même endroit (peut être interrompu et donc, si on
observe ce qui est transféré pour un temps donné on peut dessiner une carte physique du chromosome
(utilisé avant le séquençage)
1- bactérie de gauche = bactérie donatrice de gènes
(bactérie mâle), elle possède un facteur F (elle est F+)
- bactérie de droite = bactérie réceptrice, elle est dépourvue
de facteur F (elle est F-)
- le facteur F contient entre autres des gènes codant pour la
synthèse des pili sexuels (bactérie mâle contient pilus
sexuel)
2- les bactéries se mettent en contact
- fusion des membranes
- l’ADN est entre temps préparé au transfert
3- un brin unique d’ADN est transféré et le brin
complémentaire est synthétisé que ce soit dans la bactérie
donatrice (qui reste F+) et la bactérie réceptrice (qui
devient F+)
4- les cellules se séparent à la fin du transfert.
A la fin on aura 2 bactéries mâle => démultiplication du
phénomène.
La conjugaison est conservatrice. La cinétique de transfert est
orientée (orientée car elle va toujours des bactéries F+ vers
les F-), cinétique (ça veut dire que ça prend du temps),
linéaire.
Remarque : le prof étant allé vite sur cette partie j’ai regardé
ceci : http://www.bacteriologie.net/generale/conjugaison.html
Photo microscope électronique :
Pilus extrêmement long, constitué de protéines enroulées
comme sur une spirale et au moment où le pilus touche
récepteur spécifique de la bactérie réceptrice, les protéines
qui le composent vont se fluidifier dans la membrane de la
cellule réceptrice et au fur et à mesure le pilus se raccoursit
et 2 bactéries se rapprochent ≈ comme un mécanisme de
capture.
→ Formation agrégats de 2 à 20 cellules
• Contact entre l’extrémité du Pilus et un récepteur
spécifique de la membrane externe
• Rétraction
• Formation d’un pore par fusion des deux
membranes pour le passage du brun d’ADN
20
d) Le contact cellulaire, rôle du pilus F (non traité en cours)
•Appendice sexuel : 1 à 3 /bactérie
•Flexible
•Fait de piline (11000d)
•Structure :
Cylindrique : extérieur 80 A, intérieur 20 A
Hélicoïdale : 4 hélices de pas 128 A
e) Conjugaison chez les streptocoques (non traité en cours)
• Mécanisme différent : pas de pili
• Sécrétion de petites molécules diffusibles par les cellules réceptrices.
• Agrégation des donatrices et des réceptrices
• Transfert d’ADN
f) Rôle des plasmides de résistance dans l’évolution de la
résistance
• Nombreux gènes de résistance accrochés derrière une origine de transfert commune (image du
train derrière la locomotive)
• Multirésistance :
– Croisée : au sein d’une même famille
– Associée : familles différentes.
• Co-transfert et co-sélection
Ce système de transfert par conjugaison a une importance majeure dans la résistance des bactéries aux
antibiotiques car ils permettent de transférer des plasmides. Ces plasmides ont un certain nombre de
gènes et de temps en temps ils ont des gènes qui confèrent la résistance aux antibiotiques (ex : gène de la
β-lactamate que l’on retrouve souvent dans les plasmides). La β-lactamate hydrolyse un antibiotique,
l’amoxicilline. La conjugaison est un moyen de transférer ce gène de façon horizontale entre les
bactéries. Cela marche tellement bien que l’on retrouve ce gène largement disséminé à la surface da la
Terre.
De temps en temps à côté de ce gène on va avoir un autre gène conférant la résistance à un autre
antibiotique (ex : gentamicine). Ces 2 gènes sont associés comme les wagons d’un train sur le plasmide.
Si phénomène de conjugaison, ils vont-être transférés en bloc et la cellule réceptrice va donc acquérir la
résistance aux 2 antibiotiques. Cette association entre les 2 gènes est permise par certains éléments
génétiques mobiles que l’on appelle des intégrons qui mettent dans le plasmide jusqu’à une dizaine de
wagons différents. C’est un des mécanismes qui expliquent les phénomènes de multirésistance.
Co-sélection= avec un seul antibiotique on sélectionne une bactérie résistante à de multiples
antibiotiques.
21
g) Les plasmides et leur application en biotechnologie
→ Une combinaison des phages et des plasmides pour les biotechnologies : Les cosmides
(déjà cité)
C. Les éléments génétiques mobiles à l’intérieur de la bactérie
→ Mécanismes de mobilité des gènes au sein d’une cellule
• Transposons : permet à un gène de « sauter » s’une position chromosomique à une position plasmidique.
• Intégrons : permet à plusieurs gènes de « s’associer » pour être mobilisés ensemble
→ La présence d’un intégron au sein d’un transposon est un mécanisme fréquent particulièrement
efficace pour accélérer l’évolution
(le prof n’a pas insisté sur ces mécanismes, je les laisse car il les cite quand-même concernant les gènes
de résistance accrochés entre eux dans un plasmide)
22
Ces mécanismes expliquent la présence de bactéries super résistantes aux antibiotiques.
Ainsi que l’extraordinaire essor des biotechnologies !
Conclusion
• La formidable diversité des mécanismes d’adaptation du génome :
– Explique l’adaptabilité des bactéries et leur évolution
– Rend peu probable la découverte d’un antibiotique « sans résistance »
– Permet de multiples applications en biotechnologie
23
24